JP7785352B2 - 遺伝子治療のためのａａｖカプシドバリアント - Google Patents

遺伝子治療のためのａａｖカプシドバリアント

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Description

関連出願
本願は、２０１９年８月１４日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／８８６，９１５、表題「AAV CAPSID VARIANTS FOR GENE THERAPY」の出願日の、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下における利益を主張し、当該仮出願は、本明細書において参考として援用される。
背景
組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、多数の異なる疾患のためにベクターを移送する遺伝子として、臨床に入ってきた。いくつかの場合においては、ベクターは、目的の組織中に直接送達されるが、送達が全身性である疾患が増えている。したがって、様々な組織向性ならびにより高い形質導入の効率を有する新たなＡＡＶバリアントの開発が、高く望まれている。
要旨
本明細書において開示されるのは、バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質、かかるタンパク質をコードする核酸、かかるタンパク質を含む（例えば、目的の遺伝子をコードするｒＡＡＶゲノムにカプシド形成する）ｒＡＡＶ粒子である。いくつかの態様において、本願において記載される組成物は、ｒＡＡＶ粒子を生成するために、および／または１つ以上の目的の遺伝子を標的組織に（例えば、筋肉組織、例えば心筋または骨格筋に）送達するために有用である。
筋肉疾患の処置のために用いられる場合、身体の骨格筋および／または心筋に形質導入するために、大量のウイルスが必要とされる。残念ながら、大量のウイルスは、患者にとって生命を脅かし得る多数の様々な型の望ましくない免疫応答を引き起こし得る。したがって、目的の組織についてのウイルスの向性を最適化しつつ、一方で、非標的組織におけるウイルスの取り込みを減少させる必要がある。
いくつかの態様において、本明細書において開示されるのは、組織向性（例えば、筋向性）を増強する１つ以上のアミノ酸置換を有する、バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）血清型８（ＡＡＶ８）カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、脳および／または肝臓への向性を低下させる、１つ以上のさらなるアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、図１において示されるような変更のうちのいずれか１つ以上の１つ以上を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号１１において記載されるようなアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、以下の変更：Ｎ５００Ｉ；Ｎ２６３Ｓ；Ｇ２６４Ａ；Ｔ２６５Ｓ；Ｓ２６６Ｔ；Ｇ２６８の欠失；Ｔ２７０Ｓ；およびＴ２７４Ｈのうちのいずれか１つ以上をさらに含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号１５において記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号２１において記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号２７において記載されるようなアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、以下の置換：Ａ２４Ｄ、Ｄ４１Ｎ、Ｑ８４Ｋ、Ｒ９２Ｋ、Ｔ１５８Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ｒ１６９Ｋ、Ｌ１８９Ｉ、Ａ１９５Ｇ、Ｖ１９９Ｌ、Ｐ２０１Ｓ、Ｓ２２５Ａ、Ｇ２６４Ｓ、Ａ２６９Ｓ、Ｒ３１３Ｋ、Ｓ３１５Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３６２Ｅ、Ｑ４１３Ｅ、Ｔ４１５Ｓ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４５３Ｓ、Ｎ４５９Ｇ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｎ４７１Ｓ、Ｔ４７２Ｎ、Ａ４７４Ｓ、Ｎ４７５Ａ、Ｔ４９４Ｖ、Ａ５０７Ｇ、Ｇ５０８Ａ、Ｎ５１７Ｄ、Ａ５２０Ｖ、Ｔ５２８Ｓ、Ｄ５３１Ｅ、Ｄ５３２Ｇ、Ｎ５４０Ｓ、Ｎ５４９Ｇ、Ａ５５１Ｇ、Ａ５５５Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｅ５７８Ｑ、Ｉ５８１Ｑ、Ｔ５９１Ａ、Ｑ５９４Ｉ、Ｉ５９５Ｖ、Ｎ６６５Ｓ、Ｓ６６７Ａ、Ｎ６７０Ａ、Ｓ７１２Ｎ、Ｖ７２２ＴおよびＹ７３３Ｆのうちの１つ以上を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号１２において記載されるようなアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、以下の変更：Ｎ５００Ｉ；Ｎ２６３Ｓ；Ｓ２６４Ａ；Ｔ２６５Ｓ；Ｓ２６６Ｔ；Ｇ２６８の欠失；Ｓ２６９Ａ；Ｔ２７０Ｓ；およびＴ２７４Ｈのうちのいずれか１つ以上をさらに含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号１７において記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号２３において記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号２９において記載されるようなアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、以下の置換：Ｋ３１Ｑ、Ｄ４１Ｎ、Ｇ４２Ａ、Ｑ８４Ｋ、Ｒ９２Ｋ、Ｑ１０５Ｋ、Ｔ１５８Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ｓ１８０Ｔ、Ｐ２０１Ｓ、Ｓ２２５Ａ、Ｇ２６４Ｓ、Ａ２６９Ｓ、Ｒ３１３Ｋ、Ｓ３１５Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３６２Ｅ、Ｑ４１３Ｅ、Ｔ４１５Ｓ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４５３Ｓ、Ｎ４５９Ｇ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｎ４７１Ｓ、Ｔ４７２Ｎ、Ａ４７４Ｓ、Ｎ４７５Ａ、Ｔ４９４Ｖ、Ａ５０７Ｇ、Ｇ５０８Ａ、Ｎ５１７Ｄ、Ａ５２０Ｖ、Ｔ５２８Ｓ、Ｄ５３１Ｅ、Ｄ５３２Ｇ、Ｎ５４０Ｓ、Ｎ５４９Ｇ、Ａ５５１Ｇ、Ａ５５５Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｉ５８１Ｑ、Ｑ５８８Ｓ、Ｑ５８９Ａ、Ｑ５９４Ｉ、Ｉ５９５Ｖ、Ｎ６６５Ｓ、Ｓ６６７Ａ、Ｎ６７０Ａ、Ｓ７１２Ｎ、Ｖ７２２ＴおよびＹ７３３Ｆのうちの１つ以上を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号１３において記載されるようなアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、以下の変更：Ｎ５００Ｉ；Ｎ２６３Ｓ；Ｓ２６４Ａ；Ｔ２６５Ｓ；Ｓ２６６Ｔ；Ｇ２６８の欠失；Ｓ２６９Ａ；Ｔ２７０Ｓ；およびＴ２７４Ｈのうちのいずれか１つ以上をさらに含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号１９において記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号２５において記載されるようなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ８カプシドタンパク質は、配列番号３１において記載されるようなアミノ酸配列を含む。
さらに開示されるのは、開示されるアミノ酸変更のうちのいずれか１つ以上を含む、血清型８以外の血清型（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５など）のバリアントｒＡＡＶカプシドタンパク質である。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、血清型８以外の血清型のカプシドタンパク質における、ＡＡＶ８中の置換の位置に対応する位置におけるものである。したがって、いくつかの態様において、図１、図４、および／または配列番号２、４、６、１１～１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および／または３１において示されるアミノ酸置換のうちょの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）は、ｒＡＡＶ８ベースのカプシドタンパク質において含まれていても、または異なる血清型（例えば、配列番号７～１０において記載されるカプシドタンパク質）のうちのいずれかに基づくｒＡＡＶカプシドタンパク質、および／または関連するｒＡＡＶ粒子（例えば、目的の遺伝子をコードする核酸を含むもの）において、含まれていてもよい。いくつかの態様において、バリアントカプシドタンパク質は、バリアントＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３のカプシドタンパク質であってよい。いくつかの態様において、バリアントカプシドタンパク質は、図１および図４において示されるアミノ酸置換のサブセット、例えば、図１および図４において示されるものよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０少ないアミノ酸置換を有するサブセットを含む。
また開示されるのは、開示される組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質を含む、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）粒子である。いくつかの態様において、ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）粒子は、目的の遺伝子を含む核酸を含む。いくつかの態様において、核酸は、一本鎖である。いくつかの態様において、核酸は、二本鎖である。
また開示されるのは、本明細書において開示される複数のバリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）粒子を含む、組成物である。これらの組成物は、薬学的に受入可能なキャリアを含んでもよい。
また開示されるのは、目的の遺伝子で細胞を形質導入する方法であって、該方法は、細胞に、本明細書において開示される組成物を提供することを含み、ここで、組成物中のＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）粒子は、目的の遺伝子を含む。さらに提供されるのは、目的の遺伝子で細胞を形質導入する方法であって、該方法は、細胞に、本明細書において開示されるバリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質を含む複数の組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）粒子を含む組成物を提供することを含み、およびここで、組成物中のＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）粒子は、目的の遺伝子を含む。いくつかの態様において、目的の遺伝子は、治療用タンパク質をコードする。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、抗体または抗体フラグメント、ぺプチボディー、増殖因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、酵素、ヌクレアーゼまたは遺伝子編集のために用いられる他のタンパク質である。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに実証するために含められる。本開示のある側面は、本明細書において提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせた、これらの図面のうちの１つ以上への参照により、より良好に理解され得る。図面において図示されるデータは、決して本開示の範囲を限定しないことが、理解されるべきである。
図１Ａ～１Ｅは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３の、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。赤色は、比較された全てのカプシドにわたり同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較される配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較される配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較される配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図１Ａ～１Ｅは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３の、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。赤色は、比較された全てのカプシドにわたり同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較される配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較される配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較される配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図１Ａ～１Ｅは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３の、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。赤色は、比較された全てのカプシドにわたり同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較される配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較される配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較される配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図１Ａ～１Ｅは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３の、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。赤色は、比較された全てのカプシドにわたり同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較される配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較される配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較される配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図１Ａ～１Ｅは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３の、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。赤色は、比較された全てのカプシドにわたり同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較される配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較される配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較される配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。
図２は、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ２、ＳＬ３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５の、それらのカプシドタンパク質の配列に基づいた「樹形図」を表す。 図３は、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ２、ＳＬ３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５の配列相同性／分岐（divergence）の％を示す。
