JPH02227093A - マウスリンパ球に対するモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規なモノクローナル抗体およびそれを産生
ずるハイブリドーマに関する・。詳しくは、マウスＢリ
ンパ球およびマウス胸腺において分化・成熟するＴリン
パ球以外のリンパ球亜群細胞上に発現する抗原を認識す
る抗体およびそれを産生ずるハイブリドーマに関する。

［従来の技術］ 哺乳動物の免疫系は、抗体を産生ずる８９２８球と細胞
性免疫を担うＴリンパ球の２群により構成されている。

これらのリンパ球は、造血系細胞と共通の幹細胞に由来
しており、その後、それぞれ異なった場での分化を経て
機能的なＴリンパ球あるいは８９２８球へと成熟する。

近年、細胞工学あるいは遺伝子工学の進展にともない、
これらのリンパ球の分化についての解析が進みつつある
。

特に、モノクローナル抗体作製技術の登場により、形態
学上区別することができなかった８９２８球とＴリンパ
球の区別はもとより、機能別Ｔリンパ球亜群０分類さえ
も可能となった。

Ｔリンパ球は、−次造血臓器（骨髄など）に由来し胸腺
内において分化ならびに一定の選別を経た後に末梢循環
プールへと放出されたリンパ球の総称である。しかし、
・最近生体内にはその細胞表面にＴ細胞抗原レセプター
を発現しているのにもかかわらず、胸腺を経ないで分化
・成熟し末梢に分布するリンパ球亜群が存在することが
ヌードマウスなどを用いた研究から明らかにされてきた
。

こうしたリンパ球亜群は非リンパ系臓器（肝、肺、皮膚
、腸など）に固有の分布を示すリンパ球であり、その大
部分が大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）の形態をとる。こうし
たリンパ球亜群の生体における役割については必ずしも
明らかにされているわけではないが、少なくともナチュ
ラルキラー（ＮＫ）活性で代表される細胞障害活性を有
していることから、生体の防御システムにおいて重要な
働きをしていると推測されている。このことから、この
リンパ球亜群についての研究は生体防御機構を解明する
上で重要と思われるが、これらのリンパ球亜群を有効に
カバーする血清学的マーカーが少ないことから、その細
胞学的遺伝学的実体については正確につかみきれていな
い。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、ナチュラルキラー活性などの細胞障害
活性を有するＬＧＬ細胞上に特異的に発現される抗原を
認識するモノクローナル抗体を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明のモノクローナル抗体は、好ましくはマウスＬＧ
Ｌ細胞株を免疫したラット牌細胞とマウスミエローマ細
胞を融合させることによって得られる。上記方法で得ら
れた抗体は、基本的にはラット・マウスのハイブリドー
マによって産生されるものではあるが、もちろん本発明
はこれらによって限定されるものではない。

本発明で用いるマウスＬＧＬ細胞株としては、マウス胎
児肝、牌、胸腺あるいはマウス成獣牌、骨髄胸腺、肝、
リンパ節といったリンパ・造血細胞由来のＬＧＬ細胞株
が挙げられるが、胎児肝細胞由来ＬＧＬ細胞株が好まし
く用いられる。なお、この免疫原として用いたマウス胎
児肝細胞由来ＬＧＬ細胞株は、通常以下の方法により再
現性良く樹立することができる。

マウス胎児肝細胞を無菌的に採取し、これをインターロ
イキン３（以下、ＩＬ３と略す）を最終濃度で０．１〜
１０００　Ｕ／ｍｌになるように含む培地にｌＸ１０５
〜ｌＸ１０Ｂ細胞／ｍｌになるように混ぜ、３７℃にて
炭酸ガス培養器で培養を開始する。培地としては、例え
ばダルベツコ、マツコイ、ハムあるいはＲＰＭＩ−１６
４０培地などの培地を用いることができる。このとき、
同時にあるいは培養開始後１〜１４日目に、これにイン
ターロイキン２（以下、ＩＬ２と略す）を最終濃度で１
〜１０００　Ｕ／ｍｌになるように加え培養を続ける。

培養を開始して細胞濃度が上昇してきたら、数日おきに
最終濃度が１０〜２００Ｕ／ｍｌのＩＬ２を加え２〜３
週間培養する。そのとき残っている細胞を遠心して集め
、再び先に述べた培地に混ぜ培養を続ける。その後、細
胞の増殖に従い培養をスケールアップする。こうして約
２〜３ケ月後培養を続けることによりＬＧＬ細胞株を得
ることができる。

