JPH01160483A - プラスミドとその製造方法 - Google Patents
プラスミドとその製造方法Info
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- JPH01160483A JPH01160483A JP62317320A JP31732087A JPH01160483A JP H01160483 A JPH01160483 A JP H01160483A JP 62317320 A JP62317320 A JP 62317320A JP 31732087 A JP31732087 A JP 31732087A JP H01160483 A JPH01160483 A JP H01160483A
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- isolated
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、サツカロミコプシス・リボリティカの自己複
製配列を含むプラスミドとその製造方法に関するもので
ある。
製配列を含むプラスミドとその製造方法に関するもので
ある。
本発明では、サッカロミコプシス・リポリティカの菌体
内で複製されるプラスミドをはじめて製作することがで
きたものである。
内で複製されるプラスミドをはじめて製作することがで
きたものである。
本発明のサツカロミコプシス・リボリティカの自己複製
配列を含むプラスミドは、その応用が発酵業界に大いに
期待されるところである。
配列を含むプラスミドは、その応用が発酵業界に大いに
期待されるところである。
（従来技術）
一般的に、酵母はプラスミドを含むものが少く、サッカ
ロミコプシス・リポリティカもプラスミドは全く含まな
いものとして知られている。
ロミコプシス・リポリティカもプラスミドは全く含まな
いものとして知られている。
また、はとんどの酵母は、菌体内で生産した酵素やペプ
タイド等を分泌しないが、例外的にサッカロミコプシス
・リポリティカは酵素やペプタイド等を分泌する能力を
有しているのである。
タイド等を分泌しないが、例外的にサッカロミコプシス
・リポリティカは酵素やペプタイド等を分泌する能力を
有しているのである。
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら、サッカロミコプシス・リポリティカの菌
体内で複製できるプラスミドは知られておらず、酵素、
ペプタイド等の生産を試みることはできなかった。
体内で複製できるプラスミドは知られておらず、酵素、
ペプタイド等の生産を試みることはできなかった。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、サツカロミコプシス・リボリティカの菌
体内で複製できるプラスミドを求めて鋭意研究した結果
、サッカロミコプシス・リポリティカの染色体上の自己
複製配列を組込み、菌体内で複製するプラスミドを得る
のに成功したのである。
体内で複製できるプラスミドを求めて鋭意研究した結果
、サッカロミコプシス・リポリティカの染色体上の自己
複製配列を組込み、菌体内で複製するプラスミドを得る
のに成功したのである。
本発明は、サツカロミコプシス・リボリティカの自己複
製配列を含むプラスミドに関するものである。
製配列を含むプラスミドに関するものである。
更に詳細には、本発明はサッカロミコプシス・リポリテ
ィカのＬｅｕ ２遺伝子及び自己複製配列とアンピシリ
ン耐性遺伝子を含むプラスミドに関するものである。
ィカのＬｅｕ ２遺伝子及び自己複製配列とアンピシリ
ン耐性遺伝子を含むプラスミドに関するものである。
本発明のプラスミドはサツカロミコプシス・リポリテイ
カ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ １ｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ）からのＬｅｕ ２遺伝子（β−イソプロピル
マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子）及び自己複製配列（
Ａｕｔｏｎｏａ＋ｏｕｓｌｙ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ
５ｅｑｕｅｎｃｅ）（以下、ＡＲ５という）を含み、
かつ、大腸菌とサツカロミセス・セレビシェの′シャト
ルベクターｐｖｃ １から出発して作製されたので大腸
菌とサツカロミコプシス・リボリティカ間のシャトルベ
クターともなり得るものである。
カ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ １ｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ）からのＬｅｕ ２遺伝子（β−イソプロピル
マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子）及び自己複製配列（
Ａｕｔｏｎｏａ＋ｏｕｓｌｙ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ
５ｅｑｕｅｎｃｅ）（以下、ＡＲ５という）を含み、
かつ、大腸菌とサツカロミセス・セレビシェの′シャト
ルベクターｐｖｃ １から出発して作製されたので大腸
菌とサツカロミコプシス・リボリティカ間のシャトルベ
クターともなり得るものである。
本発明のプラスミド、即ちシャトルベクターに外来有用
遺伝子を挿入し、大腸菌を形質転換させて大量のプラス
ミドを得、これを用いてサッカロミコプシス・リポリテ
ィカを宿主菌として有用物質を生産することが可能とな
る。
遺伝子を挿入し、大腸菌を形質転換させて大量のプラス
ミドを得、これを用いてサッカロミコプシス・リポリテ
ィカを宿主菌として有用物質を生産することが可能とな
る。
本発明の新規なプラスミドは、例えば以下の通りに作製
される。
される。
サッカロマイセス・セレビジェのベクターｐＶＣ１を制
限酵素Ｂａａ ＨＩにて切断する。その切断部位にサツ
カロミコプシス・リポリテイカの全ＤＮＡを制限酵素Ｓ
ａｕ ３ＡＩで部分切断した断片を挿入し、大腸菌を形
質転換させ、アンピシリン（Ａｐ）耐性。
限酵素Ｂａａ ＨＩにて切断する。その切断部位にサツ
カロミコプシス・リポリテイカの全ＤＮＡを制限酵素Ｓ
ａｕ ３ＡＩで部分切断した断片を挿入し、大腸菌を形
質転換させ、アンピシリン（Ａｐ）耐性。
β−ガラクトシダーゼ非産生となったものを選択し、こ
れより各々プラスミドＤＮＡを分離し、ジーンライブラ
リーとする。
れより各々プラスミドＤＮＡを分離し、ジーンライブラ
リーとする。
次に該ジーンライブラリーでロイシン要求性のサッカロ
マイセス・セレビジェＤＫＤ−５Ｄ株を宿主としてヒン
ネン等のプロトプラスト法（）ｌｉｎｎｅｎ、 Ａ、。
マイセス・セレビジェＤＫＤ−５Ｄ株を宿主としてヒン
ネン等のプロトプラスト法（）ｌｉｎｎｅｎ、 Ａ、。
Ｈｉｃｋｓ、 Ｊ、Ｂ、、 Ｆｉｎｋ、 Ｇ、Ｒ，、Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ７５．、１９２９（１９７８））を用いて形
質転換させ、ロイシンを含まない最少培地（下記の組成
）上で増殖させた。
質転換させ、ロイシンを含まない最少培地（下記の組成
）上で増殖させた。
グルコース ２ ％ソルビト
ール １．２Ｍトリプトファン
０．０１％ヒスチジン
０．００３５％寒天
２．０％得られた形質転換体よりプラスミ
ドＤＮＡを分離し、大腸菌を形質転換させて、Ａｐ耐性
となったコロニーを選択し、これより新規なプラスミド
ＰＶＣＬ２を分離する。
ール １．２Ｍトリプトファン
０．０１％ヒスチジン
０．００３５％寒天
２．０％得られた形質転換体よりプラスミ
ドＤＮＡを分離し、大腸菌を形質転換させて、Ａｐ耐性
となったコロニーを選択し、これより新規なプラスミド
ＰＶＣＬ２を分離する。
このプラスミドｐｖｃｔ、 ２から、さらにこれより小
さくて、なおかつｐｖｃｔ、 ２と同様の性質、機能を
有するプラスミド（ｐＵＣＬ−１，ｐＵｃＬ−２，ｐＳ
Ｌ−１２，ｐＳＬ−１３）を作製する。
さくて、なおかつｐｖｃｔ、 ２と同様の性質、機能を
有するプラスミド（ｐＵＣＬ−１，ｐＵｃＬ−２，ｐＳ
Ｌ−１２，ｐＳＬ−１３）を作製する。
次に、ｐＳＬ−１３を制限酵素Ｂａｍ ＨＩで切断する
。その切断部位にサツカロミコプシス・リボリティカの
全ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩで部分切断した断片
を挿入し、大腸菌を形質転換させ、ＡＰ耐性、β−ガラ
クトシダーゼ非産生となったものを選択し、これより各
