JPH03236766A - 新規アスコルビン酸オキシダーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アスコルビン酸を酸化する酵素とその基質と
の反応による酸素の消費を利用した飲食物の劣化防止方
法及びそのための脱酸素剤、並びにこれらのために有用
な新規なアスコルビン酸オキシダーゼ及びその製造方法
に関する。

［従来の技術］ 飲食物の劣化に酸素が関与することが知られており、劣
化防止のために飲食物中の酸素を無機鉄剤で除去する方
法が知られている。しかしながら、この方法には無機鉄
剤が非食性材料であることに基く種々の制約及び問題点
が存在する。

無機鉄則に代る脱酸素剤として酸素消費性の酵素である
グルコースオキシダーゼ又はアルコールオキシダーゼを
用いる方法がある。しかしながら、これらの酵素はその
基質と反応する際に有毒物質である過酸化水素を生成せ
しめ、これが飲食物に混入するという欠点を有する。

本発明は、上記のような欠点を有しない酸素消費性酵素
としてアスコルビン酸を酸化する酵素を用いることによ
る飲食物の劣化防止方法を提供することであり、この方
法においてはアスコルビン酸を酸化する酵素とその基質
との反応により過酸化水素ではなく水が生成するため前
記の欠点を有しない。

ところで、アスコルビン酸を酸化する酵素の一種である
アスコルビン酸オキシダーゼは各種の植物に分布するこ
とが知られており〔酵素ハンドブック（朝食書店）１５
８〜１５９頁］、カポチャ（Ｍｅｎ）ｔｕｔ　Ｌｅｅ及
びＣｈａｒｌｅｓ　Ｒ，Ｄａｗｓｏｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、。

Ｖｏｌ、２４８．８（１１９，６５９６−６６０２，１
９７３；並びにＪｅａｎＤａｙａｎ及びＣｈａｒｌｅｓ
　Ｒ，Ｄａｗｓｏｎ＋　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎ
ｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍ
ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、　Ｖｏｌ、７３゜Ｎａ２．４５
１−４５８．１９７６）、及びキュウリ　（Ｔ、Ｎａｋ
ａｍｕｒａ＋Ｎ、Ｍａｋｉｎｏ及びＹ、Ｏｇｕｒａ、　
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋シｏ１．６４゜Ｎα２．１
８９−１９５．１９６８）から単離されている。しかし
ながら、これら植物由来のアスコルビン酸オキシダーゼ
は酸性域では作用しにくいため、ジュースなど酸性飲食
物の劣化防止のためには適当でない、また、酵素を植物
から大量に安価に得ることは困難である。

微生物由来のアスコルビン酸オキシダーゼとしてはミロ
セシウム・ベルカリア（Ｍ　ｒｏｔｈｅｃｉｕｅ＋ｖｅ
ｒｒｕｃａｒｉａ）の菌糸由来のもの、及びエーロバク
ター・エロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　鱈Ｌｕ狙鉦
）由来のものが知られている（母木ら、日本栄養・食糧
学会誌Ｖｏ１．４０．　Ｎａ　１　、４７〜５１．１９
８７）。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、酸素消費性酵素としてアスコルビン酸を酸化
する酵素を用いての飲食物の新規な劣化防止方法及びそ
のための脱酸素剤を提供するものであり、さらにこれら
のために特に有用な新規なアスコルビン酸オキシダーゼ
及びその製造方法を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

上記の課題を解決するため、本発明は、次の性質： （１）至適作用ｐＨが３．５〜４．５である；（２）Ｐ
ｅ″イオンにより活性化され、Ｃｕ″により阻害される
； （３）分子量ニゲル濾過法により８５．０００±５，０
００の分子量を示し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動法において分子量２３．０００
±２．０００のサブユニットを示す； （４）等電点：焦点電気泳動法により測定した場合ＰＩ
４．Ｏを示す； （５）温度安定性：ｐＨ８，０，３０分間反応で、６０
℃以下で安定な活性を示す；並びに （６）ｐＨ安定性：４℃でｐＨ４〜１１の範囲で安定な
活性を示す； を有することを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼ
を提供する。

本発明はさらに、アクレモニウム（Ａｃｒｅ＊ｏｎｉｕ
ｍ）に属し、アスコルビン酸オキシダーゼを生産するこ
とができる微生物を培養し、培養物からアスコルビン酸
オキシダーゼを採取することを特徴とするアスコルビン
酸オキシダーゼの製造方法を提供する。

本発明はさらに、飲食物にアスコルビン酸を酸化する酵
素を添加するか、又はアスコルビン酸を酸化する酵素と
その基質とを添加し、これによって飲食物中で脱酸素を
行うことを特徴とする飲食物の劣化防止方法を提供する
。

本発明はさらに、飲食物と、アスコルビン酸を酸化する
酵素及びその基質とを直接相互に接触しないように同一
容器内に密封することを特徴とする飲食品の劣化防止方
法を提供する。

本発明はさらに、開口を有するか又は少なくとも一部分
が気体透過性材料により構成されている容器に、アスコ
ルビン酸を酸化する酵素とその基質とが、使用前にはこ
れらが相互に反応しないようにして収容されていること
を特徴とする脱酸素剤を提供する。

〔具体的な説明〕

なアスコルビン　オキシダーゼ （生産株） 低い至適ｐＨを有するアスコルビン酸オキシダーゼを生
産する微生物を得るため保存株及び自然界から分離した
数千様について検索した結果、ｐＨ４付近に至適ｐＨを
有するアスコルビン酸オキシダーゼを生産する菌株が１
株得られた。

