JPH02150292A - 非高度グリコシル化ｂ型肝炎ビールス蛋白の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎ビールス（ＨＢ　Ｖ）は、数種のヒト肝臓疾患
の原因となる感染因子である。ＨＢＶに感染した多くの
個体は疾患の急性期を経て回復に向かう。しかし、感染
個体のある部分はその感染を除くことができずに該感染
の慢性的なキャリアとなる。ＨＢＶ感染は世界の多くの
部分で風土病として存在し、慢性的に感染している母親
からその新生児に周産的な感染が高頻度に生じ新生児自
体がしばしば慢性的に感染した状態となる６世界中での
慢性キャリアの数は３百万以上と算定されている。この
キャリアの中から、毎年数十万人が慢性Ｂ型肝炎の長期
的な帰結（肝硬変モして／または肝細胞癌）として死亡
している。

Ｂ型肝炎デルタビールスは、ＨＢＶと共感染すると、一
般に致死的な結果となる急性の電撃性疾患の原因となる
。デルタビールスは、ピリオンの外皮となる蛋白を（そ
れ自体の遺伝物質によっては）コードしておらず、共感
染しているＨＢＶによりコードされている外皮蛋白を被
り、それによって以下に記載されるようなＨＢＶ蛋白と
構造的および免疫学的に密接な関係を共有する。現時点
において、他の感染因子がＨＢＶと同様な関係を共有す
るか否かは解っていない。しかしながら、広域な血清学
的反応性を有するか高い免疫的な活性を示す蛋白が、Ｈ
Ｂ　Ｖと僅かあるいは部分的にでも抗原として交差反応
性を持った一部の因子による疾患（または感染）の診断
または予防（または治療）のシステムに有用であること
は明白である。

ＨＢピリオンは２群の構造蛋白、コア蛋白および外皮ま
たは表面蛋白からなっている。

ピリオンすなわちゾーン（Ｄ　ａｎｅ）粒子の主要表面
蛋白であることに加えて、該外皮蛋白はオーストラリア
（Ａｕ　ｓ　ｔｒａｌｉａ）抗原、または２２ｎｍ粒子
の唯一の構成成分である。

これら外皮蛋白は３８９アミノ酸（ａａ）をコードする
大ビールス開放読み取り枠（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ　
ｆｒａｍｅ）　（ＯＲＦ　）の翻訳産物である。

このＯＲＦはおのおのｉｎ　ｖｉｖｏで翻訳開始部位と
して機能し得るＡＴＧコドンで始まる３ドメインに区別
される。これらドメインは遺伝子内におけるおのおのの
５’−３’の順にしたがってプレＳＬ　（１０８ａａ）
、プレＳ　２　（５５ａ　ａ）およびＳ　（２２６ａａ
）と参照される。従って、これらドメインは、おのおの
　ＳまたはＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　（２２６ａ　ａ　）、プ
レＳ２＋Ｓ　（２８１ａａ）およびプレＳ１＋プレＳ２
＋Ｓ　（３８９ａａ）、またｒ、２４／ｇｐ２７、ｐ３
０／ｇｐ３３／ｇｐ３６およびｐ３９／ｇｐ４２とも参
照される３種のポリペプチドを規定する。

ＨＢＶの外皮蛋白は、特定のペプチド認識部位にＮ−グ
リコシド結合により結合した炭化水素側鎖（グリカン）
をもった糖蛋白である。［ヘエルマン（Ｈｅｅｒｍａｎ
ｎ）ほか１、ジャーナル　オブ　ピロロジー（Ｊ　、　
Ｖｉｒｏｌ、）、第５２巻、３９６頁（１９８４年）お
よびスチブ（Ｓｔｉｂｂｓ）ほか、ジャーナル　オブ　
ピロロジー、第４６巻、６２６頁（１９８３年）］、従
って、自然感染過程で産生されるＨＢＶポリヘプチドＬ
ａｐ　２４／ｇｐ２７　（Ｓポリペプチドおよびそのグ
リコシル化誘導体）、ｇｐ３３／ｇｐ３６　（プレＳ２
ドメインのみがグリコシル化されたプレＳ２＋Ｓポリペ
プチドおよびプレＳ２ならびにＳがグリコシル化された
同ポリペプチド）、およびＰ３９／ｇｐ４２　（プレＳ
１＋プレＳ２＋ＳペプチドおよびそのプレＳ１ドメイン
がグリコシル化された誘導体）種からなっている。現在
入手可能な血漿由来ワクチンは、事実上Ｓドメインのみ
（ｐ２４モノマーおよびそのグリコシル化誘導体ｇｐ２
７からなる）を含む蛋白からなっており、一方今日まで
に成功裡に開発された酵母由来のワクチンはほとんどＳ
ポリペプチドのみ（はとんど非グリコシル化ｐ２４種の
みからなる）からなっている。

２２ｎｍ粒子、あるいはＨＢ表面抗原 （ＨＢｓＡｇ）粒子は慢性のキャリア血漿から精製され
てきた。彼らの血漿が粒子−陽性であることから、これ
ら慢性キャリアはＨＢｓ”と参照される。もし感染した
人が十分な免疫反応をすれば感染を除去することが出来
、ＨＢ　ｓ−どなる。彼らがＨＢｓにたいする抗体を形
成することから、これら個体を抗−ＨＢｓ十と表示する
。このようなわけで、抗−ＨＢ　ｓ＋は疾患からの回復
およびＨＢＶ再感染にたいする免疫と関連している。従
って、ＨＢワクチンによる抗−ＨＢｓ十の促進または形
成はＨＢ　Ｖ感染にたいする防御をもたらすことが期待
されてきた。

この仮説は実験的に検証が可能であった。

ヒトを除くとチンパンジーは、ＨＢｓ十および肝臓酵素
の血清中レベルの上昇のように定量可能な指標に反映さ
れるような、ＨＢＶ感染に完全に感受性である数少ない
動物の一つである。チンパンジーが３段階量の精製され
たＨＢｓＡｇ粒子でワクチン処理され、ついで感染性Ｈ
ＢＶを静脈内に投与された。偽ワクチン処理された動物
は急性ＨＢＶ感染の兆候を示したが、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ
−ワクチン処理動物は如何なる感染の兆候からも防御さ
れていた。従って、この実験系において、ｇｐ２７およ
びｐ２４からなるＨＢｓＡｇ粒子は防御免疫を誘導する
のに十分であった。これら観察により刺激を受けて、い
くつかの製造業者がＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子からなるＨ　
Ｂワクチンを生産した。

最近、いくつかの独立した系統の証拠が、プレＳ配列が
ＨＢＶにたいする免疫をもたらすのに重要である可能性
を示唆している。ビールス感染過程におけるプレＳ抗原
の免疫除去がビールス除去および感染阻止の前兆のよう
に思われる［パドコウスカ（Ｂ　ｕ　ｄ　ｋｏｗｓｋａ
）ほか、アナレ　ド　アンスチッート　パスツール／イ
ムノロジー（Ａｎｎ、　Ｉｎ５ｔ、　Ｐａ５ｔ、／Ｉｍ
ｍｕｎ、）、第１３６Ｄ巻、５６−６５頁（１９８５年
）］、急性Ｂ型肝炎感染の過程で、プレＳドメインにた
いする抗体はしばしばＳにたいする抗体より早期に出現
する［ブチ（Ｒｅｔｉｔ）ほか、モレキュラー　イムノ
ロジー（Ｍｏ１．　Ｉ　ｍｍ　ｕｎ、　）　、第２３巻
、５１１−５２３頁（１９８６年）］、近近県系ウスに
おいて、ＳおよびプレＳにたいする免疫反応は独立に制
御されているように思われ、プレＳドメインの存在はＳ
にたいする免疫反応に影響し得る［ミリチ（Ｍｉｌｉｃ
ｈ）ほか、プロシーヂングス　オブ　ザ　ナショナル　
アカデミ−オブ　サイエンセズ　米国（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ）、第８２巻、８１
６８−８１７２　（１９８５年）、ジャーナル　オブ　
イムノロジー、第１３７巻、３１５−３２２頁（１９８
６年）；ノイラス（Ｎｅｕｒａｔｈ）ほかジャーナル　
オブ　メディカル　ピロロジー（Ｊ　、　Ｍｅｄ、　Ｖ
ｉｒｏｌ、）、第１７巻、１１９−１２５頁（１９８５
年）］。

さらに、プレＳドメインにたいする抗体はｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏでビールスの感染性を中和し［ノイラスほか、ワク
チン、第４巻、３５−３７頁（１９８６年）］、プレＳ
抗原は免疫されたチンパンジーをＨＢＶ感染から防御す
る「イト−（Ｉｔｏｈ）ほか、プロシーヂングスオブ　
ザ　ナショナル　アカデミ−オブサイエンセズ　米国、
第８３巻、９１７４−９１７８頁（１９８６年）コ。こ
れらＩｉ！！祭に照らして、また以下に考察するように
、ＨＢワクチンの生産における組換え体酵母の有用性［
ヒルマン（）（ｉｌｌｅｍａｎ）ほか、ワクチン、第４
巻、７５−７６頁（１９８６年）］の故に、出願者らは
組換え体サツカロミセス　セレビシェ（Ｓ　ａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）より実験的プ
レＳ−含有ワクチンを生成した。

入手可能なＨＢワクチン供給を拡大するために製造業者
はビールス外皮蛋白の発現をもたらす組換えＤＮＡ技術
に目を向けた。微生物の系では、ニジエリシア　コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａ　　ｃ　ｏｌｉ）およびＳ．
セレビシエ（Ｓ。

ｃｅｒａｖｉｓｉａｅ）が多くの組換え体由来蛋白の発
現のために最も普通に利用されてきた。免疫的に活性な
ＨＢｓＡｇ粒子をＥ。コリ内で発現させる多くの試みは
成功しなかった。しかし、Ｓ．セレビシエは免疫的に活
性なＨＢ　ｓ　Ａ　ｇを発現する能力において非常に有
用であることが示された。これら粒子は、ワクチンとし
て処方されると、広域の血清型の生ＨＢ　Ｖ投与にたい
してチンパンジーを完全に防御することが出来ることが
証明された。さらに、酵母由来のＳ粒子は免疫的にも活
性であり、ヒト臨床試験において血漿由来ＨＢＳＡ＆と
同様に有効である［スチブンス（Ｓ　ｔｅｖｅｎｓ）ほ
か、（ＪＡＭＡ）、第２５７巻、２６１２−２６１６頁
（１９８７年）］。それ故に、組換え体ＨＢｓＡｇの合
成を指示するための宿主種としてのＳ．セレビシエの有
用性は強固に確立されている。加えて、酵母はエンドト
キシンを含まず、ヒトに非感染性であり、工業的な規模
で醗酵し得、永続的な動物細胞系（その多くはビールス
によりトランスフオーム（形質転換）されており、マウ
スにおいて腫瘍形成性があるかも知れず、またその全て
がプロトオンコジーンＣＭ癌遺伝子）を含む）の利用に
付随する多くの安全面での問題を欠いていることから、
酵母でのヒト治療薬剤およびワクチンの発現は生産開発
にとって非常に有用である。

Ｓ．セレビシエ（パン酵母）は、糖蛋白を合成できる真
核生物である。酵母における蛋白のグリコシル化は多く
の最近の総説の主題となっている［特に：ククルジンス
力（Ｋ　ｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ）ほか、アニュアル　
レビューオブ　バイオケミストリー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ
。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）（１９８７年）、第５６巻、９１５
−４４頁；タネン（Ｔａｎｎｅｎ）ほか、ビオキミカ　
ビオフィジカ　アクタ　（ＢＢＡ）（１９８７年）、第
９０６巻、８１−９９頁］。