々プラスミドＤＮＡを分離し、ジーンライブラリーとす
る。
。その切断部位にサツカロミコプシス・リボリティカの
全ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩで部分切断した断片
を挿入し、大腸菌を形質転換させ、ＡＰ耐性、β−ガラ
クトシダーゼ非産生となったものを選択し、これより各
々プラスミドＤＮＡを分離し、ジーンライブラリーとす
る。
該ジーンライブラリーでロイシン要求性のサツカロミコ
プシス・リボリティカＭＸ ９−１１１ｅｕ Ｆ株を宿
主としてダビドウ等の方法（Ｄａｖｉｄｏｖ、 Ｌ、Ｓ
、。
プシス・リボリティカＭＸ ９−１１１ｅｕ Ｆ株を宿
主としてダビドウ等の方法（Ｄａｖｉｄｏｖ、 Ｌ、Ｓ
、。
Ａｐｏｓｔｏｌａｋｏｓ、 Ｄ、、 Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌ
ｌ、 Ｍ、Ｍ、、 Ｐｒｏｃｔｏｒ。
ｌ、 Ｍ、Ｍ、、 Ｐｒｏｃｔｏｒ。
Ａ、Ｒ，、Ｏｇｒｙｄｚｉａｋ、 Ｄ、Ｍ、、 Ｗｉｎ
ｇ、 Ｒ，Ａ、、 ５ｔａｓｋｏ。
ｇ、 Ｒ，Ａ、、 ５ｔａｓｋｏ。
１、、 ａｎｄ ＤｅＺｅｅｕｗ、 Ｊ、Ｒ，、Ｃｕｒ
ｒ、 Ｇｅｎｅｔ、、 １０，３９（１９８５））を用
いて形質転換させ、ロイシンを含まない最少培地（下記
の組成）上で増殖させる。
ｒ、 Ｇｅｎｅｔ、、 １０，３９（１９８５））を用
いて形質転換させ、ロイシンを含まない最少培地（下記
の組成）上で増殖させる。
酵母用アミノ酸不含窒素源 ０．６７％グルコ
ース ２ ％寒天
２ ％得られた形質転換体よりプ
ラスミドＤＮＡを分離し、大腸菌を形質転換させて、Ａ
ｐ耐性となったコロニーを選択し、これより新規なプラ
スミドｐＳＬ１３−２を分離する。
ース ２ ％寒天
２ ％得られた形質転換体よりプ
ラスミドＤＮＡを分離し、大腸菌を形質転換させて、Ａ
ｐ耐性となったコロニーを選択し、これより新規なプラ
スミドｐＳＬ１３−２を分離する。
プラスミドｐｓＬ１３−２を含む大腸菌はＰＳＬ１３−
２ 。
２ 。
ＦＥＲＭ Ｐ−９６９５として微工研に寄託されている
。
。
得られたプラスミドｐｓＬ１３−２でサッカロミコプシ
ス・リポリティカを形質転換し、プラスミドが多数複製
されるのが確認される。
ス・リポリティカを形質転換し、プラスミドが多数複製
されるのが確認される。
次に本発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例１
（１） プラスミドＶＣＬ ２のＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｏｐｓｉｓ １ｉｐｏｌｙｔｉｃａ野生株（＾
ＴＣＣ４４６０１）をＹＥＰＤ培地（組成：酵母エキス
１％、ペプトン２％、グルコース２％）にて３０℃、４
８時間培養後、これより全ＤＮＡを抽出し、制ｐｉ酵素
Ｓａｕ ３ＡＩで部分切断した。
ｏｍｙｃｏｐｓｉｓ １ｉｐｏｌｙｔｉｃａ野生株（＾
ＴＣＣ４４６０１）をＹＥＰＤ培地（組成：酵母エキス
１％、ペプトン２％、グルコース２％）にて３０℃、４
８時間培養後、これより全ＤＮＡを抽出し、制ｐｉ酵素
Ｓａｕ ３ＡＩで部分切断した。
一方、大腸菌と５ａｃｃｈａｒｏ＋ｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅとのシャトルベクターｐＶＣ１（ｐＵｃ
９トＹＲｐ １０）ソレソれ制限酵素Ｈａｓ ＩＩと
Ｐｖｕ Ｉで切断した断片を連結して作製した。Ｓ、ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴｒｐ １を含む）を制限酵素Ｂ
ａａ ）ＩＩで切断した。次に双方のＤＮＡを７４’Ｄ
ＮＡ連結酵素を用いて連結反応させた後、大腸 菌ＪＭ
８３株を形質転換させ、ＡＰ（５０μｇ／＋Ｑ）を含ん
だＸ−Ｇａ１寒天培地（上層培地（２０ｍＱ） ： ト
リプトン１％、ＮａＣ１Ｏ，８％、塩酸チアミン１０ｍ
ｇ／ Ｑ 、寒天２％、下層培地（３ｍＭ） ： トリ
プトン１％、ＮａＣ１０，８％、塩酸チアミン１０ｍｇ
／Ｑ、１１００ｆｆ１ ＩＰＴＧ （ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ） １０ ｐ Ｑ、 ２０ｍｇ／ｍＱＸ −ｇａｌ
（５−ｂｒｏｍｏ −４−ｃｈｌｏｒｏ −３−１ｎ
ｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ）５０ ｐ Ｑ、寒天０．６％）で１２時間培養し
た。
ｅｖｉｓｉａｅとのシャトルベクターｐＶＣ１（ｐＵｃ
９トＹＲｐ １０）ソレソれ制限酵素Ｈａｓ ＩＩと
Ｐｖｕ Ｉで切断した断片を連結して作製した。Ｓ、ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴｒｐ １を含む）を制限酵素Ｂ
ａａ ）ＩＩで切断した。次に双方のＤＮＡを７４’Ｄ
ＮＡ連結酵素を用いて連結反応させた後、大腸 菌ＪＭ
８３株を形質転換させ、ＡＰ（５０μｇ／＋Ｑ）を含ん
だＸ−Ｇａ１寒天培地（上層培地（２０ｍＱ） ： ト
リプトン１％、ＮａＣ１Ｏ，８％、塩酸チアミン１０ｍ
ｇ／ Ｑ 、寒天２％、下層培地（３ｍＭ） ： トリ
プトン１％、ＮａＣ１０，８％、塩酸チアミン１０ｍｇ
／Ｑ、１１００ｆｆ１ ＩＰＴＧ （ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ） １０ ｐ Ｑ、 ２０ｍｇ／ｍＱＸ −ｇａｌ
（５−ｂｒｏｍｏ −４−ｃｈｌｏｒｏ −３−１ｎ
ｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ）５０ ｐ Ｑ、寒天０．６％）で１２時間培養し
た。
生じたＡＰ耐性コロニーのうち白色コロニーを１４６０
０個得た。これらのコロニーからプラスミドを分離し、
Ｓ、 １ｉｐｏｌｙｔｉｃａのジーンライブラリーとし
た。
０個得た。これらのコロニーからプラスミドを分離し、
Ｓ、 １ｉｐｏｌｙｔｉｃａのジーンライブラリーとし
た。
次に、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＤＫＤ−５Ｄ株（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−７５２６）（ＭＡＴａ、 ｔｒｐｌ、１ｅｕ
２．ｈｘｓ３） を宿主としてヒンネン（）ｌｉｎｎｅ
ｎ）らのプロトプラスト形質転換法を用いて、上記ジー
ンライブラリーで形質転換させ、ロイシン欠失寒天培地
にて再生を行った。３０℃で５〜７日間培養後、生育し
てくるコロニーを分離し、ロイシン欠失液体培地で培養
後、ＤＮＡを菌体から分離し、再度大腸菌ＪＡ ２２１
株を形質転換させ、ＡＰ耐性となったコロニーを分離し
た。この菌体より調製したプラスミドＤＮＡ を分離し
、これをｐｖｃｔ、 ２と称した。
ＲＭ Ｐ−７５２６）（ＭＡＴａ、 ｔｒｐｌ、１ｅｕ
２．ｈｘｓ３） を宿主としてヒンネン（）ｌｉｎｎｅ
ｎ）らのプロトプラスト形質転換法を用いて、上記ジー
ンライブラリーで形質転換させ、ロイシン欠失寒天培地
にて再生を行った。３０℃で５〜７日間培養後、生育し
てくるコロニーを分離し、ロイシン欠失液体培地で培養
後、ＤＮＡを菌体から分離し、再度大腸菌ＪＡ ２２１
株を形質転換させ、ＡＰ耐性となったコロニーを分離し
た。この菌体より調製したプラスミドＤＮＡ を分離し
、これをｐｖｃｔ、 ２と称した。
（２）プラスミドｐｖｃｔ、 ２の制限酵素地図の作制
限酵素Ｂｇｌｌｌ、ＥｃｏＲＩ 、 Ｋｐｎ Ｉ 、
Ｓａｌ Ｉ を用いてプラスミドｐＶＣＬ ２を切断
して、その断片の大きさから、それぞれの切断部位の相
対位置を決定した。それを第１図Ａに示す、このうち１
はＳ、 １ｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来ＤＮＡ断片（３，４
ｋｂ）を示す。
限酵素Ｂｇｌｌｌ、ＥｃｏＲＩ 、 Ｋｐｎ Ｉ 、
Ｓａｌ Ｉ を用いてプラスミドｐＶＣＬ ２を切断
して、その断片の大きさから、それぞれの切断部位の相
対位置を決定した。それを第１図Ａに示す、このうち１
はＳ、 １ｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来ＤＮＡ断片（３，４
ｋｂ）を示す。
プラスミドｐｖｃｔ、 ２でＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
を伊藤らのリチウム金属性（Ｈ，Ｉｔｏ、Ｙ、Ｆｕｋｕ
ｄａ、 Ｋ、Ｍｕｒａｔａ ａｎｄ Ａ。
を伊藤らのリチウム金属性（Ｈ，Ｉｔｏ、Ｙ、Ｆｕｋｕ
ｄａ、 Ｋ、Ｍｕｒａｔａ ａｎｄ Ａ。
にｉｍｕｒａ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １５３，
