JPH04503603A - 細菌含有液体試料から細菌を分離する方法および勾配分離成分 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌含有液体試料から細菌を分離 する方法および勾配分離成分 本発明は、細菌含有液体試料から細菌を分離する方法に関する。より詳しくは、 本発明は、それ自体既知の勾配分離理論に従って細菌含有液体から細菌を分離す る方法に関する。

多くの様々な場合において、試料から細菌を分離させた後に試料から分離された 細菌の数をそれ自体既知の光学測定装置において単純にカウントすることによっ て試料の細菌含量を測定することができるという点で、細菌含有液体試料から細 菌を分離できることが望ましい。液体試料はいずれの生物起源であってもよい、 試料は血液試料（例えば米国特許第３゜９２８、１３９号参照）もしくは尿試料 、または固体試料の懸濁液もしくは溶液、例えば有機成分、例えば組織もしくは 食品試料の水溶液もしくはアルコール性懸濁液であることができる。

細菌含有液体試料の非常に重要な例は乳試料である。認識されるように、もとの 液体試料の細菌含量の測定値は、基本的に液体試料からの細菌の分離の精密度に より決定される。従って、液体試料からもっばら細菌のみが分離され、一方で他 の粒子、例えば脂肪球、血液細胞等が液体試料から分離されないような、正確で 且つ非常に精密な分離方法を実施できることが最も重要なことである。

ら、前記種類の方法および該方法を実施するための装置が知られており、該方法 によれば、高密度成分と低密度成分を含む２成分勾配分離層により、細菌含有液 体試料から細菌が分離される。高密度成分と低密度成分は、細菌含有液体試料か ら分離しようとする細菌の平均密度よりもそれぞれ高密度と低密度を有する。上 記ＵＳおよびＥＰ特許から知られる方法によれば、勾配分離層の高密度成分と低 密度成分との間に限定される界面に細菌が留置される。

管成分勾配分離層を用いて細菌含有液体試料から細菌を分、離する技術は、−緒 になって連続密度スペクトルを構成する複数の成分が使用される多成分勾配分離 層分離技術に更に発展した。　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、　Ｖｏ ｌ、　１０１．　Ｎｏ、　１２．１９８４年９月１７日（Ｃｏｌｕｓ＋ｂｕｓ＋ 　０ｈｉｏ、　ＵＳ）、　Ｍａｅｃｈｔｌｅ　Ｗ、：　ＦｊＡｐｉ！Ｌｄ　ｎａ ｓ＋ｉｃ　ｗａｔｅｒ　ＰＥＲＣＯＬＬ　ｄｅｎｓｉｔ　ｒａｄｉｅｎｔｓ　ｆ ｏｒｍｉｃｒｏ　ａｒｔｉｃｌｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｎａｌ　ｔｉｃａｌ　ｕ ｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕ　ｅ、　２４頁。

要約９１７９３ｄ　ｉおよびＣｏ１１ｏｉｄ　Ｐｏ１ｙａ＋、　Ｓｃｉ、　１９ ８４．２６２（４）。

２７０−８２　（Ｇｅｔ）を参照のこと、該論文に開示されたように、２０分間 の期間内に力学的密度勾配が構築される。理解されるように、この技術はむしろ 時間がかかり、好ましくは連続密度スペクトルを限定する異なる密度の複数の成 分を必要とする。

本発明の目的は、上記ＵＳおよびＥＰ特許から知られる方法よりも単純であり、 更に、液体試料から他の粒子を排除することなく細菌含有液体試料からの細菌の 正確で且つ非常に精密な分離を実施できるようにする、上記種類の方法を提供す ることである。