このグリコシル化またはポリペプチド上の適当なアミノ
酸（ａ　ａ）受容体へのグリカンの付加は、特定のセリ
ン（Ｓｅｐ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基（〇−結
合）あるいは特定のアスパラギン（Ａｓｐ）残基（Ｎ−
結合）に生じる＊　Ｓ　ａ　ｒまたはＴ　ｈ　ｒ残基へ
の〇−−合付加における特異性ははっきりと理解されて
おらず、ケース　バイ　ケースで経験的に決定される。

Ｎ−結合グリコシル化におけるシグナルはａａ配列Ａｓ
ｎ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡ　ｓ　ｎ　−Ｘ−８ｅｒ（Ｘは
任意のアミノ酸）のどちらかとして明確に規定されてい
る。多くの天然の、元からあるグリコシル化された蛋白
（その中でマンノ蛋白と呼ばれるもの）を合成するのに
加えて、酵母は組換え技術により発現された異種のある
いは外来の蛋白のグリコシル化も可能である（もしも該
異種蛋白がＮ−結合または〇−結結合グリコモ化化ため
の配列を含んでいたら）。

自然感染の過程で生産されるプレＳ　２＋Ｓポリペプチ
ドは２以下の１″コア”　［大きさ約３キロダルトン（
ＫＤ）Ｎ−結合グリカンを含む。一つはＳ領域であり２
番目はプレＳ２ドメインのアミノ酸残基４にあるＡ　ｓ
　ｎ上である。Ｓドメイン中の認識部位は、酵母中で合
成されたレコンビバックスＨＢ　（Ｒｅｃｏｍ−ｂｉｖ
ａｘ　ＨＢ　）あるいは組換え体プレＳ　２＋Ｓのどち
らもグリコシル化されていない。しかし、プレＳ２ドメ
インのａａ残基４の部位は酵母により認識されグリコシ
ル化される。プレＳ１ドメインはプレＳ１領域のａａ残
基４にＮ−結合グリコシル化部位を、血清型ａｄｗでＬ
主ａａ残基２６に可能性のある部位を含む、当業者にと
ってプレｓ２のグリコシル化についてなされた議論が、
プレｓ１およびＳドメインでのものと同様にプレＳ２領
域にある種々の配列にも適用されることは自明である。

組換え体プレＳ２＋Ｓを合成している酵母は、ビールス
感染過程で天然のポリペプチドに付加されるものと同様
な１′コア″グリカンを付加する。しかし、該酵母宿主
細胞がグリコシル化に関して“野生型″である場合（即
ち、殆ど全ての通常利用されている株の場合にそうであ
るが、天然のグリコシル化に要求される酵素を完全に保
持している場合）は。

これらグリカンのかなりの数は酵母が自身の構造マンノ
蛋白を造る際に使用するのと同一の方式でたくさんの付
加的なマンノース残基により拡張される。この拡張され
たグリカンの付加は、プレＳ２＋Ｓポリペプチドのよう
な外来遺伝子産物上に生じた場合は高度グリコジル化（
ｈｙＰｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）と参照される
。当業者にとって、酵母においてなされた議論が、多岐
に渡るグリコシル化のパターンに至るかも知れない他の
宿主細胞（例えば、昆虫、カビなど）にも及ぶことは自
明である。

本発明で説明する以下の方法のいずれかにより、ＨＢＶ
プレＳおよびＳポリペプチド中の高度グリコシル化を無
くしたり、グリコシル化を制限したりすることが出来る
が、それだけに限定するものではない。

第１に、Ｎ−結合の高度グリコシル化は組換え体宿主の
生育の過程で培地中に外来性の薬剤（例えばツニカマイ
シン）を存在させることにより阻止したり制限したりし
得る。第２に、炭水化物は組換え体または天然源からの
ＨＢ　Ｖから化学的（例えば無水トリフルオロメタンス
ルフォン酸または無水弗化水素）あるいは酵素的（たと
えばＮ−グリカナーゼ、エンド−Ｆまたはエンド−Ｈに
より）あるいは物理的（例えば超音波処理）に減少させ
たり除いたりすることが出来る。第３に、グリコシル化
のための認識部位はＤＮＡレベルでの変異により、コア
のグリコシル化そしてそれによる高度グリコシル化も同
じ様に阻止されるように変化または欠失させることが出
来る。グリコシル化の認識配列が変えられたりそのよう
な改変プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦ　（酵母中で活性な適当
なプロモーターにより支配された）は酵母宿主中に形質
転換される。その結果得られたプレＳ２＋Ｓポリペプチ
ドはグリコシル化を欠いている。第４に、宿主がグリコ
シル化に要する必須酵素を欠いたものにすることが出来
る。１つのその様な酵母株がＮ−結合グリカンの伸長（
高度グリコシル化）に必要なグリコシル化過程での必須
酵素を欠くことが明らかにされている（ｍｎｎ９変異株
）；化学的な検討の結果この変異株は外−鎖マンノース
残基のない“コア″炭水化物のみを含むマンノたんばく
をつくることが示された。プレＳ２＋Ｓポリペプチド用
の０ＲＦ（酵母中で活性な適当なプロモーターにより支
配された）がこのようなｍｎｎ９変異酵母に形質転換す
るのに用いられた。その結果得られたプレＳ２＋Ｓポリ
ペプチドは“コア”グリコシル化のみを含み過剰グリコ
シル化を欠いている。

本発明のこれらおよび他の目的は以下の記載から明らか
となろう。

従って、ＨＢ　Ｖ外皮蛋白そして／またはその成分であ
るポリペプチドを調節されたそして特定されたグリコシ
ル化パターンをともなう抗原形態で生産するための発現
ベクター宿主細胞そして方法を与えるのが本発明の目的
である０本発明の第２の目的は、ビールスの（本来の）
ペプチドドメインの抗原性を保ちそして宿主特異的なグ
リコシル化パターンの存在によりもたらされる宿主抗原
に対して向けられる好ましくない反応性を無くすことで
ある。本発明のもう一つの目的は、そのようなペプチド
の精製のためにより大容量でより高濃度で該外皮蛋白の
最大収率が得られるように、組換え体宿主細胞の生育を
スケールアップするための条件を特定することである。

本発明の更なる目的は、該蛋白のグリコシル化パターン
を合成後に変換し得るような調節された条件を特定する
ことである０本発明のこれらおよび他の目的は、以下の
記載から明らかになろう。

ＨＢＶプレＳ２＋Ｓ遺伝子が酵母中で至適化された高収
率で発言された０発現されそして／またはグリコシル化
の程度を調節しそれにより高度グリコシル化を減らすか
無くすような方法で処理された蛋白は、血漿由来ＨＢＶ
プレＳ２＋Ｓ蛋白によりコードされる主要抗原部位を顕
示するような形態に集合し、それによりこの遺伝子産物
の発現のための宿主としての酵母の有用性を明らかにし
ている。

この蛋白はｉｎ　ｖｊ、ｔｒｏでの診断系として、また
Ｈ　Ｂ　Ｖ−関連感染を処置そして／あるいは防御する
ためのワクチンとして有用である。

本発明は、限定された、調節されたまたは特定されたグ
リコシル化パターンを含み過剰グリコシル化されていな
いＨＢＶ外皮蛋白の調製法に関する。

ゾーン粒子（血清型ａｄｗ）がビールス０ＲＦｓの単離
のためのＨＢＶ核酸原として用いられた。当業者にとっ
て、本発明がビールスの遺伝的多様性に起因する他の血
清学的反応性を有するＨＢＶ株からの核酸の利用にまで
およぶことは自明である。ＨＢＶピリオン中に本来的に
存在するニックならびにギャップの入った核酸型からＨ
ＢＶゲノムの共有結合で閉環された２本鎖ＤＮＡを生産
するために内在性のポリメラーゼ反応が利用された。

該ＤＮＡは単離され、ＥｃｏＲＩで完全消化され、ｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＩ部位にクローン化され、ｐＨＢＶ
／ＡＤＷ−１を生じた。

プレＳゲノムをプレＳ領域のＥｅｏＲＩｇｌｓ位で環状
に置換された形で含んでいる組換え体プラスミドが選択
された。プレＳ領域の５５アミノ酸とＳ領域の２２６ア
ミノ酸をコードしテイル完全ＯＲＦが先ずｐＨＢＶ／Ａ
ＤＷ−１をＥ　ｃ　ｏ　ＲＩおよびＡ　ｅ　ｃ　Ｉで消
化した後０．８キロ塩基対（ｋｂｐ）断片を精製するこ
とにより得られた；この断片は開始コドン、アミノ末端
３ａａ、カルボキシル末端３ａａおよび翻訳終止コドン
のみを欠くプレＳ２＋Ｓポリペプチドをコードする。

オリゴヌクレオチドが合成されこの断片に連結され、そ
の断片を１０ｂｐの酵母由来非翻訳５′隣接配列および
完全なプレＳ２＋５ＯＲＦを含むＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ断片
に変換した。プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの３′隣接位の配
列は、ＡＤＨ１転写のターミネータ−中にある天然のＨ
ｉ　ｎ　ｄ　ｍ部位に直接隣接するように選択され、従
って、如何なる付加的な介在配列も含まずに完全に酵母
由来の接続部位を創造した。当業者にとって、プレＳ２
＋Ｓの発現のためにはいずれの酵母においても活性な転
写ターミネータ−がＡＤＨＩと置換することが出来るこ
とは自明である。

構築のための５′隣接配列（ＡＣ，ＡＡＡＡＣＡＡＡＡ
）は、酵母遺伝子ＧＡＰ６３　（ＧＡＰ）の非翻訳リー
ダー（ＮＴＬ）のためのものに対応するように選択され
た［ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）、ジャーナル　オブ
　バイオロジカル　ケミストリー、第２２５巻、２５９
６頁（１９８０年）］。構築は、如何なる付加的な塩基
の介在もなしにプレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの開始コドンに
直接ＮＴＬを隣接させるような方法でなされた。従って
、当業者にとって、外皮ポリペプチドの発現においてＮ
ＴＬの選択は適当な発現レベルに至る他の配列におよぶ
ことは自明である。

ＤＮＡ配列解析の結果、ｐＨＢｐｒｅＳ　Ｇ　Ａ　Ｐ３
４７／１９ＴのＤＮＡによりコードされるブレＳ２＋Ｓ
配列とはａａの相違をもたらす２塩基の置換があること
が明らかになった［バレンツエラ（Ｖ　ａｌｅｎｚｕｅ
ｌａ）ほか、バイオテクノロジー、第３巻、第４号、３
１７−３２０頁（１９８５年）］０両構築における同一
ポリペプチドを評価するために、ＨＢＶプレＳ２＋Ｓの
８４６　　ｂｐ　　ＯＲＦの塩基６４のＣの代わりにＴ
（ＬｅｕでなくＰｈｅをコードする）そして塩基３５２
のＡの代わりにＣ（ＧｉｎでなくＨｉｓをコードする）
であるこれら塩基置換が部位指定変位処理（ｓｉｔｅ−
ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によりつ
くられた［シラー（Ｚｏｌｌｅｒ）ほか、ヌクレイック
アシッズ　リサーチ（Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ−５ｅａｒｃｈ）第１０巻、６４８７−６５００頁（
１９８２年）］。最適の構築のためのコードされるａａ
配列がこうして確かめられた。当業者にとって、本発明
がこの配列に限定されることなく、ＤＮＡがＨＢＶ抗原
性を伴うポリペプチドをコードする如何なる配列にもお
よぶことは自明である。