この菌株は、理化学研究所の微生物同定委託試験報告書
に従えば、不完全菌亜目（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏ−ｔ
ｉｎａ）　、不完全糸状菌網（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅ
ｓ）に所属するＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　Ｌｉｎｋ属菌と
同定された。すなわち、本菌株の光学的ｉｊ微鏡による
観察結果は以下のとおりである。フィアライド及びフィ
アロ型分生子を形成する。フィアライドはゆるやかに先
細りし、殆ど分校せず、カラーは不明瞭である。フィア
ロ型分生子は無色、平滑、ｌ細胞、球形−亜球形（まれ
に楕円形−卵型）、直径１．５〜２（〜４）趨、粘塊状
となる。やや遅れて形成されてくる閉子嚢殻様子実体は
、不完全糸状菌網ガｒ力佳ｂＳａｃｃ、属菌が形成する
分生予圧と類似したものである。この子実体（Ｃｏｎｉ
ｄｉｏａ＋ａｔａ）は白色、亜球形−楕円形、直径ｌａ
ｗ以下であるが肉眼で確認でき、菌糸殻壁等により包ま
れていない裸生した分生子塊で、その内部には分校した
菌糸上に形成されたフィアライドを有する。フィアライ
ドはフラスコ形で、基部は亜球形、先端は極端に先細り
し、湾曲しているものが多い。フィアロ型分生子はＡｃ
ｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓ　ｎａｎａｍｏｒ　ｈのものと形
態学的には区別できないが、粘塊状で、非常に多産で、
分校した菌糸間に蓄積される。よって、本菌株をアクレ
モニウム・エスピーＨ１−２５（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
　ｓｐ　ＨＩ　−２５）と呼ぶことにした。

なお、本アクレモニウム属菌は通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに微工研菌
寄第１１２３６号として寄託されている。

なお、本発明のアスコルビン酸オキシダーゼの製造に用
いられる菌株としては、上記の株のみならず、その変異
株、さらには本発明の酵素を生産する他の株をも使用す
ることができることは言うまでもない。

（培　養） 次に、アクレモニウム属菌からアスコルビン酸オキシダ
ーゼを製造するための菌の培養法としては、いかなる培
養法でも良いが、例えば液体培養法について以下に述べ
る。本発明に使用される培地としては、アクレモニウム
属に属し、アスコルビン酸オキシダーゼを生産する微生
・物が生育することの可能な培地であれば、如何なるも
のでも良く、例えばカビ或は放線菌の培養に用いられる
培地が使用される。例えば、グルコース、シェークロー
ス、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素
源、更に例えばアミノ酸、ビタミン類、酵母エキス、肉
エキス、麹汁、ポリペプトン、タンパク質加水分解物等
より選ばれた１種以上を使用し、更に、カリウム塩、マ
グネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、
鉄塩、亜塩、銅塩等の無機塩を添加しないか或は一種以
上適宜添加したものが好適に用いられる。なお、培地の
初発ｐＨは、例えば約３．５〜９．０、好ましくは約５
．５〜６．５程度に調整し、培養温度は通常１５〜４２
℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜２０日間、
好ましくは３〜１２日間程度培養する。そして、好気的
条件下、例えば振とう培養法もしくはジャーファーメン
タ−による好気的深部培養法により培養することが゛好
ましい。

（精製方法） 次いで、このようにして得た培養物より菌体を除去し、
培養濾液を得る。培養物より、菌体を除去する方法とし
ては、如何なる方法でもよく、例えば通常の遠心分離法
もしくは濾過法等が挙げられる。そして、このようにし
て得た培養濾液からアスコルビン酸オキシダーゼを単離
し、本発明のアスコルビン酸オキシダーゼを得る。まず
、培養濾液からアスコルビン酸オキシダーゼを単離精製
するには、例えば硫安分画処理、アルコール分画処理、
ＤＥＡＲ−セルロース処理、セファクリル処理、セファ
デックス処理、ＴＳＫゲルＤＥＡＲカラム処理等のいず
れかを必要に応じて組合わせた処理を行い、必要ならば
脱水或いは乾燥を行ない目的とする酵素を製造する。

（酵素活性測定法） 本発明によって得られた新規なアスコルビン酸オキシダ
ーゼ活性の測定方法は以下に示すとおりである。０．５
ｍＭアスコルビン酸と０．５＋ｓＭエチレンジアミン四
酢酸二ナトリウムを含んだ０．１　Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ４，０）　ｌ　ｄを３０℃で５分間予備加温
した後、被検体の酵素液０．１　ｄを加え、３０℃で５
分間反応させた後、反応停止液として０．２Ｍ塩酸を３
１ｄ加え、２４５ｎａの吸光度を測定する。この時、未
反応混合液の２４５ｎｓ＋吸光度の減少から活性を求め
る。

１ユニツトは前述の酵素活性測定条件下で１分間に１ａ
ｌｌｌｏｌのアスコルビン酸を酸化する酵素量とする。

（酵素の性１ｔ） アクレモニウム・エスピーＨＩ−２５が生産するアスコ
ルビン酸オキシダーゼの性質は次の通りであった。

（１）至適作用ｐＨ ｐＨ２，６〜７．０の範囲で種々の緩衝液を使用し、３
０゛Ｃにて５分間反応させた場合、第１図に示す結果が
得られた。本発明の酵素はｐＨ３，５〜４．５に至適作
用ｐＨを有する。

（２）ｐＨ安定性 本酵素を種々のｐＨにおいて３０℃又は４“Ｃにて１７
時間インキュベートした後の残存相対活性は第２図に示
す通りであった。本発明の酵素は４℃にてｐＨ４〜１１
の範囲で安定である。

（３）至適作用温度 本酵素をｐｉ（４，０の酢酸ナトリウム緩衝液（０，５
ｄＥＤＴＡ）中で種々の温度で５分間反応させた場合の
相対活性は第３図に示す通りであった。本酵素はｐＨ４
，ｏにおいては４０℃〜５５℃にて良好に作用する。

（４）温度安定性 本酵素を種々の温度で３０分間、５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８，０）にてインキュベートした後の残存相対活
性は第４図に示す通りであった。本酵素は上記の条件下
で６０℃以下で安定である。

