JPH03503054A - ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 −２−ツー二Ｌ−２− ■Ｈ 本発明は、寄生線虫類の種、例えばトリキネラ属、アンキロストマ属、円虫属、 毛様線虫属、針虫属、オステルタジア属、烟虫属、トキサスカリス属、ランシナ リア属、鞭虫属、ジロフィラリア属、トキソカラ属、ネカトール属、撓虫属、ス トロンギロイデス属および糸状主属、特に毛様線虫属および針虫属の種による感 染に対して宿主に防御免疫を誘導する抗原の同定に関するものである。このよう な種の例には、旋毛虫、イヌ鉤虫、ストロンギルスブルガリス、コルブリフォル ミス毛様線虫、捻転毛様線虫、オステルタジアオステルタジ、ブタ畑虫、ライオ ントキサスカリス、狭頭鉤虫、トリクリスプルビス、イヌ糸状虫、トキソカラ種 の幼虫、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、回虫、ヒト駆虫、焼去、糞線虫およびバン クロフト糸状虫、特にコルブリフォルミス毛様線虫および捻転毛様線虫が含まれ る。

本発明はまた、これらの抗原をコードするヌクレオチド配列並びにこのようなヌ クレオチド配列を含有する組換え体ＤＮＡ分子およびこれらのヌクレオチド配列 を発現する宿主細胞にも関する。

本発明は更に、本発明の抗原、ヌクレオチド配列、組換え体ＤＮＡ分子および宿 主の作成方法に関するものである。

本発明は本発明の抗原に対して生じる抗体およびこれら抗体と同様に作用する化 合物に関するものである。

更に、本発明は寄生線虫、例えばトリキネラ属、アンキロストマ属、円虫属、毛 様線虫属、針虫属、オステルタジア属、姻虫、トキサスカリス属、ランシナリア 属、鞭虫属、ジロフイラリア属、トキソカラ属、ネカトール属、焼去属、ストロ ンギロイデス属および糸状主属、特に毛様線虫属および針虫属の種による感染に 対して防御免疫を誘導するワクチンに関する。このような種の例には、ヒトの旋 毛土着しくはイヌ鉤虫、ウマのストロンギルスブルガリス、ヒツジおよびヤギの コルブリフォルミス毛様線虫、ヒツジおよびヤギの捻転毛様線虫、ウシのオステ ルタジアオステルタジ、ブタのブタ畑土着しくは旋毛虫、ネコのライオントキサ スカリス若しくは狭頭鉤虫、イヌのイヌ鉤虫若しくはトリクリスプルビス、イヌ のイヌ糸状虫またはヒトのトキソカラ種の幼虫或はアメリカ鉤虫、スビニ鉤虫、 回虫、ヒト駆虫、焼土、糞線虫またはバンクロフト糸状虫による感染、特にコル ブリフォルミス毛様線虫または捻転毛様線虫が含まれる。

ｌ二」し」Ｌ−逝 キューティクルで覆われた長くて紡錘状または袋様体を有する無節の円筒形状虫 である線虫（ｎｅｍａ−系；　ｏｉｄｅｓ　　＠似する）は天然の、生息土壌、 水および植物の殆ど至る所に所在しており、そして広範囲の動物および植物の寄 生虫疾病に太き（係わっている。

哺乳動物の線虫寄生虫は線形動物門に属する。線虫に鉤虫（例えば、アメリカ鉤 虫およびズビニ鉤虫）、回虫（例えば、普通の回虫）、砂土（例えば、ヒト駆虫 ）および焼虫または線状虫（例えば、焼土）並びに糞線虫、旋毛虫およびフィラ リア虫、即ちバンクロフト糸状虫が含まれる。他の重要な線虫寄生虫には、イヌ 鉤虫（ヒトの感染）、ストロンギルスブルガリス（ウマの感染）、コルブリフォ ルミス毛様線虫、オステルタジアサーカムシンクテ（ヒツジおよびヤギの感染） 、捻転毛様線虫（ヒツジおよびヤギの感染）、オステルタジアオステルタジ、ヘ モンカスブラセイ（ウシの感染）、ブタ培土（ブタのを染）、ライオントキサカ リスまたは狭頭鉤虫（イヌの感染）、トキソカラ種（ヒ１−の循環系感染）およ びイヌ糸状虫（ネコおよびイヌの循環系感染）が含まれる。

症状がないときでさえ、寄生虫感染は、例えば下記の多くの理由から宿主動物に 有害である。即ち、これらの寄生虫は宿主から食物を奪い、器官を傷つけそして 管をふさぎ、宿主に毒性の物質を産生ずる可能性があり、そして他の生物への侵 入口を提供する。他の場合には、宿主が食物用に育成される種であることもあり 、そして食することによって寄生虫が運ばれて食した動物を感染させることがあ るからである。このような寄生虫が発見された場合には、これら寄生虫はできる だけ早（除去することが非常に望ましい。

より一般的には、このような感染には症状がない。哺乳動物の嬬虫感染、特に寄 生線虫による感染には、特に家畜ペット、例えばヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤ ギ、イヌ、ネコおよびトリ、殊に家禽の大きな経済的損失の源である（ＣＳＩＲ Ｏ／ＢＡＥ報告−「農業分野における社会−経済発展および傾向：将来の研究の 展望」参照）、これらの動物はこのような感染をコントロールしておくために駆 虫薬化学品で定期的に処置しなければならない。そうしなければ、このような疾 病によって貧血、下痢、脱水１食欲不振を生じ、そして更に死に至ることさえあ る。

畑土感染を抑制するために現在利用可能な唯一の手段は駆虫薬化学品を使用する ことであるが、これらの化学品は処置時に存在する虫に対してしか有効でない。

それ故、動物は常に感染にさらされているので継続して処置しなければならない ０例えば、ジエチルカルバマシンによる駆虫薬処置は、イヌ糸状虫を抑制するた めに１年の殆ど毎日または１日置きに実施する必要がある。これは高価で且つ労 働集約的な方法である。駆虫薬化学品の広範囲な使用によって、寄生虫は耐性を 現わすので新規で更に強力なりラスの化学品を開発しなければならない、別の方 法が明らかに望ましい。

寄生線虫に対するワクチンの開発によって畑土感染の予防および治療のための化 学品処置に固有の欠点の多くが克服されるであろう。ワクチンによる防御は確実 に長期間持続し、ワクチン投与された動物だけが影響を受け、そして毒性の問題 や残留物の持続は最も小さくなるかまたは避けられよう、従って、寄生線虫を使 用して上記のようなワクチンを開発する試みが幾つか報告されている。残念なこ とには、それらの試みは限られた成功しか得られず、そして材料の入手可能性お よびワクチンの安定性のようなフォクターによってそれら試みの大規模な使用が 妨げられている。

Ｊ、に、ディニーン（Ｄｉｎｅｅｎ）　（１９７７）が記載した上記のような１ つの試みは照射した幼虫ワクチンの使用に係わるものである。このような他の試 みと同様に、この方法の有用性は、生存線虫を長期間維持する必要性があるため に制限される。

死滅ワクチン製剤が良好な駆虫薬防御をもたらし得ないのは多数のファクターに よるものと考えられている。例えば、Ｊ、Ｔ。

袴、ネイルソン（Ｎｅｉｌｓｏｎ）　（１９７５）は、寄生線虫が宿主の免疫系 を免疫抑制するかまたは免疫調節する産生物を分泌できるメカニし且つ宿主が他 の感染にかかり易くなると考えている。デイニーンおよびワグランド（Ｗａｇｌ ａｎｄ）　（１９８２）は、免疫抑制物または免疫調節物が死滅ワクチンに使用 される寄生線虫の粗製調製物中に存在すると考えている。これらの総説論文で示 唆された第２の問題は、寄生線虫がそれらの抗原プロフィールを宿主のプロフィ ールに似たものに変え、その結果、天然の感染では、活力のある免疫学的反応が 防御的寄生虫抗原では誘発されないということである。このような現象は、死滅 した線虫またはその抽出物の不純な調製物によるワクチン投与後にも生起する。

寄生虫の全ホモジネートおよび不純なサブフラクションを使用して宿主動物から 寄生虫の急増が加速されることを示している研究者もいる。例えば、ロースウェ ル（Ｒｏｔｈｗｅｌｌ）および共同研究者（１９７４，１９７７，１９７９）　 、オツドネル（０’　Ｄｏｎｎｅｌｌ）等（１９８５）、ネイルソンおよびファ ンドウワール（Ｖａｎ　ｄｅ　Ｗａｌｌｅ）（１９８７）、シルバーマン（Ｓｉ ｌｖｅｒｍａｎ）　　：米国特許第８９４　、６０３号、オーストラリア特許第 ２４７，３５４号、アダムス（Ａｄａｍｓ）　（１９８９）、イースト（Ｅａｓ 　ｔ）等（１９Ｂ９）、ムン（Ｍｕｎｎ）およびグリーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗ ｏｏｄ）　（１９８７）　（オーストラリア特許出願第７７５９０／８７号）、 コナン（Ｃｏｎｎａｎ）　（１９６５）、サビン（Ｓａｖｉｎ）等（１９８８） およびマツクギリバリー（ＭｃＧｉｌｌｉｖｅｒｙ）等（１９８Ｂ）参照。

これらの研究では全て、線虫の粗製抽出物が動物にワクチン接種するために使用 されており、そして該抽出物のどの特定された抗原またはどの個々の成分も防御 に寄与していると同定されていない。

精製された防御成分を同定しようと試みている報告が幾つかある。例えば、シル バースタイン（Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ）およびデスボミア＝（Ｄｅｓｐｏｖ＋ ＋１ｅｒ）　（１９８５）、ヘッツ（Ｈｏｅｔｚ）等（１，９８５）、グランデ ィア（Ｇｒａｎｄｅａ）等（１９８９）、ルシウス（Ｌｕｃｉｕｓ）等（１，９ ８８）、ドネルソン（Ｄｏｎｅｌｓｏｎ）等（１９８８）、ニルセン（Ｎｉｌｓ ｅｐ）等（１９８８）参照。

しかし乍ら、記載された成分に関しては防御は示されていないしまたは証明され てもいない。

１つの天然の宿主／寄生線虫系でしか、精製してクローン化したサブユニットが 防御的であるとは示されていない、オーストラリア特許出願第１９９９８／８８ 号で、線虫トロポミオシンに対して証明されている絹換え体［）ＮＴ由来の抗原 が捻転毛様線虫抗原投与に対してヒツジで５０％の防御をもたらしたことが証明 された。本願明細書で後で明らかになる理由によって、この抗原は本願明細書中 で同定される抗原とは異なっている二本願の抗原はインビトロでのインキュベー ジラン後に線虫の排泄／分泌液体中で見られる。

Ｃ３ｌＲＯ／ＢＡＥ研究報告「農業分野における社会−経済発展および傾向：将 来の研究の展望、１は、オーストラリアのヒツジ産業における３つの最も緊急な 健康課題の１つとして腸内寄生虫を記載しており、これらの感染をより良く制御 するためにはワクチンの開発に多大の期待が持たれている。

寄生線虫に感染している動物が免疫を発現しその後の感染にかかり難くなること が確立されている（Ｒｏｔｂｗｅｌｌの総説、１９８９参照）。

感染した宿主動物の免疫系は寄生虫感染中に多くの寄生虫タンパク質を認識する ことが証明されている（例えば、Ｏ’Ｄｏｎａｌ１等、１９８５）が、免疫応答 の多くは再感染への抵抗性に関しては機能的な意義を有していない。主要な段階 は、寄生生物中に存在する何千ものタンパク質から、宿主動物を再感染から防御 する免疫応答を該宿主動物に誘導することができる個々のタンパク質を同定する ことである。

バイオテクノロジー、特に組換え体ＤＮＴ技術における最近の進歩によって、ヒ トおよび家畜動物の経済的に重要な一連の寄生虫に対する商業的に実施可能なワ クチンを製造する機会が現実的に提供される。この試みは提起された問題点の多 くを克服して、粗製寄生虫調製物を使用する死滅ワクチンの有効性の欠如原因を 明らかにするであろう０例えば、組換え体ＤＮＴ技術により製造されたワクチン は、寄生線虫種の粗製抽出物中に尭い出される可能性のある免疫抑制物または免 疫調節物を含有しないであろう。しかし、先ず抗原を同定することが必要である 。

同定されそして特徴が決定されると、これらタンパク質または防御エピトープを 含有するこれらタンパク質の部分を合成する微生物を構築するために組換え体Ｄ Ｎ？技術を使用することが可能でありそして寄生虫の感染から動物を防御するた めに組換え体生物により合成された産生物がワクチンに使用される。

本願発明者は成虫コルブリフォルミス毛様線虫から得た排泄／分泌産生物を詳細 に研究し、標的動物のワクチン接種後に防御をもたらし得る混合物から成分を精 製し、そして分子レベルで特徴を決定した。

本生肌勿説ユ 本願発明者は、寄生線虫種の排泄／分泌産生物で免疫化することによって寄生線 虫の感染に対して防御免疫を誘導できることを見い出した。コルブリフォルミス 毛様線虫の成虫の排泄−分泌液体から精製し特徴を決定した５つの分子は、Ｔｃ 　Ａｄ　ＥＳＡＩ、Ｔｃ　　Ａｄ　ＥＳＡ２　、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ３、Ｔｃ　 Ａｄ　ＥＳＡ４およびＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ５と命名して記載する。本発明者は、 ワクチン投与すると、これらタンパク質がコルブリフォルミス毛様線虫感染に対 してモルモットで防御応答を誘導することを見い出した。