免疫する細胞としては、ラット・マウスまたはハムスタ
ーなどの牌細胞が好ましく、またミエローマ細胞はラッ
トまたはマウスのものが好ましい。

牌細胞とミエローマ細胞株との融合にはセンダイウィル
スを用いた方法、電気的融合法（Ｅｌｅｃｔ。

ｒｉｃ　Ｆｕｓｉｏｎ）あるいはポリエチレングリコー
ルを用いる方法などが挙げられる。

得られた多数のラット・マウスハイブリドーマ細胞の中
で目的の抗体を産生ずるハイブリドーマを選択する方法
としては、細胞を抗原とした免疫酵素抗体法、ラジオイ
ムノアッセイ法あるいは免疫蛍光法（ｉｉｓｕｎｏｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｓｓａ
ｙ）が挙げられるが、本発明では免疫蛍光法が好ましく
用いられる。

まず免疫蛍光法による既知の手段を用いることにより、
免疫原であるマウス胎児肝由来ＬＧＬ細胞株と結合する
抗体を産生ずるハイブリドーマを選別する。次に、本抗
体の目的とする胸腺を経由しないで分化するＴリンパ球
亜群０反応する抗体を得るために、マウス胸腺細胞と牌
由来リンパ球を抗原として同様の免疫蛍光抗体法を行い
、マウス胸腺細胞には反応せず牌由来リンパ球の一部（
５〜３０％）と反、応するモノクローナル抗体の選別を
行った。この選別により２つのクローンが得られた。こ
のうち、安定した増殖性と抗体産生能を示したクローン
、Ｆ４を選出した。このクローンをさらに数次の限界希
釈法によってクローニングを行い、単一のクローンを得
た（Ｆ４−６Ｃ７：微工研菌界第１０２１８号）。この
クローンにより産生される本モノクローナル抗体、Ｆ４
−６Ｃ７は、アロタイプ決定キットによってラットＩｇ
Ｇ１クラスであり、プロティンＡ結合能を有しているこ
とがわかった。

本ハイブリドーマは通常の細胞培養法によって増殖させ
ることもできるし、ヌードマウスの腹腔にブリスタンを
注入した後に、ハイブリドーマを注入して腹腔内で増殖
させることもできる。モノクローナル抗体Ｆ４−６Ｃ７
は、例えばＩｇＧ（イムノグロブリンＧ）に結合活性を
もつプロティンＡを担持したセファロースカラムを用い
る観相性カラムクロマトグラ″フィーの手段で精製する
ことができる。

本発明の抗体Ｆ４−６Ｃ７が胸腺外で分化するリンパ球
亜群を認識することは、例えば以下のようなＴ細胞分化
抗原を認識する各種モノクローナル抗体を用いた２次元
免疫蛍光法セルソーターによって明らかにすることがで
きる。

マウスＴ細胞分化抗原としては、Ｔ細胞抗原レセプター
と随伴するＴ３、ヘルパーＴ細胞に発現されるＬ３Ｔ４
、サプレッサー／キラーＴ細胞に発現されるＬｙｔ２あ
るいはＴ細胞一般に発現されているＴｈｙｌ抗原などが
知られている。こうした抗原に対するモノクローナル抗
体と本発明の抗体Ｆ４−６０７を組合せ、リンパ・造血
組織由来の細胞の解析を行うと胸腺由来のリンパ球には
反応せず、胸腺以外のリンパ・造血系臓器由来のリンパ
球のうち上記のＴ細胞分化抗原を発現しているものと反
応することから、本発明の抗体Ｆ４−６Ｃ７は胸腺外で
分化するリンパ球亜群を認識することがわかる。

このリンパ球亜群に含まれる細胞の形態は、以下の方法
によって確認できる。まず、牌あるいはリンパ節といっ
たリンパ・造血組織由来の細胞をＦ４−６Ｃ７抗体を用
いて免疫蛍光法で標識した後、フローサイトメーターに
よりＦ４−６Ｃ７抗体で認識される抗原（以下、Ｆ４抗
原という）陽性細胞を分取する。しかる後、通常の染色
法により染色を行い、これを鏡検した。この結果、Ｆ４
抗原陽性細胞の形態はおおむねＬＧＬであった。

