JPH04505919A - トレランスを誘導するためのモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

トレランスを誘導するためのモノクローナル抗体本発明は、モノクローナル抗体 を用いたトレランス誘導に関する。 外来抗原又は外来組織、或いは自己抗原又は自己組織に対するトレランスは、そ の他の点では正常な成熟免疫系が、前記抗原／組織に対しては特異的かつ攻撃的 に反応することができない状態であり、従って免疫系は、前記抗原／組織を正常 な（非病的な）体細胞／成分のように取り扱う。しかし、これと同時に、当該免 疫系は、自己トレランスの自然のプロセス或いは治療上のトレランス誘導の手順 により特異的なトレランスが誘導されていない外来或いは病的な抗原／組織に対 しては、攻撃的に反応することができる。トレランスのための試験では、通常、 トレランスを有する個体が、後に１或いは好ましくはそれ以上の免疫するための 試みを行ったとき、特定の抗原／組織に対しては免疫できず、無関係な抗原／組 織に対しては反応を示すことができるということを証明することが必要である。 ？’７スＣＤ４　（Ｌ３Ｔ４）　抗原に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は 、液性免疫、移植拒絶及び自己免疫を制御するための有力な免疫抑制因子である ことが証明されている。 更に、ＣＤ４ｍＡｂｓは、インビボでトレランスを許容する環境を作り出し、こ れを用いて移植抗原ならびに水溶性蛋白質抗原に対するトレランスを達成できる ことが明らかになっている。しかし、ＣＤ４ｍＡｂｓがこれらの効果を生じる機 構はまだ明らかになっていない。最近の報告によると、免疫抑制は、インビボで 標的細胞を除去した状態下で得られる。 簡単に解釈すれば、この達成された免疫抑制は、ＣＤ４Ｔ細胞の欠乏によるもの である。 一方、ＣＤ４　（及びＣＤ８）ｍＡｂ　ｓが、細胞を溶解することなく、単に細 胞表面上の抗原に結合することによってリンパ球の機能に影響を与え得るという ことが、インビトロにおける仕事によって証明されている。更に、免疫抑制及び トレランス誘導は、インビボにおいて溶解濃度未満のＣＤ４Ｔ細胞或いはＦ　（ ａｂ−）　２ＣＤ４ｍＡｂｓ断片を用いることによって得られており、これはｍ Ａｂが媒介する免疫調節に対して標的細胞の除去が必須ではないことを示唆して いる。 いた。今回、我々は非破壊性ＣＤ４及びＣＤ８抗体も、外来の免疫グロブリン、 骨髄及び皮膚移植に対してトレランスを誘導することができることを見い出した 。実際、二の観察はあらゆる抗原に対して一般的に適合する。更に、我々は、非 破壊性ｍＡｂｓの投与に先だって破壊性ＣＤ４ｍＡｂ及び／又は破壊性ＣＤ８ｍ Ａｂを投与することが、トレランスを許容する環境を作るのに有用であることを 見い出した。 従って、本発明は、抗原に対するトレランス誘導において、同時に、別途に、或 いは逐次的に使用されるために組合わされた製剤として、非破壊性ＣＤ４ｍＡｂ 及び非破壊性ＣＤ８ｍＡｂを含有する生成物製品を提供する。手術或いは治療法 により人体或いは動物体を処置する方法において使用されるための、非破壊性Ｃ Ｄ４ｍＡｂ及び非破壊性ＣＤ８ｍＡｂもまた、本発明の一部を構成する。本発明 は、更に次のものを提供する。 ・手術または治療法により人体或いは動物体を治療する方法、特に抗原に対する トレランスの誘導において一緒に使用するための、非破壊性ＣＤ４及びＣＤ　８ 　ｍ　Ａ　ｂ　。 ・非破壊性ＣＤ４ｍＡｂ及び非破壊性ＣＤ８ｍＡｂを別途の成分として、典型的 には別区画に含有するパック。 を提供する。 非破壊性ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂｓを併せて投与することによって、患者の一次 抗原に対するトレランスを誘導できる。 ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂｓは、自己免疫疾患を治療するために、また長期の免疫 抑制化学療法を必要とすることなく移植拒絶を防止するために用いることができ る。器官織移植または骨髄移植等の移植に対するトレランスが達成され得る。 インビボにおいて、非破壊性ｍＡｂｓを使用する利点が存在する。例えば、非破 壊性ｍＡｂｓを短いコースで注射した場合、適格細胞が阻害から迅速に回復する ことができ、従ってｍＡｂ処理に続く免疫不全による日和見感染及び合併症（例 えばＴ破壊性骨髄移植後の白血病の再発）の危険を減らすことができる。加えて 、ＣＤ４細胞は更に異なる機能的サブセットに分解でき、この内のいくつかは免 疫調節に係わり得ることが知られている。Ｔ細胞の集団排除はもちろん免疫抑制 を引き起こすが、ＣＤ４　調節細胞のなし得る作用をも破壊するかもしれない。 従って、より巧妙な操作が、免疫系を所望の状態に導くためにより有益であり得 る。 トレランスは、好ましくは、患者に対してまず破壊性ＣＤ４及び／又はＣＤ８ｍ Ａｂｓを投与することにより達成できる。従って、本発明は更に次のものを提供 する。 ・手術または治療による人体或いは動物体の治療方法において合わせて使用する ための、特に抗原に対するトレランスの誘導において使用するための非破壊性Ｃ Ｄ４及びＣＤ８ｍＡｂ及び破壊性ＣＤ４及び／又はＣＤ８ｍＡｂ０・抗原に対す るトレランスを誘導するのに、同時に、別途に、或いは逐次的に使用されるため に組合わされた製剤として、非破壊性ＣＤ４ｍＡｂおよび非破壊性ＣＤ８ｍＡｂ 、並びに破壊性ＣＤ４ｍＡｂと破壊性ＣＤ８ｍＡｂのどちらか一方或いは両方を 含有する生成物。 ・非破壊性ＣＤ４ｍＡｂ及び非破壊性ＣＤ８ｍＡｂ、並びに破壊性ＣＤ４ｍＡｂ と破壊性ＣＤ８ｍＡｂのどちらか一方或いは両方を、典型的には別区画に含有す るバック。 非破壊性ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂの組み合わせは、他の免疫抑制剤を必要とする ことなく、いかなる抗原に対してもトは１０％未満の標的細胞を破壊するｍＡｂ である。それらは、クラスエ抗原又はクラスＩＩ抗原或いはクラスＩ又はクラス ＩＩ抗原によって生じる抗原に対するトレランスを導入するために用いることが できる。それらは両抗原に対するトレランスを誘導するために用いることができ る。移植の場合、例えば、クラスＩ及びクラスＩＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗 原及び非ＭＨＣ或いはマイナー組織適合性（マイナー）抗原が存在するかもしれ ない。移植抗原とは別に、本発明は、球状蛋白質、免疫グロブリン等の糖蛋白質 、花粉蛋白質・等の粒子上で運搬される物質、インターフェロン、インターロイ キン２または腫瘍壊死因子等の治療上の使用を意図したポリペプチド、或いは黄 体形成ホルモン、その類似物質及び拮抗物質等のホルモン置換物質（ｈｏｒｍｏ ｎｅ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）に対するトレランスを誘導するために用いるこ とができる。更に、トレランスを誘導できる特定の抗体は、受容体の遮断を援助 するために使用される蛋白質治療剤の合成ペプチド類似物質及びアロ抗原を包含 する。アロ抗原は、組織移植或いは皮膚移植における外来組織の拒絶の原因であ ると考えられる。 使用できるｍＡｂｓは、ＣＤ４細胞表面抗原に対して特異的なｍ　Ａ　ｂ　（Ｃ Ｄ　４　ｍ　Ａ　ｂ　）或いはＣＤ８細胞表面抗原に対して特異的なｍ　Ａ　ｂ 　（ＣＤ　８　ｍ　Ａ　ｂ　）である。ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂｓの語は、ＣＤ ４及びＣＤ８表面抗原に対する特異性のみならず、マウスにおけるＬ３Ｔ４抗原 等の他種の対応する表面抗原に対する特異性も意味する。前記Ｌ３Ｔ４抗原は、 ヒトＣＤ４抗原と同義のマウスの抗原である。該ｍＡｂｓは典型的にはラットＩ 　ｇ　Ｇ　２．、マウスＩｇＧ２ｂ又はヒトＩ　ｇ　０２等の１ｇ０２クラスで あるが、ヒトＩｇＧ４てもよい。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２断片等の抗体結合部位 を有するｍＡｂ断片は使用できる。 ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂｓは、−緒に宿主に投与される。 これらは、同一製剤の一部として或いは別途製剤として投与できる。典型的には 、両ｍＡｂｓは週に１〜７回、好ましくは１〜４回、例えば３回を、２〜４週間 、好ましくは３週間投与される。非破壊性ｍＡｂｓの有効量が投与される。血清 中の抗体の飽和量に対する試験によって、十分な抗体が存在することが示される に違いない。十分な各非破壊性ｍＡｂは、結果として治療中の患者にトレランス を許容する環境を誘導するために投与される。このようにしてＣＤ４及びＣＤ８ 細胞は遮断され得る。 患者に投与される非破壊性ＣＤ４ｍＡｂ及び非破壊性ＣＤ８ｍＡｂの量は、患者 の年齢及び体重、治療条件、及びトレランスを誘導することが望まれる抗原を含 む種々の因子に依存する。マウスのモデルシステムにおいては、１μｇから２ｍ ｇ、好ましくは４００μｇから１ｍｇのｍＡｂが何時でも１度に投与される。人 間においては、１〜４００ｍｇ、３〜３０ｍｇぐらい、例えば５〜２０ｍｇの抗 体が投与される。 非破壊性ｍＡｂであるＣＤＩ　１　ａｍＡｂは、ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂｓに加 えて用いることができ、また、ＣＤ４またはＣＤ８ｍＡｂ　ｓの一方或いは両方 と置き換えて用いることもできる。 トレランスを誘導するのが望まれる外来抗原は、非破壊性ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡ ｂｓのコースが開始される前５日までから、前記コースが完了した後５日或いは さらに２〜３週間まで宿主に投与することができる。しかしながら、一般には、 抗原は前記コースが始まる最初の１４日以内、典型的には該コース開始の７日以 内に投与される。