JPH02255098A - グアニジノ酢酸の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、尿又は血液等のグアニジノ酢酸含有試料中の
グアニジノ酢酸の定量法に関する。

グアニジノ酢酸はクレアチンの前駆物質であり、大部分
腎臓で生成されることが知られており、尿中に比較的多
量に排泄される物質で、腎臓の代謝機能が低下すると尿
中のグアニジノ酢酸量が減少する傾向が見られ、これを
臨床的に応用すれば腎臓障害の診断のための指標とする
ことかできる。

また、腎臓移植患者の尿及び血液中のグアニジノ酢酸量
を測定することによって、腎臓移植後の症状を観察する
ことができる。

従って尿中又は血液中のグアニジノ酢酸の定量を行なう
ことは、腎臓機能あるいは尿毒症等を診断する上で重要
な意義を有する。

従来、試料中のグアニジノ酢酸を定量する方法としては
、例えばグアニジノ酢酸をＮ−トリフルオルアセチル−
α−ブチルエステル誘導体としたのち、ガスクロマトグ
ラフィーで分析する方法（クリニカル・ケミストリー、
第２１巻、第８３８頁、１９７５年）；グアニジノ酢酸
を含有する試料から該グアニジノ酢酸をイオン交換クロ
マトグラフィーを用いて分画し、これを定量する方法（
最新医学３１巻９号、１６９５〜１７０６頁、昭和５１
年９月発行；バイオケミカル・メディンン第１０巻、第
８頁、１９７４年；ジャーナル・オブ・クロマトグラフ
ィー、第１６２巻、第３２７頁、１９７９年；同第２２
６巻、第４３頁、１９８１年）が知られているが、これ
らの方法は操作が非常に煩雑で、定量に時間を要し、ま
た大掛かりな装置を必要とし、更に定量費用が嵩む大き
な欠点を有する。

また、尿又は血液等の試料に予めウレアーゼを加えて該
試料中にすでに存在する尿素を分解消費せしめ、次いで
残存するウレアーゼな失活又は除去したのちグアニジノ
酢酸分解酵素を添加作用させ、新たに生成する尿素を比
色定量することにより、該試料中のグアニジノ酢酸を定
量する方法（酵素法；特開昭５９−２０６０００号）も
知られているが、この方法は簡便であるが、尿素の誘導
体も同時に比色定量されるため検体ブランクを取らねば
ならない不都合を有する。

そこで、本発明者等は、検体ブランクを取る必要もなく
、しかも迅速かつ正確なグアニジノ酢酸の定量法を開発
すべく鋭意検討を重ねた結果、ついに本発明を完成した
。

即ち、本発明は、グアニジノ酢酸を定量すべき試料に、
グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタール酸、還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイドホスフェー
ト、イソクエン酸、金属イオン、ウレアーゼ及びイソク
エン酸脱水素酵素を添加混合し、該試料中に既に存在す
るアンモニア及び尿素を消費せしめ、次いてキレート剤
を添加して該イソクエン酸脱水素酵素反応を停止し、こ
れと同時もしくはしかる後グアニジノ酢酸分解酵素を添
加作用させ、生成するアンモニアを測定することにより
該試料中のグアニジノ酢酸を定量することを特徴とする
グアニジノ酢酸の定量法である。

そして本発明によれば、極めて簡易な操作で迅速に、し
かも検体ブランクを取らずに精度良く試料中のグアニジ
ノ酢酸を定量することかできる。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明における反応の機構は、第１図に示す通りであっ
て、そもそも試料中に存在して測定誤差の要因となるア
ンモニアと、尿素をウレアーゼによって分解し生成した
アンモニアを、同時にグルタミン酸脱水素酵素（以下、
Ｇｌ　−ＤＨと略記する）によってα−ケトグルタール
酸（α−ＫＧ　）と反応させてグルタミン酸に変換スる
。

そして、このアンモニア→グルタミン酸の反応系には図
に示す如く還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
イドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）→ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオタイドホスフェー）（ＮＡＤＰ”）の変
化反応を伴うために、ＮＡＤＰ＋→ＮＡＤＰＨの逆反応
でＮＡＤＰ＋を連続的にＮＡＤＰＨに戻す必要があり、
この目的のためイソクエン酸を基質としてイソクエン酸
脱水素酵素（１ｃＤＨ）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２
＋）又ハマンガンイオン（Ｍｎ２”）等の金属イオンに
よって共役反応を生起させる。

式〔Ｉ〕に示すように試料中のアンモニアの消費と、尿
素を分解して得たアンモニアの消費は同じ共役反応によ
って行なうことがてきるのであるが、このように試料中
の測定誤差の要因となるアンモニアを予め消費させてお
くことは、次のステップである式〔■〕に示すように、
試料中のグアニジノ酢酸を分解して得たアンモニアの正
確す定量を行なうために重要である。