成虫は感染２１日後にヒツジから回収し、洗浄しそして抗生物質を含有するＲＰ 旧１６４０培地中３７°Ｃで１６時間維持した。コルブリフォルミス毛様線虫か ら得た排泄／分泌液体を含有する上記の培地は、グイアフロ（Ｄｉａｆｌｏ）膜 で濃縮し、ヒラマメレクチン−セファロース４Ｂカラムに吸収させて分画した。

未結合フラクション（ＬＬ−）および結合フラクション（ＬＬ”″、メチルマン ノシドで溶離）は各々僅か２．３のタンパク質バンドを有しており、更にポリア クリルアミドゲル電気泳動および電気溶離で分画した。　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ 、　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ２、およびＴｃ　ＡｄＥＳＡ５と称される３つのタンパ ク質がヒラマメレシチン結合フラクションから単離され、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ３ およびＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４と称される２つのタンパク質が更に未結合フラクシ ョンから単離された。

ヒツジの実験室モデルであるモルモットの腹腔内注入後に、全部で５つのタンパ ク質がコルブリフォルミス毛様線虫感染に対して免疫を与える。

本発明の抗原の例は精製タンパク質Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ ２、Ｔｃ　Ａｄ　Ｂ５Ａ３、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４およびＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ５ であり、Ｓ［１Ｓ−ＰＡＧＥで推定するときそれぞれ３０．３７．１７．１１お よび８１ｋＤの分子量を有している。

本発明の第１の実施態様に従って、第１の寄生線虫種に由来し第２の寄生線虫種 （これらは第１の線虫種と同一または異なることができる）による宿主の感染に 対して防御免疫を誘発することができる排泄／分泌タンパク質；または排泄／分 泌タンパク質の全体、部分、類似体、同族体、誘導体若しくはそれらの組み合わ せ物からなり、寄生線虫による感染に対して宿主に防御免疫を誘発し得るタンパ ク質分子からなる抗原が提供される。

好ましくは、排泄／分泌タンパク質は５Ｏ３−ＰＡＧＥで推定するとき概算分子 量１１．１７．３０．３７または８１ｋＤを有する。

典型的には、第１の寄生線虫種はトリキネラ属、アンキロストマ属、円虫風、毛 様線虫風、針虫属、オステルタジア属、畑虫属、トキサスカリス属、ランシナリ ア属、鞭虫属、ジロフィラリア属、トキソカラ属、ネカトール属、焼去属、スト ロンギロイデス属および糸状主属の種から選択される。このような種の例には、 旋毛虫、イヌ鉤虫、ストロンギルスブルガリス、コルブリフォルミス毛様線虫、 捻転毛様虫、オステルタジアオステルタジ、ブタ蛤虫、ライオントキサスカリス 、狭頭鉤虫、トリクリスプルビス、イヌ糸状虫、トキソカラ種、アメリカ鉤虫、 スビニ鉤虫、回虫、ヒト駆虫、焼出、糞線虫およびバンクロフト糸状虫がある。

典型的には、第２の寄生線虫種は、トリキネラ属、アンキロストマ属、円虫風、 毛様線虫風、針虫属、オステルタジア属、徊虫属、トキサスカリス属、ランシナ リア属、鞭虫属、ジロフィラリア属、トキソカラ属、ネカトール属、蛸虫属、ス トロンギロイデス属および糸状主属の種から選択される。このような種の例には 、旋毛虫、イヌ鉤虫、ストロンギルスブルガリス、コルブリフォルミス毛様線虫 、捻転毛様線虫、オステルタジアオステルタジ、ブタ畑虫、ライオントキサスカ リス、狭頭鉤虫、トリクリスプルビス、イヌ糸状虫、トキソカラ種、アメリカ鉤 虫、スビニ鉤虫、回虫、ヒト駆虫、撓虫、糞線虫およびバンクロフト糸状虫があ る。

好ましくは、第１の寄生線虫種はコルブリフォルミス毛様線虫である。

好ましくは、第２の寄生線虫種はコルブリフォルミス毛様線虫または捻転毛様線 虫である。

本発明の第２の実施態様に従って、第１の実施態様の抗原のアミノ酸配列をコー ドする第１のヌクレオチド配列；第１のヌクレオチド配列とハイブリッドを形成 するヌクレオチド配列；または１つ若しくは多数の塩基置換、挿入若しくは欠失 を含む変異によって第１のヌクレオチド配列と関連したヌクレオチドが提供され る。

本発明の好ましいヌクレオチド配列は、５Ｄ５−ＰＡＧＥで推定するとき概算分 子量１１．１７．３０．３７および８１ｋＤを有する第１の実施態様の排泄／分 泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。

好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。本願発明が包含するＤＮＡ 配列は、例えば、コルブリフォルミス毛様線虫細胞から総ＤＮＡを抽出しそして 標準的な方法でＤＮＡ配列を単離することによって製造することができる。或は 、ＤＮＡはインビトロで、合成的に、または生合成的に、例えばｍＲＮＡ鋳型を 使用して製造することができる。

本発明の第３の実施態様に従って、第１の実施態様による抗原をコードするＤＮ ＡまたはＲＮＡ配列を選択する方法が提供される。該方法は１つまたはそれ以上 のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を提供し、そしてどの配列が、第１の実施態様の抗原 をコードすることが知られているＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリッド形成す るのかを決定することからなるか、或いは抗原の抗血清を提供しそして抗原を発 現する宿主−ベクターの組合せを同定することからなる。

該配列は天然起源であることができ、ＲＮＡ配列、合成配列、組換え体ＤＮＡ分 子から得たＤＮＡ配列またはこれら配列の組合せ物であることができる。

好ましくは、抗原をコードするＤＮＡを同定しそして特徴を決定するために使用 される方法は、抗原を産生ずる細胞からａ＋ＲＮＡ種の抽出、ｍＲＮＡ種の二重 鎖（ｃＤＮ＾）への転換およびこれらの自律的複製フォクター、例えばプラスミ ドまたはファージベクター中への挿入に係わっている。これに続いて、細菌株の ような宿主細胞を上記ファクターで形質転換し、そして任意の他の細胞タンパク 質成分と異なる抗原をコードするＤＮＡを含有するクローンを検出するためにｍ ＲＮＡまたはＤＮＡ配列をコードする抗原に相補的である０合成りＮＡプローブ で産生されたライブラリーをスクリーニングする。

本発明の第４の実施態様に従って、第３の実施態様のＤＮＡ配列およびベクター １１ＮＡからなる組換え体ＤＮＡ分子が提供される。

ＤＮＡ配列は天然、合成または生合成りＮＡ配列であることができる。

本発明の好ましい組換え体ＤＮＡ分子には、ＤＮＡ配列に操作して結合された発 現制御配列が含まれる。

本発明の１つの好ましい形態では、ＤＮＡ配列は大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ に操作して結合されている。他の好ましい制御系にはトリプトファン（Ｔｒｐ） オペロン、大腸菌のＴｒａ−Ｔ遺伝子、バクテリオファージラムダの左側プロモ ーター、Ｃｕｐｌプロモーターおよびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ またはウィルスプロモーター、例えばＳＶ４０初期プロモーターが含まれる。

好ましくは、ベクターＤＮＡはプラスミドＤＮＡである。適当なプラスミドベク ターには、ｐＵＲ２９０Ｓｐ［Ｉｃ１８　、ｐＹＥＵｃ１１４およびそれらの誘 導体が含まれる。

或は、ベクターＤＮＡはバクテリオファージラムダのようなバクテリオファージ ＤＮＡ並びにラムダｇｔｌｌおよびラムダｇｔｌＯのような誘導体であることが できる。

本発明の第５の実施態様に従って、プロモーター、翻訳開始シグナルおよび第３ の実施態様のＤＮＡ配列からなる融合遺伝子が提供される。

本発明の第６の実施態様に従って、第３の実施態様のＤＮＡ配列からなるＤＮＡ 挿入物を提供することおよび１ｏＮａ挿入物をクローニングベクター中に導入す ることからなる、第４の実施態様の組換え体ＤＮＡ分子の製造方法が提供される 。

好ましくは、該ＤＮＡ挿入物はクローニングベクター中に、発現制御配列に関し て正しい配置で且つ正しい読み取り枠で導入される。

本発明の第７の実施態様に従って、第４の実施態様の少なくとも１つの組換え体 ＤＮＡ分子で形質転換された宿主が提供される。

好ましくは、形質転換された宿主は第１の実施態様の抗原を発現することができ る。

適当な宿主には、細菌細胞、サツカロミセスセレビシェ株ＣＬ１３−ＡＢＳＹ８ ６のような酵母、他の真菌、を椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、ヒト細胞、ヒ ト組繊細胞、痘苗ウィルスおよびバクロウィルスのような生存ウィルス並びに全 真核生物が含まれる。

適当な細菌宿主には大腸菌および他の腸内生物、シュードモナス属およびバチル ス属の種が含まれる。

好ましい宿主は大腸菌に１２誘導体、特にＪＭ１０９およびＹ１０９０である。

本発明の第８の実施態様に従って、宿主を提供すること、宿主を形質転換に適す るようにすることおよび第４の実施態様の組換え体ＤＮＡ分子を宿主中に導入す ることからなる、第７の実施態様の形質転換された宿主を提供するために宿主を 形質転換する方法が提供される。

本発明の第９の実施態様に従って、第１の実施態様の抗原からなる、第７の実施 態様の形質転換された宿主の発現産生物が提供される。

好ましくは、発現産生物は実質的に純粋な形態で提供される。

好ましくは、発現産生物は宿主と相同性の第１のポリペプチド配列および、第１ の実施態様の抗原をコードするアミノ酸配列である第２のポリペプチド配列から なる。

更に好ましくは、第１のアミノ酸配列はβ−ガラクトシダーゼの１部分若しくは 全部またはＴｒａ−Ｔであり、そして宿主細胞は大腸菌である。

本発明の第１０の実施態様に従って、第１の実施態様の抗原からなるタンパク賞 産生物を生合成する方法が提供される。この方法は： 宿主が第１の実施態様の抗原を含有するタンパク質産生物を発現できるように、 第４の実施態様の組換え体ＤＮＡ分子で宿主を形質転換し；宿主を培養して発現 させ；そしてタンパク質産生物を採集する、 ことからなる。

本発明の第１１の実施態様に従って、防御免疫応答に寄与する第１の実施態様の 抗原のエピトープが提供される。このエピトープは、抗原の部分の配列を有する オリゴペプチドを合成して製造することによって人工的に創製することができる 。これは細菌で産生されるかまたは天然若しくは組換え体ペプチドの化学的若し くは酵素開裂の結果化じたタンパク質のフラグメントでの免疫化学的試験の結果 から予言することができる。

本発明の第１２の実施態様に従って、第１１の実施態様のエピトープに対して生 じる抗体が提供される。これらの抗体またはイディオタイプは動物の受身免疫用 に使用することができる。

本発明の第１３の実施態様に従って、第１２の実施態様の抗体の可変領域に対し て生じる抗体、所謂抗イデイオタイプ抗体が提供され、この抗体は、抗原の防御 エピトープに似ておりそして動物の能動免疫の有効なワクチンとして使用するこ とができる。

本発明の第１４の実施態様に従って、第１の実施態様の１つまたはそれ以上の有 効量の抗原、第９の実施態様の発現産生物、第１１１７５実施態様のエピトープ および／または第１３の実施態様の抗イデイオタイプ抗体、並びに製薬的に許容 可能な賦形剤、担体、アジュバントおよび／または希釈剤からなるワクチンが提 供される。

好ましいワクチンには注入または経口投与に適するものが含まれる。好ましくは 、注入可能なワクチンには製薬的に許容可能なアジュバントが含まれる。

本発明の第１５の実施Ｕ様に従って、本願発明の１つまたはそれ以上の抗原、発 現産生物、エピトープ、抗イデイオタイプ抗体および／またはワクチンを宿主に 投与することによって、宿主へのワクチン投与の結果として製造される抗体が提 供される。

このような抗体にはポリクローナルおよびモノクローナル抗体がある。

第１５の実施態様の抗体に類似する態様で作用する化合物があることが認められ る。これらの化合物は抗体ではないが、宿主中にこれら化合物が存在すると抗体 に類似する防御効果をもたらすことができる０本願明細書および請求の範囲に亘 って、第１５の実施態様の抗体に対する記載はこれら化合物に及ぶように解釈す べきである。

本発明の第１６の実施態様に従って、少なくとも１つの第１２および／または第 １５の実施態様の抗体並びに製薬的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦 形剤からなる抗体組成物が提供される。

本発明の第１７の実施態様に従って、寄生線虫種から排泄−分泌液体を採集し； ヒラマメレクチンクロマトグラフィーにより溶離液としてメチルマンノシドを用 いて液体を分画し；結合および未結合フラクションを採集し、　５Ｏ５−ゲル電 気泳動によって更に分画し；そして抗原を電気溶離することからなる、第１の実 施態様の抗原の製造方法が提供される。

本発明の第１８の実施態様に従って、プロモーター、翻訳開始シグナルおよび第 ３の実施態様のＤＮＡ配列を提供しそしてプロモーター、翻訳開始シグナルおよ びＤＮＡ配列を操作して結合することからなる、第５の実施態様の融合遺伝子の 製造方法が提供される。

本発明の第１９の実施態様に従って、少なくとも１つの有効量の第１の実施態様 の抗原および／または第１９の実施態様の発現産生物および／または第１１の実 施態様のエピトープおよび／または第１３の実施態様の抗イデイオタイプ抗体と 製薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントとを混合 することからなる、第１４の実施態様のワクチンの製造方法が提供される。