（５）分子量及びサブユニット構造 ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ２０００　Ｓ＆４Ｇｌａｓｓカラムを
用い、分子量標準としてウシ血清アルブミン（分子量６
６．０００）及びリボヌクレアーゼＡ（ウシ膵臓由来；
分子量１３．７００）を用いてゲル濾過法により測定し
た場合、約８５．０００±ｓ、ｏｏｏの分子を示す。ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により、分子量標準としてホスホリラー
ゼｂ（ラビット筋肉由来；分子量９４．０００）　、ウ
シ血清アルブミン（分子量６７．０００）　、オバルブ
ミン（卵白由来；分子量４３．０００）　、カーボニッ
クアンヒドラーゼ（ウシ赤血球由来；分子量３０．００
０）　、）リブシンインヒビター（大豆由来：分子１２
０．１００　）、及びα−ラクトアルブミン（牛乳由来
；分子量１４．４００）を用いて測定した場合、分子量
２３．０００±２．０００に相当する単一バンドが認め
られる。従って、本酵素はサブユニットの４量体である
と推定される。

（６）酵素阻害剤の影響 下記の１ｍＭ濃度の阻害剤と共に３０℃にて１０分間イ
ンキュベートした後の残存相対活性は次の通りであった
。

対照（無添加） ００ Ｎａ、５ ＥＤＴＡ 以上の通り、本酵素は硫化ナトリウム（ＮａｚＳ）及び
アジ化ナトリウムにより失活するが、Ｎ、Ｎ−ジエチル
ジチオカルバミン酸ナトリウム及びＥＤＴＡによっては
失活しない。

（７）金属イオンの影響 各種金属イオン４．５ｍＭ濃度による影響は次の通りで
あった。

対　照　　　　（無添加）１００ Ｍｇ″　　　　ＭｇＣｊ！　ｔ・６Ｈ，０７９，２Ｃｏ
”　　　　ＣＯ３Ｏ４・７Ｈｚ０　　　　　１０８Ｃａ
″　　　　ＣａＣｌ　ｚ　’　２Ｈｔ０　　　　１０５
Ｚｎ″　　　ＺｎＳＯ４・７Ｈｚ０　　　　　１００Ｍ
ｎ″　　　　Ｍｎ５Ｏａ　・５Ｈ！０　　　　　１１３
Ｆｅ″　　　　Ｆｅ５Ｏｎ　・７Ｈｚ０　　　　　２５
４Ｃｕ″　　　Ｃｕ５Ｏａ　・５８ｚ０　　　　　２９
．８以上の通り、本酵素はＣｕ″イオンにより失活し、
Ｆｅ″イオンにより活性化される。

（８）等電点 焦点電気泳動法により測定した場合、４．０の等電点を
示す、。

以上の結果を既知酵素と比較すれば次の通りである。

本発明においてアスコルビン酸を酸化する酵素にはアス
コルビン酸オキシダーゼ及びポリフェノールオキシダー
ゼ（ラッカーゼ）が包含される。

本発明はアスコルビン酸を酸化する酵素による酸素の消
費に暴く飲食物の劣化防止方法を提供する。この方法の
第一の態様においては、アスコルビン酸を十分に含有す
る飲食物にアスコルビン酸を酸化する酵素を添加するか
、あるいはアスコルビン酸を含有しないか又は十分には
含有しない飲食物にアスコルビン酸を酸化する酵素及び
その基質、例えばアスコルビン酸もしくはその塩又はイ
ソアスコルビン酸もしくはその塩を添加する。これによ
り、飲食物中のアスコルビン酸等の基質がアスコルビン
酸を酸化する酵素により酸化される際に飲食物中の酸素
が消費され、この結果飲食物の劣化が防止される。

この方法においては、本発明の酵素及び前記のごときす
でに知られている酵素の内、任意のものを使用すること
ができる。しかしながら、果物ジュースなど酸性の飲食
物においては、既知の酵素は十分に機能しないため、酸
性域に至適作用ｐＨを有する本発明の酵素を用いるのが
好ましい。使用する酵素の量は、飲食物の種類等により
異るが、一般に飲食物ｇ又は−当り０．００１ユニット
以上であり、そして好ましくは飲食物ｇ又はｍｌ当り０
．０２ユニット以上である。酵素量が多くても食品の劣
化等の不利益はないが、酵素を一定以上増加しても劣化
防止効果がそれに応じて増加するとは限らない。

飲食物に添加するアスコルビン酸又はその塩の量は飲食
物の種類、飲食物に自然に含まれているアスコルビン酸
の量等により異るが、一般に、飲食物に対して０．Ｏ１
〜１．０重量％、好ましくは、０．０１〜０．５重量％
である。なお、アスコルビン酸の塩としては、そのナト
リウム塩、カリウム塩等を使用することができる。さら
に、アスコルビン酸又はその塩に代えてイソアスコルビ
ン酸又はその塩を使用することができる。

本発明の飲食物の劣化防止法の第二の態様によれば、ア
スコルビン酸を酸化する酵素及びその基質、例えばアス
コルビン酸もしくはその塩又はイソアスコルビン酸もし
くはその塩を水性媒体、例えば緩衝液に溶解して酸素消
費系を調製し、これと飲食物とを相互に接触せしめるこ
となく同一容器に密封する。この方法によれば、上記酸
素消費系により容器内の酸素が消費され、その結果飲食
物中の酸素が脱酸素される。この態様において酸素消費
系を構成する水性媒体、例えば緩衝液として、使用する
酵素の至適作用ｐＨと同じか又はそれに近いｐＨ値を有
するものを使用する。例えば、キュウリ由来のアスコル
ビン酸オキシダーゼは５．６付近に至適作用ｐＨを有す
るため、ｐＨ５〜７のリン酸緩衝液を用いるのが好まし
く、本発明のアクレモニウム属の株が生産する酵素は酸
性域に至適作用ｐ！（を有するため、例えばｐＨ４〜５
の酢酸緩衝液を用いるのが便利である。

