JPH03271300A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトインターロイキン−１活性を有する新規
なペプチド、そのエステル、そのアミド、そのアシル化
体及びこれらの塩に関する。

（発明の背景） 生体内に異物２例えば細菌やウィルスの侵入が起こった
場合には、侵入局所での炎症反応が惹き起こされ、さら
には免疫応答による生体防御反応が誘導される。これら
一連の生体反応に関与する物質として、マクロファージ
よシ産生される因子が注目され、その生物学的作用の違
いよシ、リンパ球活性化因子、Ｂ細胞活性化因子、ある
いは内因性発熱物質等と呼ばれていたが、互いに物理化
学的性質が類似しているので。

インターロイキン−１（ＩＬ−１）として統一し呼称さ
れた。

ＩＬ−１は、当初単球、マクロファージ、あるいは単球
性白血病株から産生されるとされたが。

その後皮膚ケラチノサイト、脳の星状細胞、グリア細胞
、腎糸球体メサンギウム細胞、眼の角膜細胞等、多くの
組織由来の細胞から産生されることが明らかになるにつ
れ、その多彩な役割が注目されてきた。

ＩＬ−１およびその前駆体をコードする２種類の遺伝子
がクローニングされ、その全アミノ酸配列も決定された
（ＩＬ−１αとＩＬ−１β）　［Ｎａｔｕｒｅ３１２、
４５８（１９８４）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８１、７９０７（１９８４）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１
５．６４１　（１９８５）ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
　　Ｒｅａ、、１３．５８６９（１９８５）コ。

現在では遺伝子組み換え法により大量に、かつ均一７’
ｆＩＬ−１が得られるようになり、ＩＬ−１の多様な生
物学的作用が認められてきた。その主な作用として、腫
瘍増殖の抑制や完全退縮が認められること［Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、、１３６．３０９８（１９８６）。

Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　９
．３３０（１９８６）コ、放射線障害防止作用［Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３６．２４８３（１９８６）］。

日和見感染に対する防御作用［Ｉｎｆｅｃｔ−Ｉｍｍｕ
ｎ、、５５＋１４３６（１９８７）］が期待されている
ほか、ＩＬ−１は内因性発熱物質であること、また結合
組織系細胞、即ち溝膜細胞や線維芽細胞からのプロスタ
グランジンＥ２　（Ｐ　Ｇ　Ｅ２　）の産生亢進作用を
有していることが報告されている。筺た最近では。

ＩＬ−１は線維芽細胞の増殖を促進することから動脈硬
化の増悪に関与するとの報告や、β細胞の疾病の治療に
対して傷害的に働くこともあり。

ＩＬ−１の医薬としての利用を複雑にしている。

最近いくつかのＩＬ−１α誘導体（特開昭６２−１８５
０９７　）や、ＩＬ−１β誘導体（特開昭６３−１５２
３９８　）、　ＩＬ−１の部分合成ペプチド（特開昭６
２−１８５０９５　）が報告され、ＩＬ−１の作用の抽
出や改善が試みられている。壕だ本発明者らは、既に作
成したＩＬ−１β誘導体が天然のヒトＩＬ−１βと比較
して改良されたＩＬ−１活性を有し、医薬品として有用
に使用できることを知り。

特許出願（特願昭６３−２７２０１９　）　している。

（解決手段） 本発明者らは、かかる技術水準下に種々研究した結果、
下記式（Ｉ）で示される文献未載のデカペプチド、その
エステル、そのアミド、そのアシル化体やこれらの塩が
、ＩＬ−１活性を有することをつきとめ２本発明を完成
させるに至った。

Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ　（Ｉ）すなわち２本発
明は、上記式（１）で示されるペプチド、そのエステル
、そのアミド、そのアシル化体又はこれらの塩を発明の
構成とする。

本発明の目的は、上記の新規化合物の提供にある。

本発明の他の目的は、下記の記載及び実施例により明ら
かにされる。

本発明者らはペプチド合成に先立ち、ヒ）ＩＬ−１タン
パク質の活性部位の同定を行った。ヒトＩＬ−１βタン
パク質は結晶化され、Ｘ線解析によりその立体構造が明
らかにされている［ＥＭＢＯ。

Ｊ、、７．３３９（１９８８）コ。これによると、ヒト
ＩＬ−１βは、１２本のβ−シートを構成するアミノ酸
と、それを連絡するαループを構成するアミノ酸の部分
からなり、２本の逆平行なβ−シートの組が１辺を成す
四面体構造を呈している。さらには、ＩＬ−１βの活性
部分として想定されているアミノ酸配列［Ｊ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、、　１３７．３２０１（１９８６）］が、４
番目のβ−シートの後半から５番目のβ−シートの前半
部分を構成している［蛋白質・核酸・酵素、　３３．１
７９３（１９８８）コことが示唆されている。