またＦ４抗原は、Ｆ４−６Ｃ７抗体を利用することによ
って最新の遺伝子工学的技術を応用して同定することが
できる。本発明者らは、このＦ４抗原をＢｒ１ａｎ　５
ｅｅｄ法（Ｂｒｉａｎ　５ｅｅｄ、　Ｎａｔｕｒｅ、　
３２９゜８４０−８４２　（１９８７）、　Ｂｒ１ａｎ
　５ｅｅｄら、Ｐｒｏｄ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４．８３６５−３３６９　（１
９８７））を利用して明らかにすることに成功した。そ
の結果、Ｆ４抗原はリンパ球表面抗原Ｌｙ−６Ｃである
ことが明らかとなった。

Ｌｙ−６抗原はマウスのリンパ球に見い出された表面抗
原であり、主としてＴリンパ球、ＮＫ細胞、単球などの
表面にホスファチジルイノシトールで細胞膜に錨を下し
た（ＰＩアンカリングタンパク質）形で存在する。Ｌｙ
−６はリンパ球の活性化に強く関与し、Ｌｙ−６に対す
るモノクローナル抗体は、ある場合には単純で、ある場
合には架橋などの処理を行うことによって、マウスリン
パ球の機能を活性化する。

一方、Ｌｙ−６抗原に対する抗原を用いたフローサイト
メーターによる解析では、例えばＭＲＬ／１ｐｒマウス
（ＭＲＬ／Ｍｐ−１ｐｒ／ｌｐρなどの自己免疫患モデ
ルマウスにおいて、Ｌｙ−６陽性細胞の数と細胞あたり
のＬｙ−６抗原の数が顕著に多くなっていることが知ら
れている。

マウスにおけるＬｙ−６抗原は数種からなるファミリー
を形成し、またマウスの遺伝的系列によって配列がわず
かに異なる亜型の存在が報告されている。ただし、それ
らの間の類似性（ホモロジー）はかなり大きい。

以上のことから、Ｌｙ−６はリンパ球活性化のメカニズ
ムの少なくとも１つに強く関与し、また自己免疫患にと
もなう現象として、Ｌｙ−６陽性細胞が多くなっている
ことがわかる。従って、Ｌｙ−６そのもの、およびそれ
の関与するリンパ球活性化のメカニズムをより詳しく研
究することは、リンパ球活性化を利用する抗ガン薬や抗
感染症薬の開発につながり、一方、Ｌｙ−６の機能を抑
制することによる免疫抑制薬の開発につながることが期
待できる。

従って本発明の抗体は、マス中での病態解明を含むリン
パ球活性化メカニズムの解明を目的とした研究にとって
極めて有用であり、このことはヒトの医薬品を最終目的
とする生物技術研究の進歩にも有用であることが期待で
きる。

一方、マウスＬｙ−６のファミリーの１種５ｃａ−１抗
原に対する抗体は、マウス血液幹胞を認識することに有
用であることがわかった。すなわち、マウスではＴｈｙ
−１ｏ”、Ｌ　ｉ　ｎ−１Ｓｃａ−１＋の細胞が血液幹
細胞を示すことが報告されている（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ
、　Ｇ、Ｊ、ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１８７．
１６７１−１６８３　（１９８ｇ　’）およびＳｐａｎ
ｇｒｕｄｅ、　Ｇ。

」、ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４１．５８−６２　（１
９８８）　）。

一方、５ｃａ−１はＬｙ−６Ａ、２であることが後に報
告されている（ｖａｎ　ｄｅ　Ｒｌｊｎ、　Ｍ、らＰｒ
。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　
８６．４６３４−４６３８（１９８９））ので、本発明
のＦ４−６Ｃ７抗体も他の抗体（Ｔｈｙ−１、Ｌ　ｉ　
ｎ）と組合せることによって、マウス血液幹細胞の同定
に有用であることが推定できる。

［実　施　例］ 以下に実施例および参考例を挙げて本発明をより具体的
に説明するが、本発明のモノクローナル抗体およびそれ
を産生ずるハイブリドーマの実質的な同機能体について
は当然本発明に含まれるものであり、本発明が以下の実
施例および参考例で限定されるものではない。