本発明の別の目的は、自動的に且つ高速で分離を実施できるようにする方法を提 供することである。

本発明によれば、放射状に内側に伸びているリム部分と内側周囲表面とにより限 定される上口を有する皿状遠心容器を用いて細菌含有液体試料から細菌を分離す る方法であって、次の逐次段階： （ａ）前記遠心容器を高回転速度で回転させ、（ｂ）前記細菌の平均密度にほぼ 等しい密度の成る容量の勾配分離成分を前記遠心容器に導入し、前記内側周囲表 面に前記勾配分離成分の分離層を生じさせ、 （ｃ）前記液体試料の残りの成分を前記遠心容器の上口から排出させながら、前 記液体試料の連続流を排出速度で前記遠心容器に導入して前記分離層により細菌 を留置させ、（ｄ）前記遠心容器にフラッシング剤を導入し、そして前記遠心容 器の上口から前記フラッシング剤を排出させ、（ｅ）前記遠心容器を減速しそし てそれを低回転速度で回転させ、 （ｆ）前記遠心容器の上口から液体を排出させることなく前記遠心容器中に成る 容量の移動液を導入しながら、先端が前記内部周囲表面から離れている第一の位 置から先端が前記内部周囲表面の近くに置かれている第二の位置まで吸引ピペッ トを作動および移動させて前記遠心容器から液体物質を吸引し、そして 輸）前記吸引ピペットをその第一の位置に戻す、を含んで成る方法が提供される 。

本発明によれば、勾配分離成分は、２速度モーターによって高回転速度で遠心容 器を回転させながら、遠心容器に導入される。米国特許第４，５４１，４４５号 および欧州特許第０．１２８゜５０９号の方法と比較して、本発明の方法は一層 単純でありなおかつ正確な分離方法である。というのは、本発明の教示によれば 、単一の勾配分離成分を使用するからである。驚くべきことに、本発明の教示に よれば、単一勾配分離成分により構成された分離層により、試料から細菌を分離 しそして留置することができる。種々の密度、即ち低および高密度、例え２ば１ ．０４〜１．１８　ｇ／ｃｉｌｌの範囲内の密度の細菌が、細菌の平均密度とほ ぼ等しい密度、例えば１．１３ｇ／ｃ１１の密度の単一勾配分離成分により留置 されるという意外な効果に全く技術的説明がないけれども、考えられ得る技術理 論は、遠心容器中への液体試料の高速導入によって、細菌含有液体層と分離層と の間に界面が生じ、この界面において、分離層の勾配分離成分中への液体試料の 懸濁が生じるというものである。上記技術理論は、本発明を限定すると解釈すべ きではない。

細菌の平均密度は勾配分離成分の平均密度とほぼ等しいので、液体試料が連続流 で遠心容器に導入されると、細菌は勾配分離成分により留置され、一方で液体試 料の残りの成分は遠心容器から上口を経て排出される。

従って、細菌含有液体試料から細菌を分離する方法は、理論上、連続分離工程に おいて実施することができる。分離工程自体を実施した後で遠心容器へのフラッ シング剤の導入により、分離層に付着している物質、例えば脂肪球等が洗い流さ れて遠心容器の上口から排出される。もとの液体試料から分離された細菌を含有 する分離層の取り出しは、遠心容器を移動液によりすすぎながら、遠心容器中に 延在する先端を有する第一の位置から第二の位置へ移動可能な吸引ピペットによ って行われる。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の方法は、段階（ａ）〜（ｇ）の後に続 く次の逐次段階を含んで成る：（ｈ）遠心容器の上口から液体を排出させること なく少量の移行液を遠心容器中に導入し、 （ｉ）遠心容器を加速しそしてそれを高回転速度で回転させ、そして （ｊ）段階（ｅ）〜（ｇ）を繰り返す。

更なる量の前記液体を遠心容器中に導入しそして遠心容器を高回転速度に加速す ることにより、任意の物質、即ち勾配分離成分またはその中に含まれる細菌が遠 心容器から洗い出され、結果として段階（ｅ）〜（ｇ）を繰り返すと測定容器に 移される。

遠心容器を完全に洗浄するために、段階（ａ）〜（ｊ）の後に次の更なる逐次段 階を実施することが好ましい：（ｋ）遠心容器を加速してそれを高回転速度で回 転させ、（１）即座にフラッシング剤と加熱空気の流れをスプレー液において遠 心容器に導入し、遠心容器に付着している物質を洗い出し、 （ｍ）遠心容器を減速してそれを低回転速度で回転させ、（ｎ）吸引ピペットを 第一の位置から第二の位置に作動および移動させ、遠心容器から液体物質を吸引 し、そして（ｏ）吸引ピペットをその第一の位置に戻す。