式［１１）に示すように、本発明では、アンモニアを予
め消費させた試料（グアニジノ酢酸含有）にグアニジノ
酢酸分解酵素（ＧＡＡＡＨ）を添加してグアニジノ酢酸
を分解し尿素を生じさせ、生じた尿素ニウレアーゼを作
用させてアンモニアヲ生成させ、このアンモニアをグル
タミン酸脱水素酵素（Ｇｌ・ＤＨ）によってα−ケトグ
ルタール酸（α−ＫＧ　）と反応させてグルタミン酸に
変換スる。この際アンモニアからグルタミン酸への共役
反応としてＮＡＤＰＨ−＋ＮＡＤＰ＋の反応が生ずるの
でＮＡＤＰＨが減少する。従って、該ＮＡＤＰＨの減少
に基づ＜３４０ｎｍ　　の吸光度の減少を測定すること
によりグアニジノ酢酸を定量することかできるが、この
とき、破線で示すようなＮＡＤＰ＋→ＮＡＤＰＨの反応
が停止していないと該ＮＡＤＰＨは再生されるため吸光
度の減少がなく、従ってグアニジノ酢酸の定量は行なえ
ない。

そこで、上記式ＣＩ）から式［１１）の反応に移行する
に際し、上記式（Ｉ〕におけるＮＡＤＰＨ＋ＮＡＤＰ＋
においてＮＡＤＰ＋→ＮＡＤＰＨの反応のみを停止させ
ることが重要で、その目的のためにエチレンジアミン四
酢酸及びその塩等のキレート剤の添加を行なう。

本発明のグアニジノ酢酸を定量すべき試料としては、グ
アニジノ酢酸を含有するものであれば、如何なるもので
も良く、例えば尿、血液、血清及び糞便等が挙げられる
。

そして、これらの試料のｐＨは無調整でも良いが、これ
を適宜なｐＨ調整剤、例えば塩酸、硫酸、硝酸、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム等によりｐＨ４〜１２、好
ましくはｐＨ６〜９に調整することが望ましい。

また、試料は、そのままあるいは水、緩衝液等で適宜な
濃度となる如く希釈して用いられる。

本発明に用いられる金属イオンとしては、マグネシウム
イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イ
オン、スズイオン、カルシウムイオン等が挙げられる。

また、キレート剤としては、ＥＤＴＡｌ又はその塩、１
．２−ビス（０−アミノフェノキン）エタン−Ｎ、Ｎ、
Ｎ’　、Ｎ’−四酢酸、又はその塩、トランス−１，２
シクロヘキサンジアミンＮ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−四酢酸
、又はその塩、ジヒドロキシエチルグリシン、又はその
塩、１，３−ジアミノプロパノ−ルーＮ、Ｎ、Ｎ’　、
Ｎ’−四酢酸、又はその塩、エチレンジアミンジオルト
ヒド０キシフエニル酢酸、又はその塩、エチレンジアミ
ンニ酢酸、又はその塩、エチレンジアミンニプロピオン
酸、又はその塩、ヒドロキシエチルエチレンシアミン三
酢酸、又はその塩、エチレンジアミンテトラキス（メチ
レンホスホン酸）、又はその塩、グリコールエーテルジ
アミン四酢酸、又はその塩、ヒドロキシェチルイミノニ
酢酸、又はそノ塩、イミノニ酢酸、又はその塩、ジアミ
ノプロパン四酢酸、又はその塩、ニトリロ三酢酸、又は
その塩、ニトリロ三プロピオン酸、又はその塩、ニトリ
ロトリス（メチレンホスホン酸）、又はその塩、トリエ
チレンテトラミン六酢酸、又はその塩等が挙げられる。

そして、反応系に対するキレート剤の濃度は５　ｍＭ以
上が好ましい。

次に、本発明において用いられるグアニジノ酢酸分解酵
素としては、微生物、動物、植物等、如何なる起源のも
のを用いても良く、例えばコリネバクテリウム（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）　　ｓｐ、　Ｎ−１９−
１（菌学的性質及びこの微生物により生産される酵素の
理化学的性質については特開昭６０−２０３１８９号「
グアニジノ酢酸分解酵素の製造法」に記載されている）
、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）　ｓ
ｐ。

Ｎ−１２−１（同上）及びシュードモナス・エスピー（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｓｐ、　）　　ＡＴＣＣ１
４６７６（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカ
ル・ケミストリー　４１巻、第９５９頁、１９７７年）
等が挙げられるが、特にコリネバクテリウム属及びアー
スロバクター属の細菌により生産されるグアニジノ酢酸
分解酵素が好ましい。

次に、本発明において、グアニジノ酢酸を定量すべぎ試
料に、グアニジノ酢酸分解酵素を作用させる際、該酵素
の添加量は、試料に含まれるグアニジノ酢酸量、酵素反
応条件等により適宜調整される。そして、該酵素を試料
に作用させる際の温度は８０°Ｃ以下、好ましくは２０
〜６０°Ｃであり、時間はグアニジノ酢酸を分解するの
に十分な時間、好ましくは５〜６０分酵素反応させるこ
とが好ましい。

