JPH03151880A - アクアライシンｉをコードする遺伝子を含む発現ベクター及び該発現ベクターを含む高度好熱性グラム陰性細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、耐熱性蛋白質分解酵素であるアクアライシ
ンＩをコードする遺伝子を含む発現ベクター及びこの発
現ベクターで形質転換された高度好熱性グラム陰性細菌
に関する。

［従来の技術］ 蛋白質分解酵素は、洗剤用添加物、ペプチド合成の触媒
、バイオリアクター素子等利用範囲が広く極めて−ｉｌ
　１’な酵素である。アクアライシンＩは、高度好熱性
細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＹＴ−１に
よって生産され、安定性に優れ、至適ｐ■を１０付近に
持つ耐熱性のアルカリ性蛋白質分解酵素で、界面活性剤
にも強い耐性を有しており、洗剤添加物としてまたバイ
オリアクター素子としての利用等応用が期待される。

アクアライシンＩは、従来Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔ
ｉｃｕｓＹＴ−１の培養上清から分離することによって
生産されていたか、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ　ＹＴ−１はその培養温度が６５°Ｃと高いので雑菌
の混入はないが培養上清より精製するため培地中の不純
物が混入するという欠点を有する。さらに、　Ｔｈｅｒ
ｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＹＴ−１は、培養後期にア
クアライシン■を産生ずるためにアクアライシン■が分
解され生産量か減少するという欠点をも有しており、こ
れによりＴｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＹＴ−
１によるアクアライシンＩの連続生産が不可能になフて
いた。

［発明が解決しようとする問題点］ 従って１本発明の目的は、雑菌の混入のない高温で培養
できる高度好熱菌の系を用いて、成熟化のステップか必
要でなくかつアクアライシンＩの連続生産を可能にする
発現ベクター及び高度好熱性グラム陰性細菌を提供する
ことである。

ｃ問題点を解決するための手段］ 上記のような問題点を解決する方法として１本発明者ら
は、　ＴｈｅｒＩｌｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＹＴ−
１よりアクアライシン■の前駆体遺伝子を切り出し、大
腸菌用ベクターに組み込んで大ａ菌で発現させ前駆体の
形で生産し、その菌体を熱処理することによって前駆体
を成熟化すると共に大腸菌由来の蛋白質を除きアクアラ
イシンＩを得る方法を特願昭６３−２４３９８１号に開
示している。しかしながら、この方法は、（１）大腸菌
の膜画分（ペリプラズム）にアクアライシンＩ＃駆体の
大部分が産生蓄積されるため生産量に限りかある、（２
）雑菌の混入を防ぐためにアンピシリン等の添加が必須
であり、また１発現の誘導を行なうためにＩ　ＰＴＧの
添加か必要でありコストかかかる。（３）熱処理により
大腸菌が死滅してしまうために連続生産が不可能である
等の問題点がある。

一方、高度好熱菌の遺伝子操作による育種改良について
は、高度好熱菌に薬剤耐性プラスミドがない等の問題が
あり高度好熱菌用プラスミドベクターは開発されていな
かったが、栄養要求マーカーを持つ新規なプラスミドが
特願昭６３−１６３７７９に開示されるに至り、Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓＨＢ２７株の遺伝
子操作の可能性が示された。もっとも、このプラスミド
ベクターのクローニング部位等は明らかにはなっておら
ず、このプラスミドを発現ベクターを構築するために利
用するにはさらなる研究が必要である。

これらに鑑み、本発明者らは、鋭意研究の結果、アクア
ライシンＩの前駆体遺伝子をプロモーター領域、ＳＤ配
列及びテール領域を含む形で高度好熱菌プラスミドベク
ターに組み込み、高度好熱菌を形質転換させ雑菌の混入
の少ない高温下で培養すると、菌の成育に伴ってアクア
ライシン■前駆体が発現し同時に成熟化も起こり成熟化
したアクアライシン■が菌体外に分泌生産されることを
見出し１本発明を完成した。