抗原は、ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂｓ処理の行程が始まった時に 投与できる。 従って、トレランスは非破壊性ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂｓ。 並びにこれに加えて該抗原を投与することによって、宿主中の抗原に対して誘導 することができる。患者は、非破壊性ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂｓの援護のもと、 外科的に手術でき、器官移植或いは骨髄移植等の組織を移植することができる。 また、トレランスは、患者が既に保持している抗原に対しても誘導することがで きる。長期間の特異的なトレランスは、多発性硬化症或いは慢性関節リウマチ等 の自己免疫疾患の治療のために、１以上の自己抗原に対して誘導することができ る。従って自己免疫疾患にかかった患者の状態は緩和できる。 持続的な抗原がトレランスを維持するために要求される。 例えば組織移植は、それ自身に対してトレランスを維持するための抗原を提供す る。同じことが自己免疫疾患の治療における自己抗原にも当てはまる。アレルゲ ン等の異質外来抗原の場合は、定期的な間隔をもって抗原リマインダー（ａｎｔ ｉｇｅｎ　ｒｅｍｉｎｄｅｒ）が投与され得る。 非破壊性ｍＡｂｓで処理を開始する前に、破壊性ＣＤ４ｍＡｂｓ及び／又は破壊 性ＣＤ８ｍＡｂで宿主を処理することが好ましい。破壊性ＣＤ４ｍＡｂとは、５ ０％を越えて、例えば９０〜９９％のインビボの標的細胞を破壊するｍＡｂであ る。破壊性抗体は、ラットＩ　ｇ　Ｇ　２ｂ又はＩｇＧ、、マウスＩｇＧ　、及 びヒトＩｇＧ　及び工ｇＧ３を含む。従って、２ａ　１ 破壊性ＣＤ４ｍＡｂｓ及び／又は破壊性ＣＤ８ｍＡｂは、関連するＴ細胞の個体 数を減少させるのに用いることができる。 非破壊性ｍＡｂｓは、従って、作用すべきＴ細胞を少ししか有しない。また、破 壊は、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）１等の他のｍＡｂ、ステロイド、シクロスポ リン、ＡＬＧ　（抗リンパ球グロブリン）の投与、或いは放射線治療等の通常の 免疫抑制治療により達成できる。 破壊性ｍＡｂによりＴ細胞の個体数が減少されるべきレベルは、トレランスの達 成が望まれる抗原に依存し得る。更に、レシピエンドが以前にドナー抗原に接し たことがあり、感作されている（例えば何度も輸血された患者）場合の、適合性 に乏しい組織移植のような難抗原、或いは、患者が感作され且つ自己免疫が持続 的に活性状態にある自己免疫疾患における難抗原に対しては、Ｔ細胞の個体数を 更に減少させることが望ましい。組織適合性に乏しいとは、例えば、１以上のク ラスＩ主要組織適合性抗原が適合しないことである。 従って、ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞の個体数を通常のレベルの約７０％未満、 例えば約５０％、２０％或いはさらに１０％未満に減少させることが必要である 。トレランスを達成するのが難しいようであればあるほど、達成されることが望 ましい破壊量は増加する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は同様に破壊され得る。 破壊性ＣＤ４ｍＡｂ及び／又は破壊性ＣＤ８ｍＡｂは、典型的に１週間当たり１ 〜７回、好ましくは１週間当たり２〜４回、例えば１週間当たり３回、或いは１ 回又は２回、好ましくは１回を、１〜７日間、例えば１〜５日間、非破壊性ＣＤ ４及びＣＤ８ｍＡｂｓの処理開始前に投与される。トレランスが誘導されるのが 望まれる抗原は破壊性ｍＡｂの投与と同時に、或いは破壊性ｍＡｂｓの投与の５ 日以内に投与され得る。投与される破壊性ｍＡｂｓの量は、関連するＴ細胞の個 体数を減少させるのに望まれるレベル、患者の年齢及び体重、治療の状態、及び トレランスを誘導されることが望まれる抗原を含む種々の因子に依存する。マウ スのモデル系において、１μｇ〜２ｍｇ、好ましくは４００μｇ〜１ｍｇの量の 破壊性ｍＡｂが投与される。ヒトでは、１〜４００ｍｇ。 ３〜３０ｍｇぐらい、例えば５〜２０ｍｇの抗体が投与される。 破壊性及び非破壊性ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂｓはいずれの手頃な方法によっても 作製できる。これらは、免疫ラット膵臓細胞をＹ３／Ａｇ１．２．３．　（Ｃ１ ａｒｋ　ａｎｄ　Ｗａｌｄｍａｎｎ、ｃｈａｐｔｅｒ　１　ｏｆ　−Ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’、これはＰ、Ｃ，Ｌ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ著 の“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔ。 １ａｇｙ　”、Ｌｏｎｇｍａｎ　（Ｃｈｕｒｃｈｉ　１１　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏ ｎｅ）、１９８６）シリーズの本である）ラットミエローマ細胞株に融合させる 通常の方法により作製できる。免疫されたマウス膵臓細胞とマウスミエローマ、 ラットミエローマ又はヒトミエローマとの融合、或いは組み換えＤＮＡの手法等 、他の方法も使用できる。 すべてのｍＡｂ投与は、非経口的に、例えば静脈内投与で行われる。ｍＡｂｓは 、一般に注射或いは注入により投与される。この目的のために、ｍＡｂは薬学的 に許容できる担体或いは希釈剤を含有する薬剤組成物として調製できる。いかな る適切な担体或いは希釈剤も用いることができ、例えば生理食塩水等張渡を用い ることができる。トレランスを誘導することが望まれる特定の抗原が与えられた とき、これらは非経口的に、例えば静脈内、筋肉内或いは皮下に投与することが できる。抗原は、典型的には上記の薬学的に許容できる担体或いは希釈剤と共に 調製される。 ｍＡｂｓを生産する各ハイブリドーマ、ＹＴＳ１７７．９、ＹＴＳ１９１．１、 ＹＴＳ１０５．１８、ＹＴＳ１６９．４は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄ （＋ｗｎ、Ｇ、Ｂ、ｏｎ　３０　Ｍａｙ　１９９０に、受託番号ＥＣＡＣＣ９０ ０５３００５、ＥＣＡＣＣ８７０７２２８２、ＥＣＡＣＣ９００５３００４、Ｅ ＣＡＣＣ８７０７２２８４をもって寄託されている。 以下の例により本発明を例解する。 添付の図面において、図１は、ｒ　Ｉ　ｇＧ２ａ及びｒ１ｇＧ２ｂＭａｂｓの組 み合わせによる補体溶解の相乗及び干渉を示している。”　Ｃｒ　（３０μＣｉ ／ｍｌ）を用いてラベルしたＣＢＡ／Ｃａ胸腺細胞を、各棒の下に示す！１／１ 　ａ　ｂ　ｓ及び補体源として２％モルモット血清と共にインキュベートした。 Ｍａｂａ度としては、（Ａ）　５　ｔｔ　ｇ／ｍ　１、（Ｂ）２５μｇ／ｍｌの Ｍａｂを用いた。 図２は、Ｔ細胞を破壊することなくインビボにｒ　Ｉ　ｇＧ２ａＣＤ４を注射し た結果を示す。ＡＴＸ　ＣＢＡ／Ｃａマウス（ｎ−３）に対して、表示されたＭ ａｂ　ｓ　（２ｍｇ／ｖウス）を−回の注射で投与し、１．４及び８週間後に血 液を採取した。ビオチニル化したＣＤ４　（ＹＴＡ３．１・）、ＣＤ８　（ＹＴ Ｓ１５６．７ム）及びＴｈｙ−１（ＹＢＭ２９．２マ）に対するＭ　ａ　ｂ　ｓ でＢＰＬを染色し、引き続いてストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ｓｔｒｅｐｔａ ｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ）で染色した。結果をフローサイトメトリーで分析し、各 個体群のパーセンデージを、試験日の未処理対照の１＜−センデージを１００と して計算した。 図３は、ＨＧＧに対するトレランスが、ＩｇＧ２ａＣＤ４ＭａｂＹＴＳ１７７． ９によってどの様に誘導されるかを示している。正常ＣＢＡ／Ｃａ７ウスにＹＴ ３１７７．９或いはＹＴＳ１９１．１を−１，０，１日に表示された旦投与した 。１ｍｇの熱凝集ＨＧＧを０日に注射した。２８日及び３５日に、マウスを０． ５ｍｇＨＧＧで再誘発した。対照マウスは他と同様にＹＴＳ１７７．９を１ｍｇ を投与したが、２８日及び３５日にのみＨＧＧで免疫した。血清抗−ＨＧＧの力 価を４５日目にＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイで測定した。 図４は、ラットＩｇＧ２ａに対して特異的なトレランスを誘導するためのＹＴＳ １７７゜９の注射結果を示している。 正常ＣＢＡ／ＣａｗウスにＹＴＳ１７７．９或いはＹＴＳＩ９１．１を３日間連 続して、表示された量を３回注射した。 ６週間後、マウスを、最初は完全な、その後不完全なフロインドアジュバント中 のＹＴＨ３５，４（ＩｇＧ２ａラット抗−ヒト）及びカムパス（Ｃａｍｐａｔｈ ）（登録商標）２（Ｉ　ｇＧ２ｂラット抗−ヒト）を週１回注射することによっ て再誘発した。１０週間目、血液を採取し、抗１ｇ０２ａ（白抜きの棒）及び抗 ＩｇＧ２ｂ（斜線の棒）の力価を、それぞれＨＰＬＣ精製ラットう　ｇＧ２ａ及 びＩｇＧ２ｂＭａｂＳでコーディングしたプレートを用いてＥＬＩＳＡアッセイ で測定した。 図５は、ＩｇＧ２ａＣＤ４及びＣＤ８Ｍａｂ処理後の延長した同種皮膚移植の生 存を示している。正常ＣＢＡ／Ｃａマウス（ｎ−６）にＹＴＳ１７７．９及びＹ ＴＳ１０５．１８或いはＹＴＳ１９１．１及びＹＴＳ１６９．４　（総抗体、３ ｍｇ／マウス）を０．２．４日の３回注射投与した。十分な厚さのＢ　Ａ　Ｌ　 Ｂ　／　ｃ尾皮膚を０日目に移植した。統計値は、ロックランク法（Ｌｏｇｒａ ｎｋ　ｍｅｔｈｏｄ）により、ＩｇＧ２ｂ１ｖｌａｂ処理（ム）対未処理対照（ ・）　ｐ＜Ｑ、００５、Ｉ　ｇＧ２ａ処理（マ）対対照ｐ≦０．００１、対１ｇ Ｇ２ｂ処理ｐ≦０．０３である。 図６は、ｒ　Ｉ　ｇＧ２ａｍＡｂ　ｓによる同種皮膚移植に対するトレランスを 示している。