図４Ａ～４Ｊは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。「Ｌ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティングをもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更を指す。「Ｂ」という接尾語は、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失を指す。「ＬＢ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティング（Ｌ）をもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更と、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失とを組み合わせたものを指す。赤色は、比較された全カプシドの間で同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較された配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較された配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較された配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図４Ａ～４Ｊは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。「Ｌ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティングをもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更を指す。「Ｂ」という接尾語は、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失を指す。「ＬＢ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティング（Ｌ）をもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更と、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失とを組み合わせたものを指す。赤色は、比較された全カプシドの間で同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較された配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較された配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較された配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図４Ａ～４Ｊは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。「Ｌ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティングをもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更を指す。「Ｂ」という接尾語は、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失を指す。「ＬＢ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティング（Ｌ）をもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更と、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失とを組み合わせたものを指す。赤色は、比較された全カプシドの間で同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較された配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較された配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較された配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図４Ａ～４Ｊは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。「Ｌ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティングをもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更を指す。「Ｂ」という接尾語は、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失を指す。「ＬＢ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティング（Ｌ）をもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更と、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失とを組み合わせたものを指す。赤色は、比較された全カプシドの間で同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較された配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較された配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較された配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図４Ａ～４Ｊは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。「Ｌ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティングをもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更を指す。「Ｂ」という接尾語は、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失を指す。「ＬＢ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティング（Ｌ）をもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更と、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失とを組み合わせたものを指す。赤色は、比較された全カプシドの間で同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較された配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較された配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較された配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図４Ａ～４Ｊは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。「Ｌ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティングをもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更を指す。「Ｂ」という接尾語は、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失を指す。「ＬＢ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティング（Ｌ）をもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更と、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失とを組み合わせたものを指す。赤色は、比較された全カプシドの間で同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較された配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較された配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較された配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図４Ａ～４Ｊは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。「Ｌ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティングをもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更を指す。「Ｂ」という接尾語は、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失を指す。「ＬＢ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティング（Ｌ）をもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更と、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失とを組み合わせたものを指す。赤色は、比較された全カプシドの間で同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較された配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較された配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較された配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図４Ａ～４Ｊは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。「Ｌ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティングをもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更を指す。「Ｂ」という接尾語は、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失を指す。「ＬＢ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティング（Ｌ）をもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更と、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失とを組み合わせたものを指す。赤色は、比較された全カプシドの間で同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較された配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較された配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較された配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図４Ａ～４Ｊは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。「Ｌ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティングをもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更を指す。「Ｂ」という接尾語は、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失を指す。「ＬＢ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティング（Ｌ）をもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更と、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失とを組み合わせたものを指す。赤色は、比較された全カプシドの間で同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較された配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較された配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較された配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。 図４Ａ～４Ｊは、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの、他の一般的に用いられるＡＡＶベクターＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５とのアラインメントを示す。「Ｌ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティングをもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更を指す。「Ｂ」という接尾語は、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失を指す。「ＬＢ」という接尾語は、より効率の低い肝臓ターゲティング（Ｌ）をもたらすことが報告されている単一のアミノ酸変更と、血液脳関門の横断を障害することが報告されている８つのアミノ酸置換／欠失とを組み合わせたものを指す。赤色は、比較された全カプシドの間で同一のアミノ酸を示す；橙色は、比較された配列のうちの１つが異なるアミノ酸を置換することを示す；緑色は、比較された配列のうちの２つが異なるアミノ酸を置換することを示す；青色は、比較された配列のうちの３つ以上が異なるアミノ酸を置換することを示す。
図５は、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３Ｂ、ＳＬ３ＬＢ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５の、それらのカプシドタンパク質の配列に基づいた「樹形図」を表す。 図６は、ＡＡＶバリアントＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３Ｂ、ＳＬ３ＬＢ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５の配列相同性／分岐の％を示す。
図７は、図８において示されるブロットのウェスタンブロット定量を示す。３つのバリアント（ＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３）の送達を、天然の血清型であるＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、ならびに操作されたバリアントであるＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５の取り込みと比較する。実験は、６月齢のＤＢＡ／２Ｊオスマウスに尾静脈全身送達により投与された、既知の飽和未満の用量（１×１０１３ｖｇ／ｋｇ）を用いて行った。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、全組織における発現についてベータ－アクチンプロモーターの制御下においてレポータータンパク質として用いた。バリアントＳＬ２は、対照血清型と比較して、改善された心臓組織における取り込みを有し、一方、ＳＬ３は、ＡＡＶ９により類似した取り込みを有する。ＳＬ３は、試験されたＡＡＶ血清型のうちのいずれにおいても骨格筋および脳において最も高い取り込みを有する。
図８は、図７において示される定量に対応するウェスタンブロットデータを示す。 図９は、骨格筋および心筋の両方における取り込みにおけるＳＬ３の優位性を示す。心臓および横隔膜のウェスタンブロットおよび定量を示す。データは、６月齢のＤＢＡ／２Ｊオスマウスへの尾静脈（全身送達）により、１×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９、ＳＬ１．２、ＳＬ２またはＳＬ３を注射することにより得た。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、全組織における発現についてベータ－アクチンプロモーターの制御下においてレポータータンパク質として用いた。
図１０は、骨格筋および心筋の両方における取り込みにおけるＳＬ３の優位性を示す。四頭筋のウェスタンブロットおよび定量を示す。データは、６月齢のＤＢＡ／２Ｊオスマウスへの尾静脈（全身送達）により、１×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９、ＳＬ１．２、ＳＬ２またはＳＬ３を注射することにより得た。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、全組織における発現についてベータ－アクチンプロモーターの制御下においてレポータータンパク質として用いた。
図１１は、ＡＡＶ９、ＳＬ１．２、ＳＬ２またはＳＬ３の５×１０１３ｖｇ／ｋｇまたは１×１０１４ｖｇ／ｋｇでの全身注射後の、骨格筋および心臓内の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；輝度）の分布を示す。発現のパターンは、ウェスタンブロットデータの結論を支持し、ＳＬ３が、心臓および骨格筋の形質導入のための優れたベクターであることを示す。
詳細な説明
ＡＡＶ由来のベクターは、他のベクターと比較して低い病原性、エピソームの局在、および安定な導入遺伝子発現に起因して、ヒト遺伝子治療の適用のための有望なツールである。ＡＡＶ粒子は、治療用遺伝子の送達のための巨大な将来性を示す。ＡＡＶ粒子の臓器または組織向性は、完全にではないとしても、粒子表面またはカプシドの構造に高度に依存する。本明細書において開示されるのは、ＡＡＶ形質導入の向性および／または効率をＡＡＶ８と比較して改変する、ＡＡＶバリアントである。これらのベクターは、獣医学またはヒトのいずれかの使用のために臨床において用いることができる。組織向性は、哺乳動物種に依存して異なり得る。組織向性および効率の差異の基盤は、主に表面ループの配列のバリエーションに依存する。
ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）は、骨格筋、網膜色素上皮、視細胞、心臓組織、および肝細胞に対して向性を有し、これらに遺伝子を送達するために用いることができる。ＡＡＶについての典型であるが、ＡＡＶ８カプシドは、単一のＡＡＶのｃａｐ遺伝子の３つの異なるがオーバーラップするトランスクリプトの生成物である３つのタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から構成される。本明細書において提供されるのは、ＡＡＶ形質導入の向性および／または効率をＡＡＶ８と比較して改変する、バリアント組み換えＡＡＶ８様カプシドタンパク質および粒子のための組成物および方法である。本開示は、少なくとも部分的に、野生型ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）タンパク質および粒子と比較して、組織向性を改変し、形質導入効率を改変する、組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）バリアントタンパク質および粒子の同定に基づく。
本明細書において用いられる場合、用語「バリアント」とは、天然に存在するものから逸脱する特徴を有する核酸またはタンパク質を指し、例えば、「バリアント」は、野生型の核酸またはタンパク質に対して、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。例えば、導入遺伝子バリアントは、導入遺伝子のヌクレオチドにおいて、その野生型配列と比較して、１つ以上の置換を含む核酸である。これらの置換は、サイレント、すなわち、それらは任意のコードされるタンパク質のアミノ酸配列を修飾しない（または別段にバリアントアミノ酸配列をもたらさない）ものであってもよい。あるいは、これらの置換は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の修飾をもたらし得、これは、野生型タンパク質配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～１５、または１５～２０アミノ酸の置換を有する）を有する、コードされたタンパク質をもたらす。これらの置換は、化学修飾ならびにトランケーションを含む。この用語は、さらに、野生型の核酸またはアミノ酸の配列の機能的フラグメントを包含する。参照配列のこれらの修飾は、参照配列の５’または３’末端において、またはそれらの位置の間のどこか別の箇所において、参照配列中のヌクレオチドまたはペプチドの間で個々に、または参照配列中の１つ以上の近接した群において、散らばって起こり得る。
いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアント組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質は、血清型８（ＡＡＶ８）ＶＰ１またはＶＰ２またはＶＰ３を含むバックグラウンドにおいて作製された、位置４４７におけるＹからＦへの置換および位置４９４におけるＴからＶへの置換句を有する。いくつかの態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質は、配列番号１１において記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質は、図１Ａ～１ＥにおいてＳＬ１．２カプシドタンパク質として同定されるアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質は、以下の置換：Ｋ１６３Ｓ、Ｒ１６９Ｋ、Ｓ１８０Ｔ、Ｌ１８９Ｉ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｔ４９４Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｔ５９１ＡおよびＹ７３３Ｆのうちの１つ以上を含む。一態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質は、置換Ｋ１６３Ｓ、Ｒ１６９Ｋ、Ｓ１８０Ｔ、Ｌ１８９Ｉ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｔ４９４Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｔ５９１ＡおよびＹ７３３Ｆを含む。
いくつかの態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質は、以下の置換：Ａ２４Ｄ、Ｄ４１Ｎ、Ｑ８４Ｋ、Ｒ９２Ｋ、Ｔ１５８Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ｒ１６９Ｋ、Ｌ１８９Ｉ、Ａ１９５Ｇ、Ｖ１９９Ｌ、Ｐ２０１Ｓ、Ｓ２２５Ａ、Ｇ２６４Ｓ、Ａ２６９Ｓ、Ｒ３１３Ｋ、Ｓ３１５Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３６２Ｅ、Ｑ４１３Ｅ、Ｔ４１５Ｓ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４５３Ｓ、Ｎ４５９Ｇ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｎ４７１Ｓ、Ｔ４７２Ｎ、Ａ４７４Ｓ、Ｎ４７５Ａ、Ｔ４９４Ｖ、Ａ５０７Ｇ、Ｇ５０８Ａ、Ｎ５１７Ｄ、Ａ５２０Ｖ、Ｔ５２８Ｓ、Ｄ５３１Ｅ、Ｄ５３２Ｇ、Ｎ５４０Ｓ、Ｎ５４９Ｇ、Ａ５５１Ｇ、Ａ５５５Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｅ５７８Ｑ、Ｉ５８１Ｑ、Ｔ５９１Ａ、Ｑ５９４Ｉ、Ｉ５９５Ｖ、Ｎ６６５Ｓ、Ｓ６６７Ａ、Ｎ６７０Ａ、Ｓ７１２Ｎ、Ｖ７２２ＴおよびＹ７３３Ｆのうちの１つ以上を含む。一態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質は、置換Ａ２４Ｄ、Ｄ４１Ｎ、Ｑ８４Ｋ、Ｒ９２Ｋ、Ｔ１５８Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ｒ１６９Ｋ、Ｌ１８９Ｉ、Ａ１９５Ｇ、Ｖ１９９Ｌ、Ｐ２０１Ｓ、Ｓ２２５Ａ、Ｇ２６４Ｓ、Ａ２６９Ｓ、Ｒ３１３Ｋ、Ｓ３１５Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３６２Ｅ、Ｑ４１３Ｅ、Ｔ４１５Ｓ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４５３Ｓ、Ｎ４５９Ｇ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｎ４７１Ｓ、Ｔ４７２Ｎ、Ａ４７４Ｓ、Ｎ４７５Ａ、Ｔ４９４Ｖ、Ａ５０７Ｇ、Ｇ５０８Ａ、Ｎ５１７Ｄ、Ａ５２０Ｖ、Ｔ５２８Ｓ、Ｄ５３１Ｅ、Ｄ５３２Ｇ、Ｎ５４０Ｓ、Ｎ５４９Ｇ、Ａ５５１Ｇ、Ａ５５５Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｅ５７８Ｑ、Ｉ５８１Ｑ、Ｔ５９１Ａ、Ｑ５９４Ｉ、Ｉ５９５Ｖ、Ｎ６６５Ｓ、Ｓ６６７Ａ、Ｎ６７０Ａ、Ｓ７１２Ｎ、Ｖ７２２ＴおよびＹ７３３Ｆを含む。いくつかの態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）は、配列番号１２において記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質は、図１Ａ～１ＥにおいてＳＬ２カプシドタンパク質として同定されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶカプシドタンパク質は、血清型８（ＡＡＶ８）ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３を含むバックグラウンドにおいて作製された、位置４４７におけるＹからＦへの置換、および位置４９４におけるＴからＶへの置換を有し、以下の置換のうちのいずれか１つ以上を含む：Ｋ３１Ｑ、Ｄ４１Ｎ、Ｇ４２Ａ、Ｑ８４Ｋ、Ｒ９２Ｋ、Ｑ１０５Ｋ、Ｔ１５８Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ｓ１８０Ｔ、Ｐ２０１Ｓ、Ｓ２２５Ａ、Ｇ２６４Ｓ、Ａ２６９Ｓ、Ｒ３１３Ｋ、Ｓ３１５Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３６２Ｅ、Ｑ４１３Ｅ、Ｔ４１５Ｓ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４５３Ｓ、Ｎ４５９Ｇ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｎ４７１Ｓ、Ｔ４７２Ｎ、Ａ４７４Ｓ、Ｎ４７５Ａ、Ｔ４９４Ｖ、Ａ５０７Ｇ、Ｇ５０８Ａ、Ｎ５１７Ｄ、Ａ５２０Ｖ、Ｔ５２８Ｓ、Ｄ５３１Ｅ、Ｄ５３２Ｇ、Ｎ５４０Ｓ、Ｎ５４９Ｇ、Ａ５５１Ｇ、Ａ５５５Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｉ５８１Ｑ、Ｑ５８８Ｓ、Ｑ５８９Ａ、Ｑ５９４Ｉ、Ｉ５９５Ｖ、Ｎ６６５Ｓ、Ｓ６６７Ａ、Ｎ６７０Ａ、Ｓ７１２Ｎ、Ｖ７２２ＴおよびＹ７３３Ｆ。一態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質は、置換Ｋ３１Ｑ、Ｄ４１Ｎ、Ｇ４２Ａ、Ｑ８４Ｋ、Ｒ９２Ｋ、Ｑ１０５Ｋ、Ｔ１５８Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ｓ１８０Ｔ、Ｐ２０１Ｓ、Ｓ２２５Ａ、Ｇ２６４Ｓ、Ａ２６９Ｓ、Ｒ３１３Ｋ、Ｓ３１５Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３６２Ｅ、Ｑ４１３Ｅ、Ｔ４１５Ｓ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４５３Ｓ、Ｎ４５９Ｇ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｎ４７１Ｓ、Ｔ４７２Ｎ、Ａ４７４Ｓ、Ｎ４７５Ａ、Ｔ４９４Ｖ、Ａ５０７Ｇ、Ｇ５０８Ａ、Ｎ５１７Ｄ、Ａ５２０Ｖ、Ｔ５２８Ｓ、Ｄ５３１Ｅ、Ｄ５３２Ｇ、Ｎ５４０Ｓ、Ｎ５４９Ｇ、Ａ５５１Ｇ、Ａ５５５Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｉ５８１Ｑ、Ｑ５８８Ｓ、Ｑ５８９Ａ、Ｑ５９４Ｉ、Ｉ５９５Ｖ、Ｎ６６５Ｓ、Ｓ６６７Ａ、Ｎ６７０Ａ、Ｓ７１２Ｎ、Ｖ７２２ＴおよびＹ７３３を含む。いくつかの態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）は、配列番号１３において記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質は、図１Ａ～１ＥにおいてＳＬ３カプシドタンパク質として同定されるアミノ酸配列を有する。
ＡＡＶ８の構造およびカプシドタンパク質
野生型ＡＡＶゲノムは、ポジティブまたはネガティブセンスのいずれかである一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）から構成される。ＤＮＡ鎖の各々の末端には、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）がある。ＩＴＲの間には、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐおよびｃａｐが存在する。ｒｅｐ ＯＲＦは、ＡＡＶの生活環のために必要とされるＲｅｐタンパク質をコードする４つのオーバライドする遺伝子を含んでなる。ｃａｐ ＯＲＦは、一緒に相互作用して正二十面体対称のカプシドを形成するカプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のオーバーラップするヌクレオチド配列を含む。
野生型ＡＡＶ８アミノ酸配列：
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL（配列番号７）
野生型ＡＡＶ９アミノ酸配列：
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL（配列番号８）
ＡＡＶｒｈ１０アミノ酸配列：
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ＡＡＶｒｈ７４アミノ酸配列：
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ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５アミノ酸配列：
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGSNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLNFKLFNIQVKEVTTNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTSGTAGNRTLQFSQAGPSSMANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTTNQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMATHKDDEDKFFPMSGVLIFGKQGAGNSNVDLDNVMITNEEEIKTTNPVATEEYGTVATNLQSANTAPATGTVNSQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSTNVDFAVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL（配列番号３２）
バリアント組み換えＡＡＶ８カプシドタンパク質
本明細書において提供されるのは、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶカプシドタンパク質のうちのいずれか１つをコードする核酸である。いくつかの態様において、プラスミドは、バリアントｒＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を含む。
バリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸のいくつかの非限定的な例を、表１において提供する。これらのバリアントは、ＳＬ１．２（配列番号１によりコードされる）、ＳＬ１．２Ｌ（配列番号１４によりコードされる）、ＳＬ１．２Ｂ（配列番号２０によりコードされる）、ＳＬ１．２ＬＢ（配列番号２６によりコードされる）、ＳＬ２（配列番号３によりコードされる）、ＳＬ２Ｌ（配列番号１６によりコードされる）、ＳＬ２Ｂ（配列番号２２によりコードされる）、ＳＬ２ＬＢ（配列番号２８によりコードされる）、ＳＬ３（配列番号５によりコードされる）、ＳＬ３Ｌ（配列番号１８によりコードされる）、ＳＬ３Ｂ（配列番号２４によりコードされる）およびＳＬ２ＬＢ（配列番号２８によりコードされる）として言及される。
ＡＡＶ粒子の組織向性および形質導入効率は、カプシドの表面において暴露されるアミノ酸残基の性質により決定される（Wu et al., J Virol. 2006、80(22):11393-7）。したがって、カプシドタンパク質のアミノ酸を操作することにより、粒子の組織向性を微調整して、また形質導入効率を改善する機会が提供される。しかし、カプシドタンパク質の特定の操作、例えばアミノ酸の置換は、それがカプシドをミスフォールディングするかまたはカプシドを全く形成しないことを引き起こし得る。
本明細書において開示されるのは、野生型ＡＡＶと比較して、形質導入効率が増大したｒＡＡＶバリアントである。いくつかの態様において、形質導入効率は、ＡＡＶ８の効率を低下させるリン酸化部位を取り除くことにより増大する。本明細書において開示されるＳＬ１．２は、リン酸化を妨害する配列修飾を有するｒＡＡＶ８バリアントである。また本明細書において開示されるのは、野生型ＡＡＶと比較して組織向性を改変する、ｒＡＡＶバリアントである。
いくつかの態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶバリアントは、野生型ＡＡＶと比較して増大した、骨格筋における形質導入効率および／またはこれに対する向性を有する。いくつかの態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶバリアントは、野生型ＡＡＶと比較して増大した、心臓組織における形質導入効率および／またはこれに対する向性を有する。いくつかの態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶバリアントは、野生型ＡＡＶと比較して増大した、中枢神経系における形質導入効率および／またはこれに対する向性を有する。いくつかの態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶバリアントは、心臓組織における形質導入効率および／またはそれに対する向性は増大しているが、ＣＮＳ組織における形質導入またはこれに対する向性は増強されていない。いくつかの態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶバリアントは、ＣＮＳ組織における形質導入効率および／またはそれに対する向性は増大しているが、心臓組織における形質導入またはこれに対する向性は増強されていない。
したがって、例えばその組織疾患または状態を有する人物を処置するために、ＣＮＳ、心筋および／または骨格筋組織に遺伝子を送達するために、本明細書において開示されるｒＡＡＶバリアントを使用することは有用である。
したがって、本明細書において提供されるのは、野生型ＡＡＶ８配列（例えば、配列番号７において記載されるような）と比較して、変更（例えば置換）を含む、ｒＡＡＶカプシドタンパク質である。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸置換は、可変領域に位置する。いくつかの態様において、１つ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶカプシド配列中の認識された可変領域または暴露されたループに属する。いくつかの態様において、全てのアミノ酸置換は、ＡＡＶカプシド配列中の認識された可変領域または暴露されたループに属する。本明細書において記載されるようなアミノ酸の任意の位置決めは、配列番号７において記載されるような野生型ＡＡＶ８配列の配列に関するものであることが、理解されるべきである。
バリアントＡＡＶカプシドタンパク質のいくつかの非限定的な例を、表１において提供する。これらのバリアントは、ＳＬ１．２（配列番号１１）、ＳＬ１．２Ｌ（配列番号１５）、ＳＬ１．２Ｂ（配列番号２１）、ＳＬ１．２ＬＢ（配列番号２６）、ＳＬ２（配列番号１２）、ＳＬ２Ｌ（配列番号１７）、ＳＬ２Ｂ（配列番号２３）、ＳＬ２ＬＢ（配列番号２８）、ＳＬ３（配列番号１３）、ＳＬ３Ｌ（配列番号１９）、ＳＬ３Ｂ（配列番号２５）およびＳＬ２ＬＢ（配列番号３１）として言及される。
本明細書において開示されるバリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）カプシドタンパク質のいずれか１つは、本明細書において記載される任意の単一のアミノ酸置換、または本明細書において記載されるアミノ酸置換の任意の組み合わせを含んでもよいことが、理解されるべきである。
例えば、いくつかの態様において、ＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３を、さらに変異させる。いくつかの態様において、特定の組織（例えば、心臓、神経または他の筋肉組織）に対するバリアントの向性を改変するために、ＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３を、さらに変異させる。いくつかの態様において、ＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３のさらなる変異は、目的の組織（例えば、心臓、神経または他の筋肉組織）におけるＳＬ１．２、ＳＬ２、および／またはＳＬ３の取り込みを改善する。いくつかの態様において、ＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３のさらなる変異は、目的のものでない組織（例えば、神経または肝臓組織）におけるＳＬ１．２、ＳＬ２、および／またはＳＬ３の取り込みを低下させる。
いくつかの態様において、アミノ酸Ｇｌｕ５７８からＧｌｙ５９６に広がるカプシド領域を、ＳＬ１．２、ＳＬ２、および／またはＳＬ３においてさらに変異させる。いくつかの態様において、１つのアミノ酸を、ＳＬ１．２、ＳＬ２、および／またはＳＬ３において、アスパラギン５００からイソロイシンへさらに変異させる。いくつかの態様において、ＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３のうちのいずれかに導入されたさらなる変異は、Pulicherla, et al., Mol. Ther. 19:6, 1070-78 (2011)において記載されるものを援用する。いくつかの態様において、Ｌ１．２、ＳＬ２、および／またはＳＬ３におけるアスパラギン５００のイソロイシンへの変異は、肝臓組織向性の低下をもたらす。
いくつかの態様において、ＳＬ１．２におけるアスパラギン５００のイソロイシンへの変異は、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす（「ＳＬ１．２Ｌ」）。いくつかの態様において、ＳＬ１．２におけるアスパラギン５００のイソロイシンへの変異は、配列番号１４の配列を有する核酸によりコードされるＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす。いくつかの態様において、ＳＬ２におけるアスパラギン５００のイソロイシンへの変異は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす（「ＳＬ２Ｌ」）。いくつかの態様において、ＳＬ２におけるアスパラギン５００のイソロイシンへの変異は、配列番号１６の配列を有する核酸によりコードされるＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす。いくつかの態様において、ＳＬ３におけるアスパラギン５００のイソロイシンへの変異は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす（「ＳＬ３Ｌ」）。いくつかの態様において、ＳＬ３におけるアスパラギン５００のイソロイシンへの変異は、配列番号１８の配列を有する核酸によりコードされる配列を有する核酸によりコードされるＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす。
