JP7788403B2 - 合成改変ワクシニアアンカラ（ｓＭＶＡ）ベースのコロナウイルスワクチン - Google Patents

合成改変ワクシニアアンカラ（ｓＭＶＡ）ベースのコロナウイルスワクチン

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Description

優先権の主張
本願は、2020年5月17日出願の米国特許仮出願第63/026,127号、同年6月25日出願の同第63/044,033号、同年11月13日出願の同第63/113,810号、2021年3月15日出願の同第63/161,371号の優先権を主張するものであり、それらの内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
背景
改変ワクシニアアンカラ（MVA）は、親株である漿尿膜ワクシニアアンカラ（CVA）から、ニワトリ胎児線維芽細胞（CEF）で570代継代することにより得られた、きわめて弱毒化されたオルソポックスウイルスである。弱毒化プロセスの結果として、MVAは、6つの主要ゲノム欠失（Del1～6）のほか、複数のもっと短い欠失、挿入、および点変異を獲得しており、それらは遺伝子の断片化、短縮、短い内部欠失、およびアミノ酸置換をもたらす。MVAは、きわめて限定的な宿主細胞指向性をもつので、鳥類細胞（たとえばCEF）およびベビーハムスター腎臓細胞（BHK）細胞でのみ生産的構築が可能になり、一方でヒトおよび他のほとんどの哺乳動物細胞では、後期にウイルス構築がブロックされるため、MVAの構築は不全に終わる。MVAは、非病原性であり、且つきわめて弱毒性であるが、さまざまな動物モデルおよびヒトで示されているように、優れた免疫原性を維持している。天然痘根絶計画の後期、MVAは、複製能のあるワクシニアをベースとするワクチンのプライミングベクターとしてドイツ国内で12万人以上に用いられたが、有害事象の報告はなかった。この数十年で、MVAはスタンドアローンの天然痘ワクチンとして開発が進み、現在は天然痘の大発生に備えての予防対策として既存のワクシニアをベースとするワクチンのストックに取って代わる、より安全性の高い代替物として、米国政府により追究されている。FDAは、2019年9月24日、天然痘およびサル痘の両方を予防する、Jynneos（Bavarian Nordic）という商用名のMVAを承認した。過去にはImvamuneという商用名の類似のMVAワクチンが、欧州で天然痘ワクチンとして承認されている。本発明者らが知る限り、現在MVAベクターまたはその誘導体を使用する組織団体はほぼすべて、学術機関、企業、または政府機関によってライセンス付与または所有されており、そのためMVAベースのワクチンベクターの商用開発にそれらを使用することが大きく制限されている。
コロナウイルスは、エンベロープをもつポジティブセンス一本鎖RNAウイルスの一つの大きな科であり、人間に感染して重篤な感染症やパンデミックさえも引き起こす場合がある。そのような感染性の高いコロナウイルスとしては、たとえば、MERS-CoV、SARS-CoV、およびSARS-CoV-2が挙げられる。新型重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2、またはCovid-19もしくはnCoV-2019としても知られる）（PMC7095418、PMC7092803）が最近大発生して以来、同ウイルスは200カ国以上に広がり、世界で300万人を超える死者を出した。前例のないペースで開発され、緊急使用のために承認された、有効なSARS-CoV-2ワクチンもいくつかあるが、さらなるワクチンが、SARS-CoV-2およびその新興変異株の多くに対する長期かつ交差反応性の免疫構築に寄与することができる。したがって本開示は、この分野における差し迫った需要を満たすべく、合成MVAプラットフォームを用いてワクチンを提供する。
概要
一局面では、対象におけるコロナウイルス感染症などのウイルス感染症を予防または治療するためのワクチン組成物が本明細書において開示され、該組成物は以下を含む:（i）MVAの全ゲノムを含む1つのDNA断片、またはMVAゲノムの部分配列をそれぞれが含む2つ以上のDNA断片であって、コトランスフェクションにより宿主細胞において発現すると、連続的に繋ぎ合わされてMVAゲノムの全長配列を構成する、2つ以上のDNA断片、および（ii）該MVAの1つまたは複数の挿入部位に挿入された、1つまたは複数のヒトコロナウイルス抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードする1つまたは複数のDNA配列であって、該1つまたは複数のDNA断片のトランスフェクション後に該抗原、そのサブユニット、またはその断片が宿主細胞において発現する、1つまたは複数のDNA配列。特定の態様では、抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列は、宿主細胞またはワクシニアウイルスにおける発現のためにコドン最適化されている。特定の態様では、1つまたは複数のヒトコロナウイルス抗原は、スパイク（S）タンパク質、ヌクレオカプシド（N）タンパク質、膜（M）タンパク質、およびエンベロープ（E）タンパク質、パパイン様プロテアーゼ、ORF1A、3CLプロテアーゼ、ORF1B、エンドリボヌクレアーゼ、マトリックス、ヘリカーゼ、またはそれらの免疫原性断片を含む。構造または非構造（1a、1b）タンパク質の他のコロナウイルス抗原も含まれ得る。特定の態様では、1つまたは複数のヒトコロナウイルス抗原は、SARS-CoV-2 Sタンパク質、Nタンパク質、またはその両方を含む。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、Sタンパク質のサブユニット、たとえばSタンパク質のS1およびS2ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、融合前の形態のSタンパク質もしくはNタンパク質、または変異Sタンパク質もしくはNタンパク質を含む。たとえば、融合前の形態のSARS-CoV-2 Sタンパク質が安定化され得、またはアミノ酸残基682～685のRRARがGSASに変異している変異フリン（Furin）切断部位を含むことでSARS-CoV-2 Sタンパク質はさらに安定化され得る。別の例では、SARS-CoV-2 Sタンパク質のリジン986およびバリン987がプロリンで置換されている（2P）。さらなるプロリン置換は、F817P、A892P、A899P、およびA942Pを含む。類似のフリン切断部位変異およびプロリン置換を、他のコロナウイルスSタンパク質のそれぞれのアミノ酸位置に含めて、非切断型および/または2P融合前安定化タンパク質形態を発現させることができる。特定の態様では、Sタンパク質は、S13I、L18F、T19R、T20N、R21T、P26S、位置69および70のヒスチジンおよびバリンの欠失、K77T、D80A、T95I、D138Y、G142D、位置144のチロシンの欠失、W152C、E154K、アミノ酸位置156および157のグルタミン酸およびフェニルアラニンの欠失（Del156-157）、R158G、R190S、D215G、Q218H、位置242～244のロイシン、アラニン、およびロイシンの欠失、R246I、K417N、K417T、N439K、L452R、Y453F、S477N、T478K、E484K、E484Q、S494P、N501Y、S520S、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、RRAR682-685GSAS、A701V、T716I、D950N、S982A、K986P、V987P、T1027I、Q1071H、H1101D、D1118H、ならびにV1176Fからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含む。特定の態様では、Nタンパク質は、D3L、P80R、S235F、R203K、R203M、G204R、T205I、およびD377Yからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含む。特定の態様では、Sタンパク質およびNタンパク質は、完全に成熟しているか、または完全にグリコシル化されている。特定の態様では、Sタンパク質およびNタンパク質は、1つまたは複数のMVA挿入部位に挿入されている。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、SARS-CoV-2の異なる変異株に由来する少なくとも2つのRBDを含み、それらは1つまたは複数のGSリンカーにより連結されていてもよく、また、それぞれがN末端にシグナルペプチドを含むか、またはC末端に膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインを含んでもよい。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、ヒトコロナウイルス抗原、そのサブユニット、もしくはその断片をコードするDNA配列の上流のウイルスプロモーター、ヒトコロナウイルス抗原、そのサブユニット、もしくはその断片をコードするDNA配列の下流の転写終結シグナル、またはその両方をさらに含む。特定の態様では、プロモーター配列は、mH5およびp7.5プロモーター、または任意の他の好適なネイティブもしくは合成ワクシニアもしくはポックスウイルスプロモーターを含む。特定の態様では、抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードするDNA配列は、遺伝子間領域、非必須遺伝子および領域、ならびに欠失部位などの1つまたは複数のMVA挿入部位に挿入されている。特定の態様では、ワクチン組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、添加物、またはそれらの組み合わせをさらに含む。特定の態様では、対象は、コロナウイルス、たとえばベータコロナウイルス、たとえばMERS-CoV、SARS-CoVおよびSARS-CoV2、229E、NL63、OC43、HKU1、ならびに他のアルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタコロナウイルスに感染しているか、または感染する危険性がある。特定の態様では、対象は、SARS-CoV-2に感染しているか、または感染する危険性がある。
別の局面では、対象においてウイルス感染症を予防または治療する方法が本明細書において開示され、該方法は、予防的または治療的有効量のワクチン組成物を該対象に投与することを含み、該ワクチンは以下を含む:（i）MVAの全ゲノムを含む1つのDNA断片、またはMVAゲノムの部分配列をそれぞれが含む2つ以上のDNA断片であって、コトランスフェクションにより宿主細胞において発現すると、連続的に繋ぎ合わされてMVAゲノムの全長配列を構成する、2つ以上のDNA断片、および（ii）該MVAの1つまたは複数の挿入部位に挿入された、1つまたは複数のヒトコロナウイルス抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードする1つまたは複数のDNA配列であって、該1つまたは複数のDNA断片のトランスフェクション後に該抗原、そのサブユニット、またはその断片が宿主細胞において発現する、1つまたは複数のDNA配列。特定の態様では、抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列は、宿主細胞またはワクシニアウイルスにおける発現のためにコドン最適化されている。特定の態様では、1つまたは複数のヒトコロナウイルス抗原は、スパイク（S）タンパク質、ヌクレオカプシド（N）タンパク質、膜（M）タンパク質、およびエンベロープ（E）タンパク質、パパイン様プロテアーゼ、ORF1A、3CLプロテアーゼ、ORF1B、エンドリボヌクレアーゼ、マトリックス、ヘリカーゼ、またはそれらの免疫原性断片を含む。構造または非構造（1a、1b）タンパク質の他のコロナウイルス抗原も含まれ得る。特定の態様では、1つまたは複数のヒトコロナウイルス抗原は、SARS-CoV-2 Sタンパク質、Nタンパク質、またはその両方を含む。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、Sタンパク質のサブユニット、たとえばSタンパク質のS1およびS2ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、融合前の形態のSタンパク質、および変異Sタンパク質を含む。たとえば、融合前の形態のSARS-CoV-2 Sタンパク質が安定化され得、またはアミノ酸残基682～685のRRARがGSASに変異している（RRAR682-685GSAS）変異フリン切断部位を含むことでSARS-CoV-2 Sタンパク質はさらに安定化され得る。別の例では、SARS-CoV-2 Sタンパク質のリジン986およびバリン987がプロリンで置換されている（2P）（K986PおよびV987P）。さらなるプロリン置換は、F817P、A892P、A899P、およびA942Pを含む。類似のフリン切断部位変異およびプロリン置換を、他のコロナウイルスSタンパク質のそれぞれのアミノ酸位置に含めて、非切断型および/または2P融合前安定化タンパク質形態を発現させることができる。特定の態様では、Sタンパク質は、S13I、L18F、T19R、T20N、R21T、P26S、位置69および70のヒスチジンおよびバリンの欠失、K77T、D80A、T95I、D138Y、G142D、位置144のチロシンの欠失、W152C、E154K、アミノ酸位置156および157のグルタミン酸およびフェニルアラニンの欠失（Del156-157）、R158G、R190S、D215G、Q218H、位置242～244のロイシン、アラニン、およびロイシンの欠失、R246I、K417N、K417T、N439K、L452R、Y453F、S477N、T478K、E484K、E484Q、S494P、N501Y、S520S、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、RRAR682-685GSAS、A701V、T716I、D950N、S982A、K986P、V987P、T1027I、Q1071H、H1101D、D1118H、ならびにV1176Fからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含む。特定の態様では、Nタンパク質は、D3L、P80R、S235F、R203K、R203M、G204R、T205I、およびD377Yからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含む。特定の態様では、Sタンパク質およびNタンパク質は、完全に成熟しているか、または完全にグリコシル化されている。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、SARS-CoV-2の異なる変異株に由来する少なくとも2つのRBDを含み、それらは1つまたは複数のGSリンカーにより連結されていてもよく、また、それぞれがN末端にシグナルペプチドを含むか、またはC末端に膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインを含んでもよい。特定の態様では、Sタンパク質およびNタンパク質は、1つまたは複数のMVA挿入部位に挿入されている。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、ヒトコロナウイルス抗原、そのサブユニット、もしくはその断片をコードするDNA配列の上流のウイルスプロモーター、ヒトコロナウイルス抗原、そのサブユニット、もしくはその断片をコードするDNA配列の下流の転写終結シグナル、またはその両方をさらに含む。特定の態様では、プロモーター配列は、mH5およびp7.5プロモーター、または任意の他の好適なネイティブもしくは合成ワクシニアもしくはポックスウイルスプロモーターを含む。特定の態様では、抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードするDNA配列は、遺伝子間領域、非必須遺伝子および領域、ならびに欠失部位などの1つまたは複数のMVA挿入部位に挿入されている。特定の態様では、ワクチン組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、添加物、またはそれらの組み合わせをさらに含む。特定の態様では、対象は、コロナウイルス、たとえばベータコロナウイルス、たとえばMERS-CoV、SARS-CoVおよびSARS-CoV2、229E、NL63、OC43、HKU1、ならびに他のアルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタコロナウイルスに感染しているか、または感染する危険性がある。特定の態様では、対象は、SARS-CoV-2に感染しているか、または感染する危険性がある。
別の局面では、対象において免疫応答を誘発する方法が本明細書において開示され、該方法は、予防的または治療的有効量のワクチン組成物を該対象に投与することを含み、該ワクチンは以下を含む:（i）MVAの全ゲノムを含む1つのDNA断片、またはMVAゲノムの部分配列をそれぞれが含む2つ以上のDNA断片であって、コトランスフェクションにより宿主細胞において発現すると、連続的に繋ぎ合わされてMVAゲノムの全長配列を構成する、2つ以上のDNA断片、および（ii）該MVAの1つまたは複数の挿入部位に挿入された、1つまたは複数のヒトコロナウイルス抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードする1つまたは複数のDNA配列であって、該1つまたは複数のDNA断片のトランスフェクション後に該抗原、そのサブユニット、またはその断片が宿主細胞において発現する、1つまたは複数のDNA配列。特定の態様では、抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。特定の態様では、1つまたは複数のヒトコロナウイルス抗原は、スパイク（S）タンパク質、ヌクレオカプシド（N）タンパク質、膜（M）タンパク質、およびエンベロープ（E）タンパク質、パパイン様プロテアーゼ、ORF1A、3CLプロテアーゼ、ORF1B、エンドリボヌクレアーゼ、マトリックス、ヘリカーゼ、またはそれらの免疫原性断片を含む。構造または非構造（1a、1b）タンパク質の他のコロナウイルス抗原も含まれ得る。特定の態様では、1つまたは複数のヒトコロナウイルス抗原は、SARS-CoV-2 Sタンパク質、Nタンパク質、またはその両方を含む。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、Sタンパク質のサブユニット、たとえばSタンパク質のS1およびS2ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、融合前の形態のSタンパク質、および変異Sタンパク質を含む。たとえば、融合前の形態のSARS-CoV-2 Sタンパク質が安定化され得、またはアミノ酸残基682～685のRRARがGSASに変異している変異フリン切断部位を含むことでSARS-CoV-2 Sタンパク質はさらに安定化され得る。別の例では、SARS-CoV-2 Sタンパク質のリジン986およびバリン987がプロリンで置換されている（2P）。さらなるプロリン置換は、F817P、A892P、A899P、およびA942Pを含む。類似のフリン切断部位変異およびプロリン置換を、他のコロナウイルスSタンパク質のそれぞれのアミノ酸位置に含めて、非切断型および/または2P融合前安定化タンパク質形態を発現させることができる。特定の態様では、Sタンパク質は、S13I、L18F、T19R、T20N、R21T、P26S、位置69および70のヒスチジンおよびバリンの欠失、K77T、D80A、T95I、D138Y、G142D、位置144のチロシンの欠失、W152C、E154K、アミノ酸位置156および157のグルタミン酸およびフェニルアラニンの欠失（Del156-157）、R158G、R190S、D215G、Q218H、位置242～244のロイシン、アラニン、およびロイシンの欠失、R246I、K417N、K417T、N439K、L452R、Y453F、S477N、T478K、E484K、E484Q、S494P、N501Y、S520S、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、RRAR682-685GSAS、A701V、T716I、D950N、S982A、K986P、V987P、T1027I、Q1071H、H1101D、D1118H、ならびにV1176Fからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含む。特定の態様では、Nタンパク質は、D3L、P80R、S235F、R203K、R203M、G204R、T205I、およびD377Yからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含む。特定の態様では、Sタンパク質およびNタンパク質は、完全に成熟しているか、または完全にグリコシル化されている。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、SARS-CoV-2の異なる変異株に由来する少なくとも2つのRBDを含み、それらは1つまたは複数のGSリンカーにより連結されていてもよく、また、それぞれがN末端にシグナルペプチドを含むか、またはC末端に膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインを含んでもよい。特定の態様では、Sタンパク質およびNタンパク質は、1つまたは複数のMVA挿入部位に挿入されている。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、ヒトコロナウイルス抗原、そのサブユニット、もしくはその断片をコードするDNA配列の上流のウイルスプロモーター、ヒトコロナウイルス抗原、そのサブユニット、もしくはその断片をコードするDNA配列の下流の転写終結シグナル、またはその両方をさらに含む。特定の態様では、プロモーター配列は、mH5およびp7.5プロモーター、または任意の他の好適なネイティブもしくは合成ワクシニアもしくはポックスウイルスプロモーターを含む。特定の態様では、抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードするDNA配列は、遺伝子間領域、非必須遺伝子および領域、ならびに欠失部位などの1つまたは複数のMVA挿入部位に挿入されている。特定の態様では、ワクチン組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、添加物、またはそれらの組み合わせをさらに含む。特定の態様では、対象は、コロナウイルス、たとえばベータコロナウイルス、たとえばMERS-CoV、SARS-CoVおよびSARS-CoV2、229E、NL63、OC43、HKU1、ならびに他のアルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタコロナウイルスに感染しているか、または感染する危険性がある。特定の態様では、対象は、SARS-CoV-2に感染しているか、または感染する危険性がある。
さらに別の局面では、本開示は、MVAベクターまたは組換えMVAベクターを製造する方法に関する。当該方法は、1つまたは複数のDNA断片を宿主細胞にトランスフェクトする工程を伴い、該1つまたは複数のDNA断片はMVA種の全ゲノムDNA配列を含み、宿主細胞においてMVAウイルスが再構成される。特定の態様では、各DNA断片がMVAゲノムの部分配列を含む2つ以上のDNA断片が宿主細胞にコトランスフェクトされ、宿主細胞において再構成されると、該2つ以上のDNA断片は、相同組換えにより連続的に繋ぎ合わされてMVAゲノムの全長配列を構成する。特定の態様では、当該方法はさらに、1つまたは複数のDNA断片のトランスフェクションの前、間、または後に宿主細胞にヘルパーウイルスを感染させて、1つまたは複数のDNA断片の転写を開始させる工程を伴う。特定の態様では、ヘルパーウイルスは、鶏痘ウイルス（FPV）であるか、またはMVA、ワクシニア、もしくはポックスウイルスの転写を刺激する任意の他のヘルパーウイルスである。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、トランスフェクションの前に環状化するか、または環状形態で宿主細胞にトランスフェクトされる。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、プラスミドまたは細菌性人工染色体（BAC）ベクターにクローニングされる。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、天然由来のDNA断片、化学合成されたDNA断片、または天然由来のDNA断片と化学合成されたDNA断片との組み合わせである。特定の態様では、MVAゲノム配列は、アクセッション番号U94848の配列を含む。特定の態様では、2つの隣接するDNA断片が、相同組換えを促進するオーバーラップ配列を有する。特定の態様では、オーバーラップ配列の長さは、約100 bp～約5000 bpである。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、逆位末端配列（ITR）領域をさらに含む。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、MVA末端ヘアピンループ（HL）配列、MVAゲノム分割（CR）配列、またはその両方をさらに含み、HLまたはCR配列は、センスまたはアンチセンスの向きの一本鎖または二本鎖DNA配列として、DNA断片の片方または両方の末端に加えられる。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、1つまたは複数のHL配列および1つまたは複数のCR配列をさらに含む。特定の態様では、各HL配列は、そのHL配列の両末端で2つのCR配列に隣接する。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、1つまたは複数の抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードする1つまたは複数のDNA配列をさらに含む。特定の態様では、抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列は、宿主細胞（たとえばヒト細胞）またはワクシニアウイルスにおける発現のためにコドン最適化され、且つ/あるいは、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性のためにコドン最適化される。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、ヒトコロナウイルス抗原、たとえばスパイク（S）タンパク質、ヌクレオカプシド（N）タンパク質、膜（M）タンパク質、およびエンベロープ（E）タンパク質、パパイン様プロテアーゼ、ORF1A、3CLプロテアーゼ、ORF1B、エンドリボヌクレアーゼ、マトリックス、ヘリカーゼ、またはそれらの免疫原性断片を含む。構造または非構造（1a、1b）タンパク質の他のコロナウイルス抗原も含まれ得る。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、Sタンパク質のサブユニット、たとえばSタンパク質のS1およびS2ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、融合前の形態のSタンパク質、および変異Sタンパク質を含む。たとえば、融合前の形態のSARS-CoV-2 Sタンパク質が安定化され得、またはアミノ酸残基682～685のRRARがGSASに変異している変異フリン切断部位を含むことでSARS-CoV-2 Sタンパク質はさらに安定化され得る。別の例では、SARS-CoV-2 Sタンパク質のリジン986およびバリン987がプロリンで置換されている（2P）。さらなるプロリン置換は、F817P、A892P、A899P、およびA942Pを含む。類似のフリン切断部位変異およびプロリン置換を、他のコロナウイルスSタンパク質のそれぞれのアミノ酸位置に含めて、非切断型および/または2P融合前安定化タンパク質形態を発現させることができる。特定の態様では、Sタンパク質は、S13L、L18F、T19R、T20N、R21T、P26S、位置69および70のヒスチジンおよびバリンの欠失、K77T、D80A、T95I、D138Y、G142D、位置144のチロシンの欠失、W152C、E154K、アミノ酸位置156および157のグルタミン酸およびフェニルアラニンの欠失（Del156-157）、R158G、R190S、D215G、Q218H、位置242～244のロイシン、アラニン、およびロイシンの欠失、R246I、K417N、K417T、N439K、L452R、Y453F、S477N、E484K、E484Q、S494P、N501Y、S520S、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、RRAR682-685GSAS、A701V、T716I、D950N、S982A、K986P、V987P、T1027I、Q1071H、H1101D、D1118H、ならびにV1176Fからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含む。特定の態様では、Nタンパク質は、D3L、P80R、S235F、R203K、R203M、G204R、T205I、およびD377Yからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含む。特定の態様では、Sタンパク質およびNタンパク質は、完全に成熟しているか、または完全にグリコシル化されている。特定の態様では、1つまたは複数のDNA断片は、抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列の上流のウイルスプロモーター、抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列の下流の転写終結シグナル、あるいはその両方をさらに含む。特定の態様では、プロモーター配列は、mH5およびp7.5プロモーター、または任意の他の好適なネイティブもしくは合成ワクシニアもしくはポックスウイルスプロモーターを含む。特定の態様では、抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードするDNA配列は、遺伝子間領域、非必須遺伝子および領域、ならびに欠失部位などの1つまたは複数のMVA挿入部位に挿入される。別の態様では、1つまたは複数の発現SARS-CoV-2抗原がさらに改変されて、新規な懸念される変異株（VOC）の1つまたは複数の変異を含む。
[本発明1001]
以下を含む、対象においてコロナウイルス感染症を予防または治療するためのワクチン組成物：
（i）MVAの全ゲノムを含む1つの合成DNA断片、または前記MVAのゲノムの部分配列をそれぞれが含む2つ以上の合成DNA断片であって、コトランスフェクションにより宿主細胞に導入されると、連続的に繋ぎ合わされて前記MVAゲノムの全長配列を構成する、2つ以上の合成DNA断片、および
（ii）前記MVAの1つまたは複数の挿入部位に挿入された、1つまたは複数のコロナウイルス抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードする1つまたは複数のDNA配列であって、前記1つまたは複数のMVA DNA断片のトランスフェクション後に前記宿主細胞において前記抗原が発現する、1つまたは複数のDNA配列。
[本発明1002]
前記抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列が、前記宿主細胞またはワクシニアウイルスにおける発現のためにコドン最適化されている、本発明1001のワクチン組成物。
[本発明1003]
前記1つまたは複数のDNA断片が、前記コロナウイルス抗原、そのサブユニット、もしくはその断片をコードする前記DNA配列の上流のウイルスプロモーター、前記コロナウイルス抗原、そのサブユニット、もしくはその断片をコードする前記DNA配列の下流の転写終結シグナル、またはその両方をさらに含む、本発明1001または本発明1002のワクチン組成物。
[本発明1004]
前記プロモーターが、mH5プロモーター、p7.5プロモーター、または任意の他の好適なネイティブもしくは合成ワクシニアもしくはポックスウイルスプロモーターを含む、本発明1003のワクチン組成物。
[本発明1005]
前記抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードする前記DNA配列が、遺伝子間領域、非必須遺伝子および領域、ならびに欠失部位などの1つまたは複数のMVA挿入部位に挿入されている、本発明1001～1004のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1006]
前記1つまたは複数のコロナウイルス抗原が、スパイク（S）タンパク質、ヌクレオカプシド（N）タンパク質、膜（M）タンパク質、およびエンベロープ（E）タンパク質、パパイン様プロテアーゼ、ORF1A、3CLプロテアーゼ、ORF1B、エンドリボヌクレアーゼ、マトリックス、ヘリカーゼ、タンパク質1a、タンパク質1b、またはそれらの免疫原性断片を含む、本発明1001～1005のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1007]
前記1つまたは複数のコロナウイルス抗原が、SARS-CoV-2スパイク（S）タンパク質、SARS-CoV-2ヌクレオカプシド（N）タンパク質、またはその両方を含む、本発明1006のワクチン組成物。
[本発明1008]
前記Sタンパク質または前記Nタンパク質が、完全に成熟しているか、または完全にグリコシル化されている、本発明1006または本発明1007のワクチン組成物。
[本発明1009]
発現する前記Sタンパク質が、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P、およびRRAR682-685GSASからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含むように改変されている、本発明1006～1008のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1010]
前記Sタンパク質が、N末端にシグナルペプチドを含むか、またはC末端に膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインを含む、本発明1007～1009のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1011]
前記Sタンパク質のC末端の19アミノ酸残基が欠失している、本発明1007～1010のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1012]