正常ＣＢＡ／ＣａマウスにＢ１０、ＢＲ皮膚を移植し、（１）０日 及び２日目にＹＴＳ１７７．９及びＹＴＳ１０５．１８混合物（２ｍｇ／マウス 合計）、（２）３週間に渡って同ｍＡｂ　ｓ　（９ｍｇ／マウス合計）を与えた 。８９日目、ＢＩＯ，ＢＲ（３及び４）及びＢ１０゜Ｄ２（点線）から皮膚を再 移植した。 図７は、骨髄及び皮膚移植に対するトレランス研究の実験結果を示している。 Ａ：ＢＩＱ、ＢＲに対するトレランス。レシピエンドＣＢＡ／Ｃａマウス（ｎ− ８）Ｉ：１〜３週間ｒ　ｉ　ｇＧ２．ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂｓの組み合わせを 注射投与し、引き続いて１０７個のＴ破壊膵臓細胞及び１０７個の骨髄細胞を注 入した。 対照マウス（ｎ−４）は骨髄及び生理食塩水を注射、或いは骨髄のみで処理した 。すべての群は、３０日後Ｂ１０．ＢＲ皮膚を移植した。ドナーアロタイプＩｇ のキメラ現象は、骨髄移植の２４及び６０日後に、骨髄及び抗体処理マウスに対 しては２．６±１．６及び１．３±０．７％としてそれぞれ測定された。生理食 塩水或いは骨髄のみの群はキメラ現象が見られなかった。 Ｂ　：　ＡＫＲ／Ｊに対するトレランス。正常ＣＢ　Ａ　／　Ｃａレシピエンド マウスにｒ　ｉ　ｇＧ、ＣＤ４及びｒｉｇＧ２ｂＣＤ８ｍＡｂｓの組み合わせを ３週間注射投与した。２×１０７個のＡＫＲ／Ｊ骨髄細胞をｍＡｂ処理処理開始 ２静後静脈内注入。 ４週間後、ＡＫＲ／Ｊ皮膚（・）を移植した。対照マウスは抗体処理のみ施した （ム）。 図８の皮膚移植に対するトレランスは、ＡＴｘマウスにおいて確立できる。ＡＴ Ｘ７ウス（ｎ−９）にｒ　Ｉ　ｇＧ２．ＣＤ４及びＣＤ８ｍＡｂ　ｓを２週間１ 日おきに注射した。Ｂ１０゜ＢＲ皮膚をｍＡｂ処理処理開始３ト後植した。６０ 日目に、ＢＩＯ，ＢＲを再移植し、ＢＡＬＢ／ｃ（・）移植片は、Ｂ１０、ＢＲ 皮膚移植片（ム）を有するＡ　Ｔ　ｘマウスによって拒絶された。対照ＡＴｘマ ウスは、Ｂ１０．ＢＲ皮膚（■）を移植している。 図９は、ＣＤ４及びＣＤ８抗体の異なる組み合わせにより処理されたマウスにお ける同種異系皮膚移植の生存を示している。８〜１４匹からなる３群のレシピエ ンドＣＢＡ／Ｃａマウスに０日にＢＡＬＢ／Ｃ皮膚を移植し、０〜２日までモノ クローナル抗体で実施例２に記載されたように処理した。 第１群はラットＩ　ｇ　Ｇ　２　、抗体のみ（マ）を与え、第２群はラットＩ　 ｇ　Ｇ　２ｂ抗体のカクテル（◆）を与え、一方策３群（・）はＩｇＧ　と引き 続いてＩ　ｇ　Ｇ　２．抗体の組み合わせプロトコｂ −ルを与えた。この第３群のすべてのマウスに、更に抗体を与えることなく、９ ４日目に新しいＢＡＬＢ／ｃ（ム）及びＢ１０（■）皮膚移植片を移植した。 移植片生存の分析：ｘｇｃ２．群Ｍ　Ｓ　Ｔ　−５５日に対するＩｇＧ　群Ｍ　 Ｓ　Ｔ　−２８日は、ｐ＜０．００６、ＩｇＧ、又は２！ １２０２１群に対する組み合わされたプロトコール群の元のＢＡＬＢ／Ｃ移植片 ＭＳＴ−１２１日は、ｐ＜Ｑ、００１、第３のＢＩＯ移植片ＭＳＴ−１６日に対 する組み合わされたプロトコール群の第２のＢＡＬＢ／Ｃ＃植片ＭＳＴ飄４３日 は、ｐ＜ｏ、０４である。 図１０は、ｈ＝Ｉ　ＨＣ−不適合皮膚移植片に対するトレランス誘導を示してい る。８〜１２匹のＣＢＡ／Ｃａマウスに０日にＢＩＯ皮膚を移植し、０〜２１日 までモノクローナル抗体で実施例２に記載されたように処理した。 （ａ）第１群は、抗体を投与されてない対照マウス（マ）である。第２群（◆） はラットＩ　ｇ　Ｇ　２　、抗体のみを投与し、一方残りの群（・）はすべて組 み合わされたＩｇＧ２．及びＩｇ　Ｇ　２　、プロトコールを投与した。この最 後の群は、１１９日に新しいＢＩＯ移植片（ム）及び第３のＢＡＬＢ／ｃ皮膚（ ■）を移植した。 移植片生存の分析用ｇ　Ｇ　２．群ＭＳＴ−４８日に対する対照群ＭＳＴ−１４ 日は、ｐ＜０．００１、第２のＢＩＯ移植片ＭＳＴ−４４日（１１９日から）に 対する組み合わされたプロトコールの元のＢＩＯ移植片ＭＳＴ＞２５０日は、ｐ く０．００２、第３のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ移植片ＭＳＴ−１３日に対する第 ２のＢＩＯ移植片は、ｐ＜０．００３である。 （ｂ）８匹のＣＢ　Ａ　／　Ｃａマウス群に、組み合わされたＩｇＧ　と引き続 いてＩ　ｇ　Ｇ　２□抗体のプロトコールと共にＢ１ｂ Ｏ移植片（ｅ）を与えた。９１日目にマウスに第３のＢＩＯ皮膚（震）と共に第 ２のＢＩＯ移植片（ム）を与えた。 移植片生存の分析：全群は、ＭＳＴ＞２００日であった。 図１１は、多マイナー抗原不適合皮膚に対するトレランスの誘導を示している。 ８及び１０匹のＣＢＡ／ＣａマウスのたラットＩｇＧ　と引き続いてＩ　ｇ　Ｇ 　２．抗体のプロトコールｂ （・）を与え、１２２日に新しいＡＫＲ／Ｊ皮膚（ム）及び第３のマイナー異１ Ｂ１０．ＢＲ皮膚（■〕を再移植した。 移植片生存の分析二組み合わされたプロトコールの元のＡＫＲ／Ｊ移植片ＭＳＴ ＞２５０日に対する無抗体対照ＭＳＴ−１３日は、ｐ＜０．００１、第３のＢＩ Ｏ，ＢＲ移植片ＭＳＴ−２７日に対する第２のＡＫＲ／Ｊ移植片ＭＳＴ＞１２８ 日は、ｐ＜０．００９である。 図１２は、感作されたレシピエンドにおける多マイナー抗原不適合皮膚に対する トレランスの誘導を示している。レシピエンドＣＢＡ／Ｃａマウスに、皮膚移植 の３週間前に１０７個の紫外線照射した（２０００ラツド）ＡＫＲ／Ｊ　（ａ。 ｂ）或いはＢＩＯ，ＢＲ（ｃ、ｄ）由来の肺臓細胞を腹腔内注射することによっ て、ドナーマイナー抗原に対して感作させた。５〜１３匹のマウスの群にＡＫＲ ／Ｊ　（ａ、ｂ）或いはＢＩＯ，ＢＲ（ｃ、ｄ）皮膚（・）を、実施例２に記載 したように、０〜２１日間のモノクローナル抗体の援護のもとに移植した。２つ の群は、組み合わされた１ｇＧ２５及びＩｇＧ２ａのプロトコール（ａ、ｃ）及 び２つの群は、ラットＩｇＧ２．抗体のみ（ｂ、ｄ）を投与した。マウスは、８ ９日（ａ。 Ｃ）或いは９６日（ｂ、ｄ）に、第２のドナー−タイプ移植片（ム）（ａ及びｂ 群におけるＡＫＲ／ＪＳｃ及びｄ群におけるＢＩＯ，ＢＲ）及び第３のマイナー 異種（震）皮膚（ａ及びｂ群におけるＢＩＯ，ＢＲ，ｃ及びｄ群におけるＡＫＲ ／Ｊ）を再移植した。 移植片生存の分析＝　（ａ）第３のＢ１０．ＢＲ移植片ＭＳＴ−４１日（８９日 から）に対する組み合わされたプロトコールの元のＡＫＲ／Ｊ移植片ＭＳＴ＞２ ２５日は、ｐく０゜００７　（ｂ）第３のＢＩＯ，ＢＲ移植片ＭＳＴ−４２日（ ９６日から）に対するＩｇＧ２□で処理された元のＡＫＲ／Ｊ移植片ＭＳＴ＞２ ００日は、ｐ＜０．０２　（ｃ）実験の全群はＭＳＴ＞２２５日Ｃｄ）実験の全 群はＭＳＴ＞２００日であった。 図１３は、第１の皮膚移植片を活発に拒絶するマウスにおけるトレランス誘導を 示している。６及び１１匹のＣＢＡ／Ｃａマウスの２つの群に、モノクローナル 抗体の処理なしに０日にＡ　Ｋ　Ｒ／　Ｊ皮膚を移植した。１４日に約半数のマ ウスがこれらの第１の移植片（・）を拒絶し、第２のＡＫＲ／Ｊ皮膚移植片を移 植しモノクローナル抗体処理を開始した（ム）。その後マウスに組み合わされた ＩｇＧ２ｂと引き続いて１ｇＧ２．抗体の３週間のプロトコール（ａ）或いはラ ットＩｇＧ移植片生存の分析：　（ａ）第２の組み合わされたプロトコールの処 理がなされたＡＫＲ／Ｊ移植片ＭＳＴ＞９２日に対する第１のＡＫＲ／Ｊ移植片 ＭＳＴ−１２日は、ｐ＜Ｑ。００４　（ｂ）（ａ）及び（ｂ）における全ての第 １の移植片ＭＳＴ−１２０に対する１ｇＧ２．で処理されたＡＫＲ／Ｊ移植片Ｍ 　Ｓ　Ｔ　＞　７５日は、ｐｒｏ、００３゜例　１ く材料および方法〉 実験動物 ＣＢＡ／Ｃ！、　ＢＩＯ，ＢＲ及びＢＡＬＥ／ｅｖウスがケンブリッジ大学病理 学部における通常の動物施設で繁殖、飼育され、年齢別および性別にグループ分 けして用いられた。 フローサイトメトリーによるモノクローナル抗体の同定ラットＴ細胞ラインＮ８ ２−６７Ｇ　（Ｄｒ、１．ｌ１ｏｖｘ＋ｄの好意により提供された）が、マウス ＣＤ４遺伝子（Ｇｏｒｍｚｎ　ｅ＋　ａｌ、！’ＮＡＳＵＳＡ　８４．７６４４ ．１９８７）でトランスフェクトされた。この細胞ラインＮＢ２．　Ｌ３Ｔ３は 、ラットの抗マウス胸腺細胞融合からの新規ＣＤ４　ｍＡｂｓのスクリーニング に使用された。細胞（１−５Ｘ１０６）は試験上清と共にインキュベートされ、 次いでＦＩＴＣ−結合ウサギ抗−ラットＩｇ血清（Ｄｘｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ 、Ｄｅｎｍｘｒｋ　）と共にインキュベートされた。サイトフルオログラフ（モ デル５０−Ｈ。 オルト社、ウェストウッド、　ＭＡ、　ｕＳＡ　）上でのフローサイトメトリー により蛍光染色が分析され、データはオルト２１５０コンピユータによりで処理 された。 ｍＡｂｓの競争的結合のために、Ｌ３Ｔ４／Ｉｌｙｇ　２．　Ｉ細胞は、先ず１ ０μｇの未標：ｉｍＡｂｓの存在下において、氷上で３０分間ビオチニル化ｍＡ ｂｓ（１μｇ／１０５細胞）と共にインキュベートされた。 更に１５分のインキュベーションのために、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ア メルシャム社、Ｕ、　Ｋ、　）が添加された。その結果は、オルト社のサイトフ ルオログラフにより分析された。 マウス肺臓細胞を第一のｍＡｂ　、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（セ ロチック社、キトリングトン、Ｕ、に、）、第二のｍＡｂ　、およびＦＩＴＣ− 結合されたアイソタイプ特異性ｍＡｂｓと共に順次連続的にインキュベートする ことにより、二色蛍光染色が行われた。緑および赤の蛍光が検出され、オルト社 のサイトフルオログラフによって対数スケール上に表示された。 末梢血液リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）の免疫蛍光染色フィコール（比密度１．０７９ 、ファーマシア社、スエーデン）上において、３０００Ｘｇで２０分の遠心分離 を行うことにより、マウスＰＢＬが分離された。