実施例１ マウス胎児肝細胞由来ＬＧＬ細胞株の樹立：胎齢１９日
口のマウスの胎児から肝臓を無菌的に摘出し、これを細
切して胎児肝細胞を得る。この胎児肝細胞を、１００Ｕ
／ｍｌマウス型組換えＩＬ　３　　［Ｆｕｎｇ　ＭＣ，
、ｅｔ　ａｌ　　Ｎａｔｕｒｅ　３０７．　２３３　（
１９８４）　：以下、ｒ−ｍＩＬ３と略す〕、１０％Ｆ
Ｃ３および５Ｘ１０−５Ｍ　　２−メルカプトエタノー
ル（２−ＭＥ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に１×１
０６細胞／ｍｌになるように混ぜ、３７℃にて炭酸ガス
培養器で培養を開始する。培養開始１日後に、これにヒ
ト型組換えＩＬ２　（以下、ｒ−ｈｌＬ２と略す）を最
終濃度で１００Ｕ／ｍｌになるように添加する。添加後
、１週間したら遠心操作により細胞を集め、再び先に述
べた培地（ｒ−ｍｌＬ３は含まない）に再懸濁し培養を
続けた。数日おきに最終濃度が５０Ｕ／ｍｌのｒ−ｈｌ
Ｌ２を加えていった。その後、細胞の増殖に従い培養を
スケールアップする。こうして約２〜３ケ月後培養を続
けることによりＬＧＬ細胞株（ＬＦＤ１９゜６）を得た
。

こうして樹立した細胞株はＩＬ２依存性の増殖を示し、
他のリンフ才力イン類（ＩＬ３、インターロイキン４、
ＧＭ−Ｃ８Ｆ）には反応しなかった。また、この細胞株
の細胞表面抗原を解析したところ、生体内に存在するＮ
ＫあるいはＬＡＫ活性を有したＬＧＬと同一であったが
、ＮＫ活性は認められなかった。

実施例２ マウス胎児肝細胞由来ＬＧＬ細胞株（ＬＦＤ１９゜６）
の培養： 実施例１で得られたＬＦＤ１９．６細胞を、最終濃度で
１００Ｕ／ｍｌのｒ−ｈｌＬ２．１０％ＦＣ８および５
Ｘ１０−５Ｍ　　２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ
）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。

実施例３ ラットの免疫と細胞融合： 実施例２で培養したＬＦＤ１９．６細胞をＰＢＳで洗っ
た後、２〜５Ｘ１０７の細胞を少量のＰＢＳで懸濁した
ものをフロイント完全アジュバントと完全に混和した。

この懸濁液を約３週齢のＬｅｗｉｓラットの腹腔内に注
射して免疫を行った。

この２ケ月後、今度は２〜５Ｘ１０７個のＬＦＤ１９．
６細胞を０．１％ホルマリンで４℃、２時間固定し、Ｐ
ＢＳで３回洗った後、少量のＰＢＳで懸濁しラットの腹
腔内に注射した。追加免疫の１′週間後、牌臓を摘出し
牌細胞を得た。

赤血球を破裂させる通常の処理を行った後、牌由来リン
パ球を、一般的なポリエチレングリコールを用いる手法
によってマウスミエローマ細胞株Ｐ　３　Ｕ　１　（Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　８１．１．
　（１９７ｇ）　）と融合させた。このハイブリドーマ
はＨＡＴ培地で選択し、ＨＴ培地で順化させた後、ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地に１０％ＦＣ８を含んだもので培養
した。こうして１８０クローンのハイブリドーマを得た
。

実施例４ スクリーニング： 実施例３で得られた１８０クローンの培養上清を免疫蛍
光抗体法により選別を行った。すなわち、各クローンの
培養上清を免疫原として用いたＬＦＤ１９．６細胞株と
反応させ、しかる後に蛍光標識した抗うットＩｇＧ抗体
をさせてから蛍光顕微鏡あるいはフローサイトメーター
を用いて、この細胞と反応する培養上清を産生ずるクロ
ーンを選んだ。こうして１８０種のクローンから４９種
のクローンを選出した。これらのクローンを９６ウエル
プレートから２４ウエルプレートに移した後、もう−度
上記の方法によりＬＦＤ１９．６細胞株と反応する３３
クローンを選出した。次にこれらのクローンの培養上清
を用い、今度はマウス胸腺細胞とは反応せず牌由来リン
パ球の一部と反応するものを同様の方法で選別し、２ク
ローンを得た。