前記Sタンパク質または前記Nタンパク質をコードする配列が、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更により、コドン最適化されている、本発明1007～1011のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1013]
前記Sタンパク質が、S13I、L18F、T19R、T20N、R21T、P26S、位置69および70のヒスチジンおよびバリンの欠失、K77T、D80A、T95I、D138Y、G142D、位置144のチロシンの欠失、W152C、E154K、アミノ酸位置156および157のグルタミン酸およびフェニルアラニンの欠失、R158G、R190S、D215G、Q218H、位置242～244のロイシン、アラニン、およびロイシンの欠失、R246I、K417N、K417T、N439K、L452R、Y453F、S477N、T478K、E484K、E484Q、S494P、N501Y、S520S、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、RRAR682-685GSAS、A701V、T716I、D950N、S982A、K986P、V987P、T1027I、Q1071H、H1101D、D1118H、ならびにV1176Fからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含む、本発明1007～1012のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1014]
前記1つまたは複数の抗原が、前記Sタンパク質のS1ドメイン、S2ドメイン、または受容体結合ドメイン（RBD）を含む、本発明1001～1013のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1015]
前記S1ドメイン、前記S2ドメイン、または前記RBDが、N末端にシグナルペプチドを含むか、またはC末端に膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインを含む、本発明1014のワクチン組成物。
[本発明1016]
前記S1ドメインが、前記Sタンパク質のN末端の698個、685個、680個、またはそれより少ないアミノ酸残基を含む、本発明1014のワクチン組成物。
[本発明1017]
前記RBDが、前記Sタンパク質のアミノ酸残基331～524または319～541を含む、本発明1014のワクチン組成物。
[本発明1018]
前記1つまたは複数の抗原が、SARS-CoV-2の異なる株に由来する少なくとも2つのRBDを含む、本発明1014のワクチン組成物。
[本発明1019]
前記少なくとも2つのRBDが、1つまたは複数のGSリンカーにより接続されている、本発明1017のワクチン組成物。
[本発明1020]
前記Nタンパク質が、D3L、P80R、S235F、R203K、R203M、G204R、T205I、およびD377Yからなる群より選択される変異のうちの1つまたは複数を含む、本発明1007～1019のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1021]
薬学的に許容される担体、アジュバント、添加物、またはそれらの組み合わせをさらに含む、本発明1001～1020のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1022]
対象においてコロナウイルス感染症を予防する方法であって、予防的または治療的有効量の本発明1001～1021のいずれかのワクチン組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
[本発明1023]
前記対象が、コロナウイルスに感染する危険性がある、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記コロナウイルスが、ベータコロナウイルスを含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記ベータコロナウイルスが、MERS-CoV、SARS-CoVおよびSARS-CoV2、229E、NL63、OC43、ならびにHKU1を含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記対象が、SARS-CoV-2またはその変異株に感染する危険性がある、本発明1022～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
対象において免疫応答を誘発する方法であって、予防的または治療的有効量の本発明1001～1021のいずれかのワクチン組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
[本発明1028]
前記対象が、コロナウイルスに感染する危険性がある、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記コロナウイルスが、ベータコロナウイルスを含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記ベータコロナウイルスが、MERS-CoV、SARS-CoVおよびSARS-CoV2、229E、NL63、OC43、ならびにHKU1を含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記対象が、SARS-CoV-2またはその変異株に感染する危険性がある、本発明1027～1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
組換えMVAベクターを製造する方法であって、1つまたは複数のDNA断片を宿主細胞にトランスフェクトすることを含み、前記1つまたは複数のDNA断片がMVA種の全ゲノムDNA配列を含み、前記MVAウイルスが前記宿主細胞において再構成され、且つ、前記1つまたは複数のDNA断片が、1つまたは複数の抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードする1つまたは複数のDNA配列をさらに含む、方法。
[本発明1033]
前記1つまたは複数の抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードする1つまたは複数のDNA配列が、前記MVA配列の1つまたは複数の挿入部位に挿入されている、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記1つまたは複数のDNA断片のトランスフェクションの前、間、または後に前記宿主細胞にヘルパーウイルスを感染させて、前記1つまたは複数のDNA断片の転写を開始させることをさらに含む、本発明1032または本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記ヘルパーウイルスが鶏痘ウイルス（FPV）である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記1つまたは複数のDNA断片が、トランスフェクション前に環状化するか、または環状形態で前記宿主細胞にトランスフェクトされる、本発明1032～1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記1つまたは複数のDNA断片が、プラスミドまたは細菌性人工染色体（BAC）ベクターにクローニングされる、本発明1032～1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記1つまたは複数の抗原が、スパイク（S）タンパク質、ヌクレオカプシド（N）タンパク質、膜（M）タンパク質、エンベロープ（E）タンパク質、パパイン様プロテアーゼ、ORF1A、3CLプロテアーゼ、ORF1B、エンドリボヌクレアーゼ、マトリックス、ヘリカーゼ、またはそれらの免疫原性断片を含む、本発明1032～1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記1つまたは複数の抗原が、Sタンパク質、その変異体、そのサブユニット、もしくはその断片、Nタンパク質、その変異体、そのサブユニット、もしくはその断片、またはその両方を含む、本発明1032～1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記Sタンパク質または前記Nタンパク質が、融合前の形態であるか、安定化しているか、または変異している、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記Sタンパク質または前記Nタンパク質が、完全に成熟しているか、または完全にグリコシル化されている、本発明1038～1040のいずれかの方法。
本願は、少なくとも1つのカラー図面を含んでいる。本願のカラー図面つきの副本は、庁に申請し必要な料金を支払うことで提供される。
図1A～1Fは、sMVAの構築および特徴決定を示す。図1A: MVAゲノム概略図。MVAゲノムは、長さ約178 kbpであり、且つ約9.6 kbpの逆位末端配列（ITR）を含む。図1B: sMVA断片。3つのサブゲノムsMVA断片（F1～F3）が、図示のように、約60 kbpの左、中央、および右のMVAゲノム部分を構成する。sMVA F1/F2およびF2/F3は、組み換えのための約3 kbpのオーバーラップ相同配列が共通している（交差させた赤い点線）。一般に用いられるMVA挿入のおよそのゲノム位置が図示されている（Del2、IGR69/70、Del3）。図1C: 末端CR/HL/CR配列。各sMVA断片は、コンカテマー分割（concatemeric resolution）（CR）配列に隣接するMVA末端ヘアピンループ（HL）の二本鎖コピーを含む配列組成を両末端に含む。BAC = 細菌性人工染色体ベクター。図1D: sMVA再構成。sMVA断片を大腸菌（E. coli）から単離し、BHK-21細胞にコトランスフェクトし、続いて該細胞をヘルパーウイルスとしてのFPVに感染させて、sMVAウイルス再構成を開始させる。図1E: PCR分析。FPV HP1.441を用いて得られたsMVA（sMVA hp）、または2つの独立したウイルス再構成に由来するTROVACを用いて得られたsMVA（sMVA tv1およびsMVA tv2）に感染させたCEFを、いくつかのMVAゲノム位置（ITR配列、左または右ITRの内部ユニーク領域への移行（左ITR/UR; UR/右ITR）、Del2、IGR69/70、およびDel3挿入部位、ならびにF1/F2およびF2/F3組換え部位）について、ならびにBACベクター配列の不存在について、PCRで調査した。wtMVA感染および非感染細胞、サンプルなし（モック）、またはMVA BACのPCR反応を、対照として実施した。図1F: 制限断片長の分析。精製されたsMVA（sMVA tv1およびsMVA tv2）またはwtMVAウイルスから単離されたウイルスDNAを、KpnIおよびXhoI制限酵素消化により比較した。 図1-1の説明を参照。 図1-1の説明を参照。 図2A～2Dは、sMVAの複製特性を示す。FPV HP1.441を用いて得られたsMVA（sMVA hp）、または2つの独立したsMVAウイルス再構成に由来するTROVACを用いて得られたsMVA（sMVA tv1およびsMVA tv2）の複製特性をwtMVAと比較した。図2A: ウイルスフォーカス。低い感染多重度（MOI）で再構成sMVAウイルスまたはwtMVAに感染させたCEFを、抗ワクシニアポリクローナル抗体（αVAC）を用いて免疫染色した。図2B: 複製キネティクス。BHK-21細胞またはCEF細胞を、sMVAまたはwtMVAに0.02 MOIで感染させ、接種材料ならびに感染24時間後および48時間後の感染細胞のウイルス力価をCEFで決定した。ガイサー-グリーンハウスの補正を用いる混合効果モデルを適用したところ、感染24時間後および48時間後の群間差は有意ではなかった。図2C: ウイルスフォーカスサイズの分析。BHK-21細胞またはCEF細胞の単層を、sMVAまたはwtMVAに0.002 MOIで感染させ、感染24時間後のウイルスフォーカスの面積を、αVAC抗体による免疫染色後に決定した。図2D: 宿主細胞範囲の分析。さまざまなヒト細胞株（HEK293、A549、143b、およびHeLa）、CEF細胞、またはBHK-21細胞を、sMVAまたはwtMVAに0.01 MOIで感染させ、感染48時間後のウイルス力価をCEFで決定した。点線は、0.01 MOIに基づき計算した接種材料のウイルス力価を示す。図2C～2Dの群間差は、一元配置分散分析に続いてTukeyの多重比較検定（2C）またはDunnettの多重比較検定（2D）を用いて計算した。ns = 有意差なし。 図2-1の説明を参照。 図3A～3Dは、sMVAのインビボでの免疫原性を示す。FPV HP1.441を用いて得られたsMVA（sMVA hp）、または2つの独立したウイルス再構成に由来するTROVACを用いて得られたsMVA（sMVA tv1およびsMVA tv2）を、インビトロ分析によりwtMVAと比較した。C57BL/6マウスを、低用量（1×107 PFU）または高用量（5×107 PFU）のsMVAまたはwtMVAで、3週間間隔で2回免疫した。モック免疫マウスを対照として用いた。図3A: 結合抗体。1回目および2回目の免疫後、sMVAまたはwtMVAにより刺激されたMVA特異的結合抗体（IgG力価）をELISAで測定した。図3B: NAb応答。GFPマーカーを発現する組換えwtMVAに対するブースター免疫後、sMVAまたはwtMVAにより誘導されたMVA特異的Nab力価を測定した。図3C～3D: T細胞応答。2回の免疫後にsMVAまたはwtMVAにより誘導された、MVA特異的なIFNγ、TNFα、IL-4、およびIL-10を分泌するCD8+（3C）およびCD4+（3D）T細胞応答を、B8R免疫優性ペプチドを用いたエクスビボ抗原刺激後に、フローサイトメトリーで測定した。群間差は、一元配置分散分析およびTukeyの多重比較検定を用いて査定した。ns = 有意差なし。 図3-1の説明を参照。 図3-1の説明を参照。 図4A～4Dは、sMVAのインビボでの免疫原性を示す。FPV株HP1.441を用いて得られたsMVA（sMVA hp）、または2つの独立したウイルス再構成に由来するFPV株TROVACを用いて得られたsMVA（sMVA tv1およびsMVA tv2）を、インビトロ分析によりwtMVAと比較した。C57BL/6マウス（N = 4）を、低用量（1×107 PFU）または高用量（5×107 PFU）のsMVAまたはwtMVAで、3週間間隔で2回免疫した。モック免疫マウスを対照として用いた。図4A: 結合抗体。sMVAまたはwtMVAを受けたマウスにおける、1回目および2回目の免疫後の、ELISAで測定した、種々の血清希釈度（IgG力価）でのMVA特異的結合抗体の450 nmの吸光度を示す。図4B: NAb応答。GFPマーカーを発現するwtMVAに対するブースター免疫後、sMVAまたはwtMVAにより誘導されたMVA特異的Nab力価を測定した。種々の血清希釈度での感染細胞GFP面積を正方画素（pix2×103）で測定したものを示す。図4C～4D: T細胞応答。sMVAまたはwtMVAでの2回の免疫後、ワクシニアA19L免疫優性ペプチドを用いるエクスビボ抗原刺激後に、IFNγ、TNFα、IL-4、およびIL-10を発現するMVA特異的CD8+（4C）およびCD4+（4D）T細胞を、フローサイトメトリーで測定した。群間差は、一元配置分散分析およびTukeyの多重比較検定を用いて査定した。ns = 有意差なし。 図4-1の説明を参照。 図4-1の説明を参照。 図5A～5Eは、sMVA-CoV2ベクターの構築および特徴決定を示す。図5A: ベクター構築の概略図。S抗原およびN抗原の配列（赤い球および緑の三角形）を、大腸菌における細菌性組換え法により、sMVA断片F2およびF3に挿入した。挿入された抗原配列を有する改変sMVA断片F1およびF2、ならびに無改変sMVA断片F1を、大腸菌から単離し、FPV感染BHK-21細胞にコトランスフェクトして、ウイルス再構成を開始させた。図5B: 一般に用いられるMVA挿入部位（Del2、IGR69/70、Del3）にS抗原およびN抗原の配列が挿入された、シングル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S、sMVA-N）およびダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-N/S、sMVA-S/N）の概略図。全ての抗原を、ワクシニアmH5プロモーターにより発現させた。ITRは、逆位末端配列を表す。図5C: PCR分析。sMVA-CoV2ベクターに感染させたCEFを、NおよびS抗原配列を擁するDel2およびDel3挿入部位に特異的なプライマー、またはF1/F2およびF2/F3組換え部位に特異的なプライマーを用いてPCRで査定した。図5D: ウエスタンブロット。FPV HP1.441を用いて得られたダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N hp、sMVA-N/S hp）またはTROVACを用いて得られたシングルおよびダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N tv、sMVA-N/S tv、sMVA-S tv、sMVA-N tv）に感染させたBHK-21細胞を、抗原発現について、抗S1およびN抗体（αS1およびαN Ab）を用いてウエスタンブロットで査定した。ワクシニアB5Rタンパク質が感染対照であると確認された。分子量バンドの高/低は、タンパク質種の成熟/未成熟を表し得る。図5E: フローサイトメトリー染色。ワクチンベクターに感染させたHeLa細胞を、抗S1、S2、およびN抗体（αS1、αS2、およびαN Ab）を用いての細胞表面および細胞内のフロー染色で査定した。生細胞を用いて細胞表面の抗原発現を査定した。固定および透過性細胞を用いて細胞内の抗原発現を査定した。MVAタンパク質発現を確認するために、染色対照として抗ワクシニアウイルス抗体（αVAC）を用いた。C、D、およびEの実験では、図示のように、sMVAもしくはwtMVAに感染した細胞、または感染していない細胞を対照として用いた。C、D、およびEの実験は、2回実施し、同じ結果を得た。 図5-1の説明を参照。 図6A～6Dは、sMVA-CoV2ベクターのインビトロでの特徴決定を示す。図6A～6C: 免疫蛍光画像法。すべてFPV HP1.441を用いて得られたシングル組換えワクチンsMVA-CoV2ベクター（sMVA-SおよびsMVA-N）およびダブル組換えワクチンsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/NおよびsMVA-N/S）によるS抗原およびN抗原の発現を、BHK-21細胞（6Aおよび6B）またはHeLa細胞（6C）で、NおよびS特異的抗体を用いて免疫蛍光共焦点画像法で査定した。6Bおよび6Cでは蛍光結合コムギ胚芽凝集素（WGA）を用いて細胞膜を染色した。各画像下に拡大挿入図がある。6Aのスケールバーは50μm。6Bおよび6Cのスケールバーは10μm。どの画像も、同じ結果が得られた2回の独立した実験を表す。図6D: フローサイトメトリーの二重染色。FPV TROVAC（tv）またはHP1.441（hp）のいずれかを用いて得られたシングル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-N、sMVA-S）またはダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-N/S、sMVA-S/N）に感染させたHeLa細胞を、マウス抗S2およびウサギ抗Nモノクローナル抗体、続いて抗マウスAlexa Fluor 488および抗ウサギAlexa Fluor 647により二重染色して、細胞内フローサイトメトリー分析により分析した。SおよびN特異的抗体により二重染色された細胞のパーセンテージを右上の区画（Q2）に示す。 図6-1の説明を参照。 図6-1の説明を参照。 図7A～7Hは、sMVA-CoV2ベクターにより刺激された体液性免疫応答を示す。5×107 PFUの、FPV HP1.441を用いて得られたダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N hpおよびsMVA-N/S hp）またはTROVACを用いて得られたシングルおよびダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N tv、sMVA-N/S tv、sMVA-S tv、sMVA-N tv）で3週間間隔で2回免疫したBalb/cマウスを、SARS-CoV-2特異的体液性免疫応答について査定した。図7A～7B: 結合抗体。1回目の免疫（7A）および2回目の免疫（7B）後、ワクチンベクターにより誘導されたS、RBD、およびN特異的結合抗体をELISAで測定した。7Aおよび7Bの破線は、回復期ヒト血清中で測定した結合抗体エンドポイント力価の中央値を示す（図9）。一元配置分散分析およびTukeyの多重比較検定を用いて、結合抗体エンドポイント力価の差を査定した。図7C: IgG2a/IgG1アイソタイプ比。2回目の免疫後、IgG2aおよびIgG1アイソタイプのS、RBD、およびN特異的結合抗体を、1:10000の血清希釈度を用いて測定し、吸光度を読み取って、IgG2a/IgG1抗体比を計算した。一元配置分散分析およびDunnettの多重比較検定を用いて、各群の平均IgG2a/IgG1比を1という比（均衡化されたTh1/Th2応答）と比較した。図7D～7G: NAb応答。SARS-CoV-2シュードウイルス（pv）（7D～7E）または感染性の真性SARS-CoV-2ウイルス（7F～7G）に対する1回目の免疫（7D、7F）および2回目の免疫（7E、7G）後、ワクチンベクターにより誘導されたSARS-CoV-2特異的Nab（NT90力価）を、プールした免疫マウス血清中で測定した。二連（duplicate）感染（7D～7E）または三連（triplicate）感染（7F～7G）で測定した平均NT90を示す。N/A = サンプル品質管理の不備。点線は、分析に含まれた最も低い抗体希釈度を示す。図7H: SARS-CoV-2/SARS-CoV-2pv相関分析。感染性SARS-CoV-2ウイルスおよびSARS-CoV-2pvを用いて1回および2回免疫した後にマウス血清中で測定したNT90の相関分析。ピアソン相関係数（r）はHで計算した。*p＜0.05。ns = 有意差なし。 図7-1の説明を参照。 図8A～8Gは、sMVA-CoV2ベクターにより誘導された体液性免疫応答を示す。5×107 PFUの、FPV HP1.441を用いて得られたダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N hpおよびsMVA-N/S hp）またはTROVACを用いて得られたシングルまたはダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N tv、sMVA-N/S tv、sMVA-S tv、sMVA-N tv）で3週間間隔で2回免疫したBalb/cマウス（N = 5）における抗体測定を示す。図8A～8B: 結合抗体。プライム2週間後（8A）またはブースト1週間後（8B）に採取した血清の系列希釈を用いた、450 nmでの、S、RBD、およびNに特異的なELISA測定値を示す。図8C: IgG2a/IgG1アイソタイプ比。IgG2aおよびIgG1アイソタイプの結合抗体を、ブースト後のマウス血清中1:10000の希釈度を用いて測定した。図8D～8G: NAb応答。免疫マウスの各群からプールした血清中で測定した、SARS-CoV-2pv（8D～8E）および感染性の真性SARS-CoV-2（8F～8G）の中和のパーセント（%）を示す。種々の血清希釈度で測定した、二連感染（8D～8E）または三連感染（8F～8G）の平均中和%を示す。品質管理不備のため、sMVA tvおよびPBS（モック）で免疫したワクチン群は、8Gに示す分析に含めなかった。点線は、図7のNT90の計算に用いられた、90%中和を表す。 図8-1の説明を参照。 図9A～9Cは、回復期免疫血清中のSARS-CoV-2特異的体液性免疫応答を示す。S、RBD、およびN特異的結合抗体を、SARS-CoV-2回復期の人々の血漿サンプルの系列希釈を用いてELISAで測定した。図9A: 個々のサンプルの結合抗体曲線（N = 19）。図9B: SARS-CoV-2回復期血漿の結合曲線をまとめ、SARS-CoV-2陰性の人のサンプル（N = 2）で測定された結合と比較した。図9C: S、RBD、およびNに対するエンドポイント結合抗体価を、個々の血漿サンプルで計算した。線は、エンドポイント力価の中央値を表す。査定したSARS-CoV-2陰性サンプル数が乏しいため、統計学的分析は実施しなかった。 図9Aの説明を参照。 図9Aの説明を参照。 図10A～10Bは、sMVA-CoV2ベクターにより誘導された体液性免疫応答を示す。C57BL/6 Nramp1マウス（N = 5）を、5×107 PFUの、FPV HP1.441を用いて得られたダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N hpおよびsMVA-N/S hp）またはTROVACを用いて得られたシングルおよびダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N tv、sMVA-N/S tv、sMVA-S tv、sMVA-N tv）で3週間間隔で2回免疫し、SARS-CoV-2特異的体液性免疫応答について査定した。図10A～10B: 結合抗体。ワクチンベクターにより誘導されたS、RBD、およびN特異的結合抗体を、1回目の免疫2週間後（10A）および2回目の免疫1週間後（10B）にELISAで査定した。10Aおよび10Bの破線は、回復期ヒト血清中で測定した結合抗体エンドポイント力価の中央値を示す（図9）。10Aおよび10Bのデータは、平均値±SDで表す。一元配置分散分析およびTukeyの多重比較検定を用いて、異なるワクチンベクターで免疫したマウスの結合抗体エンドポイント力価の差を比較した。図10C: IgG2c/IgG1アイソタイプ比。2回目の免疫後、IgG2cおよびIgG1アイソタイプのS、RBD、およびN特異的結合抗体を、1:10000の血清希釈度を用いて測定し、吸光度を読み取って、IgG2c/IgG1抗体比を計算した。一元配置分散分析およびDunnettの多重比較検定を用いて、各群の平均IgG2c/IgG1比を1という比（均衡化されたTh1/Th2応答）と比較した。線は中央値を表す。*0.05＜p＜0.01、**0.01＜p＜0.001、***0.001＜p＜0.0001、****p＜0.0001。ns = 有意差なし。 図10Aの説明を参照。 図10Aの説明を参照。 図11は、5×107 PFUの、FPV HP1.441を用いて得られたダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N hpおよびsMVA-N/S hp）またはTROVACを用いて得られたシングルおよびダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N tv、sMVA-N/S tv、sMVA-S tv、sMVA-N tv）で免疫したBalb/cマウスの免疫血清を、ADE効果について査定したことを示す。臨床株COH04S1の親分離株sMVA-N/S tvを含め、どのsMVA-COV2ベクターも、感染の抗体依存性増強（ADE）を誘導しなった。（ACE2を発現する安定導入HEK293T細胞（HEK/ACE2）でアッセイした）中和（1:5000）および非中和（1:50000）希釈液を、ルシフェラーゼ発現SARS-CoV-2シュードウイルス（pv）によるTHP-1単球感染の促進について査定した。VSV-G pvを感染対照として用いた。相対発光量（RLU）を、感染48時間後に二連で測定した。点線は、ネガティブ対照を表す（pv非存在下の細胞における平均相対発光量（RLU）を測定）。破線は、ポジティブ対照を表す（血清非存在下およびpv存在下の細胞における平均RLUを測定）。二元配置分散分析およびDunnettの多重比較検定を用いて、各群および血清希釈液をポジティブ対照の平均RLUと比較した。ns = 有意差なし; *p＜0.05。 図12A～12Dは、sMVA-CoV2ベクターにより刺激された細胞性免疫応答を示す。Balb/cマウスを、5×107 PFUの、FPV HP1.441を用いて得られたダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N hpおよびsMVA-N/S hp）またはTROVACを用いて得られたシングルまたはダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N tv、sMVA-N/S tv、sMVA-S tv、sMVA-N tv）で3週間間隔で2回免疫し、SARS-CoV-2特異的細胞性免疫応答について査定した。2回の免疫後、ワクチンベクターにより誘導された抗原特異的CD8+（12Aおよび12B）およびCD4+（12Cおよび12D）T細胞応答を、SARS-CoV-2 SおよびN特異的ペプチドライブラリーを用いるエクスビボ抗原刺激後に、IFNγ、TNFα、IL-4、およびIL-10分泌についてフローサイトメトリーで査定した。技術上の問題により、12Cおよび12DのCD4/TNFα分析には1～3動物/群を含めなかった。一元配置分散分析およびTukeyの多重比較検定を用いて、群間のサイトカイン特異的T細胞の割合（%）の差を比較した。*p＜0.05。ns = 有意差なし。 図12Aの説明を参照。 図12Aの説明を参照。 図12Aの説明を参照。 図13A～13Cは、フローサイトメトリーのゲーティング戦略を示す。図13A: SおよびNペプチドライブラリーで刺激したマウス脾細胞の細胞内染色の分析を、リンパ球＞シングレット＞CD3+ T細胞＞CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞＞サイトカイン陽性細胞を含むヒエラルキー的ゲーティング戦略を用いて実施した。図13B～13C: サイトカイン陽性CD8+ T細胞（13B）およびCD4+ T細胞（13C）のゲーティングの例。ダブル組換えsMVA-CoV2ベクターsMVA-N/Sで免疫したマウスの脾細胞を、未処置のまま放置（ペプチドなし）、またはSもしくはNペプチドプールで16時間刺激、のいずれかとした。各ドットプロットの数値は、ゲートエリア内の細胞のパーセンテージを示す。 図13Aの説明を参照。 図13Aの説明を参照。 図14は、sMVA-CoV2免疫マウスのT細胞によるTNFα分泌を示す。5×107 PFUの、FPV HP1.441を用いて得られたダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N hpおよびsMVA-N/S hp）またはTROVACを用いて得られたシングルおよびダブル組換えsMVA-CoV2ベクター（sMVA-S/N tv、sMVA-N/S tv、sMVA-S tv、sMVA-N tv）で免疫したBalb/cマウスの脾細胞を、TNFα分泌について査定した。マウス脾細胞をSまたはNペプチドライブラリーで刺激し、48時間後に細胞培養上清中のTNFαをELISAで測定した。無刺激サンプル中のTNFα量を定量化し、各ペプチド刺激サンプルから引いた。*p＜0.05 一元配置分散分析およびDunnettの多重比較検定を用いてモック免疫マウスと比較。 図15A～15Eは、sMVA-CoV2ベクターにより誘導された体液性免疫応答を示す。SARS-CoV-2特異的体液性免疫応答を、シングル組換えsMVA-CoV2ベクター、sMVA-SおよびsMVA-Nの単独または組み合わせで免疫したマウスで査定した。Balb/cマウス（N = 5）を、高用量（5×107 PFU）または低用量（1×107 PFU）のsMVA-SおよびsMVA-Nで3週間間隔で2回免疫した。同じ免疫スケジュールの、各ワクチンベクターの高用量または低用量の半分の用量の同時免疫を査定して、組み合わせたベクターによるS抗原およびN抗原に対するSARS-CoV-2特異的免疫刺激を評価した。空sMVAベクターで免疫したマウス、またはモック免疫マウスを対照として用いた。図15A～15B: 結合抗体。S、RBD、およびNに対する抗原特異的結合抗体を、1回目および2回目の免疫後にELISAで決定した。破線は、回復期ヒト血清中で測定した結合抗体エンドポイント力価の中央値を示す（図9）。一元配置分散分析およびTukeyの多重比較検定を用いて、異なるワクチン用量で免疫したマウスの、および単独または組み合わせたワクチンベクターで免疫したマウスの結合抗体エンドポイント力価の差を比較した。図15C: IgG2a/IgG1アイソタイプ比。免疫マウスのブースト後の血清を用いて、異なる抗原についてアイソタイプ特異的ELISAを実施した後、S、RBD、およびNに対するIgG2a/IgG1結合抗体の比を計算した。一元配置分散分析およびDunnettの多重比較検定を用いて、各群の平均を1という比（均衡化されたTh1/Th2応答）と比較した。図15D～15E: Nab力価。2回目免疫後、プールした血清中、SARS-CoV-2シュードウイルスを用いる中和アッセイにより、SARS-CoV-2特異的NAb応答を測定した。図15Dに、SARS-CoV-2シュードウイルス感染を90%阻止する中和抗体価（NT90）を示す。点線のベースラインは、分析に含まれた最小希釈度を表す。NT90＜ベースラインの群を、ベースラインのところに示す。Eは、プールした血清の系列希釈を用いて測定した中和%を示す。Eの点線は、90%中和を表す。*p＜0.05。 図15Aの説明を参照。 図15Aの説明を参照。 図15Aの説明を参照。 図15Aの説明を参照。 図16A～16Bは、sMVA-CoV2ベクターの細胞性免疫応答のインビボでの免疫原性を示す。SARS-CoV-2特異的細胞性免疫応答を、sMVA-CoV2シングル組換えベクターsMVA-SおよびsMVA-Nの単独または組み合わせで免疫したマウスで査定した。Balb/cマウス（N = 5）を、高用量（5×107 PFU）または低用量（1×107 PFU）のsMVA-CoV2シングル組換えsMVA-SおよびsMVA-Nで、3週間間隔で2回免疫した。同じ免疫スケジュールの、各ワクチンベクターの高用量または低用量の半分の用量の同時免疫を査定して、組み合わせたベクターによるS抗原およびN抗原に対するSARS-CoV-2特異的免疫刺激を評価した。空sMVAベクターで免疫したマウス、またはモック免疫マウスを対照として用いた。IFNγ、TNFα、およびIL-2を発現する抗原特異的CD8+ T細胞、およびIFNγを発現するCD4+ T細胞を、SARS-CoV-2特異的SおよびNペプチドライブラリーを用いるエクスビボ抗原刺激後に、フローサイトメトリー染色で査定した。一元配置分散分析の後にDunnettの多重比較検定を用いて、各群の平均をモック免疫マウスの平均と比較した。*p＜0.05。ns = 有意差なし。 図16Aの説明を参照。 