本発明の第２０の実施態様に従って、第１の実施態様の抗原および／または第９ の実施態様の発現産生物および／または第１１の実施態様のエピトープおよび／ または第１３の実施態様の抗イデイオタイプ抗体および／または第１４の実施態 様のワクチンを用いて免疫応答性宿主を免疫化することからなる、第１５の実施 態様の抗体の製造方法が提供される。

本発明の第２１の実施態様に従って、第１２の実施態様の抗体を用いて免疫応答 性宿主を免疫化することからなる、第１３の実施態様の抗イデイオタイプ抗体の 製造方法が提供される。

本発明の第２２の実施態様に従って、少なくとも１つの有効量の第１２および／ または第１５の実施態様の抗体を製薬的に許容可能な担体、希釈剤および／また は賦形剤と混合することからなる、第１６の実施態様の抗体組成物の製造方法が 提供される。

本発明の第２３の実施態様に従って、本発明の抗原、発現産生物、ワクチン、エ ピトープおよび／または抗イデイオタイプ抗体を用いて宿主にワクチン接種する ことからなる、防御処置を必要とする宿主を寄生線虫種による感染から防御する 方法が提供される。

本発明の第２４の実施態様に従って、少なくとも１つの有効量の第１２および／ または第１５の実施態様の抗体および／または第１６の実施態様の抗体組成物を 用いて宿主に受身的にワクチン接種することからなる、防御処置を必要とする宿 主を寄生線虫種による感染に対して受身的に防御する方法が提供される。

ワクチンの１回投与量形態を提供するために担体、賦形剤、希釈剤および／また はアジュバントと組み合わすことができる抗原、発現産生物、エピトープおよび ／または抗イデイオタイプ抗体の量は、治療されているかまたは予防される感染 、治療される宿主および特別の投与様式によって変動する。

任意の特別の宿主の特定の投与値は、使用される特定の抗原、発現産生物、エピ トープ、抗イデイオタイプ抗体および／またはワクチンの活性、年令、体重、全 体的な健康、性別、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、薬品の組み合せ、治 療または予防すべき特別の感染並びに治療または予防を受けている特別の感染の 重篤度を含む種々のファクターに依拠することも理解されよう。

本願発明のワクチンは経口的にまたは非経口的に、慣用的で非毒性の製薬的に許 容可能な所望の担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含有する単 位投与量の製剤で投与することができる。

注入可能な製剤、例えば、滅菌注入水性または油性懸濁液は、適当な分散化剤ま たは湿潤化剤および懸濁化剤を使用して既知の技術に従って処方することができ る。滅菌注入製剤はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の 注入溶液または懸濁液、例えば１．３−ブタンジオール溶液であることもできる 。使用できる許容可能な担体および溶媒には水、リンゲル液および塩化ナトリウ ム等張溶液がある。更に、滅菌した不揮発性油が溶媒または懸濁媒体として慣用 的に使用される。上記の目的のために、合成上ツマ−またはジグリセリドを含む 任意の刺激のない不揮発性油を使用することができる。更に、オレイン酸のよう な脂肪酸が注入剤の調製に使用される。

用語「製薬的に許容可能なアジュバント」は、ヒトへの投与に通する標準的な組 成物かまたは動物のワクチン接種に使用される典型的なアジュバントかのいずれ かを意味する。適当なアジュバントは当該技術分野の通常の技術を使用して選択 することができる。

動物およびヒトのワクチン接種に適するアジュバントには水酸化アルミニウムお よび油性エマルジョン、例えばマルコール（Ｍａｒｃｏｌ）５２：　モンタナイ ド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）８８８　（ＭａｒｃｏｌはＥｓ５ｏの商標であり、Ｍ ｏｎｔａｎｉｄｅはパリの５ｅｐｐｉｃの商標である）が含まれるがこれに限定 されない０本願発明の使用に適する他のアジュバントには原核生物または真核生 物由来の完全な膜タンパク質、例えばＴｒａＴと一緒になった発現産生物からな る抱合体が含まれる。

投与経路、投与すべき投与量並びに注入頻度は当該技術分野の通常の技術を使用 して最適とすることができるファクターの全てである。典型的には、最初のワク チン接種の数週間後に１回またはそれ以上の［ブースター（追加抗原刺激）」ワ クチン接種をし、この真の効果は抗原エピトープ、抗イデイオタイプ抗体または 発現産生物に対して高力価の抗体のような強い免疫学的応答を生じさせることで ある。

経口投与用の固体投与形態はカプセル、錠剤、ビル、粉末および顆粒であること ができる。このような固体投与形態では、抗原、エピトープ、抗イデイオタイプ 抗体および／または発現産生物を少なくとも１つの不活性希釈剤、例えば蔗糖、 ラクトースまたは澱粉と混合することができる。このような投与形態は、通常の 実施と同様に、不活性希釈前以外の物質、例えばステアリン酸マグネシウムのよ うな滑沢剤を追加して構成することもできる。カプセル、錠剤およびビルの場合 には、投与形態はまた緩衝剤からなることもできる。錠剤およびビルは更に腸溶 被贋物を用いて製造することができる。

経口投与用の液体投与形態は極小粒子、マイクロカプセル、ＬＴＢ抱合体、即ち 抱合体としてコレラまたはコレラＢサブユニットを、水のような当該技術分野で 通常使用される不活性希釈剤を含有する、製薬的に許容可能な工°フルジョン、 シロップ、溶液、懸濁液およびエリキシル剤に含有することができる。このよう な組成物はまた、湿潤化剤、乳化剤および懸濁化剤または抱合体としてＴｒａＴ のようなアジュバント並びに蔗糖、ソルビトール、フラクトース等のような糖を 含む甘味剤、矯味剤および香料、ポリエチレングリコール、プロピレングリコー ル等のようなグリコール、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等のような油、アルキル バラヒドロキシベンゾエート等のような防腐剤、並びにストロベリー風味、ペパ ーミント等のような風味剤からなることもできる。

ｚ皿企旦厘ｌ説旦 図１はＬＬ”およびＬＬ−フラクションの５Ｏ５−ＰＡＧＥ分析を示す。

図２はＴａ　Ａｄ　ＥＳＡＩ、２．３．４および５の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示 す。

図３は脱グリコキシル化前後のＴａ　Ａｄ　ＥＳＡＩの５０５−ＰＡＧＥ分析を 示す。

図４はＴｒａＴ−Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩの構造を示す。

図５はＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩをサツカロミセスセレビシェ中で発現するために使 用される酵母発現ベクターｐＹＥＵｃ１１４を示す。

図６は捻転毛様線虫およびイヌ糸状虫中でＥＳＡをコードする配列の検出を示す 。

る　　の　　能　および　の 本発明のヌクレオチド配列、融合遺伝子、組換え体ＤＮＡ分子および形質転換宿 主は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（１９８２）に記載されたような分子 バイオロジーの標準的な技術を使用して作成する。

本発明のヌクレオチド配列の調製においては、問題の遺伝子は、そして更には該 遺伝子から作られるｃＤＮＡコピーも、低収量で供給されることが認められる。

ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）技術は、検出およびクローニングを促進するのに 関係のあるＤＮＡを増幅するために使用することができる。

本発明の発現産生物は、本発明の形質転換された宿主を特別の宿主に適当な標準 的な条件下で培養し、そして発現産生物を標準的な技術によって培養物から分離 することによって得ることができる０発現産生物は不純な形態で使用することが でき、または産生される発現産生物および特別の宿主に適当な標準的技術によっ て精製することができる。

本発明のワクチンは、抗原、発現産生物、抗イデイオタイプ抗体および／または エピトープと製薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバ ントとを、標準的な製剤調製方法を使用して混合し、好ましくは均質に混合して 調製する。

１回の投与形態を製造するのに要する抗原、発現産生物、抗イデイオタイプ抗体 および／またはエピトープの量は、治療すべきまたは予防すべき感染、治療すべ き宿主および特別の投与様式によって変動する。任意の特別の宿主の特定の投与 量は、使用される抗原、発現産生物、抗イデイオタイプ抗体および／またはエピ トープの活性、年令、宿主の体重、全体的な健康、性別および食餌、投与時間、 投与経路、排泄速度、薬品の組合せ並びに治療中の感染の重篤度に依拠する。

ワクチンは、製薬的に許容可能な所望の担体、希釈剤、賦形剤および／または所 望のアジュバントを含有する単位投与製剤で経口的にまたは非経口的に投与する ことができる。

抗体は、適当な宿主中で標準的なワクチン接種形態を使用して生じさせる。宿主 は本発明の抗原、発現産生物、エピトープ、抗イデイオタイプ抗体および／また はワクチンを用いてワクチン接種する。

本発明の抗体と同様に作用する化合物は、天然に生じる化合物を精製するかまた は、標準的な化学的または生合成的技術を含む標準的な技術を使用して合成的に 製造することができる。

抗体組成物は、標準的な製剤調製方法を使用して抗体を製薬的に許容可能な担体 、希釈剤および／または賦形剤と混合し、好ましくは均質に混合することによっ て調製する。

単一投与形態を製造するのに必要な抗体量は、治療または予防すべき感染、治療 すべき宿主および特別の投与様式によって変動する。任意の特別の宿主の特定の 投与値は、使用される抗体の活性、宿主の年令、体重、全体的な健康、性別およ び食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、薬品の組み合わせ並びに治療を受けて いる感染の重篤度を含む種々のファクターに依存する。

抗体組成物は、慣用的な、非毒性の製薬的に許容可能な所望の担体、希釈剤およ び／または賦形剤を含有する単位投与製剤で経口的にまたは非経口的に投与する ことができる。

以下の実施例を参照して本発明を更に説明する。

１隻炎上 コルブ１フォルミス　　　　の　゛・　　ＥＳＡ　　の量製 メリノ種ボーダーレスター雑種の、１２月齢で虫のない状態で飼育された幼若仔 ヒツジを、コルプリフォルミス毛様線虫の感染性幼虫６０，０００個で感染させ た。感染の２１日後に、ヒツジを層殺し、そしてベーアマニゼーシゴン（Ｂａｓ ｒ＋ｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）によって線虫を腸から回収した。ペニシリン（１０ ０単位／ａｄ）およびストレプトマイシン（１００Ｉ＠／ｄ）を含有するＲＰＭ １１６４０培地中で虫を洗浄し、そして５％のＣｏｔのインキュベーター中、３ ７°Ｃで１６時間上記と同一の培地でインキュベートした。虫の生存性を目で検 査してモニターし、そして定型的には９５％以上が生存しており且つ動いていた 。

虫および大きい壊死組織片をろ過または遠心分離によって培地から取り除いた。

こうして得られた上澄液またはる液は成虫ＥＳＡ（Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ）と称す る。

Ｔｃ　Ｌ４　ＥＳＡと称する類似の調製物を、感染７〜８日後にヒツジから回収 したコルブリフォルミス毛様線虫の第４期幼虫から作った。続いてこれら抽出物 の成分を硫酸ドデシルナトリウムの存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ Ｏ５−ＰＡＧＥ）で分析すると、Ｌ４と成虫の抽出物は同じような抗原を有して いたが、成虫抽出物がＬ４抽出物より多くの抗原物質を産出したの”で、優先し て成虫抽出物を使用する。

実施Ｉ Ｌ４　ＥＳＡおよび　　ＥＳＡによるモルモー　の　り　ン排泄／分泌抗原は実 施例１に記載したようにしてＬ４および成虫コルブリフォルミス毛様線虫から調 製した。この材料は、オツドネル等（１９８５）が記載した方法を使用してモル モットを腹腔内的にワクチン接種するために使用した。　Ｌ４または幼若成虫線 虫から得たＥＳＡは各実験で非常に有意に防御（寄生虫感染の６２〜９２％の減 少）したことがわかる（表１および表２）。

表　　１ Ｌ４　ＥＳＡおよびヒラマメレクチンアフィニティークロマトグラフィーによる Ｌ４　ＥＳＡ由来のフラクションを用いたモルモットの防ワクチン接種は関係の ある抗原で腹腔内に注入した（ｎは各群のモルモットの数を示す）。動物は２８ 日後に２，０００個の幼虫を用いて抗原投与し、抗原投与の１３日後に層殺して 虫数を数えた。ＬＬ”は結合物質であり、ヒラマメレクチンカラムから溶出する 。　ＬＬ−は非結合の、通り抜ける物質である。

成虫ＥＳＡおよびヒラマメレクチンアフィニティークロマトグラフィーによる成 虫ＥＳＡ由来のフラクションを用いたモルモットの防御 ワクチン接種は関係のある抗原を用いて腹腔内的に注入した（ｎは各群のモルモ ットの数を示す）、動物は２８日後に２．０００個の幼虫を用いて抗原投与し、 抗原投与の１３日後に層殺して虫数を数えた。ヒラマメレクチンカラムに結合し た物質はＬＬ”であり、非結合はＬＬ−である。

実ｍ 戒Ｊ「易１υ３Ｊｌ化 上澄液は「グイアフロＪ　（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭＩＯ膜上で４０倍に濃縮した。