１６５（１９ｇ３））を用いて形質転換したところＤＮ
Ａ １μｇ当り１５００個の形質転換体が得られた。
１６５（１９ｇ３））を用いて形質転換したところＤＮ
Ａ １μｇ当り１５００個の形質転換体が得られた。
プラスミドｐｖｃＬ２を制限酵素にｐｎＩ で切断後
、Ｓ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＸ９−１１１ｅｕ Ｆ
株（ｌｅｕ ２変異株）をＤａｖｉｄｏｗらの方法（Ｌ
ａｎｃｅ Ｓ、 Ｄａｖｉｄｏｗ％ＤｉａｎｅＡｐｏｓ
ｔｏｌａｋｏｓ、 Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｍ、 Ｏ’Ｄｏｎ
ｎｅ１１． Ａｌａｎ Ｒ。
、Ｓ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＸ９−１１１ｅｕ Ｆ
株（ｌｅｕ ２変異株）をＤａｖｉｄｏｗらの方法（Ｌ
ａｎｃｅ Ｓ、 Ｄａｖｉｄｏｗ％ＤｉａｎｅＡｐｏｓ
ｔｏｌａｋｏｓ、 Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｍ、 Ｏ’Ｄｏｎ
ｎｅ１１． Ａｌａｎ Ｒ。
Ｐｒｏｃｔｏｒ％Ｄａｖｉｄ Ｍ、 Ｏｇｒｙｄｚｉａ
ｋ、 Ｒｏｄ Ａ、 Ｗｉｎｇ、Ｉｒｅｎｅ ５ｔａ
ｓｋｏ、ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｒ，Ｄｅｚａｅｕｗ、
Ｃｕｒｒ。
ｋ、 Ｒｏｄ Ａ、 Ｗｉｎｇ、Ｉｒｅｎｅ ５ｔａ
ｓｋｏ、ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｒ，Ｄｅｚａｅｕｗ、
Ｃｕｒｒ。
Ｇｏｎｅｔ、、 １０．３９（１９８５））に従って形
質転換したところ、ＤＮＡＩμｇ当り５９１５個の形質
転換体が得られた。
質転換したところ、ＤＮＡＩμｇ当り５９１５個の形質
転換体が得られた。
（４） ＵＣＬ−Ｉ ＵＣＬ−２ＰＳＬ−１２５Ｌ
−１３のプラスミドｐｖｃｔ、 ２から、さらにこれよ
り小さくて、なおかつｐＶＣＬ ２と同様の性質１機能
を有するプラスミド（ｐＵｃＬ−１，ｐＵｃＬ−２，ｐ
ＳＬ−１２，ｐＳＬ−１３）を作製することができる。
−１３のプラスミドｐｖｃｔ、 ２から、さらにこれよ
り小さくて、なおかつｐＶＣＬ ２と同様の性質１機能
を有するプラスミド（ｐＵｃＬ−１，ｐＵｃＬ−２，ｐ
ＳＬ−１２，ｐＳＬ−１３）を作製することができる。
すなわち、プラスミドｐｖｃｔ、 ２を制限酵素５ａｌ
ｌにて切断し、２．８ｋｂの両分を分離し、これをベク
ターｐｕｃ １９を制限酵素Ｓａｌ■にて切断した部位
に挿入し、 ｐＵｃＬ−１，ｐＵｃＬ−２を作製した（
ρＵ（、Ｌ−１とｐＵｃＬ−２は２．８ｋｂ ＤＮＡ断
片の挿入方向が逆）。
ｌにて切断し、２．８ｋｂの両分を分離し、これをベク
ターｐｕｃ １９を制限酵素Ｓａｌ■にて切断した部位
に挿入し、 ｐＵｃＬ−１，ｐＵｃＬ−２を作製した（
ρＵ（、Ｌ−１とｐＵｃＬ−２は２．８ｋｂ ＤＮＡ断
片の挿入方向が逆）。
ｐＶＣＬ ２トｐＵＣ１９からｐＵＣＬ−１及びｐＵｃ
Ｌ−２（７）作製図は第１図に示される。
Ｌ−２（７）作製図は第１図に示される。
第１図において制限酵素の略記号の意味は次の通りであ
る。
る。
Ｅ ：ＥｐｏＲＩ 、 Ｓ ：５ａｌｌ 、 Ｂｇ：８
ａｌＩ更に、ｐＵＣＬ−２を制限酵素Ｂａｇ ＨＩとＢ
ｇｌ■で切断し、２．７ｋｂの画分を分離し、これをベ
クターｐＵｃ１９８ｇ（ｐＵｃ１９のＥｃｏ ０１０９
切断部位をＢｇｌ ＩＩ 切断部位に変換したもの）
を制限酵素Ｂｇｌ ＩＩにて切断した部位に挿入し、
ｐＳＬ−１２，ｐＳＬ−１３を作製した（ｐＳＬ−１２
とｐＳＬ−１３は２．７ｋｂ ＤＮＡ断片の挿入方向が
逆）。
ａｌＩ更に、ｐＵＣＬ−２を制限酵素Ｂａｇ ＨＩとＢ
ｇｌ■で切断し、２．７ｋｂの画分を分離し、これをベ
クターｐＵｃ１９８ｇ（ｐＵｃ１９のＥｃｏ ０１０９
切断部位をＢｇｌ ＩＩ 切断部位に変換したもの）
を制限酵素Ｂｇｌ ＩＩにて切断した部位に挿入し、
ｐＳＬ−１２，ｐＳＬ−１３を作製した（ｐＳＬ−１２
とｐＳＬ−１３は２．７ｋｂ ＤＮＡ断片の挿入方向が
逆）。
ｐＵＣ１９８ｇとｐＵＣＬ−２からｐｓＬ−１２及びρ
５Ｌ−１３の作製図は第２図に示される。
５Ｌ−１３の作製図は第２図に示される。