すなわち、本発明は、高度好熱性グラム陰性菌中て活性
なプロモーター領域と、該プロモーター領域の下流に存
在するＳＤ配列と、該ＳＤ配列の下流に存在するシグナ
ル領域と、＃シグナル領域の下流に存在するプロ領域と
、該プロ領域の下流に存在するアクアライシン■をコー
ドする領域と、′該アクアライシンＩコード領域の下流
に存在するテール領域とを高度好熱性グラム陰性菌用プ
ラスミドベクターに組み込んた発現ベクターを提供する
。

また、本発明は、上記本発明の発現ベクターで形質転換
され、アクアライシン■を分泌生産することができる高
度好熱性グラム陰性細菌を提供する。

［発明の効果］ 本発明の発現ベクターを含む本発明の高度好熱性菌を培
養してアクアライシンＩを製造すると。

大腸菌で発現するために必要なＩ　ＰＴＧ等の添加等及
びアクアライシン■前駆体の成熟化のための熱処理の工
程か必要なく、また、アクアライシン■か菌体外に分泌
生産されるので菌体を連続して使用することかできアク
アライシン■の連続生産が可能になった。また、アクア
ライシン■が菌体外に分泌されるのでその回収及び精製
操作が簡単である。さらに、高温で培養するので、雑菌
の混入を有効に防止することかできる。

Ｃ発明の詳細な説明コ 本発明の発現ベクターを構築するために用いられる高度
好熱性クラム陰性菌用ベクターは、高度好熱性クラム陰
性菌中で自律的に複製するための複製開始点を有し１選
択のためのマーカーを有し、かつ、外来性の遺伝子を挿
入するための制限酵素部位を有するものである。ここて
、「高度好熱性クラム陰性菌」とは、６５℃以上で培養
することか可能なクラム陰性菌を意味する。高度好熱性
クラム陰性菌用ベクターとしては、例えばｐＹＫｌｏｌ
を挙げることができる。ベクターｐＹＫ１０１は、Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｎｏｐｈｉｌｕｓ　７２株（ＡＴ
ＣＣ２７７３７）由来のトリプトファンＤＮＡ断片を大
腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１３と共にＴｈｅｒｍｕ
ｓ　ｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓＨＢ８由来の選択マーカ
ーを持たないクリプテイックプラスミドｐＴＴ８に連結
することにより構築されたもので、ｐＴＴ８由来の複製
開始点を有しており選択マーカーＴｒｐ”を持っている
。従って、宿主としてＴｈｅｒｍｕｓ止肛肚執ユ胚ＨＢ
２７株のプロリン及びトリプトファン合成酵素遺伝子変
異株を用いることにより、この栄養要求性により選択す
ることができる。ベクターｐＹＫ１０１の遺伝子地図は
図２中に示されている。

本発明の発現ベクターは、上記した高度好熱性クラム陰
性菌用ベクターに、上流から順に高度好熱性グラム陰性
菌中で活性なプロモーター領域と、ＳＤ配列と、シグナ
ル領域と、プロ領域と、アクアライシンＩをコードする
領域と、テール領域とを高度好熱性グラム陰性菌用プラ
スミドベクターに組み込んだものである。

上記各領域を含む、サーマス・アクアティカスＹＴ−１
由来のＤＮＡ領域の塩基配列を、それがコードするアミ
ノ酸配列と共に図１に示す。なお、図１に示すＤＮＡ領
域はサーマス・アクアティカス７丁−１の染色体ＤＮＡ
中にそのまま含まれているものである。以下、上記各領
域を図１を参照しながら説明する。もっとも、各領域は
、高度好熱性クラム陰性菌である宿主中で有効に機能す
るものであれば１図１に示された。サーマス・アクアテ
ィカス由来のものに限定されるわけではない。

プロモーター領域は１図１中、ＡＧＣからＡＣＡまでの
下線を引いた領域である。この領域なその下流のＳＤ配
列と共に、高度好熱性クラム陰性菌用ベクターに組込む
ことにより、ベクター中にプロモーター領域かない場合
や、プロモーター領域の位置が不明な場合であってもア
クアライシンＩを発現させることが可能になる。