変異処理に続いて、上述の断片は以前に記載された（ａ
）ＧＡＰ４９１プロモーターの約ｉ、１ｋｂｐ、（ｂ）
酵母由来隣接配列】Ｏｂｐ、（ｃ）ビールス隣接配列を
欠いたＨＢ■プレＳ２＋Ｓ遺伝子（血清型ａｄｗ）の８
４６塩基対、そして（ｄ）酵母ＡＤＨＩターミネータ−
の約０．４　ｋｂｐからなる発現カセットの構築に用い
られた。この発現カセットは、酵母シャトルベクターｐ
ｃ１／１　［ベグス（Ｂａｇｇｓ）　、ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、第２７５巻、１０４頁（１，９７８年）
；ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ほか、ネイチ
ャー第３１２巻、７７頁（１９８４年）］中に挿入され
、酵母ＣＦ４２株を形質転換し、以後ｐＦ４０３と呼ば
れる形質転換体を作成するのに用いられたプラスミドｐ
　Ｙ　Ｇ　ｐ　ｒ　ａ　Ｓ　２＋Ｓ−１を造った。この
形質転換体は、評価ならびに以後の実験のための凍結保
存標品として確立された。親株のＣＦ４２は以下のよう
にして得られた：酵母２１．５０−２−３株中の自然ｕ
ｒａ３変異（ワシントン大学り。

ハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ）　）が選択された〔
ボーク（Ｂ　ｏｅｋｅ）ほか、モレキュラーアンドジェ
ネラルジェネチクス（Ｍｏｌ、　Ｇ　ｅｎ。

Ｇｏｎｅｔ、）、第１９７巻、３４５−３４６頁（１９
８４年）］、できた株（ＭＡＴａ、　ａｄｓじ。

ｌｅｕ２−０４”、ｕｒａ３．Ｃｉｒ’）は、プラスミ
ドＹＣｐ５０　　ＨＯで形質転換することにより２倍体
にされた［ジエンセン（Ｊθｎ５ｅｎ）ほか、プロシー
ヂングス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サ
イエンセズ　米国（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、
第８０巻、３０３５−３０３９頁（１９８３年）］。機
能性酵母遺伝子ＨＯは細胞が接合型を切り替えさせる。

従って、単一細胞形質転換体からの子孫はａおよびα接
合型の混合物となって集落形成の間に接合する。２倍体
クローン分離体はプラスミドを除去されＣＦ４２（ｌｌ
すａ／ａ　、　ａｄｅｌ−、ｌｅｕ　２−０４−ｔ　ｕ
ｒａ　３−）と命名された。これら形質転換体は、評価
ならびに以後の実験のための凍結保存標品として確立さ
れた。

ｐＦ４０３凍結保存標品からの組換え体酵母はＹＥＨＤ
培地中で生育させられた［カーチー（ｃａｒｔｙ）ほか
、ジャーナル　オブ　インダストリアル　マイクロバイ
オロジー（Ｊ。

Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏ、）　、第２巻、１
１７一−１２１頁（１９８７年）コ。定常期まで生育し
た後、酵母細胞が収穫された。溶菌液が調製され、ソヂ
ウムドデシル硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
展開され、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇに対する抗体でイムノプロ
ットされた。プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの翻訳産物および
そのグリコシル化誘導体の予想された分子量と一致した
分子量３０−および４Ｏ−ＫＤの部分に２つの主要ポリ
ペプチドが見出された。それに加えて、−群の過剰グリ
コシル化体であり抗−ＨＢｓ血清ならびに抗−酵母血清
に免疫反応性のものに対応した多波散性の（分子量≧５
Ｏ−ＫＤ）グリコペプチドも検出された。

さらに、組換え体酵母の溶菌液はラヂオイムノアッセイ
（ＲＩ　Ａ）でプレＳ＋８２陽性であったが親株溶菌液
は陰性だった。部分的に精製された酵母溶菌液の電子顕
微鏡ｌｌｌ祭の結果高密度の典型的な２２ｎｍのプレＳ
　２＋Ｓ粒子が示された。

該酵母由来プロモーターはプレＳ２＋Ｓ遺伝子の転写を
開始する。従って、当業者にとって、酵母で活性な如何
なるプロモーター配列もＧＡＰユプロモーターと置き換
え得ることは自明である。当業者にとって、適当な検定
システム、例えばイムノプロットまたはＲＩＡまたは酵
素結合イムノアッセイ（ＥＩＡ）、が、最大収率を得る
ための培養収穫時期を的確にするべく、この系でのプレ
Ｓ２＋Ｓポリペプチドの発現を検定するために用いるべ
きであることは自明である。

該ＧＡＰ４９１プロモーターは、ＨＢｓＡｇを含むいく
つかの外来性蛋白を酵母中で発現するのに有用である［
ビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ほか、ジーン（Ｇｏｎｅ）、第
３２巻、２６３−２７４頁（１９８４年）；ワンブラー
（Ｗａｍｐｌｅｒ）ほか、プロシージンゲス　オブ　ザ
　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンセズ　米国、
第８２巻、６８３０−６８３４頁（１９８５年）］、可
溶性酵母蛋白の約４０％にまでＨＢｃＡｇを発現したと
いう出願者らの以前の結果に基づき、出願者らはこのプ
ロモーターを、適当な酵母宿主細胞中でプレＳ２＋Ｓ抗
原の発現を作動させるのに用いた。

組換え酵母発現プレＳ２＋Ｓ蛋白のグリコジル化を調節
し特定するために、上述の発現カセットを含む酵母発現
プラスミド（ｐＹＧｐｒｅＳ２Ｓ−１）もまた以下のよ
うに構築されたＳ。

セレビシェＫＨＹ−１０７株を形質転換するのに用いら
れた： α接合型株ＣＺ　５／Ｌ　Ｂ　３４７−ＩＣ（＋ｍｎｎ
９−８ＵＣＺ−）（カルフォルニア大学のＣ，バロウ（
Ｂａｌｌｏｕ）　）を、ａ型株２１５０−２−３　（１
ｅｕ２−、ａｄｅｌ−）（ワシントン大学、Ｌ。

ハートウェル（Ｈａｒｔ％Ｉｅｌｌ）と株同士をＹＥＨ
Ｄ寒天平板（カーチー（Ｃａｒｔｙ）ほか、前出）」二
で混合することにより接合させた。２倍体を選択するた
めに、接合株をロイシンを含まず（ｌｅｕ−）、唯一炭
素源として２％蔗糖を含む最少培地上にレプリカした。

単一集落を分離した後、２倍体を胞子形成させ、子のう
胞子を標準法により分離した。ＫＨＹ−１０７株は単一
胞子として分離されｃｉｒ”、ａｄｅビ。

１ｅｕ２−１そしてｍｎｎ９−（シフ染色法による）と
性格付けされた。

形質転換されたクローンは１Ｍソルビトールを含む最少
培地（ｌｅｕ”’）上で選択された。

これらクローン化された形質転換体は、以後の評価およ
び実験のために１７％グリセロール中で凍結標品として
確立された。

発現プラスミドｐＹＧｐｒｅＳ２Ｓ−Ｉｔも、記載され
た（ブローチ（Ｂ　ｒｏａｅｈ）、Ｇ、Ｒ，、メンツズ
　イン　エンザイモロジー、第１０１巻、３０７−３２
５頁、１９８７年、アカデミツク　プレス、ニュー　ヨ
ーク）ようにＫＨＹ−１０７（Ｃｉｒ”、ａｄｅ　１”
、ｌｅｕ２−ｍｎｎ９−）から得られたＫＹ　Ｈ−１０
７（ａｉｒＯａｄｅｌ”、１ｅｕ２−、ｍｎｎ９−）を
形質転換するのに用いられた。形質転換されたクローン
化分離株は、以後の評価および実験のために１７％グリ
セロール中で凍結標品として確立された。

発現プラスミドｐＹＧｐｒｅＳ２Ｓ−１を含む形質転換
体酵母クローン［ＫＨＹ−１０７（ｃｉｒ”、ａｄｅ”
　　１ｅｕ２−、ｍｎｎ９’″）］は、１Ｍソルビトー
ルを含む１ｅｕ−選択寒天平板上に広げられ３０℃で２
−３日インキュベートされた。これら酵母は１Ｍソルビ
トールを含む５−７　ｍ　Ｌの複合ＹＥＨＤ　（カーチ
ーほか、前出）中に植えられ、３０℃で通気しつつ１２
−１８時間インキュベートされた。５０ｍ　Ｔ、の１Ｍ
ソルビトールを加えた複合ＹＥＨＤ（以後ＹＥＨＤＳと
呼ぶ）を含むフラスコにト記培養を植え（初期ＡＧＯｏ
　：＝　ｏ　、１となるように）、最終Ａ”’が１０−
１６になる＊”Ｃ’３０℃で振とう（３５０ｒｐｍ）　
シっつ４８−７２時間培養した。１０Ａ′。０単位の試
料を管中に分取し、酵母細胞を２０００ｘｇ、１０分で
ペレットとした。試料は直接検定されるかまたは一７０
℃で凍結保存された。検定の際には、ペレットを２ｍＭ
フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）
を含む燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．４ｍＬ中に懸
濁し１．５ｍＬのエッペンドルフ管中に移した。酵母細
胞は、１　）　２００−３００　ｍ　ｇの洗浄したガラ
スピーズ（０，４５ｍｍ）を加えポルテックスミキサー
上で１５分攪拌する、２）ＴＸ−２０を０．５％添加す
る、３）ポルテックスミキサー上で２分攪拌する、そし
て４）４℃で１０分インキュベートすることにより破砕
した。細胞破片およびガラスビーズは２００ｘｇ、１０
分の遠心により除去した。

清澄化した上清を取り出し蛋白量［ローリ−（Ｌｏｗｒ
ｙ）ほか、ジャーナル　オブ　バイオロジカルケミスト
リー、第１９３巻、２６５頁（１９５１年）の方法によ
る］およびプレＳ２＋Ｓに特異的なＲＩＡ［ハンソン（
Ｈａｎｓｓｏｎ）ほか、インフェクション　イムノロジ
ー（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍ　ｍｕｎｏｌ、）、第２６巻
、１２５−１３０頁（１９７９年）、マチダ（Ｍａｃｈ
ｉｄａ）ほか、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏ
ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、第８６巻、９１０−９１８頁
（１９８４年）］について検定した。

５クローンについて平行して評価し、対照として１．０
価と標準化したクローンｐＦ４０３からの等量の細胞ペ
レットと比較した。

５クローンについての典型的な抗原生産性の相対的値は
、実施例■中に挙げられるように得られた。

発現プラスミドを含む形質転換酵母のクローン［ＫＨＹ
−１０７（ｃｉｒ’、ａｄｅｌ”　　１ｅｕ２−、ｍｎ
ｎ９−）］はＩＭソルビトールを含む１ｅｕ−平板上に
広げられ３０℃で２−３日インキュベートされた。これ
ら酵母は、５゛−７ｍＬの複合ＹＥＨＤＳ培地中に植え
られ、３０℃で通気化で２−１８時間インキュベートさ
れた。５０ｍＬの複合ＹＥＨＤＳ培地を含むフラスコに
上記培養が植えられ（初期Ａ”’＝０．１となるように
）３０℃で振どう（３５０ｐｐｍ）　シつつ４８−７２
時間最終Ａ　”　”が　１０−１６までインキュベート
された。３組のＩＯＡ′。’単位の試料が管中に分取さ
れ、酵母細胞は２０００ｘｇ、１０分でペレットされた
。試料は上述のように直接検定されるかまたは一７０℃
で凍結保存された。

５クローンについて平行して評価し、対照として１．０
価と標準化したクローンＰＦ４０３と比較した。該５ク
ローンについての典型的な抗原生産性の相対的値は、実
施例■中に挙げられるように得られた。

上述の全組換え体クローンから得られたプレＳ２＋Ｓポ
リペプチドのイムノプロット解析の結果、ｍ　ｎ　ｎ　
９表現型の宿主中で、見かけ上の分子量３０−および３
４−ｋＤの２本のバンドを示した。多波散性の（分子量
＞５Ｏ−ｋＤ）ｉ剰グリコシル化種は抗−酵母または抗
−ＨＢｓ血清でも検出されなかった。