この第二の態様におけるアスコルビン酸を酸化する酵素
及びその基質と飲食物との量的関係は、前記第一の態様
の場合と類似するが、第二の態様においては、飲食物中
の酸素のほかにその環境中（すなわち容器内）の酸素を
も消費する必要があるため、酵素及びその基質の量は第
一の態様の場合のそれよりやや多くするのが好ましい。

第二の態様の実施に当っては、酵素の溶液及び基質の溶
液を別々に調製し、これを混合した後に飲食物貯蔵容器
に入れ、この容器を密封することができる。しかしなが
ら、酸素消費系による酸素の消費を飲食物の脱酸素のた
めに効率よく利用するためには、酵素とその基質とを反
応しない状態で飲食物貯蔵容器に入れ、この容器を密封
した後に酵素反応を開始するのが好ましい。このために
は、例えば酵素溶液と基質溶液とを別個に収容して貯蔵
容器に入れ、この貯蔵容器を密封した後に一方の液を他
方の液に注入することができる。あるいは、酵素溶液と
基質溶液とを隔壁を隔てて収容し、貯蔵容器を密封した
後、この隔壁を破壊して両溶液を混合することができる
。また、酵素及び基質のいずれか一方を溶液として、他
方を粉末として貯蔵容器に導入し、貯蔵容器を密封した
後に両者を混合することができる。他の態様においては
、酵素粉末と基質粉末との混合物と、酵素反応用媒体例
えば緩衝液とを別々に貯蔵容器に導入し、貯蔵容器を密
封した後に、前記粉混合物と反応媒体とを混合すること
ができる。また、水と酸素を透過できる膜で酵素粉末と
基質粉末との混合物を包み込んだ状態で貯蔵容器に導入
し、使用時に飲食物と接触せしめることができる。

本発明はさらに、飲食物の劣化防止方法において使用す
るための脱酸素剤を提供する。この脱酸素剤は、開口を
有するか又は少なくとも一部分が気体透過性材料により
構成されている容器に、アスコルビン酸オキシダーゼ及
びその基質が、使用前にはこれらが相互に反応しないよ
うに収容されていることを特徴とする。この脱酸素剤の
容器は、その中でアスコルビン酸を酸化する酵素とその
基質とが反応する場合に該酸素剤容器の外の環境、例え
ば飲食物貯蔵容器の内部、の空気を消費するように、開
口又は気体透過性部分を有する。前記酵素どその基質と
が該脱酸素剤の使用前に反応しないようにする手段とし
て、種々の手段を用いることができる。

例えば、酵素溶液と基ｒｔ温溶液別々の容器に入れ、こ
れらの容器を前記脱酸素剤容器に収容し、使用時にこれ
らの溶液を混合できるようにすればよい。例えば脱酸素
剤容器を逆転する。あるいは脱酸素剤容器に隔壁を隔て
酵素溶液及び基質溶液を収容しておき、使用時にその隔
壁を破壊することができる。具体例としては前記隔壁と
して容易に破ることができるフィルム又はシートからで
きた袋を用い、これを使用時に、例えば針状部材により
破ることができる。あるいは、酵素及びその基質の内一
方を溶液とし、他方を乾燥粉末として脱酸素剤容器に収
容し、使用の際これを混合することができる。別の方法
としては、酵素及びその基質を乾燥粉末状態で、反応用
緩衝液を入れた脱酸素剤容器に収容しておき、使用時に
該緩衝液と乾燥粉末とを混合することができる。上記の
種々態様において、粉末は例えばフィルム又はシートか
ら作られた袋に入れておき、使用の際にこの袋を針で破
り粉末と緩衝液とを接触せしめることができる。また、
液状飲食物に於いては酵素粉末と基質粉末との混合物を
酸素及び水を透過できるフィルム等でコーティングする
ことにより、使７１時に飲食物と接触させることで目的
を達成することができる。

〔発明の効果〕

本発明の方法によればアスコルビン酸を酸化する酵素と
その基質、すなわちアスコルビン酸もしくはその塩又は
イソアスコルビン酸もしくはその塩と反応せしめること
により酸素を消費し、これによって飲食物を脱酸素して
その劣化を防止することができ、この場合、上記酵素反
応の結果過酸化水素が発生しないので、グルコースオキ
シダーゼ等を使用するのと異り、飲食物が有害な過酸化
水素により汚染されることが無い。

また、アスコルビン酸を酸化する酵素及びその基質は水
溶液に溶解するため清澄な食品や飲料に添加してもその
外観を害することがない。

さらに、アクレモニウム属微生物によって生産される本
発明の酵素は酸性域に至適作用ｐＨを有するため、これ
を用いて果物ジュース等酸性飲食物の劣化を防止するこ
とができる。

かくして、本発明により、味噌、醤油、アルコール飲料
等の醸造飲食物、オレンジジュース、トマトジュース等
のジュース類、お茶、コーヒー等の嗜好飲料、レトルト
食品類、乳製品類、油脂類等広範な種類の飲食物の劣化
防止を行うことができる。

次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

ｍアクレモニウム・エスピーＩｆ−２５のグリセロール
１％（Ｗ／Ｖ）　、ポリペプトン１％（Ｗ／Ｖ）、肉エ
キス１％（Ｗ／Ｖ）　、リン酸二カリウム０．１％（Ｗ
／Ｖ）及び硫酸マグネシウム７水塩０．０００１％（−
ハ）の組成からなる液体培地（ｐＨ６，０）を各１０〇
−宛、５００１ｄ容振とう培養フラスコ１８０本に分注
し、常法により滅菌し、次いで、これにアクレモニウム
ｓｐ、　Ｈｌ　　２５を接種した後、３０’Ｃ１０日間
、振幅７　ｃｒａ、　１２ＯＲ，Ｐ、Ｍで振とう培養し
、アスコルビン酸オキシダーゼの比活性（蛋白質当りの
単位、ｕｎｉｔｓ／　Ａ２８０）　０．０５８９の培養
物を得た。