界面の細胞を回収し、ＰＢＳ／ ＢＳＡ／アジドの中で洗浄した。次に、この細胞を組織培養上清中の＋ＩｇＧ２ ｂ　ｍＡｂｓで染色し、続いてＦＩＴＣ−結合Ｎ０ＲＩＧ７．１６で染色するか 、或いはビオチニル化ｍＡｂｓで染色し、続いてＦＩＴＣ−ストレプトアビジン （アメルシャム社）で染色する。 結果は、上記のようなフローサイトメトリーによって分析された。 補体溶解 補体溶解は、先に述べたようにして行った。簡単にいうと、５１Ｃｒラベルされ たマウス胸腺細胞および補体源として添加された２％モルモット血清でｍＡｂｓ を稀釈し、インキュベートした。３７℃において４５分後に上清を回収し、フィ リップス社製の自動ガンマ線カウンタ（フィリップス、アインドホーベン、オラ ンダ）によって放射活性を測定した。特異的溶解は次式に従って計算された。 溶解％−（ｅ−ｓｌ　／　（１−ｓｌ　Ｘ　Ｉ（１Ｇ但し、上記式において、ｅ はサンプルカウントであり、Ｓは自然放出であり、ｔは合計カウントである。 ＨＧＧにトレランスを導入する方法は既に刊行物に記載されている（Ｂｅｎｊａ ｍｉｎ　ｅｌ　ａｌ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ　１６３．１５３９．１９８６） 　ｏ正常なＣＢ＾／Ｃ２マウスに対して、ＣＤ４　ｍＡｂｓを、１日目に静脈注 射（ｉ、ｖ、）Ｌ、０日目および１日目に腹腔内注射した。ｌｌｌ１ｇの熱凝集 ＨＧＧを、０日目にｉ、　ｐ、投与した。このマウスに対して、２１日目および ３１日目に０．５ｍｇのＨＧＧを再投与した。 ３８日目に、ＥＬ’ＩＳＡによって、ＩｇＧ抗−ＨＧＧ応答を測定した。 ＥＬＩＳＡによるマウス抗体の検出 ネズミ抗体応答を測定するために、精製されたタンパク抗原でコートされた平面 底の可撓性プレート（ベクトンディッキンソン、ＵＳＡ）中で、サンプル血清を 系列的に稀釈し、３０分間インキュベートした。このプレートをＰＢＳｌｏ、　 ０５％ツイーン２０（シグマ社、プール、ＵＫ）で洗浄し、次いでビオチン化さ れたヒツジ抗−マウスＩｇＧ　＜アメルシャム社）と共に３０分間インキユベー トシ、上記のようにして洗浄した。該プレートに対してストレプトアビジン−西 洋わさびパーオキシダーゼ（アメルンヤム社）を１５分間添加し、更に３回洗浄 した後、５０ｇ／ｍ　ｌの０−フェニレンジアミンおよび０．１％過過酸過水− よって反応させた。４９０ｎｍにおける吸収を読み、標準陽性コントロールと比 較することによって力価を決定した。 皮膚移植 皮膚移植片を、ＢｉｌｌＢｌｌｌｉｎ　ｓｌ　！ｌ　（Ｎａ１ｕｒｅ１７２，６ ０３．１９５３　）の改変方法で移植した。移植を受けるマウスは、１μｇ／マ ウスのＨ７ｐｎｏｄｉｌ及び０．２ｕ　ｇ／７ウスのＳｕｂｌｉｍａｓｅ（ジャ ンセン社、オックスフォード、ＵＫ）の１．２．注射により麻酔した。 ドナーの尾から得た全厚皮膚移植片（０，５ｃｍ　Ｘ　Ｏ，５ｃｍ　）を、横胸 壁の移植ベッドに移植し、ワセリンガーゼ及び綿包帯で覆い、プラスターで７日 間保護した。その後毎日、移植片の生存を観察して記録した。生存の再終時点は 、生きた移植組織が全く見られなくなった日である。 中間生存時間（ＭＳＴ）は、ログラン法（Ｌｏｇｒａｎｋ　ｍｅｔｈｏｄ　；Ｐ ｅ１ｏ　ｒｌ　ａｌ、　Ｂ＋、　１．　Ｃａｎｃｅｒ　３５．　Ｉ、　１９７７ ）によって計算され、分析された。Ｍｚｎｘｃｏ　ｅｌ　ｘｉ　（１，ｌｍｌｌ １’ｕｎｏ１．．９６，２２９．１９６６）の方法により４週齢で胸腺を摘出さ れたマウスを、少なくとも４週間後に用いた。犠牲に供したときに全部をチェッ クしたが、胸腺摘出が不完全なものはなかった。 移植のための骨髄細胞の調製 Ｔ細胞を除去するために、ドナーマウスから採取された骨髄ｉ胞を、ＣＤ４およ びＣＤ８を破壊させる抗体で感作した。２×１０７個の生きた細胞を、トレラン スが誘導されたか否かを調べるために、適切に調製された被移植動物中に移入し た。 キメラ現象は、先に述べたドナー１ｇアロタイプまたはドナーＴｈ７−１゜１７ ０タイプのｐ１定（Ｑｉｎ　！ｌ　ａｌ、　１９８９．　Ｊ、　Ｅｌｌｌ、　Ｍ ｓｄ、　１６９、７７９）によって決定することができた。 純真なＣＢＡ／Ｃｚマウス、または４−８週前にＢｌＯ，ＢＲ牌膵臓胞に対して 予め感作されて皮膚移植を受けたＣＢＡ／Ｃａマウスから、ドナー肺臓細胞を得 た。これらは膵臓細胞は、ｍＡｂｓで処理されてＢｌＯ，ＢＲ皮膚を移植され、 且つ該移植片を２００日以上保持したトレランスを有するＣ［ｌＡ／ＣＡ彼移植 動物中に移入された。 夫々の彼移植マウスに対して、５×１０７個の膵臓細胞を静脈内注射した。コン トロールとして、成体の胸腺摘出された（ＡＴｘ）マウスをｒｌＧＧ２ｂｃＤ４ およびＣＤ８ｍＡｂｓで処理し、Ｄ４＋およびＣＤＢ÷細胞を欠損させた。この ようなマウスは同種移植を拒絶する能力がなく　（Ｃｏｂｂａｌｄ　！ｌ　！１ ，１９８４．　Ｎａ１ｕｒｅ、　３１２．５４８）　、ここでは移入された細胞 が機能し得ることを示すために用いられた。 応答性の膵臓細胞（Ｒｅｓｐｏｎｄｏｒ　５ｐｌｅｅｎ　ｃｅｌりを洗浄し、熱 により不活性化した１０％ヒトヒト血清を補充したｌ５ｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂ ｅｃｅｏ培地（ＩＭＤＭ）中に再懸濁した。刺激性肺臓細胞（ＳｔｉＩＩｌｕｌ ａｔｏｒ　５ｐｌｅｅｎ　ｃｓｌｌ）は、３７℃で３０分間、２５μｇ／ｍｌの マイトマイシンＣ（シグマ社、Ｐｏｏｌｔ　ｓυＫ）で処理し、ＩＭＤＭ中で２ 回洗浄した。 ３×ＩＯ個の応答性細胞および３×１０５個の刺激性細胞を、９６ウエルの平底 マイクロプレート内において、３７℃で、５％ＣＯ２を用いることにより培養し た。４日目に、細胞にｌＯμＣｉ／ｍｌの１２５Ｉ−デオキシウリジン（アメル シャム社）を６時間パルスした。取込みをガンマ線カンタで測定した。三回の幾 何平均を計算した モノクローナル抗体によるリンパ球の刺激マイトジェン性の抗−Ｖβ６　ｍＡｂ 、４６−６８５は、Ｄｒ、Ｂ、ヘンガルトナー（ＰＢｏｅｓｆ　ａｌ、　１９８ Ｂ、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８５．７６９５　）の好意により提供された。３７℃ において１晩、１μｇ／ｍ　ｌのこのｍＡｂを９６ウエルの平底プレートに結合 し、次いで使用前にＩＭＤＭでよく洗浄した。ＣＤ３　ｍＡｂ、　１４５−２Ｃ １１は、Ｄｒ、　Ｊ、ブルーストーンの好意ニヨり提供され（Ｌｅｏ　！ｔ　ｘ ｔ、１．９８７．　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８４．　Ｄ７４　）、血清フリー組織培 養上清によるｌ：１００稀釈液として使用された。ＩＥＤＭおよび熱不活性化し たｌＯ％ヒトヒト血清中の４．５×１０５個の膵臓細胞を、個々のウェルに添加 した。培養４日後の増殖を既述のようにして測定した。 く結果〉 ＣＤ４分子に結合するｒ１ｇＧ２ｘの同定ｍＡｂ、　ＴＴＳ　１７７、９は、そ のＬ３Ｔ４形質導入細胞ラインへの結合に基づいて、免疫蛍光染色（表１）を用 いて単離された。そのアイソタイプは、ＥＬＩＳＡ　（データは示さない）を用 いることにより、抗−＋ＩｇＧ２ｉ　ｍＡｂ並びにＲＧ　？／１．７　（Ｓｐ＋ ｉｎｇｅｒ　ｔ１！１、Ｈ７ｂ＋ｉｄｏｍｉ　ｌ、　２５７．１９８２）との反 応により決定された。このｍＡｂを既述した二つの他のＣＤ４　Ｂ＋Ａｂｓと比 較するために、更なる分析を行った。結合阻害の研究によって、ＴＴＳ　１７７ ．９は、ＹＴＳ　１９１．１　（Ｃｏｂｂｌｏｄ　ｅｌ　！ｌ、　１９８４．Ｎ ａ１ｕｒｅ３１２．５４ｇ　）及びＧＫｌ、５　（Ｄｉａ１７ｒｚｓ　！＋　ｘ ｌ、１ｍａ＋、Ｒｓマ、　７４．２９−５６．１９８３）と同じエピトープに結 合するが（両者ともＣＤ４　ｍＡｂｓ）　、別のエピトープを認議する他のＣＤ ４　ｔｎ＾ｂ　ＹＴＡ　３．　ｌ　（Ｑｉｎ　ｅｌ　１１．　Ｅａｒ、　１．　 Ｉｍｍｕｏ。 １、１７．１１５９．１９８７）によって結合されるものとは異なる。二色フロ ーサイトメトリーにおいて、ＹＴＳ　１７７．９及びＹＴＡ　３．　Ｉはマウス 膵臓細胞の同じポピュレーシタンを染色し、これはＣＤ８　ｍＡｂ及びＹＴＳ　 １６９．８によって染色されるものとは異なる（Ｃｏｂｂｌｏｄ　ｅｌ　１１． １９８４．Ｎｘ１ｕｕ　３１２．５４８　）。 また、ＴＴＳ　１７７、９の特異性は特異的５１Ｃｒ放出検定によって試験され た。このｍＡｂは、単独で用いたときは溶菌に効果的ではないが、ＣＤ４　ｔｎ Ａｂ　ＹＴＡ　３．１との相乗作用を示した（図１ａ）。他方、ＴＴＳ　１７７ ．９は、＋１ｇＧ２１ｍＡｂ　ＹＴＳ　１９１．　Ｉに媒介された溶菌で妨害さ れ、これは蛍光染色において交差阻害であることが示された（図１ｂ）。 目ｇＧｂ　ＣＤ４　ｍＡｂはｉｎ　ｖｉｖｏでＴ細胞を破壊しないｒＩｇＧ２ｘ 　ＣＤ４　ｍＡｂのＩＩＩｖＩｖｏ細胞破壊に対する影響を調べるために、我々 は成体の胸腺摘出された（ＡＴｘ）マウスヲ用いた。というのは、これらの動物 においては、胸腺に依存したＴ細胞再生がないため、正常なマウスに比較して、 ｍＡｂの破壊に引き続くＴ細胞の回復が遥かに非効率的だからである。ｍＡｂ注 射後の末梢Ｔ細胞の変化をモニターすることによって、一時的な抗原性の調節ま たはリンパ球の再分布から、真の破壊を区別することが可能である。２ｍｇのＩ ｇＧ２ｇ抗体またはＩｇＧ２ｂ抗体と、末梢血液リンパ球を投与された夫々のマ ウスを、処理前または処理後の種々の時点において、フローサイトメトリーによ って分析した。図１に見られるように、ＩｇＧ２ｂ　ｍＡｂ治療の完了後１週間 で、約９０％のＣＤ４　細胞が末梢系から消耗された。これには全Ｔ細胞のパー センテージ減少およびＣＤ８　細胞の僅かな減少が伴われた。これとは対照的に 、ＩｇＧ２ａ　ｍＡｂ治療はＣＤ４　細胞のパーセンテージを減少＋ させるが、Ｔｌｙ−１細胞の全パーセンテージ及びＣＤ８＋細胞のパーセンテー ジは顕著な変化を示さない。これは、抗体結合に続＜　ＣＤ４分子の抗原性調節 の結果と思われる。治療後４週間、ＴＴＳ　１７７．９治療群は正常なＣＤ４レ ベルを維持したのに対し、ＩｇＧ２ｂ治療群におけるＴ細胞数は低く維持された 。 ＋１ｇ０２ａ　ＣＤ４　ｍＡｂの被覆下におけるＨＧＧに対するトレランスの誘 導 ＣＤ４　Ｆ　（ｌｂ’　）　２　ＩＩＩＡｂフラグメントを用いた先の仕事は、 タンパク抗原に対するトレランスを促進するｍＡｂがＣＤ４＋Ｔ細胞の破壊を必 要としないであろうことを示唆している。この研究において、我々はＦ（ｉｂ’ １２フラグメントのような非破壊性ＣＤＪ　ｍＡｂが同様の効果を有しているか 否かを調べた。マウスは３日コースでＴＴＳ　１７７．９又はＹＴＳ　１９１． 　ｌを与えられ、また第２日（０日）　ｌ：　ＨＧ　Ｇ　（０，５ｍｇ／マウス ）を注射された。４週間後にＨＧＧを再投与したとき、ＴＴＳ　１９１．１処理 されたマウスおよび南投与量のＹＴＳ　１７７、９を与えられたマウルは、ＨＧ Ｇに対するトレランスを獲得した（図３）。しかしながら、０、１ｍｇ以下のｍ Ａｂを投与されたマウスは、依然ＨＧＧに反応し１尋た。 ＋１ｇ０２ｘ　ｍＡｂに対するトレランスを誘導するＴＴＳ　１７７、９の能力 外因性抗体のｉｎ　ｖｉｖｏ投与によって、通常は、ホスト内で抗グロブリン応 答が引き出される。ＣＤ４　ＩＩＩＡｂｓの一つの特徴は、これら抗グロブリン 応答を抑制し、同じアイソタイプの他の抗体に対するトレランスをも誘導するこ とである。今回の研究において、ｒ１ｇＧ２ａ　ＣＤ４　ｍＡｂ　ＹＴＳ　１７ ７、９が同じ性質を有することが見出だされた。 ０、ｉｌＢ／マウスのＴＴＳ　１７７．９を投与されたマウスは、本来の抗グロ ブリン応答をしない（力価：　＜　１：２０）。しかしながら、０．０１ｍｇ／ マウスのＹＴＳ　１７７．９を投与されたマウスは、弱い応答をした（］：ｌ６ １）　）。最初の抗体注射の６週間後、十分な刺激を確実にするために、これら 動物はフロイントのアジュバント中の不規則抗体（ラットの抗ヒト）　＋１ｇ０ ２ａおよびｒ１ｇＧ２ｂ　ｍＡｂを再投与された。該ｔ１ｇ０２ｇは、ヒトＣＤ ｖ５２（Ｌａｌｄｍｘｎｎ　ｅｊ　ａｌ、　１９８５．　Ａｄｖ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｓｄ、　Ｂｉａ！、　１８６．８９６）に対するｍＡｂ　、即ちＹＴＦｌ　３ ４．５であった。また、　ｒ１ｇＧ２ｂはヒトＣＤ３（Ｗｘｌｄｍａｎｎ　ｅｌ 　！１．１９８５　）に対するｍＡｂ　、即ちＹＴＩ１１２．５であった。マウ スは４週間後に脱血され、その血清の抗−ラットＩｇ力価をＥＬＩＳＡによって 測定した。　ｒ１ｇＧ２ｂ　ｍＡｂを与えられたマウスが＋１ｇＧ２ｂ免疫グロ ブリンに対してトレランスを有するのと丁度同じように、高投与量のＹＴＳ　１ ７７、９　（Ｉ　ｌ０Ｎ）を与えられたマウスは、繰り返し行われた追加免疫の 後にも、＋１ｇ０２ｇに対して完全にトレランスを有することが示された（図４ ）　、　０．１ｍｇのＹＴＳ　１７７、９は、本来の免疫応答を抑制するが、ト レランスを誘導するためには不十分である。０．０１ｍｇのＹＴＳ　１７７．９ を与えられたマウス又は未処理の対照マウスは、二次タイプの抗グロブリン応答 を示した。ＹＴＳ　１７７．９処理マウスが＋１ｇＣ；２ｂに対して未だ応答可 能であり、またＹＴＳ　１９１゜１に対してトレランスを有するマウスが＋１ｇ ０２ａに応答できるように、このようにして誘導されたトレランスは特異的であ った。 ｒ１ｇＧ２ｘ　ｍＡｂ処理による同種移植片拒絶反応の遅延我々は、短期治療コ ース後の同種皮膚移植片の生存を延長させる能力において、ＹＴＳ　１７７、９ が＋１ｇＧ２１　ＣＤ４　ｍＡｂｓと同様に効果的であることを見出した。最初 の実験においては、同種皮膚移植の３日前から、正常なＣＢＡ／Ｃａマウスに対 して＋１ｇ０２ａ　（ＴＴＳ　１７７、９　）またはｒ１ｇＧ２ｂ　（ＹＴＳ　 １９１．１　）を、２週間に亘って毎日注射した（全ｍＡｂ量は約７ｍｇ／マウ ス）。 ＹＴＳ　１７７．９治療群においては、ＭＴＳは２０日まで顕著に延長された（ 未治療対照群：１１ｊ日；ｐ≦０．０５、表２）。この延長された移植片の生存 は、細胞を破壊させるｒ１ｇＧ２ｂ　ＣＤ４　ｍＡｂによって達成されるもの（ ＭＴＳ　１９日）に非常に近似していた。 ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの不適合による移植拒絶反応において、÷ ＣＤ４　およびＣＤ８＋サブセツトの減少は、ＣＤ４　ｍＡｂｓのみの効果（Ｃ ｏｂｂｏｌｄ　ｒｌ　！Ｉ、　Ｔｒｕｓｐｌｕ！ｘｌｉｏｎ、　４２．２３９． １９８６　）を越えて、移植片の生存を顕著に改善することが示された。今回の 研究において、我々は別の＋１ｇＧ２１　ＣＤ８　ｍＡｂを用いた。これもまた 、ＩｇＧ２ａ　ＣＤ４　ｍＡｂと共にｉｎ　ｖｉｖｏでの細胞破壊に対して若干 の効果しかもたない。このＣＤ８　ｍＡｂ　（即ちＹＴＳ　１０５．１Ｂは、完 全な同種皮膚移植片の生存を更に延長させる点において、＋１ｇＧ２１　ＣＤ４ 　ｍＡｂ　（即ちＭＴＳ　１７７．９）と共働効果を有することが見出だされた 。比較する目的で、等量の二つの＋１ｇＧ２１　ｍＡｂｓ　（ＹＴＳ　１９１． １及びＹＴＳ　１６９．４）または二つのｒ１ｇＧ２ａ　ｍＡｂｓを投与した。 皮膚移植を基準にして０日目、２日目および４日目に、合計３　ｍｇ／マウスの ｍＡｂｓを与えた。 このｒ１ｇＧ２ｂ処理されたＣＢＡ／Ｃａ　７ウスは、２４日のＭＳＴで、ＢＡ ＬＢ／Ｃ皮膚を拒絶した（対照群では１０．５日、ｐ≦０．００５．図５）。驚 くべきことに、ｒ１ｇＧ２ｘ　ＣＤ４及びＣＤ８　ｍＡｂｓで処理された群の移 植片生存は、ｒ１ｇＧ２ｂ　ＩＩＩＡｂ＋で処理したマウスのそれよりも長かっ た。　ｒ１ｇ０２ａ処理された４匹のＣＢＡマウスのうちの３匹は、移植後４５ 日まで、ＢＡＬＢ／ｃ皮膚移植片を拒絶しなかった（ＭＳＴ　４６．５日；対す るに＋ＩｇＧ２ｂ処理群テハ　、ｐ≦０．０３）。 皮膚同種移植に対するトレランス ＣＤ４　ｍＡｂ処理後の、心臓または膵臓のような一定の同種移植片の永久生存 に肝する報告が成されてはいるが、一般的には、ｍＡｂ処理のみで皮膚移植片を 長期間維持することはもっと困難であることが分かっている。我々は、ＣＤ４破 壊性ｍＡｂで処理することによって、多重マイナー非適合性肯髄の許容が可能に なること、及びこのようなマウスはドナー皮膚のトレランスを有することを先に 示した。今回の研究において、我々はＣＢ人ＩＣ！マウスにＢｌＯ，ＢＲマウス からの皮膚を移植し、移植を受けたマウスをＹＴ３１７７．９　（ＣＤ４　）及 びＹＴ５１０５．１８（ＣＤ８　）で処理した。このト２適合性で、多重マイナ ー移植抗原非適合性のコンビネーションにおいて、３週間コースのｍＡｂ治療を 受けた全てのマウスは最初の皮膚を９０日間許容した。この時点で、第二のドナ ータイプの皮膚が、第三パーティ−（ＢｌＯ，Ｄ２）の移植片と共に移植された 。図６のデータは、ＢＩＯ，Ｄ２皮膚がすぐに拒絶されたのに対して、第一およ び第二の移植片は全て無期限（〉９０＋日）に生存したことを示している。ｍＡ ｂｓを２回注射されただけのマウスのうち、６匹のうちの３匹はＢｌＯ，ＢＲ皮 膚を９０日間維持したが、これらは第二の皮膚移植の後に徐々に拒絶された。 ＣＢＡ／Ｃａに＋ＩｇＧ２ａ　ＣＤ４及びＣＤ８　ｍＡｂｓを注射することによ って、骨髄移植およびＢＩＯ１ＢＲ皮膚に対するトレランスが可能になった（図 ７）。また、同様のプロトコールにより、ＡＫＲ／Ｉ骨髄（Ｍｌｓ−１りによる キメラ現象およびトレランスが可能になった（図７）。ＣＤ４細胞の破壊を伴わ ずにトレランスが達成されるので、我々は、移植された動物の末梢系におけるＶ β６”　ＣＢＡ／Ｃ！Ｔ細胞の運命を追跡する機会を得ることができた。モノク ローナル抗体および骨髄を注入した４週間後、これら動物の肺臓細胞は、ｉｎ　 ｙｉｖｏにおいて、Ｍｉｓ−１に反応できず、またマイトジェン性Ｖ６ａ＋Ａｂ での固相刺激に対して乏しい反応しか示さなかった（表３）。ＦＡＣＳ分析によ って、末梢系における正常な数のＶβ６＋細胞が示された（これらは移植を受け た動物のＴｈ７１．２アロタイプのものであることが示された）。明らかに、Ｖ β６　細胞は刺激に対してアネルギー性であった。ＣＤ４　ｍＡｂはＴ細胞を破 壊しないから、これらはアネルギー化された末梢Ｔ細胞であろうと仮定された。 胸腺が末梢子細胞のトレランスに不可欠でないことを確かめるために、再度、今 度はＡＴエマウスをＭｌｓ−１に対してトレランス化するためにＡＫＲ／１骨髄 を使用した。今度も、牌臓Ｔ細胞は旧＋−１及びＶβ６＋′刺激に対してアネル ギー化された。骨髄およびｍＡｂの何れも、単独ではこのアネルギーを再現でき なかった。明らかに、末梢Ｔ細胞アネルギーをもたらすためにはｏＡｂ及び骨髄 の組み合わせが必要である。 我々が皮膚移植によって誘導された真実の末梢トレランスを観察していることを 確かめるために、我々はＡＴＸマウスで実験を繰り返した。＋１ｇＧ２ａ　ｍＡ ｂｓはＴ細胞を殺さないから、我々は、これらマウスにおける免疫機能はｍＡｂ 冶療を停止した後にすぐに正常に戻るはずだと考えた。免疫的に正常な発熱性マ ウス（ｓｕｌｙｍｉｃ　ｍ１ｃｒ）で見られたように、試験皮膚に対してはトレ ランスが誘導され、第三パーティ−の移植片は直ちに拒絶された（図８）。 上記の皮膚同種移植トレランスモデルの両者において、我々は、正常なリンパ球 の養子移入によってトレランス状態が終了するか否かを調べた。何れの場合にお いても、正常なドナーから得た５千万個の肺臓細胞の注入によっては拒絶能力を 回復できなかった。このタイプの実験についての多年に亘る問題は、注入された 細胞が生存し且つ機能することを示すことである。一部は、同数の肺臓細胞をＴ 消耗ＡＴＩマウスに移入することによって、このための対照にされた。この場合 、移入された細胞は皮膚移植の拒絶を媒介することができた。 トレランスを有するマウス中に移入された［感作された細胞（ｐ＋１ｍ５ｄ　ｃ ｅｌｌｓ）Ｊのみが、トレランス状態を破ることができた（表５）。ＨＧＧに対 してトレランスを有するマウスにおいて、同様の結果が見られた。ここでは、ま ず移植された動物のＣＤ４＋Ｔ細胞が破壊されない限り、正常細胞の養子移入に よってトレランスを破ることはできなかった。