本発明によれば、有利には、遠心容器からの液体の排出の遅れを引き起こすため に、遠心容器の放射状に内側に延びるリム部分の最小幅を限定しているノツチを 経て遠心容器の上口から液体を排出させることができる。その結果、遠心容器か らの液体の排出の遅れにより、液体は長期間にわたり遠心容器中に保持され、従 って遠心容器への液体の供給速度を増加させ、より高い分離速度を得ることがで きる。

制御された条件下で細菌含有液体試料からの細菌の分離を実施するためには、本 発明の方法が、予め決められた温度の空気を遠心容器に供給することにより前記 温度に遠心容器を温度調節することを更に含んで成ることが好ましい、空気は、 任意の適当な方法、例えば遠心容器の外側表面が予め決められた温度に維持され るように下方から供給することができ、そして更にまたは別の方法として、予め 決められた温度の空気を上方から遠心容器に供給することができ、遠心容器の上 口から遠心容器に空気を導入することができる。

遠心容器の上口から排出される液体が、高回転速度において遠心容器を回転させ た時に生じる吸引作用により遠心容器中に再導入されないように保証するために 、遠心容器を高回転速度で回転させながら加圧空気の流れを遠心容器に導入する ことが好ましい、好ましくは、加圧空気の流れが遠心容器を温度調節する目的に 役立つように、加圧空気は前記の予め決められた温度に温度調節される。

本発明の方法の第一態様においては、勾配分離成分は約１゜１３ｇ／ｃｊの平均 密度を有し、そして水溶液を構成する。Ｉ！！。

の勾配分離成分は、３００　ｍの８５％グリセロール；６０．Ｏｇのシｗ　ＩＩ 　；　３０．ＯｇのＮａＨＣＯ３；　１５．９　ｇのＮａ、ＣＯｚ　；　０．７ ５ｇのＮａｚＥＤＴＡ；および０．０２ｄのＢｒ１ｊ９６＠から成る。

本発明の方法の第二態様においては、勾配分離成分は約１゜０７　ｇ／ｃｄの平 均密度を有し、そして水溶液を構成する。１ｉ！。

の勾配分離成分は、９４ｍの８５％グリセロール；　１Ｂ、８　ｇ（７）　’／ ヨ糖；３０．ＯＡのＮａＨＣＯｓ　；　１５．９　ｇのＮａｔＣＯｓ　；　０． ７５ｇのＮａ、ＥＤＴＡ　；および０．００６　ｄのＢｒ１ｊ　９６　＠から成 る０分離層およびそのに含まれる細菌を遠心容器から移す時に洗浄目的に役立ち 、そして分離層の任意の物質およびその中に含まれる細菌を洗い出す目的にも役 立つ移行液は、有利には酵素溶液であることができる。これは更に上記光学計数 操作のために細菌を予備処理する目的にも役立つ、　。

本発明の方法の好ましい態様においては、遠心容器の高回転速度は４５．００Ｏ ｒｐｍのオーダーであり、そして遠心容器の低回転速度は４８０　ｒｐｍのオー ダーであり、遠心容器を高回転速度で回転させた時に限定される遠心容器の正味 容積は、２ｄのオーダーである。遠心容器を４５．０００　ｒｐｍの回転速度で 回転させると、４７圓のオーダーの内径を有する遠心容器の内部空間に５０．０ ００　Ｇのオーダーの事実上の極限重力場が提供される。

そのような極限強度の重力場を提供することにより、１．３３ｄ／秒の分離能が 得られ、即ち１０−の試料が１０秒以内に分離され、または２０ｄの試料が１５ 秒以内に分離される。

本発明の方法は任意の適当な遠心容器を用いて実施することができるが、米国特 許第４．５９１．４４５号（これは参考により本明細書に組み込まれる）および 更に欧州特許第０．１２８，５０９号において開示されたタイプの遠心容器を用 いて実施するのが好ましい。