濃縮した液体は、トリス−緩衝生理食塩液（ＴＢＳ　；　１０ｓ＋Ｍ　）リス、 １５０ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ７，４）で平衡化したヒラマメレクチン　セファロー ス−４８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（５ＸＩＣ１）に吸収させた。カラムを １ｍ／分の流速でＴＢＳｌｏｏｄで洗浄し、非吸収性物質（２ＢＯｎｍの吸収を 測定）を含有するフラクションを採集した。特異的に結合したグリコペプチドを ７８５９２％のメチルマンノシド溶液を使用してカラムから溶離した。２ＢＯｎ −で吸収する物質を含有するフラクションを集めた。ヒラマメレクチン結合（Ｌ Ｌ”　）および非結合（ＬＬ−）成分は両者共、ｌＯ容量のメタノールを添加し 、この混合物を一２０℃で１６時間冷却しそして１２．０００Ｘ　ｇで１５分間 遠心して溶液から沈降させた。

５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析するとき（図１　）　、ＬＬ”フラクションは、見かけ 上の分子量８１．３７．３２および３０キロダルトン（ｋＤ＞並びに分子量標準 と比較するとき幾らか分子量の小さい物質を有するクーマシー染色バンドを含有 していた。　ＬＬ−フラクションは、約２８〜３２．１７および１０〜１２キロ ダルトンの主要バンドを含む幾つかの成分を含有していた。

１隻■土 ヒーマメレク　ン　　Ｌ４゛　　び　　ＥＳＡによるモルモー　のえ±ｌ捜１ ヒラマメレクチンクロマトグラフィーによってＬ４または成虫ＥＳＡから調製し た物質はモルモットに腹腔内的にワクチン接種するために使用した（０°Ｄｏｎ ｎａｌ１等、１９８５）　、結合物質および非結合フラクションは共に、コルブ リフォルミス毛様線虫によるこれらモルモットのその後の抗原投与に対して非常 に顕著な防御度をもたらした（表１および２）、かくして、結合および流出フラ クションの双方にワクチン接種後に防御免疫応答を誘導し得る成分があることが 明白である。

１施Ｕ ＥＳＡヒーマメレクチン　ム゛　び　　ム　　の　なびに　″　ＳＤＳ゛ル１゛ 　々の　　の口成虫ＥＳＡ　（１００〜５００■のタンパク質）から得たＬＬ” およびＬＬ−フラクションの試料をレムリ緩衝剤（Ｌａｅｍｍｌｉ、　１９７０ ）中に懸濁し、そして１２．５％の分離用５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル上で 電気泳動分離に付した。タンパク質をクーマシーＲ−２５０で視覚化して電気溶 離した（Ｓｔｅａｒｎｅ等、１９８５）　。

ＬＬ”フラクションから回収された本明細書に記載した成分は、見かけ上の分子 量３０ｋｏのＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ　；見かけ上の分子量３７ｋｌｌのＴｃ　Ａ ｄ　ＥＳＡ２および見かけ上の分子量８１ｋＤのＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ５であった （図２）、ＬＬ−フラクションから回収され本明細書に記載した成分は見かけ上 の分子量１７ｋＤのＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ３および見かけ上の分子量１１ｋＤのＴ ｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４であった（図２）。

精製Ｔｃ　Ａｄ　ＦｔＳＡｌに対して生じた抗体と共に分画したウェスターン移 動物がこれらの成分と交差反応を示しているので、ＬＬ”３２ｋＤ成分およびＬ Ｌ−２８〜３０ｋＤ成分（図１）はＬＬ”　３０ｋＤ抗原に関係があると思われ る（Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ）、これらの差異は、クローン化したＤＮＡ配列の分 析によってこの成分が広範にグリコジル化されていることが予測されるので、少 なくとも１部はＴｃ　ＡｄＥＳＡＩのグリコジル化の相異度によるものと思われ る。

１施１− ［によるモルモ・　の　　　ン ＳＯＳゲルから電気溶離された個々の抗原は実施例２に記載したようにしてモル モットのワクチン接種に使用した。モルモットはコルプリフォルミス毛様線虫で 抗原投与され、そして寄生虫感染から有意に防御されることが示された（表３お よび４）。

ヒラマメレクチン結合フラクション（ＬＬ”　）から得た、精製抗原、Ｔｃ　Ａ ｄ　ＥＳＡＩ、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ２およびＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ５を用いたワク チン接種によるモルモットの防御 群　　　　　　　　抗　原　　　注入（ｉ）ｎ　　束数　　防御χワクチン接種 は関係のある抗原を用いて腹腔内に注入した。

動物は２８日後に２，０００個の幼虫を抗原投与し、そして抗原投与の１３日後 に層殺して束数を数えた（ｎは各群の動物数を示す）。

−１−ニー ヒラマメレクチン非結合フラクション（ＬＬ−）　　から得た、精製抗原、Ｔｃ 　Ａｄ　ＥＳＡ３およびＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４での予防接種によるモルモットの 防御 ワクチン接種は成虫コルプリフォルミス毛様線虫ＥＳＡ調製物から単離した抗原 を用いて腹腔内に注入した。動物には２８日後に２，０００個の感染性幼虫を抗 原投与し、そして抗原投与１３日後に層殺して束数を数えた。

ＬＬ”およびＬＬ−フラクションの双方の５０５−ＰＡＧＥから電気溶離した抗 原がコルブリフォルミス毛様線虫による抗原投与感染に対してモルモットに実質 的な防御を与え得ることは表３および４の結果から明白である。この研究では、 ＬＬ”フラクションのＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ２およびＴｃ 　Ａｄ　ＥＳＡ５成分並びにＬＬ−フラクションのＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ３および Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４の成分が特に関係がある。他のＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ成分も 効果を有しており、そして関係がある。

アルヒドロゲルで補助されたＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩによるモルモットのワクチン 接種によって６３％の防御が得られる。　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩの脱グルコシル 化しても、得られる防御度の低下は生じず（実験２５７では、対照の束数が異常 に低かった）、これはこの分子のタンパク質部分が防御を与えうろことを示して いる：炭水化物は明らかに防御成分ではなかった。

！施■１ −したベブの　ミ　　　　１ 実施例５に記載したようにして単離したポリペフチドは、アプライドバイオシス テム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋ｓ）ガス相アミノ酸配列分析装置で Ｎ−末端アミノ酸配列を分析した。内部配列を得るために、精製したタンパク質 はブロテイナーゼで消化した〔３７°Ｃ１−夜、０．ＩＭ　ＮＨＪＣＯ３（ｐＨ ７，８）中、５−／ｗχの酵素／基質比で〕、ペプチドは３０Ｘ２．１ｓｉのア クアボール（Ａｑｕａｐｏｒｅ）　ＲＰ−３０カラムを使用するＨＰＬＣにより 、０．１χＴＰＡから０．１χＴＦＡ／７０χアセトニトリルに勾配させて分離 した。得られたアミノ酸配列の幾つかは表５に示す：下線を引いた配列は、ｃＤ ＮＡクローンの単離に適するオリゴヌクレオチドプローブを設計する為の情報の 提供に特に有用であることが見い出された。

Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳ＾１〜５から得られる幾つかのＮ−末端および内部アミノ酸配 列 Ｔｃ　Ａｄ、　ＥＳＡＩ アミノ酸末端配列：ＡＮＮＫＸＱＸＤＩＥＯＬＭＰＫＹＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ２ Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ３ アミノ末端配列：ＫＳＤＥＥＩ　ＩＫＤＡＬＳＡＬＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４ トリプシンペプチド：ＲＬＡＤＤＳＤＦＧＮＹＤすＭＫＧＯＷＯＮ Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ５ アミノ末端配列：５ＸＳＬＫＤ Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩでは、還元およびカルボキシメチル化（０’Ｄｏｎａｌ１ 等、１９７３）後のアミノ酸分析によって半一シスチンの２つの残基の存在が示 された。　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩのＮ−グリカナーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）による 脱グリコジル化（これによってアスパラギンに結合した炭水化物が除去される） によって、見かけ上の分子量が２０ｋＤから１５ｋＤに低下した（図３）、これ はｃＤＮＡ配列によって提供される情報と密接に一致している（以下参照）。

同様の処置で、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ２を脱グリコジル化すると、ＳＯ５−ＰＡＧ Ｅで分析した見かけ上の分子量は３７ｋＤから約３０ｋＤに減少した。

災施ＩＬ Ｔｚ　Ａｄ　ＥＳＡ　　　　　：２−−　　る゛　−る　　え企単塁 Ａ　　ｃＤＮＡ−イブ−１−の メツセンジャーＲＮＡは、コルブリフォルミス毛様線虫線中のし４期の幼虫を、 塩酸グアニジン（６Ｍ）、酢酸ナトリウム（０，２Ｍ、ｐＨ５，２）、および２ −メルカプトエタノール（５ｋＭ）を含有する緩衝剤中で粉砕し、エタノールで 沈降させそしてオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムで分画して上記幼虫から単離 した。　Ｌ４　　ポリＡ゛ｍＲＮＡは、アマ−ジャム（＾ｍｅｒｓｈａｍ）リボ ヌクレアーゼ）ｌ／ＤＮＡポリメラーゼＩキット（Ａｍｅｒｓｈａ＋＊のｃＤＮ Ａ合成システム、１ｌＲＰＮ、１２５６）を製造者が推奨したように使用して二 重鎖ｃＤＮＡ合成用の鋳型として使用した。　ＥｃｏＲＩ　リンカ−を添加した 後、二重ｔｉｃＤＮＡはラムダｇｔ１１に結合させそして、本質的にヒュイン（ ）ｌｕｙｎｈ）等（１９８５）が記載したようにして、大腸菌Ｙ１０９０細胞を 感染させるために使用される生存バクテリオファージ中に入れた。上記方法を使 用して、２Ｘ１０’個の別個の組換え体からなるｃＤＮＡライブラリーを確立し た。　　１．５Ｘ１０’個の別個の組換え体を含有するラムダｇｔｌｏ中に成虫 ｃＤＮＡライブラリーを確立するために同様な技術を使用した。

Ｂ　第１ゴヌ　レオ　゛プロー゛ ｉ　）　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ アミノ酸配列ＤＩＥＱＬＭＰは縮重オリゴヌクレオチドプローブ を設計するために使用した。

ｉｉ　）　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ２ アミノ酸配列ＮＰＰＩＫＤＴＰは、４倍宿重の位置にデオキシイノシンを使用し て市電オリゴヌクレオチドプローブ ｉｉ　）　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ３ アミノ酸配列ＤＥＥＩＩＫＤＡは市電オリゴヌクレオチｉｖ）　Ｔｃ　Ａｄ　Ｅ ＳＡ４ アミノ酸配列−ＭＫＧＱＷＱＮは、オリゴヌクレオチドプローブ ５’　ＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＩＣＣＴＴＴＣＡＴＣＣ＾３”を設計するために 使用した。

ｖ）　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ５ オリゴヌクレオチドは全て、選択したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の逆 補体である。

ＣｃＤＮＡ−イブ−１−、＋ｅ　　の−ラムダｇｔｌｌおよびｇｔｌＯ中のＬ４ および幼若成虫のｃＤＮＡライブラリーはそれぞれ増幅しそして、ワラス（Ｗａ ｌｌａｃｅ）等［１９８５］並びにベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）およびデービス（ Ｄａｖｉｓ）　［１９７７］　が記載したようにして重複フィルターリフトを検 索するために上記合成オリゴヌクレオチドを使用してスクリーニングした。

Ｄ　　ｃＤＮ＾クローンの　１ 多数の選択されたクローンは、ＥｃｏＲＩで再び切断されそして同じ酵素で消化 されたＭ１３ｍｐｌＢ中にサブクローン化され得る挿入物を含有していた。サブ クローン化された挿入物のＤＮＡ配列はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等［１９８０ ］の方法を使用して決定した。

Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ　ｃＤＮＡの幾つかのクローンのＤＮＡ配列を決定しそし て表６に要約する。　ＤＮＡ配列は１３０個のアミノ酸のタンパク質をコードす る読み取り枠を有している。Ｎ−末端アミノ酸配列はＡｄ　ＥＳＡＩから単離さ れた抗原のガス相配列分析で得られる配列に相当しく表６の下線部）、そしてＴ ｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩおアーミラリアメレア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ園ｅｌｌｅａ ）消化で得られた２つの内部ペプチド配列も同定可能である。　Ｔｃ　Ａｄ　ｆ ！ＳＡＩ遺伝子を含有するプラスミドベクターＰＴＴＱ１８で形質転換した大腸 菌株ＴＧＩは、内部参照番号ＢＴＡ１６８９が与えられている。

幾つかの単離体から得たＤＮＡの配列は、翻訳されたアミノ酸配列に幾らか変動 があることを示している。変動しているアミノ酸は表６中で二重下線を引いであ る。成熟タンパク質に相当する配列は決定されている。推定Ｎ−末端リーダー配 列の配列配列は未だ確定されていない。

このアミノ酸配列はＮ−結合グリコシル化の可能性のある４つの部位を示しくコ ンセンサス配列、ＡｓｎＸ５ｅｒ／Ｔｈｒ）、これはこの抗原のヒラマメレクチ ン結合特性およびＮ−グリカナーゼによる処置後のＳ［１Ｓ−ＰＡＧＥでの抗原 の移動性の変化と一致している。

最後に、示されたアミノ酸から計算した分子量（１５，３００ダルトン）はＮ− グリカナーゼ処理抗原で得られたものと非常に一致している（図３）。

一麦一旦− Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡｌをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列および完全成熟タンパ ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４をコードするクロ ーンのＤＮＡ配列は表７に示す。

ＤＮＡ配列は９２個のアミノ酸のタンパク質をコードする読み取り枠を有し、そ して唯１つのグリコジル化可能部位を有している。

Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４の遺伝子を有する、内部のｐＢＲ３２２に基づくベクター 、ｐＢＴＡ５０３で形質転換された大腸菌株ＴＧＩは内部参照番号ＢＴＡ１６９ ０が与えられている。ヒラマメレクチンカラムに結合しないことおよび５Ｏ５− ＰＡＧＥでの概算分子量と配列に基づく推定分子量間の密接な一致はこのタンパ ク質がグリコジル化されていないことを示している。