実施例１で得られた培養物を東洋ろ紙阻２を用いて濾別
し、培養濾液１１．ｉを得た。これを酵素液とし、１１
．５１に対し硫安を８０％飽和になるように６．４５ｋ
ｇ加え、冷蔵室で静置沈降を行なった。上澄部分は捨て
て、沈澱部分は遠心分離にかけ沈降区分を得た。これを
２０ｍＭ酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐＨ５，５）（
以降、酢酸ナトリウム緩衝液という）７００−に懸濁後
、−夜、水を外液として透析した。更に透析後、酢酸ナ
トリウム緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースｌｌを
加えて、濾別した。得られた沈澱区分に０．１Ｍ食塩を
加えた酢酸ナトリウム緩衝液２１で活性区分を溶出し、
溶出液に８０％飽和硫安塩析を行ない、前述と同様沈澱
区分を得た。これを、酢酸ナトリウム緩衝液２７０ｄに
懸濁後、遠心分離により、固形部分を除き、アスコルビ
ン酸オキシダーゼ活性区分２６５ｍＩ／、を得た。

さらに、この酵素液を、０．２Ｍ食塩を加えた酢酸ナト
リウム緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−３００カラ
ム（５Ｘ４０Ｃ１）でゲル濾過を行ない、活性区分を集
めた。次にこの活性区分を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５，０）に対して、−夜透析した。更に透析後
、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化したＤ
ＥＡＲ−セルロースカラム（５Ｘ９ｃｍ）にて食塩グラ
ジエン目容出を行ない、０．０２〜０．０８Ｍ食塩濃度
近辺の活性区分を得た。この活性区分を減圧濃縮により
１２ｄに濃縮し、０．２モル食塩を加えた酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化したセファデックスＧ
−１００カラムでゲル濾過を行ない活性区分を集めた。

次に、この活性区分を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，
０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ−５Ｐ−カラ
ム（５ｍ　Ｘ　５　ｃｍ　）で食塩グラジェント溶出を
行ない、０．０４〜０．０６Ｍ食塩濃度近辺の活性区分
に精製されたアスコルビン酸オキシダーゼを得た。各精
製段階の総タンパク質、全活性、比活性及び収率は以下
の表の如くであった。

酵素精製処理段階に於ける活性変化 をＰＨ４，０、０，１モル酢酸ナトリウム緩衝液に溶解
した酵素液としく７．０ｕｎｉｔｓ／ａｒｍり　、この
１０　ｐｌを、予じめみかん・バレンシアオレンジジュ
ースが充填され２５℃にされた溶存酸素測定セルに注入
し脱酸素を行った。その結果は下記のとおりであった。

表中にはキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ（
東洋紡■製）２３ｕｎｉｔｓ／ｌ１１（ｐＨ６，０）の
活性のものを１０ｍ前述同様にセルに注入し、脱酸素を
行った結果も示す。溶存酸素の測定は■東興化学研究所
製ＤＯ−ＭＥＴＥＲＭＯＤＥＬ　ＴＤ−１００を用いた
。

食品の一例として、濃縮還元のみかん・バレンシアオレ
ンジ混合１０σ％果汁に実施例２に従って調製し凍結乾
燥したアスコルビン酸オキシダーゼみかん・バレンシア
オレンジジュースのアスコルビン酸オキシダーゼによる
脱酸素 （単位Ｏｘ　ｐｐｍ） 度とすることができた。

実五１０エ　生乳坐劣止伍走 食品の他の例として、牛乳にアスコルビン酸０、１％を
添加溶解したものを、溶存酸素測定セルに注入し２５℃
の恒温に保った。これに実施例２に従って調製し凍結乾
燥したアスコルビン酸オキシダーゼをＰＨ６，０，０，
１モルリン酸緩衝液に溶解した酵素液（７，０ｕｎｉｔ
ｓ　／　−）の５０ｍを注入して脱酸素を行った。その
結果は下記のとおりである。表中にはキュウリ由来のア
スコルビン酸オキシダーゼ２３．０ｕｎｉｔｓ／ｍ　（
ｐＨ６，０）の活性のものを５０〃、前述同様にセルに
注入し、脱酸素を行なった結果も示す。

みかん・バレンシアオレンジジュース（グリコ製）のｐ
Ｈは３．５２であり、かかる低ｐＨでのキュウリ由来の
アスコルビン酸オキシダーゼによる脱酸素はほとんど行
なわれなかった。しかし、アクレモニウム・エスピー旧
−２５由来のアスコルビン酸オキシダーゼを用いると２
０分間で０．０１ｐｐｍの酸素濃牛乳のアスコルビン酸
オキシダーゼによる脱酸素Ｍ　　）１４．５　　　ナト
リウム　　　でのアス実施例２に従って調製し凍結乾燥
したアスコルビン酸オキシダーゼをｐＨ４，５，０，１
モル酢酸ナトリウム緩衝液に溶解した酵素液（７，Ｏｕ
ｎ　ｉ　ｔｓ　／　ｄ）１０１Ｉｌを、０．１％アスコ
ルビン酸を含むＯ，１モル酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，５）に添加し２５℃における溶存酸素を測定した結
果を下表に示す。

表中、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼによ
る溶存酸素の除去についても示した。キュウリ由来のア
スコルビン酸オキシダーゼは２３ｕｎｉｔｓ／　ｍｌ−
ｐＨ６，０の活性のものを１０Ｉ１１前述同様に添加し
測定した。

牛乳（雪印製）はｐＨが６．７４と高いため、キュウリ
由来のアスコルビン酸オキシダーゼでもアクレモニウム
・エスピーＨ１−２５由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼに近い溶存酸素の除去が行われた。