本発明は、更に、上記方法に従って使用するための勾配分離成分に関する。該勾 配分離成分は、分離しようとする細菌の平均密度とほぼ等しい平均密度を有する 。

本発明の勾配分離成分の第一のＢ様によれば、該勾配分離２成分は約１．１３　 ｇ／ｃｉｌｌの平均密度を有し、そして水溶液を構成する。この勾配分離成分１ ２は、３００　ｄの８５％グリセロール；　６０．Ｏｇのシー！糖；３０．Ｏｇ のＮａＨＣＯｉ　；　１５．９　ｇのＮａＨＣＯ３；　０゜７５ｇのＮａｔＥＤ ＴＡ　；および０．０２ｍ１！のＢｒ１ｊ　９（ｉ　＠から成る。

本発明の勾配分離成分の別の態様によれば、該勾配分離成分は約１．０７　ｇ／ ｃｔｉｌの平均密度を有し、そして水溶液を構成する。この勾配分離成分１１は 、９４ｄの８５％グリセロール；１８゜゛　８ｇのシーｉ　Ｓｉ　；　３０．Ｏ ｇのＮａＨＣＯｚ　；　１５．９　ｇのＮａｔＣＯｓ　ｉ　０．７５ｇのＮａｚ ＥＤＴ＾　；および０．００６　ｄのＢｒ１ｊ　９６　”から成る。

図面を参照しながら本発明を更に説明する。

図１は、本発明の方法を実施するための装置であって細菌含有液体試料から細菌 を分離する装置の好ましい態様の垂直断面図であり、そして 図２は、本発明の一般的分離方法を説明する部分断面略図である。

図１において、細菌含有液体試料、例えば乳試料から細菌を分離するための装置 が示される。この装置は全体では１０と示され、底板１１が提供され、底板の上 に円筒形ケーシング１２が載せられている。円筒形ケーシング１２の下端部分は 底板１１に固定され、そして円筒形の円周くぼみ１３に埋め込まれている。外側 の周囲表面において円筒形ケーシング１２に放熱子を構成するひれ２８が提供さ れている。即ち、このひれ２８は、大きな放熱または伝熱表面を提供するために 役立ち、その表面を通して余熱が放射されるかまたは冷却剤、例えば冷却ガスま たは冷却液に伝達される。円筒形ケーシング１２の最上部には床１４が置かれる 。床１４は、床１４の下側表面から突き出ている円筒形リムによって円筒形ケー シング１２に関して固定される０円筒形ケーシング１２の中にモーター１６が封 入される。モーター１６は、４５．００Ｏｒｐｍのオーダーでの高速回転と４８ Ｏｒｐｍのオーダーでの低速回転を生じるように適合させた２速度モーターであ る。モーター１６は、それぞれ床１４と底板１１に置かれた上部軸受１８と下部 軸受１９においてジャーナル軸受された軸１７を有する。軸１７は上部軸受１８ を越えて延び、その上端に内部テーパーコーン２０が提供されている。

皿状遠心容器２１が軸１７上に載せられ、その下端には軸１７の内部テーパーコ ーン２０のテーパー量に等しいテーパー量の外部テーパーコーンのくぼみが提供 されている。その結果、軸１７のコーンと皿状遠心容器２１のコーンは、モータ ー軸１７に関して遠心容器２１を固定する０図２に更に詳細に示されそして後述 する遠心容器２１は、円錐底部２２、垂直円筒部２３、および遠心容器２１の上 口２５を限定している内側に延びるリム部分２４を含んで成る。遠心容器２１の 上口２５の所に、内側に延びるリム部分２４に該リム部分の最小ラジアル幅を限 定するノツチ２６が提供される。更に、遠心容器２１には、液体が上部軸受１８ と接触するのを防ぐのに役立つ下向きに突き出ている隔離スカート２７が提供さ れる。液体または小滴が上部軸受１８と接触するのを更に防ぐために、予め決め られた温度の空気流（これは遠心機を予め決められた温度に温度調節するために も働く）が、供給管（図示せず）を経て下方から遠心容器に供給され、遠心容器 の下部を取り囲む隔離エアカーテンを形成する。

床１４の上には、遠心容器２１を包み込むようにハウジング３０が置かれる。ハ ウシング３０は、その垂直円筒側壁に、ハウジング３０から液体を出すために働 （出口３１が与えられている。