発現された蛋白の本来的な性質がＨＢＶプレＳ３＋Ｓの
グリコシル化の調節を規定するような発現ベクターを与
えるために、プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦ中のＮ−結合グリ
コシル化のための認識配列［Ａ　ｓ　ｎ　−Ｘ　−Ｔ　
ｈ　ｒコを変異させた。クローンｐ　Ｕ　Ｃ１，３ｐ　
ｒ　ｅ　Ｓ　２　Ｓ（図１）がこの構築の出発材料とな
った。

プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの５′部分を再構築するために
、ＡＴＧの上流ＢａｍＨＩから１０ｂｐ　　ＮＴＬまで
とＨｉｎｄ１１１部位からＥ　ｃｏ　ＲＩ適合末端まで
のＯＲＦを再構成する一組のオリゴヌクレオチドを合成
した。ＡからＣへの変異（塩基３１における）およびＴ
からＡへの変！４（塩基３３における）を含み、Ｓ２蛋
白ドメインの４位のａａ変化Ａ　ｓ　ｎからＧｌｎをも
たらすこのオリゴヌクレオチドの配列は： ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＡＧＣＴＴＡ　ＣＡＡ　ＡＡＣＡＡＡ
　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＡＡ　ＴＣＣＧＴ　ＴＣ
Ｇ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＴＡＣＧＴＣＡ
ＣＣＧＴＴ　ＡＧＧＡＣＴ　ＧＣ，Ｃ，ＴＴＣＣＡＣＣ
ＡＡ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡＧＴＧＡ　ＣＧＧ　ＡＡＧ
　ＧＴＧ　ＧＴＴ　ＣＧＡ　ＧＡＣＧＴＣＣＴＡＧであ
る。

この合成オリゴヌクレオチドペアは、前もってＥｃｏＲ
ＩおよびＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化されたＰＵＣ１Ｑ中に
連結された。得られたプラスミドはＢ　ａ　ｍ　ＨＩお
よび５ａｌＩで消化され、その後ｐＵｃ１３ｐｒｅｓ２
ｓがら消化され精製された０、８　ｋ　ｂ　ｐのＢ　ａ
　ｍ　ＨＩおよび５ａｌＩ断片と連結されて、Ｈｉ　ｎ
ｄｌｌｌ断片として４位のＡ　ｓ　ｎがＧｌｎに置換し
たプレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦを含むｐＵｃ１９ｐｒｅｓ２
ΔＧ−１を創出した（図２参照）、このＯＲＦは、前述
と類似の流儀で酵母発現ベクタ−を造るのに用いられた
。

類似体に関する流儀で、該０．８ｋｂｐの１（ｉ　ｎ　
ｄ　ｍ断片がｐＵｃ１３ｐｒｅｓ２ｓから分離され、Ｅ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位が前もって破壊されているＰ
ＵＣ１９ベクター中に連結された。得られたベクターは
ＥｃｏＲＩとＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化され、プレＳ２ド
メインのアミノ酸＋６位でＴ　ｈ　ｒからＡｌａへのア
ミノ酸交換に至るＡからＧへの変異（オリゴヌクレオチ
ドの塩基＋７位）をもつＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまで
のプレＳ２＋Ｓ外皮ＯＲＦを再生するようにデザインさ
れた一組のオリゴヌクレオチドに連結された。

このオリゴヌクレオチドの配列は： ＡＴＴ　ＴＣＣＧＣＴ　ＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡ　Ｇ
ＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡＡＧＧ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＡＡＧ　
ＧＴＧ　ＧＴＴ　ＣＧＡ　ＧＡＣＧＴＴ　ＣＴＡＧであ
る。

この構築はプレＳ２ドメインのアミノ酸６でのＴｈｒが
Ａ　ｌ　ａに置換したＢ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ断片としての
ＯＲＦを含むｐＵｃ１９ｐｒｅｓ２ＳΔＧ−２の創出と
なる（図２）、このＯＲＦは、前述の類似体に関する流
儀で酵母発現ベクターを造るのに利用された。

ブレＳ２＋Ｓ抗原発現は前述のように評価され、上述の
形質転換体で得られたものと生産性において対等である
ことが示された６両変異株クローンは以後の評価のため
に凍結標本として保存された。抗−ＨＢｓ（ｐ２４）血
清または抗−プレＳ２血清で得られたイムノプロット解
析では、プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの非グリコシル化産物
で予想される分子量と等しい分子置駒３Ｏ−ｋＤの単一
主要種が検出された。

翻訳後の操作により、プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦ蛋白の特
異的なグリコシル化パターンを更に特定し生み出すため
に、前述のプラスミドｐ　Ｙ　Ｇ　ｐ　ｒ　ｅ　Ｓ　２
　Ｓ　−１で形質転換された酵母から調製された過剰グ
リコシル化されたプレＳ２＋Ｓ蛋白が以下に述べるよう
に酵素的に脱グリコシル化された： 抗原試料（免疫アフィニチーまたは疎水相互作用クロマ
トグラフィーにより精製された）を０．５％　ソヂウム
ドデシル硫酸（ＳＯ８）および０．２Ｍ　　β−メルカ
プトエタノール中で１００℃５分の加熱により変性させ
、次いで水浴中で冷却した。酵素的な脱グリコシル化は
Ｎ−グリカナーゼ（ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ、
ペプチド−Ｎ４　［Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル
］アスパラギンアミダーゼ）で開始され、混合物は３７
℃で１８時間インキュベートされた。対照実験は酵素が
加えられなかったことを除き、同じ条件下で行われた。

蛋白からのオリゴサツカライドの遊離は、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上での蛋白サブユニットの移動度の変化により検出
された（銀染色分析）。Ｓ抗原またはプレＳ２ドメイン
に対する２つの異なる抗体を用いたイムノプロット分析
も脱グリコシル化反応の検出に利用された。

本発明の決定的な面は、非高度グリコシル化プレＳ２＋
Ｓ蛋白は重要なペプチドドメインを含みかつ表面に出し
ており、感染性ピリオンおよび実証された免疫原として
の有効性を伴うワクチン（例えば組換え体ＨＢｓＡｇ）
の構造的なエピトープ（訳註：　抗原決定基）を模して
いる筈であると云う点である。それ故、申請者らは非高
度グリコシル化プレＳ２＋Ｓ蛋白のｉｎ　ｖｉｔｒｏで
の抗原性とともにｉｎ　　ｖｊｖｏでの抗原能力につい
ても研究した。

この目的のために、該プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦはｍ　ｎ
　ｎ　９表現型を示す酵母細胞中で発現され、非グリコ
シル化プレＳ２＋Ｓ産物が免疫アフィニチーまたは疎水
相互作用クロマトグラフィーにより精製された。

ｉｎ　ｖｉｖｏでの能力決定のために、非グリコシル化
プレＳ２＋Ｓ試料はミ３ウバンに吸着され、−群のマウ
スが段階的な量の抗原を投与された。６週後にマウス血
清が抗−ＨＢｓ抗体（ＡＵＳＡＢＲ）および抗−プレＳ
２抗体について検定された［ノイラス（Ｎｅｕｒａｔｈ
）、ジャーナルオブメヂ力ル　ピロロジー、第１７巻、
１１９−１２１頁（１９８５年）に従って］、このよう
な実験の結果は、該プレＳ２＋Ｓ試料は抗−ＨＢｓ抗体
反応を誘導するのにＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ対照試料と同じに
有効である（有効免疫量はＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ対照が０．
２５μｇに比較してプレＳ２＋Ｓで０．３４μｇであっ
た）ことを示した。加うるに、プレＳ２＋Ｓ試料はプレ
Ｓ２ドメインに対して特異的な抗体反応を同時に誘導す
る能力を示した（有効免疫量０．１４μｇ）。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　の抗原性を決定するために、ＨＢ　
ｓ　Ａ　ｇ、高度グリコシル化プレＳ２＋Ｓおよび非高
度グリコシル化プレＳ２＋Ｓの試料がＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ
に対する５種の異なるモノクローナル抗体（ＭｃＡｂｓ
）を用いて解析された。　Ｍ　ｃ　Ａ　ｂ　ｓ　１．２
、および３は２２ｎ　ｍ　ＨＢｓＡ　ｇ粒子または感染
性ピリオンの表面にあるａ構造エピトープ上の３部位を
認識する。ＭｃＡｂｓ４および５はＨＢｓＡｇのｄエピ
トープを認識する（ＭｃＡｂ４はｄの配列を認識し、Ｍ
　ｃ　Ａ　ｂ　５はｄの構造を、認識する）。

このプレＳ２＋Ｓ抗原に関するモノクローナル抗体解析
の結果はいくつかの段階で有意である。第１に、一般に
非高度グリコシル化抗原は５種のＭ　ｃ　Ａ　ｂ　ｓに
対し高度グリコシル化抗原に比して数倍高い特異的反応
性を有する。この結果は、高度グリコシル化が抗体の免
疫結合を妨害することを示す、第２に、Ｍ　ｃ　Ａ　ｂ
　１はチンパンジーにおける生ＨＢＶ接種に対して防御
効果をもつ点において生物学的に重要な抗体である。こ
の抗体は高度グリコシル化プレＳ２＋Ｓ抗原よりもコア
のグリコシル化プレＳ２＋Ｓに６倍よく結合する。

Ｂ型肝炎抗原に対するＭ　ｃ　Ａ　ｂ　１の反応性は非
常に予言的でありヒトにおける免疫応答と関連している
。

組換え体蛋白における、定性的および定量的なグリコシ
ル化のパターンは宿主種および稚内での細胞系の係数で
ありそれに大きく依存している。当業者にとって、宿主
株の選択はグリコシル化過程の酵素内の変異が同定され
るＳ．セレビシエ以外の種および細胞系にまで広げられ
ることは自明である。当業者にとって、Ｓ．セレビシエ
宿主株の選択がグリコシル化過程の酵素内の変異が同定
される全ての株にまで広げられることは自明である。

さらに本分野の熟練者にとって、翻訳後改変によりグリ
コシル化を制限するために、外皮蛋白の選択が、自然感
染から、トランスジェニック（訳註：遺伝子移植）動物
から、モしてＳ．セレビシエ以外の種の組換え体宿主細
胞から造られる蛋白産物にまで広げられることは自明で
ある。さらに、［）ＮＡレベルで翻訳されたグリコシル
化のシグナルを変えることによりグリコシル化の制限を
調節するのが、アミノ酸置換によりグリコシル化を阻止
するのと同様に認識配列の全部または一部を欠失させる
結果となる変異処理にまで広げられることも自明である
。当業者にとって、そのような変異株の発現が、哺乳類
、昆虫および他の糸状菌に由来するがそれに限定されな
い種および細胞にまで広げられるがそれに限定されない
ことは自明である。

サツカロミセス属は種々の種からなっている。Ｓ．セレ
ビシエは組換え体ＤＮＡ−介在性の各種外来ポリペプチ
ド発現における宿主として最も普通に用いられている。

しかし、サツカロミセス属の他の種間の区別は必ずしも
明確になされていない、これら種の多くはＳ．セレビシ
エと異種交配が可能であり、Ｓ。

セレビシェ内のプロモーターと類似あるいは同一のプロ
モーターを持っているようである。

それ故１本分野の熟練者にとって、プレＳ２＋Ｓポリペ
プチドの発現のための宿主の選択は、カルスベルゲンシ
Ｘ　（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、ヂアスタチカ
ス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、エロンギスボラス　（
ｅｌｏ　　１ｓｐｏｒｕｓ）、クルイベリ（４）、モン
タナス（ｍｏｎｔａｎｕｓ）、ノルベンシス（ｎｏｒｂ
ｅｎｓｉｓ）、オビフオルミス（ｏｖｉｆｏｒ　ｍ　ｉ
ｓ）　、　　ルキシ（ｒｏｕｘｉｉ）、およびウバルム
（ｕｖａｒｕ　ｍ　）を含むが、それに限定されないサ
ツカロミセス属の他の種にまで広げられることは自明で
ある。

カンヂダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅ
−ｎｕｌａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）および　トルロ
プシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）のようないくつかの属
は、生育のための唯一炭素源としてメタノールを利用す
るための同様な代謝経路を含むことが示されている。こ
の代謝系に関与している酵素であるアルコール　オキシ
ダーゼの遺伝子がピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ）から単離されている。該Ｐ、パストリ
ス　アルコール　オキシダーゼ　プロモーターが単離さ
れ５発現がメタノールによる誘導に感受性であることが
示されている。このような誘導可能なプロモーターは酵
母内でのポリペプチドの発現において有用である。特に
、このプロモーターはプラスミド上において、Ｐ、パス
トリス中で粒状でＳドメインを誘導発現するのに活性で
あることが示されている。この観察結果は、組換え体Ｄ
ＮＡ−介在性のポリペプチドの発現が免疫的に活性な形
でなされるための宿主として他の酵母属が機能する能力
があることを明らかにしている。それ故。

本分野の熟練者にとって、プレＳ２＋Ｓの発現における
宿主株の選択がサツカロミセスおよびクリプトコツカス
科から、カンヂダ、ハンセヌラ、クルイベロミセス（に
ｌｕｙｖｅｒｏ−ｍ　ｙｃｅｓ）、ピキア、サツカロミ
セオプシス（Ｓａｅｃｈａｒｏｍ　ｃｅｏ　５ｉｓ）お
よびトルロプシスを含むがそれに限定されない他の酵母
属にまで広げられることは自明である。

以下の実施例は本発明を説明するが、それだけに限定す
るものではない。以下の実施例中に指摘されている各文
献の開示はここに参考として取り入れられている。

実施例　Ｉ ＢＲ３２２中へのＨＢＶ　　ＤＮＡのクロニング ＨＢＶゾーン粒子（血清型ａｄｗ）がヒト血漿（キャリ
ア）から単離され精製され、２本鎖ＤＮＡがランダース
（Ｌａｎｄｅｒｓ）ほか［ジャーナル　オブ　ピロロジ
ー、第２３巻、３６８−３７６頁（１９７７）］および
ルスカ（Ｈｒｕｓｋａ）ほか［ジャーナル　オブ　ピロ
ロジー、第２１巻、（１９７７年）］の方法に従ってゾ
ーン粒子中の内在性ポリメラーゼにより合成された。Ｓ
ＤＳ中でのプロテイナーゼＫによる消化に続くフェノー
ル／クロロフォルム抽出およびエタノール沈澱によって
ＤＮＡが単離された。該ＨＢＶゲノム性ＤＮＡはＥｃｏ
ＲＩで消化され３．２ｋｂＰ断片を生じ、これがｐＢＲ
３２２のＥｃｏＲＩ部位にクローン化されてｐＨＢＶ／
ＡＤＷ−１（図１）を形成した。ＨＢＶ　　ＤＮＡの存
在はＥ　ｃ　ｏ　ＲＩによる消化、ニトロセルロースへ
のサザーン転移および［”Ｐｌ−標識特異オリゴヌクレ
オチドプローブとのハイブリダイゼーション（雑種形成
）により確認された。

実施例　■ 図１に示されるように、プラスミドｐＨＢＶ／ＡＤＷ−
１（実施例Ｉ中に記載）がＥｃｏＲＩおよびＡ　ｃ　ｃ
　Ｉにより消化され、０．８ｋｂｐ断片が調製用ゲル電
気泳動により精製された。

プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの５′部分を再構築するために
、ＡＴＧの上流Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ部位から１０ｂｐ　　
ＮＴＬのＨｉｎｄｍ末端までのＯＲＦを再構成する１対
のオリゴヌクレオチドが合成された。このオリゴヌクレ
オチドの配列は： ＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡ
ＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＴＡＡであ
る。

ブレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの３′部分を再構成するために
、ＡｃｃＩ部位から翻訳ターミネータ−のＨｉ　ｎ　ｄ
　ｍ末端までのＯＲＦを再構成する第２のオリゴヌクレ
オチド対が合成された。このオリゴヌクレオチドの配列
は：ＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡ ＴＧＴＡＡＡＴＴＴＣＧＡ である。

ｐＢＲ３２２中にＧＡＰ４９１プロモーター［ホランド
（Ｈｏｌｌａｎｄ）ほか、ジャーナルオブ　バイオロジ
カル　ケミストリー、第２５５巻、２５９６頁（１９８
０年）］およびＡＤＨ１転写ターミネータ−を含むプラ
スミドｐＧＡＰ−ｔＡＤＨ−２（図１参照）はユニーク
なＨｉｎｄｍ部位を有し、そこに上述のブレＳ２＋Ｓ　
　ＯＲＦが連結され、ｐＥＧｐｒｅｓ２ｓ−１（図１）
を生成した。ＨＢＶＤＮＡの存在および方向性は制限エ
ンドヌクレアーゼ解析およびサザーンプロット転移によ
り確かめられた。ブレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦを含む発現カ
セットは、ｐＥＧｐｒｅＳ２＋Ｓ−１からΣｄＩ消化に
より除かれ、調製用アガロース　ゲル電気泳動により単
離された。

該カセットは、次いで、前もって５ｐｈＩで消化された
シャトル　ベクターｐ　Ｃ１／　１（ベグス（Ｂ　ｅｇ
ｇｓ）　、前出；ロゼンパーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）
ほか、前出）中にクローン化され、酵母発現ベクター（
ｐＹＧｐｒｅＳ２Ｓ−１）を創出しこれは以下に記載す
るようにＳ．セレビシエを形質転換するのに用いられた
。

得られた発現カセットを含むプラスミドｐＹＧｐｒｅＳ
２Ｓ−１（上記実施例■より）が、以下のように造られ
たＳ．セレビシエＣＦ４２株（ＭＡＴａ／　ａ、　ａ　
ｄ　ａ　１−１ｌｓｕ２−０４−１ｕ　ｒ　ａ　３−）
を形質転換するのに用いられた： 酵母２１５９−２−３株（Ｌ、ハートウェル（Ｈａｒｔ
　ｗ　ａｌｌ）、ワシントン大学）のｕｒａ３変異株が
選択された（ボークはか、前出）。

得られた株（ＭＡＴ　ａ　、　ａ　ｄ　ｅ−１ｌｅｕ２
−０４−１ｕｒａ３−１ｃｉｒ”）がプラスミドＹＣｐ
５０−ＨＯ［ジエンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）ほか、プロシ
ーヂングス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　
サイエンセズ　米国。

第８０巻、３０３５−３０３９頁（１９８３年）］で形
質転換することにより２倍体化された。２倍体株はプラ
スミドをキュア（喪失）され、ＣＦ２　（ＭＡＴａ／ａ
、ａｄａ−１ｅｕ２−０４−９ｕ　ｒ　ａ　３−）と命
名された。

形質転換されたクローン（ｐ　Ｆ４０３）が選択され、
以下に記載するような評価のために凍結保存株（１７％
グリセロール中）として確立された。

大蓋■−立 生　とグリコシル化に関する“　生型″の酵　中でのブ
レＳ２＋Ｓ’伝子の 実施例■で記載された発現プラスミド゛を含む酵母のｐ
Ｆ４０３クローンが１ｅｕ−寒天平板上に撒かれ３０℃
で２−３日インキュベートされたにれら酵母は５−７ｍ
Ｌの複合ＹＥＨＤ培地中に植えられ、３０℃で通気下１
２−１８時間インキュベートされた。５０ｍＬの複合Ｙ
ＥＨＤ培地を含むフラスコに上記培養をＡ　”。が０．
１に植え、最終Ａ　Ｇ　＠　ｌ′が１０−１６になるま
で３０℃で振どう（３５０ｐｐｍ）Ｌ、つつ４８−７２
時間インキュベートした。ＩＯＡ”’単位の３試料が管
中に分は取られ酵母細胞が２０００ｘｇ、１０分でペレ
ットとされた。該ベレットは直接検定されるかまたは、
以下の実施例■、■、■およびＸ中に記載されたグリコ
シル化を調節されたクローンの評価における内部対照標
準（これらの比較のために　ｐＦ４０３クローンの値が
１．０と標準化された）として将来利用するために一７
０℃で貯蔵された。検定の際には、該ペレットは２ｍＭ
　　ＰＭＳＦを含む０．４ｍＬの燐酸緩衝生理食塩水中
に再懸濁された。酵母細胞は：　１）２００−３００ｍ
ｇの洗浄ガラスピーズ（０，４５ｍｍ）の添加、２”）
ポルテックスミキサー上で１５分間撹拌、３）ＴＸ−１
００を０．５％（ｖ　／　ｖ　）に添加、４）ポルテッ
クス上で２分撹拌、そして５）４℃で１０分間インキュ
ベートすることにより破壊された。細胞破片およびガラ
スピーズは、２０００Ｘｇ、１０分間の遠心により除か
れた。清澄化された上清かとられ。

蛋白［ローリ−（Ｌｏνｒｙ）ほか、ジャーナルオブ　
バイオロジカル　ケミストリー、第１９３撒き、２６５
頁（１９５１年）の方法によりコおよびプレＳ２＋Ｓに
特異的なＲＩＡ［ハンソンほか、前出、マチダほか、前
出］について検定された。

＋　　ｍｎｎ９　　　　　　でのプレＳ２＋Ｓのり正（
ΩＵ 上述の実施例■で得られた発現カセットをプラスミド（
ｐ　ＹＧ　ｐｒｅ　Ｓ　２　Ｓ　−１）が、以下のよう
に構築されたＳ．セレビシエＫＹＨ−１０７（ｃｉｒ”
）を形質転換するのに用いられた。

α接合型株ＣＺ５／ＬＢ３４７−ＩＣ （ｍｎｎ９−１ＳＵＣＺ−）を、ａ型株２１５０−２−
３　（ｌｅｕ−ａｄｅ−）とＹＥＨＤ完全培地平板上で
混合することにより接合させた。２倍体を選択するため
に２％蔗糖を唯一炭素源として含む１ｅｕ−最少培地上
にレプリカした。単一集落を分離した後、２倍体は胞子
形成させ、子のう胞子を標準的な方法により分離した。

ＫＨＹ−１０７株は単一胞子として分離され、ｃｉｒ”
、ａｄｓ＋　ｌｅｕそしてｍｎｎ９”’（シフ染色技術
による）と性格づけされた。

クローンは最少培地（ｌｅｕ−および１Ｍソルビトール
を含む）上で選択され、凍結保存株（１７％グリセロー
ル中）として確立され、以下のように評価された。

実施例　■ 上述の実施例■中に記載された発現プラスミドが、ブロ
ーチ（Ｂ　ｒｏａｃｈ）　［“メソッズイン　エンザイ
モロジー″第１０１巻、バートＣ１３０７−３２５頁（
１９８３年）］により記載されたようにしてＫＨＹ１０
７（Ｃｉｒ”）株から得られたＳ．セレビシエＫＹＨ１
０７（Ｃｉ　ｒ”　）株を形質転換するのに用いられた
。クローンが選択され、上記実施例Ｖに記載されたよう
に凍結保存株として確立され、以下の実施例■に記載さ
れるようにプレＳ２＋３の発現に関する評価が行われた
。