アスコルビン酸オキシダーゼによる溶存酸素の除去実Ｊ
Ｌｆｌ　　）１６．０リン　ナトリウム　　　でのアｐ
Ｈ４，５でのアスコルビン酸オキシダーゼによる溶存酸
素の除去は、２５℃２０分間の反応でアクレモニウム・
エスピーＨ１−２５由来のアスコルビン酸オキシダーゼ
による場合０．０２ｐｐｍまで、酸素が除去されたが、
キュウリ由来のそれは４．５２ｐｐｍ酸素濃度までにし
か除去できなかった。

実施例２に従って調製し凍結乾燥したアスコルビン酸オ
キシダーゼをＰＨ６，０、Ｏ，１モルリン酸緩衝液に溶
解した酵素液（７，０ｕｎｉｔｓ／Ｉｄ）　１０ｍを、
０、１％アスコルビン酸を含む０．１モルリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６，０）に添加し、２５℃に於ける溶
存酸素を測定した結果、下表のごとくとなった。

表中、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼによ
る溶存酸素の除去についても示した。キュウリ由来のア
スコルビン酸オキシダーゼは２３ｕｎｉｔｓ　／　ｍＬ
　ｐＨ６，Ｏの活性のものを１０ｍを前述と同様添加し
、溶存酸素を測定した。

アスコルビン酸オキシダーゼによる溶存酸素の除去ｐＨ
が高くなると、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダ
ーゼでも、アクレモニウム・エスピーＨ１−２５由来の
アスコルビン酸オキシダーゼと比較して大差ない溶存酸
素の除去が行なわれた。

の３９５５００ＸＹＧＥＮ　ＥＬＥＣＴＲＯＤＥヲ差り
込ミ、容Ｍｒ内ニアスコルビン酸１３３■と実施例２で
調製したアスコルビン酸オキシダーゼ８．　Ｏｕｎｉｔ
ｓ　とを、ｐＨ６，。

で０．１モルリン酸ナトリウム緩衝液で溶かして５−と
したものを加え、小撹拌子で常時撹拌しながら、密閉さ
れたガラス容器中の酸素量（Ｏ！％）を測定した。なお
、ガラス容器は２５±０．１″Ｃに制御された恒温中に
保持した。この結果を下表に示す。

表中、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼによ
る容器内酸素の除去についても示した。

キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼの場合は４
．７　ｕｎｉｔｓを用いた。これ以外の条件はアクレモ
ニウム・エスピーＨＩ−２５の場合に準じた。