液体試料の供給のための供給管３２は、ハウジング３０の内腔からハウジング３ ０の内部にそして遠心容器２１の上口２５を経てその内部に延びている。供給管 ３２は、適当なチューブ押出（図示せず）を経て外部の液体試料容器に接続でき るように適合されている。

ハウジング３０の上の別の円筒内腔中に、全体的に４０と指示される吸引ピペッ トが置かれる。吸引ピペット４０は、ハウジング３０の内側に延びそして遠心容 器２１の口２５からその内側に延びているピペット管４１を含む、ピペット管４ １は、適当なチューブ押出および弁（図示せず）を経て、外部容器（図示せず） に接続することができる。吸引ピペット４０は更に空気モーター４３を含んで成 る。空気モーター４３のピストンは、板部品４４の任意の動作がピペット管４１ の同一動作を引き起こすように、ピペット管４１にしっかりと接続された板部品 ４４の上側面上で作動する。板部品４４の下側面上では、空気モーター４３が作 動していない場合、図１に示されるような第一の位置に板部品を維持するように コイル４５が作用する。空気モーター４３の作動により、板部品４４がその第一 の位置から、コイル４５が圧縮される第二の位置に移動する。上記第一の位置お よび第二の位置に相当するピペット管４１の位置は、それぞれ、図１に示される 位置、およびピペット管４１の外側末端が遠心容器２１の垂直円筒部２３に近い 位置に移動した場合の延長位置である。加圧空気は継手４６から空気モーター４ ３に供給され、そして空気モーター４３には絞り弁４７が提供され、この絞り弁 ４７は、ピペット管４工がそれぞれ板部品４４の上記第一および第二の位置に相 当する図１と図２に示される収縮位置から延長位置へ移動する速度を減少させる だめに働く。

ハウジング３０の頂上部の中心に本体５０が配置される。本体５００貫通腔内に 管５１が置かれ、そして封止リングまたはガスケット５２により本体５０に関し て封止される。管５１の上端には、適当なチューブ押出（図示せず）を経て、外 部の液体源への接続を可能にする接続継手５３（図示せず）が用意されている。

本体５０の貫通腔に垂直に、内腔５４は接続継手５５からそこへの連絡通路を提 供する。接続継手５５は、適当なチューブ押出（図示せず）を経て、外部の空気 圧縮源（図示せず）、例えば吸引ピペット４０の接続継手４６に接続された上記 加圧源、に接続できるように適合されている。接続継手５５からおよび更に本体 ５０の貫通腔からの加圧空気の供給は、２つの目的に役立つ。第一に、予め決め られた温度に維持された空気は、遠心容器を予め決められた温度に温度調節する ために役立つ。

第二に、加圧空気は、４５．００Ｏｒｐｍの高回転速度で遠心容器を回転させた 時に、液体がハウジング３０の内側表面に収集されそして遠心容器中に吸い込ま れるのを防ぐために役立つ。

図２において、遠心容器２１が更に詳細に図示されている。

矢印６４により示さ゛れたように遠心容器２１がモーター６４により作動され高 回転速度で回転される間、内側に延びるリム部分の最小幅限定ノツチにより境界 が限定される遠心容器２１の円周内部空間に勾配分離層６０が配置される。分離 層６０は、分離しようとする細菌の平均密度にほぼ等しい密度を有する勾配分離 成分を含んで成る。液体試料は供給管３２から遠心容器２１の中心に供給され、 そしてそこから排出される。液体試料はかなり高い排出速度で供給管３２がら排 出され、高回転速度での遠心容器２１の回転により生じる遠心力のため、液体試 料は″遠心容器の中心から外側に振りまかれ、そして分離層６０と接触させられ る。供給管３２から連続流で供給された液体は、液体フィルム層６２を形成する 。

液体フィルム層６２と分離層６０との間の界面において、液体試料は分離層６０ の勾配分離成分中に懸濁され、そして液体試料から分離させようとする細菌が勾 配分離成分の密度とほぼ等しい平均密度を有する時、細菌が分離層６０により留 置されると思われる。勾配分離成分の密度より低い密度、結果として細菌の平均 密度より低い密度を有する液体試料の構成成分は、上方に押しやられ、そして参 照番号６６により示されるように、ノツチ２６を経て遠心容器から排出される。