図17は、SARS-CoV-2臨床候補ワクチンCOH04S1、SARS-CoV-2 S抗原およびN抗原を発現する合成MVAウイルスベクターベースワクチン（sMVA-N/S）を示す。S抗原およびN抗原をコードする遺伝子配列が、図示のように、Del3およびDel2挿入部位に挿入されている。mH5 = 改変ワクシニアH5プロモーター; ITR = 逆位末端配列; UR = 内部ユニーク領域。 図18は、前臨床げっ歯類モデルにおいてC46（別名sMVA-S/N）がSARS-CoV-2に対する強力な結合抗体応答を誘導したことを示す。破線は、回復期ヒト血清中で測定した結合抗体エンドポイント力価の中央値を示す。緑のひし形はC46（別名sMVA-S/N）を表し、これはスパイクおよびヌクレオカプシド抗原の両方を発現するsMVA-CoV2ダブル組換えワクチンである。青い円はsMVA-Sを表し、これはスパイク抗原のみのシングル組換えsMVAである。赤い四角形はsMVA-Nを表し、これはヌクレオカプシド抗原のみのsMVA-CoV2シングル組換え体である。茶色の逆三角形は、SARS-CoV-2抗原なしのsMVAウイルスベクターを表す。紺色の三角形は、モックワクチン接種を表す。 図19は、臨床候補COH04S1が、前臨床げっ歯類モデルで、強力な細胞性（T細胞）免疫応答を誘導したことを示す。COH04S1（C35、sMVA-N/S）により誘導されたスパイクおよびヌクレオカプシドに特異的なIFNγ、TNFα、およびIL-4 CD8+およびCD4+応答を、スパイクのみを発現するsMVA-CoV2シングル組換えワクチン（sMVA-S）、空対照sMVA、モック免疫動物、およびミョウバン混合スパイクで免疫したマウスにより誘導された応答と比較した。COH04S1臨床候補は、ロバストなスパイクおよびヌクレオカプシドT細胞応答を誘導した。 図19-1の説明を参照。 図20は、C35（sMVA-N/S）接種マウスの体液性および細胞性応答が、Th1応答を示したことを示している。臨床候補COH04S1（sMVA-N/S）で免疫したBALB/cマウスにおける体液性および細胞性応答を、スパイクのみを発現するsMVA（sMVA-S）、空対照sMVA、モック免疫動物、およびミョウバン混合スパイクで免疫したマウスにより誘導された応答と比較した。スパイク/ミョウバン免疫動物は、ワクチン接種後、IgG1に偏った抗体応答およびIL-4に偏ったT細胞応答により示されるように、Th2応答を発生した。臨床候補COH04S1（sMVA-N/S）免疫マウスは、Th1にシフトした体液性および細胞性応答を示した。 図21は、HeLa-ACE2細胞で生SARS-CoV-2を用いたプラーク減少アッセイで、臨床候補COH04S1が、前臨床げっ歯類モデルで強力なSARS-CoV-2中和抗体応答を誘導したことを示す。*NT50/90は、感染の50/90%中和を示す（抗体含有）血清の希釈度である。 図22は、感受性細胞（VeroE6）で真性SARS-CoV-2ウイルスを用いて、臨床候補COH04S1がマウスで強力なSARS-CoV-2特異的中和抗体（Nab）を誘発したことを示す。臨床候補COH04S1プライムおよびプライムブーストマウス血清を、生SARS-CoV-2の中和ついて分析し、軽症～重症のSARS-CoV-2感染症を有する35人のヒト血漿サンプルのプールにおける中和と比較した。 図23は、sMVAベースのSARS-CoV2ワクチンが感染の抗体依存性増強（ADE）を誘導しなかったことを示す。 図24は、COH04S1がマウスの腹腔内（IP）および鼻腔内（IN）接種後に強い免疫応答を誘導したことを示す。臨床候補COH04S1を用いてBalb/cマウスをIPまたはINにより免疫した。臨床候補COH04S1により誘導された応答を、ミョウバンと混合したスパイクおよびヌクレオカプシドタンパク質により誘導された体液性および細胞性応答と比較した。プライム後およびブースト後の抗体応答を、IgGおよびIgA RBD-ELISAならびに真性SARS-CoV-2ウイルス中和アッセイで査定した。SおよびN特異的ペプチドライブラリーでの脾細胞刺激後、T細胞応答をIFNγ-ELISPOTで査定した。 図25A～25Dは、HLAトランスジェニックマウスにおいてSARS-CoV2 sMVA構築物sMVA-N/Sにより誘導されたCD8+ T細胞応答を示す。HLA-B*07:02（B7）トランスジェニックマウス（n = 4）を、3週間間隔で2回、1×107 PFUのSARS-CoV2 sMVA構築物sMVA-N/SまたはsMVA対照ベクター（FPV TROVACを用いて再構成）で免疫した。B7マウス（n = 3）を追加の対照としてモック免疫した。SARS-CoV-2特異的CD8+ T細胞の発生を、ブースター免疫1週間後に査定した。図25A～25Dは、細胞内サイトカイン染色を示す。ヌクレオカプシド特異的（25Aおよび25C）ならびにスパイク特異的（25Bおよび25D）CD8+ T細胞を、IFNγ、TNFα、およびIL-4分泌について、それぞれNおよびSペプチドライブラリーによるエクスビボ抗原刺激後に、細胞内サイトカイン染色で査定した。パネル25Aおよび25Bは、ペプチド刺激後にIFNγ、TNFα、またはIL-4を分泌するCD3+/CD8+ T細胞のパーセンテージを示す。パネル25Cおよび25Dは、ペプチド刺激後に1つまたは複数のサイトカインを分泌するCD8+ T細胞の相対的な頻度を示す。CD3+/CD8+ 集団内のサイトカイン分泌細胞の合計パーセンテージを、各パイチャート下に示す。25Aおよび25Bでは一元配置分散分析およびDunnettの多重比較検定を用いた。25Aおよび25Bのデータを平均値±SDとして示す; *0.05＜p＜0.01、**0.01＜p＜0.001、***0.001＜p＜0.0001、****p＜0.0001; ns = 有意差なし。 図26は、臨床候補COH04S1（sMVA-N/S）で免疫したHLA-B*07:02（B7）トランスジェニックマウスにおけるT細胞応答を示す。SおよびNペプチドライブラリー、Sライブラリーサブプール（1S1、2S1、S2）、ならびにHLA-B*07:02制限N特異的免疫優性エピトープSPRWYFYYL（SEQ ID NO: 90）含有N26ペプチドでの刺激後に、IFNγ分泌細胞のELISpot分析を実施した。二元配置分散分析およびDunnettの多重比較検定を用いた。データを平均値±SDとして示す; *0.05＜p＜0.01、**0.01＜p＜0.001、***0.001＜p＜0.0001、****p＜0.0001; ns = 有意差なし。 図27は、老齢マウスが、臨床候補COH04S1でのプライムブースト免疫後、若齢マウスに匹敵する免疫応答を生じたことを示す。臨床候補COH04S1を用いて若齢（8週齢）、中齢（40週齢）、および老齢（80週齢）C57BL/6マウスを免疫した。対照動物は、同齢の、ミョウバンと混合したスパイクおよびヌクレオカプシドタンパク質で免疫したマウス、ならびにモック免疫動物であった。HEK-293/Ace2細胞でSARS-CoV-2スパイクシュードウイルスを用いて中和抗体を査定した。スパイクペプチドサブプール（1S1、2S1、およびS2）、ならびにNペプチドでのマウス脾細胞刺激後に、マウスIFNγ ELISpotアッセイを用いてT細胞応答を測定した。 図28は、臨床候補COH04S1の免疫原性を示す。COH04S1は、Balb/Cマウスの雌雄間で同等の免疫原性を示し、また、S/N/ミョウバンと比較して、全抗原に対しTh1免疫を示す。 図29は、ハムスターの臨床候補COH04S1ワクチン試験デザインを示す。 図30は、ハムスターにおける1×108 pfuのsMVA-CoV2ワクチン構築物での筋肉内（IM）または鼻腔内（IN）免疫後、sMVA-SARS-CoV-2ベクターおよび臨床候補COH04S1臨床候補により誘導された結合抗体の力価を示す。この試験で用いたsMVA-CoV2ワクチンは、C79（2Pスパイク配列を有するS2P/Nダブル組換え）、臨床候補COH04S1（C35/F4/B1、C35ダブル組換えの二重プラーク精製分離株）、C35/F4/D5（C35ダブル組換えの二重プラーク精製分離株）、C46/C3/F10（C46ダブル組換えの二重プラーク精製分離株）、C15（スパイクのみ発現するシングル組換え）、C35（ダブル組換え、且つCOH04S1臨床分離株の親クローン）であった。sMVA空ベクターを対照として用いた。 図30-1の説明を参照。 図31は、42日目に測定した、ハムスターにおいてsMVA-SARS-CoV-2ベクターおよびCOH04S1臨床候補により誘導された中和抗体（PRNT）を示す。ハムスターは、筋肉内または鼻腔内の1×108 pfuの臨床候補COH04S1またはsMVA-SARS-CoV-2ベクターで、0日目にプライムし、28日目にブーストした。空ベクターsMVA免疫ハムスターを対照として用いた。ベロ細胞を用いて真性SARS-CoV-2ウイルス中和抗体をインビトロで測定した。Bioqual（メリーランド州ゲイサーズバーグ）で、SARS-CoV-2の分離株USA-WA1/2020を用いてPRNTアッセイを行った。42日目の血清サンプルを分析に用いた。 図32は、sMVA-CoV2ベクターまたはCOH04S1で免疫し、ブースト後2週間で6×104 pfuの真性SARS-CoV-2ウイルス分離株USA-WA1/2020に曝露した、ハムスターの体重変化を示す。10日間毎日体重変化を測定した。COH04S1を含め、全てのsMVA-CoV2ベクターが、曝露された動物の重篤な体重減少を阻止した。 図33は、筋肉内または鼻腔内のsMVA-CoV2ベクターで免疫し、ブースト後2週間で6×104 pfuの真性SARS-CoV-2ウイルス分離株USA-WA1/2020に曝露した、ハムスターの体重変化を示す。10日間毎日体重変化を測定した。動物は、免疫経路（上）または性別（下）によりグループ分けした。 図34は、ハムスターにおいて臨床候補COH04S1により誘導された結合抗体および中和抗体を示す。ハムスターは、筋肉内または鼻腔内の1×108 pfuの臨床候補COH04S1で0日目にプライムし、28日目にブーストした。空ベクターsMVA免疫ハムスターを対照として用いた。プライム後（28日目）およびブースト後（42日目）の免疫ハムスターで測定した、スパイク、RBD、およびヌクレオカプシドに対するエンドポイント結合抗体価（合計IgG）を示す。スパイク、RBD、およびヌクレオカプシドに対するIgG2/3とIgG1免疫グロブリンとの力価の比が示され、臨床候補COH04S1免疫ハムスターにおける応答がTh1に偏っていることがわかる。ベロ細胞を用いて真性SARS-CoV-2ウイルス中和血清抗体をインビトロで測定した。Bioqualで、SARS-CoV-2分離株USA-WA1/2020を用いてPRNTアッセイを行った。42日目の血清サンプルを分析に用いた。 図34-1の説明を参照。 図35は、臨床候補COH04S1接種ハムスターが、真性SARS-CoV-2ウイルスでの亜致死的曝露に対し成功裏に防護されたことを示す。ハムスターを、ブースト後2週間でSARS-CoV-2分離株USA-WA1/2020に曝露し、10日間毎日体重変化を測定した。太線は体重減少の中央値を示す。細線は動物一匹の体重減少を示す。 図36は、曝露後10日目のウイルス量分析を示す。肺および鼻甲介の洗浄液を曝露の10日後に採取し、SARS-CoV-2ゲノムRNA（gRNA）（図36A）およびサブゲノムRNA（sgRNA、図36B）の存在について分析した。筋肉内（IM）または鼻腔内（IN）投与した臨床候補COH04S1は、SARS-CoV-2ウイルスの肺内の複製を成功裏に阻止し、且つ鼻甲介のウイルス量を減少させた。 図36Aの説明を参照。 図37は、フェレットにおける、臨床候補COH04S1の筋肉内（IM）および鼻腔内（IN）接種により誘導された強い免疫応答を示す。結合抗体は、S、RBD、およびN-IgG ELISAで査定した。中和抗体の力価は、VeroE6細胞で真性SARS-CoV-2ウイルスを用いて測定した。フェレットのPBMC中のT細胞IFNγ応答を、フェレットIFNγ-ELISpotを用いて測定した。 図38は、アフリカミドリザル（AGM）における臨床候補COH04S1の試験デザインを示す。AGMを臨床候補COH04S1で1回または2回免疫した。プライムのみでの試験（試験2）の動物は、2.5×108 pfuで免疫した。プライムブースト試験（試験1）では、AGMを1×108 pfuで免疫した。 図39は、T細胞応答を臨床候補COH04S1免疫AGMで査定したことを示す。新鮮分離PBMCをSおよびNペプチドライブラリーで刺激した後、スパイク（S）およびヌクレオカプシド（N）を認識するIFNγ T細胞のレベルをELISpotで定量化した。 図40は、試験1（プライムブースト）の細胞性応答を示す。プライムブーストAGMからブースト2週間後および5週間後（曝露時）に新鮮分離したPBMC中、スパイク（S）、ヌクレオカプシド（N）、および膜（M）タンパク質に対するIFNγ、IL-2、およびIL-4応答を、ELISpotで測定した。 図40-1の説明を参照。 図41は、試験2（プライムのみ）の細胞性応答を示す。プライムAGMからプライム2週間後および5週間後（曝露時）に新鮮分離したPBMC中、スパイク（S）、ヌクレオカプシド（N）、および膜（M）タンパク質に対するIFNγ、IL-2、およびIL-4応答を、ELISpotで測定した。 図41-1の説明を参照。 図42は、曝露後2日目および4日目の気管支肺胞洗浄液（BAL）中のゲノムRNA（gRNA）のqPCRによる定量化を示す。 図43は、試験1および試験2の、曝露後2日目、4日目、および7日目の、TCID50エンドポイント希釈アッセイによる、気管支肺胞洗浄液（BAL）中のウイルス量の定量化を示す。 図44は、モック、sMVA、および臨床候補COH04S1のプライムおよびプライムブーストAGMにおける、曝露後のBALウイルス量（TCID50）の比較を示す。 図45Aは、DL1センチネルにおける120日目までのS、RBD、およびN特異的結合抗体エンドポイント力価を示す。 図45Bは、DL2センチネルにおける90日目までのS、RBD、およびN特異的結合抗体エンドポイント力価を示す。 図45Cは、DL3センチネルにおける56日目までのS、RBD、およびN特異的結合抗体エンドポイント力価を示す。 図46は、臨床候補COH04S1 DL1/DL2/DL3センチネルでプライム後120日目まで測定した、S、RBD、およびNに対する結合抗体エンドポイント力価を示す。スパイクに基づくEUA Pfizer-BioNTech SARS-CoV-2 mRNA EUAワクチンを2回受けた11人の血清を、ワクチン後60日目および90日目に分析し、サンプル採取前に軽症～重症のSARS-CoV-2症状を有していた35人のSARS-CoV-2回復期の人々のプールからの抗体価を比較として含めた。DL1 = 4センチネル 120日目、DL2 = 5センチネル 90日目、DL3 = 6センチネル 56日目、EUA = 14サンプル 60日目、12サンプル 90日目、回復期 = 35サンプル。 図47は、DL1、DL2、およびDL3センチネルで経時的にELISAで定量化した、スパイク（武漢D614G株）、およびスパイクP.1ブラジルの懸念される変異株（VOC）に対する結合抗体の比較を示す（上）。武漢D614GスパイクおよびP.1スパイクに対し、DL1/DL2/DL3センチネルおよびEUA Pfizer/BioNTechワクチンレシピエントで測定した、56～60日目のELISAエンドポイント力価（下）。 図47-1の説明を参照。 図48は、D614G変異（D614G）を有するSARS-CoV-2武漢株、ならびに懸念される変異株（VOC）B.1.1.7（UK）、B.1.351（RSA）、およびP.1（BRA）に由来するスパイクシュードウイルスを用いて、DL1、DL2、およびDL3センチネルでプライム免疫後90日まで測定した中和抗体価を示す。 図49は、D614G変異（D614G）を有するSARS-CoV-2武漢株、ならびに懸念される変異株（VOC）B.1.1.7（UK）、B.1.351（RSA）、およびP.1（BRA）に由来するスパイクシュードウイルスを用いて測定した中和抗体価を示す。DL1およびDL2センチネルは56日目に、DL3センチネルは42日目または可能であれば56日目に、そしてEUA-Pfizerワクチンレシピエントは60日目に査定した。 図50は、臨床候補COH04S1で免疫した健康な成人（DL1）が、予備分析において、S抗原およびN抗原に対し機能性T細胞応答を生じたことを示す。 図51は、臨床候補COH04S1でのプライム免疫後、DL1センチネルは120日目まで、DL2センチネルは90日目まで、DL3センチネルは56日目まで、IFNγ/IL-4フルオロスポットを用いて測定した、S、N、およびMに特異的なIFN-γおよびIL-4 T細胞応答を示す。PBMCをインビトロで48時間、スパイク、ヌクレオカプシド、または膜のペプチドプールの存在下で培養した。 図52は、臨床候補COH04S1でのプライム免疫後、DL1、DL2、およびDL3センチネルで120日まで測定した、S、N、およびMに特異的なIFN-γおよびIL-4 T細胞応答を示す。 図52-1の説明を参照。 図53は、臨床候補COH04S1センチネル、およびPfizer/BioNTechワクチンレシピエントのプールで、プライム免疫後56～60日目（上）および90日目（下）に測定した、S抗原およびN抗原に対するIFN-γおよびIL-4応答を示す。COH04S1:56日目/90日目、EUA: 60日目/90日目、D0応答を差し引いた。 図53-1の説明を参照。 図54A～54Dは、SARS-CoV-2 VOCワクチンベクターC163およびC164による抗原発現を示す。CEF細胞をVOC sMVAベクターC163およびC164またはオリジナルCOH04S1 sMVA-CoV2ベクター（C35）に感染させ、Sタンパク質のS1およびS2ドメインに特異的な抗体（αS1およびαS2）またはNに特異的な抗体（αN）を用いてウエスタンブロットで査定した。非感染CEF細胞、および空sMVAベクター感染CEF細胞を、対照として分析した。ワクシニアB5Rタンパク質（αB5R）を検出して、ワクチンベクターがほぼ同等のレベルで感染したことを確認した。 図55A～55Cは、SARS-CoV-2 VOCワクチンベクターC170による抗原発現を示す。CEF細胞をVOC sMVAベクターC170またはオリジナルCIG04S1 sMVAワクチン構築物（C35）に感染させ、Sタンパク質のS1ドメインに特異的な抗体（αS1）またはNに特異的な抗体（αN）を用いてウエスタンブロットで査定した。非感染CEF細胞、および空sMVAベクター感染CEF細胞を、対照として分析した。ワクシニアB5Rタンパク質（αB5R）を検出して、ワクチンベクターがほぼ同等のレベルで感染したことを確認した。 図56は、前臨床ワクチン製造プロセスの概要を示す。 図57は、図56の拡張であり、オリジナルC35 sMVA-N/Sワクチンベクターから臨床ワクチン候補COH04S1を得ることを例示している。 図58は、sMVA-N/Sの配列（SEQ ID NO: 1）を示す（アクセッション番号MW036243としてNCBIに寄託、www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW036243.1/）。 図58-1の続きを示す。 図58-2の続きを示す。 図58-3の続きを示す。 図58-4の続きを示す。 図58-5の続きを示す。 図58-6の続きを示す。 図58-7の続きを示す。 図58-8の続きを示す。 図58-9の続きを示す。 図58-10の続きを示す。 図58-11の続きを示す。 図58-12の続きを示す。 図58-13の続きを示す。 図58-14の続きを示す。 図58-15の続きを示す。 図58-16の続きを示す。 図58-17の続きを示す。 図58-18の続きを示す。 図58-19の続きを示す。 図58-20の続きを示す。 図58-21の続きを示す。 図58-22の続きを示す。 図58-23の続きを示す。 図58-24の続きを示す。 図58-25の続きを示す。 図58-26の続きを示す。 図58-27の続きを示す。 図58-28の続きを示す。 図58-29の続きを示す。 図58-30の続きを示す。 図58-31の続きを示す。 図58-32の続きを示す。 図58-33の続きを示す。 図58-34の続きを示す。 図58-35の続きを示す。 図58-36の続きを示す。 図58-37の続きを示す。 図58-38の続きを示す。 図59は、sMVA-S/Nの配列（SEQ ID NO: 2）を示す（アクセッション番号MW030460としてNCBIに寄託、www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW030460.1/）。 図59-1の続きを示す。 図59-2の続きを示す。 図59-3の続きを示す。 図59-4の続きを示す。 図59-5の続きを示す。 図59-6の続きを示す。 図59-7の続きを示す。 図59-8の続きを示す。 図59-9の続きを示す。 図59-10の続きを示す。 図59-11の続きを示す。 図59-12の続きを示す。 図59-13の続きを示す。 図59-14の続きを示す。 図59-15の続きを示す。 図59-16の続きを示す。 図59-17の続きを示す。 図59-18の続きを示す。 図59-19の続きを示す。 図59-20の続きを示す。 図59-21の続きを示す。 図59-22の続きを示す。 図59-23の続きを示す。 図59-24の続きを示す。 図59-25の続きを示す。 図59-26の続きを示す。 図59-27の続きを示す。 図59-28の続きを示す。 図59-29の続きを示す。 図59-30の続きを示す。 図59-31の続きを示す。 図59-32の続きを示す。 図59-33の続きを示す。 図59-34の続きを示す。 図59-35の続きを示す。 図59-36の続きを示す。 図59-37の続きを示す。 図59-38の続きを示す。 図59-39の続きを示す。 図59-40の続きを示す。 図59-41の続きを示す。 図60は、武漢-Hu-1分離株であるNCBI SARS-CoV-2標準株（reference strain）（#NC_045512）のゲノム配列をベースとするスパイク（S）抗原配列のDNA配列/オープンリーディングフレーム（ORF）（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 3）を示す。 図61は、武漢-Hu-1分離株であるNCBI SARS-CoV-2標準株（#NC_045512）のゲノム配列をベースとするスパイク（S）抗原配列のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 4）を示す。 図62は、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし、且つ同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されている、SARS-CoV-2 S抗原配列のDNA配列/オープンリーディングフレーム（ORF）（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 5）を示す。 図63は、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし、且つ同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されている、SARS-CoV-2 S抗原配列のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 6）を示す。 図64は、武漢-Hu-1分離株であるNCBI SARS-CoV-2標準株（#NC_045512）のゲノム配列をベースとするヌクレオカプシド（N）抗原配列のDNA配列/オープンリーディングフレーム（ORF）（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 7）を示す。 図65は、武漢-Hu-1分離株であるNCBI SARS-CoV-2標準株（#NC_045512）のゲノム配列をベースとするヌクレオカプシド（N）抗原配列のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 8）を示す。 図66は、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし、且つ同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されている、SARS-CoV-2 N抗原配列のDNA配列/オープンリーディングフレーム（ORF）（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 9）を示す。 図67は、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし、且つ同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されている、SARS-CoV-2 N抗原配列のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 10）を示す。 図68は、2P改変（アミノ酸位置986および987のリジンおよびバリンがプロリンで置換されている）を有する融合前安定化S抗原をコードするようにさらに改変されている、上記で開示されるコドン最適化S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）のDNA配列/オープンリーディングフレーム（ORF）（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 11）を示す。 図69は、2P改変（アミノ酸位置986および987のリジンおよびバリンがプロリンで置換されている）を有する融合前安定化S抗原をコードするようにさらに改変されている、上記で開示されるコドン最適化S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 12）を示す。 図70は、2P改変（アミノ酸位置986および987のリジンおよびバリンがプロリンで置換されている）および変異フリン切断部位（位置682～685のRRARアミノ酸がGSASに置換されている）を有する融合前安定化S抗原をコードするようにさらに改変されている、上記で開示されるコドン最適化S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 13）を示す。 図71は、2P改変（アミノ酸位置986および987のリジンおよびバリンがプロリンで置換されている）および変異フリン切断部位（位置682～685のRRARアミノ酸がGSASで置換されている）を有する融合前安定化S抗原をコードするようにさらに改変されている、上記で開示されるコドン最適化S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 14）を示す。 図72は、2P改変（アミノ酸位置986および987のリジンおよびバリンがプロリンで置換されている）、変異フリン切断部位（位置682～685のRRARアミノ酸がGSASで置換されている）、ならびに小胞体保留を阻止するためおよび細胞表面発現を増強するためのC末端の19アミノ酸残基欠失を有する融合前安定化S抗原をコードするようにさらに改変されている、上記で開示されるコドン最適化S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 15）を示す。 図73は、2P改変（アミノ酸位置986および987のリジンおよびバリンがプロリンで置換されている）、変異フリン切断部位（位置682～685のRRARアミノ酸がGSASで置換されている）、ならびに小胞体保留を阻止するためおよび細胞表面発現を増強するためのC末端の19アミノ酸残基欠失を有する融合前安定化S抗原をコードするようにさらに改変されている、上記で開示されるコドン最適化S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 16）を示す。 図74は、ヒトでの発現のために十分にコドン最適化されており、さらに、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されており、且つ変異フリン切断部位および安定化2P変異を有するS抗原をコードする、SARS-CoV-2 S抗原配列（SEQ ID NO: 17）を示す。 図75は、ワクシニアウイルス発現のために十分にコドン最適化されており、さらに、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されており、且つ変異フリン切断部位および安定化2P変異を有するS抗原をコードする、SARS-CoV-2 S抗原配列（SEQ ID NO: 18）を示す。 図76は、ヒトでの発現のために十分にコドン最適化されており、且つさらに、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されている、SARS-CoV-2 N抗原配列（SEQ ID NO: 19）を示す。 図77は、ワクシニアウイルス発現のために十分にコドン最適化されており、且つさらに、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されている、SARS-CoV-2 N抗原配列（SEQ ID NO: 20）を示す。 図78は、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているSARS-CoV-2 S抗原のN末端の698個のアミノ酸残基を含むS1ドメインのDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 21）を示す。 図79は、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているSARS-CoV-2 S抗原のN末端の698個のアミノ酸残基を含むS1ドメインのコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 22）を示す。 図80は、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているSARS-CoV-2 S抗原のN末端の680個のアミノ酸残基を含むS1ドメインのDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 23）を示す。 図81は、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているSARS-CoV-2 S抗原のN末端の680個のアミノ酸残基を含むS1ドメインのコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 24）を示す。 図82は、S抗原のシグナルペプチド（C末端の13アミノ酸）に融合している、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているSARS-CoV-2 S抗原のアミノ酸残基331～524を含むRBDのDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 25）を示す。 図83は、S抗原のシグナルペプチド（C末端の13アミノ酸）に融合している、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているSARS-CoV-2 S抗原のアミノ酸残基331～524を含むRBDのコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 26）を示す。 図84は、S抗原のシグナルペプチド（C末端の13アミノ酸）に融合している、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているSARS-CoV-2 S抗原のアミノ酸残基319～541を含むRBDのDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 27）を示す。 図85は、S抗原のシグナルペプチド（C末端の13アミノ酸）に融合している、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているSARS-CoV-2 S抗原のアミノ酸残基319～541を含むRBDのコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 28）を示す。 図86は、南アフリカで同定されたB.1.351変異株系統の変異（N501Y、E484K、K417N、L18F、D80A、D215G、Del242-244、R246I、D614G、A701I）を含むS抗原をコードするようにさらに改変されている、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されているコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 29）を示す。 図87は、南アフリカで同定されたB.1.351変異株系統の変異（N501Y、E484K、K417N、L18F、D80A、D215G、Del242-244、R246I、D614G、A701V）を含むS抗原をコードするようにさらに改変されている、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されているコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 30）を示す。 図88は、英国で同定されたB.1.1.7変異株系統の変異（N501Y、Del69/70、Del144、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H）を含むS抗原をコードするようにさらに改変されている、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されているコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 31）を示す。 図89は、英国で同定されたB.1.1.7変異株系統の変異（N501Y、Del69/70、Del144、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H）を含むS抗原をコードするようにさらに改変されている、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されているコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 32）を示す。 図90は、カリフォルニア州で同定されたB.1.429+B.1.427変異株系統の変異（D614G、L452R、S13I、W152C）を含むS抗原をコードするようにさらに改変されている、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されているコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 33）を示す。 