プロモーター領域の下流にはＳＤ配列が存在し１図１に
示す例ではＳＤ配列はＡＡＧＧＡＧである。

５Ｄｆｉ！、／ｌの下流には、シグナル領域が存在する
。シグナル領域はシグナルベプチトをコードする領域で
あり、図１においては、ＡＴＧから始まりＧＣＣで終る
、アンダーラインが引かれた領域である。シグナル領域
は、ポリペプチドを宿主の菌体外に分泌させる機能を有
するものであり、図１に示す配列以外にもい（つかのシ
グナル領域が知られている。例えば、シグナル領域は下
記の公知文献に記載されている。Ｍａｒｉｓｏｎ　Ｅら
、Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ
　ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓＮｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ｖｏｌ、　１２．　
Ｎｏ、　１３゜１９８４、本発明においては、これら公
知のいずれのシグナル領域をも採用することができる。

また、これら以外の公知のシグナル領域であっても、宿
主菌体外への分泌機能を有する領域は全て本発明におけ
るシグナル領域として用いることができる。

シグナル領域の下流には、プロ領域と呼ばれる領域が存
在する。プロ領域は、Ｔｈｅｒｍｕｓ赳」工匡凹ＹＴ−
１のＤＮＡ中において、前記シグナル領域と後述するア
クアライシン■コード領域（図１において実線で囲まれ
ている領域）との間に挟まれた領域であり、アクアライ
シン■の成熟１ｇ１）に関与する部分である。なお、こ
のようなプロ領域を有する他のセソンプロテアーゼも知
られており（例えば下記文献に記載、高木博史。

「タンパク質工学的手法による枯草菌プロテアーゼ・サ
チライシンの構造と機能に関する研究」、東京大学農学
部博士論文１９８８年）、本発明においては、このよう
な他のセリンプロテア□−ゼのプロ領域をも用いること
ができる。

プロ領域の下流には、アクアライシン■をコードする領
域が存在する。アクアライシンＩをコードする領域はＴ
ｈｅｒｖｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＹＴ−１のＤＮＡ
中に含まれており、その塩基配列は従来より知られてい
る（櫂錫泰、「高度好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａ
ｔｉｃｕｓ　ＹＴ−１の菌体外プロテアーゼ（アクアラ
イシンＩ）の生化学的、堺仏子工学的研究」東京大学農
学部博士論文、１９８７年）６図１において、アクアラ
イシンＩコード領域は実線で囲まれた部分である。

アクアライシンＩコード領域の下流には、テール領域が
存在する。テール領域は、アクアライシン■の活性を阻
害する機能を有し、また、アクアライシン■前駆体の安
定化とアクアライシン■の菌体外への分泌に関与してい
ると考えられる。テール領域は図１においてはアクアラ
イシンＩコード領域の下流からターミネーションコドン
ＴＡＧまでの領域（アクアライシンＩコード領域よりも
下流でアミノ酸配列を記載した領域）である０図１にお
けるテール領域はＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ　
ＹＴ−１のＤＮＡ中に天然に存在するものである。もつ
とも、図１に示したアミノ酸配列をコードする塩基配列
以外の配列であっても、アクアライシンＩ前駆体の安定
化及びアクアライシンＩの分泌機能を有する塩基配列で
あれＬｆｕｌずれの塩基配列をも採用することができる
。

なお１本発明の遺伝子に含まれる各領域を説明したが、
一般に、１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在
する０図１に示したアミノ酸配列をコードする他の塩基
配列も図１に示す塩基配列と同一のものであると解釈す
る。さらにまた、生理活性を有するペプチドにおいて、
少数のアミノ酸が置換し、欠失し又は少数のアミノ酸が
付加されてもそのペプチドの生理活性が影響を受けない
ことかあることは当業者において広く認識されているこ
とである。従って１図１に示す上述した各領域において
、少数の塩基が置換し、欠失し又は付加された結果、各
領域がコードするアミノ酸配列のうちの少数のアミノ酸
が置換し、欠失し又は付加された場合であっても、各領
域が有する上記したａ歳が実質的に影響を受けない場合
には、その領域は図１に示されたものと実質的に同一で
あり、本願発明の範囲内に含まれるものと解釈する。従
って、例えばプロ領域について言えば、図１に示したプ
ロ領域がコードするアミノ酸配列のうちの少数のアミノ
酸が置換し、欠失し又は少数のアミノ酸が付加された場
合てあっても、プロ領域の機能、すなわち、アクアライ
シンＩの成熟化を達成することがてきる場合には、その
領域は図１に示されたプロ領域と実質的に同一であると
解釈される。