細菌が最高の密度を有する液体試料の成分を構成するので、遠心容器の高回転速 度により生じる遠心勾配基のために細菌が液体フィルム層６２から分離層６０中 に必然的に押し込められることが理解され得る。液体はノツチ２６からのみ排出 されるので、遠心容器の全上口から液体が排出され最小幅限定ノ・ンチ２６を有 さない皿状遠心容器に比較して長期間にわたり遠心容器内に保持され、従って、 遠心容器への液体の供給速度を更に増加させることができ、ノツチ２６を持たな い装置に比較して細菌の分離速度を更に増加させることができる。

装置１０の操作を下記実施例において記載する。

実施例１ 図面を参照しながらの上記種類の実施態様において、皿状遠心容器２１はチタン 類であり、そしてＴｅｆ　Ｉｏｎ■−ＰＦＡ　（ペルフルオロアルコキシ）内面 被覆が施されていた。遠心容器２１の内径は４７帥であった。モーター１６は、 ５０，０ＯＯＧのオーダーにおいて遠心容器に事実上の重力場を提供する、４８ ０　ｒｐｍの低回転速度と４５，０００　ｒｐｍの高回転速度で駆動するように 適合されたサイリスタ制御三相ＡＣモーターであった。遠心容器２１の円周内部 空間の高さは、内側に延びるリム部分２４の最小幅限定ノツチ２６により限定さ れ、その内部空間は２戚のオーダーであった。この態様では、ｌＯ−の液体試料 が１０秒以内に分離された。あるいは、２０戚の液体試料が１５秒以内に分離さ れた。１０ｍ１と２０ｄの液体試料は、それぞれ２．５蔵と５−の乳試料の水性 希釈液であった。接続継手５５および本体５０の貫通腔を経て、４０℃の温度に 加熱された加圧空気流が、１．５バールの加圧源から内径１．５　ｒｔｍおよび 長さ２５０−の管を経て連続的に供給された。上述したように、４０℃の温度の 空気流は下方からも遠心容器に供給された。

本発明の方法を実施する際に、次の段階を含んで成る自動操作順序において上記 装置を駆動させた。

（ａ）遠心容器２１を４５．０００　、ｒｐｍＯ高回転速度で回転させるために モーター１６を高回転速度に加速させ、（ｂ）　１．１３ｇ／ｃｆｆｌの平均密 度の２．２威の勾配分離成分（その１！は３００戚の８５％グリセロール；６０ ．Ｏｇのシ！Ｆ糖；３０．ＯｇのＮａＨＣＯｓ　；　１５．９　ｇのＮａｚＣＯ ｓ　；　０．７５ｇのＮａｚＥＤＴＡ　；および０．０２ｄのＢｒ１ｊ　９６■ から成る）を別の供給管（図示せず）から遠心容器２１の中心に導入し、そうす るとすぐに勾配分離成分が遠心容器２工の中心から外側に振りまかれそして図２ に示されるような分離相６０に配置され、そして約０．２蔵の余分な勾配分離成 分が遠心容器２１のノツチ２６から排出され、（ｃ）液体試料をｌｄ／秒の速度 で連続流において供給管３２から供給し、それによって界面６２が生じ、そして １．０４〜１．１８８／−のオーダーの密度を有する細菌が分離層６０中に堆積 し、そして図２の参照番号６６により示されるように、液体が遠心容器の上口２ ５から排出され、 （ｄ）分離工程それ自体が完結した後、洗浄溶液により構成されるフラッシング 剤を供給管３２から遠心容器の中心に供給し、得る任意の粒子、例えば脂肪球を 洗い出し、そして遠心容器２１から排出させ、 （ｅ）遠心容器２１を４８Ｏｒｐｍの低回転速度で回転させるためにモーター１ ６を低回転速度に減速させ、（ｆ）図２から明らかなように、吸引ピペット４０ を作動させ、そして該ピペットの先端が遠心容器の周囲壁の内面から離れた第一 の位置から、該ピペットの先端が前記内面近くに配置された第二の位置に移動さ せながら、別の供給管（図示せず）から遠心容器２１の外周に１．５雄の酵素溶 液を供給し、それによって分離層６０を含む物質を酵素溶液としてピペット管４ １、更に接続継手４２および外部管（図示せず）から外部の測定容器または測定 装置（図示せず）に移し、（ｇ）吸引ピペットをその第一の位置に戻し、（ｈ） 　１．５　ｄの酵素溶液を上記供給管（図示せず）から遠心容器２１の外周に供 給し、 （ｉ）遠心容器２１を４５．００Ｏｒｐｍの高回転速度で回転させるためにモー ター１６を加速させ、それによって遠心容器２１の円周の内側空間内に置かれた 物質を前記酵素溶液量により洗い出し、そして （ｊ）　１．３　ｒｄの酵素溶液量をその中に溶解した任意の物質と一緒に上記 測定容器または測定装置（図示せず）中に洗い出すために段階（ｅ）〜（ｇ）を 繰り返す。