この２クローンのうち安定してＬＦＤ１９．６細胞株と
反応するラットＩｇＧ１モノクローナル抗体Ｆ４を産生
ずるクローンを選択した。

実施例５ クローニング： 実施例４で得たモノクローナル抗体Ｆ４を産生するハイ
ブリドーマは、限界希釈法によりクローン化を行った。

つまりｌＸ１０７個／ｍｌに調整したラット胸腺細胞を
９６ウエルマイクロプレートに各ウェル１００μαずつ
まき゛、これに３〜１０個／ｍｌに調整したＦ４を各ウ
ェル１００μαずつ入れ、３７℃で１〜２週間培養する
。出現してきたコロニーの上清について実施例３と同様
のスクリーニングを行った。このクローニングを３回行
い、Ｆ４のサブクローンＦ４−６Ｃ７（微工研菌寄第１
０２１８号）を得た。

実施例６ モノクローナル抗体の生産と精製： 実施例５で得たＦ４−６Ｃ７を大全に得るために、Ｂ　
Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃヌードマウスの腹腔に注入した。

この注入は、ヌードマウスの腹腔にまずプリスタンを注
入し、その１週間後ｌＸ１０７個のＦ４−６Ｃ７を接種
した。

約２〜３週間後、接種したハイブリドーマの増殖により
ふくれたヌードマウスの腹腔から、１匹当り約２〜６ｍ
ｌの腹水を得た。この腹水からプロティンＡ−セファロ
ースビーズ（ファルマシア社）を用いたアフィニティー
クロマトグラフィーにより、本発明の抗体Ｆ４−６Ｃ７
を精製した。

実施例７ モノクローナル抗体の解析： 本発明の抗体Ｆ４−６Ｃ７がどういった細胞群を認識す
るか解析するために、各種のＬＧＬ細胞株およびマウス
の各臓器由来の細胞との反応性を免疫蛍光抗体法により
調べた。まず、ＬＧＬ細胞株あるいはマウスの各種臓器
由来のリンパ球を採取し、ｌＸ１０６個／サンプルに調
整し、これにビオチン化Ｆ４−６Ｃ７抗体を加え反応さ
せた。

Ｆ４−６Ｃ７抗体のビオチン化は、ＢＲＬ社のサクシミ
ドビオチンを用いＢＲＬ社のマニュアルに従って行った
。反応後、洗浄操作を行い非特異的な結合をしている抗
体を取り除き、これにアビジン化ＦＩＴＣを反応させた
後、細胞をフローサイトメーターにより解析した。結果
を表１および表２にまとめた。

以下余白 表１：各種ＬＧＬ細胞株に対する Ｆ４−６Ｃ７抗体の反応性 表２＝正常リンパ系組織における Ｆ４抗原の分布 実施例８ Ｆ４抗原陽性細胞の解析： 本発明の抗体Ｆ４−６Ｃ７がどのような細胞系列に属す
る細胞を認識するかということを解析するために、マウ
スの牌由来リンパ球を用いて既知のマウスリンパ球分化
抗原に対するモノクローナル抗体と組合せ２次元免疫蛍
光法を行った。まず、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの
牌細胞を採取し、通常の方法により赤血球破壊した後、
４Ｘ１０６／サンプルになるように調整する。これに抗
Ｔｈｙ１（マウスＩｇＭ）、抗Ｔ３（ハムスター１ｇＧ
）、抗Ｌ３Ｔ４　（ラットＩｇＧ）あるいは抗Ｌｙｔ２
（マウスＩｇＧ）抗体を加えた後、各々に対するＦＩＴ
Ｃラベル２次抗体を加え反応させる。次にビオチン化し
たＦ４−６Ｃ７抗体をこれに加え、さらにアビジン化フ
ィコエリスリン（ＰＥ）を用いて二重染色を行った。こ
の結果を第１図に示す。

また、Ｆ４陽性細胞の形態を調べるために上記の方法で
二重染色を行ったマウス牌由来リンパ球を用いて、フロ
ーサイトメーターにより陽性細胞の分取を行い、これを
ギムザ染色し鏡検した。この結果、Ｔ細胞分化抗原を発
現しているＦ４抗原陽性細胞はおおむねＬＧＬの形態を
していた。