本発明においてベクターに組込まれるＤＮＡ領域は、上
記で説明した各領域を含んでいればよく、上記領域にさ
らにＤＮＡが付加されていてもよい０例えば、図１には
シグナル領域の前及びテール領域の後にそれぞれＤＮＡ
領域を含んでいるか、このようなものも当然本発明にお
いて採用することができる。

本発明の発現ベクターは、例えば以下のようにして調製
することができる。なお、本発明のベクターの調製方法
は種々のものか可能であり、以下に記載するものに限定
されないことは言うまてもない０例えば、以下に記載す
る方法では、アクアライシンＩコード領域中のＸｂａ　
［部位で組込むべきＤＮＡ領域を２分割し、それぞれ別
々にクローニングした後に結合しているが１本発明のベ
クターの調製方法はこのような方法に限定されるものて
はない。

（１）遺伝子源及び遺伝子の調製 本発明に用いる遺伝子源としては、Ｔｈｅｒｖｕｓａｑ
ｕａｔｉｃｕｓ　ＹＴ−１（ＡＴＣ２５１０４）のＤＮ
Ａを利用することがてきる、アクアライシンＩ遺伝子は
常法に従い、−旦大腸閑にクローニングすることが好ま
しい、この際アクアライシンＩ遺伝子の上流にはプロモ
ーター領域が存在し、大腸菌内でアクアライシン■が発
現するため完全な形でクローニングすることが困難であ
るのでアクアライシン■の前駆体遺伝子のＮ末端部分を
有するＤＮＡ断片（２，８ｋｂｐ）とＣ末端部分を有す
るＤＮＡｌ１片（０，８ｋｂｐ）を各々市販のベクター
プラスミドｐＵｃ１２にクローニングする。この２つの
ＤＮＡＩ！ｌｒ片を方向性を持たせて結合し、アクアラ
イシン■遺伝子とする（下記実施例参照）。

（２）ベクタープラスミド 高度好熱性グラム陰性菌用ベクターとしては。

上記したように、例えばベクターｐＹＫ１０１を採用す
ることができる。ベクターｐＹＫ１０１は、特願昭６３
−１６３７７９に開示された方法によりＴｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＨＢ８由来のプラスミドｐ
Ｔτ８より構築されたもので、ｐＴＴ８由来の複製開始
点を有して３す、選択マーカーとして栄養要求性マーカ
ーＴｒｐ◆を有する。また、大腸菌のプラスミドｐＵｃ
１３を含み大ｆｌｉ菌中でも複製可能なシャトルベクタ
ーである。

（３）本発明のベクターの構築 上記のようにして調製したアクアライシン■前駆体遺伝
子を上記のベクタープラスミドに挿入し、目的の本発明
の発現ベクターを得る。ベクターとしてｐＹＫｌｏｌを
用いた場合には、挿入すべきＤＮＡ領域は、例えばｐＵ
ｃ１３が挿入されているＸｂａ　Ｉ−Ｅｃｏ旧部位に挿
入することができる。

本発明はまた、上記した本発明の発現ベクターで形質転
換され、アクアライシンＩを分泌生産することができる
高度好熱性グラム陰性菌を提供する。高度好熱性グラム
陰性菌として好ましいものの例として、サーマス・サー
モフィラス、特にサーマス・サーモフィラスＨＢ２７（
ｔｒｐ−）　（微工研菌寄第７５０７号）を挙げること
ができる。高度好熱性グラム陰性菌の形質転換は、サー
マス属細菌が通常の培養状態のままでＤＮＡを取り込み
形質°転換できるという性質を利用して行なうことがで
きる。また、形質転換された菌株の選択は栄養要求性選
択マーカーにより行なうことができる。

本発明の高度好熱性グラム陰性菌を培養することによっ
て、培地中にアクアライシン■を蓄積することができる
。培地としては通常高度好熱性グラム陰性菌の培養に用
いられているものを用いることができ、例えば７Ｍ培地
を用いることができる。培養温度は通常４０℃〜７９℃
、好ましくは約７０℃である。