このような実験を制御することの 困難さにもかかわらず、トレランスを有する動物の免疫システムは、正常な無垢 のＴ細胞の免疫能力を発現することができないと結論しなければならない。 例２ く材料および方法〉 二ヱ玉 ＣＢ＾／Ｃａ５Ｃ５７Ｂ１．１０／Ｐｃ　、　ＢＡＬＢ／ｃＳＢＩＯ，ＢＲ及び ＡＫＲ／ＪＴウスが、ケンブリッジ大学病理学部における通常の動物施設で繁殖 および飼育された。性別にグループ分けされたマウスが、６〜１２週齢で用いら れた。 モノクローナル抗体 これらの実施例で用いた全てのラット−モノクローナル抗体を表１に列記した。 抗体は、プリスタンで感作された（ＤＡｘＬＯυ）Ｆｌラット内で生成された複 水から、５０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿し、続いて燐酸緩衝生理食塩水（Ｐ ＢＳ、９１１７．２）中に透Ｆ斤することによって調製された。タンパク濃度は 、２−５ｍｇ／ｌｌ１ｌのモノクローナル抗体を含む０Ｄ２８ｏによって評価し た値がｌ０ｍｇ／ｌｌ１ｌに調節された。全ての抗体製剤は、マウスに投与され る前に０．２μフイルターを通された。 皮膚移植 皮膚移植は、先に報告されているようにして行われた（Ｃ。 ｂｂｏｌｄ　ｅｌ　ｃｌ、　１９８６．Ｔｒｘｏｓｐｌａｎｌｘｌｉｏｎ、４１ ．６３４　）　ｏ簡略にいうと、ドナーの尾の皮膚移植片（０，５ｃｍ　−１， ０ｃｍ平方）を、麻酔された移植を受けるマウスの横胸壁の移植ベッドに移植し た。この移植片は、ガーゼ及びプラスター包帯で７日間被覆された。最初の１月 間は、週に３回だけ移植片の状態を記録し、その後は略１週毎に記録した。生存 期間の相違をログラン法（Ｌｏｇｒｚｎｋ　＋ｕｌｈｏｄ　７　Ｐｅｔｏ　ｓｔ 　ａｌ、　Ｂｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｔ　３５．　Ｉ、　１９７７）を用いて分 析した。成るドナー領域からの多重再移植（ｍｕＨｉｐｌｒ　Ｂ−ｇ＋ｇｌｔｉ ｌを行うときは、これらは単一の調製された移植ベッド、通常は元の皮膚移植と は反対の脇腹に移植された（Ｃｏｂｂｏｌｄ　ｃｌ　ａｌ、　１９８６．Ｎａ１ ｕｒｓ、　３２３．１６４　）　ｏ移植片は最初は週に３回観察され、その後は １週毎に観察された。中間生存時間（ＭＳＴ）は拒絶が完結するまでの日数とし て与えられるが、生存時間が定まらないようなトレランス化された移植片は、一 般に正常な毛の成長を伴う良好な状態にあった。 皮膚移植に対するトレランスの誘導 皮膚移植は抗原／トレロゲンの唯一の供給源として用いられ、上記のようにして 、モノクローナル抗体治療の開始と同じ日に行われた。モノクローナル抗体は、 ０日目から２１日目（算入して）まで、週に３回投与された。最初の２回の注射 （０日目および２日目）は静脈内に、それ以外は腹腔内に行われた。１回の注射 で与えられる全抗体の合計投与量は、０．２ｍｌのＰＢＳ中の２ｍｇの腹水免疫 グロブリン画分てあった。 ラットＩｇＧ２ｂ抗体のためには、これはＹＴＳ　１９１．１．２、ＹＴＡ　３ ゜１、２　、　ＴＴＳ　！６９．４．２及びＹＴＳ　１５６．７．７の夫々０． ５ｍｇである（ＣＤ４およびＣＤ８モノクローナル抗体の相乗作用的な破壊性カ クテル；　Ｑｉｏ　ｅｌ　ａｌ、　１９８７．　Ｅｕｒ、　Ｊ、　ＩＩＩｌｍｕ ｎｏｌ、　１７．１１５９）　ｏラットＩｇＧ２ａ抗体の場合は、ＹＴＳ　１７ ７、９．６　（ＣＤ４　）及びＹＴＳ　ＩＯ５、１８，１０（ＣＤ８　）の夫々 ｌｌｌ１ｇが用いられた。組み合わされた破壊およびブロッキングのプロトコー ルとしては、０日目及び２日目に相乗作用的ラットＩｇＧ２ｂカクテルがｉ、　 Ｖ、で与えられ、その後は２１日目まで、ラットＩｇＧ２ｘ　ＣＤ４及びＣＤ８ をｉ、　ｐ、で週に３回与えた。 血清中における活性モノクローナル抗体のレベルモノクローナル抗体投与の最中 および投与後の種々の時点で個々のマウスから採取した血清サンプルを、１％（ ｗ＃）の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および５％（ｖ／マ）の熱失活された正常 兎血清を含むＰＢＳにより　１１５稀釈した状態で、その２５μｇをＣＤ４およ びＣＤ８形質導入された細胞５Ｘ１０５個に加えた。このＣＤ４形質導入体はラ ットＮＢ２−６ＴＧ系発現マウスＬ３／Ｔ４　（例１）であり、一方、ＣＤ８　 （Ｌｙｊ−２）遺伝子はマウスＬ−細胞中において高レベルで発現した（Ｘｕ＋ ｏｙｓｋａ、　１９８５．　Ｃｅ１１．４３．１５３　）。結合抗体は、ＦＩＴ Ｃに結合されたモノクローナル抗ラットＩｇＧ　２！　（ＭＡＲＧ２Ａ−ＦＩＴ Ｃ；　５ｅｒｏＩｔｃ、　０ｘｌｏｒｄ、　Ｕに）を、製造者が推奨する稀釈度 で用いて検出された。また、分析は１２５０コンピ二−タを具備したオルト社の ５０１１サイトフルオログラフ（Ｏｒｌｈｏ、　Ｗ！５ｌｖｏｏｄ、　ＭＡ、　 ＵＳＡ　）で行った。平均蛍光は、精製されたＣＤ４またはＣＤ８抗体（ＹＴＳ 　＋７７、９．６又はＹＴＳ　１０５゜１８．１０）を、血清サンプルと等しい 濃度にするために正常マウス血清中で稀釈された標準稀釈系列と比較した。蛍光 が飽和抗体を示し、またはバックグラウンドより高い検出可能な蛍光を示さなく なった場合、その結果は、標準曲線の滴定可能領域よりも大きいか又は小さいと 思われる。 末梢血液白血球の調製 個々のマウスをその尾血管から脱血し、ＩＵのヘパリンを含む滅菌チューブ内に この血液を採取した。微小遠心機で２分間処理（６０００＋ｐｍ）　した後、血 漿を除去した。室温で１０秒間０．９ｍｌの水を添加し、続いて０．１ｍｌのＩ ＯＸ燐酸緩衝生理食塩水を添加することによって赤血球を２回溶血し、１，００ ０ｒｐｍで７分間遠心分離することによって白血球を回収した（Ｃｈａｎｄｌｒ ｒｓｆ　ａｌ、　１９７９．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　。 Ｔ細胞サブセット破壊のモニタリング 末梢血液白血球は、上記のように処理された個々のマウスから調製された。これ らに対して、ＣＤ４抗原（ＹＴＳ　１９１．１．２プラスＹＴＡ　３．１．２　 ＞またはＣＤ８抗原（ＹＴＳ　１６９．４．２プラスＹＴＳ　１５６．７．７　 ＞の何れかに対するモノクローナル抗体を含んだ上清が添加された。他のモノク ローナル抗体（表６参照）もまた、対照として使用された。結合抗体は、モノク ローナル抗ラットＩｇＧ２ｂ−ＦＩＴＣ（ＮＯＲＩＧ−７，１６−ＦＩＴＣ＋　 Ｃｌｇｒｋ、　１９８６．　Ｍｔｔｈｏｄｓ　ＥｎＢｍｏｌ、　１２１．５４８ 　）およびモノクローナル抗ラットにＬ鎖（ＭＡＲ−１８，５−ＦＩＴＣ１Ｌｘ ｎｉｅ＋　ｃｔ　ａｌ、　１９８２．　Ｈ７ｂ「ｉｄｏｍ＝、　１．１２５）の 混合物を用いて検出された。蛍光は、１２５０コンピユータ及び線形増幅器を具 備し、且つ生きたリンパ球を選別するための順方向ゲーティング及び９０°分散 を有するオルト社の５０Ｈサイトフルオログラフ（Ｏｒｔｈｏ、　Ｗｅｓｌｗｏ ｏｄ、’ＭＡ、　ＵＳＡ　）を用いて分析された。 混合リンパ球培養 応答細胞は、個々のマウス血液サンプル（略０．２ＩＩｌｌ）から上記の水溶解 によって得られた。この細胞を、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｓ、 ＬＩＫ：　２５μｇ／ｍｌ）処理されよく洗浄された４×１０５個の刺激性肺臓 細胞を含む、三つのＵ底組織培養マイクロタイターウェル内に分割（ウェル当り 略４×１０５個の白血球）することによって、夫々のサンプルについて増殖検定 を行った。ｌＯ％熱失活ヒトヒト血清を含有するｌ５ｃｏｖｅの改良Ｄｕｌｂｅ ｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）は、最終容積が０．１１であった。 ５％ＣＯ２ガスを充填したインキュベータ内において、３７℃で３日間インキュ ベートした後、５μｇの１２５Ｉ−デオキシウリジン（ＩＵＤＲ：　１０μｃｉ ／ｍｌ、Ａｍｅ＋ｓ７ａｍ、ＵＫ　）を６時間添加した。細胞をグラスファイバ ーフィルター上で培養し、フィリップス社の自動ガンマ線カウンタで計測するこ とによって、１２５　工の取り込みを測定した。 例１は、非破壊性のＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体を用いた３週間の治療によって 、多重マイナー非適合性皮膚移植に対するトレランスを可能になることを示して いる。強力なＭＥＩＣ相違に対してトレランスを生じさせ得るプロトコールを確 立するために、我々はＢＡＬＢ／ｃ　（Ｈ−２’　）皮膚を移植したＣＢ＾／Ｃ ！　（Ｈ−２ｋ）マウスウに対して、破壊性抗体（ラットＩｇＧ　２ｂ）を投与 した場合、非破壊性抗体（ブロッキング性のラットＩｇＧ　２りを投与した場合 、並びに破壊性のものに続いてブロッキング性のＣＤ４抗体およびＣＤ８抗体を 投与した場合の夫々の効果を比較した。先に報告したように、厳密に破壊性のプ ロトコールは拒絶反応を顕著に遅延させたが、全てのマウスは７０日以内に拒絶 した（ＭＳＴ−５５日）。非破壊性の抗体は、ここでは効果は小さいが（ＭＳＴ −２８日）、二つの非破壊性抗体の投与の組合わせは、続いてラットＩｇＧ２ａ 抗体でのブロックによって、その殆ど（全部ではない）が２００日で拒絶されは したが、最長の移植片生存が与えられた（ＭＳＴ＞１００日）。 この実験において、９２日目間、第三パーティ−の８１０　（Ｈ−２ｂ）皮膚と 共に第二のＢＡＬＢ／ｃ試験移植片を与えた。これら第三パーティ−の移植片は 直ぐに拒絶され（ＭＳＴ−１６日）、マウスが免疫適格性を回復したことを示し たが、第二のＢＡＬＢ／Ｃ移植片は中間的な４３日の間生存した。このことは、 ＢＡＬＢ／ｃ移植片抗原に対しである程度の特異的な非応答性が存在しているに 違いないことを示している。この株の組合わせにおいて、我々は完全なトレラン スを得てはいないが、ＢＩＯ（Ｈ−２ｂ）皮膚をＭ肛不適合ＣＢＡ／Ｃａ　（Ｈ −２ｋ）マウスウに移植したときに、同じ組合わせプロトコールによって完全に トレランスを許容することを見出だした。