図91は、カリフォルニア州で同定されたB.1.429+B.1.427変異株系統の変異（D614G、L452R、S13I、W152C）を含むS抗原をコードするようにさらに改変されている、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されているコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 34）を示す。 図92は、ブラジルで同定されたP.1変異株系統の変異（N501Y、E484K、K417T、L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027I、V1176F）を含むS抗原をコードするようにさらに改変されている、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されているコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 35）を示す。 図93は、ブラジルで同定されたP.1変異株系統の変異（N501Y、E484K、K417T、L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027I、V1176F）を含むS抗原をコードするようにさらに改変されている、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されているコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 36）を示す。 図94は、武漢-Hu-1標準株のS抗原をコードする配列（SEQ ID NO: 37）を示す。 図95は、南アフリカ変異株B.1.351のS抗原をコードする配列（SEQ ID NO: 38）を示す。 図96は、英国変異株B.1.1.7のS抗原をコードする配列（SEQ ID NO: 39）を示す。 図97は、N末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41) を含む、三重多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 40）を示し、ここでRBDドメインはGSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーにより接続されている。 図98は、N末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41) を含む、三重多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 43）を示し、ここでRBDドメインはGSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーにより接続されている。 図99は、N末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41)を含み、且つC末端にT4フォールドンドメイン (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、SEQ ID NO: 45) を含む、三重多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 44）を示し、ここでRBDドメインはGSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーにより接続されている。 図100は、N末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41)を含み、且つC末端にT4フォールドンドメイン (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、SEQ ID NO: 45) を含む、三重多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 46）を示し、ここでRBDドメインはGSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーにより接続されている。 図101は、多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 47）を示し、ここでは、各RBDドメインがN末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41) を含み、且つRBDドメインは、GSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーならびにP2AおよびT2Aペプチドにより接続されている。 図102は、多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 48）を示し、ここでは、各RBDドメインがN末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41) を含み、且つRBDドメインは、GSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーならびにP2AおよびT2Aペプチドにより接続されている。 図103は、多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 49）を示し、ここで、RBDドメインは、GSリンカー（GSGSGS、SEQ ID NO: 42）ならびにP2AおよびT2Aペプチドにより接続されており、且つ各RBDドメインが、N末端でSシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41) に、C末端でT4フォールドンドメイン (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、SEQ ID NO: 45) に融合している。 図104は、多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 50）を示し、ここで、RBDドメインは、GSリンカー（GSGSGS、SEQ ID NO: 42）ならびにP2AおよびT2Aペプチドにより接続されており、且つ各RBDドメインが、N末端でSシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41) に、C末端でT4フォールドンドメイン (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、SEQ ID NO: 45) に融合している。 図105は、N末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41) を含み、C末端にS抗原のTMおよびCTドメイン（最後の19アミノ酸なし）を含む、多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 51）を示し、ここでRBDドメインはGSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーにより接続されている。 図106は、N末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41) を含み、C末端にS抗原のTMおよびCTドメイン（最後の19アミノ酸なし）を含む、多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 52）を示し、ここでRBDドメインはGSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーにより接続されている。 図107は、多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 53）を示し、ここでは、各RBDドメインがN末端にSタンパク質のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41) を、C末端にS抗原のTMおよびCTドメイン（最後の19アミノ酸なし）を含み、且つRBDドメインは、GSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカー、ならびにP2AおよびT2Aペプチド配列により接続されている。 図108は、多シストロン性発現構築物により共発現する、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインのコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 54）を示し、ここでは、各RBDドメインが、N末端にSタンパク質のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、SEQ ID NO: 41) を、C末端にS抗原のTMおよびCTドメイン（最後の19アミノ酸なし）を含み、且つRBDドメインは、GSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカー、ならびにP2AおよびT2Aペプチド配列により接続されている。 図109は、Nタンパク質のアミノ酸位置3のアスパラギン酸からロイシンへの置換（D3L）、Nタンパク質のアミノ酸位置235のセリンからフェニルアラニンへの置換（S235F）、Nタンパク質のアミノ酸位置203のアルギニンからリジンへの置換（R203K）、およびNタンパク質のアミノ酸位置204のグリシンからアルギニンへの置換（G204R）を含む、英国で同定されたB.1.1.7変異株系統におけるN特異的変異を含む、コドン最適化N抗原のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 55）を示す。 図110は、Nタンパク質のアミノ酸位置3のアスパラギン酸からロイシンへの置換（D3L）、Nタンパク質のアミノ酸位置235のセリンからフェニルアラニンへの置換（S235F）、Nタンパク質のアミノ酸位置203のアルギニンからリジンへの置換（R203K）、およびNタンパク質のアミノ酸位置204のグリシンからアルギニンへの置換（G204R）を含む、英国で同定されたB.1.1.7変異株系統におけるN特異的変異を含む、コドン最適化N抗原のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 56）を示す。 図111は、Nタンパク質のアミノ酸位置205のスレオニンからイソロイシンへの置換（T205I）を含む、南アフリカで同定されたB.1.351変異株系統におけるN特異的変異を含む、コドン最適化N抗原のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 57）を示す。 図112は、Nタンパク質のアミノ酸位置205のスレオニンからイソロイシンへの置換（T205I）を含む、南アフリカで同定されたB.1.351変異株系統におけるN特異的変異を含む、コドン最適化N抗原のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 58）を示す。 図113は、Nタンパク質のアミノ酸位置80のプロリンからアルギニンへの置換（P80R）、ならびにR203KおよびG204Rを含む、ブラジルで同定されたP.1変異株系統におけるN特異的変異を含む、コドン最適化N抗原のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 59）を示す。 図114は、Nタンパク質のアミノ酸位置80のプロリンからアルギニンへの置換（P80R）、ならびにR203KおよびG204Rを含む、ブラジルで同定されたP.1変異株系統におけるN特異的変異を含む、コドン最適化N抗原のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 60）を示す。 図115は、RBDドメイン内の変異L452RおよびE484Q、D614G、Sタンパク質のアミノ酸位置142のグリシンからアスパラギン酸への置換（G142D）、Sタンパク質のアミノ酸位置154のグルタミン酸からリジンへの置換（E154K）、Sタンパク質のアミノ酸位置681のプロリンからアルギニンへの置換（P681R）、Sタンパク質のアミノ酸位置1071のグルタミンからヒスチジンへの置換（Q1071H）、ならびにSタンパク質のアミノ酸位置1101のヒスチジンからアスパラギン酸への置換（H1101D）を含む、インドで同定されたB.1.617変異株系統の変異を含むS抗原をコードするようにさらに改変されている、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されているコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 61）を示す。 図116は、RBDドメイン内の変異L452RおよびE484Q、D614G、Sタンパク質のアミノ酸位置142のグリシンからアスパラギン酸への置換（G142D）、Sタンパク質のアミノ酸位置154のグルタミン酸からリジンへの置換（E154K）、Sタンパク質のアミノ酸位置681のプロリンからアルギニンへの置換（P681R）、Sタンパク質のアミノ酸位置1071のグルタミンからヒスチジンへの置換（Q1071H）、ならびにSタンパク質のアミノ酸位置1101のヒスチジンからアスパラギン酸への置換（H1101D）を含む、インドで同定されたB.1.617変異株系統の変異を含むS抗原をコードするようにさらに改変されている、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されているコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 62）を示す。 図117は、Nタンパク質のアミノ酸位置203のアルギニンからメチオニンへの置換（R203M）およびNタンパク質のアミノ酸位置377のアスパラギン酸からチロシンへの置換（D377Y）を含む、インドで同定されたB.1.617変異株系統のN特異的変異を含むN抗原をコードする、コドン最適化SARS-CoV-2 N抗原配列のDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）（SEQ ID NO: 63）を示す。 図118は、Nタンパク質のアミノ酸位置203のアルギニンからメチオニンへの置換（R203M）およびNタンパク質のアミノ酸位置377のアスパラギン酸からチロシンへの置換（D377Y）を含む、インドで同定されたB.1.617変異株系統のN特異的変異を含むN抗原をコードする、コドン最適化SARS-CoV-2 N抗原配列のコード化タンパク質配列（N末端からC末端）（SEQ ID NO: 64）を示す。
詳細な説明
本明細書では、コロナウイルス抗原をコードする1つまたは複数の異種性遺伝子配列を発現する組換えsMVA（rsMVA）を製造する方法が開示される。環状化または線状合成DNA断片から完全合成バージョンのMVA（sMVA）が製造され、PCT出願PCT/US21/16247に開示されており、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。sMVAまたはrsMVAは、コロナウイルス感染症および関連疾患などのさまざまな状態を予防する、および治療するためのワクチンとして用いられ得る。
2019年12月の新型重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2（SARS-CoV-2）の大発生以降、同ウイルスは世界200カ国以上に広がり、死者数300万人を超える世界規模のパンデミックを引き起こした。現在この世界的パンデミックを制御すべく、各種ワクチン候補が急ぎ開発されており、前例のないペースで臨床試験段階に入ったものもある。これらのアプローチのほとんどが抗原形態のスパイク（S）タンパク質を採用しているが、それは、それが防御免疫の主要な標的と考えられているからである16、20～22。Sタンパク質は、アンジオテンシン変換酵素2（ACE）との結合によりSARS-CoV-2が宿主細胞に侵入するのを媒介し、また、中和抗体（Nab）の主要な標的である23～25。アカゲザルでの研究によると、S抗原ベースのワクチン戦略は、この適切な動物モデルにおいてSARS-CoV-2の感染および疾患を予防することができ18、S抗原がワクチン免疫源として十分に防御免疫を誘発し得ることが示された。しかし最近の一研究によると、測定可能なNabをもたない患者でもSARS-CoV-2感染症から回復することができ、SARS-CoV-2感染症に対する防御が、Sおよびヌクレオカプシド（N）抗原を含めた複数の免疫優性抗原に対する体液性および細胞性免疫の両方によって媒介されることが示唆された20、26。本開示では、「Sタンパク質」および「S抗原」という用語が交換可能に用いられ、「Nタンパク質」および「N抗原」という用語が交換可能に用いられる。
本明細書では、化学合成DNAから組換えMVAベクターを効率よく作製するための、独自にデザインされた3プラスミド系に基づく新規なワクチンプラットフォームが開示される。今日の世界的SARS-CoV-2パンデミックに対応して、この新規なワクチンプラットフォームは、SARS-CoV-2のS抗原およびN抗原を、または任意の追加の抗原を共発現するsMVAベクターを迅速に製造するのに用いられ得る。ワクチン製造に用いられるこれらの抗原は、武漢標準株をベースとする場合もあるし、または新興VOCをベースとする1つまたは複数の変異を含む場合もある。実施例にて示すように、これらのsMVAベクターはマウスで、強力なNabを含め、強力なSARS-CoV-2抗原特異的体液性および細胞性免疫を誘導した。これらの結果は、SARS-CoV-2感染症を予防するために、化学合成DNAから組換えMVAベクターを効率よく製造し、且つ合成ポックスウイルスベースのワクチン候補を迅速に開発する実行可能性を強調している。
本明細書では、MVAの合成体、および化学合成DNAを用いてそれを製造する方法が開示され、それは最近記述された合成馬痘ウイルスワクチンベクター42を製造するアプローチとは異なる。特定の態様では、1つのDNA断片が、ウイルスDNAから得られ、または化学合成され、該断片はMVAの全ゲノム配列を含んでいる。この1つのDNA断片を宿主細胞のトランスフェクトに用いて、MVAを再構成させることができる。他の態様では、2つ以上の天然由来のDNA断片もしくは化学合成されたDNA断片またはそれらの組み合わせを宿主細胞のコトランスフェクトに用いることができ、各DNA断片は、MVAゲノムDNAの部分配列を含み、2つの隣接するDNA断片の末端にオーバーラップ配列を有するので、2つ以上のDNA断片は、宿主細胞にコトランスフェクトされると相同組換えにより互いに繋ぎ合わされて、所望のMVAゲノムの全長配列を含むMVAを形成する。特定の態様では、オーバーラップ配列は、約100 bp～約5000 bpの長さである。
特定の態様では、MVAゲノムまたはサブゲノムDNAを含む1つまたは複数の天然由来または化学合成されたDNA断片は、天然および合成MVAゲノムDNA配列で構成される人工ハイブリッド断片を形成するように、さらに改変され得る。
特定の態様では、MVAゲノムまたはサブゲノムDNAの配列を含む1つまたは複数のDNA断片のトランスフェクション前、トランスフェクション中、またはトランスフェクション後に、宿主細胞をFPVなどのヘルパーウイルスに感染させる。
本明細書で示すように、開示されるsMVA作製法は、固有のHLおよびCR配列を有する3つの大きい環状DNA断片（約60 kbp）の使用を伴い（図1）、合成馬痘ワクチンを製造するNoyceらのアプローチは、複数のもっと小さい線状DNA断片（約10～30 kbp）の使用および末端HL配列の付加を伴う42。sMVA再構成プロセスでは3つのsMVA断片が環状形態で使用されるので、BACとして大腸菌内で容易に維持され、そしてsMVAウイルス再構成のためBHK-21細胞に容易に導入され、追加の精製工程も改変も必要ない。この特徴は、高効率な細菌性組換え法により異種性抗原配列をsMVA DNAに挿入し、それによって組換えsMVAワクチンベクターを製造することを、大いに促進する。それに加えて、3つのプラスミド系は、異なるMVA挿入部位に挿入された複数の抗原を擁する組換えMVAを迅速に製造するためのフレキシビリティを提供するが、それは従来のトランスフェクション/感染手順により組換えMVAを作製する際には特に厄介であり得る3、43。3つのsMVA断片は、効率よく相互に組み換えて、ゲノム内容、複製特性、宿主細胞範囲、および免疫原性においてwtMVAと事実上同一であるMVA合成体を作る。
より具体的には、図1Aに例示するように、MVAゲノムは、約9.6 kbp長の逆位末端配列（ITR）領域に隣接する、内部ユニーク領域（UR）を含む。Antoineと同僚らが発表した、本明細書ではMVA株Antoineと呼ばれるMVAゲノム配列（アクセッション番号U94848）は、1974年以降ライセンス許諾され、市販もされている国立保健研究所クローン1（MVA NIHクローン1）のMVAゲノムの内部URと5塩基対だけ異なり、その配列はMVA株Acambis（アクセッション番号AY603355）の公表ゲノムと同一である。sMVA断片1（F1）は、MVAゲノムの左ITRおよび内部URの左末端の約50 kbpを含み; sMVA断片2（F2）は、MVAゲノムの内部URの中央部の約60 kbpを含み; sMVA断片3（F3）はMVAゲノムの内部URの右末端の約50 kbpおよび右ITRを含む（図1B）。sMVA F1およびF2、ならびにsMVA F2およびF3は、相同組換えにより完全MVAゲノムが再構成されるように、約3 kbpのオーバーラップ配列が共通するようにデザインされる（図1B）。3つの断片それぞれの両末端に、MVAコンカテマー分割配列に隣接する165ヌクレオチド長のMVA末端ヘアピンループ（HL）の二本鎖コピーが付加されて、MVAゲノムの分割およびパッケージングを促進する（図1C）。3つのsMVA断片は、細菌中で3つの断片を低コピー数で安定して増殖させるBACベクターとして用いられ得る細菌性ミニFレプリコン要素を含む、pCCI-Brick（GeneScript）という名称の酵母-細菌性シャトルベクターにより、大腸菌にクローニングされて維持される（DH10B、EPI300、GS1783）（図1）。次世代シーケンシング分析により、断片のMVAゲノム配列の完全性が確認されたが、明確な例外は、sMVA断片F1内で021Lから3bpだけ下流の非コード決定領域に存在する未知の1つの点変異であった。
ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）にsMVA断片F1～F3を含む3つのプラスミドをコトランスフェクトし（図1）、続いてヘルパーウイルスとしての鶏痘ウイルス（FPV）に感染させると、3つのsMVA断片は共通する相同配列により相互に組み換え、合成MVA（sMVA）の再構成が始まる（図3D）。FPVは、sMVA DNAの転写を、したがってsMVA再構成プロセスを開始するためのヘルパーウイルスとして用いられる。ヘルパーウイルスの非存在下では、ポックスウイルスDNAが非感染性とみなされて、「ネイキッド」sMVA DNAがウイルス再構成を促進できないことがある。重要なことに、BHK-21細胞は、MVA感染および複製を高度に許容するが、増殖性のFPV感染は許容しないので、BHK-21細胞においてsMVAウイルスが再構成されると、FPVヘルパーウイルスは直ちに除去されることになる。それに加えて、哺乳動物細胞でヘルパーウイルスとして用いられるFPVは、高効率かつ選択的なワクシニアウイルスゲノムのパッケージングを促進する。
sMVAをベースとする高汎用性合成ワクチンプラットフォームを用いる多抗原性sMVA-CoV2ワクチンも開示される。MVAは、きわめて弱毒化されたポックスウイルスベクターであり、感染性疾患および癌のためのワクチン開発に広く用いられている。ヒトでの安全性、有効性、および長期防御性に関しては、長い歴史がある。SARS-CoV-2の新スパイク変異体を、組み換えられるとsMVAワクチンを形成する3つのプラスミドのうちの1つに手早くクローニングすることができる。
本明細書に開示されるように、複数の抗原、そのサブユニット、またはその断片を、同じプロモーターまたは異なるプロモーターを用いて共発現させてもよく、2Aペプチドにより連結してもよい。複数の抗原、そのサブユニット、またはその断片をコードする配列は、sMVAの同じ挿入部位または異なる挿入部位に挿入され得る。たとえば、少なくとも2つのSもしくはNタンパク質、S1もしくはS2ドメイン、またはRBDをコードする、2つ以上の抗原を含むワクチン組成物を、同じプロモーターもしくは異なるプロモーター、または同じ挿入部位もしくは異なる挿入部位を用いて、共発現させる。別の例では、少なくとも2つのSもしくはNタンパク質、S1もしくはS2ドメイン、またはRBDをコードする、2つ以上の抗原を含むワクチン組成物を、2Aペプチドにより連結し、そして多シストロン性（polycistonic）構築物によって同じプロモーターにより共発現させる。
特定の態様では、本明細書に開示されるワクチン組成物は、武漢-Hu-1標準株および異なるVOCから選択される2つ以上の異なるSARS-CoV-2抗原配列をコードする2つ以上のsMVAベクターの混合物を含む。たとえば、混合物中の1つのsMVAベクターは、武漢-Hu-1標準株に由来するSARS-CoV-2抗原をコードする配列を含み、混合物中の別のsMVAベクターは、VOC由来のSARS-CoV-2抗原をコードする配列を含む。
MVAは、ワクシニアの極めて弱毒化された株である。哺乳動物細胞は、ヒト細胞を含め、MVAに対し許容的であるが、増殖は鳥類細胞に限られている。MVAは、多抗原性能（30 Kb）もあり、容易に改変してウイルス変異株、たとえばUKまたはRSA変異株に対する新ワクチンを作ることができる。MVAが弱毒化ウイルスワクチンであることは、DNA/RNA/タンパク質ワクチンと比べて免疫原性の利点がある。MVAは、長命かつ高力価の体液性免疫応答、および高頻度の細胞性免疫応答の能力があり、凍結乾燥物として免疫原性を維持するのでコールドチェーンが不要となり、より廉価な保管および輸送が可能になる。MVAベースのワクチンの安全性および有効性は、1970年代からヒトの臨床試験で構築されてきた。過去の諸研究では、子どもおよび高齢者を含め、15万人以上の人が成功裏に免疫されている。NIAID助成による複数の研究で、成人HIV感染者の免疫後の安全性が示されている。FDAが承認したJynneos（商標）（Bavarian-Nordic）に基づくMVAは、天然痘に対する生涯免疫を提供するのに適している。COHでは複数のMVAベースのワクチンが開発され、成功裏に調査されている。健康なボランティアおよび移植患者が、1回投与後でも強い免疫を発生している。
S抗原のみに依存する、ほとんどの他の現在利用されているSARS-CoV-2ワクチンのアプローチとは異なり、本開示のsMVAを用いるSARS-CoV-2ワクチンのアプローチは、どちらも防御免疫に関わるS抗原およびN抗原による免疫刺激を利用する20,26。S抗原およびN抗原を共発現するsMVA-CoV2ベクターが、SARS-CoV-2シュードウイルスおよび感染性の真性SARS-CoV2ビリオンに対する強力なNabを刺激することができるという観察は、それらがSARS-CoV-2感染症およびCOVID-19疾患の予防に有効と考えられる抗体を誘発できることを示唆している16、18、20、21。実施例は、ワクチンベクターがTh1に偏った抗体および細胞性免疫応答を刺激したことを示しており、それはワクチン関連の呼吸器疾患の増強を回避する好ましい抗ウイルス適応免疫応答と考えられている44、45。さらには、ワクチンにより誘導された免疫血清により促進されたFc媒介性ADEのエビデンスは発見されておらず、SARS-CoV-2ワクチン開発の一般的な懸念である、ワクチンベクターにより誘導された抗体応答が担うADE媒介性免疫病理のリスクはごくわずかしかないことが示唆されている44、45。S抗原を標的とするNAb以外の免疫応答もSARS-CoV-2感染に対する防御に寄与している可能性があり、そのことは、測定可能なNabなしの患者でも、SARS-CoV-2感染症から回復することができる、という知見により強調されている20。抗体は初めのSARS-CoV-2獲得の予防に特に重要であり得るが、T細胞応答はウイルス感染の局所での孤発的ウイルス伝搬を抑制する追加の対策を課すことができ、それによってウイルス伝搬を制限できる。S抗原およびN抗原に対するロバストな体液性および細胞性免疫応答を誘導するsMVAをベースとする本開示のデュアル組換えワクチンアプローチは、S抗原のみを用いる他のワクチンアプローチを上回るSARS-CoV-2感染防御を提供し得る。
sMVA組換体は、1つまたは複数の抗原またはそのサブユニットをコードする配列を1つまたは複数のMVA断片に挿入することにより製造される。特定の態様では、抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、ヒトコロナウイルス抗原、たとえばSタンパク質、Nタンパク質、Mタンパク質、Eタンパク質、パパイン様プロテアーゼ、ORF1A、3CLプロテアーゼ、ORF1B、エンドリボヌクレアーゼ、マトリックス、ヘリカーゼ、またはそれらの免疫原性断片を含む。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、Sタンパク質のサブユニット、たとえばS抗原のS1およびS2ドメインまたは受容体結合ドメイン（RBD）を含む。特定の態様では、1つまたは複数の抗原は、融合前の形態のS抗原および変異S抗原を含む。たとえば、アミノ酸残基682～685のRRARがGSASに変異している変異フリン切断部位を含むことで、SARS-CoV-2 Sタンパク質はさらに安定化され得る。別の例では、S抗原のリジン986およびバリン987がプロリンで置換されている。特定の態様では、S抗原およびN抗原は、完全に成熟しているか、または完全にグリコシル化されている。
特定の態様では、sMVA-N/Sの配列（アクセッション番号MW036243としてNCBIに寄託、www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW036243.1/）を図58に示す。
特定の態様では、sMVA-S/Nの配列（アクセッション番号MW030460としてNCBIに寄託、www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW030460.1/）を図59に示す。
本明細書に開示されるように、さまざまなSARS-CoV-2抗原の配列をsMVAベクターに挿入してワクチン組成物を得ることができる。本明細書で用いられるいくつかの抗原の配列を以下に開示する。一態様では、スパイク（S）抗原配列は、武漢-Hu-1分離株であるNCBI SARS-CoV-2標準株（#NC_045512）のゲノム配列をベースとし、1273アミノ酸を含むSタンパク質をコードする。DNA配列/オープンリーディングフレーム（ORF）（5'末端から3'末端）を図60に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図61に示す。
別の例では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし、且つ同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されている。COH04SL1（別名構築物C15、図5にsMVA-Sとして図示）、COH04SL3（別名構築物C35、図5にsMVA-N/Sとして図示）、およびCOH04SL4（別名構築物C46、図5にsMVA-S/Nとして図示）において、ならびに臨床構築物COH04S1（図17、COH04S1は図57に例示するようにC35 sMVA-N/Sワクチン構築物（図5）から得た）において用いられるDNA/配列/ORF（5'末端から3'末端）を図62に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図63に示す。
一態様では、ヌクレオカプシド（N）抗原配列は、武漢-Hu-1分離株であるNCBI SARS-CoV-2標準株（#NC_045512）のゲノム配列をベースとし、419アミノ酸で構成されるNタンパク質をコードする。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図64に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図65に示す。
別の例では、SARS-CoV-2 N抗原配列は、武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし、且つ同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されている。COH04SL2（別名構築物C13、図5にsMVA-Nとして図示）、COH04SL3（別名構築物C35、図5にsMVA-N/Sとして図示）、およびCOH04SL4（別名構築物C46、図5にsMVA-S/Nとして図示）において、ならびに臨床構築物COH04S1（図17、COH04S1は図57に例示するようにC35 sMVA-N/Sワクチン構築物（図5）から得た）において用いられるDNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図66に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図67に示す。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、2P改変（アミノ酸位置986および987のリジンおよびバリンがプロリンで置換されている）を有する融合前安定化S抗原をコードするように改変される。たとえば、上記で開示されるコドン最適化S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）が、そのようなS抗原をコードするようにさらに改変される。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図68に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図69に示す。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、2P改変（アミノ酸位置986および987のリジンおよびバリンがプロリンで置換されている）および変異フリン切断部位（位置682～685のRRARアミノ酸がGSASで置換されている）を有する融合前安定化S抗原をコードするように改変される。たとえば、上記で開示されるコドン最適化S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）が、そのようなS抗原をコードするようにさらに改変される。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図70に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図71に示す。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、2P改変（アミノ酸位置986および987のリジンおよびバリンがプロリンで置換されている）、変異フリン切断部位（位置682～685のRRARアミノ酸がGSASで置換されている）、ならびに小胞体保留を阻止するためおよび細胞表面発現を増強するためのC末端の19アミノ酸残基 (KFDEDDSEPVLKGVKLHYT、SEQ ID NO: 65) の欠失を有する融合前安定化S抗原をコードするように改変される。たとえば、上記で開示されるコドン最適化S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）が、そのようなS抗原をコードするようにさらに改変される。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図72に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図73に示す。