いくつかの態様において、７つのアミノ酸を、ＳＬ１．２においてさらに変異させる：アスパラギン２６３からセリンへ；グリシン２６４からアラニンへ；スレオニン２６５からセリンへ；セリン２６６からスレオニンへ；グリシン２６８の欠失；スレオニン２７０からセリンへ；およびスレオニン２７４からヒスチジンへ（「ＳＬ１．２における７つのアミノ酸変異」）。いくつかの態様において、８つのアミノ酸を、ＳＬ２においてさらに変異させる：アスパラギン２６３からセリンへ；セリン２６４からアラニンへ；スレオニン２６５からセリンへ；セリン２６６からスレオニンへ；グリシン２６８の欠失；セリン２６９からアラニンへ；スレオニン２７０からセリンへ；およびスレオニン２７４からヒスチジンへ（「ＳＬ２における８つのアミノ酸変異」）。いくつかの態様において、８つのアミノ酸を、ＳＬ３においてさらに変異させる：アスパラギン２６３からセリンへ；セリン２６４からアラニンへ；スレオニン２６５からセリンへ；セリン２６６からスレオニンへ；グリシン２６８の欠失；セリン２６９からアラニンへ；スレオニン２７０からセリンへ；およびスレオニン２７４からヒスチジンへ（「ＳＬ３における８つのアミノ酸変異」）。いくつかの態様において、ＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３のいずれかに導入されたさらなる変異は、Albright, et al., Mol. Ther. 26:2, 510-23 (2018)において記載されるものを援用する。いくつかの態様において、ＳＬ１．２における７つのアミノ酸変異、またはＳＬ２および／もしくはＳＬ３における８つのアミノ酸変異は、脳組織向性の低下をもたらす。
いくつかの態様において、ＳＬ１．２における７つのアミノ酸変異は、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす（「ＳＬ１．２Ｂ」）。いくつかの態様において、ＳＬ１．２における７つのアミノ酸変異は、配列番号２０の配列を有する核酸によりコードされるＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす。いくつかの態様において、ＳＬ２における８つのアミノ酸変異は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす（「ＳＬ２Ｂ」）。いくつかの態様において、ＳＬ２における８つのアミノ酸変異は、配列番号２２の配列を有する核酸によりコードされるＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす。いくつかの態様において、ＳＬ３における８つのアミノ酸変異は、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす（「ＳＬ３Ｂ」）。いくつかの態様において、ＳＬ３における８つのアミノ酸変異は、配列番号２４の配列を有する核酸によりコードされるＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす。
いくつかの態様において、８つのアミノ酸を、ＳＬ１．２においてさらに変異させる：アスパラギン５００からイソロイシンへ；アスパラギン２６３からセリンへ；グリシン２６４からアラニンへ；スレオニン２６５からセリンへ；セリン２６６からスレオニンへ；グリシン２６８の欠失；スレオニン２７０からセリンへ；およびスレオニン２７４からヒスチジンへ（「ＳＬ１．２における７つのアミノ酸変異」）。いくつかの態様において、ＳＬ１．２における８つのアミノ酸変異は、肝臓および脳組織への向性の低下をもたらす。いくつかの態様において、ＳＬ１．２における８つのアミノ酸変異は、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす（「ＳＬ１．２ＬＢ」）。いくつかの態様において、ＳＬ１．２における８つのアミノ酸変異は、配列番号２６の配列を有する核酸によりコードされるＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす。
いくつかの態様において、９つのアミノ酸を、ＳＬ２においてさらに変異させる：アスパラギン５００からイソロイシンへ；アスパラギン２６３からセリンへ；セリン２６４からアラニンへ；スレオニン２６５からセリンへ；セリン２６６からスレオニンへ；グリシン２６８の欠失；セリン２６９からアラニンへ；スレオニン２７０からセリンへ；およびスレオニン２７４からヒスチジンへ（「ＳＬ２における９つのアミノ酸変異」）。いくつかの態様において、ＳＬ２における９つのアミノ酸変異は、肝臓および脳組織への向性の低下をもたらす。いくつかの態様において、ＳＬ２における９つのアミノ酸変異は、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす（「ＳＬ２ＬＢ」）。いくつかの態様において、ＳＬ２における９つのアミノ酸変異は、配列番号２８の配列を有する核酸によりコードされるＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす。
いくつかの態様において、９つのアミノ酸を、ＳＬ３においてさらに変異させる：アスパラギン５００からイソロイシンへ；アスパラギン２６３からセリンへ；セリン２６４からアラニンへ；スレオニン２６５からセリンへ；セリン２６６からスレオニンへ；グリシン２６８の欠失；セリン２６９からアラニンへ；スレオニン２７０からセリンへ；およびスレオニン２７４からヒスチジンへ（「ＳＬ３における９つのアミノ酸変異」）。いくつかの態様において、ＳＬ３における９つのアミノ酸変異は、肝臓および脳組織への向性の低下をもたらす。いくつかの態様において、ＳＬ３における９つのアミノ酸変異は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす（「ＳＬ３ＬＢ」）。いくつかの態様において、ＳＬ３における９つのアミノ酸変異は、配列番号３０の配列を有する核酸によりコードされるＡＡＶバリアントタンパク質をもたらす。
本明細書において企図されるのはまた、血清型８以外の血清型のバリアントｒＡＡＶカプシドタンパク質である。いくつかの態様において、本明細書において記載されるアミノ酸変更のいずれか１つは、血清型８以外の血清型のカプシドタンパク質の可変領域であって、ＡＡＶ８の可変領域（例えば、１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、９、１０、１１、１２または１３）に対して相同なものにおけるものである。いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶカプシドは、１つの血清型のｃａｐ遺伝子が、異なる血清型のｒｅｐ遺伝子と共に送達されるという背景において作製してもよい。
組み換えＡＡＶベクター
本明細書において用いられる場合、用語「ベクター」とは、核酸ベクター（例えば、プラスミドまたは組み換えウイルスゲノム)、野生型ＡＡＶゲノム、またはウイルスゲノムを含むウイルスを指し得る。いくつかの態様において、用語「ベクター」とは、ＡＡＶウイルス粒子などのウイルス粒子を指し得る。
野生型ＡＡＶゲノムは、ポジティブまたはネガティブセンスのいずれかである一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）である。ゲノムは、２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）をＤＮＡ鎖の各々の末端において１つずつ、ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐおよびｃａｐをＩＴＲの間に含む。ｒｅｐ ＯＲＦは、ＡＡＶの生活環にとって必要とされるＲｅｐタンパク質をコードする４つのオーバーラップする遺伝子を含む。ｃａｐ ＯＲＦは、カプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするオーバーラップする遺伝子を含み、これらは、一緒に相互作用してウイルスのカプシドを形成する。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、２つの異なる様式においてスプライシングされ得る１つのｍＲＮＡトランスクリプトから翻訳される。より長いまたはより短いイントロンが切り取られて、２つのｍＲＮＡのアイソフォーム：約２．３ｋｂ長および約２．６ｋｂ長のｍＲＮＡアイソフォームの形成をもたらす。カプシドは、約６０の個々のカプシドタンパク質サブユニットの超分子アセンブリーを、ＡＡＶゲノムを保護することができる無エンベロープのＴ－１正二十面体格子へと形成させる。成熟ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（それぞれ約８７、７３および６２ｋＤａの分子質量）を、約１：１：１０の比で含んでなる。
組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子は、組み換え核酸ベクター（本明細書において以後、「ｒＡＡＶベクター」として言及される）を含んでもよく、これは、最小限、以下を含んでもよい：（ａ）導入遺伝子をコードする配列を含む、１つ以上の異種核酸領域；および（ｂ）対象のゲノム中への異種核酸領域の組み込み（任意に、発現を促進する配列を含む１つ以上の核酸領域と共に）を促進する配列を含む、１つ以上の領域。いくつかの態様において、対象のゲノム中への異種核酸領域の組み込み（任意に、発現を促進する配列を含む１つ以上の核酸領域と共に）を促進する配列は、１つ以上の核酸領域（例えば、異種核酸領域）に隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列（例えば、野生型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列）である。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ核酸ベクターは、プロモーターに作動的に連結された、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含む１つ以上の導入遺伝子を含み、ここで、１つ以上の導入遺伝子は、各々の側において、ＩＴＲ配列に隣接する。いくつかの態様において、核酸ベクターは、プロモーターに作動的に連結された、本明細書において記載されるようなＲｅｐタンパク質をコードする領域をさらに含む（これは、ＩＴＲに隣接する領域中に、または当該領域または核酸の外側のいずれかに含まれる）。ＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）に由来するものであっても、または１つより多くの血清型に由来するものであってもよい。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型に由来する。いくつかの態様において、本明細書において提供される第１の血清型は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ８血清型ではない。いくつかの態様において、第１の血清型のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５またはＡＡＶ６に由来する。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５またはＡＡＶ６に由来する。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、カプシドと同じ血清型である（例えば、ＡＡＶ６のＩＴＲ配列およびＡＡＶ６カプシドなど）。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶｒｈ．１０血清型に由来する。
いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶカプシドタンパク質のうちのいずれか１つを含有する組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）粒子は、血清型８のＩＴＲおよび／またはｒｅｐ ＯＲＦを含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイピングされたｒＡＡＶ粒子であって、これは、（ａ）血清型８の背景において作製された本明細書において記載される修飾を含有するカプシドタンパク質を含んでなるカプシド、および（ｂ）別の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０）からのＩＴＲを含む核酸ベクターを含む。
本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ調製物中の粒子は、任意の誘導体またはシュードタイプ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２／１、２／５、２／８、２／９、３／１、３／５、３／８または３／９）を含む任意のＡＡＶ血清型のものであってよい。本明細書において用いられる場合、ｒＡＡＶ ｒＡＡＶ粒子の血清型は、組み換えウイルスのカプシドタンパク質の血清型を指す。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ６またはｒＡＡＶ９である。誘導体またはシュードタイプの非限定的な例として、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２－ＡＡＶ３ハイブリッド、ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＨＡＥ１／２、ＡＡＶクローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２（Ｙ－＞Ｆ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶＭ４１およびＡＡＶｒ３．４５が挙げられる。かかるＡＡＶ血清型および誘導体／シュードタイプ、ならびにかかる誘導体／シュードタイプを製造する方法は、当該分野において公知である（例えば、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.を参照）。特定の態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれかのカプシドは、ＡＡＶｒｈ．１０血清型のものである。いくつかの態様において、カプシドは、ＡＡＶ２／６血清型のものである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイピングされたｒＡＡＶ粒子であり、これは、（ａ）１つの血清型（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３）からのＩＴＲを含むｒＡＡＶベクター、および（ｂ）別の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０）に由来するカプシドタンパク質を含んでなるカプシドを含む。シュードタイピングされたｒＡＡＶベクターを生成してこれを用いるための方法は、当該分野において公知である（例えば、Duan et al., J. Virol.、75:7662-7671、2001；Halbert et al., J. Virol.、74:1524-1532、2000；Zolotukhin et al., Methods、28:158-167、2002；およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet.、10:3075-3081、2001を参照）。
ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含むプラスミドは、当該分野において公知であり、市販されている（例えば、Vector Biolabs, Philadelphia, PA； Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MAから入手可能な製品およびサービス；ならびにGene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7；およびCurtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine（商標）. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201（著作権）Humana Press Inc. 2003. Chapter 10. Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski；米国特許第５，１３９，９４１号および同第５，９６２，３１３号を参照；これらの全ては本明細書において参考として援用される）。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含むプラスミドであるｐＴＲ－ＵＦ－１１プラスミド骨格を含む。このプラスミドは、American Type Culture Collectionから市販されている（ATCC MBA-331）。
本明細書において提供されるのは、バリアント組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）粒子である。いくつかの態様において、粒子は、空の粒子（例えば、目的の遺伝子を含む核酸ベクターを含まないもの）。いくつかの態様において、ＡＡＶ８粒子は、目的の遺伝子を含む核酸ベクターを含む。本明細書において用いられる場合、「目的の遺伝子」とは、目的のＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子である。
したがって、いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、目的の遺伝子の発現を促進する配列を含む１つ以上の領域、例えば核酸に対して作動的に連結されている発現制御配列を含む。多数のかかる配列は、当該分野において公知である。発現制御配列の非限定的な例として、プロモーター、インスレーター、サイレンサー、応答エレメント、イントロン、エンハンサー、開始部位、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）終結シグナル、およびポリ（Ａ）シグナルが挙げられる。かかる制御配列の任意の組み合わせは、本明細書において企図される（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、目的の遺伝子のコード配列に対して作動的に連結されて目的の遺伝子の発現を促進するプロモーターを含む。「プロモーター」とは、本明細書において用いられる場合、そこにおいて核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸の制御領域を指す。プロモーターは、それが制御する核酸配列の転写を駆動し、したがって、それは、典型的には、遺伝子の転写開始部位において、またはその近傍に位置する。プロモーターは、例えば、１００～１０００ヌクレオチドの長さを有していてもよい。いくつかの態様において、プロモーターは、核酸、または核酸の配列（ヌクレオチド配列）に作動的に連結されている。いくつかの態様において、１つ以上のプロモーターは、異種の核酸中のコードヌクレオチド配列に作動的に連結されていてもよい。プロモーターは、配列に対してプロモーターが、プロモーターが制御および／または調節する（例えば、その配列の転写開始および／または発現を制御する（「駆動する」）ような正確な機能的な位置および配向にある場合に、それが制御する核酸の配列に「作動的に連結されている」とみなされる。。プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターであってよい。