実施例９ ＳＰ８２．４由来のｃＤＮＡライブラリーの作製：５Ｘ
１０８個の５Ｐ８２．４細胞から通常の方法により、ポ
リＡ”　ＲＮＡを調製した。２μｇのポリＡ”　ＲＮＡ
を用いてＢ、５ｅｅｄの方法（前述）によりｃＤＮＡラ
イブラリーを作製した。ライブラリーサイズはｌＸ１０
６であった。ここで用いたＣＤＭ８ベクターは動物細胞
で発現可能なものである。得られたｃＤＮＡライブラリ
ーのＤＮＡ（混合物）を通常の方法により大量調製し、
以下の実験に用いた。

実施例１０ パンニング法によるｃＤＮＡのクローニング：パンニン
グ法によるｃＤＮＡのクローニングは、Ｂ、５ｅｅｄの
方法（前述）に準じて行なった。

Ａ、抗体プレートの作製 実施例６で得られたＦ４−６Ｃ７抗体を５０１１１ｇＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ９，５で１０　ｍｇ／　ｍ
ｌなるように希釈した。この溶液を大腸菌用６ｃｍφシ
ャーレ（ファルコン社）あたり３ｍｌ加え、室温で１．
５時間静置した。１．５Ｍ　　ＮａＣ１で３回洗った後
、１■／ｍｌのＢＳＡ　（牛血清アルブミン）を含むＰ
ＢＳ溶液を３ｍｌ加え、−晩装置した。

溶液を吸い取り抗体プレートとした。保存は一８０℃で
行った。

Ｂ、パンニング ６Ｘ１０５個のＣｏ５１細胞を細胞用６ｃｍφシャーレ
（コーニング社）にまいた。培地は１０％血清と抗生物
質を含むダルベツコＭＥＭ　にラスイ社）を用いた。培
養はすべて５％ＣＯ２，３７℃のＣＯ２インキュベータ
ーで行った。翌日、培地を吸い取り通常のＤＥＡＥデキ
ストラン法により、実施例９で得られたｃＤＮＡをＣｏ
５１細胞に導入した。反応液組成は以下のとおりである
。

ｃＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　１〜５μｇ２０ｍ
ｇ／ｍｌＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−ｄｅｘｔｒａｎ　　　　３
０１１α１５０ｍＭ　　クロロキン　　　　　　　　１
μαダルベツコＭＥＭ　（含１０％Ｎｕ血清）１．５ｍ
１ ＤＥＡＥデキストランはファルマシア社、クロロキンは
シグマ社のものを使用した。Ｎｕ血清（コラボレイティ
プ　リサーチ社）は５６℃で３０分間加熱し、非動化し
たものを用いた。４時間培養後、反応液を吸い取り２＋
ｎｌの１０％ＤＭＳ　Ｏを含むＰＢＳ溶液を加えた。室
温で２分間静置した後、１０％血清を含むダルベツコＭ
ＥＭで１度洗い、あらたに５ｍｌの培地を加え２日間培
養した。

培地を吸い取り、０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡと０．０２％
のアザイドを含むＰＢＳ容器を２ｍｌ加え、３０分間静
置、細胞をはがした。パスツールピペットで細胞をよく
ほぐし、８００ｒｐｍ、４時間、４℃で遠心し細胞を集
めた。０．５ｍｌの５％血清、０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ
と０．０２％のアザイドを含む溶液を加え、細胞を懸濁
した。これを１００ミクロンのナイロンメツシュを通し
た後、Ａ項の抗体プレートに滴下した。抗体プレートに
は、先に２ｍｌの５％血清、０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡと
０．０２％のアザイドを含むＰＢＳ溶液を入れておいた
。

室温で１時間静置した後、非接着細胞を吸い取った。さ
らに、５％血清を含むＰＢＳ溶液で３回洗った。

Ｃ，ｌ１ｉｒｔ法によるプラスミドＤＮＡの回収前８項
で得たバンニングシャーレに、０．４ｍｌの０．６％Ｓ
ＤＳ、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ溶液を加え、室温で２０分
間静置し、接着細胞を可溶化した後、エッペンドルフチ
ューブに移した。これに、０゜１ｍｌの５Ｍ　　Ｎａｃ
ｌを加え撹拌した後、氷上に一晩静置した。１５０００
ｒｐｍで１０分間遠心し、上清中のプラスミドＤＮＡを
回収した。フェノール処理を２回繰り返し、余分なタン
パク質を取り除いた後、１０μｇの直鎖ポリアクリルア
ミド（ビスアクリルアミドなしでポリマー化したもの）
と２倍量のエタノールを加え、プラスミドＤＮＡを沈殿
させた。沈殿を１００μ０のＴＥ液（１０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣ３ｐＨ８，０，１ｍＭＥＤＴＡ％ｐＨ８，０
）を加えて溶解した後、１０μαの酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ５，２と３００μＵのエタノールを加え、ＤＮＡを沈
殿させ回収した。