第２図において制限酵素の略記号の意味は次の通りであ
る。
る。
Ｂ ： Ｂａｎ Ｈｌ、 Ｂｇ ： Ｂｇｌ ＩＩ、Ｓ
：５ａｌＩ、Ｅ ： ＥｃｏＲ■。
：５ａｌＩ、Ｅ ： ＥｃｏＲ■。
プラスミドｐＵｃＬ−１及びｐＳＬ−１３により、Ｓ、
１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＸ９−１１１ｅｕ Ｆ（ｌｅ
ｕ ２変異株）をＤａｖｉｄｏｗらの方法に従って形質
転換したところ表１のような結果を得た。
１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＸ９−１１１ｅｕ Ｆ（ｌｅ
ｕ ２変異株）をＤａｖｉｄｏｗらの方法に従って形質
転換したところ表１のような結果を得た。
表Ｉ Ｓ、１ｉｐｏｌｙｌｉｃａ ＭＸ９−１１の形
質転換＄１μｇＤＮＡ当りの形質転換体数を表す。
質転換＄１μｇＤＮＡ当りの形質転換体数を表す。
（６）逝ＪじＬ之ノｊ−１格り１づ４日１艮Ｓ、１ｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ野生株（ＡＴＣＣ４４６０１）をＹＥＰ
Ｄ培地にて３０℃、４８時間培養後、これより全ＤＮＡ
を抽出し、制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩで部分切断した。一
方、プラスミドｐｓｔ、−１３を制限酵素ＢａＩＩＩＨ
Ｉで切断した。次に双方のＤＮＡをＴ４ ＤＮＡ連結酵
素を用いて連結反応させた後、大腸菌ＪＭ １０９を形
質転換させ、Ａｐ（５０μｇ／＋ｎＱ）を含んだＸ−Ｇ
ａ１寒天培地で１２時間培養した。
ｏｌｙｔｉｃａ野生株（ＡＴＣＣ４４６０１）をＹＥＰ
Ｄ培地にて３０℃、４８時間培養後、これより全ＤＮＡ
を抽出し、制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩで部分切断した。一
方、プラスミドｐｓｔ、−１３を制限酵素ＢａＩＩＩＨ
Ｉで切断した。次に双方のＤＮＡをＴ４ ＤＮＡ連結酵
素を用いて連結反応させた後、大腸菌ＪＭ １０９を形
質転換させ、Ａｐ（５０μｇ／＋ｎＱ）を含んだＸ−Ｇ
ａ１寒天培地で１２時間培養した。
生じたＡｐ耐性コロニーのうち白色コロニーを２５００
個得た０これらのコロニーからプラスミドを分離し、Ｓ
、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａのジーンライブラリーとした。
個得た０これらのコロニーからプラスミドを分離し、Ｓ
、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａのジーンライブラリーとした。
次に、Ｓ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＸ９−１１１ｅｕ
Ｆ株（′Ｌｅｕ ２変異株）を宿主としてＤａｖｉｄ
ｏｗらの方法を用いて、上記ジーンライブラリーで形質
転換させ、ロイシン欠失寒天培地にて再生を行った。３
０℃で４〜５日間培養後、生育してくるコロニーを分離
し、ロイシン欠失液体培地で培養後、ＤＮＡを菌体から
分離し、再度大腸菌ＪＭ １０９を形質転換させ、Ａｐ
耐性となったコロニーを分離した。この菌体より調装し
たプラスミドＤＮＡを分離し、これをｐｓＬ１３−２と
称した。
Ｆ株（′Ｌｅｕ ２変異株）を宿主としてＤａｖｉｄ
ｏｗらの方法を用いて、上記ジーンライブラリーで形質
転換させ、ロイシン欠失寒天培地にて再生を行った。３
０℃で４〜５日間培養後、生育してくるコロニーを分離
し、ロイシン欠失液体培地で培養後、ＤＮＡを菌体から
分離し、再度大腸菌ＪＭ １０９を形質転換させ、Ａｐ
耐性となったコロニーを分離した。この菌体より調装し
たプラスミドＤＮＡを分離し、これをｐｓＬ１３−２と
称した。
ｐｓＬ１３−２を含む大腸菌ＪＭ １０９はｐｓＬ１３
−２ ＦＥＲＭＰ−９６９５として微工研に寄託されて
いる。
−２ ＦＥＲＭＰ−９６９５として微工研に寄託されて
いる。
（７）プラスミドｐｓＬ１３−２のＳ、１ｉｐｏｌｙｔ
ｉｃａにおける欠里 プラスミドｐｓＬ１３−２を無切断で、Ｄａｖｉｄｏｗ
らの方法に従って、Ｓ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＸ９
−１１１ｅｕ Ｆを形質転換したところ、ＤＮＡ １μ
区当り５７７個の形質転換体が得られた。プラスミドｐ