−ＪＬ二し− Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４をコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列および翻訳アミノ酸Ａ ＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ３を＝１−ドす る部分クローンのＤＮＡ配列は表８に示す、このＤＮＡは４３個のアミノ酸のペ プチドをコードする読み取り枠を有している。天然タンパク質から得たＮ−末端 アミノ酸配列に相当する配列には下線を引いである０表８に示されるＴｃ　Ａｄ 　ＥＳＡ３遺伝子フラグメントを有する、プラスミドｌ）Ｔ？Ｔ３（Ｐｈａｒａ ａｃｉａ）で形質転換された大腸菌株ＤＨ５ａ　Ｆ　（ＢＲＬ）は内部参照番号 １６９１が与えられている。

−表−■− Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ３をコードする部分ｃＤＮＡのＤＩｉＡ配列および翻訳アミ ノ裏立斑工 Ｔｒａ　Ｔ　　人　とし　のＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡの　　　　′のＴｒａＴは、大 腸菌の特定の株の外部膜リボプロティンである。

本発明者は抗生物質抵抗性のプラスミドＲ１００（Ｏｇ、１ｔａ　Ｒ，丁６等、 １９８２、Ｊ、Ｂａｃｔ、　耳ｌイ８１９〜８２７）　　から得られるＴｒａＴ をコードする遺伝子をクローニングしそしてこの遺伝子を、ＴｒａＴの発現がバ クテリオファージラムダの左方向のプロモーター（Ｐ　Ｊ、）の制御下にあるプ ラスミド形質転換した。　ＰＬの不耐熱性リプレッサーを有する細胞、λｃ１８ ５７（Ｒｅｔａａｕｔ　Ｅ、等、１９８０．　ＧｅｎｅＳ１５．８１〜９３）を ３８〜４２°Ｃでインキュベートするとき、高レベルのＴｒａＴを得ることがで きる。

Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩをコードする遺伝子は、新しい遺伝子がＴｒａＴの最初の ３０個のアミノ酸（２０個のアミノ酸の長いシグナル配列を含む）をコードする ように、ＴｒａＴのコード領域の５″位に融合させ、次いで幾つかのアミノ酸が ＤＮＡ操作に使用される制限部位で生じ、その後Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩをコード する遺伝子が生じた（図４）。

Ｔｒａ−Ｔ遺伝子のこの位置への挿入は、ＴｒａＴ遺伝子のコドン３１および３ ２にＰｖｕｌｌ制限部位を特定部位の突然変異誘発によって創製することにより 可能となった。Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ遺伝子は、５７ＱｂｐのＸａ＋ｎ１（Ｅｃ ｏＲＩ部位を切断し、ＩＩＮＡポリメラーゼ■−フレノウフラグメント−を入れ そして再結合して生成される）から旧ｎｄｌｆｆのフラグメントとして得られた 。

適当な大腸菌宿主では、培養温度を上昇させると、００．。。当たり１リツトル 当たり５０■までの見かけ上の分子量２２ｋＤのＴｒａＴ−Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ Ｉが産生される。

発現レベルが細胞の処理能力を超えない場合、シグナル配列を融合タンパク質か ら切り離して末端システィンを更に修飾することができる。このＴｒａＴ−免疫 原融合体を作成すると、タンパク質に自己補助特性を与え得るので、この修飾は 有利であろう（国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８７１００１０７　、発明の名称：免 疫強化）。

Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡのＴｒａＴＷ人　　　　のＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４コードする 遺伝子はＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ−ＴｒａＴの構築と同−の方法でＴｒａＴのコー ド化領域の５”部分に融合させた。　Ｔｃ　ＡｄＥＳＡ４の全コード化領域（９ ２個のアミノ酸）はラムダ左側プロモーターの制御下でＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４と して発現される。

ＹＥＵＣ４への　ローニングお　　　　　のＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩをコードする ｃＤＮＡフラグメントは、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） のＣ５ＩＲＯ部で開発された、酵母発現ベクター、ｐＹＥＵｃ１１４中に挿入し た（図５）、このベクターはサツカロミセスセレビシェのＣｕｐ　１遺伝子（メ タロチオコンをコードする）を使用する。付随するプロモーターは、酵母細胞に 含まれているとき銅で誘導可能である０ｗ４で誘導可能なＣｕｐ　１プロモータ ーおよび複数のクローニング部位を有するＣｕｐ　１遺伝子カセツトはオースト ラリア特許出願第１５８４５／８８およびマクレアディ（Ｍａｃｒｅａｄｉｅ） 等、プラスミド（Ｐ１ａｓｓ＋ｉｄ）　、Ｌ、　１４７〜１５０に記載されてい る。上記したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ　ｃＤＮ＾を含有するＥｃｏＲＩフラグメン トをｐＹＥＵｃ中に挿入してＣｕｐ　１をコードする配列の大部分を置換する。

これによって、表６に示される配列に続いているメタロチオコンのＮ−末端の４ つのアミノ酸からなる融合タンパク質が合成される。組換え体プラスミド（ｐＹ ＥＵｃ３０８４Ｅ）を有するサツカロミセスセレビシェ細胞（ＣＬ１３−ＡＢＳ Ｙ８６株、［α、ΔＵｒａ３１ｅｕ２　ｈｉｓ　ｐｒａｌ　ｐｒｂｌ　ｐｒｃｌ 　ｃｐｓ１ｌ）は、ヒスチジンおよびロイシンを含有する最少培地中で増殖させ た。　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩの発現を誘導するために、培地に硫酸銅を添加して ０．５＋＊Ｍとした。

銅の存在下２時間後に、細胞を採集し、チモリアーゼで処理して酵母の外部壁を 除去し、次いで５Ｏ５−ＰＡＧＥおよびウェスターン法で検査した。Ｔｃ　Ａｄ 　ＥＳＡＩをコードするＤＮＡを含有する組換え体プラスミドはｐＹＥＵｃ３０ ８４Ｂと命名した。

１１１１段 ゛よび　　）°パれる　　”　　　の 組換え体大腸菌細胞により発現された抗原はワクチン接種試験用に精製すること ができる。以下はＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩの単離法を例示するものである。

実施例９で記載した組換え体プラスミドを含有する細菌細胞は適当な培地中２８ °Ｃで増殖させ、そしてＴｃ　Ａｄ　ＥＳ＾１の発現は温度を４２°Ｃに上昇さ せそしてこの温度で培養物を４〜６時間インキュベートして誘導する。４°Ｃ， １０，０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心して培養物から細胞を回収する０次いで、こ のペレットを適当な緩衝剤、例えば５０ｍＭ　）リス−塩酸、１０ｍＭ　ＥＤＴ Ａ　、　５０ａ＋Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ８，０中に再懸濁し、そして前と同じよう に遠心して細胞をペレットにする。洗浄したペレットを緩衝剤、例えば５０■Ｈ トリス−塩酸、１ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ　、５＋ｗＭ　ＤＴＴ、０．１＋＋Ｍ　ＰＭ ＳＦ、　ｐＨ８，０中に再懸濁し、マルトンーガウリン（Ｍａｒｔｏｎ−Ｇａｕ ｌｉｎ）ホモジナイザー中、９０００ｐｓ　ｉで６回ホモシナネートする０次い で、細胞ホモジネートを４°Ｃｌ２Ｏ，０ＯＯＸ　ｇで２０分間遠心して、組換 え体抗原を含有する濃密な封入体を採集する。上澄液を傾瀉して除きそしてペレ ットを、封入体中のタンパク質を可溶化するのに適する溶液、例えば８Ｍの尿素 、１００ｍＭ　ＮａＰｉ、　ｂ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、　４０ｍＭ　ＤＴＴ、　ｐＨ８ ，５中に再懸濁し、そして攪拌し乍ら３７°Ｃで４時間インキエベートする。可 溶化した抗原は、上記溶液を「グイアフロ」アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭ３０ 膜を通過させ次いで「グイアフロ」アミコンＹＭＩＯ膜で溶離物を濃縮すること によって回収することができる０次いで、レアネート（ｒｅｔｅｎａｔｅ）はり ん酸を添加してｐＨ３，０に調整し、８Ｍの尿素で１：１に希釈してＮａ・濃度 を５０ｓ＋Ｍに減少させ、そして８Ｍの尿素、５０ｗＭ、ＮａＰｉ、　５ｍＭ　 ＥＯＴＡ　、　５ｍＭ　０ＴＴＳｐＨ３，０で平衡化させたＳ−セファロース「 高速流」のカラムを通過させることができる０組換え体抗原は５０〜４００ｍＭ 　ＮａＰｉの勾配でカラムから溶離させる。　２１ｋＤＯ組換え体Ｔｃ　Ａｄ　 ＥＳＡ抗原を集めそして「グイアフロＪアミコンＹＭＩＯ膜で濃縮する０次いで 、この濃縮をＳＤＳに関して０．１χとし、１００００カセツトオフ透析袋中、 ８Ｍの尿素、５０ｍＭ　ＮａＰｉ　、　２ｍＭ　ＤＴＴ　、　０．１χＳＤＳ、 　ｐＨ８，５に対して透析してＮａ”濃度を５０ｍＭに減少させ、そしてｐＨを ８．５にあげる０次いで抗原は、１５ｈＭ　ＮａＣ１，１０１Ｍトリス−塩酸、 ０．００６５Ｍ酸化型グルタチオン、０．０６＋ａＭ還元型グルタチオン、０． １χＳＯＳ。

ｐｎｓ、ｓを含有する溶液に対して室温で２４時間透析し、最後に１５０ａ＋Ｍ 　ＮａＣ！、　１０ｍＭのトリス−塩酸、０．１χのＳＤＳ　、　ｐ）１７．４ に対して室温で２４時間透析することができる。透析袋から回収した抗原は、宿 主動物のワクチン接種に先き立つ適当なアジュバント中での製剤化前に０．２２ −のフィルターで滅菌することができる。

精製プロトコールの詳細は各抗原で異なるが、本明細書に従って他の組換え体抗 原を精製するために同様な方法を実施することができる。

１゛　えＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡの１ ｐＹＥＵｃ３０Ｂ４Ｅを有する酵母細胞は、ヒスチジンおよびロイシンを含有す る最少培地中で２日間増殖させた０次いで、細胞を新鮮な培地に入れ、更に２時 間インキエベートし、ついで硫酸鋼を０．５ｍＭになるように加えた。更にイン キユベートを２時間継続し、細胞を遠心して採取し、そしてブラウン（Ｂｒａｕ ｎ）の細胞ホモジナイザーを製造者の指示に従って使用して細胞を溶解させた。

Ｎ単に言うと、細胞はガラスピーズと共に高速で振とうすることによって破壊さ れる。ガラスピーズは重力下で沈ませて細胞溶解物を集める。粗製溶解物を１５ ．０００ｒｐ■で遠心し、得られた上澄液およびペレットはＴｃ　Ａｄ　ＥＳ＾ １タンパク質の存在を試験した。該タンパク質は１５ｋｒｐ−のペレットにだけ 見られた。

次ぎにこのペレットを、８Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２％ メルカプトエタノールを含有する５０ｓ＋Ｍの重炭酸アンモニウム溶液に溶解さ せた０次いで、この粗製物質は、セファデフクスＧ７５カラムを使用し１ｍＭ　 ｆｉＤＴＡ、　０．１χＳＤＳおよび０．１χメルカプトエタノールを含有する ５０＋ｗＭの重炭酸アンモニウム溶液を流して分画した。　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ Ｉ　（グリコジル化されていない）に予期される分子量の物質を含有しそして成 虫寄生虫から得られるＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩに対してウサギで生じる抗血清（Ｒ ４５）と反応するフラクションを集め、そしてその後のワクチン接種試験に使用 した。

皇施拠Ｕ に　　　　　　　　　　　　る　　　　’　　　Ｔｃ　　Ａｄ　　ＥＳＡ盪 ５２９５　　　　　　　　束数±５ＤＩ８御％対照　　　　　　　　４１３±２ ９９ ワクチン接種　　　２７５±１６６　　　　３３組換え体Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ 製剤でモルモットにワクチン接種し、そして上記したようにしてコルブリフォル ミス毛様線虫で抗原投与した。対照動物での束数が非特異的に低くそしてこの特 別の実験では散在していたことに注意すべきである。このようなことが起きた以 前の事例（例えば表３、実験２５７参照）では、実験を繰り返すことによって観 察される防御値の上昇がもたらされた（例えば、表３、実験２３６参照）。