２０Ｉ１１容ガラス容器に、Ｂｅｃｋｓａｎ　ＯＸ’１
ＧＥＮ　ＡＮＡＬＹＺＥＲアスコルビン酸オキシダーゼ
による容器内酸素の除去あろうが、いずれとも脱酸素さ
れていることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はアクレモニウムｓｐ、旧−２５が生産するアス
コルビン酸オキシダーゼの至適作用ｐｌを示すグラフで
ある。 第２図は同酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。 第３図は同酵素の至適作用温度を示すグラフである。 第４図は同酵素の温度安定性を示すグラフである。 ｐＨ６，０の緩衝液を用いた場合、容器内の酸素量はキ
ュウリ由来であろうがアクレモニウム由来でＴｒｉ、５
−ＨＣＬ ０ ２ Ｈ 七才 作２ 図 手 続 補 正 書（方式） ％式％ （０） １、事件の表示 平成２年特許願第０３２１７５号 ２、　発明の名称 アスコルビン酸オキシダーゼ及びその使用４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号第４
図 ５、補正命令の日付 自発補正 ６、補正の対象 （１）明細書 （２）委任状 ７、補正の内容 （１）明細書の浄書（内容に変更なし）（２）　　委任
状を追究する。 ８、添付書類の目録 （１）　　浄書した明細書 （２）委任状 １通 ２通 手続補正書（自発） 】、事件の表示 平成２年特許願第０３２１７５号 ２゜発明の名称 アスコルビン酸オキシダーゼ及びその使用３、補正をす
る者 事件との関係　　　特許出願人　　　３．２．。、、、
）名称　イチビキ株式会社 名称　有限会社ビセイケン ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正の対象 （１）明細書の「発明の詳細な説明」の欄（２）明細書
の「図面の簡単な説明」の欄（３）図面 （４）受託証 ６、補正の内容 （１）■　明細書第９頁第１３行目と１４行目の間に次
の記載を加入します。 １次に、この株の菌学的性質を記載する。 （各培地における生育状態） 培地４種類（ポテト・デキストロース寒天培地、サブロ
ー寒天培地、麦芽エキス寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地）
で、３０’Ｃ１４日間培養し、各培地における生育状態
は次の通りである。 〔ポテト・デキストロース寒天培地〕 イ、生育；遅く、直径６．０Ｃ角 口０表面；白色、短線毛状の気生菌糸を形威し密なコロ
ニーとなり、中心に放射状 の溝を呈し、やや遅れて閉子嚢殻様 の子実体（Ｃｏｎｉｄｉｏｓ＋ａｔａ）を形成する。 しばしば表面に淡褐色の水滴を生ず る。 ハ、裏面：シワ有り、クリーム色。 二８色素；生生成し。 〔サブロー寒天培地〕 イ、生育；遅く、直径５．６　ｃｍ 口０表面；白色、短線毛状、中心の小隆起により放射状
の溝を呈す。 ハ、裏面；シワ有り、レモン色。 二０色素；生成なし。 〔麦芽エキス寒天培地〕 イ、生育；遅く、直径５．１　ｃｍ 口０表面；白色、短線毛状、中心付近に放射状の溝を呈
す。 ハ、裏面；シワ有り、黄褐色。 二１色素；生成なし。 （ＹｐＳｓ寒天培地） イ、生育；遅く、直径６．０　ｃｍ 口０表面；白色、短い綿毛状の気生菌糸を形威し、平坦
なコロニーとなる。やや遅 れて閉子嚢殻様の子実体（Ｃｏｎｉｄｉｏａ＋ａｔａ）
を形成する。しばしば表面に淡褐色 の水滴を生ずる。 ハ、裏面；シワ無し、クリーム色。 二８色素；生生成し。 （ポテト・デキストロース培地での生育条件）〔最適生
育条件〕 最適温度　　２８〜３１℃ 最適生育ｐｎ６．ｏ〜７．０ 〔生育の範囲〕 生育の温度範囲　１５〜３５℃ 生育のｐＨ範囲　　５．０〜７．８１ ■　同第９頁第１６〜１７行目「寄託されている。」を
ｒ寄託され、そして平底２年１月２９日に微工研条寄第
３１２４号（Ｆｔ！ＲＭ　０Ｐ−３１２４）としてブダ
ペスト条約に基く国際寄託に移管された。１に補正しま
す。 ■　同第４０頁２行目の次に、下記の記載を加入します
。 ｒ参１墨逮に この参考例においては、酵素の乾燥安定剤ＢＳＡ　。 ＥＤＴ＾等の共存下でアスコルビン酸をアスコルビン酸
オキシダーゼにより酸化する場合、アジ化ナトリウム（
ＮａＮｉ）によるアスコルビン酸埃キシダーゼの不活性
化が抑制され、ＮａＮ、を含む測定系において本発明の
アスコルビン酸オキシダーゼが使用可能であることを示
す。 各５０ｍＭバッファーに０．１％ＢＳＡを添加した。 そして、それぞれのアスコルビン酸オキシダーゼを加え
、更にＮａＮ５添加区には０．２％になるようにＮａＮ
５を添加した上、２日間５℃及び２８℃に保存後の残存
活性を測定した。その結果が下表に示す通りとなった。 単位　％ バッファーのみの時を１００とした相対活性で見られる
ようにＮａＮ、添加による活性低下はアクレモニウム由
来の酵素の方が多いが、５℃保存を１００とした時の２
８℃残存活性及び調整直後を１００とした時の２８℃残
存活性に見られるように、ＮａＮｚ添加による活性低下
がアクレモニウム由来の酵素の方が多いとは言えなかっ
た。 この場合のアスコルビン酸オキシダーゼ活性測定は次の
通り行った。 アスコルビン酸の還元性消去の活性測定方法（ＮＴＢ法
） １ｍＭアスコルビン酸と１ｍＭエチレンジアミン四酢酸
二ナトリウムを含んだ５０ｍＭリン酸三水素カリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＱ５．６　）　０．１−を
３７℃で５分間予備加温した後、被検体の酵素液０．０
２ｄを加え、３７℃で正確に５分間反応させた後、２ａ
＋Ｍニトロブルーテトラゾリウム（ＮＴＢ）と４％ポリ
オキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔ
ｒｉｔｏｎ　Ｘ’−１００）を含んだ５０−リン酸二水
素カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐｔ１７．６）
１．０−を加え、酵素反応を停止した上で、３７℃で１
５分間ＮＴＢとアスコルビン酸の反応を行う。この反応
液に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含んだ０．１
　Ｍ塩酸を２．５　ｄ加え、５３０ｎｍの吸光度を測定
する。この時、酵素を加えない反応との吸光度の差から
活性を求めた。 参壽班１　アスコルビン　オキシダーゼ６較 精製されたアクレモニウム・エスピーＨＩ−２５由来の
アスコルビン酸オキシダーゼ（Ａ、ＡＳＯＤ）と従来か
らあるキュウリ由来の天野製薬■製アスコルビン酸オキ
シダーゼ（Ｃ，ＡＳＯＤ）との比較安定性試験を行った
。 Ａ、ＡＳＯＤ及びＣ、Ａ　Ｓ’０口とも０．２−メンブ
レンフィルターで除菌し、これを殺菌した所定量の５０
＋ｗＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０及び６．８５）に加え
て、保存温度は４℃、３０℃で、３日間保存した。 その結果、以下の表の通りとなった。 （残稿猾ｕ／ｄり （残存活性ｕ／ｄ） この場合のアスコルビン酸オキシダーゼ活性は明細書１
２頁に記載の酵素活性測定法によった。 これらの結果より、アクレモニウム由来のアスコルビン
酸オキシダーゼ（Ａ、ＡＳＯＤ）はキュウリ由来のアス
コルビン酸オキシダーゼ（Ｃ，ＡＳＯＤ）に比較し、１