のプレＳ２＋Ｓ’伝子の 実施例Ｖ中に記載された発現プラスミドを含む酵母クロ
ーンは、１Ｍソルビトールを含む１ｅｕ−選択寒天平板
上に撒かれ３０℃で２−３日インキニベートされた。こ
れら酵母は、５−７ｍＬの複合ＹＥＨＤＳ培地に植えら
れ３０℃で通気下１２−１８時間インキュベートされた
。５０ｍＬのＴＥＨＤＳ培地を含むフラスコに上記培養
が植えられ（初期Ａ′。’＝０．１になるよう）、３０
℃で振どう（３５０ｐｐｍ）　シつつ４８−７２時間イ
ンキュベートされ最終Ａ　６　＠　＠が１０−１６に達
した。１０　　Ａ”’単位の試料が管中に分は取られ、
酵母細胞は２０００ｘｇ、１０分でペレットとされた。

試料は実施例■中で記載されたように直接検定されるか
、−７０℃で凍結保存された。細胞破片およびガラスピ
ーズは、２０００ｘｇ　　１０分の遠心により除かれた
。

清澄化された上清が取られ、以前に記載されたように蛋
白およびプレＳ２＋Ｓに特異的なＲＩＡにつき検定され
た。

５クローンが平行して評価され、対照として１．０値に
標準化されたクローンｐＦ４０３からの等敗細胞ペレッ
トと比較された。５クローンの抗原生産性における典型
的な相対値は次のようであった： 相対的（１） クローン　　μブレＳ２＋Ｓ／ｍ１ ａ１．６ ｂｌ、４ Ｃ１，２ ｄ　　　　　　　１．５ ｅｌ、３ ｐＦ４０３　　　　　１．０ 相対的（１） ブレＳ２＋Ｓ単位／蛋白単位 ０．７ ０．２５ ０．５ ０．３ ０．２ １．０ （１）エリス（Ｅ　１ｌｉｓ）ほか、（１９８７年）“
ビールス性肝炎および肝臓疾患（ＶｉｒａｌＨｅｐａｔ
ｉｔ’ｉｓ　ａｎｄ　Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ”中
、Ａ。

ラッカーマン（Ｚ　ｕｃｋｅｒｍａｎ）編、ニューヨー
ク：アランＲ，リス（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ）社。

１０７９頁、およびニスケルン（Ｋｎｉｓｋｅｒｎ）ほ
か、（１９８８年）へバトロジー（Ｈｅｐａ−ｔｏｌｏ
ｇｙ）、第８巻、８２−８７頁。

家兎抗ＨＢ　ｓ　（ｐ　２４）またはプレＳ２ドメイン
に対するＭ　ｅ　Ａ　ｂでなされたイムノプロット解析
の結果、分子量約３４−ＫＤの単一主要種が検出された
。上述のクローン゛′ａ″以後クローン１４００７−２
３０−ＩＡと参照されるが、以後の開発に向けて選択さ
れた。

実施例■で記載された発現プラスミドを含む酵母クロー
ンが１Ｍソルビトールを含む１ｅｕ−選択寒天平板上に
撒かれ、３０℃で２−３日インキュベートされた。これ
ら酵母は５−７ｍＬのＹＥＨＤＳ培地に植えられ３０℃
通気下１２−１８時間インキュベートされた。５０ｍＬ
の複合ＹＥＨＤＳ培地を含むフラスコに上記培養が植え
られ（初期Ａ　Ｇ　ＯＳ＝０．１になるように）、３０
℃で振どう（３５０ｒｐｍ）しつつ４８−７２時間、最
終Ａ６００が１０−１６になるまでインキュベートされ
た。１０Ａ″００単位の３試料が管中に分は取られ、酵
母細胞は２０００ｘｇ、１０分でペレットにされた。試
料は、前記のように直接検定するか、−７０℃で凍結保
存された。細胞破片およびガラスピーズは２０００ｘｇ
、１０分の遠心により除かれた。清澄化された上清がと
られ、蛋白およびプレＳ２＋Ｓ抗原について以前に記載
されたように検定された。

５クローンが平行して評価され、対照として１．０値に
標準化されたクローンＰＦ４０３（上記実施例■参照）
と比較された。５クローンについての抗原生産性の典型
的な相対値は以下のようであった： 相対的東　　　　　　　相対釣車 クローン　　ｉ　Ｌ／Ｓ２＋Ｓ／Ｉｌｌ　　プレＳ２＋
Ｓ　　位／　　単位ａ　　　　　　　２．１　　　　　
　　　　　　１．２ｂ　　　　　　　１．７　　　　　
　　　　　　　１．１ｃ　　　　　　　１．６５　　　
　　　　　　　　１．０ｄ　　　　　　　２．０　　　
　　　　　　　　　１．２ｓ　　　　　　　　２．０　
　　　　　　　　　　　１．ＩＰＦ４０３　　　　１．
０　　　　　　　　　　１，０１４００７−２３０−Ｉ
Ａ　　　１．８　　　　　　　　　　１．０（実施例■
より） 傘　実施例■参照 イムノプロット解析（実施例■参照）の結果、分子量約
３４ｋＤの単一主要バンドが検出された。上記クローン
“ａ”、以後クローン１４００７−２８４−ＬＡと参照
されるが。

以後の開発に向けて選択された。

立１炙 １４００７−２３０−ＬＡ凍結保存培養（上記実施例■
）が、１Ｍソルビトールを含む１ｅｕ−平板上に植えら
れた。該平板は逆さまにして２８℃、２−３日インキュ
ベートされた。タネ培養は、上述の実施例■に記載され
たように確立されるか、平板上の菌体がＹＥＨＤＳ培地
に懸濁され、懸濁された菌体は５００　ｍ　ＬのＹＥＨ
ＤＳを含む２−Ｌエルシンマイヤーフラスコ中に移され
た。該フラスコは２８℃、３５０ｒｐｍで調節された環
境のシェーカー用インキュベーター中で１８−２２時間
インキュベートされた。

タネフラスコからの植苗（５％（ｖ／ｖ）Ｎｔ。

各５０−　ｍ　Ｌまたは５００ｍＬのＹＥＨＤＳを含む
２５０−■Ｌまたは２−Ｌフラスコ中へ移された。該生
産用フラスコは次いで上述のように４０−４６時間イン
キュベートされた。

吸光度８．０　Ａ″ａｏａｏ単位的に得られた。

該上清が移され、細胞ペレットが５０−１００　ｍ　Ｌ
の緩衝化塩溶液に再懸濁された。

２０％洗浄菌体スラリーの０．６ｍＬ量が１．５ｍＬエ
ッペンドルフ管中でガラスピーズを用いて破壊された。

ＰＭＳＦ（２００ｍＭ貯蔵溶液６．５μＱ）がプロテア
ーゼ阻害剤として添加された。破壊後一部が管からとら
れ、イムノプロット解析のために一７０℃で凍結された
。管中の残った試料にトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　
−１００が終濃度０．５％に添加され、短時間混合され
、４℃で２０−４０分インキュベートされた。細胞破片
は遠心により除かれ、清澄化された細胞抽出物はプレ５
ＲＩＡおよびローリ−蛋白について検定された。

得られた典型的な値は、１５．６５　　μｇプレＳ２＋
Ｓ／ｍＬ培養液およびＱ　、　Ｑ　４　ｍ　ｇプレＳ　
２　＋　Ｓ　／　ｍ　ｇ全蛋白であった。

実施例　Ｘ １４００７−２３０−ＩＡ凍結保存培養が１Ｍソルビト
ールを含む１ａｕ−平板上に植えられた。該平板は逆さ
まにして２８℃、２−３日インキュベートされた。平板
上の菌体はＹＥＨＤＳ中に再懸濁され、再懸濁菌体は５
００　ｍ　ＬのＹＥＨＤＳを含む２−Ｌのエルシンマイ
ヤーフラスコ中に移された。該フラスコは２８℃、３５
０ｐｐｍで調節された環境の振どう機インキュベーター
中１８−２２時間インキュベートされた。これらタネ培
養は次いで生産段階容器に植えられた。

１またはそれいしようのフラスコからのタネ（ｉｎｏｃ
ｕｌｕｍ）　（１−５％ｖ　／　ｖ　）が、各１０−り
または２００−ＬのＹＥＨＤＳを含む１６−Ｌまたは２
５０−Ｌ醗酵槽中に移された。該１６−Ｌ醗酵層は５０
０ｒｐｍ、５Ｌ／分空気、そして２８℃で運転された。

該２５０−Ｌ醗酵層は、１６０ＲＰＭ、６０Ｌ／分空気
、そして２８℃で運転された。ＷＡ酵層は、タネ培養を
植えた後４０−４６時間で収穫された。吸光度値１５．
ＯＡ””単位が典型的に得られた。収穫はホロラフアイ
バー濾過装置を用いた細胞の濃縮に続く、緩衝化塩溶液
中での細胞の洗浄からなった。細胞スラリーは以下に記
載されるように検定されるか。

以後の工程および解析のために一７０℃で凍結保存され
た。

少量（０，６ｍＬ）の２０％洗浄細胞スラリーが１．５
−ｍＬエッペンドルフ管中でガラスピーズ（０，４５−
０，５２ｍｍ）を用いて破壊された。ＰＭＳＦ　（２０
０ｍＭ貯蔵溶液６．５μＱ）がプロテアーゼ阻害剤とし
て添加された。破壊の後一部が管から取られ、イムノプ
ロット解析のために一７０℃で凍結された。管中の残り
の試料にトライトンＸ−１００が終濃度０．５％に添加
され、短時間混合され４℃で２０−４０分インキュベー
トされた。細胞破片は遠心で除かれ、清澄化された上清
はプレＳ　　ＲＩＡおよびローリ−蛋白について検定さ
れた。抗原生産性の平均値は、８．４　／Ａ　ｇプレＳ
　２　＋　Ｓ　／　ｍ　Ｌ醗酵液および０．０２５ｍｇ
プレＳ２＋Ｓ／＋ｍｇ全蛋白ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＡＧＣＴ
ＴＡ　ＣＡＡ　ＡＡＣＡＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ
　ＣＡＡ　ＴＣＣであった。

ＧＴ　ＴＣＧ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＴＡ
ＣＧＴＣＡＣＣＧＴＴ　ＡＧＧＡＣＴ　ＧＣＣＴＴＣＣ
ＡＣＣＡＡ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡＧＴＧＡ　ＣＧＧ　
ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＧＴＴ　ＣＧＡ　ＧＡＣＧＴＣＣＴＡ
Ｇ本構築の出発材料となったプレＳ　２＋５ＯＲＦは上
述の実施例■中に含まれており、図１に同定されている
。プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの５′部分を再構築するため
に、ＡＴＧから１０　　ｂｐ　　ＮＴＬ　　Ｈｉｎｄｍ
部位の上流にあるＢ　ａ　ｍ　ＨＩからＥ　ｃ　ｏ　Ｒ
Ｉ適合末端までのＯＲＦを再構成するオリゴヌクレオチ
ド対が合成された。ＡからＣへの交換（塩基３１位）お
よびＴからＣへの交換（塩基３３位）を含み、プレＳ２
ドメインの４位でＡｓｎからＧｉｎへのアミノ酸変化を
もたらすことになるこのオリゴヌクレオチドの配列は：
である。

この合成オリゴヌクレオチドは前もってＥｃｏＲＩおよ
びＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化されたｐＵｃ１９中に連結さ
れた。出来たプラスミドはＢ　ａ　ｍ　ＨＩおよび５ａ
ｌＩで消化され、後に、前もってｐＵｃ１３ｐｒｅｓ２
ｓから精製された０、８　　ｋｂｐ　　ＢａｍＨＩから
５ａｌＩへの断片と連結され、プラスミドｐＵｃ１９ｐ
ｒｅｓ２ｓＡＧ１を生成するが、このプラスミドは、Ｈ
ｉ　ｎ　ｄ　ｍ断片として、第４位ａａのＡ　ｓ　ｎを
Ｇ　ｌ　ｎに置換したプレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦを含む（
図２参照）、このＯＲＦ　［これ以後プレＳ　２　Ｓ　
（Ｇｉｎ’）変異株と呼ばれるコは、上記実施例■に記
載されたものと類似に関する流儀で酵母発現ベクターを
造るのに用いられた。このプラスミドは上記実施例■中
に記載されたように酵母ＣＦ４２株を形質転換するのに
用いられた。クローンが選択され、実施例Ｖ中に記載さ
れたように凍結保存株として確立され、以下の実施個別
中に記載されたようにプレＳ２＋Ｓの発現が評価された
。