培地中のアクアライシ■は、常法に従って回収、精製す
ることができる。例えば、培養上清の９０％飽和の硫安
で沈殿する画分を回収し、緩衝液（ｐＨ４〜ｌＯ１好ま
しくはｐＨ６）に透析し、これを同緩衝液で平衡化した
陰イオン交換カラムにかけ、０〜０．３　ｕ　ＮａＣ１
１１度勾配で溶出させ０．０６Ｍ　Ｎａ（：ｌ付近の活
性化画分を回収することにより回収、精製することがで
きる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に
説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるもの
ではない。

なお、下記の実施例において、各操作は、特に明示がな
い限り、Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、　”Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｕａｌ”、　（１９８２）、　ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ記載の方法により行なった。また
、制限酵素は市販のものを用い、その具体的使用方法は
市販品の指示書に従った。

アクアライシンＩ発現ベクターｐＮに００６の構築（図
１± Ｔｈｅｒｗｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＹＴ−１（ＡＴ
ＣＣ２ＳＩＱ４）の染色体ＤＮＡをＭａｒｍａｒ法（Ｍ
ａｒｍａｒ、　Ｊ、　（１９６１）　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　３．２０８−２１８）に従い
：Ａｉａ＋、た。これを制限酵素Ｘｂａ　ｆとＳａｃ　
ｌとで完全分解して、プロモーター領域（ＰＭ）、ＳＤ
配列、シグナル領域（Ｓ）、プロ領域（Ｐ）及びアクア
ライシンＩコード領域（Ｍ）のＮ末端側を含む断片（２
，８ｋｂｐ　、以下、Ｎ末端側断片と言う）と、アクア
ライシン■コード領域のＣ末端側及びテール領域（Ｔ）
を含む断片（０，８ｋｂｐ　、以下、Ｃ末端側断片と言
う）とに分断した。これらをそれぞれ市販のプラスミド
ベクターであるｐＵｃ１２　　（宝酒造社製）に組み込
みクローニングした（図２中、工程■）。

高度好熱性細菌のベクターｐＴＴ８由来のシャトルベク
ターｐＹＫ１旧をＸｂａ　ＩとＥｃｏ　Ｒ１で消化し、
−方、Ｎ末端側断片ｆ２．８ｋｂｐ）を含むプラスミド
ｐｓｘｔ、をＸｂａ　ＩとＥｃｏ　ＲＩで消化しライゲ
ーションしてＴｈｅｒｍｕｓ止肛肚畦ユ朋ＨＢ２７　（
Ｐｒｏ−、Ｔｒｐ−１に形質転換しプラスミドｐｙｔ、
ｏｏｓを得た（図２中、工程■）、形質転換は、次のセ
クションにおいて後述する方法により行なった。その選
択は、シャトルベクターｐＹＫｌｏ１の栄養要求マーカ
ー（Ｔｒｐ”ｌにより行ない、最少培地にプロリンのみ
を加えた培地で成育した菌を選択した。

次に、プラスミドｐＹＬＯＯ５をＸｂａ　Ｉで消化し、
方、市販の大腸菌プラスミドｐＵｃ１８を同じく珈■で
消化しライゲーションして大腸菌に形質転換し、アンピ
シリン耐性で選択してプラスミドｐｙｔｏｓｓを得た（
図２中、工程■）。

プラスミドｐＹＬＯ５５をＸｂａ　Ｉで消化し、一方Ｃ
末端部分を含むＤＮＡ１１片（０，８ｋｂｐ）を含むプ
ラスミドｐＸｓｓを同じ＜山！で消化しライゲージコン
して後述のようにＴｈｃｒｓｕｓ　Ｌｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ　ＨＢ２７（Ｐｒｏ−１Ｔｒｐ−）に形質転換し
、スキムミルクプレート上でアクアライシン■の活性を
指標として選択しプラスミドｐＮＫ００６を得た（図２
中、工程＠）。