実薯朋■ 他の寄生虫への拡張 組換え体ＤＮＡ技術により作成されたＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ抗原はワクチン接種さ れた動物にコルブリフォルミス毛様線虫侵入に対する防御免疫応答を誘導するこ とができる。この免疫応答はまた、本明細書の他の箇所で引用したような他の寄 生線虫種に対する防御を提供することも可能であるが、他の寄生線虫種はＴｃ　 ＡｄＥＳＡ抗原に関係はあるが同一ではないタンパク質を発現すると上記より一 層考えられる。大部分の寄生線虫種では、これら寄生虫から遺伝子をクローニン グしてその成分の防御能力を試験する目的で寄生虫物質の成分を精製し且つ調製 品中のそれらの構造を同定するのに十分な寄生虫物質を得ることは実際的でない 、これらの場合には、関係している抗原を試験出来る唯一の手段は、関係のある タンパク質をコードする遺伝子を単離するために組換え体ＤＮＡ法を使用して関 係のあるタンパク質を組換え体止物中で発現させ、関係のあるタンパク質をこれ ら組換え体生物から精製して動物にワクチン接種し、そして動物を寄生線虫の他 の種で抗原投与することである。抗原を精製するのに十分な寄生虫物質を得るこ とが可能な場合であっても、Ｔｃ　ＡｄＥＳＡ抗原に関係がある防御抗原をコー ドする遺伝子をクローニングするために分子バイオロジーを使用する上記方法は ワクチンを開発するのに好ましい方法である。この方法が実施可能でであること を示すために、以下の実施例は、コルブリフォルミス毛様線虫以外の寄生線虫の ２つの種、即ち特にヒツジやヤギのしわ胃寄生虫である捻転毛様線虫およびイヌ やネコの寄生虫であるイヌ糸状虫にＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩおよび４に関係した遺 伝子があることを証明している。

ゲノムＤＮＡは、ヘルマン（Ｈｅｒｒ＋＋ａｎｎ）およびフリシャラフ（Ｆｒ− ３ｓｃｈａｕｆ）、１９８７、が記載した方法によって３種の寄生虫から精製し た。各ＤＮＡ調製品１ｔｒｇは制限酵素、ＢａａＨＩ　、ＰｓｔＩおよびＨｉｎ ｄ　ｍ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）の各々で消化した。適当な大きさのマーカーを共に 存している消化ＤＮＡは０．４χのアガロースゲルで電気泳動してそれらの大き さに従ってＤＮＡフラグメントを分離した。このゲルをエチジウムプロミドで染 色しＤＮＡを写真撮影した後、ゲル中のＤＮＡは、プラスに負荷されたナイロン 膜および製造者（Ａ＋＊ｅｒｓｈａｍ）が推奨したようにしてハイブリッド形成 用に製造した膜アルカリ性伝達によって移した。　Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩおよび ４をコードするＤＮＡのフラグメントは、ベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ）が販売したキットに記載された無作為標識法に よって３２ｐで標識した。次いで、この膜を、ｌＱ”ｃｐｍ／ｄの放射性Ｔｃ　 Ａｄ　ＥＳＡ　ＤＮＡを含有する５　ｘｓＳｐＥ、　５　ｘデンハート（Ｄｅｎ ｈａｒｄ　ｔｓ）溶液、０．５χＳＤＳおよび２０ｎ／ｄの変性へリング精子Ｄ ＮＡ　（Ｎａｎｉａｔｉｓ等、１９８２参照）の溶液中、４２°Ｃで２０時間イ ンキュベートした。次いで、この膜を洗浄して全ゆる非特異的に結合したＤＮＡ を除去しそしてＸ線フィルムに暴露した。図６は、捻転毛様線虫およびイヌ糸状 虫ＤＮＡの両方に、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ　ＤＮＡフラグメントとハイブリッドを 形成する特異的ＤＮＡ配列があることを示している。このことによって、これら ＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡ　ライブラリーからか若しくはｃＤＮＡライブラリー からクローニングすることができまたは、上記種の寄生虫からポリメラーゼ連鎖 反応のような他の組換え体ＤＮＡ技術によりそして拡大化により寄生線虫の任意 の他の種から作成することができ、そして寄生線虫の他の種に対するワクチンに 使用するためにこれら関連遺伝子を合成する組換え体生物を構築することができ るであろうことが証明される。

裏庭例お 商業的なワクチンを製造するための規模拡大これまで記載した製造および精製技 術は実験室規模で実施されている。本発明の抗原を商業的に製造するためには、 形質転換された宿主の大規模発酵が必要である。

大Ｍ１．槓発酵は標準的技術に従って実施され、その際選択される特別の技術は 抗原を産生ずるために使用される形質転換宿主に適するものである。

二粟敗通且一 本発明は、寄生線虫、特にコルブリフォルミス毛様線虫および捻転毛様線虫によ る動物の寄生虫感染に対する防御用の効果的なワクチンとして使用することがで きる抗原を提供する。

コルブリフォルミス毛様線虫から単離された精製抗原に対して生じる抗体および これらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、コルブリフォルミス毛様線虫以 外の寄生線虫の種から得た抗原をコードする関連ペプチドおよび遺伝子を同定す るために使用することができる。同一のＤＮＡ配列および抗体は、ヒトおよび家 畜動物に寄生する他の線虫種の範囲内の上記タンパク質をコードする関連抗原お よび遺伝子を同定するために使用することができ、そしてこれらタンパク質が、 線虫の上記種による寄生虫感染に対して、寄生虫自体から単離されるかまたは組 換え体ＤＮＡ技術で製造される。効果的なワクチンを提供することが予想される 。寄生虫の種および感染の可能性のある宿主には、例えば次のものが含まれる： ヒトの旋毛生着しくはイヌ鉤虫感染、ウマのストロンギルスブルガリス感染、ヒ ツジのコルブリフォルミス毛様線虫感染、ヤギの捻転毛様線虫感染、ウシのオス テルタジアオステルタジ感染、ブタのブタ姻土着しくは旋毛虫怒染、ネコのライ オントキサスカリス若しくは狭頭鉤虫感染、イヌのイヌ鉤虫若しくはトリクリス プルビス感染並びにトキソカラ種の幼虫によるヒトの循環系感染およびイヌ糸状 虫によるイヌの循環系感染並びに上記および他の種の動物の循環系、尿生殖系、 呼吸系、皮膚および皮下組織の感染。このリストは決して完全でないことに注意 すべきである。

Ｍ！／　　　ＬＬ＋　　ＬＬ− 第　　１　　図 Ｔ”ｅ　　Ａｄ　　ＥＳ＾ 第　　２　　図 第　　３　　図 ■ 補正書の翻訳文提出書 請書の部間 （特許法第１８４条の７第１項） ■、第１の寄生線虫種の寄生段階から誘導され、第１の寄生よび糸状主属から選 択される請求項１から３のいずれが１項に記載の抗原。

９、第１の線虫種が旋毛虫、イヌ鉤虫、ストロンギルスブルガリス、コルブリフ ォルミス毛様線虫、捻転毛様線虫、オステルタジアオステルタジ、ブタ畑土、ラ イオントキサスカリス、狭頭鉤虫、トリクリスプルビス、イヌ糸状束、トキソカ ラ種、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、回虫、ヒト駆虫、焼土、糞便虫およびバンク ロフト糸状束から選択される請求項８に記載の抗原。

１０、第２の線虫種がトリキネラ属、アンキロストマ属、円虫風、毛様線虫属、 針虫属、オステルタジア属、培土属、トキサスカリス属、ランシナリア属、駆虫 属、ジロフィラリア属、トキソカラ属、ネカトール属、焼去属、ストロンギルス デス属および糸状主属から選択される請求項１から９のいずれか１項に記載の抗 原。

１１、第２の線虫種が旋毛虫、イヌ鉤虫、ストロンギルスブルガリス、コルブリ フォルミス毛様線虫、捻転毛様線虫、オステルタジアオステルタジ、ブタ畑土、 ライオントキサスヵリス、狭頭鉤虫、トリクリスプルビス、イヌ糸状束、トキソ カラ種、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、回虫、ヒト駆虫、焼土、糞便虫およびバン クロフト糸状束から選択される請求項１０に記載の抗原。

１２、第１の寄生線虫種がコルブリフォルミス毛様線虫である請求項１から１１ のいずれか１項に記載の抗原。

１３、第２の線虫種がコルブリフォルミス毛様線虫である請求項１から１２のい ずれか１項に記載の抗原。

１４゜ Ａｈａ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　　ｌｉｅ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｌ ｙｓ　　Ｍｅｔ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ@　５ｅｒ Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｔｒｐ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｓ ｅｒ　　Ｍｅｔ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ@　Ｌｅｕ Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓｌｌｅ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｒ ｇ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ｔｉｅ　　Ｌｙｓ　　Ｇａｙ　　Ａｓｐ 　　Ａｓｎ　　Ａｌａ@　Ｔｈｒ Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　 Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＬｅｕＡｒｇ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ｌｙ ｓ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｔｒｐ　　 Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　　g４５ Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　 Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　ＡｓｐＶａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｖａ ｌ　　Ａｌａ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　ｌｉｅ 　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ@　Ｌｙｓ Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ のアミノ酸配列からなる請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗原。

１５゜ Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　 Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　ＬｙｓＡｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔ ｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕしｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　 　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｎ@　Ｔｈｒ ｌｌｅ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｖ ａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ@　Ｌｅｕ Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ｃ ｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ@　Ｇａｙ Ｇｌｙ　Ａｈａ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　 Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＴｒｐ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇ ｉｎ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ａｓｎのアミノ酸配列からなる請求項１から１３のいず れか１項に記載の抗原。

１６゜ Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｈａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　 Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　ＡｌａＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｈａ　Ｌ ｅｕＡｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙのアミノ酸からなる請 求項１から１３のいずれか１項に記載の抗原。

１７、上記で定義したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ。

１８、上記で定義したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ２゜１９、上記で定義したＴｃ　Ａｄ 　ＥＳＡ３゜２０、上記で定義したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４゜２１、上記で定義し たＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ５゜２２、請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗原 のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列であって、その際ヌクレオ チド配列が上記第１のヌクレオチド配列とハイプリントを形成するかまたは１つ 若しくは多数の塩基置換、挿入若しくは欠失を含む突然変異によって上記第１の ヌクレオチド配列に関連化されたヌクレオチド配列とハイブリッドを形成してい る。

２３、上記ヌクレオチド配列が請求項２から７のいずれか１項または請求項１４ から２１のいずれか１項に記載の抗原のアミノ酸配列を特徴とする請求項２２に 記載のヌクレオチド配列。

２４、上記ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である請求項２２または２３に記載の ヌクレオチド配列。

２５゜ ＧＡＡ　　ＴＴＣＧＧＧ　　ＧＧＣＡＡＣＡＣＴ　　ＴＡＣＡＧＴ　　ＧＣＡ　 　ＡＡＣＡＡＴ　　ＡＡＧ　　ＣＡＡ　　ＣＡＧ　　ＡＣＣＧＡＣＡＴＡ　　Ｇ ＡＡ　　ＣＡＡ　　ＣＴＣＡＴＧ　　ＣＣＣＡＡＡ　　ＴＡＴ　　ＡＡＣＴＣＧ 　　ＡＣＧ　　ＴＴＣＧＣＧ　　ＡＡＧＡＴＧ　　ＡＡＴ　　ＧＧＡ　　ＡＡＣ ＴＡＴ　　ＡＧＴ　　ＴＡＴ　　ＡＡＧ　　ＣＴＧ　　ＡＴＣＴＧＧ　　ＧＡＴ 　　ＧＡＣＡＧＣＡsＧ ＧＴＡ　　ＴＣＴ　　ＧＡＴ　　ＧＣＧ　　ＣＴＧ　　ＣＡＡ　　ＧＡＡ　　Ｇ ＣＡ　　ＡＡＧ　　ＧＡＧ　　ＣＡＡ　　ＴＡＣＡＧＴ　　`ＣＧ　　ＡＡＴ ＧＣＴ　　ＡＣＣＴＴＣＡＡＧ　　ＡＴＣ−σＩＩ；Ｔ　　ＣＧＧ　　ＡＧＡ　 　ＡＡＧ　　ＧＴＧ　　ＴＴＣＡＴ八　ＡＡＧ　　ＧＧＣＧ`Ｔ ＡＡＣＧＣＡ　　ＡＣＧ　　ＡＴＧ　　ＧＡＧ　　ＧＡＡ　　ＡＡＡ　　ＧＴＧ 　　ＧＡＧ　　ＧＧＡ　　ＧＣＴ　　ＣＴＧ　　ＡＡＧ　　sＡＣＣＣＣ ＧＴＣＴＴＧ　　ＡＧＡ　　ＧＣＣＧＡＴ　　ＡＡＡ　　ＴＴＴ　　ＣＴＴ　　 ＣＧＣＣＧＴ　　ＣＴＴ　　ＣＴＣＴＧＧ　　ＴＴＣＡＣＡＣＡＣＴＡＣＧＣＡ 　　ＴＧＣＡＡＴ　　ＧＧＡ　　ＴＡＴ　　ＴＡＣＧＡＴ　　ＡＣＧ　　ＡＡＡ 　　ＧＧＴ　　ＧＧＡ　　ＣＡＣＧＡＴＧＴＣＣＴＧ　　ＡＣＴ　　ＧＴＣＧＣ Ｇ　　ＴＧＴ　　ＣＴＣＴＡＣＡＧＡ　　ＧＡＧ　　ＡＴＣＧＡＴ　　ＴＡＣＡ ＡＡ　　ＡＡＴＴＣＴ　ＣＡＣＴＡＴ　ＴＡＧ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＧＴＣＡＡＣ ＡＡＡ　ＡＡＣＡＧＣＡＧＡ　ＧＴＡ　ＡＡＣＴＧＡＣＴＧ　ＣＡＣＡＴＴ　Ｔ ＣＣＧＣＡ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＴＡＡ　ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＧＣ Ａ　ＡＣＴ　ＣＡＡＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡからなる請求項２４ に記載のＤＮＡ配列。