別の例では、図74に示すように、SARS-CoV-2 S抗原配列は、ヒトでの発現のために十分にコドン最適化されており、さらに、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されており、且つ変異フリン切断部位および安定化2P変異を有する、S抗原をコードする。
別の例では、図75に示すように、SARS-CoV-2 S抗原配列は、ワクシニアウイルス発現のために十分にコドン最適化されており、さらに、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されており、且つ変異フリン切断部位および安定化2P変異を有する、S抗原をコードする。
一例では、図76に示すように、SARS-CoV-2 N抗原配列は、ヒトでの発現のために十分にコドン最適化されており、且つさらに、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されている。
別の例では、図77に示すように、SARS-CoV-2 N抗原配列は、ワクシニアウイルス発現のために十分にコドン最適化されており、且つさらに、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりワクシニアにおける安定性が最適化されている。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、Sタンパク質のN末端の698個、685個、もしくは680個のアミノ酸残基、またはさらに短いアミノ酸配列を含むS1ドメインだけをコードする。たとえば、上記で開示される、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているS抗原配列は、SARS-CoV-2 S抗原のN末端の698個のアミノ酸残基を含むS1ドメインをコードする。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図78に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図79に示す。
別の例では、上記で開示される、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているSARS-CoV-2 S抗原配列は、SARS-CoV-2 S抗原の680個のアミノ酸残基を含むS1ドメインをコードする。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図80に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図81に示す。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、S抗原のアミノ酸残基331～524もしくは319～541を含む受容体結合ドメイン（RBD）だけを、または該RBDドメインを含むそのもっと長い、もしくはもっと短い断片だけをコードする。たとえば、上記で開示される、武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているS抗原配列は、S抗原のシグナルペプチド（MFVFLVLLPLVSSを含むC末端の13アミノ酸、SEQ ID NO: 91）に融合している、SARS-CoV-2 S抗原のアミノ酸残基331～524を含むRBDをコードする。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図82に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図83に示す。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、S抗原のシグナルペプチド（MFVFLVLLPLVSSを含むC末端の13アミノ酸、SEQ ID NO: 91）に融合している、上記で開示される武漢標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアにおける安定性が最適化されているSARS-CoV-2 S抗原のアミノ酸残基319～541を含むRBDをコードする。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図84に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図85に示す。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、任意のアミノ酸位置に1つまたは複数の変異を含むS抗原をコードする。これらの変異または改変には、アミノ酸置換、挿入、または欠失が含まれ得る。変異は、SARS-CoV-2が、中和抗体（Nab）を含む特定の体液性および細胞性免疫応答に対して耐性になる免疫回避に関与し得る。変異は、宿主細胞への結合および侵入を媒介し且つNabの主要な標的であるRBDドメイン（アミノ酸残基319～541）の1つまたは複数の改変を含み得る。たとえば、RBD変異は、S抗原のアミノ酸位置501のアスパラギンからチロシンへの置換（N501Y）; S抗原のアミノ酸位置484のグルタミン酸からリジンへの置換（E484K）; S抗原のアミノ酸位置484のグルタミン酸からグルタミンへの置換（E484Q）; S抗原のアミノ酸位置417のリジンからアスパラギンへの置換（K417N）; S抗原のアミノ酸位置417のリジンからスレオニンへの置換（K417T）; S抗原のアミノ酸位置452のロイシンからアルギニンへの置換（L452R）; S抗原のアミノ酸位置477のセリンからアスパラギンへの置換（S477N）; S抗原のアミノ酸位置439のアスパラギンからリジンへの置換（N439K）; S抗原のアミノ酸位置494のセリンからプロリンへの置換（S494P）; S抗原のアミノ酸位置520のアラニンからセリンへの置換（S520S）; S抗原のアミノ酸位置453のチロシンからフェニルアラニンへの置換（Y453F）を含み得る。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、SARS-CoV-2およびその新興変異株の多くに生じる優性変異であるD614G変異（S抗原のアミノ酸位置614のアスパラギン酸からグリシンへの置換）を含有するかまたは含むS抗原をコードする。
別の態様では、SARS-CoV-2抗原配列は、最初に南アフリカで同定されたB.1.351変異株系統、最初に英国（UK）で同定されたB.1.1.7変異株系統、最初にブラジルで同定されたP.1変異株系統、カリフォルニア州で同定されたB.1.429+B.1.427変異株系統、または最初にインドで同定されたB.1.617変異株系統などの、特に懸念されるSARS-CoV-2の新興変異株（懸念される変異株、またはVOC）において生じる全ての変異、変異のサブセット、または変異の組み合わせを含む、S抗原をコードする。PANGOツール（cov-lineages.org）またはGISAID（gisaid.org）により記述される他のSARS-CoV-2変異株系統に基づく変異を有する改変抗原配列も使用することができる。たとえば、SARS-CoV-2 S抗原配列は、南アフリカ変異株において同定されたB.1.351変異株系統の変異、たとえば、RBDドメインにおけるN501Y、E484K、およびK417N置換、D614G変異、S抗原のアミノ酸位置18のロイシンからフェニルアラニンへの置換（L18F）、S抗原のアミノ酸位置80のアスパラギン酸からアラニンへの置換（D80A）、S抗原のアミノ酸位置215のアスパラギン酸からグリシンへの置換（D215G）、S抗原の位置242～244の3アミノ酸（ロイシン、アラニン、ロイシン）の欠失（Del242-244）、S抗原のアミノ酸位置246のアルギニンからイソロイシンへの置換（R246I）、ならびにS抗原のアミノ酸位置701のアラニンからバリンへの置換（A701V）を含む、S抗原をコードし得る。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、英国で同定されたB.1.1.7変異株系統の変異、たとえばRBDにおけるN501Y、D614G、S抗原の位置69および70の2アミノ酸（ヒスチジン、バリン）の欠失（Del69/70）、S抗原の位置144のチロシン残基の欠失（Del144）、S抗原のアミノ酸位置570のアラニンからアスパラギン酸への置換（A570D）、S抗原のアミノ酸位置681のプロリンからヒスチジンへの置換（P681H）、S抗原のアミノ酸位置716のスレオニンからイソロイシンへの置換（T716I）、S抗原のアミノ酸位置982のセリンからアラニンへの置換（S982A）、ならびにS抗原のアミノ酸位置1118のアスパラギン酸からヒスチジンへの置換（D1118H）を含む、S抗原をコードする。英国変異株をベースとするコード化S抗原は、上記で開示されるRBDドメインにおけるE484KおよびK417NもしくはK417Tまたは他の変異をさらに含み得る。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、ブラジルで同定されたP.1変異株系統の変異、たとえばD614G、N501Y、E484K、K417T、L18F、S抗原のアミノ酸位置20のスレオニンからアスパラギンへの置換（T20N）、S抗原のアミノ酸位置26のプロリンからセリンへの置換（P26S）、S抗原のアミノ酸位置138のアスパラギン酸からチロシンへの置換（D138Y）、S抗原のアミノ酸位置190のアルギニンからセリンへの置換（R190S）、S抗原のアミノ酸位置655のヒスチジンからチロシンへの置換（H655Y）、S抗原のアミノ酸位置1027のスレオニンからイソロイシンへの置換（T1027I）、およびS抗原のアミノ酸位置1176のバリンからフェニルアラニンへの置換（V1176F）を含む、S抗原をコードする。コード化S抗原は、上記で開示されるRBDドメインの他の変異（たとえばL452RまたはY453F）をさらに含み得る。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、カリフォルニア州で同定されたB.1.429+B.1.427変異株系統の変異、たとえばD614G、RBDにおけるL452R、S抗原のアミノ酸位置13のセリンからイソロイシンへの置換（S13I）、およびS抗原のアミノ酸位置152のトリプトファンからシステインへの変異（W152C）を含む、S抗原をコードする。南カリフォルニア州変異株に基づくコード化S抗原は、N501Y、E484K、E484Q、または他のRBD変異をさらに含み得る。
別の態様では、SARS-CoV-2抗原配列は、VOCに生じる変異の種々の組み合わせを含むS抗原をコードする。たとえば、S抗原配列は、B.1.429+B.1.427およびB.1.1.7変異株系統、B.1.429+B.1.427およびB.1.351変異株系統、B.1.429+B.1.427およびP.1変異株系統、B.1.1.7およびB.1.351系統、B.1.1.7およびP.1系統、B.1.351およびP.1系統、またはこれらの系統の他の組み合わせに生じる変異、または当該変異のサブセットだけを併せ持つ、S抗原をコードし得る。これらの変異の組み合わせは、N501Y、E484K、K417N、K417T、L452R、S477N、N439K、S520S、およびY453Fなどの上記で開示されるRBD変異のうちのいずれかをさらに含み得る。
別の態様では、上記で開示されるコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）は、南アフリカで同定されたB.1.351変異株系統の変異（N501Y、E484K、K417N、L18F、D80A、D215G、Del242-244、R246I、D614G、A701V）を含むS抗原をコードするようにさらに改変される。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図86に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図87に示す。
別の例では、上記で開示されるコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）は、英国で同定されたB.1.1.7変異株系統の変異（N501Y、Del69/70、Del144、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H）を含むS抗原をコードするようにさらに改変される。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図88に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図89に示す。
別の例では、上記で開示されるコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）は、カリフォルニア州で同定されたB.1.429+B.1.427変異株系統の変異（D614G、L452R、S13I、W152C）を含むS抗原をコードするようにさらに改変される。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図90に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図91に示す。
別の例では、上記で開示されるコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）は、ブラジルで同定されたP.1変異株系統の変異（N501Y、E484K、K417T、L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027I、V1176F）を含むS抗原をコードするようにさらに改変される。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図92に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図93に示す。
別の態様では、SARS-CoV-2 S抗原配列は、B.1.429+B.1.427、B.1.1.7、B.1.351、またはP.1変異株系統をベースとし、2P安定化変異（リジン986およびバリン987がプロリンで置換されている（K986PおよびV987P））、変異フリン切断部位（682～685 RRARからGSAS）、ならびに/またはC末端19アミノ酸残基(KFDEDDSEPVLKGVKLHYT、SEQ ID NO: 65) 欠失をさらに含む、S抗原をコードするようにさらに改変される。
別の態様では、異なるコドン使用を有する異なるSARS-CoV-2抗原配列を用いて、オリジナルの武漢-Hu-1標準株、およびB.1.429+B.1.427、B.1.1.7、B.1.351、またはP.1変異株系統に基づく異なるS抗原をコードする。これらの抗原配列は、1つのsMVAベクターに一緒に、または別々のsMVAベクターに、異なる挿入部位（たとえばDel2、Del3、IGR69/70）を用いて、挿入され得る。たとえば、以下の3つの抗原配列を用いて、武漢-Hu-1標準株、南アフリカ変異株B.1.351、および英国変異株B.1.1.7のS抗原を共発現させることができる。
武漢-Hu-1標準株のS抗原をコードする配列を図94に示し、南アフリカ変異株B.1.351のS抗原をコードする配列を図95に示し、英国変異株B.1.1.7のS抗原をコードする配列を図96に示す。
別の態様では、オリジナルの武漢-Hu-1標準株、またはB.1.429+B.1.427、B.1.1.7、B.1.351、P.1もしくはB.1.617変異株、あるいはSARS-CoV-2の他の新興変異株に基づく複数の異なるSARS-CoV-2 RBDドメイン（アミノ酸残基319～541）を、1つのベクターから、または別々のベクターから、異なるコドン使用の利用によって、共発現させることができる。これらのRBDドメインは、それぞれ各自の1つのワクシニアプロモーター（たとえばmH5）により共発現させることもできるし、または多シストロン性発現構築物によって共発現させることもでき、後者において個々のRBDドメインは、異なるリンカー配列（たとえばGSリンカー）により、またはリボソームスキッピングを媒介するピコルナウイルスの2Aペプチドにより接続されている。それに加えて、これらのドメインの1つまたは複数が、N末端でSARS-CoV-2シグナル配列（Sタンパク質の最初の13もしくは16個のN末端アミノ酸）に、NもしくはC末端で三量体化を媒介するT4フィブリチンフォールドンドメイン (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、 SEQ ID NO: 45) に、ならびに/またはC末端でSARS-CoV-2 Sタンパク質の膜貫通ドメイン（TM）および細胞質ドメイン（CT）に融合し得、ここでCTドメインの最後の19アミノ酸は、ER保留を回避するためおよび細胞表面発現を増強するために欠失され得る。
たとえば、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインは、N末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、 SEQ ID NO: 41) を含む三重多シストロン性発現構築物によって共発現させることができ、ここでRBDドメインはGSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーにより接続されている。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図97に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図98に示す。
別の例では、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインは、N末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、 SEQ ID NO: 41) を含み、且つC末端にT4フォールドンドメイン (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、SEQ ID NO: 45) を含む三重多シストロン性発現構築物によって共発現させることができ、ここでRBDドメインはGSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーにより接続されている。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図99に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図100に示す。
別の例では、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインは、多シストロン性発現構築物によって共発現させることができ、ここでは各RBDドメインがN末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、 SEQ ID NO: 41) を含み、且つRBDドメインは、GSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカー、ならびにP2AおよびT2Aペプチドにより接続されている。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図101に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図102に示す。
別の例では、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインは、多シストロン性発現構築物によって共発現させることができ、ここで、RBDドメインはGSリンカー（GSGSGS、SEQ ID NO: 42）ならびにP2AおよびT2Aペプチドにより接続されており、且つ各RBDドメインが、N末端でSシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、 SEQ ID NO: 41) に、C末端でT4フォールドンドメイン (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、SEQ ID NO: 45) に融合している。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図103に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図104に示す。
別の例では、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351変異株のRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427変異株の変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインは、N末端にS抗原のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、 SEQ ID NO: 41) を含み、且つC末端にS抗原のTMおよびCTドメイン（最後の19アミノ酸なし）を含む、多シストロン性発現構築物によって共発現させることができ、ここで、RBDドメインはGSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカーにより接続されている。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図105に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図106に示す。
別の例では、武漢-Hu-1標準株のRBDドメイン、B.1.351 VOCのRBDドメイン、ならびにB.1.1.7およびB.1.429+B.1.427 VOCの変異N501YおよびL452Rを併せ持つRBDドメインは多シストロン性発現構築物によって共発現し、ここでは、各RBDドメインが、N末端にSタンパク質のシグナルペプチド (MFVFLVLLPLVSSQCV、 SEQ ID NO: 41) を、C末端にS抗原のTMドメインおよびCTドメイン（最後の19アミノ酸KFDEDDSEPVLKGVKLHYT (SEQ ID NO: 65) なし）を含み、且つRBDドメインは、GSGSGS（SEQ ID NO: 42）などのGSリンカー、ならびにP2AおよびT2Aペプチド配列により接続されている。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図107に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図108に示す。
別の態様では、SARS-CoV-2 N抗原配列は、Nタンパク質の異なるアミノ酸位置に1つまたは複数の変異を含む、N抗原をコードする。これらの変異または改変には、アミノ酸置換、挿入、または欠失が含まれ得る。変異は、南アフリカVOC B.1.351、カリフォルニア州変異株B.1.429+B.1.427、英国変異株B.1.1.7、ブラジル変異株P.1、インド変異株B.1.617、または任意の他の新興SARS-CoV-2 VOCに生じるN特異的変異に基づき得る。
たとえば、SARS-CoV-2 N抗原配列は、英国で同定されたB.1.1.7変異株系統に生じるN特異的変異を含むN抗原をコードする。これらの変異は、Nタンパク質のアミノ酸位置3のアスパラギン酸からロイシンへの置換（D3L）、Nタンパク質のアミノ酸位置235のセリンからフェニルアラニンへの置換（S235F）、Nタンパク質のアミノ酸位置203のアルギニンからリジンへの置換（R203K）、およびNタンパク質のアミノ酸位置204のグリシンからアルギニンへの置換（G204R）を含む。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図109に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図110に示す。
別の例では、コドン最適化SARS-CoV-2 N抗原配列は、南アフリカで同定されたB.1.351変異株系統に生じるN特異的変異を含むN抗原をコードする。これは、Nタンパク質のアミノ酸位置205のスレオニンからイソロイシンへの置換（T205I）を含む。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図111に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図112に示す。
別の例では、コドン最適化SARS-CoV-2 N抗原配列は、ブラジルで同定されたP.1変異株系統に生じるN特異的変異を含むN抗原をコードする。これは、Nタンパク質のアミノ酸位置80のプロリンからアルギニンへの置換（P80R）、ならびにR203KおよびG204Rを含む。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図113に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図114に示す。
別の態様では、上記で開示されるコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）は、インドで同定されたB.1.617変異株系統の変異を含むS抗原をコードするようにさらに改変される。これは、RBDドメインのL452RおよびE484Q変異、D614G、Sタンパク質のアミノ酸位置142のグリシンからアスパラギン酸への置換（G142D）、Sタンパク質のアミノ酸位置154のグルタミン酸からリジンへの置換（E154K）、Sタンパク質のアミノ酸位置681のプロリンからアルギニンへの置換（P681R）、Sタンパク質のアミノ酸位置1071のグルタミンからヒスチジンへの置換（Q1071H）、ならびにSタンパク質のアミノ酸位置1101のヒスチジンアスパラギン酸置換（H1101D）を含み得る。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図115に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図116に示す。
別の態様では、上記で開示されるコドン最適化SARS-CoV-2 S抗原配列（武漢-Hu-1標準株（#NC_045512）をベースとし且つワクシニアについて最適化されている）は、B.1.617変異株系統の変異または変異のサブセット、たとえばL452R、E484Q、D614G、G142D、E154K、P681R、Q1071H、およびH1101D、アミノ酸位置478のスレオニンからリジンへの置換（T478K）、アミノ酸位置95のスレオニンからイソロイシンへの置換（T95I）、アミノ酸位置19のスレオニンからアルギニンへの置換（T19R）、アミノ酸位置77のリジンからスレオニンへの置換（K77T）、アミノ酸950のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換（D950N）、アミノ酸位置21のアルギニンからスレオニンへの置換（R21T）、アミノ酸位置218のグルタミンからヒスチジンへの置換（Q218H）、アミノ酸位置156および157のグルタミン酸およびフェニルアラニンの欠失（Del156-157）、ならびにアミノ酸位置158のアルギニンからグリシンへの置換（R158G）を含むS抗原をコードするようにさらに改変される。
別の態様では、コドン最適化SARS-CoV-2 N抗原配列は、インドで同定されたB.1.617変異株系統に生じるN特異的変異を含むN抗原をコードする。これは、Nタンパク質のアミノ酸位置203のアルギニンからメチオニンへの置換（R203M）およびNタンパク質のアミノ酸位置377のアスパラギン酸からチロシンへの置換（D377Y）を含み得る。DNA配列/ORF（5'末端から3'末端）を図117に示し、コード化タンパク質配列（N末端からC末端）を図118に示す。
特定の態様では、2つ以上の抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列は、1つのMVA挿入部位または2つ以上のMVA挿入部位に挿入され得、それらは同じsMVA断片または異なるsMVA断片に存在し得る。たとえば、2つ以上の抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列は、どちらもsMVA F1に存在する2つの異なるMVA挿入部位に挿入され得る。別の例では、2つ以上の抗原、そのサブユニット、またはその断片のDNA配列は、1つはsMVA F1に存在し、その他はsMVA F2に存在する、2つの異なるMVA挿入部位に挿入され得る。
これらの挿入部位には、一般に用いられる挿入部位、たとえばMVA欠失2（Del2）部位、オープンリーディングフレーム（ORF）44Lと45Lとの間の遺伝子間領域（IGR）（IGR44/45）、ORF 69Rと70Lとの間のIGR（IGR69/70）、64Lと65Lとの間のIGR（IGR64/65）、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子挿入部位、もしくはMVA欠失3（Del3）部位、または任意の他のMVA欠失部位、遺伝子間領域、もしくは遺伝子挿入部位（ORF番号はMVA株Antoine（アクセッション番号U94848）に基づく）が含まれ得る。
本明細書に開示されるコロナウイルス抗原を発現するsMVAまたはrsMVAは、ウイルス感染症を治療または予防する方法に用いられ得るワクチン組成物の重要な成分であり得る。本明細書に記載されるワクチン組成物は、治療有効量の本明細書に開示されるsMVAまたはrsMVAを含み得、標準法にしたがい薬学的に許容される担体をさらに含む。許容される担体の例としては、無菌生理食塩水および無菌緩衝生理食塩水などの生理的に許容される溶液が挙げられる。
いくつかの態様では、ワクチンまたは薬学的組成物は、予防または治療効果を増強するために薬学的有効量のアジュバントと組み合わせて用いられ得る。それ自体は特に抗原作用をもたずに免疫系を刺激でき且つワクチンに対する応答を増大できる任意の免疫アジュバントが、アジュバントとして使用され得る。多くの免疫アジュバントが、病原体関連分子パターン（PAMP）として知られる進化的保存分子を模倣し、且つToll様受容体（TLR）として知られる一式の免疫受容体により認識される。本明細書に記載される態様で用いられ得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、二本鎖RNA（TLR3リガンド）、LPS、モノホスホリルリピドA（MPL）（TLR4リガンド）などのLPSアナログ、フラゲリン（TLR5リガンド）、リポタンパク質、リポペプチド、一本鎖RNA、一本鎖DNA、イミダゾキノリンアナログ（TLR7およびTLR8リガンド）、CpG DNA（TLR9リガンド）、Ribiアジュバント（モノホスホリル-リピドA/トレハロースジコリノイコラート（dicorynoycolate））、糖脂質（α-GalCerアナログ）、非メチル化CpGアイランド、オイルエマルジョン、リポソーム、ビロソーム、サポニン（QS21などのサポニン活性部分）、ムラミルジペプチド、ミョウバン、水酸化アルミニウム、スクアレン、BCG、GM-CSFおよびIL-12などのサイトカイン、MIP 1-αおよびRANTESなどのケモカイン、CD40L、N-アセチルムラミン-L-アラニル-D-イソグルタミン（MDP）、およびチモシンα1などの活性化細胞表面リガンドが挙げられる。使用されるアジュバントの量は、このタイプのワクチンの投与後にヒトまたは動物において免疫応答の一環として現れ得る症状、たとえば皮膚の軟化、痛み、紅斑、熱、頭痛、および筋肉痛の度合いに応じて適切に選択され得る。
さらなる態様では、上述したように、さまざまな他のアジュバント、薬物、または添加物を、本発明のワクチンと共に使用することで、ワクチンまたは薬学的組成物の投与により得られる治療効果が増強され得る。薬学的に許容される担体は、微量の添加物、たとえば等張性および化学的安定性を増強する物質を含有し得る。そのような添加物は、用いられる投与量および濃度でヒトまたは他の哺乳動物対象に対し非毒性でなければならず、それらの例としては、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸、ならびにその塩などのバッファー; アスコルビン酸などの抗酸化剤; 低分子量（たとえば約10残基未満）のポリペプチド（たとえばポリアルギニンおよびトリペプチド）タンパク質（たとえば血清アルブミン、ゼラチン、および免疫グロブリン）; アミノ酸（たとえばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびアルギニン）; 単糖、二糖、および他の糖質（たとえばセルロースおよびその誘導体、グルコース、マンノース、ならびにデキストリン）、キレート剤（たとえばEDTA）; 糖アルコール（たとえばマンニトールおよびソルビトール）; 対イオン（たとえばナトリウム）; 非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベートおよびポロキサマー）; 抗生物質; ならびにPEGが挙げられる。
本明細書に開示されるsMVAまたはrsMVAを含有するワクチンまたは薬学的組成物は、水溶液または凍結乾燥剤として、単位用量または多用量容器、たとえば密封アンプルまたはバイアルで保管され得る。
本明細書に開示されるsMVA、rsMVA、ワクチン、または薬学的組成物は、動物モデルおよびヒトにおけるSARS-CoV-2感染症の治療または予防のために、SARS-CoV-2特異的体液性免疫応答（結合抗体、中和抗体）、および細胞性免疫応答（CD4+ およびCD8+ T細胞）を刺激するために用いられ得る。それらはまた、SARS-CoV-2感染症の治療またはSARS-CoV-2感染症に対する受動免疫のために用いられ得る抗体応答を生じさせるため及び単離するために用いられ得る。