図１０は、６／８移植を受けたマウス ６／８がその元の皮膚移植片を無期限（＞　２５０日）に保持する一方、全ての マウスが１１９日目間接植された第三パーティ−のＢＡＬＢ／ｃ皮膚を１５日以 内に拒絶したことを示している。第二のＢＩＯ移植片は実質的に生存時間を延長 したが（ＭＳＴ−４４日）、遺伝的に同一と思われる第一の移植片が維持された ときでさえ、結局は全てが拒絶された。この結果は再現性があり、第二の移植片 を拒絶する能力をもったエフェクター細胞の存在にもかかわらず、トレランスを 有するようになった最初の移植片が保持の特典を享受することを明瞭に示してい る。そのメカニズムがどうであれ、元の皮膚移植はそれ自体に対する非応答性の 状態を誘導し且つ維持するに違いない。第一のＢＩＧ移植片と第二の８１０移植 片とを区別するマウスの能力は、ＢＡＬＢ／ｃ移植片の代わりに８１０．　ＢＲ を与えられたマウス５／８が三つの全部に対してトレランスを維持したように（ 図１０）、第三パーティ−の皮膚に対する拒絶に依存しているように思える。こ のことは、移植を受けた動物が両ドナーＭＩＩＣの関係においてＢＩＯマイナー 抗原のトレランスを有していることを示している。これは、その移植片自体がト レランスを呈し得ること、また受容動物タイプのＭＨＣ（これは元の移植片抗原 の再プロセッシング及び受容動物Ａｒｃｓによるトレランスの発現に由来するに 違いない）をも呈し得ることを意味する。 こらば、高度に免疫源性の皮膚移植片を唯一のトレローゲンとして用いた、完全 なＭＢＣバリアに対する抗体媒介トレランスに関する最初の報告である。移植片 それ自体が、トレランスを引き起こすために必要な全ての抗原提示をもだなけれ ばならない二とが強調されなければならない。 例１において、我々はＣＤ４およびＣＤ８に対するモノクローナル抗体でブロッ キングすることが、多重マイナー抗原（ＣＢ＾／ＣａのＢＩＯ，ＢＲ）が異なる 皮膚移植に対してトレランスを得るために十分であることを示した。図１１にお いては、破壊性のものに続いてブロッキング性プロトコールを組合わせることも 、ＡＩＲ／Ｉ移植片を無期限に保持しているＣＢＡ／Ｃａマウス８／１０につい て有効であることが分かる。これらマウスのうちの６匹もまた、第二のＡＫＲ／ １移植片（更なるｍＡｂ治療を行うことなく１２２日目心間植された皮膚）を保 持したが、全てのマウスは第三パーティ−のマイナー不適合皮膚（８１０，ＢＲ ）を拒絶した。しかし、この第三パーティ−皮膚の拒絶は正常なＣＢＡ対照群よ りもやや遅かった（正常群の１４日に対して、２７日；　Ｃｏｂｂｏｌｄ　ｅｆ 　！＋、、　１９８６．Ｔｒｚｏｓｐｌａ＋ｒｆｉ目ｏｎ、　４１．６３４）　 。逆のコンビネーション（ＣＢＡ／Ｃａマウス上のＢＩＯ，ＳＲ）もまた、破壊 性のものに続いてブロッキング性プロトコールを用いることによりトレランスを 獲得したが（４／５移植片〉２２０日）、２１５マウスは第二の８１０．８Ｒ移 植片ならびに第三パーティ−のマイナー相違ＡＩＲ／Ｉ皮膚の両方を許容した（ データは示していない）。これは、多数の共通した抗原を反映しており、また異 なった実験モデルにおいて見られる「優勢な」トレランスの発見を暗示している （Ｘｘｍｏｙｓｋ！ｅｌ　ａｌ、、　１９８９．　Ｅｕ＋、　Ｊ、１ｍｍｕｎｏ １．１９．１１１　）。 我々はこのセクションの纏めとして、ＣＤ４及びＣＤ８抗体を適切に使用すさば 、皮膚移植のみに関して、抗原の造血源や他の骨髄切除治療を必要とすることな （、Ｍ！ＩＣ及び非ＭＨＣ抗原の相違に対するトレランスの誘導が可能であると 結論したい。皮膚移植片は明らかに、拒絶を導く活性化または許容およびトレラ ンスに導く不活性化のために、末梢Ｔ細胞に対して直接に抗原を提示することが できる。 ラットＩｇ（ｄｘ及びＩｇＧ２ｂ抗体の組合わせによる循環Ｔ細胞に対する影響 上記実験に見られる顕著なトレランス化の観点から、循環ＣＤ４　抗体及びＣＤ ８　抗体のモノクローナル抗体の影響を評価することが重要である。先に、我々 はＣＤ４およびＣＤ８１：対するモノクローナル抗体がその標的Ｔ細胞を破壊す ることを示した（Ｃｏｂｂｏｌｄ　ｓｔ　ａｔ、、　１９８４．　Ｎａ１ｕｒｒ 、　３１２．５４８）　、例１において、ラットＩｇＧ２ａ抗体は、その与えら れた投与量では細胞表面の抗原を調節するだけであった。組合わせプロトコール の場合には、ラットＩｇＧ２ｂ　ＣＤ４及びＣＤ８モノクローナル抗体の初期投 与量によって期待通りＴ細胞数の減少が生じ、次いでＩｇＧ２ａ抗体での治療を 継続する開にＣＤ４＋及びＣＤ８　細胞の比率が実際に回復し始めた（表７）が 、発現された抗原の量は遥かに減少した（データは示していない）。残りの抗体 は投与期間を通してＴ細胞上に存在し、これがＣＤ４　及びＣＤ８＋細胞の詳細 な測定を困難にした。その後、末梢血液中のＴ細胞比率は、抗体治療を停止した 後生なくとも１月間は減少したままであり、ＩｇＧ２ａ抗体が単独で等量与えら れたときには効果は観察されなかった。 非破壊性モノクローナル抗体による移植拒絶抑制の一つのメカニズムは、抗原提 示の間、Ｔ細胞表面のＣＤ４及びＣＤ８アクセサリ−分子の機能のプロツクング を介するものである。 これは、血清抗体が抗体陽性細胞を飽和するに充分なレベルに維持されるときに のみ、最も効果的であろう。治療されたマウスにおける活性抗体のレベルは、３ 週間の治療を通して、また何匹かのマウスでは抗体投与の停止後３週間までは、 実際に標的のＣＤ４及びＣＤ８抗原を飽和するに充分であることが分かった（表 ８）。しかし、６０ロ目までに、検出可能なモノクロナル抗体（＜　０．５Ｂ／ ｍｌのＣＤ４と、＜Ｉｈｇ／ｒｎｆのＣＤ８　）は血清中に残存しなくなったが 、さもなければこれは非特異的免疫抑制を維持することができたであろう。留意 しなければならないことは、どのマウスも、捕獲ＥＬＩＳＡによって測定される ような何等かの検出可能な抗グロブリン（抗種または抗イデオタイブの何れも） を造らず、これは、マウスがこのプロトコールによってラット免疫グロブリンに 対してもトレランスを与えることを示していることである。 我々は、上記のようにして８１０皮膚に対するトレランスを与えられたＣＢＡマ ウスが、１ｎマ目「０において８１０刺激剤である膵臓細胞に応答して、未だ増 殖し得ることを見出だした。 これは、かなりの数の同種反応性Ｔ細胞が破壊されなかったことを示している。 明らかに、移植を受けた動物の免疫系は元の移植片によって提示される抗原に対 してトレランスを賽しているが、未だｉｎ　ｖｉｌｒｏでの膵臓刺激剤細胞また は第二の皮膚移植片による提示に対して反応することができる。 末梢免疫系における無垢のＴ細胞が、移植で生じた抗原（ｇｒａｂ−ｂｏｒｎ　 ｚｎ！１ｇ５ｏｓ　）によってトレランス化されることができると仮定して、我 々は感作されたＴ細胞もトレランス感受性であるか否かを測定した。我々は、二 つの処理プロトコール（ブロッキング単独、または破壊性に続いてブロッキング ）の両方が、被爆したドナー牌臓細胞で前もって感作されたＣＢＡ／Ｃａマウス において、ＡＩＲ／ＩまたはＢＩＯ，ＢＲ皮膚の何れかに対するトレランスの誘 導に効果的であることを見出だした（図１２ａ〜１２ｄ）。これとは対照的に、 先に我々は、破壊性のＣＤ４　及びＣＤ８　は生まれつきのマウスまたは感作さ れたマウスにおいて等しく免疫抑制的ではあるが、全ての移植片が結局は拒絶さ れたように、多重マイナー抗原不適合性の皮膚についてトレランス許容性でない ことを示した（Ｃ。 ｂｂｏｌｄ　ｅｌ　！＋、、１９８６、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、　４ １．６３４）。 図１１の生まれつきのマウスと図１２の感作されたマウスとの間の唯一の相違は 、抗原再投与の後に見られる。ＡＰ：Ｒ／１に対して感作され且つトレランス化 された群の約半分のマウスは、ＢＩＯ，ＢＲ第三パーティ−移植片よりも遅くで はあるが、第−及び第二のＡＫＲ＃移植片の両方を拒絶した（夫々、ＭＳＴ−６ ３日および２１日；図１２ａ）。Ｃ３Ａ上のＢＩＯ，ａｌｌにおいて、殆どのマ ウスは元の移植片を無期限に保持したが、何匹かのマウスでは、第二ＢＩＯ，Ｂ ＲおよびＡＩＲ／Ｊ移植片は徐々に拒絶された（図１２Ｃ）。株の組合わせの挙 動におけるこの相違は、生まれつきのマウスに見られたものと比較することがで き（図１１参照）、おそらくは共通かつ特有のマイナー抗原の複雑なパターンに ある。 皮膚移植片の能動拒絶の際のトレランス誘導感作子細胞ですらトレランス化でき ることの発見は、明らかに臨床的な意味を有している。進行中の免疫応答にもか かわらずトレランスを誘導することは、特に自己免疫において、又は移植の後の 器官拒絶危機（ｏ「ｇａｎ　ｕｊｓｃｌｉｏｎ　ｃｒｉｓｉ＋）の最中に明らか に有利である。図１３において、成る場合には第一および第二の移植片の両方に おいて、多重マイナー抗原不適合性皮膚移植片の進行中の拒絶を逆行させ、長期 間の生存を確立することが実際に可能であることが分かる。この実験において、 非破壊性に続いてプロ・ツク性のものを用いる組合わせが最も効果的である（図 １３８）。しかし、ブロッキング性（非破壊性）の抗体を与えられたマウスの３ ７６もその第二の移植片を保持したように（図１３ｂ）、エフェクターＴ細胞が 不活性化またはトレランス化されることさえ可能であるに違いない。 表Ｉ　Ｌ３Ｔ４形質導入細胞へのＹＴＳ　１７７．９の結合ＹＴＳ　１７７．９ 　及び　１．１ ＹＴＳ　１９１．１ ＹＴＳ　１７７．９　及び　９８．１ ＹＴＡ３．１ ａ　対応するＭｘｂで染色され、且つフローサイトメトリーで分析されたＬ３／ Ｔ４形質導入細胞ラインｂ　Ｍｘｂは、ＦＩＴＣ結合兎抗ラット１ｇの前に、組 織培養上清として用いられた。 Ｃビオチニル化されたＭ！ｂであり、これは下に与えられた過剰量の「冷たいＪ Ｍｘｂと供にインキュベートされた。蛍光はＦＩＴＣ−ストレプトアビジンで発 現された。 １）正常なＣＢＡ／Ｃｌマウスは、皮膚移植の３日前から始めて２週間の間、Ｃ Ｄ４　Ｍｘｂｓを投与された（略７　ｍｇ／マウス）。 ｂ）最後のＭ　ａ　ｂ注射の４日後に採取された末梢血液は、ビオチニル化され たＹＴＡ　３．１（ＣＤ４）、ＹＴＳ　１５６．