２６゜ ＡＣＴ　　ＡＣＡ　　ＡＧＡ　　ＣＣＣＣＡＡ　　ＴＴＧ　　ＴＡＣＡＣＧ　　 ＡＡＡ　　ＴＴＣＴＴＣＡＡＣＧＡＡ　　ＧＡＡ　　ＡＡＣＡＧＣＣＴＡ　　Ａ ＡＴ　　ＣＴＧ　　ＡＧＡ　　ＴＧＧ　　ＡＡＣＣＡＣＡＴＡ　　ＴＧＴ　　Ｃ ＧＣＡＧＣＡＴＧ　　ＣＴＣＴＡＣＡＡＧ　　ＡＡＡ　　ＴＴＧ　　ＡＧＡ　　 ＡＧＣＣＡＧ　　ＧＧＡ　　ＡＡＴ　　ＴＴＴ　　ＣＧＣＡＡＡ　　ＡＡＴ　　 ＧＡＴ　　ＴＣ`　　ＧＣＡ ＴＡＴ　　ＴＴＣＡＡＧ　　ＣＴＣＧＡＡ　　ＡＡＣＡＡＧ　　ＡＧＧ　　ＧＡ Ａ　　ＣＴＧ　　ＡＡＧ　　ＧＧＡ　　ＧＡＣＡＡＴ　　ＣsＡ ＣＣＡ　　ＧＴＧ　　ＧＡＧ　　ＧＡＧ　　ＡＡＡ　　ＧＴＡ　　ＣＧＣＣＡＡ 　　ＡＣＴ　　ＡＴＴ　　ＧＡＡ　　ＡＡＡ　　ＴＴＣＡＡf　　ＧＡＴ ＧＡＴ　　ＧＴＡ　　ＡＧＣＧＡＡ　　ＡＴＣＡＧＡ　　ＣＧＴ　　ＣＴＴ　　 ＧＣＴ　　ＧＡＴ　　ＧＡＴ　　ＴＣＧ　　ＧＡＴ　　ＴＴs　　ＧＧＡ ＴＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡ　　ＧＡＡ　　ＡＣＣＧＧＧ　　ＧＧＴ　　ＧＣＡ　 　ＡＴＧ　　ＣＡＣＡＴＴ　　ＧＴＧ　　ＴＧＴ　　ＴＴＣＴＴＣＣＡＧ　　Ａ ＡＧ　　ＡＡＴ　　ＴＡＴ　　ＧＡＣＴＧＧ　　ＡＴＧ　　ＡＡＡ　　ＧＧＡ　 　ＣＡＡ　　ＴＧＧ　　ＣＡＡ　　ＡＡbＴＧＡ ＴＴＴ　　ＴＴＣＴＧＡ　　ＡＧＴ　　ＡＣＴ　　ＴＧＴ　　ＴＧＧ　　ＡＴＴ 　　ＣＴＴ　　ＣＧＴ　　ＡＧＡ　　ＡＴＣＧＡＴ　　ＧＣ`　　ＣＡＡ ＡＡＴ　　ＡＣＣＴＴＴ　　ＴＴＴ　　ＧＧＧ　　ＡＧＡ　　ＣＡＡ　　ＣＴＴ 　　ＣＧＣＡＴＡ　　ＡＡＡ　　ＣＴＴ　　ＣＴＣＧＡＴ　@ＧＡＡ ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ八 からなる請求項１９に記載のＤＮＡ配列。

２７゜ ＣＧＧ　　ＴＴＣＣＴＴ　　ＣＴＴ　　ＣＴＡ　　ＧＣＡ　　ＧＣＧ　　ＴＴＣ ＧＴＣ，ＧＣＣＴＡＴ　　ＧＣＧ　　ＴＡＴ　　ＧＣＡ　　`ＡＧ ＴＣＡ　　ＧＡＴ　　ＧＡＡ　　ＧＡＡ　　ＡＴＣＣＧＡ　　ＡＡＡ　　ＧＡＴ 　　ＧＣＡ　　ＣＴＡ　　ＴＣＴ　　ＧＣＴ　　ＣＴＧ　　fＡＴ　　ＧＴＡ ＧＴＴ　　ＣＣＡ　　ＣＴＧ　　ＧＧＴ　　ＴＣＧ　　ＡＣＴ　　ＣＣＣＧＡＡ 　　ＡＡＡ　　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　　ＡＡＴ　　ＧＧＣからなる請求項２４に記 載のＤＮＡ配列。

２８．請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗原をコードするＤＮＡまたは ＲＮＡ配列を選択する方法であって、該方法は１つまたはそれ以上のＤＮＡまた はＲＮＡ配列を提供し、そしてどの配列が請求項１から２１のいずれか１項に記 載の抗原をコードすることが知られているＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリッ ドを形成するのかを決定するか或は、抗原に対する抗血清を提供しそして抗原を 発現する宿主−ベクターの組合せを同定することからなる。

２９、請求項２４から２７のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列およびベクターＤ ＮＡからなる組換え体ＤＮＡ分子。

３０、上記ＤＮＡ配列に操作して結合した発現制御配列から更になる請求項２９ に記載の組換え体１３ＮＡ分子。

３１、発現制御配列が大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、トリプトファンオ ペロン、大腸菌のＴｒａ−Ｔ遺伝子、バクテリオファージラムダの左側プロモー ター、ｔａｃプロモーター、ＣｕｐｌプロモーターおよびＳＶ４０初期プロモー ターから選択される請求項３０に記載の岨換え体ＤＮＡ分子。

３２、上記ベクターＤＮＡがプラスミドＤＮＡである請求項２９から３１のいず れか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分子。

３３、上記プラスミドＤＮＡがｐＵＲ２９０、ｐＵｃ１８　、ｐＹＥＵｃ１１４ およびそれらの誘導体から選択される請求項３２に記載の組換え体ＤＮＡ分子。

３４、上記ベクターＤＮＡがバクテリオファージＤＮＡである請求項２９または ３０に記載の組換え体ＤＮＡ分子。

３５、上記バクテリオファージＤＮＡがラムダｇｔｌＯおよびラムダｇｔｌｌを 含むバクテリオファージラムダおよびその誘導体から選択される請求項３４に記 載の組換え体ＤＮＡ分子。

３６、上記で定義したｐＹＥＵｃ３０Ｂ４Ｅ。

３７、プロモーター、翻訳開始シグナルおよび請求項２４から２７のいずれか１ 項に記載のＤＮＡ配列からなる融合遺伝子。

３８、請求項２９から３５のいずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分子の調製方 法であって、その際該方法は請求項２４から２７のいずれか１項に記載のＤＮＡ 配列からなるＤＮＡ挿入物を提供しそして該ＤＮＡ挿入物をベクターＤＮＡに導 入することからなる。

３９、上記ＤＮＡ挿入物が発現制御配列に関して正しい配置で且つ正しい読み取 り枠でクローニングベクターに導入される請求項３８に記載の方法。

４０、請求項２９から３６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換え体Ｄ ＮＡ分子で形質転換された形質転換宿主。

４１、上記宿主が請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗原を発現し得る請 求項４０に記載の形質転換宿主。

４２、上記宿主が細菌細胞、サツカロミセスセレビシェ株ＣＬ１３−ＡＢＳＹ８ ６を含む酵母、他の真菌、を推動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、ヒト細胞、ヒト 組繊細胞、痘苗つィルス若しくはバクロウィルスのような生存ウィルスまたは全 真核生物である請求項４０または４１に記載の形質転換宿主。

４３、上記宿主が大腸菌、大腸菌以外の他の腸内生物、シュードモナス種または ハシラス種である請求項４０から４２のいずれか１項に記載の形質転換宿主。

４４、上記宿主がＪＭ１０９およびＹ１０９０から選択される大腸菌に１２誘導 体である請求項４３に記載の形質転換宿主。

４５、上記に定義したＢＴＡ　１６８９゜４６、上記に定義したＢＴＡ　１６９ １゜４７、上記に定義したＢＴＡ　１６９０゜４８、請求項４０から４７のいず れか１項に記載の形質転換宿主を提供する宿主の形質転換方法であって、その際 該方法は宿主を提供し、形質転換に適する宿主を作成し、そして請求項２９から ３６のいずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分子を該宿主に導入することからな る。

４９、請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗原からなる、請求項４０から ４７のいずれか１項に記載の形質転換宿主の発現産生物。

５０、実質的に精製された形質の請求項４９に記載の発現産生物。

５１、上記宿主に相同性の第１のポリペプチド配列および請求項１から２１のい ずれか１項に記載の抗原をコードするアミノ酸配列である第２のポリペプチド配 列からなる請求項４９または５０に記載の発現産生物。

５２、第１のポリペプチド配列がβ−ガラクトシダーゼの全部若しくは１部また はＴｒａ−Ｔでありそして宿主が大腸菌である請求項５１に記載の発現産生物。

５３、請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗原からなるタンパク質産生物 の生合成方法であって、その際該方法は宿主が請求項１から２１のいずれか１項 に記載の抗原を含有するタンパク質産生物を発現するように請求項２９から３６ のいずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分子で該宿主を形質転換し；該宿主を培 養して発現させ、そしてタンパク質産生物を採集することからなる。

５４、エピトープが防御免疫応答の原因である請求項１から２１のいずれか１項 に記載の抗原のエピトープ。

５５、請求項５４に記載のエピトープに対して生じる抗体。

５６、請求項５５に記載の抗体の可変領域に対して生じる抗イデイオタイプ抗体 。

５７．１つまたはそれ以上の有効量の、請求項１から２１のいずれか１項に記載 の抗原、請求項４９から５２のいずれか１項に記載の発現産生物、請求項５４に 記載のエピトープおよび／または請求項５６に記載の抗イデイオタイプ抗体と製 薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントとからなる ワクチン。

５８、経口投与または注入可能な形態に適する請求項５７に記載のワクチン。

５９、上記に定義したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡＩ、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳ八へ、Ｔｃ　Ａ ｄ　ＥＳＡ３、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ５またはこれら抗原 の全部またはいくつかの組み合わせ物から選択される有効量の抗原と製薬的に許 容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントとからなるワクチン 。

６０．１つまたはそれ以上の請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗原、請 求項４９から５２のいずれか１項に記載の発現産生物、請求項５４に記載のエピ トープ、請求項５６に記載の抗イデイオタイプ抗体および／または請求項５７か ら５９のいずれか１項に記載のワクチンを宿主に投与することによる宿主のワク チン接種の結果産生される抗体。

６１、請求項５５また６０に記載の少なくとも１つの有効量の抗体と製薬的に許 容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤とからなる抗体組成物。

６２、請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗原の調製方法であって、該方 法は、寄生段階の寄生線虫種から排泄／分泌液体を採集し、溶離溶媒としてメチ ルマンノシドを用いるヒラマメレクチン　クロマトグラフィーによって上記液体 を分画し、結合および非結合フラクションを集め、５ＤＳ−ゲル電気泳動によっ て更に分画し、そして抗原を電気溶離することからなる。

６３、請求項３７に記載の融合遺伝子の調製方法であって、該方法はプロモータ ー、翻訳開始のシグナルおよび請求項２４から２７のいずれか１項に記載のＤＮ Ａ配列を提供し、そしてプロモーター、翻訳開始シグナルおよびＤＮＡ配列を操 作して結合させることからなる。

６４、請求項５７から５９のいずれか１項に記載のワクチンの調製方法であって 、該方法は少なくとも１つの有効量の請求項１から２１のいずれか１項に記載の 抗原および／または請求項４９から５２のいずれか１項に記載の発現産生物およ び／または請求項５４に記載のエピトープおよび／または請求項５６に記載の抗 イデイオタイプ抗体と製薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／または アジュバントとを混合することからなる。

６５、請求項５５または６０に記載の抗体の調製方法であって、該方法は有効量 の請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗原、請求項４９から５２のいずれ か１項に記載の発現産生物、請求項５４に記載のエピトープ、請求項５６に記載 の抗イデイオタイプ抗体または請求項５７から５９のいずれか１項に記載のワク チンで免疫応答性宿主を免疫化することからなる。

６６、請求項５６に記載の抗イデイオタイプ抗体の調製方法であって、該方法は 請求項５５に記載の抗エピトープ抗体または請求項６１に記載の抗体組成物で免 疫応答性宿主を免疫化することからなる。

６７、請求項６１に記載の抗体組成物の調製方法であって、該方法は請求項５５ または６０に記載の少なくとも１つの有効量の抗体を製薬的に許容可能な担体、 希釈剤および／または賦形剤と混合することからなる。

６８、寄生線虫による感染の防御を必要とする宿主の感染防御方法であって、該 方法は少なくとも１つの請求項１から２１のいずれか１項に記載の抗原、請求項 ４９から５２のいずれか１項に記載の発現産生物、請求項５４に記載のエピトー プ、請求項５６に記載の抗イデイオタイプ抗体、および／または請求項５７から ５９のいずれか１項に記載のワクチンで宿主にワクチン接種することからなる。

６９、寄生線虫による感染に対してその処置を必要とする宿主を受身的に防御す る方法であって、該方法は少なくとも１つの請求項５５または６０に記載の抗体 および／または請求項６１に記載の抗体組成物で宿主に受身的にワクチン接種す ることからなる。

国際調査報告 Ｉ酵ＩＩＣ酊１１開ａ１ム帥（籠、ｄ開−１にηｍ器沖粍舖Ａｌ閃■Ｔ＋）工］ 打り廿仄−℃ｗ己原スにΣはＰゴごｌＤ打ＥｔαＴ工α幼りにすＬ工ＱＴＫ猶圏 、にテにＪ　９　区１６０発　萌　者　　ワグランド、バリー、マックスウェル ■出　願　人　　コモンウエルス・サイエンティフィック・アンド・インダスト リアル・リサーチ・オーガナイ ゼイション オーストラリア国　ニュー・サウス・ウェールズ　２１１８、カーリングフォー ド、ノーウッド・アヴエニュー　３１オ一ストラリア国　オーストラリアン・キ ャピタル・テリトリ−２６００、キャンベル、ライムストーン・アヴエニュー　 １