宿主微生物としてのＴｈｅｒｍｕｓ　Ｌｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓＨＢ２７　（Ｐｒｏ−１Ｔｒｐつを７Ｍ培地（
ボッペプトン０．４ｚ、イーストエキストラクト０．２
＄、塩化ナトリウムＯ，ｌ＄　、　Ｂａ５ａｌ　５ａｌ
ｔｓ　、　ｐ）１７．５）て７０°Ｃで予め一晩培養し
たものを同じ＜７Ｍ培地に０．１％Ｍ菌し、２時間、　
７０’Ｃで培養した。これを予め７０６Ｃに温めておい
た７Ｍ培地で１０倍に希釈しプラスミドＤＮＡ溶液を加
えて１時間７０６Ｃで培養し形質転換した。形質転換株
は、栄養要求マーカーにより選択した。なお、プラスミ
ドｐＮＫ００６で形質転換された高度好熱性細菌（Ｔｈ
ｅｒｖｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＨＢ２７　（ｐ
ＮＫ００６））は、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されており、その受託番号は、微工研菌寄第１０９
５４号である。

芝二ｍ生鹿Ｉ ７Ｍ培地に、予め一晩同様の培地て７０°Ｃで培養した
高度好熱性細菌形質転換株を３．７５！接種し７Ｇ’Ｃ
て連続培養した。形質転換株の成長曲線（波長６５０ｎ
ｍにおける吸光度）とその培養上溝中のアクアライシン
■の活性量（カゼイン分解活性、１単位は２８０ｎｍに
おける吸光度を０．００２／分増大させる量、特開昭５
８−１５２４８２に記載）を図３に示す。

菌体の成育に伴ってアクアライシン■の活性も上昇する
ことか分かる。

また、培養３６時間後の上清２５１の９０％硫酸アンモ
ニウムで沈殿する両分を集め、ｌ　ｉＭｃａｃｌ□を含
む１０５Ｍリン酸緩衝液（ｐｎａ、ｏ）に溶解した後同
緩衝液に対して透析した。これをＤＦＰで３０分間処理
した後、５分間過熱し５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なったとこ
ろ天然のアクアライシンＩと同じところにバンドが検出
され、アクアライシンＩの生成か確認された。

アクアライシン■の精製 培養３６時間後の培養上清の９０％硫安濃度て沈殿する
両分を回収し、　　１　ｍＭｃａｃｌｚを含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ＰＨ６，０）に溶解し同緩衝液に対して
透析した。これを同緩衝液で平衡化した陽イオン交換カ
ラムにかけＯ〜０．３　Ｍ　ＮａＣ１濃度勾配て溶出し
た。活性画分は、０．０６　Ｍ　ＮａＣ１付近に溶出し
た。

【図面の簡単な説明】

図１は１本発明の発現ベクターに組込まれる、アクアラ
イシンＩ遺伝子を含むＤＮＡ領域の塩基配列の１例をそ
のコードするアミノ酸配列と共に示す図。 図２は、本発明のアクアライシンＩ発現ベクターを構築
する工程を示す図、 図３は、本発明によりアクアライシンＩを生産するとき
の菌の成育状態とアクアライシンＩの量の時間的推移を
表わす図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）高度好熱性グラム陰性菌中で活性なプロモーター
   領域と、該プロモーター領域の下流に存在するＳＤ配列
   と、該ＳＤ配列の下流に存在するシグナル領域と、該シ
   グナル領域の下流に存在するプロ領域と、該プロ領域の
   下流に存在するアクアライシン I をコードする領域と
   、該アクアライシン I コード領域の下流に存在するテ
   ール領域とを高度好熱性グラム陰性菌用プラスミドベク
   ターに組み込んだ発現ベクター。
2. （２）前記プロモーター領域、ＳＤ配列、シグナル領域
   、プロ領域、アクアライシン I コード領域及びテール
   領域は、サーマス・アクアティカスＹＴ−１由来のもの
   である請求項１記載の発現ベクター。
3. （３）ｐＮＫ００６である請求項２記載の発現ベクター
   。
4. （４）請求項１ないし３のいずれか１項に記載の発現ベ
   クターで形質転換され、アクアライシン I を分泌生産
   することができる高度好熱性グラム陰性菌。
5. （５）前記高度好熱性グラム陰性菌はサーマス・サーモ
   フィラスＨＢ２７である請求項４記載の高度好熱性グラ
   ム陰性菌。
6. （６）サーマス・サーモフィラスＨＢ２７（ｐＮＫ００
   ６）である請求項５記載の高度好熱性グラム陰性菌。