また、ＩＬ−１のアミノ酸配列は、ヒト、ウシ。

マウス、ウサギらでよく保存されておジ２種特異性が低
いことが知られている。さらに、タンパク質の活性部位
は、比較的親水性の高い領域に多く見いだされることが
知られている。

本発明者らはこれらの点に着目し、特によく種間で保存
されており、比較的親水性の高い領域である。５番目と
６番目のβ−シートを連絡し、かつ四面体の頂点の一つ
を構成するαループ部分に相当するペプチド（Ｐ　ｒｏ
ｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ。

ＵＳＡ、　８１．７９０７（１９８４）の文献に示され
たＩＬ−１βのアミノ酸配列において１７５位から１８
４位）を合成したものである。

（化合物） 以下に９本発明化合物につき詳述する。

式（Ｉ）のペプチドのエステルには、Ｃ末端のカルボキ
シル基及びＧｌｕ　（グルタミン酸残基）のγ−カルボ
キシル基の一方又は双方と、アルコール成分とが結合し
て形成するエステルが金管れ、このようなエステル形成
アルコール成分としてＦｉ、　　メタノール、エタノー
ル、プロパノールウインプロパツール、ブタノール、イ
ンブタノール、　　ｔｅｒｔ−ブタノールなどの炭素数
１乃至６個の直鎖又は分岐状の低級アルコールや、ベン
ジル基などのアラルキル基が挙げられる。

また９式（Ｉ）のペプチドのアミドとしては、Ｃ末端の
カルボキシル基及びＧｌｕ　（グルタミン酸残基）のγ
−カルボキシル基の一方又は双方がカルバモイル基であ
る化合物が挙げられる。

筐た２式（Ｉ）のペプチドのアシル化体としては。

Ｎ末端のアミノ基及びＬｙｓ　（リジン残基）のε−ア
ミノ基のいくつか、捷たはすべてと、有機酸成分とが結
合して形成するアシル化体が含すれ、このような有機酸
成分としては、ギ酸、酢酸、ミリスチン酸、コハク酸、
マレイン酸、グルクロン酸などが挙げられる。

本発明のペプチド、そのエステル、そのアミド、そのア
シル化体は、酸付加塩を形成する場合がある。かかる塩
としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝
酸、リン酸等の鉱酸、ギ酸、酢酸、炭酸、トリフルオロ
酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸。

フマール酸°、マレイン酸、　乳酸、　　ＩＪンゴ酸、
酒石酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸。

ピクリン酸などの有機酸との酸付加塩が挙げられる。

また９本発明のペプチド、そのエステル、そのアミド、
そのアシル化体は、塩基との塩を形成する場合がある。

そのような塩としてはカリウム、ナトリウムなどのアル
カリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土
類金属、アルミニウムなどの■価の金属との塩、アンモ
ニウム塩。

々どが挙げられる。

本発明化合物はデカベグチド又はその誘導体であるから
少々くとも１０個の不斉炭素原子を含み、異性体が存在
する。本発明にはこれら異性れる。従って９本発明化合
物を構成するアミノ酸残基はＬ体のアミノ酸残基に限定
されるものではなく、Ｄ体、ＤＬ体であってもよい。中
でも２本発明化合物の好適なＩＬ−１活性剤としては天
然型のものあるいは１０個のアミノ酸残基の一部がＤ型
となったものが挙げられる。

なお９本発明ペプチド（Ｉ）を示すアミノ酸残基の記号
は、当分野で慣用されているアミノ酸の三文字略記法に
基づいて表わしたものであり。

Ａｌａ　：アラニン、Ｌｅｕ：ｏイシン、ｃｔｙニゲリ
シン。

Ｌｙｓ　：リジン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ａｓｎ：ア
スパラギン。

Ｔｙｒ　：チロシン のそれぞれの残基を示している。

〈製法〉 本発明ペプチド、そのエステル、そのアミドそのアシル
化体、又はこれらの塩は、ペプチド合成法の一つである
各種保護基、カップリング試薬などを駆使して行うカッ
プリング法、Ｃ端活性化法、Ｎ端活性化法などの液相法
を用いて合成することはもちろん可能であるが簡便に生
産及び精製が可能な固相法［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　［
Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　８５．２１８５　（１９６３
）　］によって初めて紹介され、その後改良が加えられ
ている方法］を適用して合成するのが有利である。固相
法によってペプチドを合成するに当っては、優れたペプ
チド自動合成機９例えばアプライド・バイオシステムズ
社のペプチド自動合成機４３０　Ａなどが市販されてお
り、このような装置の標準的運転プログラムに従って行
なえばよい。なお２本発明ペプチドの製法として、現在
市販品装置の適用のみに限定されるべきでないことはい
うまでもない。