ｓＬ１３を用い同様の条件で形質転換を行なったところ
、ＤＮＡ ｌμｇ当り０．６個の形質転換体しか得られ
なかったので、ｐＳＬ１３−２はＳ、１ｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａ中で機能するＡＲ５を含んでいるものと認められた
。
ｉｃａにおける欠里 プラスミドｐｓＬ１３−２を無切断で、Ｄａｖｉｄｏｗ
らの方法に従って、Ｓ、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＸ９
−１１１ｅｕ Ｆを形質転換したところ、ＤＮＡ １μ
区当り５７７個の形質転換体が得られた。プラスミドｐ
ｓＬ１３を用い同様の条件で形質転換を行なったところ
、ＤＮＡ ｌμｇ当り０．６個の形質転換体しか得られ
なかったので、ｐＳＬ１３−２はＳ、１ｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａ中で機能するＡＲ５を含んでいるものと認められた
。
（８）プラスミドｐｓＬ１３−２の制限酵素地図の作制
限酵素Ｂａｍ Ｈｌ、 ＥｃｏＲＩ 、Ｋｐｎ Ｉ 、
ＨｉｎｄＩ［［、Ｓｍａ Ｉ 、 Ｘｈｏ Ｉを用いて
プラスミドｐｓＬ１３−２を切断して、その断片の大き
さから、それぞれの切断部位の相対位置を決定した。そ
れを第３図に示す。
限酵素Ｂａｍ Ｈｌ、 ＥｃｏＲＩ 、Ｋｐｎ Ｉ 、
ＨｉｎｄＩ［［、Ｓｍａ Ｉ 、 Ｘｈｏ Ｉを用いて
プラスミドｐｓＬ１３−２を切断して、その断片の大き
さから、それぞれの切断部位の相対位置を決定した。そ
れを第３図に示す。
第３図において制限酵素の略記号の意味は次の通りであ
る。
る。
Ｂ ： Ｂａｍ ＩＩＩ、Ｂｇ ： Ｂｇｌ■、Ｅ ：
ＥｃｏＲＩ、に：Ｋｐｎ■、Ｈ： １（ｉｎｄｌｌｌ、
Ｓ ：５ａｌｒ 、 Ｓｍ：Ｓｍａｌ 、Ｘｈ：Ｘｈｏ
１
ＥｃｏＲＩ、に：Ｋｐｎ■、Ｈ： １（ｉｎｄｌｌｌ、
Ｓ ：５ａｌｒ 、 Ｓｍ：Ｓｍａｌ 、Ｘｈ：Ｘｈｏ
１
第１図はｐｖｃＬ２とｐＵＣ１９から〕ｐＵＣＬ−１及
びｐｕｃＬ−２の作製図で、第２図はｐＵＣ１９Ｂｇと
ＰＬＩＣＬ−２からのｐＳＬ−１２及びｐＳＬ−１３の
作製図で、第３図はｐｓＬ１３−２の制限酵素地図を示
すものである。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 １ 図 第２図
びｐｕｃＬ−２の作製図で、第２図はｐＵＣ１９Ｂｇと
ＰＬＩＣＬ−２からのｐＳＬ−１２及びｐＳＬ−１３の
作製図で、第３図はｐｓＬ１３−２の制限酵素地図を示
すものである。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 １ 図 第２図
Claims (2)
- （１）サッカロミコプシス・リポリティカの自己複製配
列を含むプラスミド。 - （２）下記の（ａ）〜（ｈ）の工程からなるサッカロミ
コプシス・リポリティカの自己複製配列を含むプラスミ
ドの製法。 （ａ）サッカロマイセス・セレビジェのベクターＰＶＣ
１を用いてサッカロミコプシス・リポリティカのジーン
ライブラリーを作製し、 （ｂ）次いで、該ジーンライブラリーでロイシン要求性
サッカロマイセス・セレビジェを宿主として形質転換し
、 （ｃ）得られた形質転換体からプラスミドを分離して大
腸菌を形質転換し、アンピシリン耐性のプラスミドを分
離し、 （ｄ）該アンピシリン耐性プラスミドを制限酵素により
切断し、サッカロミコプシス・リポリティカのＬｅｕ２
遺伝子領域を単離し、 （ｅ）大腸菌ベクターを制限酵素で切断し、（ｄ）で単
離した領域と連結させ、 （ｆ）（ｅ）で連結されたプラスミドを用いてサッカロ
ミコプシス・リポリティカのジーンライブラリーを再度
作製し、 （ｇ）次いで、該ジーンライブラリーでロイシン要求性
サッカロミコプシス・リポリティカを宿主として形質転
換し、 （ｈ）得られた形質転換体からプラスミドを分離して大
腸菌を形質転換し、アンピシリン耐性のプラスミドを分
離する。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62317320A JPH082304B2 (ja) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | プラスミドとその製造方法 |