装置全体を完全に洗浄するために、次の逐次段階を実施した。

（ｋ）遠心容器２１を４５．００Ｏｒｐｍの高回転速度で回転させるためにモー ター１６を加速させ、 （１）供給管５１から供給されるフラッシング剤および予め約４゜°Ｃの温度に 空気を加熱する予熱器から内腔５４を経て供給される空気を、ハウジング３０の 内側表面と遠心容器２１の外側表面を洗浄するために働くスプレーにおいて、０ ．５秒のオーダーの間隔で断続的にハウジング３０の内部空間に導入し、（ａ＋ ）遠心容器を４８０　ｒｐｍの低回転速度で回転させるためにモーター１６を減 速さ°せ、 （ｎ）吸引ピペットを第一の位置から第二の位置に作動および移動させ、それに よって遠心容器中に存在する任意の液体お°　よび物質を吸引し、そしてピペッ ト管４１、更には接続継手４２および外部管（図示せず）から廃棄容器に移し、 そして（ｏ）最後に吸引ピペットをその第一の位置に戻し、そしてモーター１６ を停止させた。

実施例２ ′　あるいは、本発明の分離方法を実施する際に、上記実施例１の（ｂ）におい て、実施例１の（ｂ）に記載の勾配分離成分の代わりに、１．０７ｇ／ｃｎの平 均密度の２．２ｄの勾配分離成分（その１１は９４戚の８５％グリセロール；　 １８．８　ｇのシヨ糖；３０．ＯｇのＮａＨＣＯｓ　；　１５．９　ｇのＮａｚ ＣＯ＋　；　０．７５ｇのＮａｔＥＤＴＡ　＊および０゜００６−のＢｒ１ｊ　 ９６■から成る）を使用した。