Claims (64)

【特許請求の範囲】
1. １．第１の寄生線虫種から誘導され、第１の寄生線虫種と同一若しくは異なって いることができる第２の寄生線虫種による宿主の感染に対して防御免疫を誘導し 得る排泄／分泌タンパク質；または該排泄／分泌タンパク質の全部、１部、類似 体、同族体、誘導体若しくはそれらの組み合わせからなるタンパク質（該タンパ ク質分子は寄生線虫による感染に対して宿主に防御免疫を与えることができる） からなる抗原。
2. ２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥで推定するとき概算分子量１１、１７、３０、３７または ８１ｋＤを有する請求項１に記載の排泄／分泌タンパク質からなる抗原。
3. ３．第１の線虫種がトリキネラ属、アンキロストマ属、円虫属、毛様線虫属、針 虫属、オステルタジア属、蛔虫属、トキサスカリス属、ウンシナリア属、鞭虫属 、シロフィラリア属、トキソカラ属、ネカトール属、蟯虫属、ストロンギロイデ ス属および糸状虫属から選択される請求項１または２に記載の抗原。
4. ４．第１の寄生線虫種が旋毛虫、イヌ鉤虫、ストロンギルスブルガリス、コルブ リフォルミス毛様線虫、捻転毛様線虫、オステルタジアオステルタジ、ブタ蛔虫 、ライオントキサスカリス、狭頭鉤虫、トリクリスブルピス、イヌ糸状虫、トキ ソカラ種、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、回虫、ヒト鞭虫、蟯虫、糞便虫およびバ ンクロフト糸状虫から選択される請求項３に記載の抗原。
5. ５．第１の線虫種がトリキネラ属、アンキロストマ属、円虫属、毛様線虫属、針 虫属、オステルタジア属、蛔虫属、トキサスカリス属、ウンシナリア属、鞭虫属 、シロフィラリア属、トキソカラ属、ネカトール属、蟯虫属、ストロンギロイデ ス属および糸状虫属から選択される請求項１から４のいずれか１項に記載の抗原 。
6. ６．第２の寄生線虫種が旋毛虫、イヌ鉤虫、ストロンギルスブルガリス、コルブ リフォルミス毛様線虫、捻転毛様線虫、オステルタジアオステルタジ、ブタ蛔虫 、ライオントキサスカリス、狭頭鉤虫、トリクリスブルピス、イヌ糸状虫、トキ ソカラ種、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、回虫、ヒト鞭虫、蟯虫、糞便虫およびバ ンクロフト糸状虫から選択される請求項５に記載の抗原。
7. ７．第１の寄生線虫種がコルブリフォルミス毛様線虫である請求項１から６のい ずれか１項に記載の抗原。
8. ８．第２の線虫種がコルブリフォルミス毛様線虫である請求項１から７のいずれ か１項に記載の抗原。
9. ９． 【配列があります】のアミノ酸配列からなる請求項１から８のいずれか１項に記 載の抗原。
10. １０． 【配列があります】 のアミノ酸配列からなる請求項１から８のいずれか１項に記載の抗原。
11. １１． 【配列があります】 のアミノ酸からなる請求項１から８のいずれか１項に記載の抗原。
12. １２．上記で定義したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡｌ。
13. １３．上記で定義したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ２。
14. １４．上記で定義したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ３。
15. １５．上記で定義したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４。
16. １６．上記で定義したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ５。
17. １７．請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗原のアミノ酸配列をコードす る第１のヌクレオチド配列であって、その際ヌクレオチド配列が上記第１のヌク レオチド配列とハイブリッドを形成するかまたはヌクレオチド配列が１つ若しく は多数の塩基置換、挿入若しくは欠失を含む突然変異によって上記第１のヌクレ オチド配列に関連化されている。
18. １８．上記ヌクレオチド配列が請求項２または請求項９から１６のいずれか１項 に記載の抗原のアミノ酸配列をコードする請求項１７に記載のヌクレオチド配列 。
19. １９．上記ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である請求項１７または１８に記載の ヌクレオチド配列。
20. ２０． 【配列があります】 からなる請求項１９に記載のＤＮＡ配列。
21. ２１． 【配列があります】 からなる請求項１９に記載のＤＮＡ配列。
22. ２２． 【配列があります】 からなる請求項１９に記載のＤＮＡ配列。
23. ２３．請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗原をコードするＤＮＡまたは ＲＮＡ配列を選択する方法であって、該方法は１つまたはそれ以上のＤＮＡまた はＲＮＡ配列を提供し、そしてどの配列が請求項１から１６のいずれか１項に記 載の抗原をコードすることが知られているＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリッ ドを形成するのかを決定するか或は、抗原に対する抗血清を提供しそして抗原を 発現する宿主−ベクターの組合せを同定することからなる。
24. ２４．請求項１９から２２のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列およびベクターＤ ＮＡからなる組換え体ＤＮＡ分子。
25. ２５．上記ＤＮＡ配列に操作して結合した発現制御配列から更になる請求項２４ に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
26. ２６．発現制御配列が大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、トリブトファンオ ペロン、大腸菌のＴｒａ−Ｔ遺伝子、バクテリオファージラムダの左側プロモー ター、ｔａｃプロモーター、Ｃｕｐ１プロモーターおよびＳＶ４０初期プロモー ターから選択される請求項２５に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
27. ２７．上記ベクターＤＮＡがプラスミドＤＮＡである請求項２５または２４に記 載の組換え体ＤＮＡ分子。
28. ２８．上記プラスミドＤＮＡがｐＵＲ２９０、ｐＵＣ１８、ｐＹＥＵＣ１１４お よびそれらの誘導体から選択される請求項２７に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
29. ２９．上記ベクターＤＮＡがバクテリオファージＤＮＡである請求項２５または ２６に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
30. ３０．上記バクテリオファージＤＮＡがラムダｇｔ１０およびラムダｇｔ１１を 含むバクテリオファージラムダおよびその誘導体から選択される請求項２９に記 載の組換え体ＤＮＡ分子。
31. ３１．上記で定義したｐＹＥＵＣ３０Ｂ４Ｅ。
32. ３２．プロモーター、翻訳開始シグナルおよび請求項１９から２２のいずれか１ 項に記載のＤＮＡ配列からなる融合遺伝子。
33. ３３．請求項２４から２９のいずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分子の調製方 法であって、その際該方法は請求項１９から２２のいずれか１項に記載のＤＮＡ 配列からなるＤＮＡ挿入物を提供しそして該ＤＮＡ挿入物をベクターＤＮＡに導 入することからなる。
34. ３４．上記ＤＮＡ挿入物が発現制御配列に関して正しい配置で且つ正しい読み取 り枠でクローニングベクターに導入される請求項３３に記載の方法。
35. ３５．請求項２４から３１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換え体Ｄ ＮＡ分子で形質転換された形質転換宿主。
36. ３６．上記宿主が請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗原を発現し得る請 求項３５に記載の形質転換宿主。
37. ３７．上記宿主が細菌細胞、サッカロミセスセレビシェ株ＣＬ１３−ＡＢＳＹ８ ６を含む酵母、他の真菌、脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、ヒト細胞、ヒト 組織細胞、痘苗ウイルス若しくはバクロウイルスのような生存ウイルスまたは全 真核生物である請求項３５または３６に記載の形質転換宿主。
38. ３８．上記宿主が大腸菌、大腸菌以外の他の腸内生物、シュードモナス種または バシラス種である請求項３５から３７のいずれか１項に記載の形質転換宿主。
39. ３９．上記宿主がＪＭ１０９およびＹ１０９０から選択される大腸菌Ｋ１２誘導 体である請求項３８に記載の形質転換宿主。
40. ４０．上記に定義したＢＴＡ　１６８９。
41. ４１．上記に定義したＢＴＡ　１６９１。
42. ４２．上記に定義したＢＴＡ　１６９０。
43. ４３．請求項３５から４２のいずれか１項に記載の形質転換宿主を提供する宿主 の形質転換方法であって、その際該方法は宿主を提供し、形質転換に適する宿主 を作成し、そして請求項２４から３１のいずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分 子を該宿主に導入することからなる。
44. ４４．請求項１から１４のいずれか１項に記載の抗原からなる、請求項３５から ４２のいずれか１項に記載の形質転換宿主の発現産生物。
45. ４５．実質的に精製された形質の請求項４４に記載の発現産生物。
46. ４６．上記宿主に相同性の第１のポリペプチド配列および請求項１から１６のい ずれか１項に記載の抗原をコードするアミノ酸配列である第２のポリペプチド配 列からなる請求項４４または４５に記載の発現産生物。
47. ４７．第１のポリペプチド配列がβ−ガラクトシダーゼの全部若しくは１部また はＴｒａ−Ｔでありそして宿主が大腸菌である請求項４６に記載の発現産生物。
48. ４８．請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗原からなるタンパク資産生物 の生合成方法であって、その際該方法は宿主が請求項１から１６のいずれか１項 に記載の抗原を含有するタンパク質産生物を発現できるように請求項２４から３ １のいずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分子で該宿主を形質転換し；該宿主を 培養して発現させ、そしてタンパク質産生物を採集することからなる。
49. ４９．エピトープが防御免疫応答の原因である請求項１から１６のいずれか１項 に記載の抗原のエピトープ。
50. ５０．請求項４９に記載のエピトープに対して生じる抗体。
51. ５１．請求項５０に記載の抗体の可変領域に対して生じる抗イディオタイプ抗体 。
52. ５２．１つまたはそれ以上の有効量の、請求項１から１６のいずれか１項に記載 の抗原、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の発現産生物、請求項４９に 記載のエピトープおよび／または請求項５１に記載の抗イディオタイプ抗体と製 薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントとからなる ワクチン。
53. ５３．経口投与または注入可能な形態に適する請求項５２に記載のワクチン。
54. ５４．上記に定義したＴｃ　Ａｄ　ＥＳＡ１、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ２、Ｔｃ　Ａ ｄ　ＥＳＡ３、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ４、Ｔｃ　Ａｄ　ＥＳＡ５またはこれら抗原 の全部またはいくつかの組み合わせ物から選択される有効量の抗原と製薬的に許 容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントとからなるワクチン 。
55. ５５．１つまたはそれ以上の請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗原、請 求項４４から４７のいずれか１項に記載の発現産生物、請求項４９に記載のエピ トープ、請求項５１に記載の抗イディオタイプ抗体および／または請求項５２か ら５４のいずれか１項に記載のワクチンを宿主に投与することによる宿主のワク チン接種の結果産生される抗体。
56. ５６．請求項５０また５５に記載の少なくとも１つの有効量の抗体と製薬的に許 容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤とからなる抗体組成物。
57. ５７．請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗原の調製方法であって、該方 法は、寄生線虫種から排泄／分泌液体を採集し、溶離溶媒としてメチルマンノシ ドを用いるヒラマメレクチンクロマトグラフィーによって上記液体を分画し、結 合および非結合フラクションを集め、ＳＤＳ−ゲル電気泳動によって更に分画し 、そして抗原を電気溶離することからなる。
58. ５８．請求項３２に記載の融合遺伝子の調製方法であって、該方法はプロモータ ー、翻訳開始シグナルおよび請求項１９から２２のいずれか１項に記載のＤＮＡ 配列を提供し、そしてプロモーター、翻訳開始シグナルおよびＤＮＡ配列を操作 して結合させることからなる。
59. ５９．請求項５２から５４のいずれか１項に記載のワクチンの調製方法であって 、該方法は少なくとも１つの有効量の請求項１から１６のいずれか１項に記載の 抗原および／または請求項４４から４７のいずれか１項に記載の発現産生物およ び／または請求項４９に記載のエピトープおよび／または請求項５１に記載の抗 イディオタイプ抗体と製薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／または アジュバントとを混合することからなる。
60. ６０．請求項５０または５５に記載の抗体の調製方法であって、該方法は有効量 の請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗原、請求項４４から４７のいずれ か１項に記載の発現産生物、請求項４９に記載のエピトープ、請求項５１に記載 の抗イディオタイプ抗体または請求項５２から５４のいずれか１項に記載のワク チンで免疫応答性宿主を免疫化することからなる。
61. ６１．請求項５１に記載の抗イディオタイプ抗体の調製方法であって、該方法は 請求項５０に記載の抗エピトープ抗体または請求項５６に記載の抗体組成物で免 疫応答性宿主を免疫化することからなる。
62. ６２．請求項５６に記載の抗体組成物の調製方法であって、該方法は請求項５０ または５５に記載の少なくとも１つの有効量の抗体を製薬的に許容可能な担体、 希釈剤および／または賦形剤と混合することからなる。
63. ６３．寄生線虫による感染の防御を必要とする宿主の感染防御方法であって、該 方法は少なくとも１つの請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗原、請求項 ４４から４７のいずれか１項に記載の発現産生物、請求項４９に記載のエピトー プ、請求項５１に記載の抗イディオタイプ抗体、および／または請求項５２から ５４のいずれか１項に記載のワクチンで宿主にワクチン接種することからなる。
64. ６４．寄生線虫による感染に対してその処置を必要とする宿主を受身的に防御す る方法であって、該方法は少なくとも１つの請求項５０または５５に記載の抗体 および／または請求項５６に記載の抗体組成物で宿主に受身的にワクチン接種す ることからなる。