本明細書では、sMVAワクチン組成物が開示される。COH04S1は、防御免疫にかかわるSARS-CoV-2スパイクおよびヌクレオカプシドという2つの抗原を共発現し、マウス、ハムスター、フェレット、およびサルで非常に有望な免疫応答を示している。好意的なプレIND FDAを受けた。FDAは、合成sMVAが従来のMVAと同等であること、そしてINDによる毒性試験の必要がないことに同意している。シティー・オブ・ホープのcGMP製造施設で、第1相試験および第2相試験の材料を製造した。最大122人の18～54歳のボランティアが投与を受け、55人のボランティアが1回または2回投与を受けた。
ワクチン組成物はまた、強力なT細胞応答を誘発するN抗原を含む。ワクチン組成物にはジェンダー依存性がなく、また、全年齢群にわたり、たとえば2歳から75歳まで有効である。強力な免疫原性が、査定した最小臨床用量でも得られた。ワクチン組成物は、ハムスターにおいて重症疾患からの防護を実現した。ワクチン組成物は、Th1に偏った抗体およびT細胞応答を示す。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるワクチン組成物は、粘液防御のため、鼻腔送達用に製剤化される。あるいは、本明細書に開示されるワクチン組成物は、対象において強力な免疫応答を誘導するため、腹腔内（IP）、筋肉内（IM）、または鼻腔内（IN）投与用に製剤化される。特定の態様では、ワクチン組成物は、1×107 PFU～10×108 PFU/用量、1～10×108 PFU/用量、または1～5×108 PFU/用量で投与される。いくつかの態様では、ワクチン組成物は、約1×107 PFU/用量、約2×107 PFU/用量、約3×107 PFU/用量、約4×107 PFU/用量、約5×107 PFU/用量、約6×107 PFU/用量、約7×107 PFU/用量、約8×107 PFU/用量、約9×107 PFU/用量、約1×108 PFU/用量、約2×108 PFU/用量、約3×108 PFU/用量、約4×108 PFU/用量、約5×108 PFU/用量、約6×108 PFU/用量、約7×108 PFU/用量、約8×108 PFU/用量、約9×108 PFU/用量、または約10×108 PFU/用量で投与される。特定の態様では、ワクチン組成物は対象に単用量で投与される。特定の態様では、ワクチン組成物は、対象に、初回用量として、続いてブースター用量として投与される。本明細書に開示されるワクチン組成物は、対象に投与すると、SARS-CoV-2に対する強力な体液性および細胞性免疫応答を刺激する。
実施例で示すように、1×107 PFUの用量のCOH04S1で免疫した健康な成人は、S、RBD、Nに対する結合抗体および中和抗体、ならびにS抗原およびN抗原に対する機能性T細胞応答を生じた。
本明細書ではまた、図56に例示するように、最初のウイルス再構成から最終的な前臨床ウイルスストック作製までの前臨床ワクチン製造プロセスが例示される。このプロセスは、実施例で示すように、sMVA断片を含むプラスミドを用いたトランスフェクション/感染、sMVAウイルス再構成、一次小規模増殖、一次大規模増殖、一次インビボ免疫原性・有効性・安全性試験、プラーク精製、ウイルス分離株の増殖、二次小規模増殖、二次大規模増殖、ならびに最終インビトロおよびインビボ試験の各工程を含む。このプロセスは、製造の需要に基づき、当分野の一般知識を用いてさらに改変、改善、または最適化され得る。
工程1および2: トランスフェクション/感染およびsMVAウイルス再構成
3つのsMVA断片F1～F3（無改変、改変、またはそれらの組み合わせ）を含む3つのプラスミドを、アルカリ溶解により大腸菌から単離する。単離したプラスミドを、Fugene HDリピドに基づくトランスフェクション試薬（Roche）により、60～70%コンフルエントなBHK-21細胞（ATCC（登録商標）CCL-10（商標））にコトランスフェクトするが、該BHK-21細胞は、前日に6ウェルプレート組織培養フォーマットで播種し、37℃、5% CO2インキュベーター内で、最小必須培地（MEM、Gibco）に10%ウシ胎仔血清を加えたMEM10中で増殖させてある。トランスフェクションの4時間後、BHK-21細胞をFPV（ATCC VR-2553）におよそ0.1～1感染多重度（MOI）で感染させて、sMVAウイルス転写および再構成を開始させる。トランスフェクト/感染BHK-21細胞を、図56に例示するように（工程2）、37℃、5% CO2インキュベーター内で、6ウェル組織培養プレートでMEM10中2日間インキュベートし、ほとんどのまたは全部のBHK-21細胞がsMVAウイルス感染の徴候を示すまで8～12日間にわたり、隔日で移し、再播種し、より大きい組織培養プレートで2日間増殖させる。sMVAウイルス再構成を示す特徴的なMVAウイルスプラーク形成および細胞変性効果（CPE）が、通常はトランスフェクション/感染4～8日後に検出される。完全感染BHK-21細胞の単層は、通常、トランスフェクション/感染8～12日後に見られる。感染BHK-21細胞単層から、MEMに2% FBSを加えたMEM2中での3サイクルの従来の凍結/融解法によりsMVAウイルスを調製し、－80℃で保管する。これらの最初のウイルスストックからsMVAをBHK-21細胞でタイトレーションを行い、通常は、さまざまな方法（PCR、ウエスタンブロット（WB）、フローサイトメトリー（FC））で特徴決定して、sMVA再構成および抗原発現を確認する。
工程3および4: 一次小および大規模増殖
より活性の高いインビトロおよびインビボ試験のために、より大量のウイルスを製造するため、最初のウイルスストックから再構成されたsMVAウイルス（工程1および2）を、初めのBHK-21細胞での小規模増殖、その後のニワトリ胎児線維芽細胞（CEF）細胞での大規模増殖を含む2工程のプロセスで増殖させる。小規模増殖（工程3）では、5×150 mm 組織培養ディッシュに播種したBHK-21細胞を、80～90%コンフルエントとなるまで増殖させ、最初のウイルスストックからのsMVAに0.02 MOIで感染させる。感染BHK-21細胞を、MEM10中、37℃、5% CO2インキュベーター内で2～3日間インキュベートする。小規模増殖からウイルスストックを3サイクルの凍結/融解法により調製し、MEM2中、－80℃のフリーザーで保管し、その後BHK-21細胞でタイトレーションを行う。小規模増殖からのsMVAウイルスの特徴をインビトロで決定して（PCR、WB、FC）、アイデンティティー、ゲノム再構成、および抗原発現を確認する。開発プロセスのこの時点で、sMVAウイルスは、CEFでの5～10継代の増殖後、安全性試験も受ける場合がある。大規模増殖（工程4）では、30×150 mm 組織培養ディッシュに播種した、新たに調製したCEFを、70～90%コンフルエントとなるまで増殖させ、小規模増殖から調製したsMVAウイルスに0.02 MOIで感染させる。感染CEF細胞を、MEM10中、37℃、5% CO2インキュベーター内で2～3日間増殖させる。大規模増殖から36%スクロース密度の超遠心法によりウイルスを調製し、1 mM Tris-HCl（pH 9）中、－80℃で保管し、その後CEF細胞でタイトレーションを行う。精製したウイルスの特徴をインビトロでPCR、WB、およびFC（または他の方法）により決定して、アイデンティティー、ゲノム再構成の忠実度、および抗原発現を確認する。
工程5: 一次インビボ試験
インビトロでの特徴決定の後、大規模増殖からの精製ウイルスを、異なる動物モデルでワクチン候補の免疫原性、曝露に対する防御、および安全性について評価するインビボ試験に用いる。これにはマウスの試験が含まれ得るが、ハムスター、フェレット、または非ヒト霊長類などの他の動物モデルの試験も含まれ得る。免疫原性およびウイルス曝露に対する防御の最適条件を評価するため、用量漸増および免疫経路が試験され得る。
工程6および7: プラーク精製およびウイルス分離株の増殖
臨床製品の製造に移行するために、選択したsMVAワクチン構築物（工程4および5の結果に基づき選択）を、プラーク精製し、増殖させ、インビトロおよびインビボ試験により追試する。この時点からは、製造プロセスの全工程を、血清フリー条件で、VP-SFM培地（Gibco）を用いて実施する。プラーク精製手順（工程6）では、96ウェル組織培養プレートに前日播種した、新たに調製したCEF細胞（80～90%コンフルエント）を、10～100 PFU/プレートで、一次小規模増殖（工程3）からのsMVAウイルスに感染させる。感染後3～5日で、96ウェルプレートのCEF細胞を、ウェルごとの単一ウイルスプラーク形成について選別し、単一ウェルからのsMVAウイルス分離株を3サイクルの凍結/融解法により調製する。単一ウェルから調製したウイルス分離株を、次に、24ウェル組織培養プレートに播種した80～90%コンフルエントなCEF細胞の感染を通して増殖させる（1ウイルス分離株/ウェル; 工程7、図56）。感染後2～4日で、24ウェルプレートで増殖させたウイルス分離株を凍結/融解法により調製し、さらに、1分離株/ディッシュで、60 mm 組織培養ディッシュに播種した80～90%コンフルエントなCEFで増殖させる。感染CEF細胞を2～4日間増殖させ、増殖したウイルス分離株を凍結/融解法により収穫し、CEFでタイトレーションを行う。タイトレーションを行ったウイルス分離株（5～10）を、次に、PCR、WB、およびFCを用いるインビトロ試験により選別して、単一ウイルス分離株のアイデンティティー、ゲノム組成、および抗原発現を査定する。
工程8および9: 二次小および大規模増殖
次の工程として、最終分離株のより活性の高いインビトロおよびインビボ試験のために大量のウイルスを製造するため、sMVAワクチン候補の選択されたプラーク精製ウイルス分離株を、二次小規模増殖および二次大規模増殖を含む2工程のプロセスでさらに増殖させる。二次増殖手順は、大筋では前臨床ワクチン開発プロセスの一次増殖手順（図56、工程3および4ならびに工程8および9）を踏襲するが、二次増殖手順では、特に血清フリー条件で増殖させたCEF細胞を用いる（VP-SFM）。大規模増殖からのウイルスストックは、超遠心法により調製され、1 mM Tris-HCl（pH 9）中、－80℃で保管される。最終的に精製されたウイルスストックの特徴をPCR、WB、およびFCによりインビトロで決定して、sMVAワクチン候補の選択されたウイルス分離株のアイデンティティー、ゲノム組成、および抗原発現を確認する。
工程10: 最終インビトロおよびインビボ試験
最終産物の最初のインビトロ試験の後、選択したウイルス分離株を、宿主範囲、複製キネティクス、ワクチン安定性、および完全ゲノムのシーケンシングについて、インビトロでさらに査定する。それに加えて、sMVAワクチン候補の最終ウイルス分離株の免疫原性、曝露に対する防御、および安全性を、動物モデル（マウスまたは他の動物）で調査する。
本明細書では、さまざまなプライムブースト手順も開示される。いくつかの態様では、プライムブースト手順は、武漢-Hu-1標準株または種々の懸念される変異株の2つ以上のSARS-CoV-2抗原配列をコードする同じsMVAベクターによる1回目および2回目の免疫、または追加のブースター免疫を含む。いくつかの態様では、プライムブースト手順は、武漢-Hu-1標準株および種々の懸念される変異株から選択される2つ以上の異なるSARS-CoV-2抗原配列をコードする、2つ以上のsMVAベクターの混合物による1回目および2回目の免疫、または追加のブースター免疫を含む。いくつかの態様では、武漢-Hu-1標準株の1つまたは複数のSARS-CoV-2抗原配列をコードするsMVAベクターでの1回目の免疫、および種々の懸念される変異株の1つまたは複数のSARS-CoV-2抗原配列をコードする異なるsMVAベクターでの2回目の免疫、あるいはその逆を含む、プライムブースト手順。いくつかの態様では、プライムブースト手順は、武漢-Hu-1標準株の1つまたは複数のSARS-CoV-2抗原配列をコードするsMVAベクター、および種々の懸念される変異株の1つまたは複数のSARS-CoV-2抗原配列をコードする異なるsMVAベクターでの多重ブースター免疫による、あるいはその逆による、多重免疫を含む。
本開示では、図5および図17に図示するように、COH04S1はsMVA-N/Sベクター構成を有する。図57に図示するように、COH04S1は、親sMVA-N/SベクターC35（別名sMVA-N/S tv）から二重プラーク精製により得られた臨床製品である。本明細書で使用する場合、「sMVA-CoV2ベクター」および「sMVA-SARS-CoV2ベクター」という用語は、1つまたは複数のSARS-CoV2抗原を発現するsMVAベクターを指すのに交換可能に用いられ得る。
以下の実施例は、本発明のさまざまな態様を例示するものである。したがって、論じられる具体的な態様は、本発明の範囲の限定として構築されるものではない。当業者にとっては、本発明の範囲を逸脱することなくさまざまな等価形態、変更、および改変を実施できることは明白となろうし、そのような等価の態様は本明細書に含まれることが理解される。さらに、本開示で引用する全ての参照文献は、本明細書にすべて記述されているかのように、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。
材料および方法
細胞およびウイルス: BHK-21（CCL-10）、A549（CCL-185）、HeLa（CCL-2）、293T（CRL-1573）、143B（CRL-8303）、MRC-5（CCL-171）、HEK293/17（CRL11268）、THP-1（TIB-202）、ARPE-19（CRL-2302）をAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入し、ATCCの推奨にしたがい増殖させた。CEFをCharles River（10100795）から購入し、最小必須培地（MEM）に10% FBSを加えたMEM10中で増殖させた。HEK293T/ACE2は、Pamela J. Bjorkman46の厚意により寄贈された。wtMVA（NIHクローン1）は、標準物質としてのみ用いた。sMVAおよびwtMVAウイルスストックを製造するために、CEFを30×150 mm 組織培養ディッシュに播種し、約70～90%コンフルエントとなるまで増殖させ、感染多重度（MOI）0.02でsMVAまたはwtMVAに感染させた。感染2日後、36%スクロース密度の超遠心法により精製ウイルスを調製し、1 mM Tris-HCl（pH 9）にウイルスを再懸濁した47。ウイルスストックは－80℃で保管した。感染の16～24時間後、ポリクローナルワクシニア抗体を用いたウイルスプラークの免疫染色により、CEFでのウイルス力価を測定した。FPVストックは、FPV株TROVAC（ATCC VR-2553）3またはBernard Mossの厚意により寄贈されたHP1.4414を用いてCEFで増殖させて製造した。CEFでのウイルスプラークを測定して、FPV力価を査定した。SARS-CoV-2株USA-WA1/2020（BEI Resources NR-52281）をフォーカス減少中和試験（FRNT）アッセイに用いた53。
sMVA断片の構築: Antoineらが報告した完全MVAゲノム配列（NCBIアクセッション番号U94848）4を構成する3つの約60 kbpのsMVA断片（F1～F3; 図1）を以下のように構築した: sMVA F1は、該MVAゲノム配列の塩基対191～59743を含み、sMVA F2は、該MVA配列の塩基対56744～119298を含み、sMVA F3は、報告された該MVAゲノム配列4の塩基対116299～177898を含んだ。各sMVA断片の両末端に、
(SEQ ID NO: 66) で構成されるCR/HL/CR配列配置を同じ向きで加えた。ここで、斜体文字はMVA末端HL配列の二本鎖コピーを示し、下線文字はCR配列を示す。なお、sMVA F1およびF3のITRのところに組み入れられるCR/HL/CR配列は、推定MVA複製中間体4のゲノム接合部のITRのところに生じるCR/HL/CR配列と同一の配置で加えた。sMVA断片は、酵母組換系との組み合わせで化学合成を用いてGenscriptにより製造され繋ぎ合わされた。全てのsMVA断片を、大腸菌中で大きなDNA断片を低コピーBACとして安定増殖させるミニFレプリコンを含む、pCCI-Brickという名称の酵母シャトルベクターにクローニングした。sMVA F1およびF3はEPI300大腸菌（Epicentre）にクローニングして維持し、sMVA F1はDH10B大腸菌（Invitrogen）にクローニングして維持した。
抗原挿入: SARS-CoV-2のS抗原およびN抗原の配列を、GS1783大腸菌細胞中、アンパッサン変異誘発により、sMVA断片に挿入した48、49。簡単に説明すると、上流mH5プロモーター配列および下流ワクシニア転写終結シグナル（TTTTTAT、SEQ ID NO: 67)）を有するSまたはN抗原配列からなるトランスファー構築物を作製し、該抗原配列に、50 bp遺伝子重複部に隣接するカナマイシン抵抗性カセットを導入した。相同組換えのための約50 bpの伸長を提供するプライマーを用いてPCRによりトランスファー構築物を増幅し、得られたPCR産物を用いて、1回目Red組換え反応によりトランスファー構築物をsMVA DNAに挿入した48、49。プライマー 5'- AAA AAA TAT ATT ATT TTT ATG TTA TTT TGT TAA AAA TAA TCA TCG AAT ACG AAC TAG TAT AAA AAG GCG CGC C-3' (SEQ ID NO: 68) 及び 5'-GAA GAT ACC AAA ATA GTA AAG ATT TTG CTA TTC AGT GGA CTG GAT GAT TCA AAA ATT GAA AAT AAA TAC AAA GGT TC-3' (SEQ ID NO: 69) を用いて、N抗原配列をDel2部位に挿入した。プライマー 5'- ATA TGA ATA TGA TTT CAG ATA CTA TAT TTG TTC CTG TAG ATA ATA ACT AAA AAT TTT TAT CTA GTA TAA AAA GGC GCG CC-3' (SEQ ID NO: 70) 及び 5'-GGA AAA TTT TTC ATC TCT AAA AAA AGA TGT GGT CAT TAG AGT TTG ATT TTT ATA AAA ATT GAA AAT AAA TAC AAA GGT TC-3' (SEQ ID NO: 71) を用いて、S抗原配列をIGR69/70挿入部位プライマーに挿入した。プライマー 5'- TTG GGG AAA TAT GAA CCT GAC ATG ATT AAG ATT GCT CTT TCG GTG GCT GGT AAA AAA TTG AAA ATA AAT ACA AAG GTT C-3' (SEQ ID NO: 72) 及び 5'-ACA AAA TTA TGT ATT TTG TTC TAT CAA CTA CCT ATA AAA CTT TCC AAA TAC TAG TAT AAA AAG GCG CGC C-3' (SEQ ID NO: 73) を用いて、SまたはN抗原配列をDel3部位に挿入した。下線文字は、相同組換えのための約50 bpの伸長を生産するのに用いた配列を示す。S抗原およびN抗原配列は、SARS-CoV-2標準株（NCBIアクセッション番号NC_045512）をベースとし、且つワクシニアのためにコドン最適化された10、38。コドン最適化SおよびN遺伝子配列は、Twist Biosciencesにより合成された。トランスファー構築物を、Phusionポリメラーゼ（Thermo Fisher Scientific）を用いるPCRにより、相同組換えのための約50 bpの伸長を提供するプライマーを用いて増幅して、トランスファー構築物をRed組換えによりsMVA断片に挿入した。挿入された抗原配列を、PCR、制限酵素消化、およびシーケンシングにより確認した。増幅したPCR産物を、NucleoSpin GelおよびPCRクリーンアップキット（Macherey-Nagel）を用いて精製し、100 ngのPCR産物の15 kV/cm、25μF、200 Ωの電気穿孔により、sMVA断片を擁する50 μLの組換えコンピテントGS1783細菌を作製した。細菌を、抗生物質なしで、1 mLのLuria-Bertani（LB）培地に再懸濁し、2時間、32℃、220 r.p.m.でインキュベートした。2時間のインキュベーション後、細菌を30 μg/mLのクロラムフェニコールおよび30 μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天板に画線し、32℃で2日間インキュベートした。それぞれのMVA挿入部位に抗原配列が挿入されたsMVA断片を擁する細菌性クローンを、PCRおよび制限パターン分析により特定した。挿入された抗原配列から、I-SceI媒介性2回目Red組換え反応によりカナマイシン抵抗性マーカーを継ぎ目なく除去するために、選択した細菌性クローンの一晩培養物100 μLを、30 μg/mLのクロラムフェニコールを含有するLB培地900 μLに加え、32℃、220 r.p.m.で1.5～2時間インキュベートした。その後、30 μg/mLのクロラムフェニコールおよび2% L-アラビノースを含有する1 mLのLBを加えてI-SceIホーミングエンドヌクレアーゼ酵素の発現を誘導して、50 bp遺伝子重複での二本鎖切断を誘導した。細菌を32℃で1時間インキュベートしてから水浴に移し、220 r.p.m.、42℃で30分間インキュベートしてRed組換えタンパク質の発現を誘導して、50 bp遺伝子重複の組み換えによるカナマイシン抵抗性マーカーの除去を媒介した。さらに2時間、32℃、220 r.p.m.の細菌のインキュベーション期の後、細菌を30 μg/mLのクロラムフェニコールおよび1% L-アラビノースを含むLB寒天板に画線し、32℃で2日間インキュベートした。挿入された抗原配列からカナマイシンマーカーが継ぎ目なく除去されたsMVA断片を擁する細菌性クローンを、PCR、制限パターン分析、およびサンガーシーケンシングにより特定した。
sMVAウイルス再構成: BHK-21細胞における、ヘルパーウイルスとしてFPVを用いての、3つのsMVA DNAプラスミドからのsMVAウイルス再構成を、次のようにして実施した8～10。3つのsMVA DNAプラスミドを、アルカリ溶解により大腸菌から単離し50、6ウェルプレート組織培養プレートで増殖させた60～70%コンフルエントBHK-21細胞に、Fugene HDトランスフェクション試薬（Roche）をメーカーの指示どおりに用いてコトランスフェクトした。トランスフェクション4時間後、細胞をおよそ0.1～1 MOIのFPVに感染させて、sMVAウイルス再構成を開始させた。トランスフェクト/感染BHK-21細胞を2日間増殖させた後、ほとんどのまたは全部の細胞がsMVAウイルス感染の徴候を示すまで8～12日間にわたり、隔日で移し、再播種し、より大きい組織培養フォーマットでさらに2日間増殖させた。この手順を用いて、sMVAウイルス再構成を示す特徴的なMVAウイルスプラーク形成および細胞変性効果（CPE）が、通常はトランスフェクション/感染4～8日後に検出された。完全感染BHK-21細胞単層は、通常、トランスフェクション/感染8～12日後に見られた。感染BHK-21細胞単層から、従来の凍結/融解法によりsMVAウイルスを調製し、BHK-21細胞で1代継代してから、CEFで精製ウイルスストックを製造した。sMVAまたは組換えsMVA-CoV-2ベクターは、FPV HP1.441を用いて（sMVA hp、sMVA-N/S、sMVA-S/N hp）、またはTROVACを用いて（sMVA tv1およびtv2、sMVA-S tv、sMVA-N tv、sMVA-N/S tv、sMVA-S/N tv）再構成された。
宿主細胞範囲: さまざまなヒト細胞株（HeLa、293T、MRC-5、A549、および143B）、BHK-21細胞、およびCEFを用いて、sMVAおよびwtMVA宿主細胞範囲を次のように決定した。細胞を6ウェルプレート組織培養フォーマットで播種し、70～90%コンフルエントで、MEM2を用いて0.01 MOIのsMVAまたはwtMVAに二連で感染させた。感染2時間後、細胞をPBSで2回洗い、（細胞およびウイルスのセクションに記載される）規定の増殖培地中、2日間インキュベートした。インキュベーション期の後、従来の凍結/融解法によりウイルスを調製し、各二連感染のウイルス力価をCEFで二連で決定した。
複製キネティクス: sMVAおよびwtMVAの複製キネティクスを比較するために、CEFまたはBHK-21細胞を6ウェルプレート組織培養フォーマットで播種し、70～90%コンフルエントで、MEM2を用いて0.02 MOIでsMVAまたはwtMVAに三連で感染させた。2時間のインキュベーション後、細胞をMEM10中で増殖させた。感染24時間および48時間後、凍結/融解法によりウイルスを調製し、各三連感染および接種材料のウイルス力価をCEFで二連で決定した。
プラークサイズの分析: sMVAウイルスおよびwtMVAのプラークサイズを比較するために、CEFまたはBHK-21細胞を6ウェルプレート組織培養フォーマットで播種し、70～90%コンフルエントで、MEM2を用いて0.002 MOIでsMVAまたはwtMVAに感染させた。2時間のインキュベーション後、MEM10を加えて細胞を16～24時間増殖させた。細胞単層をワクシニアウイルスポリクローナル抗体で染色し、Leica DMi8倒立顕微鏡を用いてウイルスプラークを撮像し、LAS Xソフトウェアを用いて測定した。sMVAまたはwtMVAの25ウイルスプラークのサイズを、面積 = π×a×bという式[式中、aは楕円の主半径であり、bは楕円の副半径である]を用いて計算した。
PCR分析: sMVAベクターのウイルスDNAの特徴をPCRにより決定するために、CEFを6ウェルプレート組織培養フォーマットで播種し、70～90%コンフルエントで、sMVAまたはwtMVAに5 MOIで感染させた。感染16～24時間後に、DNA Easy Blood and Tissue Kit（Qiagen）をメーカーの指示どおりに用いて、DNAを抽出した。全てのPCR反応を、Phusionポリメラーゼ（ThermoFisher Scientific）を用いて実施した。プライマー 5'-TCG TGG TGT GCC TGA ATC G-3' (SEQ ID NO: 74) 及び 5'-AGG TAG CGA CTT CAG GTT TCT T-3' (SEQ ID NO: 92) を用いてMVA ITR配列を検出し、プライマー 5'-TAT CCA CCA ATC CGA GAC CA-3' (SEQ ID NO: 75) 及び 5'-CCT CTG GAC CGC ATA ATC TG-3' (SEQ ID NO: 93) を用いて左ITRからユニーク領域への移行を確認し、プライマー 5'-AGG TTT GAT CGT TGT CAT TTC TCC-3' (SEQ ID NO: 76) 及び 5'- AGA GGG ATA TTA AGT CGA TAG CCG-3' (SEQ ID NO: 94) を用いて挿入N抗原配列ありまたはなしのDel2部位を確認し、結合部位がF1/F2相同配列に隣接しているプライマー 5'-TGG AAT GCG TTC CTT GTG C-3' (SEQ ID NO: 77) 及び 5'-CGT TTT TCC CAT TCG ATA CAG-3' (SEQ ID NO: 78) を用いてF1/F2組換え部位を確認し、プライマー 5'-TAT AGT CTT TGT GGC ATC CGT TG-3' (SEQ ID NO: 79) 及び 5'-ACC CAA ACT TTA GTA AGG CCA TG-3' (SEQ ID NO: 80) を用いて挿入S抗原ありまたはなしのIGR69/70挿入部位を確認し、結合部位がF2/F3相同配列に隣接しているプライマー 5'-ATA AGC GTT GTC AAA GCG GG-3' (SEQ ID NO: 81) 及び 5'-AGG AAA TAG AAA TTG TTG GTG CG-3' (SEQ ID NO: 82) を用いてF2/F3組換え部位を確認し、プライマー 5'-ACA TTG GCG GAC AAT CTA AAA AC-3' (SEQ ID NO: 83) 及び 5'-ATC ATC GGT GGT TGA TTT AGT AGT G-3' (SEQ ID NO: 84) を用いて挿入SまたはN抗原配列ありまたはなしのDel3挿入部位を確認し、プライマー 5'-TAT CCA CCA ATC CGA GAC CA-3' (SEQ ID NO: 85) 及び 5'-GTC TGT CCG TCT TCT CTA TTG TTT A-3' (SEQ ID NO: 86) を用いてユニーク領域から右ITRへの移行を確認し、そしてプライマー 5'-TTA ACT CAG TTT CAA TAC GGT GCA G-3 (SEQ ID NO: 87) 及び 5'-TGG GGT TTC TTC TCA GGC TAT C-3' (SEQ ID NO: 88) を用いてBACベクターのSopA要素を検出した。PCR産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、GeneSys（v1.5.4.0）ソフトウェア搭載Syngene PXi6撮像装置を用いて撮像した。トリミングしていないゲル画像は、ソースデータファイルとして提供される。sMVAベクターから得られたPCR産物の配列決定をするため、増幅したPCR産物をNucleoSpinゲルおよびPCRクリーンアップキット（Macherey-Nagel）をメーカーの指示どおりに用いて精製し、サンガーシーケンシングにより分析した。
制限パターン分析: BHK-21細胞を20×150 mm 組織培養ディッシュに播種し、約70～90%コンフルエントとなるまで増殖させ、0.01 MOIでwtMVA、sMVA tv1、またはsMVA tv2に感染させた。過去の記述のように47、精製ウイルスを感染2日後に調製した。過去の記述のように51、ウイルスDNA（vDNA）をフェノール/クロロホルム抽出し、次いでエタノール沈殿させた。簡単に説明すると、単離したウイルス粒子を溶解バッファー（50 mM Tris-HCl pH 8.0、1.2% SDS、4 mM EDTA pH 8.0、4 mM CaCl2、および0.4 mg/mL プロテイナーゼK）に再懸濁し、一晩37℃でインキュベートした。DNAをフェノールで2回抽出し、各抽出は、等量の緩衝フェノールを加え、室温（RT）で10分間、300×gで遠心処理することにより、実施した。DNAのせん断が起きないように気をつけながら水相を採取した。最後の抽出は、1:1の等量のフェノール/クロロホルムを水相に加え、次いで上述のように遠心処理をすることにより実施し、最後にフェノール/クロロホルム抽出したウイルスDNAをエタノール沈殿させた。DNA濃度およびA260/A280比を、NanoVue（GE Healthcare Bio-sciences Corp）を用いて決定した。10 μgのvDNAを3単位のKpnIまたはXhoIで消化し、次いで2.4 v/cmで一晩泳動させた0.5% EtBr染色アガロースゲル上で可視化した。画像は、GeneSys（v1.5.4.0）ソフトウェア搭載Syngene PXi6撮像装置を用いて取得した。
sMVA断片およびsMVAベクターのシーケンシング: PacBio（Pacific Biosciences）ロングリードシーケンシング分析を用いて、クローン化sMVA断片（F1～F3）および再構成sMVAベクターの配列を決定した。sMVA断片のシーケンシングのためのプラスミドDNAを、QIAGENラージ-コンストラクト（Large-Construct）キットで、メーカーの指示どおりに単離した。sMVAのシーケンシングのためのウイルスDNAを、上記に開示したフェノール/クロロホルム抽出により、精製ウイルス粒子から単離した。sMVA-CoV2ベクターのシーケンシングのためのウイルスDNAを、NucleoSpin Blood QuickPure DNA抽出キット（Macherey-Nagel）で、メーカーの指示どおりに、精製ウイルス粒子から単離した。簡単に説明すると、5 μgの断片化DNAを、SMRTbell Template Prepキット1.0およびBarcoded Adapter Plate-96（PacBio）を用いて、バーコード化されたSMRTbellライブラリーに変換した。sMVA断片およびsMVAベクターのライブラリーを、BluePippin（Sage Science）でサイズ選択した（7 kbサイズのカットオフ）。シーケンシングプライマーによるポリメラーゼのライブラリーとの結合後、ポリメラーゼ複合体を、MagBeadsローディングによりRSII SMRTセルにロードし、PacBio RSIIで6時間ムービーで配列決定した。sMVA-CoV2ベクターのポリメラーゼ複合体を、拡散モードを用いてSequel SMRTセルにロードし、PacBio Sequelで10時間ムービーで配列決定した。リード脱多重化（read demultiplexing）、リファレンス配列に対するリードマッピング、および環状コンセンサスシーケンシング（CCS）分析を、それぞれ、脱多重化バーコード（Demultiplex Barcodes）、リシーケンシング、およびCCSモジュールにより、SMRT Portal（v. 2.3.0）またはSMRT Link（v6.0.0.47841）またはSMRT Link（v8.0.0.80529）で実施した。CCSリードでのバリアントコーリングは、pbmm2v 1.0.0を用いてCCSリードをマッピングした後、VarScan v2.3.9を用いて実行した。canu v1.7.1を用いてデノボアセンブリを行った。繋ぎ合わせたコンティグの5’開始位置を、リファレンスと比較して編集した。MVA U94848.1を、sMVAゲノム配列のリードのマッピングのリファレンスとして用いた。sMVA断片およびsMVA-CoV2ベクターの配列を、ベクターNTI（Invitrogen、v. 11.5）により構築されたMVA U94848.1に基づく対応するリファレンス配列とのアラインメントを通してマップした。デノボの繋ぎ合わせたコンティグの各リファレンスとの比較とともに、この分析によって、sMVA断片F1および配列決定した全ての再構成sMVAベクター（sMVAおよびsMVA-CoV-2ベクター）に見られた021L4の3塩基対下流の非コード決定領域における1つの点変異を含め、クローン化sMVA断片および再構成sMVAベクターの配列同一性が確認された。明白に排除できない追加のバリエーション（点変異）が、sMVA断片F3内のITRの末端から88 bpのタンデムリピートの非コード決定領域に見られた。これらの2つのバリエーションがクローン化sMVA断片に存在したが、それらはsMVA断片の化学合成中に生じたエラーであったことが確認された。内部ユニーク領域、および完全MVAコード量（coding content）を含むITRのユニーク領域は、全ての再構成sMVAベクターで確実に繋ぎ合わせることができた。sMVAベクターの配列コンティグは、全U94848.1リファレンス配列のほとんど（99%超）をカバーしており、高反復性ITRタンデムリピートに少々例外があるだけだった。sMVA-CoV2ベクターのITRタンデムリピートの全領域は、配列リードの質が原因と思われるこれらの領域の低カバレッジのせいで、リファレンス配列またはデノボアセンブリとのアラインメントを通して確実にマップすることはできなかった。PacBioシーケンシングに基づくsMVA断片およびsMVA-CoV2ベクターのリファレンス配列を、NCBIに寄託した。再構成sMVAベクターの生シーケンシングデータに混入したBACベクター配列の不存在を決定するために、シーケンシングのリードを、SMRT Link（v8.0.0.80529）のリシーケンシングモジュールを用いて、Genscript提供のリファレンスpCCl-Brickベクター配列に重ねてアラインメントした。