沈殿を６０μαのＴＥ液に溶解した。このうちの２０μ
αを用いて、大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３株をＢ、５ｅｅ
ｄ方法（前述）により形質転換した。得られたコロニー
（複数）を混合して培養し、これから通常の方法で混合
物のＤＮＡを調製した。Ｂ項と０項を繰り返し、得られ
たコロニーからはコロニーごとに各々別々にＤＮＡを調
製し、Ｃｏ５１細胞に導入した。このうちで、Ｆ４−６
Ｃ７抗体と反応するＣｏ５１細胞が得られたＤＮＡクロ
ーンＮα９について続いて解析を行った。

実施例１１ Ｆ４−６Ｃ７抗体が認識する抗原とコードするＣＤＮＡ
の塩基配列の決定： 実施例１０で得られたクローＮＯ１９のｃＤＮＡについ
て、デオキシ−７−ジアザグアニントリホスフェートを
用いたジデオキシ法により配列解析を行った。得られた
塩基配列を第２図に示す。この配列と既知の塩基配列と
のホモロジーをＬＡＳＬデータバンクを用いて調べたと
ころ、マウスＬｙ−６ＣをコードするｃＤＮＡであるこ
とがわかった。

［発明の効果コ 本発明のモノクローナル抗体Ｆ４−６Ｃ７は、生体防御
反応において重要な役割を果たしていると考えられてい
るＮＫを有するＬＧＬを含む胸腺外で分化・成熟をとげ
るリンパ球亜群を認識することから、その実体が明らか
とはなっていないこのリンパ球亜群を詳細に解析する上
で非常に有用である。また、本抗体はマウスの細胞に対
するものであるが、この抗体の認識する抗原を解析する
ことによりヒトの細胞でも同様の抗原を見い出すことが
できれば、ヒトの系でもこのリンパ球亜群を解析するこ
とが可能となり、癌をはじめとする疾患の治療に役立つ
ことが期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例８の結果、すなわちマウス牌細胞をＦ
４−６Ｃ７抗体と各種Ｔ細胞分化抗原に対するモノクロ
ーナル抗体との組合せで２次元免疫蛍光法を行い、フロ
ーサイトメトリーにより解析した結果を示す。図中、ａ
）はＦ４−６Ｃ７抗体と抗Ｔｈｙｌ抗体との組合せを、
ｂ）はＦ４−６Ｃ７抗体と抗Ｔ３抗体との組合せを、Ｃ
）はＦ４−６０７抗体と抗Ｌ３Ｔ４抗体との組合せを、
ｄ）はＦ４−６Ｃ７抗体と抗Ｌｙｔ２抗体との組合せを
示し、各々Ｘ軸がＦ４−６Ｃ７抗体、Ｙ軸が他方の抗体
を表わす。 第２図は、Ｆ４−６Ｃ７抗体が認識する抗原をコードす
る塩基配列を示す。 １０　　　　　　２０　　　　　　３０　　　　　　４
０　　　　　　　Ｓｏ　　　　　　　６０ｃｃｒｒｃテ
ＣテＧ入　ＧＧＡ？ＧＧ入Ｃ入Ｇ　　’ｒＡｃＴｃＡｃ
ＧｃＴ　　ＡＣＡＡＡＧ？ＣＣＴ　　ＧＴ’ｌ’？ＧＣ
ＴＧ入Ｔ　’ｒｃ？Ｔｃ？ＴＧ？Ｇ特許出願人　　東　
し　株　式　会　社第２図 ■？７１ Ｃ） １ｉ’４ 第

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）マウスリンパ球に対するモノクローナル抗体であ
   って、マウスＢリンパ球およびマウス胸腺由来のＴリン
   パ球とは反応しないモノクローナル抗体。
2. （２）ナチュラルキラー活性を有する大顆粒リンパ球の
   細胞表面上に発現する抗原を認識する請求項（１）記載
   のモノクローナル抗体。
3. （３）抗原がマウスリンパ球表面抗原Ｌｙ−６である請
   求項（２）記載のモノクローナル抗体。
4. （４）請求項（１）〜（３）記載のモノクローナル抗体
   を産生するハイブリドーマ。