エステルは９本発明ペプチドあるいはそのＣ端活性化体
に前記アルコールを縮合剤、酸、塩基触媒の存在下又は
非存在下に作用させる常法により、アミドは１本発明ペ
プチドあるいはそのＣ端活性化体にアンモニア又はその
塩を作用させる常法によりそれぞれ合成される。また。

ペプチド自動合成の際に初発担体として、ベンズヒドリ
ルアミンを結合させた固相担体を用いれば固相担体より
遊離させたときにＣ末端のアミドとして得られる。さら
に、ペプチド自動合成の最終段階で、有機酸成分活性化
体を作用させる常法により、Ｎ末端アミノ基及びＬｙｓ
のε−アミノ基のいくつか、またはすべてがアシル化さ
れた誘導体を合成することができる。

これらの合成ペプチドは、さらに精製度を高めるために
９分取用逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）によって精製するのが有利である。

ｋお、この精製法適用によりペプチド自動台て単離する
ことができる。＋ なお、純度は分析用逆相ＨＰＬＣによって確立した。

また９合成ペプチドの純度、安定性を維持するためには
、凍結乾燥するのが好適である。なお９本発明ペプチド
を製造する方法として、このペプチド（Ｉ）をコードす
るＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法により生産させるこ
とによって行うことも可能である。

（発明の効果） 本発明の新規ペプチド（Ｉ）やそのエステル。

そのアミド、そのアシル化体及びこれらの塩（以下ペプ
チド類という）は、ＩＬ−１βに認められるのと同様の
薬理作用を有しているが、幾つかの作用については選択
性があり、その作用が改善されている。す々わち１本発
明の新規ペプチド類は、リンパ球活性化作用、インター
ロイキン−２（ＩＬ−２）の産生亢進作用、抗体産生の
増強やコロニー刺激因子（Ｃ８Ｆ）亢進作用等免疫系細
胞に対する作用の増大１発熱作用の減少やＰＧＥ、産生
先進作用の減少などで改良されたＩＬ−１活性を示すこ
とができる。

さらに２本発明の新規ペプチド類は、　　ＩＬ−１と同
様マクロファージ、血管内皮細胞や線維芽細胞などから
のＣ８Ｆ産生を促進し［Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、８１，９２　（１９８８）；　Ｂｌｏ
ｏｄ、６８，１３１６（１９８６）コかつ放射線障害防
止作用を有していることから。

化学療法剤治療や放射線治療後の顆粒球減少症や放射線
障害防止に有用であり、また９日和見感染に対する抗感
染剤、抗炎症剤としても有用である。

更に９本発明の新規ペプチド類は、他の生理活性物質、
化学療法剤や免疫増強剤と併用して用いることによりそ
の治療効果を高めることができる。例えば、ＩＬ−２，
腫瘍壊死因子（ＴＮＦα、　ＴＮＦβ）ヤインターフェ
ロンーガンマ（ＩＦＮγ）等と併用することにより、免
疫増強作用や抗腫瘍作用に於て、相加並びに相乗効果が
認められる。化学療法剤や免疫増強剤等と併用すること
により、その抗腫瘍効果を増強し、かつ副作用を低減せ
しめることができる。また、５−ＦＵによる造血障害に
対して、Ｇ−Ｃ８Ｆとの併用により相乗的に回復作用を
果たすことや肺臓中のコロニー形成能の増強作用を有す
ることが期待できる［Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏＬ、１４０．
３８３０（１９８８）］。

（実施例） 以下に実施例を掲記し本発明を更に詳細に説明する。な
お、実施例は本発明を限定するものではない。

実施例１ ペプチド合成及び精製 ペプチドの合成はアプライド・バイオシステムズ社のペ
プチド自動合成機４３０Ａ型を用イテ。

同社市販の試薬、溶媒類を使用し、同機の標準的な運転
プログラムに従って行った。即ち、α−ｔ−フチルオキ
シカルボニループロモペンジルオキシカルボニルーＬ−
チロシン（０，５ミリモル）が結合したポリスチレン固
相担体を、　５０％トリフルオロ酢酸−塩化メチレンで
処理し、ｔ−ブチルオキシカルボニル基を除去し、Ｌ−
チロシンのα−アミノ基を遊離させた。これに４当量の
α−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシンを２当
量のジシクロへキシルカルボジイミドで活性化し、生成
したＬ−ロイシンの活性エステルを縮合させた。これら
の工程はプログラムに従ってチロシンが合成された。以
下、トリフルオロ酢酸によるｔ−ブチルオキシカルボニ
ルの脱離と、ジシクロへキシルカルボジイミドを活性化
剤とするアミノ酸の縮合をＬ−アスノくラギン。

Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン。

Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ロイシン。

Ｌ−アラニンで自動的にくり返しく但し、Ｎ−末端をｔ
　−Ｂｏｃで保護したものを用いているが。

リジンｅ−ア□ノ基についてはｐ−クロロベンジルオキ
シカルボニル基で、グルタミン酸のγ−カルボキシル基
についてはベンジル基で保護したものを用いた）、固相
担体上にデカペプチドを合成した。ただし、Ｌ−アスノ
くラギンの活性には４当量のジシクロへキシルカルボジ
イミドと４当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを
用いた。樹脂から合成ペプチドの脱離は、　　４３０Ａ
ユーザーズマニユアルに記述される操作によりトリフル
オロメタンスルホン酸で処理することによって達成され
、凍結乾燥後４２５■の粗製ペプチドを得た。得られた
粗製ペプチドは逆相カラムを用いた分取用ＨＰＬＣで精
製した。即ち、粗製ペプチドを５０％アセトニトリル水
溶液に溶解し、逆相カラム（センシュー科学。

ＯＤＳ　−Ｈ−５２５１，ｔ　２０　ｘ　２５０ｍｍ）
にかげて、Ａ液（０，１％トリフルオロ酢酸）５％とＢ
液（０，１％トリフルオロ酢酸−７０％アセトニトリル
）９５％との混液からＡ液４０％とＢ液６０％との混液
までのグラジェントで溶出した。ペプチドを含むフラク
ション（島津５ＰＤ−６Ａ装置による２１０μｍの吸収
を分析して同一性を確認した）を集め。

減圧下で乾固し、　Ａｌｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−’Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒのトリフル
オロ酢酸塩として白色の粉末を得た。

得られたペプチドは５０％アセトニトリル水溶液に溶解
し９分析用逆相カラム（センシュー科学、　　０ＤＳ−
Ｈ−１２５１，ｒ４．６Ｘ２５０ｍｍ）　　にかげ。

流速０．７　ｍ１７分、Ａ液１００％からＢ液１００％
まで３５分間のグラジェント溶出によるＨＰＬＣによる
単一性を確認した（保持時間約２１分に単一ピークが認
められた）。得られたペプチドを１５０℃。

１時間で６Ｎ塩酸（１％フェノールを含む）によって加
水分解した後、アミノ酸分析によって同定した。分析に
よって得られた残基の値を第１表に示す。

第　　１　　表 実施例　２ リンパ球活性化因子（ＬＡＦ）活性の測定ＬＡＦ活性「
Ｍｉｚｅｌ、　Ｓ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉ　
ＩｍｍｕｎａＬ、　１２０　。

１４９７　（１９７８）］は、マイトジェンによるマウ
ス周線細胞分裂作用を促進させる生物活性であり、これ
によって実施例１で得られたペプチド（Ｉ）のトリフル
オロ酢酸塩の活性を測定した。

析液の５０μｌを９６穴平底型マルチプレートに入れ、
それぞれに４−６週令の雄のＣ３Ｈ／　ＨｅＪマウスよ
り採取した脚線細胞（ｌ　Ｘ　１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｔ
）とコンカナバリンＡ（０，６μｇ／ｍ７）を含む細胞
浮遊液を。

１００μを加え、５％二酸化炭素を含む３７℃の培養器
内で、４８時間培養した。ついで３Ｈ−チミジンを１．
８５　ｋＢｑ　／２０μｌ／穴加え、さらに１８時間培
養後、セルノ・−ペスタを用いて、細胞をグラスファイ
バーフィルター上に集め、液体シンチレイションカウン
ターでその細胞内に取り込まれた３Ｈ−チミジン量を計
測することにより、脚線細胞の増殖を測定した。

第１図は実施例１で得られたペプチド（Ｉ）のトリフル
オロ酢酸塩の脚線細胞の増殖におよぼす影響を示すグラ
フである。縦軸には胸線細胞４゜ に取り込まれた３Ｈ−チミジンの量（ｃｐｍ）として。

横軸にはこの合成ペプチドの濃度をμｇ／ｍｌとして示
した。合成ペプチドによる３Ｈ−チミジンの正味の取り
込み量で示した。第１図から明らかなように９本発明合
成ペプチド（■）トリフルオロ酢酸塩がマウス胸腺細胞
分裂活性を有することが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例１で得られたペプチド（Ｉ）の
トリフルオロ酢酸塩が周線細胞の増殖におよぼす影響を
示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式 Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌ
   ｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒで表わされるペプチド、
   そのエステル、そのアミド、そのアシル化体、又はこれ
   らの塩。