免疫ブロット分析:5 MOIで感染させたBHK-21細胞を、感染24時間後に収穫した。タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤を添加した0.1% トリトンX-100含有PBSに可溶化してから、DTT含有Laemmliバッファー中で還元し変性させ、95℃で約10分間煮沸した。タンパク質を4～20% Mini Protean TGX 勾配ゲル（BioRad）上で分解させ、PVDFメンブレンに転写した。Sタンパク質は、抗SARS-CoV-1 S1サブユニットウサギポリクローナル抗体（40150-T62-COV2、Sino Biological）でプローブし、Nタンパク質は抗SARS-CoV1 NPウサギポリクローナル抗体（40413-T62、Sino Biological）でプローブした。ワクシニアBR5タンパク質は、ローディング対照としてプローブした。西洋わさびペルオキシダーゼ（Sigma-Aldrich）結合抗ウサギポリクローナル抗体を二次抗体として用い、化学発光基質（ThermoFisher）を用いてタンパク質のバンドを可視化した。
フローサイトメトリー: HeLa細胞を6ウェルプレート（5×105/ウェル）に播種し、翌日、sMVAワクチン候補にMOI 5で感染させた。6時間のインキュベーション後、非酵素性細胞解離バッファー（Cat. No. 13151014、GIBCO）を用いて細胞を剥離した。細胞は、そのまま一次抗体とともにインキュベートするか、または抗体を添加する前に固定し透過処理をした。抗SARS-CoV-1 S1マウス（40150-R007、Sino Biological）およびS2ウサギ（GTX632604、GeneTex）モノクローナル抗体、抗SARS-CoV-1 Nウサギモノクローナル抗体（40143-R001、Sino Biological）、ならびに抗ワクシニアウサギポリクローナル抗体（9503-2057、Bio Rad）を1:2000希釈で用いた。1時間後、抗マウスまたは抗ウサギAlexa Fluor 488結合二次抗体（A11001、A21206; Invitrogen）を1:4000希釈で細胞に加えた。生細胞は、最後に1% パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、BD FACSDivaソフトウェア（v8.0.1.1）搭載BD FACSCelestaフローサイトメーターを用いて取得された。分析は、FlowJo（v10.6.2）を用いて実施した。
免疫蛍光法: BHK-21細胞またはHeLa細胞をカバーガラス上で増殖させ、37℃の加湿インキュベーター（5% CO2）内で6時間かけて、Sおよび/またはNタンパク質をコードするsMVAまたは組換えsMVAにMOI 5で感染させた。感染後、2% PFA中15分かけて細胞を固定してから、そのまま、氷冷の1:1アセトン/メタノールを加えて氷中で5分間透過処理をした。3% BSAを用いて室温で1時間かけて細胞をブロックし、S2サブユニットまたはNに対する一次抗体ミックス（1:500）とともに1時間、37℃でインキュベートしてから、Alexa結合二次抗体（ThermoFisher）（1:2000）とともに1時間、37℃でインキュベートし、各工程の間で洗浄した（PBS + 0.1% Tween20）。細胞膜および核を検出するために、細胞を、5 μg/mLのAlexa結合コムギ胚芽凝集素（ThermoFisher）およびDAPIとともに室温で10分間インキュベートした。カバーガラスを洗い、Fluoromount-G（SouthernBiotech）を用いてスライドに載せた。顕微鏡分析は、共焦点レーザー走査顕微鏡（Zeiss、LSM700）を用いて実施した。画像を取得し、Zenソフトウェア（Zeiss、Black Edition Version 8.1）を用いて処理した。
マウスの免疫化: シティー・オブ・ホープ（COH）のベックマン研究所の研究機関動物管理・使用委員会（IACUC）は、この試験に割り当てられたプロトコル20013を承認した。全ての試験手順は、「実験動物の管理と使用に関する指針」、および「公衆衛生局の実験動物の人道的管理と使用に関する規範」の推奨事項を厳守して実行した。6週齢C57BL/6（C57BL/6J、000664）またはBalb/c（BALB/cJ、000651）をJackson laboratoriesから購入した。C57BL/6 Nrampは、シティー・オブ・ホープの動物施設で繁殖した。マウス（N = 4～5）を、3週間間隔で2回、腹腔内経路で、5×107 PFU（高用量）または1×107 PFU（低用量）のsMVA、wtMVA、またはsMVA-CoV2ベクターで免疫した。別々のベクターを用いた場合のS抗原およびN抗原両方による免疫刺激を決定するために（図15～16）、同じ免疫スケジュールおよび経路で、各ワクチンベクターの高用量の半分（2.5×107 PFU）または低用量の半分（0.5×107 PFU）でマウスを同時免疫した。体液性免疫の分析用の血液サンプルを、プライム2週間後、およびブースター免疫1週間後に後眼窩の出血により採取した。細胞性免疫の分析用の脾細胞を、ブースター免疫1週間後、動物を人道的に安楽死させてから採取し標準的な手順により単離した。
結合抗体: sMVA、wtMVA、またはsMVA-CoV2ベクターで免疫したマウスにおける結合抗体をELISAで査定した。ELISAプレート（3361、Corning）を、Venus蛍光マーカー9、S（S1+S2、40589-V08B1、Sino Biological）、RBD（40592-V08H、Sino Biological）、またはN（40588-V08B、Sino Biological）を発現する1 μg/mlのMVAで一晩かけてコーティングした。プレートを、PBS中3% BSAを用いて2時間かけてブロックした。マウス血清の系列希釈をPBS中で調製し、2時間にわたりプレートに加えた。洗浄後、1:3000希釈のHRP結合抗マウスIgG二次抗体（W402B、Promega）を加え、さらに1時間インキュベートした。1-Step Ultra TMB-ELISA（34028、Thermo Scientific）を用いて1～2分かけてプレートを現像した後、1M H2SO4を用いて反応を停止させた。FilterMax F3マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて、波長450 nmでプレートを読んだ。結合抗体エンドポイント力価は、0.1吸光単位（OD）よりも高い吸光度、またはモック免疫マウスの平均ODプラス同群の同希釈度のODの標準偏差の5倍よりも高い吸光度を有する、最後の血清希釈度として計算した。IgG2a/IgG1比を査定するため、マウス血清を1:10000でPBS中に希釈した。二次抗体（1:2000。ヤギ抗マウスIgG2a交差吸着HRP抗体、Southern biotech、1083-05; ヤギ抗マウスIgG1交差吸着HRP抗体、Thermo Scientific、A10551）を除き、上述したようにしてアッセイを実施した。IgG2a/IgG1比は、IgG2a二次抗体とともにインキュベートしたウェルの吸光度リードを、IgG1抗体とともにインキュベートした同じサンプルの吸光度で割ることにより計算した。
MVA中和アッセイ: ARPE-19細胞を96ウェルプレートに播種した（1.5×104細胞/ウェル）。翌日、マウス血清の系列希釈液を、蛍光マーカーVenus10を発現するMVAとともに2時間インキュベートした（1.5×104 PFU/ウェル）。血清-ウイルス混合物を二連ウェルの細胞に加え、24時間インキュベートした。24時間のインキュベーション期の後、Leica DMi8倒立顕微鏡を用いて細胞を撮像した。各ウェルの写真を、Image-Pro Premier（Media Cybernetics）を用いて処理し、MVA-Venus感染細胞がカバーする面積に対応する蛍光面積を計算した。
SARS-CoV-2シュードウイルスの製造: トランスフェクションの前日に、HEK293T/17を、10% 熱失活FBS、非必須アミノ酸、HEPES、およびグルタミンを添加したDMEM中、5×106細胞の密度で15 cmのディッシュに播種した52。翌日、細胞に、パッケージングベクター（pALDI-Lenti System、Aldevron）、ルシフェラーゼレポーターベクター、および野生型SARS-CoV2スパイクタンパク質（Sino Biological）または水疱性口内炎ウイルスG（VSV-G、Aldevron）をコードするプラスミドのミックスを、トランスフェクション試薬FuGENE6（Roche）をメーカーの指示どおり試薬:DNA比3:1で用いて、トランスフェクトした。トランスフェクション16時間後、培地を交換し、細胞をさらに24～72時間インキュベートした。24時間、48時間、および72時間で培地を収穫し、1500 RPMで5分間遠心処理し、0.22 μmポアサイズの無菌フィルターを用いて濾過して、清澄化した。清澄化したレンチウイルス粒子を、20000 RPM、4℃、2時間の超遠心法により濃縮した。ペレットを、2% 熱失活FBS含有DMEMに再懸濁し、4℃で一晩保管して、ペレットを完全に溶かした。翌日、サンプルを分注し、急速冷凍し、下流アッセイのために－80℃で保管した。
SARS-CoV-2偽型の中和およびADEアッセイ: 精製SARS-CoV-2偽型の懸濁液中のp24抗原のレベルをELISA（Takara）で測定した。マウス血清を熱失活させ、プールし、完全DMEM中、線形範囲1:100～1:50000で希釈した。中和アッセイでは、希釈血清サンプルを、SARS-CoV-2-スパイク偽型ルシフェラーゼレンチウイルスベクターとともに4℃で一晩プレインキュベートし、100 ng/mLのp24抗原に対し正規化した。形質導入前日に、ACE-2受容体を過剰発現するHEK293T細胞を、完全DMEM中2×105細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。感染前に、5 μg/mLのポリブレンを各ウェルに加えた。次に、中和した血清サンプルをウェルに加え、細胞をさらに48時間、37℃で、5% CO2雰囲気でインキュベートした。インキュベーション後、1ウェルあたり40 μLのLuciferase Cell Culture Lysis 5x試薬（Promega）を用いて細胞を溶解させた。100 μLのルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）を基質として用いて、ルシフェラーゼ活性を定量化した。マイクロプレートリーダー（SpectraMax L、Molecular Devices）を用いて波長570 nmで相対ルシフェラーゼ単位（RLU）を測定した。各希釈度の中和力価パーセントを次のようにして計算した: NT ＝ [1-（免疫血清ありの平均発光/免疫血清なしの平均発光）] ×100。90%中和（NT90）となった力価は、すぐ上のNTおよびすぐ下のNTを用いてNT対血清希釈度をプロットするグラフの線形スロープを決定することにより計算した。全ての実験で非感染細胞のRLUを測定し、それは常に50～90であった。
ADEアッセイでは、THP1細胞を96ウェルプレートに2×106細胞/mLのコンフルエンシーで播種し、SARS-CoV-2-スパイク偽型またはVSV-Gルシフェラーゼレンチウイルスベクターの存在下、1:5000または1:50000希釈の血清サンプルとともに48時間共インキュベートし、100 ng/mLのp24抗原に対し正規化した。インキュベーション後、1ウェルあたり100 μLのONE-Glo Luciferase Assay System（Promega）を用いて細胞を溶解させた。RLUは上記のようにして測定した。
SARS-CoV-2フォーカス減少中和試験（FRNT）: HeLa-ACE2細胞を、12 μLの完全DMEM中、2×103細胞/ウェルの密度で播種した。希釈プレートで、プールしたマウス血清を系列希釈し、終量は12.5 μLとした。次に、12.5 μLのSARS-CoV-2ウイルスを、濃度1.2×104 pfu/mLで希釈プレートに加えた。
1時間のインキュベーション後、384ウェルプレートに残った培地を除去し、該384ウェルプレートに25 μLのウイルス/血清混合物を加えた。プレートを20時間インキュベートした後、1時間かけて固定した。次に各ウェルを100 μLの1xPBS 0.05% tweenで3回洗った。Perm/Washバッファー（BD Biosciences 554723）中1:500で希釈した12.5 μLのヒトポリクローナル血清をプレートの各ウェルに加え、室温（RT）で2時間インキュベートした。プレートを3回洗い、ペルオキシダーゼヤギ抗ヒトFab（Jackson Scientific）をPerm/Washバッファー中1:200で希釈してからプレートに加え、RTで2時間インキュベートした。次にプレートを3回洗い、12.5 μLのPerm/Washバッファーを該プレートに加えてから、RTで5分間インキュベートした。Perm/Washバッファーを除去し、ただちにTrueBlueペルオキシダーゼ基質を加えた（Sera Care 5510-0030）。血清を三連ウェルで試験した。正常ヒト血漿を血清スクリーニングのネガティブ対照として用いた。
SARS-CoV-2回復期血漿サンプル: COHの研究機関バイオセイフティー委員会（Institutional Biosafety Committee）のプロトコル20004は、SARS-CoV-2回復期血漿の使用を承認した。SARS-CoV-2回復期の人（N = 19）の匿名血漿サンプルをカリフォルニア州立大学サンディエゴ校から入手した。この人たちが過去3～10週間に感染していたことを、PCRおよびラテラルフローアッセイで確認した。全員に軽症から中等～重症の症状があった。SARS-CoV-2パンデミック以前に購入した血清サンプル（DS-626-GおよびDS-626-N、Seracare）をネガティブ対照として用いた。血漿サンプル中のSARS-CoV-2特異的結合抗体は、上記のようにして測定した。交差吸着ヤギ抗ヒトIgG（H+L）二次抗体（A18811、Invitrogen）を1:3000の希釈度で用いた。
T細胞分析: 脾臓を収穫し、セルメッシュを用いて解離した後、RBC溶解バッファー（BioLegend）を用いて血液細胞を除去した。2.5×106の脾細胞を、SもしくはNペプチドライブラリー（GenScript、11aaオーバーラップを有する15マー、1 μg/ml）、0.1% DMSO、またはホルボールミリスタートアセタート（PMA）-イオノマイシン（BD Biosciences）で、1.5時間、37℃で刺激した。同時刺激として、抗マウスCD28およびCD49d抗体（1 μg/ml; BioLegend）を加えた。ブレフェルジンA（3 μg/ml; eBioscience）を加え、細胞をさらに16時間、37℃でインキュベートした。Cytofixバッファー（BD Biosciences）を用いて細胞を固定し、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗マウスCD3（クローン17A2、555274、BD）、BV650抗マウスCD8a（クローン53-6.7、563234、BD）を用いて表面染色を実施した。Cytopermバッファー（BD Biosciences）を用いて細胞の透過処理をした後、アロフィコシアニン（APC）結合抗マウスIFN-γ（クローンXMG1.2、554413、BD）、フィコエリトリン（PE）結合抗マウスTNF-α（クローンMP6-XT22、554419、BD）、およびPE-CF594抗マウスIL-2（BD Biosciences（クローンJES6-5H4、562483、BD)を用いてICSを実施した。ダブル組換体のSARS-CoV2ベクターを試験した実験では、IL-2抗体は含めず、PE-CF594抗マウスIL-4（クローン11B11、562450、BD）およびBV421ラット抗マウスIL-10（クローンJES5-16E3、563276、BD）を加えた。BD FACSCelestaフローサイトメーターを用いて事象を取得した（2×105細胞/チューブ）。分析はFlowJoを用いて実施した。抗原特異的T細胞は、サイズ（FSC対SSC）、ダブレットネガティブ（FSC-H対FSC-A）、CD3+、CD8+/CD4+についてゲーティングして特定した。サイトカイン陽性応答は、個々のマウスサンプルの対応する無刺激サンプル（モック刺激開始から1時間後に培地にブレフェルジンAを添加）で検出されたバックグラウンド応答を引いた後に示される。多機能性T細胞の分析は、FlowJo Booleanコンビネーション・ゲーティングを適用して実施した。
サイトカインELISA: 免疫マウスからの脾細胞（1×106）を、2 μg/mlのSもしくはNペプチドプールの存在下、または刺激なしで、200 μlの量で、v底ウェルでインキュベートした。48時間後、プレートを2000 RPMで10分間遠心処理し、細胞上清を採取し、－80℃で保管した。マウスTNF-アルファ（MTA00B）、Quantikine ELISAキット（R&D systems）をメーカーの推奨どおりに使用した。
IFNγ ELISpot: IFNγ ELISpotアッセイによるT細胞検出を、メーカーの指示どおりに実施した（3321-2A、Mabtech）。ELISpot PVDFプレート（MSIPS4W10、Millipore）をエタノールで事前に活性化し、IFNγコーティング抗体でコーティングした。脾細胞（2×105ペプチド刺激、2×104PMA/イオノマイシン刺激）を二連ウェルに加え、一晩、2 μg/mLのペプチドとともにインキュベートした。刺激には、SおよびNペプチドライブラリー; Sライブラリーのペプチド1～86（プール1S1）および87～168（プール2S1）をカバーするS1サブユニットペプチドプール; Sライブラリーのペプチド169～316を含んだS2サブユニットペプチドプール; ならびにNペプチドライブラリーのペプチドN26 (MKDLSPRWYFYYLGT、SEQ ID NO: 89) が含まれた。24時間後、細胞を除去し、IFNγ検出抗体に続いてストレプトアビジン-ALPを加えた。BCIP/NBT-plus（3650-10、Mabtech）を用いてスポットを現像し、AID ELISpot 5.0 iSpotソフトウェア搭載AID ELISpotリーダーを用いて分析した。
統計学: 統計学による査定は、GraphPad Prism（v8.3.0）を用いて行った。BHK-21およびCEF細胞におけるsMVAとwtMVAとのプラーク面積の差、ならびにsMVAとwtMVAとの宿主細胞範囲の差の査定には、一元配置分散分析の後、Tukeyの多重比較検定およびDunnettの多重比較検定をそれぞれ用いた。sMVAおよびwtMVAの増殖キネティクスの分析には、ガイサー-グリーンハウスの補正を用いる混合効果モデルに続いてTukeyの多重比較検定を適用した。ELISAには、一元配置分散分析およびTukeyの多重比較検定を用いて、エンドポイント力価の差、および群間の群平均を計算した。IgG2a/IgG1比の分析には、一元配置分散分析およびDunnettの多重比較検定を用いて、各群で測定したIgG2a/IgG1比を1という比と比較した。ピアソン相関分析を実行して、相関係数rおよびその有意度を計算した。T細胞応答分析には、一元配置分散分析後、1つのプールした分散を用いるDunnettの多重比較検定を用いて、各群の平均を比較した。ELISpot分析には、二元配置分散分析およびDunnettの多重比較検定を適用した。
実施例1: sMVAの構築
3プラスミド系のsMVAワクチンプラットフォームを開発するために、Antoineら4が発表した長さ約178 kbpの、且つ約9.6 kbpの逆位末端配列（ITR）を含むMVAゲノム配列（図1A）をベースとし、3つのユニーク合成サブゲノムMVA断片（sMVA F1～F3）をデザインした。sMVA F1は、MVAゲノムの左ITR配列を含めて約60 kbpの左部分を含み、sMVA F2は、MVAゲノムの約60 kbpの中央部分を含み、sMVA F3は、MVAゲノムの右ITR配列を含めて約60 kbpの右部分を含むように、3つの断片をデザインした（図1B）。sMVA F1およびF2ならびにsMVA F2およびF3は、3つのsMVA断片の組み換えを促進するために、約3 kbのオーバーラップする相同配列が共通するようにデザインした（図1B）。それに加えて、3つのsMVA断片それぞれの両末端に、コンカテマー分割（CR）配列に隣接する165ヌクレオチド長のMVA末端ヘアピンループ（HL）の二本鎖コピーを加えた（図1C）。そのようなCR/HL/CR配列配置は、ポックスウイルスDNA複製中間体のゲノム接合部に形成され、ゲノム分割およびパッケージングに不可欠である27～31。これらのCR/HL/CR配列配置を含む環状DNAプラスミドは、ヘルパーウイルス感染細胞にトランスフェクトされると、インタクトな末端HL配列を有する線形ミニ染色体へと自発的に分割される28、29、32。図1B～1Cに示すようにデザインされた3つのsMVA断片は、環状DNAプラスミドとしてヘルパーウイルス感染細胞にコトランスフェクトされると、線形ミニ染色体へと分割されることができ、共通の相同配列によって互いに組み換え、最終的に全長MVAゲノムとしてパッケージ化する。3つのsMVA断片のすべてを、細菌性人工染色体（BAC）クローンとして、大腸菌にクローニングした。
MVAをBACから救出する過去に使用された手順8、9、33を用いて、3つのDNAプラスミドをBHK-21細胞にコトランスフェクションした後に鶏痘（FPV）をヘルパーウイルスとしてsMVAウイルスを再構成させたが（図1D）、それらはFPVには許容されない34。2つの異なるFPV株（HP1.441およびTROVAC）35、36を用いてsMVAウイルス再構成を促進した（図2A）。MVAワクチン製造で一般に用いられる、CEFでのウイルス増殖の後、精製sMVAウイルスを製造した。再構成sMVAウイルスで得られたウイルス力価は、「野生型」MVA（wtMVA）で得られたウイルス力価と類似していた（表1）。
* ストックは、30×15 cmディッシュの感染（MOI 0.02）後CEFで製造。
実施例2: sMVAのインビトロでの特徴決定
sMVAのウイルスDNAの特徴を決定するために、sMVAおよびwtMVAに感染させたCEFからのDNA抽出物を、いくつかのMVAゲノム位置についてPCRで比較した15。F1/F2およびF2/F3組換え部位を含め、査定した全てのゲノム位置について、sMVAとwtMVAとで類似したPCR結果が得られ（図1E）、3つのsMVA断片の高効率な組み換えが示された。追加のPCR分析から、sMVAウイルスDNAにはBACベクター配列は全く存在しないことが示され（図1E）、sMVAウイルス再構成後に細菌性ベクター要素が自発的かつ効率的に除去されたことが示唆された。精製sMVAおよびwtMVAウイルスのウイルスDNAの制限酵素消化による比較から、sMVAとwtMVAとの類似したゲノムパターンが明らかになった（図1F）。sMVAウイルスDNAのシーケンシング分析により、F1/F2およびF2/F3組換え部位を含め、いくつかの位置でのMVAゲノム配列が確認された。さらに、FPV TROVACを用いて再構成させたsMVAウイルス分離株の1つの全ゲノムシーケンシングにより、リファレンスMVAゲノム配列のアセンブリ、および再構成sMVAウイルスに由来するウイルスDNAのベクター特異的配列の不存在が確認された。
sMVAの複製特性の特徴を決定するために、sMVAおよびwtMVAの増殖キネティクスを、増殖性MVA複製を支持することがわかっている2つの細胞種、BHK-21細胞およびCEF細胞で比較した6。この分析から、BHK-21細胞およびCEF細胞の両方で、sMVAとwtMVAとの類似した増殖キネティクスが明らかになった（図2B）。それに加えて、sMVAまたはwtMVAに感染させたBHK-21およびCEF細胞単層で、類似したウイルスフォーカス面積が決定され（図2C）、MVA許容性細胞におけるsMVAおよびwtMVAの類似した伝播能が示唆された。BHK-21およびCEF細胞におけるsMVAおよびwtMVAの増殖性複製6と比べて、さまざまなヒト細胞株の感染後は、sMVAまたはwtMVAの限られたウイルス産生しか観察されなかった（図2D）。これらの結果は、MVAのきわめて限定的な複製特性と一致するものであり、また、sMVAウイルスはBHK-21およびCEF細胞では効率よく増殖できるが、ヒト細胞では効率よく増殖できないことを示している。
実施例3: sMVAのインビボでの免疫原性
インビボでのsMVAの特徴を決定するために、C57BL/6マウスを高用量または低用量で2回免疫した後に、sMVAおよびwtMVAの免疫原性を比較した。1回目および2回目の免疫後にsMVAおよびwtMVAにより刺激されたMVA特異的結合抗体は、同等であった（図3A、4A）。1回目の免疫後は、高用量ワクチン群の抗体レベルが低用量ワクチン群を上回ったが、2回目の免疫後は、高用量および低用量ワクチン群で類似した抗体レベルが観察された。それに加えて、2回目の免疫後にsMVAおよびwtMVAにより誘導されたMVA特異的NAb応答レベルの有意差は検出されなかった（図3B、4B）。ブースター免疫後に免疫優性ペプチドを用いたエクスビボ抗原刺激35により決定されたMVA特異的T細胞応答から、sMVAまたはwtMVAを受けたマウスにおける類似したMVA特異的T細胞レベルが明らかになった（図3C～3Dおよび図4C～4D）。これらの結果は、マウスにおけるMVA特異的な体液性免疫および細胞性免疫の誘導において、sMVAウイルスがwtMVAと同様の能力を有することを示している。
実施例4: sMVA SARS-CoV-2ワクチンベクターの構築
大腸菌における高効率なBAC組換え法を用いて、SARS-CoV-2のS抗原およびN抗原の全長配列を、3つのsMVA断片内の異なる位置にある、一般に用いられるMVA挿入部位に挿入した。次に、改変および無改変sMVA断片の組み合わせをFPV感染BHK-21細胞にコトランスフェクトして、S抗原およびN抗原の配列を単独または組み合わせで発現するsMVA SARS-CoV-2（sMVA-CoV2）ベクターを再構成させた（図5Aおよび5B）。sMVA-SおよびsMVA-Nという名称の、それぞれSまたはNだけをコードするシングル組換えベクターでは、欠失（Del3）部位に抗原配列を挿入した（図1Bおよび5B）5。sMVA-N/SおよびsMVA-S/Nという名称の、SおよびN両方をコードするダブル組換えベクターでは、抗原配列を、Del3および欠失2（Del2）部位に（sMVA-N/S）、またはDel3および069Rと070Lとの間の遺伝子間領域（IGR69/70）に（sMVA-S/N）挿入した（図1Bおよび5B）5、38。全ての抗原配列をmH5プロモーターと共にsMVA-CoV2ベクターに挿入して、MVA複製の初期および後期の抗原発現を促進させた39、40。FPV株HP1.441またはTROVACを用いてsMVA-CoV-2ワクチンベクター再構成させた。CEFを用いて製造されたsMVA-CoV2ベクターの精製ウイルスは、sMVAまたはwtMVAで得られた力価とほぼ同等の力価に達した（表1）。Del2、Del3、およびIGR69/70 MVA挿入部位のPCRおよびシーケンシング分析により、全てのsMVA-CoV2ワクチンベクターのSARS-CoV-2抗原配列の完全性および挿入が確認された（図5C）。さらに、FPV株TROVACまたはHP1.441を用いて再構成させた全てのダブル組換えsMVA-CoV2ワクチンベクターの全ゲノムシーケンシングにより、NCBIに寄託されたこれらのワクチン構築物のリファレンス配列が実証され、挿入部位のSARS-CoV-2抗原配列、MVAゲノムのアイデンティティー、およびBACベクター配列の除去が確認された。
実施例5: sMVA-CoV2ワクチンベクターのインビトロでの特徴決定
sMVA-CoV2ベクターによるS抗原およびN抗原の発現の特徴を決定するために、sMVA-CoV2ベクターに感染させたBHK-21細胞を、SおよびN特異的抗体を用いて免疫ブロットで査定した。この分析により、シングル組換えワクチンベクターsMVA-SおよびsMVA-NによるS抗原およびN抗原の単独の発現が確認され、ダブル組換えベクターsMVA-N/SおよびsMVA-S/NについてはS抗原およびN抗原両方の発現が確認された（図5D）。
細胞表面および細胞内のフローサイトメトリー（FC）染色を用いての、HeLa細胞におけるsMVA-CoV2ベクターによる抗原発現のさらなる特徴決定により、シングルおよびダブル組換えワクチンベクターによるS抗原およびN抗原の単独または両方の発現が確認された。S特異的抗体での染色から、S抗原をコードする全ベクター（sMVA-S、sMVA-N/S、sMVA-S/N）による豊富な細胞表面および細胞内抗原発現が明らかになった（図5E）。一方、抗N抗体での染色からは、N抗原をコードする全ベクター（sMVA-N、sMVA-N/S、sMVA-S/N）による、主として細胞内での抗原発現が明らかになったが（図5E）、少ないながら細胞表面染色も観察された。sMVA-CoV2ベクターによるS抗原およびN抗原の発現を、免疫蛍光法でも調査した。この分析により、ダブル組換えワクチンベクターによるS抗原およびN抗原の共発現が確認され、また、S抗原の高効率な細胞表面および細胞内での発現が示されたが、N抗原の発現は主として細胞内で観察された（図6A～6C）。さらに、細胞内フローサイトメトリーに加えて、二重抗体染色による免疫蛍光画像法により、ダブル組換えsMVA-CoV2ベクターによる同一細胞内でのS抗原およびN抗原の共発現が示された（図6A～6D）。これらの結果は、シングルおよびダブル組換えsMVA-CoV2ベクターによる高効率な抗原発現を示している。
実施例6: sMVA-CoV2ベクターのインビボでの免疫原性
sMVAベクターによるS抗原およびN抗原の単独または組み合わせの免疫原性を決定するために、シングルまたはダブル組換えワクチンベクターでの2回の免疫によるBalb/cマウスでのSARS-CoV-2特異的な体液性および細胞性免疫応答の査定を行った。1回目の免疫後、全ワクチン群で高力価の抗原特異的結合抗体が検出され、ブースター免疫後はこれらの応答の増大が観察された（図7A～7Bおよび8A～8B）。シングル組換えベクターはS抗原のみまたはN抗原のみに対する結合抗体を誘導したが、ダブル組換えベクターはS抗原およびN抗原の両方に対する結合抗体を誘導した。それに加えて、S抗原をコードする全sMVA-CoV2ベクター（sMVA-S、sMVA-S/N、sMVA-N/S）が、NAbの主要標的と考えられるS受容体結合ドメイン（RBD）に対する高力価の結合抗体を刺激した22、24。シングルおよびダブル組換えワクチン群間の抗原特異的結合抗体価は同等であった。なお、マウスにおいてsMVA-CoV2ワクチンベクターにより刺激されたSARS-CoV-2抗原特異的結合抗体応答は、ヒト回復期免疫血清で測定したSARS-CoV-2 S、RBD、およびN特異的結合抗体応答を上回っていた（図7A～7B、および9）。Balb/cマウスにおいてsMVA-CoV2ベクターにより誘導されたのとほぼ同等の結合抗体応答が、C57BL/6マウスにおいて該ワクチンベクターにより誘発された（図10）。結合抗体のIgG2a/IgG1アイソタイプ比の分析から、Th-1に偏った免疫応答が、調査したワクチン群または抗原に関係なくIgG2aに偏っていたことが明らかになった（図7Cおよび8C）。
シュードウイルスを用いてアッセイした場合、S抗原をコードするベクター（sMVA-S、sMVA-S/N、sMVA-N/S）を受けた全ワクチン群で、1回目の免疫後に強力なSARS-CoV-2特異的NAb応答が検出され、これらのNAb応答はブースター免疫後に増大した（図7D～7Eおよび8D～8E）。シュードウイルスを用いて測定した場合とほぼ同等の強力なNAb応答が、感染性SARS-CoV-2ウイルスを用いたワクチン群で観察された（図7F～7Gおよび8F～8G）。免疫血清の潜在的な感染の抗体依存性増強（ADE）について、THP-1単球を用いて査定した。これらの細胞は、ACE2受容体を発現しないが、SARS-CoV感染症におけるADEの主たる媒介因子と考えられているFcγ受容体II41を発現する。SARS-CoV-2シュードウイルスによるTHP-1単球の感染は、どのワクチン群の免疫血清によっても、サブ中和抗体濃度でも促進されず（図11）、ワクチンベクターにより誘導された抗体によるFc媒介性ADEは存在しないことが示唆された。
2回目の免疫後にエクスビボ抗原刺激により査定したSARS-CoV-2特異的T細胞から、ダブル組換えベクターsMVA-S/NおよびsMVA-N/Sを受けたワクチン群におけるS特異的およびN特異的なT細胞応答が明らかになった。一方、シングル組換えベクターsMVA-NまたはsMVA-Sを受けたマウスは、NまたはS抗原のいずれかに対してのみT細胞応答を生じた（図12A～12D、13、および14）。SをコードするsMVA-CoV2ベクターで免疫した全てのワクチン群において、高レベルのサイトカイン（IFNγ、TNFα、およびIL-4）を分泌するS特異的CD8+ T細胞を測定した（図12A）。S特異的CD4+ T細胞はほぼTh1サイトカイン（IFNγおよびTNFα）を産生したが、Th2サイトカイン（IL-4およびIL-10）の産生は抗原刺激後に増加せず（図12C、14）、Th1に偏った応答が示された。活性化したN特異的CD8+ T細胞は有意な頻度では検出されなかったが（図12B）、Nに特異的なIFNγを、およびある程度はTNFαを分泌するCD4+ T細胞が、Nをコードするシングルおよびダブル組換えベクターを接種した全ての動物で測定された（図12Dおよび14）。シングルおよびダブル組換えワクチン群のT細胞レベルの有意差は観察されなかった。
S抗原およびN抗原の両方によるSARS-CoV-2特異的免疫応答の刺激を、シングル組換えベクターsMVA-SおよびsMVA-Nを異なる用量で用いるマウス同時免疫によっても査定した。この試験から、sMVA-SおよびsMVA-Nを単独または組み合わせで受けたワクチン群における、類似した、SARS-CoV-2抗原特異的な体液性および細胞性免疫応答が明らかになった（図15および16）。まとめると、これらの結果は、1つのベクターまたは2つの別個のベクターを用いてsMVAベクターのS抗原およびN抗原を単独または組み合わせで発現させると、強力なSARS-CoV-2特異的な体液性および細胞性免疫応答をマウスにおいて刺激できることを示している。
実施例7: マウスにおけるCOH04S1のインビボでの免疫原性