区から４区のどの区においても残存活性が高く、安定で
あった。 参主拠１　　゛のリン８　の゛ 血清中のリン脂質の測定では検体にフォスホリパーゼＤ
　（ＰＬＯ）を作用させコリンを生成させ、このコリン
をコリンオキシダーゼで酸化し、過酸化水素を生成させ
る。この過酸化水素をパーオキシダーゼで酸化し、同時
に発生する酸素により、色原体を酸化し発色させて、リ
ン脂質を測定する。 この測定では、検体中のアスコルビン酸が発色に関与し
ているパーオキシダーゼ反応を阻害し、正しいリン脂質
の定量を妨害する。これを避けるために、アスコルビン
酸オキシダーゼが使用されている。 従来はこのアスコルビン酸オキシダーゼとして、キュウ
リ由来のものが用いられている。しかし、前項の安定性
試験で示したごとく、キュウリ由来のアスコルビン酸オ
キシダーゼは安定性の点で劣り、試薬を調製した後での
保存を長期に亙って行うことが出来ず、不便であると共
に、ロスにもつながり、結果として高価になる。アクレ
モニウム由来のアスコルビン酸オキシダーゼを用いるこ
とにより、これらの欠点が改善される。 「メルクタイプ試薬溶液−１」の調製 フォスホリパーゼＤ　（ＰＬＯ）　（メルク酵素液−１
（７７０３７）　　１本）とアスコルビン酸オキシダー
ゼ（メルク７７０４９　１本）を３，５−ジメトキシ−
Ｎ＝エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−アニリン０．５ｍｍｏｌ溶液１００ａｄ　（メル
ク緩衝液−１（７７０３８）　　１本）で溶かす。 「アクレモタイプ試薬溶液−１」の調製フォスホリバー
ゼＤ　（ＰＬＯ）　（メルク酵素液−■（７７０３７）
　　１本）とアクレモニウム由来のアスコルビン酸オキ
シダーゼ１５０ｕｎｉｔとを３．５−ジメトキシ−Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−アニリン０．５　ｍｍ＋ｏｌ溶液１００ｄ（メルク緩
衝液−１（７７０３８）　　１本）で溶かす。 これらの「メルクタイプ試薬溶液−１」及び「アクレモ
タイプ試薬溶液−１」を用いて、ヒト血清を検体として
リン脂質の測定を実施した結果が次の表である。実際の
血清中のリン脂質量に換算はしていないが、６００ｎｍ
吸光度からキュウリのアスコルビン酸オキシダーゼを用
いても、アクレモニウム由来のアスコルビン酸オキシダ
ーゼを用いても変わらない値が出ることが示された。 参考例３のリン脂質の測定以外に、アスコルビン酸オキ
シダーゼが用いられる検査薬、例えばコレステロール、
トリグリセライド、尿酸、遊離脂肪酸などの測定にも利
用することができる。 量定 アミノ化ポリアクリルニトリル（ＰＡＮ）膜（１，５セ
ンチ平方）１０枚を５Ｉ１１の１２．５％のグルタルア
ルデヒド溶液に加え、０℃で２０分間反応を行った。そ
の後５００ｄの０．１　Ｍホウ醇緩衝液（ｐＨ８，５）
膜を洗浄後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　１
０−に溶解したキュウリ由来及び本件アスコルビン酸オ
キシダーゼ（１２００単位）を加え、３０℃で１時間反
応させ、膜への酵素の固定化を行った。 ０、　Ｉ　Ｍ　Ｕン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄後、
固定化酵素膜を酸素電極表面に装着し、アスコルビン酸
の測定に供した。アスコルビン酸の測定は１．５　ｍの
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にアスコルビン酸
を含む溶液３０マイクロリツトルを添加し３７℃での溶
存酸素の減少量により行った。その結果を第５図（キュ
ウリ由来酵素）、及び第６図（アクレモニウム由来酵素
）に示した。 奎主明星 参考例４で得られた２種類の固定化酵素膜を０、１　Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で３７℃に保存し経時的に
取り出しアスコルビン酸の測定に供した。 第７図に示したようにキュウリ由来の酵素よりもアクレ
モニウム由来の酵素を使用した時の方が安定性に優れて
いることが解った。」 （２）明細書第４０頁第１１行目の次に、下記の記載を
加入します。 ｒ第５図は、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼを固定した膜を用いてＬ−アスコルビン酸を測定した
場合のサンプル中のＬ−アスコルビン酸濃度とシグナル
との関係を示す（参考例４）。 第６図は、本発明のアクレモニウム由来のアスコルビン
酸オキシダーゼを固定した膜を用いてＬ−アスコルビン
酸を測定した場合のサンプル中のＬ−アスコルビン酸濃
度とシグナルとの関係を示す（参考例５）。 第７図は、本発明のアクレモニウム由来アスコルビン酸
オキシダーゼを固定した膜、及びキュウリ由来のアスコ
ルビン酸オキシダーゼを固定した膜の貯蔵期間中の性能
の経時変化を示すグラフである。」 （３）第５図、第６図及び第７図を追加します。 （４）　　ｆ’ｉ’Ｊ＃ｔｖ　％！Ｌ江（％　ン’ｆ−
ｆｊ、、ｉ　１，４５゜７、添付書類の目録 （１）第５図、第６図及び第７図　　　　　１通（２）
受託紙（写し）　　　　　　　　　　　１通し一アスコ
ルビン酸（ｍｇ／ｄｌ） 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、飲食物にアスコルビン酸を酸化する酵素を添加する
   か、又はアスコルビン酸を酸化する酵素とその基質とを
   添加し、これによって飲食物中で脱酸素を行うことを特
   徴とする飲食物の劣化防止方法。 ２、飲食物と、アスコルビン酸を酸化する酵素及びその
   基質とを直接相互に接触しないように同一容器内に密封
   することを特徴とする飲食物の劣化防止方法。 ３、開口を有するか又は少なくとも一部分が気体透過性
   材料により構成されている容器に、アスコルビン酸を酸
   化する酵素とその基質とが、使用前にはこれらが相互に
   反応しないようにして収容されていることを特徴とする
   脱酸素剤。 ４、次の性質 （１）至適作用ｐＨが３．５〜４．５である；（２）Ｆ
   ｅ＾＋＾＋イオンにより活性化され、Ｃｕ＾＋＾＋によ
   り阻害される； （３）分子量：ゲル濾過法により８５，０００±５，０
   ００の分子量を示し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
   リルアミドゲル電気泳動法において分子量２３，０００
   ±２，０００のサブユニットを示す； （４）等電点：焦点電気泳動法により測定した場合ｐＩ
   ４．０を示す； （５）温度安定性：ｐＨ８．０、３０分間の反応で６０
   ℃以下で安定な活性を示す；並びに （６）ｐＨ安定性：４℃でｐＨ４〜１１の範囲で安定な
   活性を示す； を有することを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼ
   。 ５、アクレモニウム（￥Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ￥）に属
   し、アスコルビン酸オキシダーゼを生産することができ
   る微生物を培養し、培養物からアスコルビン酸オキシダ
   ーゼを採取することを特徴とする、請求項１に記載のア
   スコルビン酸オキシダーゼの製造方法。