国際調査報告 １階陶ｉ−＾呻−ｍＭＩｌ＆Ｐ口Ａ累９０１０００５２国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．放射状に内側に伸びているリム部分と内側周囲表面とにより限定される上口 を有する皿状遠心容器を用いて細菌含有液体試料から細菌を分離する方法であっ て、次の逐次段階； （ａ）前記遠心容器を高回転速度で回転させ、（ｂ）前記細菌の平均密度にほぼ 等しい密度の或る容量の勾配分離成分を前記遠心容器に導入し、前記内側周囲表 面に前記勾配分離成分の分離層を生じさせ、 （ｃ）前記液体試料の残りの成分を前記遠心容器の上口から排出させながら、前 記液体試料の連続流を排出速度で前記遠心容器に導入し、前記分離層により細菌 を留置させ、（ｄ）前記遠心容器にブラッシング剤を導入し、そして前記遠心容 器の上口から前記ブラッシング剤を排出させ、（ｅ）前記遠心容器を減速しそし てそれを低回転速度で回転させ、 （ｆ）前記遠心容器の上口から液体を排出させることなく前記遠心容器中に或る 容量の移動液を導入しながら、先端が前記内部周囲表面から離れている第一の位 置から先端が前記内部周囲表面の近くに置かれている第二の位置まで吸引ピペッ トを作動および移動させて前記遠心容器から液体物質を吸引し、そして （８）前記吸引ピペットをその第一の位置に戻す、を含んで成る方法。 ２．段階段階（ａ）〜（ｇ）の後に続く次の逐次段階；（ｈ）遠心容器の上口か ら液体を排出させることなく少量の移行液を遠心容器中に導入し、 （ｉ）遠心容器を加速し、それを高回転速度で回転させ、そして （ｊ）段階（ｅ）〜（ｇ）を繰り返す。 を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。 ３．段階段階（ａ）〜（ｊ）の後に次の逐次段階；（ｋ）遠心容器を加速してそ れを高回転速度で回転させ、（ｌ）即座にブラッシング剤と加熱空気の流れをス プレー液において遠心容器に導入し、遠心容器に付着している物質を洗い出し、 （ｍ）遠心容器を減速してそれを低回転速度で回転させ、（ｎ）吸引ピペットを 第一の位置から第二の位置に作動および移動させ、遠心容器から液体物質を吸引 し、そして（ｏ）吸引ピペットをその第一の位置に戻す。 を更に含んで成る、請求項２に記載の方法。 ４．前記遠心容器からの液体の排出の遅れを引き起こすように、前記液体が前記 遠心容器の前記上口から、前記放射状に内側に延びるリム部分の最小幅限定ノッ チを経て排出される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。 ５．前記遠心容器に予め決められた温度の空気を供給することにより、前記遠心 容器を前記温度に温度調節することを更に含んで成る、上記請求項のいずれか一 項に記載の方法。 ６．前記遠心容器を高回転速度に回転させながら、加圧空気流が前記遠心容器に 導入される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。 ７．前記勾配分離成分が約１．１３ｇ／ｃｍ２の平均密度を有しそして水溶液を 構成し、その１ｌが３００ｍｌの８５％グリセロール；６０．０ｇのショ糖；３ ０．０ｇのＮａＨＣＯ３；１５．９ｇのＨａ２ＣＯ３；０．７５ｇのＮａ２ＥＤ ＴＡ；および０．０２ｍｌのＢｒｉｊ９６■から成る、上記請求項のいずれか一 項に記載の方法。 ８．前記勾配分離成分が約１．０７ｇ／ｃｍ２の平均密度を有しそして水溶液を 構成し、その１ｌが９４ｍｌの８５％グリセロール；１８．８ｇのショ糖；３０ ．０ｇのＮａＨＣＯ３；１５．９ｇのＮａ２ＣＯ３；０．７５ｇのＮａ２ＥＤＴ Ａ；および０．００６ｍｌのＢｒｉｊ９６■から成る、上記請求項のいずれか一 項に記載の方法。 ９．前記遠心容器の高回転速度が４５，０００ｒｐｍのオーダーであり、そして 前記遠心容器の低回転速度が４８０ｒｐｍのオーダーである、上記請求項のいず れか一項に記載の方法。 １０．前記遠心容器を高回転速度で回転させた時に限定される前記遠心容器の正 味容積が２ｍｌのオーダーである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。 １１．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実施する際に使用される勾 配分離成分であって、前記細菌の平均密度にほぼ等しい平均密度を有する勾配分 離成分。 １２．約１．１３ｇ／ｃｍ２の平均密度を有しそして水溶液を構成し、その１ｌ が３００ｍｌの８５％グリセロール；６０．０ｇのショ糖；３０．ＯｇのＮａＨ ＣＯ３；１５．９ｇのＮａ２ＣＯ３；０．７５ｇのＮａ２ＥＤＴＡ；および０． ０２ｍｌのＢｒｉｊ９６■から成る、請求項１１に記載の勾配分離成分。 １３．約１．０７ｇ／ｃｍ２の平均密度を有しそして水溶液を構成し、その１２ が９４ｍｌの８５％グリセロール；１８．８ｇのショ糖；３０．０ｇのＮａＨＣ Ｏ３；１５．９ｇのＮａ２ＣＯ３；０．７５ｇのＮａ２ＥＤＴＡ；および０．０ ０６ｍｌのＢｒｉｊ９６■から成る、請求項１１に記載の勾配分離成分。