上記実施例■中で確立された組換え体プラスミドを含む
酵母クローンが、実施例■中に記載されるように抗原発
現が評価された。５クローンが平行して評価され、対照
として１．０値に標準化されたクローンｐＦ４０３（実
施例■参照）からの細胞ペレットと比較された。６クロ
ーンについての抗原生産性の典型的な値は： 相対的（１） クローン　　μブレＳ２＋Ｓ／ｍｌ ａ　　　　　　　１．Ｏ ｂ　　　　　　　Ｏ，７５ ｃ　　　　　　　１．１ ｄｌ、１ ｅ　　　　　　　Ｏ，９４ ｐＦ４０３　　　　　１．０ （１）実施例■参照 であった。

イムノプロット分析の結果、プレＳ　２＋Ｓ○ＲＦの非
グリコシル化翻訳産物について予想されるものと一致す
る分子置駒３ｌ−ｋＤを示す単一主要種を検出した。ク
ローンｄ、以後クローン１４５０１−３４−Ｃ１と参照
される、が以後の開発のために選択された。

−Ｘ−Ｔｈｒ）がＡ　ｓ　ｎ　−Ｘ　−Ａ　ｌ　ａに　
えられることによりグリコシル化が阻止されたこの構築
のための出発材料となったプレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦは、
上記実施例■中に記載されており図１中に同定されてい
る亜クローン（ｐＵｃ１３ｐｒｅｓ２ｓ）中に含まれて
いる。

該０．８ｋｂｐのＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ断片がｐＵｃ１３ｐ
　ｒｅｓ２ｓから分離され、ＥＣｏＲＩとＢ　ａ　ｍ　
ＨＩ部位が前もって破壊されているｐＵｃ１９ベクター
中に連結された。得られたベクターはＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ
およびＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化され、プレＳ２ドメイン
の＋６位のアミノ酸がＴｈｒからＡｌａに交換すること
になるＡからＧへの交換（オリゴヌクレオチドの＋７位
の塩基）を伴うＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでのプレＳ
２＋Ｓ外皮○ＲＦを再び造るようにデザインされた合成
オリゴヌクレオチドに連結された。

このオリゴヌクレオチドの配列は： ＾ＴＴ　ＴＣＣＧＣＴ　ＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡ　Ｇ
ＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡＡＧＧ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＡＡＧ　
ＧＴＧ　ＧＴＴ　ＣＧＡ　ＧＡＣＧＴＴ　ＣＴＡＧであ
る。

この構築は、プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦをプレＳ２ドメイ
ンの６位のアミノ酸ＴｈｒがＡｌａに置換したＨｉｎｄ
ｌｌｌ断片として含むプラスミドｐ　Ｕ　Ｃ１９ｐ　ｒ
　ｅ　Ｓ　２　＋　ＳΔＧ−２を創製することになる（
図２参照）、該ＯＲＦ　［以後ｐ　ｒｅ８２ｓ　（Ａｌ
　ａ＠）と参照する］は、上記実施例■中に記載された
のと類似に関する流儀で酵母発現ベクターを造るのに用
いられた。このプラスミドは上記実施例■中に記載され
た酵母ＣＦ４２株を形質転換するのに用いられた。クロ
ーンが選択され、実施例Ｖに記載されたように凍結保存
株として確立され、以下の実施例ＸＩＶ中に記載される
ようにプレＳ２＋Ｓの発現に関して評価された。

夫１外−人ｙ 生育とプレＳ　２　＋　Ｓ　　Ａ１．ａ’）変異ＯＲＦ
のＳ．セレビシエ中での 上記実施例Ｘ■中で確立された組換え体プラスミドを含
む酵母クローンが実施例■中に記載されたように抗原発
現に関して評価された。評価された３クローンの１つは
高レベルのプレＳ２＋Ｓポリペプチドの発現を与えた。

このクローンのｐＦ４０３　（１，０に標準化された）
に対する典型的な相対的抗原発現値は：　　１．３μｇ
プレＳ　２　＋　Ｓ　／　ｍ　Ｌおよび０．６単位プレ
Ｓ２＋Ｓ蛋白／単位全酵母蛋白であった。

イムノプロットの結果、プレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦの非グ
リコシル化翻訳産物に予想されるものと一致する分子置
駒３ｌ−ｋＤの単一種を検出した。

このクローン、以後１４５０１−３４−Ａｌと参照され
る、は以後の開発のために選択された。

るＮ−４グリコシル化の除 上記実施例■、■および■中に記載されたプラスミドで
形質転換された酵母から調製されたＢ型肝炎プレＳ２＋
Ｓ蛋白は、以下のように脱グリコシル化された： 抗原試料（イムノアフィニチーまたは疎水相互作用クロ
マトグラフィーにより精製された）は、０．５％　ＳＤ
Ｓおよび０．２Ｍ　β−メルカプトエタノール中で１０
０’Ｃ１５分の加熱、次いで水浴中で冷却することによ
り変性した。変性蛋白（Ｑ、ＳｍＬ中３００μｇ）に以
下のものを加えた：　ａ）Ｑ、２５ｍＬの１Ｍ燐酸ナト
リウム、ｐ　Ｈ８、６、ｂ　）　０　、１５ｍＬのメタ
ノール中　１，１０７エナントロリン　ハイドレートお
よび　ｃ）０．２５ｍＬの７．５％ＮＰ−４０Ｒ［ポリ
エチレン（９）オクタフェノール］、酵素的な脱グリコ
シル化は、上記混合物へ１０単位のＮ−グリカナーゼく
ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ、ペプチド−Ｎ’［Ｎ
−アセチル−β−グルコサミニル］アスパラギンアミダ
ーゼ）を添加することにより開始され、混合物は３７℃
で１２−２４時間インキュベートされた。対照実験は酵
素を添加しないことを除き同条件下で行われた。蛋白か
らのオリゴサツカライドの遊離は、銀染色で検出された
５ＤＳ−ＰＡＧＥ上での蛋白サブユニットの異なる移動
度により示された。イムノプロット分析も上記実施例■
に記載されたように行われた。このような５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥでの分析の結果、上記実施倒立およびＸＩＶ中に記
載された非グリコシル化種と同じ位置に移動する分子量
約３ｌ−ｋＤの単一主要種のみが示され、これはプレＳ
２＋Ｓ　　ＯＲＦのポリペプチド翻訳産物について予想
される分子量と一致するものであった。

実施例　ＸＶＩ 上記実施例■、■および■中に記載されたプラスミドで
形質転換した酵母から調製されたＢ型肝炎プレＳ２＋Ｓ
蛋白は、以下のように酵素的に処理された。抗原試料は
先ず、ローリ−蛋白４０μｇ　／　ｍ　Ｌを含む蛋白１
００μＱを０．４８μＱの１％ＳＤＳとともに沸騰水中
で１０分加熱することにより変性した。

加熱後、素材は氷上で冷却し、２０μＱを反応容器中に
いれ以下のものを添加した：　ａ）１５μＱの５０ｍＭ
燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，０、そして　ｂ）２５μ
ＱのエンドＨ（２０００ｍＵ／ｍＱ）、混合物は次いで
１６時間３７℃でインキュベートされた。対照はエンド
Ｈなしに同条件下で行われた。蛋白からのオリゴサツカ
ライドの遊離は、銀染色で検出された５ＤＳ−ＰＡＧＥ
上の蛋白サブユニットの異なる移動度により示された。

イムノプロット分析も、上記実施例■中に記載されるよ
うに行われた。このような５ＤＳ−ＰＡＧＥでの分析の
結果、上記実施倒立およびＸＩＶ中に記載された非グリ
コシル化種と同じ位置に移動する分子量約３１−ｋＤ単
一主要種のみが示され、これはプレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦ
のポリペプチド翻訳産物について予想される分子量と一
致するものであった。

実施例　Ｘ■ プレＳ２＋ＳポリペプチドのエンドＦによる消化 上記実施例■、■および■中に記載されたプラスミドで
形質転換した酵母から調製されたＢ型肝炎プレＳ２＋Ｓ
は以下のように酵素的に消化された： 該抗原試料は先ず、ローリ−蛋白で４０Ｍｇ／ｍＬを含
む１００μΩの蛋白を２．５μ込の１０％ＳＤＳおよび
０．７２５μＱのβ−メルカプトエタノール（１，４３
Ｍ）　とともに沸騰水浴中で３分加熱することにより変
成させた。抗原試料を冷却し、１０μＱを反応容器にい
れ以下のものを添加した：ａ）７μＱの０．４４Ｍ酢酸
ナトリウム、ｐＨ６，０゜ｂ）３μＱの１００　ｍ　Ｍ
　　１　、１０フエナントロリンハイドレート（メタノ
ール中）、Ｃ）５μＱの７．５％ＮＰ−４０，モしてｄ
）　５μ０のエンドＦ　（６０ｍＵ／ｍｌ）、この混合
物を次いで１６時間、３７℃でインキュベートした。対
照はエンドＦなしで同条件で行った。オリゴサツカライ
ドの遊離は実施例ｘ■およびＸＶＩ中に記載されたよう
に示された。

しかし、酵素処理の前後とも主要種の移動が約３４−ｋ
Ｄのところに示されたことから、エンドＦでの消化は明
瞭にはオリゴサツカライドを遊離させなかった。

実施例　Ｘ■ ＨＢ抗原のＭ　ｃ　Ａ　ｂ分析 以下に挙げた３種のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ試料が、ＨＢ　ｓ
　Ａ　ｇに対する５種の異なるＭ　ｃ　Ａ　ｂを用いて
分析された。１．２および３は２２ｎｍＨＢｓＡｇ粒子
の表面にあるａ構造エピトープ上の３部位を認識する。

Ｍ　ｃ　Ａ　ｂ　４および５はＨＢ　ｓ　Ａ　ｇのｄエ
ピトープを認識する（ＭｃＡｂ４はｄ上の配列を認識し
、そしてＭ　ｅ　Ａ　ｂ　５はｄの構造を認識する）。

この検定はｌｎｇの抗体を０．１−１゜Ｑｎｇに段階希
釈した抗原とインキュベートすることにより行われた。

室温で２時間のインキュベーションの後、結合しなかっ
た抗−ＨＢ　ｓ　　Ｍｅ　Ａ　））がＡＵＳＡＢ”検定
により検出された。分当りのカウントがＨＢｓＡｇｌ１
度として描かれ、傾斜から力価が求められた；標準ＨＢ
ｓＡｇ試料と比較すると相対的力価が計算される。

これら分析の結果は以下の表に示されている： ＨＢｓＡｇ（Ｓ）　　　　１．０　　１．０　　１．０
　　１．０　　　１．０プレＳ２＋Ｓ　　　　　Ｏ，１
０，４０，４０，６０，３（高度グリコシル化） プレＳ２＋Ｓ　　　　　Ｏ，６０，７０，９０，６０，
８（コアグリコシル化） ヌ１１四−ラ（Δ 非グリコシル化プレＳ２＋Ｓ　　Ｂ型肝　蛋１０匹のＢ
　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスが、段階希釈したミョウバ
ン吸着ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇまたはプレＳ２＋Ｓを腹腔内に
投与された。６週後に血清が抗−ＨＢｓ抗体（ＡＵＳＢ
Ｒ）および抗−プレＳ２抗体［ノイラス（Ｎｅｕｒａｔ
ｈ）、ジャーナルオブメヂ力ルビロロジー（Ｊ　、　Ｍ
ｅｄｉｃａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ）、第１７巻、１１９−
１．２５頁（１９８５年）］の存在について検定された
。