sMVAワクチンCOH04S1で1回または2回免疫したマウスは、高力価の結合抗体、中和抗体、およびT細胞の反応性を示した。これらの結果は、COH04S1がマウスにおいて高免疫原性であることを示唆している。下の表2を参照されたい。NT50/90は、感染の50/90%中和をなおも示す（抗体含有）血清の希釈度である。MVAの過去の広範な安全性および臨床経験と併せて、また将来のコロナウイルスの変異株に取り組むためのプラットフォームとして、本明細書に開示されるワクチンは、潜在的に重要な臨床使用を有する。
（表２）COH04S1により誘発されたマウス免疫原性のまとめ
図18は、S抗原およびN抗原の両方を発現するC46での1回目の免疫後（上のパネル）および2回目の免疫後（下のパネル）に示された、スパイク（S）、受容体結合ドメイン（RBD）、およびヌクレオカプシド（N）抗原に対する高力価での総結合抗体を示す。抗体価は、回復期ヒト血清の抗体価（点線）と好ましくも似ていた。S特異的抗体応答は、変異S（D614G）抗原に有効に結合した（データ図示せず）。
図19は、デュアル抗原構築物sMVA-N/S（C35）ならびにシングル抗原および無抗原および対照を接種したマウスにおける抗原特異的CD4+（左側）およびCD8+（右側）T細胞応答を示す。IFNγおよびTNFαサイトカインの産生は、ロバストな抗スパイクTh1サイトカイン応答を示す。IL-4（およびIL-10、データ図示せず）に対する応答の不存在は、Th2応答の欠如を示す。
図20は、IGg2a対IgG1、およびIFNγ対IL-4分泌の比を示し、sMVA-N/S（C35）接種の結果、Th2応答ではなく、主に体液性および細胞性Th1応答（病原体に対する細胞媒介性免疫に役立つ）が生じたことを示す。ミョウバンアジュバント（Th2応答を誘導するためのプロトタイプアジュバント）と混合したスパイク抗原の接種を、各パネルの右側に対照として示す。
図21は、デュアル抗原COH04S1、シングル抗原、および空ベクター、ならびにモック対照での1回の免疫後（「プライム後」）、および2回目の免疫後（「ブースト後」）のマウス血清中の抗体が、スパイク抗原を発現するベクターを用いた場合、有効な中和抗体の発生を示すことを示している。スパイク抗原のみを発現するsMVAワクチンを青色で示し（sMVA-S）、ヌクレオカプシド抗原のみを発現するsMVAワクチンを赤色で示し（sMVA-N）、スパイク（S）およびヌクレオカプシド（N）抗原の両方を発現するsMVAワクチンを緑色で示し（COH04S1）、SARS-CoV-2の挿入なしのsMVAベクターを茶色で示し（sMVA）、モックワクチン接種を紺色で示す（モック）。中和抗体は、HeLa-Ace2細胞に感染させる生SARS-CoV-2を用いて測定した。
図22は、COH04S1がマウスにおいて強力なSARS-CoV-2特異的中和抗体（Nab）を誘発したことを示す（生SARS-CoV-2ウイルスを用いた）。Nabは、SARS-CoV-2感染性ウイルスの感染を有効にブロックした。Nabの力価は、SARS-CoV-2感染症に対して防御的とみなされる力価を1～2桁上回った。
図23は、C46が、感染の抗体依存性増強（ADE）と同義の特徴的エビデンスを示さなかったことを示している。左のパネルは、ヒトACE2タンパク質を発現するHEK細胞を示す。マウスをC46に、ならびにシングルS発現ベクターに感染させた後に生じた抗体により、シュードウイルス感染が成功裏に予防された。対照による感染阻害は観察されず、また、どのベクターで治療したマウスの血清抗体によっても、ADE（上側の点線の上にRLU単位として示されることになっていた）は観察されなかった。このパネルは、ワクチンが効いていたことを示すポジティブ対照であった。中央のパネルは、ACE2受容体は発現しない（したがって、SARS-CoV-2ウイルスに感染できない）が、Fc受容体（ADEの原因であると思われる）は発現する、THP-1単球細胞株を示す。この実験では感染もADEも観察されなかった（点線を超える増大なし）。右のパネルは、VSVベクター感染ポジティブ対照のTHP-1細胞を示す。治療マウスに由来する抗体の存在下ではこの感染の減少はなく、また、これらの抗体の存在下ではADE効果も観察されなかった（RLUは上側の点線を超えなかった）。RLUは相対ルシフェラーゼ単位を表し、この系における感染度の尺度となる。
図24は、COH04S1がマウスの腹腔内（IP）および鼻腔内（IN）接種後に強力な体液性および細胞性免疫応答を誘導したことを示す。
sMVAベクターN抗原の免疫原性をさらに評価するために、ダブル組換えワクチンベクターsMVA-N/Sを、ヒト白血球抗原（HLA）-B*0702（B7）発現トランスジェニックC57BL/6マウスにおける抗原特異的T細胞刺激について査定した。このHLA型は、SARS-CoV-2感染患者において頻繁に認識される免疫優性N特異的ペプチドを呈示することが、最近記述された。sMVA-N/Sで免疫したC57BL/6 B7マウスは、IFNγおよびTNFα分泌N特異的CD8+ T細胞を高頻度で生じ、それは全CD8+ T細胞集団の2～3%超に達した（図25A）。sMVA-N/S免疫C57BL/6 B7マウスでは、N特異的T細胞応答と比較すると低頻度ではあったが、IFNγ分泌S特異的CD8+ 細胞も有意なレベルで検出された（図25B）。IL-4を分泌するNまたはS特異的CD8+ T細胞は、sMVA-N/S免疫動物では、有意なレベルで観察されなかった。なお、C57BL/6 B7マウスにおけるNおよびS抗原の両方に対するsMVA-N/S刺激CD8+ T細胞は、ほぼ多機能性であり、N特異的CD8+ T細胞の半分以上がIFNγとTNFαとを併せて分泌していた（図25Cおよび25D）。IFNγ ELISpotでのさらなる分析から、C57BL/6 B7マウスにおいてsMVA-N/Sにより誘導されたS特異的T細胞応答は、ほぼS2ドメインのエピトープに対するものであったことが明らかになった（図26）。それに加えて、sMVA-N/S-免疫B7マウスにおいて、COVID-19疾患から回復しつつある人の大部分で認識されることが最近示されたHLA-B*0702免疫優性N特異的ペプチドエピトープ（SPRWYFYYL、SEQ ID NO: 90）での刺激後に、有意な応答が測定された（図26）。図26は、スパイク抗原に対する応答の主要コンポーネントはS2ドメインに対する応答であることを示す。Nライブラリーは、ヒトに存在するので、よく認識されている。重要なコンポーネントが、過去に記述されたNペプチド:
(SEQ ID NO: 89) として特定された。太字下線部は、ヒトで記述されたエピトープである: Peng, Y., Mentzer, A.J., Liu, G. et al., Broad and strong memory CD4+ and CD8+ T cells induced by SARS-CoV-2 in UK convalescent individuals following COVID-19. Nat Immunol (2020). https://doi.org/10.1038/s41590-020-0782-6。これらの結果は、sMVAベクターNおよびS抗原の両方が、HLA B*0702トランスジェニックマウスにおいて免疫原性であること、そしてNを標的とするCD8+ T細胞応答が免疫優性とみられることを示している。
図27は、COH04S1臨床分離株で免疫した老齢マウスが、プライムブースト免疫後に、若齢マウスに匹敵する免疫応答を生じたことを示す。
図28は、COH04S1臨床分離株の免疫原性を示す。COH04S1は、Balb/Cマウスの雌雄間で同等の免疫原性を示し、また、S/N/ミョウバンと比較して、全抗原に対しTh1免疫を示す。
実施例8: ハムスターにおけるCOH04S1のインビボでの免疫原性
COH04S1の免疫原性および防御性の試験を、6～8週齢のゴールデンシリアンハムスター（Mesocricetus auratus）を用いて実行した。この試験の目的は、シティー・オブ・ホープ（COH）合成MVAプラットフォームに基づくSARS-CoV-2ワクチン候補の免疫原性および防御有効性を、ゴールデンシリアンハムスターで試験することであった。
ゴールデンシリアンハムスターを小動物モデルとして選んだのは、その比較されるモデルCOVID-19疾患症状が、他の小動物モデルと比べても、ヒト疾患とよく似ているため、COH04S1を含めてさまざまなワクチンが予防薬および疾患重症度の軽減におよぼす影響の評価が可能になるからである。
表3に記載の15群で査定した、全部で90匹のゴールデンシリアンハムスターを用いて、合成SARS-CoV-2 sMVAワクチン候補を筋肉内および鼻腔内経路で査定した。COH04S1に加えて、野生型または2P S（スパイク）およびN（ヌクレオカプシド）またはS単独を発現するsMVA構築物を試験した。この分析には、野生型のS抗原およびN抗原を共発現する親sMVA-N/SベクターC35（図5）、C35から二重プラーク精製プロセスにより得られた臨床分離株COH04S1（C35/F4/B1）（図17および57）、C35から得られた別の二重プラーク精製分離株（C35/F4/D5）; sMVA-S/NベクターC46から得られた二重プラーク精製分離株（C46/C3/F10）（図5）、Nと、2P改変を有する融合前安定化形態のS抗原とを共発現するsMVAベクター（C79）、ならびに野生型Sだけを発現するsMVA-SベクターC15が含まれた。対照群は、sMVA空ベクターおよびモック免疫動物であった。動物を、1×108 pfuのsMVA組換体で、筋肉内（IM）または鼻腔内（IN）免疫した。
（表３）試験群/実験デザイン
ワクチン構築物を、表示の経路、記載の用量で、0日目に動物に投与し、続いて28日目にブースト投与した。表示の時点で、結合抗体およびSARS-CoV-2真性ウイルスの中和について血清を査定した（図29）。動物6匹/群（雌3匹および雄3匹のハムスター）を、プライムブーストスケジュールで、1×108 pfuのCOH04S1または1×108 pfuのsMVA空対照ベクターで、筋肉内または鼻腔内経路で免疫した。
免疫後の分析には、生SARS-CoV-2ウイルスおよびスパイクシュードウイルスの両方による、スパイクおよびヌクレオカプシド特異的結合抗体の検出、ならびに中和抗体の定量化が含まれた。
ブーストの2週間後に、動物を6×104 pfuのSARS-CoV-2分離株USA-WA1/2020（NR-52281、BEI Resources）に曝露した。曝露後10日で動物を安楽死させ、ウイルス力価の決定、肉眼所見、および病理組織学評価のために臓器を採取した。経時的体重減少および臨床所見を1日2回確認した。
体液性応答
S、RBD、およびNに対する全部のIgG結合抗体を、プライム4週間後（28日目）およびブースト2週間後（42日目）にハムスター血清中で測定した。結合抗体は対照動物では検出されなかった。一方、全てのsMVA-SARS-CoV-2免疫動物はプライム後にS、RBD、およびNに対する結合抗体を生じ、力価は2回目の投与により増加した（図30）。IMおよびIN免疫ハムスターで同等の力価が測定された。
28日目および42日目に採取した血清を、PRNT SARS-CoV-2アッセイを用いて、中和抗体（Nab）の存在について査定した。
表4および図31に示すように、対照動物はNabを生じなかった（IC50＜20）。プライム後に数匹の動物で低力価Nabが検出され、IN免疫後のほうが高いようであったが、全ての動物について結果が得られたわけではない。ブースト後はNAb力価が増大し、60から＞4860（アッセイの検出上限）の範囲となった。
（表４）PRNTアッセイの結果
体重の分析
ハムスターを、ブースト2週間後に6×104 pfuのSARS-CoV-2分離株USA-WA1/2020に曝露し、10日間毎日体重変化を測定した。IMのsMVA-S/N、N/S、Sワクチンで免疫したハムスターは当初、対照動物と同等のわずかな体重減少を示した。曝露後3日目から、sMVA-S/N、N/S、S免疫動物は体重が戻り始めたが、対照動物は体重が減り続けた。対照動物の体重は7日目に平均値－15%まで落ち込み、その後増え始めた。曝露後3日目から最終時点である曝露後10日目までの間、sMVA-SARS-S/N、N/S、Sと対照動物との体重差は有意であった（図32および33）。
sMVA-S/N、N/S、S-IN免疫動物でも、同様の結果が得られた。鼻腔内投与のsMVA-S/N、N/S、Sは、モック免疫およびsMVA IN免疫ハムスターと比較して、曝露された動物における体重減少を阻止した。この差は、2日目から試験終了まで有意であった（図32および33）。投与経路にかかわらず、全ての試験組換えワクチン間で、差は観察されなかった。それに加えて、雌雄ハムスター間の体重減少の差は観察されなかった（図33）。
COH04S1の効果
COH04S1 IMおよびIN免疫動物は、プライム後もブースト後も、S、RBD、およびNに対し同等の結合抗体価を生じた（図34）。それに加えて、抗体アイソタイプの分析により、IgG2-3/IgG1比がTh1アイソタイプIgG2およびIgG3へと大きくシフトした、Th1に偏った応答が示された。IM免疫COH04S1ハムスター6匹のうち6匹が、IC50の幾何平均が540という高力価のNabを有した。COH04S1 IN免疫動物は180～1620の力価を有し、中央値力価は540であった。IMまたはIN投与のCOH04S1は、真性SARS-CoV-2ウイルスによる亜致死的曝露後、動物の体重減少を阻止した（図35）。
曝露後10日目に採取した肺、鼻甲介、および鼻洗浄液を、SARS-CoV-2ゲノムの存在について、ゲノムRNA qPCRで分析した（図36）。曝露後10日目、モック免疫およびsMVA免疫ハムスターは、肺、鼻甲介、および鼻洗浄液中になおも高いウイルス量を有した。COH04S1 IMおよびIN免疫動物のサンプルは、肺、鼻甲介、および鼻洗浄液中gRNA量の著しい減少を示し、肺内測定の差が最も大きく、COH04S1媒介性の防御が示された。
実施例9: アフリカミドリザルにおけるCOH04S1のインビボでの免疫原性および防御有効性
アフリカミドリザル（AGM）は、高レベルのSARS-CoV-2複製をサポートし、且つ、カニクイザルおよびアカゲザルを含めた他のNHP種よりも実質的であり得る明白な呼吸器疾患を発症し、それはより高い類似性でもって、人間で提示されるCOVID-19症状になぞらえることができる。
この試験では、性別および体重の異なる非近交系AGM（表5）に1用量または2用量のCOH04S1を筋内（IM）接種し、ワクチン免疫原性および防御有効性を査定した。
（表５）AGM群の体重および性別の分布
AGMは、それぞれ5×108 pfuまたは2.5×108 pfuのsMVA組換体で1回（試験2）または2回（試験1）免疫された。各試験につき3匹のAGMが、対照として、モック生理食塩水免疫または空sMVAベクターを受けた。各試験につき6匹のAGMを、COH04S1で、プライム（試験2）またはプライムブースト（試験1）設定で免疫した（図38）。細胞性および体液性免疫の分析のため、血液および血清のサンプルを異なる時点で採取した。プライムの6週間後（試験2）またはブーストの6週間後（試験1）に、AGMを1×105 pfuのSARS-CoV-2に曝露した。最初の1週間は毎日、その後2週間は1日おきに、動物を観察し、体重測定し、検温した。各サンプリング日には、鼻内、口腔、および肛門のスワブを採取した。曝露後2日目、4日目、7日目、10日目、および21日目に、気管支肺胞洗浄液（BAL）を採取した。曝露後7日目、両試験のモック動物1匹、sMVA対照動物2匹、およびCOH04S1免疫動物3匹を屠殺し、ウイルス定量化および病理組織学のため臓器を採取した。曝露後21日目、両試験の残りの動物を屠殺し、ウイルス学および免疫学の研究用に臓器を採取した。
プライムの2週間後から（試験2）、およびブーストの2週間後から（試験1）、スパイク（S）およびヌクレオカプシド（N）抗原に対するT細胞応答を、新鮮分離PBMC中、IFNγ/IL-2/IL-4 ELISpotで査定した（図39～41）。プライムのみの動物は、プライムブースト動物よりも低いSおよびN特異的IFNγ T細胞レベルを有する傾向があった。しかし、曝露後のリコール応答は、プライムのみの動物のほうがプライムブースト動物よりも高かった。COH04S1免疫AGMは、SおよびNに対し、対照動物では存在しなかったロバストなIFNγ T細胞応答を生じ、それは曝露後7日目に増大して、曝露ウイルスに対する既往応答を示した（図39）。IFNγ応答の直後にIL-2応答が生じたが、もっと低レベルであった。病的炎症性応答の指標であるIL-4 T細胞応答は、全COH04S1免疫動物で非常に低いか、または存在しなかった（図40～41）。
BALサンプルを、ゲノムRNA（gRNA）定量化およびプラーク定量化（組織培養感染用量50、TCID50）により、SARS-CoV-2曝露ウイルスの存在について査定した。サブゲノムRNA（sgRNA）およびTCID50（これは、複製するウイルスのみを測定する）とは異なり、gRNAは、インプットされた曝露ウイルスおよび複製するウイルス両方の尺度であり、とくに曝露後の早い時点では、インプットされたウイルスが大いに混入し得る。曝露後2日目、プライムおよびプライムブーストCOH04S1動物の両方が、BALサンプル中、対照動物と比べて大幅に少ないgRNAコピーを示した（図42）。各試験のCOH04S1接種動物1匹が、BAL中に検出不能なウイルスを有した。曝露後4日目、接種動物のほうが対照よりもgRNAコピーが少ない傾向があったが、有意差はなかった。
曝露後2日目、4日目、および7日目に採取したBALサンプル中のウイルス量を、プラークアッセイにより定量化した（図43～44）。曝露後2日目、COH04S1で免疫した動物からのサンプル中のウイルス量が、対照と比較して大幅に少なかった。曝露後2日目、試験1の動物1匹および試験2の動物3匹が、BALサンプル中、検出不能なウイルスを有した。曝露後7日目には、試験1のAGM1匹を除き、全てのCOH04S1免疫動物が、アッセイの検出下限未満のウイルス量を有した。一方、両試験の全ての対照動物は、曝露後7日目になっても、肺内に測定可能なウイルスを有していた。これらの結果は、1回または2回の注射として投与したCOH04S1は、AGMの下気道をSARS-CoV-2ウイルス感染症から速やかに保護できることを示している。
実施例10: COVID-19予防のためのCOH04S1の第I相臨床試験
健康な成人の用量漸増臨床試験（NCT04639466）でCOH04S1を査定して、有害事象および最適用量を特定した。COH04S1ワクチンの安全性および忍容性を、1.0×107プラーク形成単位（PFU）/用量、1.0×108 PFU/用量、および2.5×108 PFU/用量の、異なる3つの用量レベル（DL）で査定した。各DLにつき、4～6人の非盲検センチネルが含まれた。
COH04S1第I相臨床試験は、3つの用量レベル（DL1～3）で、各DLにつき4～6人の非盲検センチネルを用いて実施し、続いて注射済みの35人の健康な被験者をプラセボに対し無作為化した。DL1は、マウスで使用したのと同じ低用量、1×107 PFU/用量に対応する。DL2は、1×108 PFU/用量に対応し、DL3は、2.5×108 PFU/用量に対応する。全ての用量は、大規模製造に適合する。プライムブースト免疫が、17人のセンチネル中16人に安全に投与され（DL2センチネル1人が、プライムワクチン接種のみを受けた後に試験から脱落した）、COH04S1は、DL1、DL2、およびDL3センチネルで安全であり、且つ良好に忍容された。試験した全センチネルが、S抗原およびN抗原に対し血清転換し、Th1 T細胞応答を生じた。試験した全センチネルが、中和抗体を生じた。
結合抗体
4人のDL1非盲検センチネルを、スパイク（S）、S受容体結合ドメイン（RBD）、およびヌクレオカプシド（N）に対するIgG結合抗体の発生について、120日目まで、ELISAで査定した（図45A）。全DL1センチネルの全時点で、S特異的結合抗体が測定可能であり、且つブースト後に増加する傾向があった。RBD特異的結合抗体は、プライム後、3/4人のDL1センチネル中に存在しなかった。ブースト後のレベルは、軽症～重症のCOVID-19疾患を有したSARS-CoV-2回復期の35人のプールで測定した中央値レベルに匹敵するか、またはそれよりもわずかに低かった。N特異的結合抗体レベルは、DL1センチネル間でばらつきがあった。ブースト後N特異的結合抗体は、ブースト後の全DL1センチネルで、回復期の人々で測定されたのと同じくらい高レベルで検出可能であった。
5人のDL2センチネルを、S、RBD、およびNに対するIgG結合抗体について、90日目まで査定した（図45B）。DL1センチネルと同じく、5人のDL2センチネル全員で、1回目のCOH04S1接種の直後にSに対する結合抗体が生じ、2回目の投与によりブーストされた。RBD結合抗体は、5人中4人のDL2センチネルでプライム免疫後に測定され、ブースト後は、回復期血清で測定された力価に匹敵する、より高い力価に達した。DL2センチネルはさまざまなレベルのN特異的結合抗体を生じ、5人中5人のセンチネルが56日目までに測定可能レベルのN特異的IgGを示した。
S、RBD、およびN特異的結合抗体を、6人のDL3センチネルで56日目まで査定した（図45C）。全てのDL3センチネルが、プライム後すぐにS特異的結合抗体を生じた。6人中2人のDL3センチネルで、S特異的IgG力価は2回目の投与によりブーストされなかった。残りの4人のDL3センチネルで、S-IgGは、28日目に投与されたブースト後に増加した。RBD特異的結合抗体は、プライム後に回復期血清で測定されたよりも高い力価に達した1人のDL3センチネルを含め、6人中4人のDL3センチネルで、ベースラインよりも高かった。ブースト後、全てのDL3センチネルが、回復期血清で測定された力価に匹敵する、またはそれに近い力価のRBD特異的結合抗体を有した。N特異的結合抗体はDL3センチネル間でさまざまであったが、DL1およびDL2センチネルと比較して、プライム後により高い力価に達する傾向があった。42日目には、6人中6人のDL3センチネルが測定可能なN特異的結合抗体を有していた。
プライム免疫後60日目および90日目、DL1/DL2/DL3センチネルにおけるS、RBD、およびNに対するIgG力価を、2回のEUAワクチン（Pfizer/BioNTech）を受けたシティー・オブ・ホープの従業員群で測定した力価と比較した。それに加えて、COH04S1ワクチンからの力価を、軽症～重症のCOVID-19疾患を有したSARS-CoV-2回復期の35人のプールで測定した力価と比較した（図46）。全体的に、2回のCOH04S1後に誘導されたS、RBD、およびN特異的抗体は、EUAワクチンレシピエントの同抗体、および/または軽症～重症のCOVID-19疾患から回復した人の回復期血漿中の同抗体に匹敵した。ブースター免疫は、特にRBD結合抗体で、力価を増大させた。
直近のSARS-CoV-2変異ウイルスに対処するために、DL1/DL2/DL3センチネルの血清サンプルを、P.1ブラジルSARS-CoV-2変異株スパイクとの結合について査定し、且つオリジナルのSARS-CoV-2武漢株に由来するスパイクとの結合と比較した（図47）。DL1センチネル血清サンプルは、武漢スパイクと比較してP.1スパイクとは有効に結合せず、力価はより低かった。一方、全ての時点で、DL2およびDL3センチネルは、P.1スパイクおよび武漢スパイクに対し類似した力価を有し、ほとんどのDL3センチネルが、56日目に、P.1スパイクに対し、武漢スパイクに匹敵する力価、またはそれより高い力価を有した。
中和抗体
先祖武漢スパイクのアミノ酸配列のD614G変異株に対する、ならびに流行している英国（UK、B.1.1.7）、南ア共和国（RSA、B.1.351）、およびブラジル（BRA、P.1）VOCに対する中和抗体を、インビトロマイクロ中和アッセイ、および各株のレンチウイルスをベースとするシュードウイルスを用いて測定した（図48）。全てのスパイク配列がD614G変異を含み、且つC末端の最後の19アミノ酸 (KFDEDDSEPVLKGVKLHYT、SEQ ID NO: 65) の短縮化を有した。
RBD特異的結合抗体の発生のタイミングと同じくして、3つの株に対する中和抗体は、プライム後、DL1センチネルでは低いかまたは測定不能であったが、例外として1人のDL1センチネルは、標準株、UK、およびブラジルVOCに対し、プライム後14日目ですぐに50～100のNT50を生じた。他の3人のDL1センチネルでは、ブースト後に力価の大幅な増大が観察され、NT50力価が最大150に達した。3つの株はすべて、さまざまな強度で中和され、力価は56日目まで安定していた。90日目および120日目に、全DL1センチネルが、少なくとも1つのウイルス株（先祖武漢株またはVOC）に対し測定可能な中和抗体を有していた。
標準株、ならびにUK、RSA、およびBRA VOCに対する中和抗体について試験した5人のDL2センチネルのうち4人が、プライム後早期に中和抗体を生じ、ピークNT50力価は最大300に達した。全体的に、ブースト後力価はDL1センチネルよりも上昇し、D614G（武漢）、UK、RSA、およびBRA VOCに対する56日目のNT50幾何平均力価（GMT）は、それぞれ212、169、64、および119という力価であった（図49）。
DL3センチネルは、6人のボランティアのうち2人において、早期の高力価の中和抗体を生じた。他の4人のDL3センチネルは、プライム後に低力価の中和抗体を有したが、それは2回目のワクチン後に増大した。全体的に、DL3センチネルでは、D614G（武漢）株、ならびにUK、RSA、およびBRA VOCに対する中和抗体の力価は、DL2センチネルで測定した力価に匹敵し、且つ同じシュードウイルスを用いてコホートのEUAワクチンレシピエントで測定した力価に匹敵した（図49）。
T細胞応答
T細胞応答を、IFNγ/IL-4 ELISpotで査定した。凍結保存したPBMCを、インビトロで一晩、全ワクチン抗原SおよびNをカバーするペプチドプールで、そしてさらにSARS-CoV-2ウイルス膜（M）抗原ペプチドプールで刺激した。スパイクペプチドを4つのサブプールに分け、各サブプールにつき71～86ペプチドとし、各プールに対するELISpot応答を加えていって、S抗原に対するトータルの応答を得た。N抗原をカバーする全ペプチドを1つのN抗原プールに含めた。モック刺激サンプル（DMSO）のELISpot応答を各サンプルから引いた（図50および51）。
図51および52に示すように、4人のDL1センチネル全員がプライム後にSおよびNに特異的なIFN-γ T細胞応答を生じた。T細胞は、2回目の免疫によりブーストされ、より高いSおよびN-IFNγ応答の傾向を有しながら120日目まで安定していた。IL-4分泌T細胞のレベルは、S刺激後もN刺激後も、非常に低いか、または不存在であった。M特異的応答は、全てのDL1ボランティアで不存在であった。DL2センチネルは、SおよびN両方に対し、DL1センチネルよりも高いIFN-γ T細胞応答を有した。ブースト後のIFN-γ T細胞応答は、一部の被験者ではプライム後よりも高く、他の被験者ではプライム後よりも低かった。Th2表現型のTヘルパー細胞を示唆する、SおよびNに対するIL-4応答は、全被験者で低かった。M特異的T細胞応答は、低いか、または不存在であった。DL3センチネルのIFN-γ T細胞応答は、該センチネルのほとんどで、プライム後にピークになり、ブースト後のレベルはプライム後よりも低くなった。
プライム免疫後56～60日目および90日目、COH04S1センチネルのIFN-γおよびIL-4 T細胞応答を、Pfizer/BioNTechワクチンレシピエントのプールで測定したレベルと比較した（図53）。56～60日目および90日目の両方で、COH04S1センチネルは、EUAワクチンレシピエントに匹敵するレベルのS特異的IFN-γおよびIL-4 T細胞を示した。COH04S1にはN抗原が組み込まれたが、mRNAワクチンには組み込まれていないため、N特異的IFN-γ T細胞応答は、EUAワクチンレシピエントよりも大幅に高かった。
これらの結果は、COH04S1での免疫が、SおよびNに対し強力なTh1 T細胞応答を、そして望ましい低いTh2応答を、成功裏に誘導したことを示している。本明細書に開示されるワクチン組成物により誘発されたT細胞応答は、他のEUAおよび治験ワクチンに匹敵していた。
実施例11: SARS-CoV-2変異株に基づくさらなるsMVAワクチンの構築
この合成ワクチンプラットフォームを用いて、南アフリカで最初に同定されたSARS-CoV-2変異株系統B.1.351に基づくS抗原およびN抗原の全長配列を共発現するsMVAベクターを作製した。これらのsMVA構築物は、2つの独立したウイルス再構成から得られ、本明細書ではC163およびC164と呼ばれる。C163およびC164 sMVAベクターは、上記で開示されるようにして、臨床製品COH04S1の基本となったC35 sMVAワクチンベクターと同様に構築されたが、違いは、C163およびC164では、Del3およびDel2部位に挿入された、武漢標準株をベースとするコドン最適化遺伝子配列が、B.1.351系統に特異的ないくつかの変異を有するS抗原およびN抗原をコードするようにさらに改変されたことである（具体的な配列については、図86および87、ならびに111および112を参照）。組換えsMVAベクターは、N501Y、E484K、K417N、L18F、D80A、D215G、Del242-244、R246I、D614G、およびA701I変異をS抗原に含み、T205I変異をN抗原に含んだ。ウエスタンブロット分析により、オリジナルのC35ワクチン構築物と比較してほぼ同等の発現レベルの、C163/C164バリアントベクターによるSタンパク質のS1およびS2ドメイン、ならびにNタンパク質の発現が確認された（図54）。
この合成ワクチンプラットフォームを用いて、ブラジルで最初に同定されたSARS-CoV-2変異株系統P.1に基づくS抗原およびN抗原の全長配列を共発現するsMVAベクターを作製した。このsMVA構築物は、本明細書ではC170と呼ばれる。C170 sMVAベクターは、上記で開示されるようにして、臨床製品COH04S1の基本となったC35 sMVAワクチンベクターと同様に構築されたが、違いは、C170では、Del3およびDel2部位に挿入された、武漢標準株をベースとするコドン最適化遺伝子配列が、P.1系統に特異的ないくつかの変異を有するS抗原およびN抗原をコードするようにさらに改変されたことである（具体的な配列については、図92および93、ならびに113および114を参照）。組換えsMVAベクターは、N501Y、E484K、K417T、L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027I、およびV1176F変異をS抗原に含み、P80R、R203K、およびG204R変異をN抗原に含んだ。ウエスタンブロット分析により、オリジナルのC35ワクチン構築物と比較してほぼ同等の発現レベルの、C170バリアントベクターによるSタンパク質のS1およびS2ドメイン、ならびにNタンパク質の発現が確認された（図55）。
参考文献
以下に挙げる参考文献、特許、および特許出願公報、ならびに上記明細書で引用した全ての参考文献は、それらが本明細書にすべて記載されているかのごとく、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (13)

  1. 再構成組換え合成MVA（rsMVA）ウイルスを含むワクチン組成物であって、該rsMVAが、
    （i）全長合成MVA（sMVA）ゲノム、
    （ii）該全長sMVAゲノムの第1の挿入部位に挿入される、SEQ ID NO: 10を含むアミノ酸配列を有するSARS-CoV-2 ヌクレオカプシド（N）タンパク質をコードする、第1のDNA配列、
    および
    （iii）該全長sMVAゲノムの第2の挿入部位に挿入される、SEQ ID NO: 6を含むアミノ酸配列を有するSARS-CoV-2 スパイク（S）タンパク質をコードする、第2のDNA配列
    を含み、
    該rsMVAが、3つのDNA断片であるF1、F2、およびF3の相同組換えにより再構成され、
    F1が、該全長sMVAゲノムの第1の部分配列およびSARS-CoV-2 Nタンパク質をコードする該第1のDNA配列を含み、
    F2が、該全長sMVAゲノムの第2の部分配列を含み、かつ
    F3が、該全長sMVAゲノムの第3の部分配列およびSARS-CoV-2 Sタンパク質をコードする該第2のDNA配列を含み、かつ
    MVAコンカテマー分割（concatemeric resolution）（CR）配列に隣接するMVA末端ヘアピンループ（HL）配列（CR/HL/CR）が、F1、F2、およびF3のそれぞれの両末端に付加されている、
    ワクチン組成物。
  2. 前記全長sMVAゲノムが、MVA株Antoine（NCBIアクセッション番号U94848）と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
  3. 前記SARS-CoV-2 Nタンパク質をコードする前記第1のDNA配列または前記SARS-CoV-2 Sタンパク質をコードする前記第2のDNA配列が、同じヌクレオチドが4つ以上連続するのを回避するサイレントコドン変更によりコドン最適化されている、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
  4. 前記第1のDNA配列がSEQ ID NO: 9である、請求項１～３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  5. 前記第2のDNA配列がSEQ ID NO: 5である、請求項１～４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  6. 前記第1の挿入部位がDel2である、請求項１～５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  7. 前記第2の挿入部位がDel3である、請求項１～６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  8. 前記CR/HL/CR配列がSEQ ID NO: 66を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
  9. 前記第1の部分配列がMVA株Antoineの塩基対191～59743を含み、前記第2の部分配列がMVA株Antoineの塩基対56744～119298を含み、かつ前記第3の部分配列がMVA株Antoineの塩基対116299～177898を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  10. 薬学的に許容される担体、アジュバント、添加物、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  11. 対象において、免疫応答を誘発する、またはコロナウイルス感染症を予防するための、請求項１～１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物であって、予防的または治療的有効量の該ワクチン組成物が該対象に投与されることを特徴とする、ワクチン組成物。
  12. 前記対象が、コロナウイルスに感染する危険性がある、請求項１１に記載のワクチン組成物。
  13. 予防的または治療的有効量が、1×107PFU～10×108PFU/用量である、請求項１１または１２に記載のワクチン組成物。
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