次に本発明の利点を挙げると次の通りである。

本発明は、検体中にそもそも存在している高濃度の尿素
とアンモニアをあらかじめ完全に消去していること、ま
たキレート剤による１ＣＤＨ反応の停止しま、反応を停
止したままの媒質でＮＡＤＰＨ→ＮＡＤＰ＋の反応を用
いてグアニジノ酢酸を定量できる点できわめて有用であ
る。しかも検体ブランクを取る必要もなく、簡便、迅速
により正確にグアニジノ酢酸を定量することが可能にな
った。

また、本発明は、特に臨床医学における腎臓疾患の診断
等に利用することができ、臨床検査技術上価値の高いも
のである。

以下、実施例により本発明を具体的に示す。

実施例１ １、試薬の調製 （試薬１） トリエタノールアミ７　（ｐＨ８，５）　　２００　　
　ｍＭＭｇＣｂ　　　　　　　　　　　　　　　　０．
２　　ｍＭＮＡＤＰＨ０，３２ｍＭ ａ　−ＫＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２０　　　　ｍＭイソクエン酸　　　　　　　　
　　４０　　　ｍＭＧｌ−ＤＨ３０Ｕ　／　ｍｅ ＣＤＨ Ｕ　／　ｍｅ ウレアーゼ Ｕ　／　ｍｌ （試薬２） トリエタノールアミン（ｐＨ８，５）　　２００　　　
ｍＭＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　　６　　
　ｍＭＧＡＡＡＨ１０Ｕ　／　ｍ６ 以上のような組成を含有する試薬１及び試薬２を調製す
る。

尚、上記ＧＡＡＡＨは、コリネバクテリウムｓｐ。

Ｎ−１９−１の微生物を用い、特開昭６０−２０３１８
９号に記載された方法により調製して得たものである。

２、検量線の作成 グアニジノ酢酸を５０ｍｙ／ｄ７！　　になる様に溶解
した水溶液を希釈して様々な濃度に調整したグアニジノ
酢酸含有検体（０，５，１０，１５，２０，２５，３０
，３５，４０，４５、及び５０ｐｇ／ｄｌｌ　　）　　
１０１”それぞれに試薬１を１５０μβ添加し、３７°
Ｃに保温して１０分間反応させた。次いで、それぞれの
反応液に試薬２を１５０μｌ添加し、３７°Ｃに保温し
て１０分間反応させた後、ロッジ−社製自動分析装置（
Ｃ０ＢＡＳ　−ＦＡＲＡ　）により　３４０　ｎｍ　　
の吸収の減少量から検体中のグアニジノ酢酸を測定した
。グアニジノ酢酸量と希釈との相関図を第２図に示す。

これによって明らかなように、グアニジノ酢酸と希釈と
の間に−は直線的な相関があり、十分標準検量線として
使用できることが判明した。

３、尿中のグアニジノ酢酸の定量 任意に選んだ尿２３検体の１０μｌそれぞれに試薬１を
１５０μｌ添加し、３７°Ｃに保温して１０分間反応さ
せた。次いで、それぞれの反応液に試薬２を１５０μ４
添加し、３７°Ｃに保温して１０分間反応させた後、ロ
ッジ−社製自動分析装置（Ｃ０ＢＡＳ　−ＦＡＲＡ　）
により３４０　ｎｍ　　の吸収の減少量から検体中のグ
アニジノ酢酸を測定した。本発明と従来法（特開昭５９
−２０６０００号）との相関図を第３図に示す。これに
よって明らかなように、従来法との間に非常に高い相関
性が認められ、しかも検体中ｅこ存在している高濃度の
尿素とアンモニアの影響を全く受けず被検体中のグアニ
ジノ酢酸の定量が可能になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の反応の機構を示す図、第２図はグアニ
ジノ酢酸量と希釈との相関を示す標準検量線図、第３図
は本発明と従来法（特開昭５９−２０６０００号）で尿
検体中のグアニジノ酢酸量を測定した際の両方法の相関
図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）グアニジノ酢酸を定量すべき試料に、グルタミン
   酸脱水素酵素、α−ケトグルタール酸、還元型ニコチン
   アミドアデニンジヌクレオタイドホスフェート、イソク
   エン酸、金属イオン、ウレアーゼ及びイソクエン酸脱水
   素酵素を添加混合し、該試料中に既に存在するアンモニ
   ア及び尿素を消費せしめ、次いでキレート剤を添加して
   該イソクエン酸脱水素酵素反応を停止し、これと同時も
   しくはしかる後グアニジノ酢酸分解酵素を添加作用させ
   、生成するアンモニアを測定することにより該試料中の
   グアニジノ酢酸を定量することを特徴とするグアニジノ
   酢酸の定量法。
2. （２）グアニジノ酢酸分解酵素がコリネバクテリウム属
   又はアースロバクター属の細菌により生産されるグアニ
   ジノ酢酸分解酵素である特許請求の範囲第１項記載のグ
   アニジノ酢酸の定量法。
3. （３）グアニジノ酢酸を定量すべき試料が尿又は血液で
   ある特許請求の範囲第１項記載のグアニジノ酢酸の定量
   法。