７（ＣＤ８）およびＹＴＳ１５ ４、７　（Ｔｂｙ−１）で染色され、続いてストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染 色された。その結果はフローサイトメトリーで分析された。 Ｃ）　ＢＩＯ，ＢＲ移植片のＭＳＴ： 非治療対照＝１２日 ＹＴＳ　１９１．１治療＝３２日（ｖ、ｓ、対照：ｐ≦０．００５）ＹＴＳ　１ ７７治療＝２２日（ｖ、５、対照　ｐ≦０．００４゜ｖ、ｓ、　ＹＴＳ　１９１ ．１群ｐ≦０．７）ＢＡＬＢ／ｃ移植片のＭＳＴ二 非治療対照：ｌＯ，５日 ＹＴＳ　１９１．１治療：１９日（ｖ、ｓ対照：ｐ≦０．００６）ＴＴＳ　１７ ７．９治療：２０日（ｖ、１．対照　ｐ≦０．００６゜ｖ、ｓ、　ＹＴＳ　１９ １．１群ｐ≦０．４）表３　：　Ｍｉｓ−１ａ抗原に対するＭｌｓ−１ｂマウス のトレランスは、Ｖβ６＋細胞のアネルギーを伴うユ　フッ２　１１：Ｌ１２　 ５１１３　１２３５０　５９６　１０．２２　４コ９　８９６４　１１７コ　９ Ｂ７９　４６０　１２．１３　９６１　６４９８　１０５０　７７１９　７０３ 　８．７４　１２０３　１２８６６　１１６３　１：１４９６　１０Ｂ２　７． ５５　８５９　１０７８４　７６４　１１２：１０　９７７　７．１３マクχ　 ２７５２９　１７２５］　１０５）Ｏ：Ｌ３２９１　６４２　１０°２や燵　３ Ｂ２６４１００４２　１３９５０　１９０８７　８１５　８．１″り　１５８３ ２８６７９　７２６７１３５６３９７６　９．。 正常なＣＢＡ／Ｃａマウスは、合計量Ａｂｓ量１０ｍｇ／ｖウスのｔｌｇＧ。 ＣＤ４　（ＴＴＳ　１７７．９１およびｔｌｇＧ２．ＣＤ８（ＹＴＳ　１５６． ７）で３週間治療された。２　Ｘ　１０７のＡＩＲ／Ｊ骨髄細胞が注射された。 ４週間後、これらマウスからの膵臓細胞をＭＬＣおよびフローサイトメトリーの ために染色された蛍光において試験した。与えられた数字は、３回の幾何平均で ある。 表４：ＡＴＩ旧ｓ−１ｂマウス　におけるＭｌｓ−１に対するトレランス及びア ネルギー ＡＫＲＢＡＬＢ／（：　Ｍｔｉ−Ｖβ６１　１コ４８　８０８１　６９６　２． ８２　１１４５　１０２コｌ　Ｂ１２　．２．９コ　９９８　７コ１１　９７６ 　コ、７４　１０３９　６５０８　７９３　コ、コＸ４’！ｌ　ｄ　１２４６３ 　１０２８３　７３７４　コ、ａスリ１　１５５７８　８８６４　５８２４　２ ．９ａＡＴＩ　ＣＢＡ／Ｃａ　７ウスに、等量の山Ｇ　２．ＣＤ４　ｍＡｂ　（ ＹＴＳ　１７７．９）および山Ｇ２．ＣＤ８０Ａｂ　（ＹＴＳ　１５６．７）を ２週間注射した（合計量Ａｂ　ｉｉは７　ｍｇ／マウス）。ｍＡｂ治療を開始し た２日後に、２×１０７のＡＫＲ骨髄細胞が注入された。８週間後、これらの膵 臓細胞を例２に記載したようにしてｉｎ　ｙｉｌ＋ｏで刺激した。 ５与えられた数は、個々のマウスの夫々についての１分間当たりカウント（３回 の幾何平均）である。 ｃｍＡｂ　４４−２２−１　（Ｐａｙ＋ｕ　ｅｌ　ａｌ、　１９８８．ＰＮＳＡ 　ＵＳＡ、８５，７６９５）て染色され、フローサイトメトリーで分析された膵 臓Ｖβ６＋細胞。 ｄ対照マウスはｍＡｂ＋のみを注射されたＡＴｘ　ＣＢＡである。 表５：正常リンパ球の移入は、正常マウスにおけるトレランスを破壊しない。 動物　注射された細胞　細胞移入後の 移植片生存 トレラント　ＢｌＯ，ＢＲ牌肺臓胞　〉１００日×４ＣＢＡ　無垢のＣＢＡ牌臓 肺臓　〉１００日×４感作ＣＢＡ牌臓細胞　＋５．、＋７．　ＩＴ、　２１Ｔ− 消耗　無垢のＣＢ＾牌臓肺臓　１２．　＋４．１４．１５された　感作ＣＢＡ牌 臓肺臓　８．８．９．　１０ＴｘＣＢＡ なし　〉１００日×４ ＣＢＡ／Ｃ！？ウスは、図１３ａの凡例に記載したように、Ｂ１１１．　ＢＲ皮 膚に対してトレランス化された。 ａＢＩＯ，ＢＲ皮膚を〉２００日保持しているマウスを選択し、膵臓細胞５　Ｘ 　１０７個を静脈注射した。 ｂＡＴＩ　ＣＢＡマウスは、ＢＩＯ，ＢＲ皮膚を移植される前に少なくとも４週 間、ＣＤ４およびＣＤ８　ｍＡｂｓの注射によりＴ細胞を破壊された。 ０感作された膵臓細胞は、ＢＩＯ，ＢＲ牌肺臓胞を注射され且つＢＩＯ，ＢＲ皮 膚移植片を拒絶したＣＢＡマウスからのものである。 表６：使用されたモノクローナル抗体 ＹＴＳ　１７７．９．６　７？）スＣＤ４　ａ　工”２ａＹＴ５　１０５．１Ｂ 、ｌＯマクスＣＤ８　Ｌｙｔ−２（ｃ）ＸｑＧ２ａ表７　：　ＣＤ４＋ＣＤ８抗 体治療されたマウスに残存するＴ細胞Ｂｏｏ　）レラントａ込 ”！ｔ　ｉ　１服牌月べご１乙のパーちシＹ０　３４±２　１６±１　４７±ｌ 　Ｏ±０　４５　１２±３　１２±５　１３±４　６±１８１２　１Ｂ±４　１ ８±６　１８±５　３±１　３１９　２７±４　２２±３　２６±５　３±３６ ４５　２４±５　１１±２　２８±４　０±０８＊抗ラット１ｇは、ＭＡＲ−１ ８，５−ＦＩＴＣ及びＮ０ＲＩＧ−７，１６−ＦＩＴＣの混合物であった。 全てのマウスは、例２に記載したように、０〜２１日に、う・ン）　１ｇＧ　２ ｂ　ＣＤ４及びＣＤ８に続いて、ラットＩｇＧ、　ＣＤ４及びＣＤ８を受けた。 表８：活性１ｇＣ；、　ＣＤ４及びＣＤ８モノクローナル抗体の血清レベル ＣＤ４　ｍ；（キ九停、　ＣＤ８　血９責才り体（ｎ９／ｍｌ）　（Ｍ／ｍｌ）

【＋匹すイ囚イネマクズ　】　［４二つイ出（峯マう又　］特間 ＤａｙＯ＜０．５　＜０．５　＜０．５　＜０．５　＜１０　＜１０　＜１ｏ　 ＜１゜Ｄａ’ｆ　１２　＞１００　＞１００　＞１００　）４００　＞１００　 Ｌ２Ｑ　１５０　＞１０００Ｄａｙ１９　５０　＞１００　＞ＬＯＯ＞１００　 １９０＞１０００＞１０００＞ＬＯＯＯＤａｙ２９　ｓｏ　＞１ｏｏ　＞１００ 　＞１００　７５　２５０　＞１０００　＞１０００Ｄａｙ３２　８０　９０　 ＞１００　＞１ｏｏ　５００　６００　＞１０００　＞１０００Ｄａｙ３６　５ 　１００　＞１００　＞１００　６０　８５　５００　＞１０００Ｄａｙ４３　 ＜０．５　１５　７ｏ　＞１００　＜１０　＜１０　１２　２５Ｄａｙ４６　＜ ｏ、ｓ　＜０．５　＜ｏ、ｓ　１．０　＜１０　＜ＬＯ＜１０　＜１０Ｄａｙ６ ０　＜Ｏ−５＜０．５　＜０．５　＜０．５　＜１０　＜１０　＜１０　＜１０ Ｄａｙ７Ｂ　＜０．５　＜０．５　＜０．５　＜０．５　＜１０　＜１０　＜１ ０　＜１０モノクローナル抗体治療は、０日目および２日目にう・ント１ｇＧ２ ｂ　ＣＤ４およびＣＤ８を、続いて２１日目まで週３回、う・ントＩｇＧ２ａ　 ＣＤ４およびＣＤ８　（−回の注射当り合計２　＋ｎｔ）行った。 表９：ＢｌＯトレランスを有するＣＢＡマウスから得た末梢血液リンパ球の増殖 ｍ％　ＣＢＡ　ＢＡｆｆＪ／ＣＢ１０ （ｅＰＨ−）　（Ｃｐｍ−）　（ＣｐｍＥｌ−）、（ｔｌ、ＣＢＡ　１４ｐ、ｉ 、　３７０＋２３６　４９５２＋５２３６　２２ｘｏ＋２ｅ、２２ＢＨｏ　Ｂラ ント　ＣＢＡ　７１６＋８００　４９５２＋３４７０　３５９２＋２８７５Ｂ１ ０トレランスを有する個々のＣＢＡ／ＣａマウスまたＧｉ正常な対照は、７８日 目に尾静脈から放血された。 末梢血球の増殖は、例２に記載したようにして測定された。 与えられた数字は、群当り６マウスの対数平均および標準偏差である。 ＹＴＳ　１９１．１処理 ＹＴＳ　１７７．９　ＹＴＳ　１９１．１時間（日） 嶋側（Ｉヨ　） 的廁（１３） 国際調査報告 １ｓｌ−１−１＾・−ｎｕ−−師、　ＰＣＴ／ＧＢ　９０１００８４０

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原に対するトレランスの誘導において、同時に、別途にまたは逐次的に使 用するための組み合わされた製剤として、非破壊性ＣＤ４モノクローナル抗体及 び非破壊性ＣＤ８モノクローナル抗体を含む生成物製品。
2. ２．更に、破壊性ＣＤ４モノクローナル抗体及び／又は破壊性ＣＤ８モノクロー ナル抗体を含む請求項１に記載の生成物製品。
3. ３．手術又は治療により人体又は動物体を処理する方法において使用するための 、非破壊性ＣＤ４モノクローナル抗体。
4. ４．手術又は治療により人体又は動物体を処理する方法において使用するための 、非破壊性ＣＤ８モノクローナル抗体。
5. ５．抗原に対するトレランス誘導における使用のための、請求項３又は４記載の 抗体。
6. ６．抗原に対するトレランス誘導に使用するための薬剤の調製における、非破壊 性ＣＤ４モノクローナル抗体の使用。
7. ７．抗原に対するトレランス誘導に使用するための薬剤の調製における、非破壊 性ＣＤ８モノクローナル抗体の使用。
8. ８．抗原に対するトレランス誘導に使用するための薬剤であって、非破壊性ＣＤ ４モノクローナル抗体及び非破壊性ＣＤ８モノクローナル抗体を含有する薬剤。
9. ９．更に、破壊性ＣＤ４モノクローナル抗体及び／又は破壊性ＣＤ８モノクロー ナル抗体を含有する請求項８記載の薬剤。
10. １０．非破壊性ＣＤ４モノクローナル抗体及び非破壊性ＣＤ８モノクローナル抗 体を別途成分として有するパック。
11. １１．更に破壊性ＣＤ４モノクローナル抗体及び／又は破壊性ＣＤ８モノクロー ナル抗体を別途成分として有する請求項１０記載のパック。
12. １２．手術又は治療により人体又は動物体を処理する方法において、一緒に使用 するための非破壊性ＣＤ４及びＣＤ８モノクローナル抗体。
13. １３．抗原に対するトレランス誘導において、一緒に使用するための請求項１２ 記載の抗体。
14. １４．更に、破壊性ＣＤ４モノクローナル抗体及び／又は破壊性ＣＤ８モノクロ ーナル抗体を包含する請求項１２又は１３記載の抗体。
15. １５．投与が望まれる抗原に対するトレランスを患者に授与する方法であって、 有効量の非破壊性ＣＤ４モノクローナル抗体及び非破壊性ＣＤ８モノクローナル 抗体、並びに有効量の前記抗体を患者に投与することを具備する方法。
16. １６．患者が既に保有する抗原に対するトレランスを、患者に授与する方法であ って、有効量の非破壊性ＣＤ４モノクローナル抗体及び非破壊性ＣＤ８モノクロ ーナル抗体を患者に投与することを包含する方法。
17. １７．更に、非破壊性ＣＤ４及びＣＤ８モノクローナル抗体の投与に先だって、 有効量の破壊性ＣＤ４モノクローナル抗体及び／又は破壊性ＣＤ８モノクローナ ル抗体を患者に投与することを包含する請求項１５又は１６記載の方法。