プレＳ２＋Ｓ試料の免疫原性を実証する典型的な実験の
結果を以下にまとめるニ ーＨＢｓ応答　　　　抗−プレＳ２応答陽性マウス　　
相乗平均　　陽性マウスＨＢｓＡｇ（Ｓ） ２．０ ０．６７ ０．２２ ０．０７ １０／１０ ９／１０ ５／１０ ０／１０ ０／１０ ０．２５ｍＩｃｇ　　Ｏ／１０ ０／１０　　＞２．Ｏｍｃｇ Ｏ／１０ プレＳ２＋３　　２．０ （コア　　　０．６７ グリコシ　０．２２ ル化） プレＳ２＋Ｓ　　　Ｏ，０７ 傘ＡＵＳＡＢ １０／１０　１２６０　　　　　１０／１０８／１０　
　３８６　　　　　１０／１０３／１０　　６４　０．
３４ｍｃｇ　　８／１０　０．１ｈ＋ｃｇ０／１０　　
２０　　　　　　１／１０タイター ４、図の簡単な説明 第１図はプレＳ２ドメイン中に“本来の″Ｎ−結合グリ
コシル化認識部位を持ったブレＳ２＋Ｓ発現ベクターで
あるｐＹＧｐｒｅｓ２Ｓ−１の調製方法を模式的に示す
。

第２図はプレＳ２＋Ｓ　　ＯＲＦと、プレＳ２配列ドメ
インの４位にある本来のＡ　ｓ　ｎをＧｌｎ（Ｇｌｎ４
変異）に変えるかプレＳ２ドメインの６位にあるＴｈｒ
をＡｌａ（Ａｌａ６変異）に変えることによりＮ−結合
グリコシル化認識部位を失わせた変異体のものとの比較
を模式的に示す。

ＰＲＥＳ２＋Ｓ （ＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣ
ＣＡＣＣＡＡ）（ＡＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＣＣＡＣ
ＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡ）（ＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡ
ＡＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡ）４Ｆ７ｙ
−結合オリゴサッカライト ＦＩＧ、　２ 手続補正書 （方式） （＋）別紙の通り 明細書１通を提出致します。

モ成１年１０月５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グリコシル化が限定されているか なくなっており、プレＳおよびＳ外皮蛋白の主要抗原部
   位を表示している、Ｓ蛋白ドメインの少なくとも一部と
   隣接して結合しているプレＳドメインの少なくとも一部
   を構成する、Ｂ型肝炎ビールス（ＨＢＶ）蛋白。 ２、プレＳドメインが、プレＳ１領域の 少なくとも一部を構成している請求項１記載のによる蛋
   白。 ３、プレＳドメインが、プレＳ２領域の 少なくとも一部を構成している請求項１記載のによる蛋
   白。 ４、プレＳ１ドメインの少なくとも一部 を付加的に含む請求項３記載の蛋白。 ５、蛋白がそのＤＮＡコード断片の組換 え体宿主中での発現により得られる請求項１記載の蛋白
   。 ６、ＨＢＶ蛋白の血清型特異性が￥ａｄｗ￥、￥ａｄｒ
   ￥、￥ａｙｗ￥、￥ａｙｒ￥、または￥ａｄｙｗ￥であ
   る請求項１記載の蛋白。 ７、血清反応性がＨＢＶ抗原性を反映し ている請求項１記載の蛋白。 ８、グリコシル化過程の遺伝子に欠損が ある宿主中でのポリペプチド発現により、ＨＢＶポリペ
   プチドのグリコシル化が限定されている請求項１記載の
   蛋白。 ９、ＨＢＶポリペプチドのグリコシル化 が１５糖残基以内に限定されている請求項８記載の蛋白
   。 １０、宿主細胞が、酵母種である請求項８ 記載の蛋白。 １１、酵母の種が、サッカロミセス （￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ￥）または
   クリプトコカス（￥Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ￥
   ）科に由来する請求項１０記載の蛋白。 １２、宿主のグリコシル化欠損が￥ｍｎｎ￥９遺伝子で
   ある請求項８記載の蛋白。 １３、組換え体細胞を正常なグリコシル化 を阻害する薬剤の存在下で生育させることにより￥ｉｎ
   ￥￥ｖｉｖｏ￥でのポリペプチドのグリコシル化が阻止
   される請求項１記載の蛋白。 １４、薬剤がツニカマイシンである請求項 １３記載の蛋白。 １５、Ｎ−結合グリコシル化のためのアミ ノ酸認識配列中の少なくとも１つのアミノ酸をコードす
   るＤＮＡコドンをグリコシル化の不可能なアミノ酸また
   はＮ−結合グリコシル化のためのアミノ酸認識配列の一
   部でないアミノ酸に変化させることによりポリペプチド
   のグリコシル化が失われた請求項１記載の蛋白。 １６、プレＳ２ドメインのＮ−結合グリコ シル化がプレＳ２ドメインの残基４−６にある認識配列
   の少なくとも１つのアミノ酸をグリコシル化の不可能な
   またはＮ−結合グリコシル化のアミノ酸認識配列の一部
   でないものに変換することによりプレＳ２ドメインのＮ
   −結合グリコシル化が失われた請求の範囲第１５項によ
   る蛋白。 １７、プレＳ２ドメインの４位のアミノ酸 がＡｓｎを除くアミノ酸である請求項１６記載の蛋白。 １８、４位のアミノ酸がＧｌｎである請求 項６記載の蛋白。 １９、６位のアミノ酸がＴｈｒまたはＳｅｒを除くアミ
   ノ酸である請求項１６記載の蛋白。 ２０、６位のアミノ酸がＡｌａである請求 項１６記載の蛋白。 ２１、プレＳ１ドメイン中の４−６位にあ るＮ−結合グリコシル化におけるグリコシル化認識配列
   のアミノ酸を変換することによりプレＳ１＋プレＳ２＋
   ＳペプチドのプレＳ１ドメインのＮ−結合グリコシル化
   が失われる請求項１５記載の蛋白。 ２２、Ｎ−結合グリカンの全部または一部 の化学的または酵素的除去により翻訳後にグリコシル化
   が最小にされるかまたは失われている請求項１記載の蛋
   白。 ２３、酵素がＮ−グルカナーゼ、エンドＤ、エンドＦ、
   エンドＨまたはグリコペプチダーゼＡである請求項２２
   記載の蛋白。 ２４、化学薬剤が無水トリフルオロメタン スルホン酸または無水弗化水素である請求項２２記載の
   蛋白。 ２５、少なくともプロモーター配列、Ｓド メインの全てまたは一部と結合しているＨＢＶプレＳド
   メインの少なくとも一部、および適当な転写終結配列を
   コードしているＯＲＦで、ＨＢＶ蛋白産物のＮ−結合グ
   リコシル化をなくす目的でＯＲＦ中のヌクレオチドが変
   換されているＯＲＦを構成している発現カセット。 ２６、ＤＮＡがＨＢＶプレＳ１＋プレＳ２ ＋Ｓポリペプチドをコードする請求項２５記載の発現カ
   セット。 ２７、ＤＮＡがＨＢＶプレＳ２＋Ｓポリペ プチドをコードしている請求項２５記載の発現カセット
   。 ２８、ＤＮＡがＨＢＶ抗原性を示すポリペ プチドをコードする請求項２５記載の発現カセット。 ２９、ＤＮＡによりコードされる血清型特 異性が￥ａｄｗ￥、￥ａｙｗ￥、￥ａｄｒ￥、￥ａｙｒ
   ￥、または￥ａｄｙｗ￥である請求項２５記載の発現カ
   セット。 ３０、プレＳ２ドメインの４位のアミノ酸 をコードするＤＮＡ配列がＡＡＴまたはＡＡＣでない請
   求項２５記載の発現カセット。 ３１、プレＳ２ドメインの４位のアミノ酸 をコードするＤＮＡ配列がＣＡＡまたはＣＡＧである請
   求項２５記載の発現カセット。 ３２、プレＳ２ドメインの６位のアミノ酸 をコードするＤＮＡ配列がＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＣＴ、Ａ
   ＣＣ、ＡＣＡまたはＡＣＧでない請求項２５記載の発現
   カセット。 ３３、プレＳ２ドメインの６位のアミノ酸 をコードするＤＮＡ配列がＧＣＴまたはＧＣＣまたはＧ
   ＣＡまたはＧＣＧである請求項 ２５記載の発現カセット。 ３４、プロモーターならびにターミネータ ー配列が酵母中で活性である請求項２５記載の発現カセ
   ット。 ３５、請求項２５による発現カセットを含 むサッカロミセスまたはクリプトコカス科から由来する
   酵母種の宿主細胞。 ３６、種がサッカロミセス属からのもので ある請求項２６記載の酵母種の宿主細胞。 ３７、種がサッカロミセスセレビシエで ある請求項３６記載の酵母種の宿主細胞。 ３８、宿主細胞種がグリコシル化ならびに マンノ蛋白生合成に必要な全ての酵素を生化学的に活性
   な形で含むＳ．セレビシエ株である請求項３７記載の酵
   母種宿主細胞。 ３９、株がＣＦ４２である請求項２７記載 の酵母種宿主細胞。 ４０、宿主細胞がグリコシル化過程におけ る酵素をコードする遺伝子または遺伝子群に欠損を含み
   、少なくともプロモーター、Ｓドメインの全てまたは一
   部に結合したＨＢＶプレＳドメインの全てまたは一部を
   コードするＯＲＦ、および適当な転写ターミネーター （訳註：終結信号）を構成する発現カセットを含んでい
   るサッカロミセスまたはクリプトコカス科から由来する
   酵母種宿主細胞。 ４１、欠損が￥ｍｎｎ￥９遺伝子にある請求項４０記載
   の酵母種宿主細胞。 ４２、株がＫＨＹ−１０７である請求項４１記載の酵母
   種。 ４３、ａ、サッカロミセスまたはクリプト コカス科からの種の株からの宿主細胞を請求項２５の発
   現カセットを含むＤＮＡで形質転換する。 ｂ、形質転換細胞を培養する、そして ｃ、生成した培養細胞または生育培地からポリペプチド
   を回収する。 ことからなるプレＳ２＋Ｓポリペプチドを得る方法。 ４４、宿主細胞がサッカロミセス属からの 種である請求項４３方法。 ４５、宿主細胞がＳ．セレビシエ種である 請求項４４記載の方法。 ４６、宿主細胞がＳ．セレビシエＣＦ４２ 株である請求項４５記載の方法。 ４７、ａ、宿主細胞がグリコシル化過程の 酵素をコードする遺伝子または遺伝子群に欠損を含むサ
   ッカロミセスまたはクリプトコカス科からの種の株から
   の宿主細胞を少なくともプロモーター配列、Ｓドメイン
   の全てまたは一部と結合したプレＳドメインの全てまた
   は一部をコードするＯＲＦ、および適当な転写ターミネ
   ーターからなる発現カセットを含むＤＮＡで形質転換す
   る、 ｂ、形質転換細胞を培養する、そして ｃ、生成した培養細胞または生育培地からポリペプチド
   を回収する。 ことからなるプレＳ２＋Ｓポリペプチドを得る方法。 ４８、宿主細胞が￥ｍｎｎ￥９遺伝子中に欠損を持つ請
   求項４７記載の方法。 ４９、宿主細胞がＳ．セレビシエＫＨＹ− １０７株である請求項４８記載の方法。 ５０、生理的に受容可能な希釈液中に請求 項１のポリペプチド含むワクチン。 ５１、請求項１のポリペプチドを含む診断 試薬。 ５２、感受性種の一員に請求項１のポリペ プチドにたいして作られた抗体を投与することからなる
   Ｂ型肝炎から受動的に保護する方法。