例えば、異なる強度の構成的プロモーターを用いることができる。本明細書において記載される核酸ベクターは、転写を促進することにおいて一般に活性である、ウイルスプロモーターまたは哺乳動物遺伝子からのプロモーターなどの１つ以上の構成的プロモーターを含んでもよい。構成的ウイルスプロモーターの非限定的な例として、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ａｄ Ｅ１Ａサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられる。構成的哺乳動物プロモーターの非限定的な例として、β－アクチンプロモーター（例えば、ニワトリβ－アクチンプロモーター）およびヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーターにより例示されるような多様なハウスキーピング遺伝子プロモーターが挙げられる。いくつかの態様において、キメラウイルス／哺乳動物プロモーターは、キメラＣＭＶ／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ、ＣＢまたはＣＡＧ）プロモーターを含んでもよい。いくつかの態様において、短縮化またはトランケーションされたプロモーターが用いられる。
誘導性プロモーターおよび／または調節エレメントもまた、目的のタンパク質またはポリペプチドの適切な発現レベルを達成するために企図され得る。好適な誘導性プロモーターの非限定的な例として、チトクロームＰ４５０遺伝子、ヒートショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、およびエストロゲン遺伝子プロモーターなどのホルモン誘導性遺伝子などの遺伝子からのものが挙げられる。誘導性プロモーターの別の例は、テトラサイクリンに対して応答性であるｔｅｔＶＰ１６プロモーターである。
組織特異的プロモーターおよび／または調節エレメントもまた、本明細書において企図される。いくつかの態様において、プロモーターは、組織特異的プロモーターであってよい。「組織特異的プロモーター」とは、本明細書において用いられる場合、特定の型の組織、例えば心臓においてのみ機能することができるプロモーターを指す。したがって、「組織特異的プロモーター」は、他の型の組織においては導入遺伝子の発現を駆動することはできない。いくつかの態様において、本明細書において開示されるようなバリアントｒＡＡＶ粒子を、また当該バリアントｒＡＡＶ粒子と同じ細胞、組織または臓器を標的とするプロモーターと組み合わせることは、有益であり得る。例えば、心臓への向性が改善したバリアントのためには、心臓特異的な発現を達成するための心筋トロポニンＴプロモーターの使用が適切であろう。
本開示に従って用いることができるプロモーターは、いくつかの態様において、対象の心臓において導入遺伝子の発現を駆動することができる任意のプロモーターを含んでもよい。いくつかの態様において、本開示に従って用いることができるプロモーターは、心臓に限定されたプロモーターである。例えば、プロモーターは、心筋トロポニンＣ、心筋トロポニンＩ、および心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）から選択される心臓に限定されたプロモーターである。
あるいは、プロモーターは、限定することなく、以下の遺伝子のうちの１つからのプロモーターであってよい：α－ミオシン重鎖遺伝子、６－ミオシン重鎖遺伝子、ミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ－２ｖ）遺伝子、ミオシン軽鎖２ａ遺伝子、ＣＡＲＰ遺伝子、心筋α－アクチン遺伝子、心筋ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体遺伝子、ＡＮＦ、心筋トロポニンＣ、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、心筋小胞体Ｃａ－ＡＴＰａｓｅ遺伝子、骨格α－アクチン；またはＭＬＣ－２ｖ遺伝子に由来する人工の心臓プロモーター。
いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶベクターは、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナルをさらに含む。真核生物のｍＲＮＡは、典型的には、前駆体ｍＲＮＡとして転写される。前駆体ｍＲＮＡは、プロセッシングされて成熟ｍＲＮＡを生じ、これは、ポリアデニル化プロセスを含む。ポリアデニル化のプロセスは、遺伝子の転写が終結するとともに開始する。新たに作られた前駆体ｍＲＮＡの最も３’側のセグメントが、初めにタンパク質のセットにより切断される。これらのタンパク質は、次いで、ＲＮＡの３’末端においてポリ（Ａ）テイルを合成する。切断部位は、典型的には、ポリアデニル化シグナル、例えばＡＡＵＡＡＡを含む。ポリ（Ａ）テイルは、ｍＲＮＡの核輸送、翻訳および安定性のために重要である。
いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶベクターは、少なくとも、５’から３’の順に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、第１の導入遺伝子に作動的に連結されているプロモーター、第２の導入遺伝子に作動的に連結されているＩＲＥＳ、ポリアデニル化シグナル、および第２のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、環状である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、直鎖状である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、二本鎖である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補的ｒＡＡＶベクターである。本明細書において記載される任意のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６カプシドまたは任意の他の血清型（例えば、ＩＴＲ配列と同じ血清型の血清型）などのウイルスのカプシドにより、カプシド形成されていてもよい。
目的のタンパク質は、検出可能マーカーまたは治療用タンパク質であってよい。検出可能マーカーは、可視化することができる（例えば、裸眼を用いて、または顕微鏡下において）分子であってよい。いくつかの態様において、検出可能マーカーは、蛍光分子、生物発光分子、または、色を提供する分子（例えば、β－ガラクトシダーゼ、β－ラクタマーゼ、β－グルクロニダーゼおよびスフェロイデノン（spheriodenone））である。いくつかの態様において、検出可能マーカーは、蛍光タンパク質またはその機能的ペプチドまたは機能的ポリペプチドである。
いくつかの態様において、目的の遺伝子は、治療用タンパク質をコードし、「治療用遺伝子」として言及される。治療用遺伝子は、それが送達される細胞、組織または臓器において治療効果を提供することができる。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、抗体、ぺプチボディー、増殖因子、凝固因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、血栓溶解剤、酵素、骨形成性タンパク質、ヌクレアーゼまたは遺伝子編集のために用いられる他のタンパク質、Ｆｃ－融合タンパク質、抗凝固剤、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたは遺伝子編集のための他の核酸もしくはタンパク質をコードする。いくつかの態様において、目的の遺伝子は、治療用ＲＮＡ、例えば、小分子干渉ＲＮＡをコードする。
いくつかの態様において、治療用遺伝子（例えば、目的の遺伝子）は、心保護的遺伝子である。ヘムオキシゲナーゼ－１を含むいくつかの心保護的遺伝子が知られている。このタンパク質は、酸化促進剤ヘムを分解して、一酸化炭素および抗酸化剤ビリルビンを生じ、虚血／再灌流傷害からの心筋の保護を与える（Franz et al., Circ. Res. 73:629-638, 1993）。炎症性疾患において、ＨＯ－１は、細胞保護的遺伝子として増加する。しかし、それは、通常は、炎症を停止させるには不十分な量におけるものである。警戒（vigilant）ベクターは、還元された酸素がＨＯ－１の必要性を示す場合に、増幅された量のＨＯ－１を提供することができる。心保護的遺伝子の別の例は、スーパーオキシドジスムターゼであり、これは、虚血－再灌流の間に生じるスーパーオキシドラジカルから心臓組織を保護する（Chen et al., Circulation 94:11412-11417, 1996；およびWoo et al., Circulation 98:11255-11260, 1998）。心臓の変性および心不全などの他の心疾患状態からの保護的効果を提供する遺伝子もまた、本発明のベクターにおいて用いてよい。心臓の機能を改善する遺伝子の一例は、ホスホランバン（ＰＬＮ）である。ＰＬＮ遺伝子生成物は、各々の心拍の強さを調節し、心不全において機能不全となることが知られている（Zvaritch et al., J. Biol. Chem. 275:14985-14991, 2000）。治療有効レベルの保護を提供する任意の好適な心保護的遺伝子を、本発明のベクター中で用いてよい。
いくつかの態様において、心保護的遺伝子は、心保護におけるシグナル伝達経路のために重要な遺伝子である。いくつかの態様において、心保護的遺伝子は、以下のいずれか１つである：protectomiRs（例えば、microRNA 125b*）、ＺＡＣ１転写因子、ホスホランバン（ＰＬＮ）、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）－２および誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）などの炎症促進性遺伝子、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）－１、細胞外スーパーオキシダーゼジスムターゼおよびマンガンスーパーオキシダーゼジスムターゼ（ｅｃ－ＳＯＤおよびＭｇ－ＳＯＤ）などの抗酸化酵素、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）－１および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの増殖因子、Ｂｃｌ－２およびＢｃｌ－ｘＬなどの抗アポトーシス性タンパク質、ＦａｓＬ、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、カスパーゼ－３およびｐ５３などのアポトーシス促進性タンパク質、ならびにＴＧＦベータなどの血管新生促進性遺伝子、スフィンゴシンキナーゼ１（ＳＰＫ１）、カスパーゼ動員ドメインを有するアポトーシスリプレッサー（apoptosis repressor with caspase recruitment domain：ＡＲＣ）、野生型心筋トロポニンＴ、野生型心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ、ミオシン軽鎖（調節性または必須のいずれか）、ＰＩ３Ｋ-Ａｋｔ、および／またはＳ１００バリアント。
本開示により用いてもよいＳ１００ファミリータンパク質として、限定することなく、Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ３、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ５、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１００Ａ７（例えば、ソリアシン）、Ｓ１００Ａ８（例えば、カルグラニュリンＡ）、Ｓ１００Ａ９（例えば、カルグラニュリンＢ）、Ｓ１００Ａ１０、Ｓ１００Ａ１１、Ｓ１００Ａ１２（例えば、カルグラニュリンＣ）、Ｓ１００Ａ１３、Ｓ１００Ａ１４、Ｓ１００Ａ１５（例えば、コエブネリシン（koebnerisin））、Ｓ１００Ａ１６、Ｓ１００Ｂ、Ｓ１００Ｐ、およびＳ１００Ｚ、またはそのバリアントが挙げられる。
いくつかの態様において、Ｓ１００ファミリータンパク質は、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１（Ｓ１００Ａ１）であってもよい。いくつかの態様において、Ｓ１００Ａ１は、心臓Ｓ１００Ａ１（ｃＳ１００Ａ１）またはそのバリアントである。ｃＳ１００Ａ１タンパク質は、心筋の収縮性の調節因子である。ｃＳ１００Ａ１タンパク質レベルは、肺高血圧症のモデルにおいて右室肥大した組織において低下する。さらに、Ｓ１００Ａ１は、ＭＹＨ７、ＡＣＴＡ１およびＳ１００Ｂを含む肥大症遺伝子のアルファ１アドレナリン作動性の刺激を阻害する点において、心肥大の根底にある遺伝プログラムの調節因子である。
心筋細胞において、Ｓ１００Ａ１は、リアノジン受容体２（ＲＹＲ２）、筋小胞体（sarco/endoplasmic reticulum）のＣａ２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）、タイチンおよびミトコンドリアＦ１－ＡＴＰａｓｅの活性の調節を通して、カルシウムにより制御されるＳＲ、サルコメアおよびミトコンドリアの機能のネットワークを調節する。結果として、Ｓ１００Ａ１の発現が増大した心筋細胞および心臓は、収縮および弛緩の能力の増大を示し、これは、ＳＲのＣａ２＋負荷およびその後の収縮期Ｃａ２＋放出の増強に加えて、弛緩期のＳＲのＣａ２＋漏出の減少およびＣａ２＋再隔離の増強からもたらされる、Ｃａ２＋過渡振幅の改善の結果である。同時に、Ｓ１００Ａ１は、ミトコンドリアの高エネルギーリン酸産生を増大し、それにより、エネルギー供給を、心筋細胞のＣａ２＋ターンオーバーの増強によるアデノシン５’－三リン酸（ＡＴＰ）要求の増大と協調させる。心筋細胞におけるＳ１００Ａ１発現の低下は、収縮機能の低下と関連し、このことは、このタンパク質の病態生理学的重要性を実証している。
いくつかの態様において、開示されるｒＡＡＶベクターのうちのいずれかのポリヌクレオチドのＳ１００Ａ１ ｃＤＮＡ（導入遺伝子）配列は、天然に存在するヒト由来のＳ１００Ａ１配列に対して、１００％の同一性を有する。他の態様において、Ｓ１００Ａ１ ｃＤＮＡ配列は、天然に存在するＳ１００Ａ１配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、または少なくとも約９９．９％の同一性を有する。
いくつかの態様において、Ｓ１００Ａ１ ｃＤＮＡ配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。他の態様において、Ｓ１００Ａ１ ｃＤＮＡ配列は、イヌ細胞における発現のためにコドン最適化される。
本開示の側面は、アポトーシス阻害剤（例えば、抗アポトーシス剤）をコードする遺伝子の送達を含む、組成物および方法を提供する。アポトーシス阻害剤の説明例として、アデノウイルスからのｆｉｎｋ、ｐ３５、ｃｒｍＡ、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ＸＬ、Ｍｃｌ－１、Ｅ１Ｂ－１９Ｋ、ならびにアポトーシス促進剤のアンタゴニスト（例えば、アンチセンス、リボザイム、抗体など）が挙げられる。いくつかの態様において、アポトーシス阻害剤は、心臓のカスパーゼ動員ドメインを有するアポトーシスリプレッサー（ＡＲＣ）、またはそのバリアントである。他の態様において、アポトーシス阻害剤は、心臓ＡＲＣまたはそのバリアントである。いくつかの態様において、Ｓ１００ファミリータンパク質とアポトーシス阻害剤とを、別々に送達することが望ましい場合がある。ある態様において、Ｓ１００ファミリータンパク質をコードする遺伝子は、１つ以上の小分子アポトーシス阻害剤と、同時に、または連続的に送達される。他の例示的な小分子アポトーシス阻害剤として、ｃ－Ｍｙｃ阻害剤、Ｂａｘ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｔＢｉｄ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、およびアポトーシス促進性のＢＣＬ－２ファミリーメンバーの阻害剤が挙げられる。
ｃＡＲＣは、筋原細胞においてほぼ排他的に発現される、アポトーシス調節タンパク質である。それは、カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を含み、これを通して、それは、いくつかのイニシエーターカスパーゼの活性化を遮断する。ＡＲＣはまた、アポトーシスと関連するカスパーゼ非依存的なイベントを遮断する。急性の虚血およびその後の心室リモデリングにより引き起こされるアポトーシスは、心不全のメディエーターとして関連付けられている。虚血後心不全は複数の原因を有し得るが、最近の関心は、アポトーシスまたはプログラム細胞死の寄与を理解することに対して向けられてきている。アポトーシスは、ミトコンドリア膜および筋細胞膜の保存、核クロマチン凝縮、および炎症応答を引き起こさないマクロファージまたは近傍の細胞による食作用により特徴づけられる。アポトーシスの活性化は、不活性な前駆体として合成されてタンパク質分解によりそれらの活性化形態へと切断される、システインプロテアーゼのファミリーであるカスパーゼを含む機構を通して起こることが知られている。ＡＲＣは、カスパーゼを遮断することにより、アポトーシスの活性化を遮断することができる。
特定の態様において、ｃＡＲＣ ｃＤＮＡ配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。他の態様において、ｃＡＲＣ ｃＤＮＡ配列は、イヌ細胞における発現のためにコドン最適化される。
いくつかの態様において、目的の遺伝子は、アンチセンス分子をコードする。心保護効果を付与する多数のアンチセンス分子が公知であり、これは、アンギオテンシンＩＩの１型受容体に対するアンチセンス（Yang et al., Circulation 96:922-926, 1997；およびYang et al., Circ. Res. 83:552-559, 1998）、アドレナリンベータ－１受容体に対するアンチセンス（Chen et al., Pharmacol. Exp. Ther. 294:722-727, 2000)、および虚血再灌流からラットの心臓を保護することが示されているアンジオテンシン変換酵素に対するアンチセンス（Chen et al., Pharmacol. Exp. Ther. 294:722-727, 2000）を含む。いくつかの態様において、アンチセンス分子は、アンギオテンシンＩＩの１型受容体に対するアンチセンス、アドレナリンベータ－１受容体に対するアンチセンス、またはアンジオテンシン変換酵素に対するアンチセンスである。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）粒子中に含まれる核酸ベクターは、以下の１つ以上を含む：（ａ）目的の遺伝子を含む１つ以上の異種核酸領域、および（ｂ）１つ以上の核酸領域（例えば、異種核酸領域）に隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む１つ以上の領域（例えば、野生型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列）。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子中の核酸ベクターは、異種核酸領域（例えば、プロモーター）の発現を促進する制御配列を含む１つ以上の核酸領域を含む。いくつかの態様において、組み換えＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ８）粒子中の核酸ベクターは、対象のゲノム中への異種核酸領域の組み込み（任意に、発現を促進する配列を含む１つ以上の核酸領域と共に）を促進する配列を含む１つ以上の核酸領域を含む。
いくつかの態様において、ＡＡＶは、本発明により修飾されたｃａｐ遺伝子を含む完全に構成されたＡＡＶ、またはトランスで供給されたカプシドタンパク質と共に導入遺伝子を担持する、本発明により修飾されたＡＡＶカプシドである。いくつかの態様において、開示される修飾カプシドタンパク質を含む空のカプシドは、形質導入をさらに増強するために、充填されたＡＡＶカプシドの使用の前に前処置するために用いることができる。
表１において記載されるのは、例示的な本開示のｒＡＡＶカプシドタンパク質または関連する遺伝子配列である。表１において示されるｒＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１～１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１として記載されるアミノ酸配列を含む。
本開示のｒＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１１～１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１として記載される配列に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、または少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ配列を含んでもよい。
表１において示されるｒＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１、３、５、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８および３０として記載される配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。本開示のｒＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１、３、５、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８および３０として記載される配列に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、または少なくとも約９９．９％の同一性を有する核酸配列によりコードされていてもよい。
現実の問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、導入遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを慣用的に用いて決定することができる。網羅的配列アラインメントとしても言及される、問い合わせ配列（例えば、本開示の配列）と対象配列との間の最良の全体的な一致を決定するための好ましい方法は、FASTDBまたはblastnコンピュータープログラムを用いて、Brutlagら（Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)）のアルゴリズムに基づいて、決定することができる。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列は、いずれもヌクレオチド配列であるか、またはいずれもアミノ酸配列である。前記網羅的配列アラインメントの結果は、パーセント同一性として表される。FASTDBアミノ酸アラインメントにおいて用いられる好ましいパラメーターは、以下のとおりである：Matrix=PAM 0、k-tuple＝２、Mismatch Penalty＝１、Joining Penalty＝２０、Randomization Group Length＝０、Cutoff Score＝１、Window Size＝配列の長さ、Gap Penalty＝５、Gap Size Penalty＝０．０５、Window Size＝５００または対象アミノ酸配列の長さのうちいずれか短い方。ヌクレオチドがマッチ／アラインメントするか否かは、FASTDB配列アラインメントの結果により決定される。このパーセンテージを、次いで、特定されるパラメーターを用いて上のFASTDBプログラムにより計算されるパーセント同一性から減算し、最終的なパーセント同一性スコアに到達する。この最終的なパーセント同一性スコアは、本開示の目的のために用いられるものである。問い合わせ配列と比較して５’および／または３’末端においてトランケーションされた対象配列について、パーセント同一性は、問い合わせ配列に対して５’にまたは３’に位置する問い合わせ配列のヌクレオチドであって、対応する対象ヌクレオチドとマッチ／アラインメントしないものの数を、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして計算することにより、補正される。
いくつかの態様において、開示されるｒＡＡＶアミノ酸ベクター配列のうちのいずれかは、配列番号１１～１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１のうちのいずれか１つの配列と比較して、５’または３’末端においてトランケーションを含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターのうちのいずれかは、配列番号１１～１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１のうちのいずれか１つの配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１８より多くのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、開示されるｒＡＡＶ核酸ベクター配列のうちのいずれかは、配列番号１、３、５、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８および３０のうちのいずれか１つの配列と比較して、５’または３’末端においてトランケーションを含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターのうちのいずれかは、配列番号１、３、５、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８および３０のうちのいずれか１つの配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１８より多くの核酸が異なる核酸配列によりコードされる。
ｒＡＡＶ粒子を作製する方法
本明細書においてさらに提供されるのは、ｒＡＡＶ粒子を作製する方法である。ＲＡＡＶ粒子は、ウイルスのカプシド、および、ウイルスのカプシドによりカプシド形成された、本明細書において記載されるようなｒＡＡＶベクターを含む。ｒＡＡＶ粒子および核酸ベクターを生成する多様な方法は、当該分野において公知であり、市販されている（例えば、Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167；およびU.S. Patent Publication Numbers US20070015238 and US20120322861、これらは、本明細書において参考として援用される；ならびにＡＴＣＣおよびCell Biolabs、Inc.から入手可能なプラスミドおよびキットを参照）。いくつかの態様において、目的の遺伝子を含むベクター（例えばプラスミド）を、例えばｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするもの）ならびにｃａｐ遺伝子（本明細書において記載されるような修飾されたＶＰ領域を含むＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするもの）を含む１つ以上のヘルパープラスミドと組み合わせて、核酸ベクターがカプシド内部にパッケージングまたはカプシド形成され、その後精製されるように、ヘルパーまたは産生株細胞と称される組み換え細胞中に遺伝子導入してもよい。
哺乳動物ヘルパー細胞の非限定的な例として、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞またはＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５１（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５０（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１０（商標）、またはＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－６１（商標））が挙げられる。昆虫ヘルパー細胞の非限定的な例は、Ｓｆ９細胞である（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１７１１（商標）を参照）。ヘルパー細胞は、Ｒｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質をコードするｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含んでもよい。いくつかの態様において、パッケージングは、in vitro（例えば、細胞の外側）で行われる。
いくつかの態様において、異種遺伝子を含む核酸ベクター（例えばプラスミド）１つ以上のヘルパープラスミド、例えば、第１の血清型のｒｅｐ遺伝子、および同じ血清型または異なる血清型のｃａｐ遺伝子を含むものと組み合わされて、ｒＡＡＶ粒子がパッケージングされるように、ヘルパー細胞中に遺伝子導入される。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む第１のヘルパープラスミド、および以下のヘルパー遺伝子：Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、およびＶＡ遺伝子のうちの１つ以上を含む第２のヘルパープラスミドを含む。明確性のために、ヘルパー遺伝子とは、ヘルパータンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡをコードする遺伝子である。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作製する方法は、当該分野において公知であり、市販されている（例えば、PlasmidFactory, Bielefeld, Germany製のｐＤＦ６、ｐＲｅｐ、ｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド；Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MAから入手可能な他の製品およびサービス；ｐｘｘ６；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adeno associated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760；Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.；Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol. 7, 839-850；Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capside Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303；およびMoullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188を参照）。特定の血清型についての野生型ＡＡＶコード領域をコードするプラスミドもまた、公知であり、入手可能である。例えば、Addgeneカタログ＃37825-AAV8.Tは、ｒｅｐおよび野生型ＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子を含むヘルパープラスミドを含む（https://www.addgene.org/37825/#37825-AAV8）。
ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含むプラスミドは、当該分野において公知であり、市販されている（例えば、Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MAから入手可能な製品およびサービス；ならびにGene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7；およびCurtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine（商標）. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201（著作権）Humana Press Inc. 2003. Chapter 10. Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski；米国特許第５，１３９，９４１号および同第５，９６２，３１３号を参照；これらの全ては本明細書において参考として援用される）。
ＡＡＶ血清型１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３の配列についてのGenebank参照番号は、特許公開ＷＯ２０１２０６４９６０において列記され、これは本明細書においてその全体において参考として援用される。
ｒＡＡＶ粒子生成方法の非限定的な方法を、次に説明する。所望されるＡＡＶ血清型についてのｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦ、ならびにアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子を、それらのネイティブのプロモーターの転写制御下においてを含む、１つ以上のヘルパープラスミドを、生成するか取得する。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、ならびに任意にアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子のうちの１つ以上を、それらのネイティブのプロモーターの転写制御下において含む。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、所望されるＡＡＶ血清型についてのｃａｐ ＯＲＦ（および任意にｒｅｐ ＯＲＦ）、ならびにアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子を、それらのネイティブのプロモーターの転写制御下において含む。ｃａｐ ＯＲＦはまた、本明細書において記載されるような修飾されたカプシドタンパク質を生成するために、１つ以上の修飾を含んでもよい。例として、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）を、ＣａＰＯ４媒介性トランスフェクション、脂質またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー性分子を介して、ヘルパープラスミドおよび核酸ベクターを含有するプラスミドにより、遺伝子導入する。ＨＥＫ２９３細胞を、次いで、少なくとも６０時間にわたりインキュベートして、ｒＡＡＶ粒子を生成させる。あるいは、ＨＥＫ２９３細胞を、上記の方法を介して、１つ以上の目的の遺伝子を含有するＡＡＶ－ＩＴＲ、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子を含むヘルパープラスミドにより遺伝子導入し、ヘルパーウイルスにより共導入する。ヘルパーウイルスとは、ＡＡＶの複製を可能にするウイルスである。ヘルパーウイルスの例は、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスである。
あるいは、別の例において、Ｓｆ９ベースの産生株安定細胞株を、核酸ベクターを含む単一の組み換えバキュロウイルスに感染させる。さらなる代替として、別の例において、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞株を、核酸ベクターを含むＨＳＶ、および任意に本明細書において記載されるようなｒｅｐおよびｃａｐのＯＲＦならびにアデノウイルスのＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）およびＥ４遺伝子を、それらのネイティブのプロモーターの転写制御下において含む１つ以上のヘルパーＨＳＶに感染させる。ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、またはＳｆ９細胞を、次いで、少なくとも６０時間にわたりインキュベートして、ｒＡＡＶ粒子を生成させる。ＲＡＡＶ粒子を、次いで、当該分野において公知であるかまたは本明細書において記載される任意の方法を用いて、例えば、イオジキサノール段階的勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿により、精製してもよい。
ヘルペスウイルスベースの系を用いたＡＡＶのラージスケール生成のための方法もまた、公知である。例えば、Clementら（Hum Gene Ther. 2009, 20(8):796-806）を参照。中和性の抗ＡＡＶ抗体に対してより耐性であり得るエキソソーム関連ＡＡＶを生成する方法もまた、もまた、公知である（Hudry et al., Gene Ther. 2016, 23(4):380-92；Macguire et al., Mol Ther. 2012, 20(5):960-71）。
シュードタイピングされたｒＡＡＶベクターを生成してこれを用いるための方法もまた、当該分野において公知である（例えば、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671、2001；Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000；Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002；およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照）。
組成物
本開示は、開示されるｒＡＡＶ粒子または調製物のうちの１つ以上を含む組成物に対して向けられる。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ調製物は、第１の血清型（例えば、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９）のＩＴＲを含有するｒＡＡＶベクター、およびｒＡＡＶベクターにカプシド形成するカプシドタンパク質を含む、ｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、第１の血清型（例えば、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９）のものである。いくつかの態様において、調製物は、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含有するｒＡＡＶベクターを用いて調製された調製物と比較して、少なくとも４倍高い形質導入効率（例えば、Ｈｕｈ７などのヒト肝細胞癌細胞株において）を有する。
本明細書において記載される場合、かかる組成物は、医薬用の賦形剤、バッファーまたは希釈剤をさらに含んでもよく、ex vivoでの宿主細胞への、またはin situでの動物への、および特にヒトへの投与のために処方してもよい。かかる組成物は、さらに任意に、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子を含んでもよく、それを必要とするヒト対象の細胞、組織、臓器または身体への投与のために別段に処方してもよい。かかる組成物は、多様な治療における、例えば、ペプチド欠損、ポリペプチド欠損、ペプチド過剰発現、ポリペプチド過剰発現などの状態の、寛解、予防、および／または処置などにおける使用のために処方されてもよく、これは、例えば本明細書において記載されるような疾患または障害をもたらす状態を含む。
ｒＡＡＶ粒子の使用を促進するために、多様な処方物が、開発されてきた。例えば、ｒＡＡＶ粒子の注射可能な水溶液の投与のために、溶液を、必要であれば好適に緩衝化してもよく、液体の希釈剤を、初めに十分な食塩水またはグルコースで等張化してもよい。いくつかの態様において、本明細書において提供されるような組成物は、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つを複数含む。いくつかの態様において、組成物は、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ粒子の１つより多くを複数含む。いくつかの態様において、「投与すること」または「投与」は、薬理学的に有用な様式において材料を対象に提供することを意味する。
したがって、いくつかの態様において、バリアントｒＡＡＶ粒子の組成物は、薬学的に受入可能なキャリアを含む。用語「キャリア」とは、それと共にｒＡＡＶ粒子が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。かかる医薬用キャリアは、無菌の液体（例えば、水、油脂、食塩水溶液、水性デキストロースおよびグリセロール溶液）、懸濁剤、保存剤（例えば、メチル－、エチル－、およびプロピル－ヒドロキシ－ベンゾエート）、ならびにｐＨ調整剤（無機および有機の酸および塩基など）であってよい。いくつかの態様において、キャリアは、緩衝化食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝化食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水）を含む。ＵＳＰグレードのキャリアおよび賦形剤は、ｒＡＡＶ粒子のヒト対象への送達のために、特に有用である。かかる組成物は、さらに任意に、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子を含んでもよく、あるいは、それを必要とする対象の細胞、組織、臓器または身体への投与のために、別段に処方されてもよい。かかる組成物を作製するための方法は、周知であり、例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、第２２版、Pharmaceutical Press（２０１２年）において見出すことができる。
いくつかの態様において、本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つを含む組成物は、０．０１４％のTween 20を添加した平衡化塩溶液（ＢＳＳ）（ポリソルベート20）を含む。
典型的には、組成物は、治療剤（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のうちの少なくとも約０．１％またはそれより多くを含んでもよいが、活性成分のパーセンテージは、変化してもよく、便利に、全処方物の重量または容積の約１または２％～約７０％または８０％またはそれより多くの間であってよい。当然のことながら、各々の治療上有用な組成物中の治療剤（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の量は、化合物の任意の所与の単位用量において好適な投与量が得られるであろう方法において調製してもよい。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期間、ならびに他の薬理学的配慮などの要因が、かかる医薬処方物を調製する当業者により企図され、したがって、多様な投与量および処置レジメンが望ましい場合がある。
注射可能な使用のために好適なｒＡＡＶ粒子組成物の薬学的形態として、無菌の水溶液または分散が挙げられる。いくつかの態様において、形態は、無菌であり、容易な通針性（syringability）が存在する程度まで液体である。いくつかの態様において、形態は、製造および貯蔵の条件下において安定であり、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保存される。いくつかの態様において、形態は、無菌である。キャリアは、例えば、水、食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および／または植物油を含む、溶媒または分散媒であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
対象への投与のための組成物の調製は、当該分野において公知である。例えば、１投与量を、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解して、１０００ｍｌの皮下点滴液に添加するか、または提案される注入の部位において注射してもよい（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１５版、1035～1038頁および1570～1580頁を参照）。いくつかの投与量のバリエーションは、処置されている対象の状態に依存して、必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象のために適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトの投与のために、調製物は、例えば、FDA Office of Biologicsの標準により必要とされるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性および純度の標準を満たすべきである。
心臓疾患のためのｒＡＡＶ遺伝子治療
本開示のＲＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、またはｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、それを必要とするヒト対象において心臓疾患のための遺伝子治療のために用いてもよい。本開示の方法および組成物を用いて処置してもよい心臓疾患の例として、これらに限定されないが、心筋症および急性虚血が挙げられる。いくつかの態様において、心筋症とは、肥大型心筋症または拡張型心筋症である。心筋症または他の心臓疾患により引き起こされる心不全は、２つの構成成分、カルシウム調節機能不全およびアポトーシスを含む。ＲＡＡＶベクター、粒子、およびｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、それを必要とする対象に、例えば、冠動脈中への血管送達および／または心臓への直接注射を介して投与される場合、かかる心不全の処置のために用いてもよい。ＲＡＡＶベクター、粒子、およびｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、対象の心筋細胞におけるｃＳ１００Ａ１タンパク質およびＡＲＣタンパク質の同時発現を駆動する。Ｓ１００Ａ１は、カルシウム調節の側面を改善し、これは、筋小胞体のカルシウムの一時滞在（transient）の正常化を含み、これは、収縮機能の正常化をもたらす。ＡＲＣは、ミトコンドリア機構および非ミトコンドリア機構により開始されるアポトーシス（伸展により誘導される（stretch-induced）アポトーシスなど）を遮断するのみならず、ミトコンドリアの機能を改善するであろう。したがって、本開示の導入遺伝子により発現される２つのタンパク質の相乗的利益は、心筋症の両方の側面を標的とすることにより、より良好な長期治療成績をもたらすことができる。
細胞に形質導入する方法
本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つ、またはｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つを含む組成物は、細胞、組織または臓器に形質導入するために用いることができる。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つを用いて形質導入される細胞、組織または臓器は、目的の遺伝子により形質導入され、これは、治療用遺伝子、または研究することが所望されるものであってよい。いくつかの態様において、細胞、組織または臓器は、in vitroのセッティングにおいて形質導入され、ここで、細胞、組織または臓器は、培地と共にインキュベートされるかまたはこれを灌流される。細胞は、特定の条件下において培養された多くの細胞のうちの１つ、または採取された臓器の部分、オルガノイド、または生物の部分であってよい。
いくつかの態様において、細胞、組織または臓器は、例えば疾患を処置する目的のために、in vivoで形質導入される。いくつかの態様において、かかるｒＡＡＶ粒子は、治療用タンパク質またはＲＮＡをコードする目的の遺伝子を含む。
いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つ以上を含む組成物は、細胞に提供される。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントｒＡＡＶ粒子のうちのいずれか１つ以上を含む組成物は、ＣＮＳにおける組織に、骨格筋に、または心臓組織に提供される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、in vivoで、ex vivoで、腹腔内、静脈内、筋肉内、冠内、皮下、クモ膜下内、頭蓋内、小胞内、または経口の送達方法を介して、細胞に提供される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、静脈内、筋肉内、冠内またはクモ膜下内の注射または投与により、細胞に提供される。
いくつかの態様において、目的の遺伝子で細胞を形質導入する方法は、細胞に、本明細書において提供される組成物のうちのいずれか１つを提供することを含む。いくつかの態様において、目的の遺伝子で細胞に形質導入するために用いられるバリアントｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１、１２または１３を含む。
本開示の他の側面は、対象、例えばヒトまたは非ヒト対象、対象におけるin situでの宿主細胞、または対象に由来する宿主細胞による、使用のための方法および調製物に関する。いくつかの態様において、細胞、組織または臓器が形質導入される対象は、脊椎動物（例えば、哺乳動物または爬虫類）である。いくつかの態様において、哺乳動物対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ハムスター、マウス、ラット、ブタ、ウマ、ウシ、ラバまたはウサギである。非ヒト霊長類対象の非限定的な例として、マカク（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、サバンナモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジーおよびオランウータンが挙げられる。いくつかの態様において、対象は、特定の疾患のための、あるいは薬物動態学および／または目的の遺伝子によりコードされるタンパク質もしくはｓｉＲＮＡの薬物動態学を研究するために用いられるモデルである。
いくつかの態様において、対象は、遺伝子治療により処置してもよい心臓疾患を有するか、またはこれを有することが疑われる。いくつかの態様において、対象は、心不全の任意のステージにおけるものである。いくつかの態様において、心不全は、心筋症により引き起こされる。いくつかの態様において、心不全は、肥大型心筋症または拡張型心筋症である。
疾患を「処置する」とは、当該用語が本明細書において用いられる場合、対象により経験される疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重篤度を軽減することを意味する。上または本明細書において他の場所で記載される組成物は、典型的には、望ましい結果を提供することができる量である有効量において、対象に投与される。望ましい結果は、投与されている活性剤に依存するであろう。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、発現コンストラクトを、宿主細胞、組織または臓器に移送できる粒子の量であってよい。治療的に受入可能な量は、疾患を処置することができる量であってよい。医学および獣医学の分野において周知であるとおり、任意の１つ対象のための投与量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与されるべき特定の組成物、組成物中の活性成分、投与の時間および経路、一般的健康、および同時に投与されている他の薬物を含む、多くの要因に依存する。
以下の例は、本開示のある態様の説明的なものとなることを意図され、非限定的であることを意図される。
例
例１．
３つのＡＡＶバリアント（「ＳＬ１．２」（配列番号１１）、「ＳＬ２」（配列番号１２）、および「ＳＬ３」（配列番号１３））を、ＡＡＶ形質導入の向性および／または効率をＡＡＶ８と比較して改変するために設計して作製した。ＡＡＶ８の効率を低下させるリン酸化部位を取り除くことにより形質導入効率を増大させた。向性を改変するために、ＡＡＶカプシドの配列の差異と共に、既知のＡＡＶ８の向性をＡＡＶ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶ＿ＡＮＣ８０Ｌ６５の向性と比較する、合理的な設計アプローチをとった（図１を参照）。改善された心臓およびＣＮＳへの向性により補正された差異を、次いで、ＡＡＶ８カプシド配列中に移入する。ＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３は、段階的に増加するかかる配列の付加を代表する。ＡＡＶ－ＳＬ１．２は、したがって、ＡＡＶ８に対して配列において緊密に関連し、一方、ＡＡＶ－ＳＬ２およびＡＡＶ－ＳＬ３は、より相違しているが、ＡＡＶ９またはＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５よりも緊密にＡＡＶｒ１０、ＡＡＶｒｈ７４およびＡＡＶ８に関連している。他のＡＡＶ血清型と比較したＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３の系統学および分岐の％を、それぞれ、図２および３において示す。
例２．
心保護的遺伝子の心臓への送達を改善するために、変異体カプシドを、天然に存在するＡＡＶ血清型との比較に基づいて、心筋での取り込みのために重要であると考えられる領域を改変するように設計した。特に、アミノ酸Ｇｌｕ５７８からＧｌｙ５９６に広がるカプシド領域は、本明細書において記載される３つのバリアント（ＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３；例１および図１～３を参照）において異なっていた。
図８において示されるブロットのウェスタンブロット定量（図７）は、３つのバリアント（ＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３）の送達を、天然の血清型であるＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、操作されたバリアントであるＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５の取り込みと比較した。ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０は、心臓送達のための最良の記載されたＡＡＶ血清型のうちの２つであるので、これらを選択した。実験は、尾静脈全身送達により６か月齢のＤＢＡ／２Ｊオスマウスに投与される、既知の飽和未満の用量（１×１０１３ｖｇ／ｋｇ）を用いて行った。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、全組織における発現についてベータ－アクチンプロモーターの制御下においてレポータータンパク質として用いた。図７および８は、バリアントＳＬ２は対照血清型と比較して改善された心臓組織における取り込みを有するが、一方、ＳＬ３はＡＡＶ９により類似した取り込みを有することを示す。ＳＬ３は、試験されたＡＡＶ血清型のうちのいずれにおいても骨格筋および脳において最も高い取り込みを有することが観察された。
表２において示されるとおり、また、ＳＬ２およびＳＬ３中に導入された変異が、生成の効率（例えば、所与の量のＤＮＡについての収量）の実質的な増大をもたらしたことも観察された。ＳＬ２およびＳＬ３についての生成の効率は、収量がＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０の収量を１．５～４倍上回るように増大し、これは、合成バリアントＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５の収量をはるかに上回る。ＡＡＶａｎｃ７０Ｌ６５は、ＡＡＶ８と比較して、心臓送達のためにより有用であることが提案されているが、本明細書において記載される結果に基づいて、実際にはＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、および本発明のバリアントＳＬ２およびＳＬ３よりも劣る。ＳＬ２およびＳＬ３のより高い収量は、これらのバリアントは生成するのがより容易かつより安価であることから、全身ヒト遺伝子治療のために必要とされるラージスケール生成のために重要である。
骨格筋および心筋の両方における取り込みにおけるＳＬ３の優位性を、図９（心臓および横隔膜のウェスタンブロットおよび定量）および図１０（四頭筋のウェスタンブロットおよび定量）において示す。図９および１０におけるデータは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９、ＳＬ１．２、ＳＬ２またはＳＬ３を尾静脈（全身送達）により６か月齢のＤＢＡ／２Ｊオスマウスに注射することにより得た。レポーターは、全ての組織において発現についてベータ－アクチンプロモーターの制御下におけるＧＦＰである。

図１１は、５×１０１３ｖｇ／ｋｇまたは１×１０１４ｖｇ／ｋｇでのＡＡＶ９、ＳＬ１．２、ＳＬ２またはＳＬ３の全身注射の後の、骨格筋および心臓内の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；輝度）の分布を示す。発現のパターンは、ウェスタンブロットデータの結論を支持し、ＳＬ３が、心臓および骨格筋の形質導入のための優れたベクターであることを示す。
肝臓以外の組織を標的とすることを意図される新たなＡＡＶベクターを設計する場合、典型的にいかなる他の組織よりも多くのベクターを取り込む肝臓への送達を最小化することが有用である。肝臓によるＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３の取り込みを減少させるために、単一のアミノ酸変更（アスパラギン５００からイソロイシンへ）をＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３の各々に導入した（例えば、Pulicherla、et al., Mol. Ther. 19:6、1070-78 (2011)を参照）。結果として生じたベクターを、本明細書において、「ＳＬ１．２Ｌ」（配列番号１５）、「ＳＬ２Ｌ」（配列番号１７）、および「ＳＬ３Ｌ」（配列番号１９）として指定した。
いくつかの適用において、特に中枢神経系（ＣＮＳ）が標的ではない場合、ウイルスが血液脳関門を通過することを防止して、それにより脳への送達を最小化することが有用である。脳によるＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３の取り込みを減少させるために、７つのアミノ酸変更（アスパラギン２６３からセリンへ；グリシン２６４からアラニンへ；スレオニン２６５からセリンへ；セリン２６６からスレオニンへ；グリシン２６８の欠失；スレオニン２７０からセリンへ；およびスレオニン２７４からヒスチジンへ）を、ＳＬ１．２に導入し、８つのアミノ酸変更（アスパラギン２６３からセリンへ；セリン２６４からアラニンへ；スレオニン２６５からセリンへ；セリン２６６からスレオニンへ；グリシン２６８の欠失；セリン２６９からアラニンへ；スレオニン２７０からセリンへ；およびスレオニン２７４からヒスチジンへ）を、ＳＬ２およびＳＬ３の各々へ導入した（例えば、Albright、et al., Mol. Ther. 26:2、510-23 (2018)を参照）。結果として生じたベクターを、本明細書において、「ＳＬ１．２Ｂ」（配列番号２１）、「ＳＬ２Ｂ」（配列番号２３）、および「ＳＬ３Ｂ」（配列番号２５）として指定した。
最後に、いくつかの場合において、天然に存在するＡＡＶ血清型と比較して、肝臓におけるおよび脳における取り込みがいずれも減少したＡＡＶベクターを利用することが、有用である場合がある。したがって、それぞれ上記の肝臓および脳に関連する、単一のアミノ酸変更および８つのアミノ酸変更を組み込むＳＬ１．２、ＳＬ２およびＳＬ３バリアントを、設計した。結果として生じたベクターを、本明細書において「ＳＬ１．２ＬＢ」（配列番号２７）、「ＳＬ２ＬＢ」（配列番号２９）、および「ＳＬ３ＬＢ」（配列番号３１）として指定した。
他のＡＡＶ血清型と比較した、ＳＬ１．２、ＳＬ１．２Ｌ、ＳＬ１．２Ｂ、ＳＬ１．２ＬＢ、ＳＬ２、ＳＬ２Ｌ、ＳＬ２Ｂ、ＳＬ２ＬＢ、ＳＬ３、ＳＬ３Ｌ、ＳＬ３ＢおよびＳＬ３ＬＢの系統学および分岐の％を、それぞれ図５および６において示す。
他の態様
本明細書において開示される特徴の全ては、任意の組み合わせにおいて組み合わせてもよい。本明細書において開示される各々の特徴は、同じか、同等か、または類似の目的に役立つ代替的特徴により置き換えられてもよい。したがって、別段に明示的に記述されない限り、開示される各々の特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
上の記載から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適応させるために、本開示の多様な変更および改変を行うことができる。したがって、他の態様もまた、請求の範囲内である。
均等物
いくつかの本発明の態様を、本明細書において記載および説明してきたが、一方で、当業者は、機能を行うため、ならびに／または本明細書において記載される結果および／もしくは利点のうちの１つ以上を得るための、多様な他の手段および／または構造を、容易に想起し、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書において記載される本発明の態様の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメーター、寸法、材料および立体構造は、例示的であることを意図されること、ならびに、実際のパラメーター、寸法、材料および／または立体構造は、本発明の教示がそのために用いられる特定の適用に依存するであろうことを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書において記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物を、理解するか、または慣用的な実験のみを用いて確認することができるであろう。したがって、前述の態様は、単に例として提示されるものであること、ならびに、添付の請求の範囲およびそれに対する均等物の範囲内において、本発明の態様は、具体的に記載されるかまたは請求されるものとは別段に実施してもよいことが理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書において記載される各々の個々の特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法に対して向けられる。加えて、２つ以上のかかる特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに相反しない場合には、本開示の発明の範囲内に含まれる。
全ての定義は、本明細書において定義され用いられる場合、定義される用語の辞書の定義、参考として援用される文書における定義および／または通常の意味に対して優先されることが理解されるべきである。
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して、参考として援用され、これは、いくつかの場合においては、文書の全体を包含してもよい。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書において、明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、逆であることが明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
句「および／または」、本明細書において、明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、そのように結合された要素のうちの「いずれかまたは両方」、すなわち、いくつかの場合において接続的に存在し、他の場合においては離接的に存在する要素を意味するものと理解されるべきである。「および／または」により列記される複数の要素は、同じ様式において、すなわち、そのように結合された要素のうちの「１つ以上」において、解釈されるべきである。他の要素は、「および／または」節により特に同定された要素の他に、任意に存在してもよく、これは、特に同定された要素と関連しても関連しなくてもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」についての言及は、「含む（comprising）」などのオープンエンドの語法と組み合わせて用いられる場合、一態様においては、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）を指していてもよく；別の態様においては、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）を指していてもよく；さらに別の態様においては、ＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む)を指していてもよい、など。
本明細書において、明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、「または」は、上で定義されるような「および／または」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リストにおいて項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包含的である、すなわち、少なくとも１つの包含として解釈されるべきであるが、また、多数の要素または要素のリストのうちの１つより多く、および任意にさらなる列記されていない項目を含む。「～のうちの１つのみ」または「～のうちの正確に１つ」、または、請求の範囲において用いられる場合、「～からなる（consisting of）」などの、逆であることが明確に示される用語は、多数の要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を指すであろう。一般的に、用語「または」とは、本明細書において用いられる場合、「～のいずれか」、「～のうちの１つ」、「～のうちの１つのみ」または「～のうちの正確に１つ」などの排他性の用語により先行される場合には、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるべきである。「～から本質的になる（consisting essentially of）」とは、請求の範囲において用いられる場合、特許法の分野において用いられる場合のその通常の意味を有するべきである。
本明細書において、明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、１つ以上の要素のリストに関する句「少なくとも１つ」は、要素のリスト中の要素のうちのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも要素のリスト中に特に列記される各々および全ての要素のうちの少なくとも１つを含むものではなく、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを除外するものではないことが、理解されるべきである。この定義はまた、句「少なくとも１つ」が言及する要素のリスト中に特に同定される要素以外の要素が、特に同定される要素と関連しても関連しなくとも、任意に存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または、同等に、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一態様においては、Ｂの不在下における（および任意にＢ以外の要素を含む）、少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＡを指していてもよく；別の態様においては、Ａの不在下における（および任意にＡ以外の要素を含む）、少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＢを指していてもよく；さらに別の態様においては、少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＡ、および少なくとも１つ（任意に１つより多くを含む）のＢ（および任意に他の要素を含む）を指していてもよい；など。
また、逆であることが明確に示されない限り、本明細書において請求される任意の方法であって、１つより多くのステップまたは行為を含むものにおいて、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも、当該方法のステップまたは行為が記述される順序に限定されないことが、理解されるべきである。
請求の範囲において、ならびに上の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「担持する（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「含む（involving）」、「保持する（holding）」、「～を含んでなる（composed of）」、および類似のものなどの全ての移行句は、オープンエンドである、すなわち、それを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁特許審査便覧、セクション2111.03において記載されるとおり、移行句「～からなる（consisting of）」および「～から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれ、クローズまたはセミクローズの移行句であるべきである。オープンエンドの移行句（例えば、「含む（comprising）」）を用いて本文書において記載される態様もまた、代替的な態様においては、オープンエンドの移行句により記載される特徴「からなる（consisting of）」およびそれ「から本質的になる（consisting essentially of）」ものとして企図されることが、理解されるべきである。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、代替的な態様「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」を企図する。
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Claims (22)

  1. バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、配列番号１２において記載されるアミノ酸配列、または配列番号１２の配列と１、２、３、４、５、または６アミノ酸まで異なるアミノ酸配列を含み、ただし、前記カプシドタンパク質が、Ａ２４Ｄ、Ｄ４１Ｎ、Ｑ８４Ｋ、Ｒ９２Ｋ、Ｔ１５８Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ｒ１６９Ｋ、Ｌ１８９Ｉ、Ａ１９５Ｇ、Ｖ１９９Ｌ、Ｐ２０１Ｓ、Ｓ２２５Ａ、Ｇ２６４Ｓ、Ａ２６９Ｓ、Ｒ３１３Ｋ、Ｓ３１５Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３６２Ｅ、Ｑ４１３Ｅ、Ｔ４１５Ｓ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４５３Ｓ、Ｎ４５９Ｇ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｎ４７１Ｓ、Ｔ４７２Ｎ、Ａ４７４Ｓ、Ｎ４７５Ａ、Ｔ４９４Ｖ、Ａ５０７Ｇ、Ｇ５０８Ａ、Ｎ５１７Ｄ、Ａ５２０Ｖ、Ｔ５２８Ｓ、Ｄ５３１Ｅ、Ｄ５３２Ｇ、Ｎ５４０Ｓ、Ｎ５４９Ｇ、Ａ５５１Ｇ、Ａ５５５Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｅ５７８Ｑ、Ｉ５８１Ｑ、Ｔ５９１Ａ、Ｑ５９４Ｉ、Ｉ５９５Ｖ、Ｎ６６５Ｓ、Ｓ６６７Ａ、Ｎ６７０Ａ、Ｓ７１２Ｎ、Ｖ７２２Ｔ、およびＹ７３３Ｆアミノ酸置換を含み、ここで置換の位置が、配列番号７において記載される野生型ＡＡＶ８カプシドタンパク質アミノ酸配列に基づく、前記バリアントカプシドタンパク質。
  2. バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、配列番号１３において記載されるアミノ酸配列、または配列番号１３の配列と１、２、３、４、５、または６アミノ酸まで異なるアミノ酸配列を含み、ただし、前記カプシドタンパク質が、Ｋ３１Ｑ、Ｄ４１Ｎ、Ｇ４２Ａ、Ｑ８４Ｋ、Ｒ９２Ｋ、Ｑ１０５Ｋ、Ｔ１５８Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ｓ１８０Ｔ、Ｐ２０１Ｓ、Ｓ２２５Ａ、Ｇ２６４Ｓ、Ａ２６９Ｓ、Ｒ３１３Ｋ、Ｓ３１５Ｎ、Ｅ３５０Ｄ、Ｑ３６２Ｅ、Ｑ４１３Ｅ、Ｔ４１５Ｓ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４５３Ｓ、Ｎ４５９Ｇ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｎ４７１Ｓ、Ｔ４７２Ｎ、Ａ４７４Ｓ、Ｎ４７５Ａ、Ｔ４９４Ｖ、Ａ５０７Ｇ、Ｇ５０８Ａ、Ｎ５１７Ｄ、Ａ５２０Ｖ、Ｔ５２８Ｓ、Ｄ５３１Ｅ、Ｄ５３２Ｇ、Ｎ５４０Ｓ、Ｎ５４９Ｇ、Ａ５５１Ｇ、Ａ５５５Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｉ５８１Ｑ、Ｑ５８８Ｓ、Ｑ５８９Ａ、Ｑ５９４Ｉ、Ｉ５９５Ｖ、Ｎ６６５Ｓ、Ｓ６６７Ａ、Ｎ６７０Ａ、Ｓ７１２Ｎ、Ｖ７２２Ｔ、およびＹ７３３Ｆアミノ酸置換
    を含み、ここで置換の位置が、配列番号７において記載される野生型ＡＡＶ８カプシドタンパク質アミノ酸配列に基づく、前記バリアントカプシドタンパク質。
  3. 請求項１または２に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、バリアントｒＡＡＶ粒子。
  4. 目的の遺伝子を含む核酸をさらに含む、請求項３に記載のバリアントｒＡＡＶ粒子。
  5. 核酸が、一本鎖である、請求項４に記載のバリアントｒＡＡＶ粒子。
  6. 核酸が、二本鎖である、請求項４に記載のバリアントｒＡＡＶ粒子。
  7. 請求項３～６のいずれか一項に記載の複数のバリアントｒＡＡＶ粒子を含む、組成物。
  8. 薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む、請求項７に記載の組成物。
  9. 目的の遺伝子で細胞を形質導入する方法における使用のための請求項７または８に記載の組成物であって、方法が、細胞に前記組成物を提供することを含み、ここで組成物中のＡＡＶ粒子が、目的の遺伝子を含む、前記組成物。
  10. 細胞が、対象におけるｉｎ ｓｉｔｕであるかまたは対象に由来し、かつ対象が、哺乳動物である、請求項９に記載の使用のための組成物。
  11. 哺乳動物が、ヒトである、請求項１０に記載の使用のための組成物。
  12. 目的の遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、請求項９～１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  13. 治療用タンパク質が、抗体または抗体フラグメント、ペプチボディー、増殖因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、酵素、ヌクレアーゼまたは遺伝子編集のために用いられる他のタンパク質である、請求項１２に記載の使用のための組成物。
  14. 配列番号１１において記載されるアミノ酸配列、または配列番号１１の配列と１、２、３、４、５、または６アミノ酸まで異なるアミノ酸配列を含む、バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質、ただし、前記カプシドタンパク質が、Ｋ１６３Ｓ、Ｒ１６９Ｋ、Ｓ１８０Ｔ、Ｌ１８９Ｉ、Ｔ４１７Ｑ、Ｙ４４７Ｆ、Ｔ４６２Ｑ、Ｇ４６４Ｌ、Ｔ４９４Ｖ、Ｄ５５９Ｋ、Ｔ５９１Ａ、およびＹ７３３Ｆのアミノ酸置換を含み、ここで、置換の位置は、配列番号７において記載される野生型ＡＡＶ８カプシドタンパク質アミノ酸配列に基づく、前記バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質。
  15. 複数のバリアントｒＡＡＶ粒子を含む、請求項１４に記載の組成物。
  16. さらに薬学的に受入可能なキャリアを含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 細胞に目的の遺伝子を形質導入する方法における使用のための組成物であって、前記方法が、細胞の組成物を提供することを含み、ここで組成物中のｒＡＡＶ粒子が、目的の遺伝子を含む、請求項１５または１６に記載の組成物。
  18. 細胞が、対象においてｉｎ ｓｉｔｕで存在するか、または対象に由来し、かつ前記対象が、哺乳動物である、請求項１７に記載の方法における使用のための組成物。
  19. 哺乳動物が、ヒトである、請求項１８に記載の使用のための組成物。
  20. 目的の遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
  21. 治療用タンパク質が、抗体または抗体フラグメント、ペプチボディ、増殖因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体、またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性ペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、酵素、ヌクレアーゼ、または遺伝子編集のために用いられる他のタンパク質である、請求項２０に記載の使用のための組成物。
  22. 目的の遺伝子が、心保護的遺伝子である、請求項１１、および１７～１９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
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