| US07/285,032 US5118625A (en) | 1987-12-17 | 1988-12-16 | Autonomously replicating plasmid and saccharomycopsis lipolytica transformed therewith |
| EP88121186A EP0320994A1 (en) | 1987-12-17 | 1988-12-17 | Plasmid and a method for producing thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62317320A JPH082304B2 (ja) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | プラスミドとその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01160483A true JPH01160483A (ja) | 1989-06-23 |
| JPH082304B2 JPH082304B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=18086893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62317320A Expired - Fee Related JPH082304B2 (ja) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | プラスミドとその製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5118625A (ja) |
| EP (1) | EP0320994A1 (ja) |
| JP (1) | JPH082304B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
| KR100529254B1 (ko) * | 2003-09-22 | 2005-11-17 | 한국생명공학연구원 | Ｈａｒｓ36서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파균주에서 라이브러리를 제조하는 방법 및 상기 방법에의하여 제조된 라이브러리 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN163393B (ja) * | 1983-10-06 | 1988-09-17 | Pfizer | |
| DE3572688D1 (en) * | 1984-06-26 | 1989-10-05 | Agronomique Inst Nat Rech | Transformation vector for yeast yarrowia lipolytica, transformation process and transformed yeast |
| US4937189A (en) * | 1985-10-18 | 1990-06-26 | Pfizer Inc. | Expression and secretion of heterologous proteins by Yarrowia lipolytica transformants |
-
1987
- 1987-12-17 JP JP62317320A patent/JPH082304B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-12-16 US US07/285,032 patent/US5118625A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-17 EP EP88121186A patent/EP0320994A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5118625A (en) | 1992-06-02 |
| EP0320994A1 (en) | 1989-06-21 |
| JPH082304B2 (ja) | 1996-01-17 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |