JPH05252956A - ポリペプチド高発現性組換え細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ｈＴＧＦ−β１に代表されるポリペプチドを
コードしているヌクレオチド配列（１）、ヌクレオチド
配列（１）を増幅し、かつ選択薬剤に対する耐性能を哺
乳動物細胞に付与するヌクレオチド配列（２）、並びに
これらヌクレオチド配列（１）及び（２）の発現を調節
するヌクレオチド配列（３）を有するベクターを、哺乳
動物細胞に導入し、得られた組換え細胞群より、単一細
胞由来の組換え細胞として分離し、これを選択薬剤に対
する耐性能を示標として高発現株を選択する方法、並び
にこの方法を利用してｈＴＧＦ−β１に代表されるＴＧ
Ｆ−βを製造する方法。 【効果】 有用ポリペプチドの高産生細胞の製造方法を
確立し、更に該製造方法により新規なｈＴＧＦ−β１産
生細胞株２９Ｅ６−２が得られ、更に該細胞により均質
なｈＴＧＦ−β１の大量製造が可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬等として有用なポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するベク
ターを哺乳動物細胞に導入して得られた組換え細胞群よ
り、目的ポリペプチドを高度に発現する組換え細胞株を
選択する方法、及びこの方法を利用してヒトトランスフ
ォーミング成長因子β１（ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β１；以下
「ｈＴＧＦ−β１」と略す）に代表されるトランスフォ
ーミング成長因子β（以下「ＴＧＦ−β」と略す）を高
度に発現する組換え細胞株を選択し、選ばれた組換え細
胞株を用いてＴＧＦ−βを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年多種類の有用ポリペプチドが、該ポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を各種の形質
転換法により細菌等に導入させ、その形質転換された細
菌等を用いて該細菌内あるいは培養上清中に発現・産生
させ、これを精製することにより製造されている。特に
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は生化学
的に最もよく研究されている細菌であることから、既に
インシュリンや成長ホルモンなどの量産化に用いられ成
功している。しかし、多くの有用ポリペプチドは糖鎖の
付加、アミド化、リン酸化などの修飾を受けており、こ
れらの修飾が、その生物活性の発現、体内寿命、そして
輸送のための血漿蛋白質との結合増強に必要であった
り、生体内での物性、安定性、溶解性に関与しているこ
とが多い。しかし細菌はポリペプチドを修飾する機能の
多くを欠いているため、これらを宿主としてポリペプチ
ドの組換え生産を企てても天然型と同一の修飾を受けた
ポリペプチドを得られないことが多い。一方、細菌に生
産させたこれらポリペプチドはその活性に修飾の有無が
関与しない場合でもそのままでは活性を示さないことが
多い。これはポリペプチドの立体構造が天然の物と異な
るからであり、活性を回復させるためにはポリペプチド
の再構成が必要となる。しかし多数のＳ−Ｓ結合あるい
は複数のサブユニット構造を有するポリペプチドの再構
成は困難で、この様な複雑な立体構造のポリペプチドを
生産させる目的には大腸菌などの細菌は宿主として不適
切である。更に大腸菌を宿主として生産したポリペプチ
ドには大腸菌由来の発熱性物質（パイロジェン）の混入
が心配され、その除去が医薬品生産の上では問題とされ
ている。

【０００３】これらのことにより、糖鎖付加などの修飾
を受けたあるいは複雑な高次構造を有する哺乳動物由来
のポリペプチド（以下目的ポリペプチドという）の産生
においては微生物を宿主とする方法は非常に不利であ
り、本来、該ポリペプチドを生産し得る能力を有する細
胞、もしくはそれに近い哺乳動物細胞を宿主とすること
が有利である。

【０００４】しかし、哺乳動物細胞を宿主に用いて目的
ポリペプチドを生産させる場合、細菌において用いられ
ているようなプラスミドベクターが利用できないので、
以下に示す２通りの方法が行なわれている。１つは組換
えウイルス等をベクターに用いて目的ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列のコピー数を一時的に宿主細
胞内で上昇させ、短期間に大量の目的ポリペプチドを発
現させる方法、もう１つは宿主細胞の染色体ＤＮＡに目
的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入さ
せて、安定に目的ポリペプチドを発現させる方法であ
る。

【０００５】前者の方法としてＳＶ４０やアデノウイル
スの組換えウイルスを用いる方法がある。これらウイル
スベクターは動物細胞に感染した後、著しく増幅がおこ
り、高いコピー数が得られ、一時的に多量の目的ポリペ
プチドが生産されるが、その結果宿主細胞は死滅する。
又ＳＶ４０の複製開始点を含むベクター（例えばＰ９１
０２３Ｂ，ＣＤＭ８等）はＳＶ４０のＴ抗原を構成的に
発現しているサルＣＯＳ細胞に導入されると多量に増幅
するがこれも同様に細胞を死滅させる。この様に一時的
にベクターのコピー数を増加させ、目的ポリペプチドを
発現させる方法は、導入したベクターから発現するポリ
ペプチドに関する研究を行なう上では有利であるが、医
薬品原体等として目的ポリペプチドを継続的に量産する
ための手段としては不利である。またウシパピローマウ
イルス（ＢＰＶ）やＢＫウイルスのベクターを用いる方
法では、これらのベクターは導入細胞において染色体に
組込まれずに存在し、かつ細胞も死滅させないので比較
的安定した形質転換細胞を得ることができる。しかしこ
れらのベクターは一般に不安定であり、コピー数は保持
されているにもかかわらず転写が行なわれなかったり、
複製しているベクターに一部欠損したものが見られるの
で、安定に目的ポリペプチドを得るための手段としては
不利である。

【０００６】このような理由により、目的ポリペプチド
をコードしたヌクレオチド配列が染色体に保持される組
込み型ベクターを用いるという後者の方法が、安定に目
的ポリペプチドを得るには好ましい。例えばレトロウイ
ルスはＲＮＡゲノムを持つが、その複製途中でゲノム
は、ＤＮＡに逆転写され、このプロウイルスＤＮＡが宿
主細胞を殺さずに増殖し、その過程で染色体に保持され
ることが知られている。このことを利用し、レトロウイ
ルスのプロウイルスＤＮＡの複製に要する領域を含むＤ
ＮＡをベクターとし、この一部を目的ポリペプチドをコ
ードしたヌクレオチド配列に置換することで目的ポリペ
プチド産生のための発現ベクターを得ることができる。

【０００７】しかしながら単に目的ポリペプチドをコー
ドしたヌクレオチド配列を染色体に保持させてもその発
現量はきわめて低い。例えば目的ポリペプチドの一つで
あるｈＴＧＦ−β１を発現させるため、ｈＴＧＦ−β１
ｃＤＮＡを、アデノウイルスにより形質転換されたヒ
ト胎児腎臓由来 ２９３細胞に導入した場合、ｈＴＧＦ
−β１の発現量は大半が１ng／ml以下であった。一方、
ジヒドロ葉酸リダクターゼ（以下ＤＨＦＲという）など
のある種の遺伝子は、一定の条件下で染色体ＤＮＡ上で
そのコピー数が増幅されることが知られている。従って
目的ポリペプチドの発現量を増大させるため、遺伝子増
幅可能な遺伝子（以下増幅遺伝子という）と目的ポリペ
プチドをコードしたヌクレオチド配列を一つのベクター
上に共存させ、これらが宿主ＤＮＡに挿入できるベクタ
ーを用いることが好ましい。事実、既にＤＨＦＲやアデ
ノシンデアミナーゼ〔Ｋａｎｔｍａｎ ＲＪ：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３ ３１
３６（１９８６）〕またはグルタミン合成酵素〔Ｈａｙ
ｗａｒｄ ＢＥ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１４ ９９９（１９８６）〕等をコードするヌクレ
オチド配列を増幅遺伝子として用いることにより、イン
ターロイキン２（ＩＬ−２）等の製造が可能になってい
る。

【０００８】一方、ＴＧＦ−βは分子量２５，０００の
ホモダイマー型のポリペプチドであり、種々の細胞増
殖、分化を制御する生理的に極めて重要な作用を有する
因子である。このことから創傷治癒、骨折、炎症、自己
免疫疾患、ガンなどに対する治療薬としてＴＧＦ−βの
応用開発が期待されている。ＴＧＦ−βは正常な動物の
腎臓、胎盤及び血小板に存在することが知られている
が、その存在量は極めて微量であって、ＴＧＦ−βを安
定にかつ大量に取得することは不可能であった。このＴ
ＧＦ−βのうち、ｈＴＧＦ−β１の前駆体をコードする
ｃＤＮＡが１９８５年デリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ）らに
よりヒト胎盤よりクローニングされた〔Ｎａｔｕｒｅ，
３１６ ７０１（１９８５）〕。この発表によればｈＴ
ＧＦ−β１モノマーは１１２個のアミノ酸よりなるポリ
ペプチドで９個のシステイン残基を有する比較的小型の
ポリペプチドである。そしてこれらシステイン残基間の
架橋により複雑な立体構造を形成することによりｈＴＧ
Ｆ−β１はその生物活性を発揮する。

【０００９】このｈＴＧＦ−β１に代表されるＴＧＦ−
βについて遺伝子組換え技術による製造が企てられ、現
在までに前記のように、目的ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含むベクターを宿主染色体に挿入さ
せ、更にＤＨＦＲなどの増幅遺伝子を用いた遺伝子増幅
法を用いることにより、哺乳動物細胞を宿主とした遺伝
子組換え法での製造が試みられている。特開平１−２５
７４９７号においてはサル（ｓｉｍｉａｎ）ＴＧＦ−β
１の前駆体をコードするｃＤＮＡを用いて生物学的に活
性のある成熟型のＴＧＦ−β１が２８μｇ／１０⁷ ｃｅ
ｌｌｓ／２４ｈｒの割合で産生されている。そして、ゴ
パール（Ｇｏｐａｌ）らは２９３細胞を用い、ｈＴＧＦ
−β１をコードするヌクレオチド配列及び増幅遺伝子等
を有するベクターを用いてｈＴＧＦ−β１の製造を試み
ている。しかしそのｈＴＧＦ−β１の発現量は１０μｇ
／１０⁷ ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒにすぎず、これら報告さ
れたＴＧＦ−βの生産量は、いずれも実用レベルの製造
としては不十分なものであった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】前記のように哺乳動物
細胞を用いた目的ポリペプチドをコードしたヌクレオチ
ド配列配列を持つベクターにより形質転換された発現細
胞を得る際において、得られた形質導入細胞が多量の目
的ポリペプチドを生産し得る場合には特に問題とならな
いが、ＴＧＦ−βのように発現量が低く、実用レベルの
製造が困難な場合に、いかにその発現量を高めるかとい
うのは重大な課題である。

【００１１】そして、目的ポリペプチドの発現量を高め
るための手段としていくつかの方法が考えられる。すな
わち、目的ポリペプチドの発現量を規定するひとつの大
きなファクターは、プロモーター、エンハンサーなどの
発現制御因子であるが、これらについては既に多くの研
究がされており、現在用いられている発現制御因子はい
ずれもすぐれたもので、その改良はあまり期待できな
い。また、用いる宿主細胞の種類、培地あるいは培養方
法の組合せにより、目的ポリペプチドの発現量が大きく
変化する場合があるが、これらの組合せは目的ポリペプ
チドあるいは用いた宿主細胞の個々の性質に依存して個
別に決められるべきものであり，試行錯誤を行なわざる
を得ないので、一般的な方法論としては成立しない。一
方、遺伝子増幅法においては、増幅遺伝子を増幅させる
ため順次選択薬剤の濃度を高めて形質導入細胞を培養
し、より高い薬剤耐性を有する細胞を選択することによ
り目的ポリペプチドの高発現株が得られるが、その際、
細胞の薬剤耐性を上昇させる程目的ポリペプチドの発現
量が高まるという訳ではなく、必ず限界がある。

【００１２】このように組換え哺乳動物細胞より、目的
ポリペプチドを高度に発現し得る組換え細胞の選択手段
は、未だ充分満足すべきレベルに達していなかった。ま
た、当該選択手段がないためＴＧＦ−β等の低発現性の
ポリペプチドの工業的生産はできないのが現状であっ
た。

【００１３】従って、本発明の目的は、哺乳動物細胞を
宿主として、遺伝的に安定で均一であり、かつポリペプ
チド高発現性の組換え細胞株の選択方法を提供すること
にある。さらに、本発明の他の目的は、哺乳動物細胞を
宿主とした組換えＤＮＡ手法によるＴＧＦ−β、特にｈ
ＴＧＦ−β１の大量製造法を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは従
来の組換え細胞株の選択手段につき、種々検討してきた
結果、それらの方法論には次のような大きな欠陥がある
ことを見出した。すなわち、目的ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列を含むベクターが最初に宿主染色
体ＤＮＡに挿入される時、その挿入位置は、巨大な染色
体ＤＮＡ上の任意のある１点であり、その結果生じた形
質導入細胞は１つ１つが異なる細胞であるにもかかわら
ず、それら形質導入細胞を個としてとらえることなく群
としてしか見ていない点である。これは細菌におけるプ
ラスミドベクターのように形質転換細胞に導入されたす
べてのベクターが外来遺伝子として均一にふるまうのと
は対称的である。このように個として別々の特徴をもつ
組換え細胞を群として処理したために生じる問題とし
て、形質転換当初はわずか存在したかも知れない高い発
現能をもった組換え細胞が遺伝子増幅法による選択の過
程で淘汰され消失する可能性が考えられる。

【００１５】選択過程での淘汰が生じる原因としては、
次の１）〜４）のような事項が考えられる。 １）ある形質導入細胞が目的ポリペプチド及び薬剤耐性
能を付与する酵素等の遺伝子産物を多量に生産した場
合、該細胞の増殖に用いられるべき細胞活動のエネルギ
ーがこれらの遺伝子産物の生産に優先的に使用され、該
細胞の増殖速度は他の形質導入細胞に比べ遅くなる。そ
の結果、隣接した組換え細胞同志の増殖速度の違いが、
細胞分裂を繰り返すたびに逐次拡大され、最後には発現
能が高く、増殖能の劣る細胞が排除される可能性があ
る。例えば、動物細胞が直径約１mmのコロニー（約１０
³ cell）を形成するまでに、計算上約１０回の細胞分裂
が必要である。そして、形質導入された最初の細胞が隣
接して存在し、かつ一方の組換え細胞株に対して他方の
組換え細胞株の増殖速度が２０％程度遅い場合、これら
の細胞が１mmのコロニーを形成した時、このコロニー中
の細胞の約９０％が前者の細胞であり、後者の細胞は約
１０％以下である。このような混合細胞株を繰返し培養
すると、後者の細胞が淘汰されついには消失すると考え
られる。更に、動物細胞が付着細胞である場合は、前記
のように隣接し、かつ増殖速度に差があれば、後者の細
胞の回りを前者の細胞が取り囲むこととなり、後者の細
胞は増殖が妨げられ前記の計算に比べ、より少ない細胞
数になると考えられる。

【００１６】２）遺伝子増幅法は増幅遺伝子と目的ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列が同様に増幅す
るという仮定に基づいているが、この仮定が正しいか否
かは不明である。つまり細胞集団の中には増幅遺伝子だ
けが選択的に増幅するものが存在するという可能性は十
分考えられ、このような細胞は選択薬剤存在下では他の
細胞に比べ、目的ポリペプチド産生のためのエネルギー
ロスがないので有利に増殖できる。従って、目的ポリペ
プチドの産生能の低い組換え細胞が選択的に生き残るこ
ととなる。

【００１７】３）目的ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列が構造上不安定な場合、あるいは目的ポリペ
プチドを産生することが宿主細胞の生存に不利である場
合には、増幅遺伝子の増幅時に目的ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列が脱落する可能性があり、脱落
した細胞は有利に増殖できる。このことから２）と同様
に目的ポリペプチドの産生能の低い組換え細胞が選択的
に生き残ることとなる。

【００１８】４）増幅遺伝子の発現には好ましいが、目
的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現に
好ましくない宿主染色体ＤＮＡ上の位置にベクターが挿
入された場合、この組換え細胞株は高い薬剤耐性を獲得
するが、目的ポリペプチドの生産能は低いため、好まし
くない細胞が有利に増殖することになる。逆に増幅遺伝
子の発現には好ましくないが、目的ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列の発現に好ましい位置に挿入さ
れた場合、目的ポリペプチドの生産能は高いが、薬剤耐
性能は低くなり、この望ましい細胞は選択薬剤の濃度を
高めることにより容易に淘汰されてしまう。

【００１９】本来ヘテロであって個としてとらえるべき
細胞を群として扱い、遺伝子増幅法による選択を行なう
場合には、以上述べたような理由で、その群の中の最も
すぐれた目的ポリペプチドの産生細胞が淘汰されること
から、結果的に十分に高い発現能を有する細胞を得るこ
とが困難になるのだと考えられる。そこで、本発明者ら
は、前記の問題を解決すべく、形質導入された哺乳動物
細胞を群ではなく、個としてとらえる観点から研究を行
なった結果、本発明を完成するに至った。

【００２０】すなわち、本発明は、ポリペプチドをコー
ドしているヌクレオチド配列（１）、ヌクレオチド配列
（１）を増幅し、かつ選択薬剤に対する耐性能を哺乳動
物細胞に付与するヌクレオチド配列（２）、並びにこれ
らヌクレオチド配列（１）及び（２）の発現を調節する
ヌクレオチド配列（３）を有するベクターを、哺乳動物
細胞に導入し、得られた組換え細胞群より選択薬剤を用
いてポリペプチド高発現性組換え細胞を選択する場合に
おいて、（ａ）当該組換え細胞群より選択薬剤に対する
薬剤耐性を有する組換え細胞を、各単一細胞由来の組換
え細胞として分離し、（ｂ）当該単一細胞由来の組換え
細胞についてポリペプチドの発現性を定量的に確認し、
ポリペプチド高発現性候補組換え細胞として選択した
後、（ｃ）当該高発現性候補組換え細胞を、段階的に選
択薬剤濃度を高くした培地中で培養することにより、ポ
リペプチド高発現性組換え細胞を選択することを特徴と
するポリペプチド高発現性組換え細胞の製造方法を提供
するものである。

【００２１】また、本発明は上記選択方法により得られ
たＴＧＦ−β高発現性組換え細胞を培養し、当該培養液
よりＴＧＦ−βを採取することを特徴とするＴＧＦ−β
の製造方法を提供するものである。

【００２２】本発明方法により高度に発現されるポリペ
プチドとしては、哺乳動物細胞を宿主として使用した場
合に活性型が産生されるポリペプチドであれば特に制限
されない。大腸菌等の微生物を宿主として用いた場合に
は活性型が産生されず、活性発現に糖鎖の付加、アミド
化、リン酸化等の修飾が必要なポリペプチドや、複雑な
高次構造を有するポリペプチドが好ましい。具体例とし
ては、組織プラスミノーゲン活性化因子、エリスロポエ
チン、インターロイキン類、インヒビン、ＴＧＦ−β等
の成長因子、アクチビン、プロレラキシン、スーパーオ
キサイドディスムターゼ、ウイルス抗原等が挙げられ
る。これらのポリペプチドをコードしているヌクレオチ
ド配列（１）は、これらのポリペプチドの活性型アミノ
酸配列をコードするヌクレオチド配列であれば特に制限
されない。

【００２３】ヌクレオチド配列（１）を増幅し、かつ選
択薬剤に対する耐性能を哺乳動物細胞に付与するヌクレ
オチド配列（２）は、哺乳動物細胞を宿主として目的ポ
リペプチドを産生させる場合に、該ヌクレオチド配列と
隣接させて細胞に導入した目的ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列のコピー数を増加させることができ
るものであればなんら限定されない。例えばＤＨＦＲを
コードするヌクレオチド配列はその阻害剤である葉酸の
アナログ体であるメトトレキセート（以下ＭＴＸとい
う）により増幅されることが知られている。そのほかに
もアデノシンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配
列はデオキシコホルマイシンで、アスパラギン酸トラン
スカルバミラーゼをコードするヌクレオチド配列はＮ−
（フォスフォセチル）−Ｌ−アスパルテートにより、グ
ルタミンシンセターゼをコードするヌクレオチド配列は
メチオニンスルホキシミンで、メタロチオネイン−Ｉを
コードするヌクレオチド配列はＣａ²⁺のような重金属の
作用で、多薬剤耐性因子をコードするヌクレオチド配列
はアドレアマイシンの作用で細胞内でそれぞれ増幅する
ことが知られているので、これらのヌクレオチド配列を
用いるのが好ましい。

【００２４】また、ヌクレオチド配列（１）及び（２）
の発現を調節するヌクレオチド配列（３）は、コントロ
ール領域、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグ
ナル、転写終止部位、非翻訳部位等を有することが好ま
しい。これらの配列（３）は、ベクター中にヌクレオチ
ド配列（１）及び（２）とともに、適当な順序で組み込
まれていることが望ましい。

【００２５】コントロール領域は、転写または翻訳のい
ずれかのコントロールに関係する真核性遺伝子の５′ま
たは３′非コード領域の特異な配列である。実際、ほと
んどの真核性遺伝子は転写開始部位から約２５−３０塩
基上流に、特徴的なＡＴに富んだ配列を有する。そし
て、大多数の真核性遺伝子の３′末端にはＡＡＴＡＡＡ
配列があり、これは転写されたｍＲＮＡの３′末端にポ
リＡ鎖を付加するためのシグナルである。

【００２６】哺乳動物細胞内でベクターからの転写をコ
ントロールするプロモーターは、例えばポリオーマウイ
ルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイ
ルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはサイ
トロメガロウイルス等のウイルス由来のゲノム、または
ベーターアクチンプロモーターの如きへテロローガスな
哺乳類起源等の様々な供給源から得られる。ＳＶ４０ウ
イルスの早期及び後期プロモーターはＳＶ４０ウイルス
の複製開始領域をも含有している。もちろん本発明にお
いては、宿主細胞またはその近縁種から得られるプロモ
ーターも使用し得ることは当然である。プロモーターは
発現されるべきヌクレオチド配列、例えば選択薬剤に対
する耐性能を宿主細胞に付与するヌクレオチド配列と連
結されるものであり、プロモーターの連結の方向性及び
該ヌクレオチド配列との距離は適宜決定しうる。

【００２７】エンハンサーは必要に応じてベクターに挿
入される。エンハンサーは通常約１０−３００ｂｐのｃ
ｉｓ作用をするヌクレオチド配列であって、プロモータ
ーに作用し、その転写を増大する要素である。真核細胞
による目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
の転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入すること
により増強される。エンハンサーは、比較的方向性や位
置に非依存性であり、転写単位の５′側〔レイミンスら
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
８ ９９３（１９８１）〕及び３′側〔ラスキー Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３ １１０８（１９８
３）〕、またはイントロンの中〔バネルジーＣｅｌｌ
１３３ ７２９（１９８３）〕にまたは構造遺伝子の中
〔オズボーン Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４ １２
９３（１９８４）〕に見出されている。今日、哺乳類遺
伝子由来の多くのエンハンサーが知られている（グロビ
ン、エラスターゼ、アルブミン、アルファーフェトプロ
テイン及びインシュリン）。しかしながら、一般に真核
細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。例えば
ＳＶ４０の複製開始領域の後期部位に存在するエンハン
サー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターのエン
ハンサー、ポリオーマウイルスの複製開始領域の後期部
位に存在するエンハンサー、並びにアデノウイルスのエ
ンハンサー等が挙げられる。

【００２８】挿入された目的ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列の翻訳のためには、翻訳開始シグナル
も必要である。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドン及
び隣接配列が含まれる。目的ポリペプチドがそれ自身の
開始コドンを含んだ形でベクター内に導入されている場
合は、更なる翻訳開始シグナルを必要としない。更に、
ベクターには転写終止部位、非翻訳部位等を有する。

【００２９】これらの配列（１）、（２）及び（３）を
有するベクターの構築は、常法に従って行なわれる。ま
た、ベクターは大腸菌において複製可能なものが、ベク
ターを調製する場合に好都合である。

【００３０】また、目的ポリペプチドの修飾（例えば糖
鎖付加）及びプロセッシングは目的ポリペプチドの機能
にとって重要である。目的ポリペプチドの翻訳後のプロ
セッシング及び修飾については、各々の宿主細胞は特徴
的かつ特異的な機構を有しているので、適切な細胞系ま
たは宿主系を選択する必要がある。

【００３１】本発明において使用される哺乳動物細胞
は、宿主としてベクターを導入しうる細胞であればなん
ら制限されるものではない。しかしながら目的ポリペプ
チドと同じ種類起源の動物細胞である方が、目的ポリペ
プチドの高次構造を維持する場合に有利であり、特にヒ
ト由来ポリペプチドの場合ヒト由来細胞の方がより良好
な結果を得やすい。

【００３２】宿主細胞は、通常不死化されている、即ち
安定化された細胞系統を用いるのが好ましい。適当な宿
主細胞としては、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎ＣＶ
Ｉ系統、ヒト胎児性腎細胞系統、ベビーハムスター腎細
胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サル腎細胞、ア
フリカミドリザル腎細胞、ヒト顎部ガン細胞、イヌ腎細
胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細
胞、マウス乳がん細胞、ラット肝がん細胞、ＴＲ−１細
胞などが挙げられる。

【００３３】そして宿主−ベクター系としては、既に当
業者によく知られた多くの哺乳動物宿主／発現ベクター
系（即ち適切な宿主細胞中に目的ポリペプチドをコード
したＤＮＡの複製、転写及び翻訳を指示するための、発
現を調節するヌクレオチド配列群を有するベクター）を
使用し得る。これには前記した哺乳動物細胞及びベクタ
ーには限定されないが、系としては、ウイルス発現ベク
ター／哺乳動物の宿主細胞系、または哺乳動物細胞のゲ
ノムから誘導された非ウイルス系プロモーター発現系ベ
クター／哺乳動物の宿主細胞（例えばマウスのメタロチ
オネイン・プロモーター）等がある。

【００３４】本発明において哺乳動物細胞へのベクター
の導入方法としては、特に制限されないが、例えばカル
シウム−リン酸法、電気穿孔法、微注入法、リボゾーム
融合法、プロトプラスト融合法等がある。これらの方法
により、ベクターを導入した後、各種ベクター由来の機
能が発現したならば該ベクターが哺乳動物細胞に導入さ
れたと考えることができる。

【００３５】上記の如くして得られた組換え細胞群より
選択薬剤を用いてポリペプチド高発現性組換え細胞を選
択するには、次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の操作を行
なう。 （ａ）当該組換え細胞群より選択薬剤に対する薬剤耐性
を有する組換え細胞を、各単一細胞由来の組換え細胞と
して分離する。 （ｂ）当該単一細胞由来の組換え細胞についてポリペプ
チドの発現性を定量的に確認し、ポリペプチド高発現性
候補組換え細胞を選択する。 （ｃ）当該高発現性候補組換え細胞を、段階的に選択薬
剤濃度を高くした培地中で培養することにより、ポリペ
プチド高発現性組換え細胞を選択する。

【００３６】操作（ａ）の実施に先立って、予備試験と
して宿主である哺乳動物細胞の選択薬剤に対する致死濃
度を求めた上で、前記選択薬剤致死濃度に基づき、ベク
ターを導入処理した哺乳動物細胞つまり形質導入細胞を
選択し、ベクターが導入される効率、すなわち形質導入
率を求めておく。ここで、宿主である哺乳動物細胞の薬
剤致死濃度は、従来より公知の方法によって求められ
る。又この場合の「薬剤致死濃度」は、操作（ｃ）に記
載した遺伝子増幅の対象とする遺伝子に基づいて発現す
る薬剤耐性に係る薬剤によって、宿主細胞が死滅する濃
度を意味する。目的ポリペプチドがｈＴＧＦ−β１の場
合には、宿主であるヒト由来細胞について、遺伝子増幅
作用をもつヌクレオチド配列として例えばＤＨＦＲをコ
ードするヌクレオチド配列を用い、ＤＨＦＲの拮抗阻害
剤であるＭＴＸを選択薬剤として用い、該細胞のＭＴＸ
による致死濃度を求めればよい。そして形質導入率はベ
クターの導入により発現する薬剤耐性能を有する細胞数
の、ベクターの導入処理に供した細胞数に対する割合に
より求められる。これも従来より公知の方法により求め
られる。

【００３７】操作（ａ）は、宿主哺乳動物細胞にベクタ
ーを導入する処理をし、前記形質導入率より計算して、
培養器に生じる個々の単一細胞由来コロニーを充分に分
離しえる密度にまで希釈した細胞を、選択薬剤を含有す
る培地に接種し、コロニーが分離できる大きさになるま
で培養することにより行なわれる。通常の培養器を用い
ると隣接したコロニー同志が混じり合うことが多いの
で、培養器底面が多数の壁面で仕切られたものを用いる
のが好ましい。例えば、７００個のセルを有するハイブ
リドーマディッシュを用いることができるが、多数のセ
ルを有する動物細胞培養プレートも用いうる。その際、
単一細胞由来のコロニーが１セル中に１個出現する細胞
密度に細胞懸濁液を調製して培養すればよい。そして培
養においては、初め形質導入処理による損傷を回復させ
るため、選択薬剤が添加されていない培地で培養後、次
いで選択薬剤を含む培地に交換して培養するのが好まし
い。そしてその培養条件は宿主細胞が増殖できる条件で
行なえば良い。例えばウシ血清添加ＲＰＭＩ１６４０培
地、ウシ血清添加イーグル培地、無血清培地等を用いて
培養することにより行なわれる。

【００３８】次に操作（ｂ）は、（ａ）で得られた単一
細胞由来の組換え細胞について、目的ポリペプチド産生
量を定量することにより、行なわれる。目的ポリペプチ
ドがｈＴＧＦ−β１である場合には、ミンク肺上皮細胞
ＭｖｌＬｕ（以下ＣＣＬ−６４細胞とする）の成長阻止
活性を簡易的に測定して求めるのが好ましい。この簡易
的測定方法の開発が多数の組換え細胞を短時間で処理す
ることを可能にした。従来よりニュートラルレッドは損
傷を受けていない細胞数に比例して取り込まれること、
そしてリン酸１ナトリウムを含むエタノール溶液で、取
り込まれたニートラルレッドが抽出され、その抽出液の
吸光度を５４０nmで測定することより、ニュートラルレ
ッドの量、即ち生細胞数を求められることが知られてい
る〔Ｂａｂｉｃｈ：Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７９ ５
９２（１９９０）〕。そこでこの特徴を生かし、ＣＣＬ
−６４細胞の懸濁液に対し組換え細胞の培養上清または
対照としての血小板由来ｈＴＧＦ−β１を含む溶液を添
加し、培養後ニュートラルレッド溶液にて染色し、分光
光度計にて吸光度を測定する。そしてＣＣＬ−６４の生
細胞数を求め、既知量の血小板由来ｈＴＧＦ−β１を加
えた時のＣＣＬ−６４の生細胞数と比較して組換え細胞
の培養上清中のｈＴＧＦ−β１量を求める。そして、ポ
リペプチドの産生量の多い細胞群をポリペプチド高発現
性候補組換え細胞とする。

【００３９】操作（ｃ）は、操作（ｂ）で得られた高発
現性候補組換え細胞を遺伝子増幅処理に付すことによ
り、目的とする高発現性組換え細胞を選択する工程であ
る。遺伝子増幅処理は、操作（ａ）で用いた薬剤濃度よ
り高い濃度の選択薬剤を含有する培地で培養し、生き残
った細胞より、目的ポリペプチド高発現性の細胞を選択
すればよい。つまり、培地中の選択薬剤の濃度を高める
と多くの細胞は死滅するが、一部の細胞は薬剤耐性にか
かわるヌクレオチド配列のコピー数を増すことにより生
き残る。その時薬剤耐性にかかわるヌクレオチド配列に
隣接しているヌクレオチド配列のコピー数も同時に高め
られる。これは該薬剤耐性にかかわるヌクレオチド配列
に隣接している目的ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列のコピー数が増幅され、結果として目的ポリペ
プチドの生産能が上昇することを意味する。この時も
（ｂ）の操作と同様に目的ポリペプチドの発現量を定量
することにより、発現能の上昇を確認することができ
る。

【００４０】目的ポリペプチドがｈＴＧＦ−β１である
場合、この操作（ｃ）に供された組換え細胞は９細胞で
ある（第３次スクリーニング）。この９細胞について各
濃度の選択薬剤に対する耐性を示し、増殖してきた細胞
についてｈＴＧＦ−β１の発現量を測定した。その結
果、各単一細胞由来の組換え細胞のＭＴＸ耐性能及びｈ
ＴＧＦ−β１の発現量を見ると、各細胞ごとに大きな差
があるだけでなく、同一レベルの薬剤耐性を示す細胞に
ついても目的ポリペプチドの発現量が異なることが明ら
かである。そして従来のＭＴＸを用いた選択方法により
選択された形質導入株であり、実施例において陽性対照
として用いている２９ＡｌのＭＴＸ耐性能が５μＭ、そ
してｈＴＧＦ−β１の発現量は約１mg／ｌに比しても本
発明の高発現株の分離方法を用いた場合、同じ５μＭの
耐性能で２９Ａｌより高い発現能を示したものが３株あ
った。又、これと同等の発現能を示す株のうち更に高い
薬剤耐性能を獲得したものも分離できた。更に最高の薬
剤耐性能である１５０μＭのＭＴＸに耐性を示した細胞
株のうち１株は、陽性対照の６倍の目的ポリペプチドの
発現能を獲得した。

【００４１】本発明により得られる高発現性組換え細胞
を培養し、当該培養液より目的ポリペプチドを採取すれ
ば、目的ポリペプチドが効率良く、大量に生産される。

【００４２】本発明により得られる組換え細胞株の培養
方法としては、公知の方法を用いれば良い。培地として
は組換え細胞が増殖できるものであれば良く、例えばウ
シ血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地、ウシ血清添加イーグ
ル培地、無血清培地等を用いて培養することで培養物が
得られる。得られた培養物を常法に従い遠心分離、膜濾
過等の操作に付すことによって目的とするポリペプチ
ド、例えばｈＴＧＦ−β１を含む培養上清を分離取得す
ることができる。ここで、培養上清を分離取得するの
は、ｈＴＧＦ−β１の場合は、ｈＴＧＦ−β１前駆体が
シグナル配列を有する分泌タンパクであることから、組
換え細胞より生産されるｈＴＧＦ−β１もまた培地中へ
分泌されるという考えに基づいている。

【００４３】かくして得られる培養上清からのｈＴＧＦ
−β１に代表されるＴＧＦ−βを含む粗標品の製造は、
従来より知られている各種操作を適宜組合せることによ
り実施できる。その操作としては、例えば硫安塩析等の
蛋白沈澱剤を用いる処理、遠心分離、透析、限外濾過、
濃縮等を例示できる。

【００４４】また上記粗標品の精製操作も、公知の各種
方法、例えばゲル濾過、液体クロマトグラフィー、電気
泳動、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフ
ォーカシング、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、これらの組合せ等に
より行なうことができる。より詳しくは、例えば、ＴＳ
ＫゲルＳＰ−トヨパール ６５０Ｍ（トーソー社製）等
を用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、ＨＡ
−１０００（トーソー社製）等を用いるハイドロキシア
パタイトクロマトグラフィー、バイダックプロテインＣ
４カラム（Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕ
ｐ社製）等を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー等
により精製することができる。またＳＤＳ−ＰＡＧＥ
は、レムリの方法〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ ２２７ ６８０（１９７０）〕等に従い実施で
きる。

【００４５】なお、ＴＧＦ−βは、前記の如く、１０％
（ｖ／ｖ）の牛胎仔血清を含有するダルベッコの改変イ
ーグル培地中に維持されたミンク肺上皮細胞を用いるこ
とにより、測定することができる。より詳しくは、０．
０５％（ｗ／ｖ）トリプシン及びカルシウム及びマグネ
シウムを含まない０．１％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡのリン
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加することにより、組
織培養プレートから上記細胞を遊離させ、得られる細胞
（約５×１０⁴ 細胞／ml）０．５mlを２４ウエル組織培
養プレートに接種する。この時点で、血小板由来標準ｈ
ＴＧＦ−β１及びアッセイされるべき未知の試料を加え
る。３７℃にて５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下で、２４
時間培養した後、０．０１ｍＣｉ／mlの³ Ｈ−チミジ
ン、比活性＝６．７Ｃｉ／mM）５０μl を各ウエルに加
える。約１６時間後、ＤＭＥＭで３回、冷１０％（ｗ／
ｖ）トリクロロ酢酸で２回各ウエルを洗浄する。トリク
ロロ酢酸を除去した後１．０Ｎ水酸化ナトリウム０．５
mlを加え、細胞を溶解する。溶解した細胞４５０μｌを
とり、液体シンチレーションカウンターで測定する。ま
た、前記のようにミンク肺上皮細胞懸濁液に対して、血
小板由来標準ｈＴＧＦ−β１及びアッセイされるべき未
知の試料を加えると同時に、０．２％ニュートラルレッ
ド溶液を加え、３７℃にて５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気
下で２４時間培養する。そして細胞を洗浄後、７．８％
リン酸１ナトリウムを含む５０％エタノール溶液で抽出
した液の５４０nmの吸光度を測定することでミンク肺上
皮細胞の生存率を求め、この値から試料中のｈＴＧＦ−
β１量を定量的に測定することができる。なお、この定
量法はミンクの肺上皮細胞の増殖が、ＴＧＦ−β１の存
在下で阻害されるという事実に基づくものである。

【００４６】

【作用】本発明によれば、前述した組換え細胞から高発
現組換え細胞を選択する過程で生じる淘汰の問題をすべ
て解決している。すなわち、細胞の増殖速度に関する項
目１）については、形質導入処理された細胞を薬剤耐性
を利用した選択方法に供する時点において、単一細胞由
来のコロニーが成育する条件下で、形質導入細胞を増殖
させることで解決された。これは、従来の薬剤耐性など
の選択マーカーの発現だけで、形質導入細胞を選択する
方法に比べ非常に手間がかかるが、該細胞固有の性質を
考慮した形での選択方法であり、その効果は極めて大き
い。このことより、従来得られていない有用物質の高発
現組換え細胞株の樹立に非常に有用な考え方を示してい
る。すなわち、項目１）に記載の増殖速度の違い以外の
細胞固有の性質に由来する様々な問題に対応しえる優れ
た選択方法を示すものである。高発現株の分離における
項目２）については、形質導入処理された細胞を薬剤耐
性を利用した選択方法に供した後、単一細胞由来のコロ
ニーごとに目的ポリペプチド発現量による選択に供した
ことにより薬剤耐性能だけの選択ではなく、目的ポリペ
プチドの発現量も並行して確認できた。これは本発明に
おいて目的ポリペプチドであるｈＴＧＦ−β１の発現量
を簡便に測定しえる方法を確立して初めて行なえたもの
である。これは各単一細胞由来の組換え細胞の遺伝的な
違いを排除し、最も好ましい組換え細胞を得るための条
件を整えることで初めて成しえたものである。そしてこ
れは増幅遺伝子及び目的ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列の増幅において発現量、薬剤耐性能以外の
変化、例えば増殖速度の変化等の影響を受けずに高発現
組換え細胞株の選択を行なえる条件として初めて成しえ
たものである。また、これは高発現株の分離における項
目３）の目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列の脱落の問題についても、遺伝子が脱落したものは目
的ポリペプチドが発現しないため、スクリーニングで容
易に排除できることにより解決している。これらのこと
により、薬剤耐性と高発現性の両者が上昇した細胞の選
択が可能となり、項目４）も解決し得た。このことは同
一宿主、同一ベクターを用いて従来から行なわれている
方法による選択方法つまり形質導入処理された細胞を群
としてとらえた選択方法で得られた組換え細胞との比較
においても薬剤耐性能において３０倍、ｈＴＧＦ−β１
の発現量において６倍であることからも明白である。

【００４７】

【実施例】以下に本発明を具体的に説明するため実施例
を記載する。但し本発明は実施例に限定されるものでは
ない。

【００４８】実施例１ 目的ポリペプチドの一つである
ＴＧＦ−β１高発現株の選択 ａ）ｈＴＧＦ−β１発現プラスミド及び細胞 ｈＴＧＦ−β１発現プラスミドＣＭＶ−ＴＧＦ−β−Ｓ
Ｖ２−ＤＨＦＲは、オーツカ アメリカ ファーマシュ
ーティカル インクのゴパール博士より供与を受けた
〔Ｔ．Ｖ．ＧｏｐａｌらＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．
Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５ １１４７−１１５４（１９８
９）〕。ＣＭＶ−ＴＧＦ−β−ＳＶ２−ＤＨＦＲは約
７．２５Kbのプラスミドであり、ヒト赤血球白血病細胞
株（ＨＥＬ）のｍＲＮＡからクローニングされたｈＴＧ
Ｆ−β１ ｃＤＮＡ（１．３Kb) を有しており、その上
流にはサイトメガロウイルスの初期プロモーターが、そ
してその下流にはプラスミドｐＭＳＧ( ファルマシア社
製) 由来のＳＶ４０ｔスプライス及びポリＡ付加配列が
連結されている。更に、該プラスミドは野性型ヒトＤＨ
ＦＲ遺伝子も有しており、その上流にはＳＶ４０初期プ
ロモーターが、そしてその下流にはＳＶ４０ｔスプライ
ス及びポリＡ付加配列が連結されている。また、宿主細
胞としてはアデノウイルスにより形質転換されたヒト胎
児腎臓由来細胞（受入番号２９３ アメリカン タイプ
カルチャー コレクション：以下２９３細胞とする）
を用いた。２９３細胞は２００ｎＭ以上のメトトレキセ
ート（ＭＴＸ）存在下で培養するとすみやかに死滅する
ことが確認されている。

【００４９】ｂ）比較例 本発明の陽性対照としては、２９３細胞にＣＭＶ−ＴＧ
Ｆ−β−ＳＶ２−ＤＨＦＲを導入し、ＭＴＸを用いた選
抜法にて得られた２９Ａ１細胞を用いた。２９Ａ１細胞
はゴパール博士から供与された細胞株であり、以下に示
す方法により取得された。まず、１×１０⁶ 個の２９３
細胞をＬ−グルタミン３００μｇ／ｌ及びウシ胎仔血清
（ＦＢＳ：Ｂｉｏｃｅｌｌ社製）１０％（ｖ／ｖ）を含
有するＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）１０mlに
接種し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で３日
間培養した後、培地をＲＰＭＩ１６４０培地に変えて更
に同条件下で２４時間培養して培養器（φ１００mmのシ
ャーレ）内に細胞単層を形成させた。尚、以下でＲＰＭ
Ｉ１６４０あるいはＦＢＳ等を添加したＲＰＭＩ１６４
０培地という場合、これらはすべて３００μｇ／ｌのＬ
−グルタミンを含むものである。実施例１．ａ）のプラ
スミドＣＭＶ−ＴＧＦ−β−ＳＶ２−ＤＨＦＲ ４０μ
ｇを１mlの水に溶解した後、よく撹拌しながら１Ｍ塩化
カルシウム０．１２mlを加えプラスミド溶液を調製し
た。また、２×ＨＢＳ緩衡液（２８０ｍＭ 塩化ナトリ
ウム ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ pH７．０７）１ml及び１
００×ＰＯ₄ 溶液（７０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ と７０ｍ
Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄ ）２５μｌの混合溶液に、ピペット
で空気を吹き込みながら該プラスミド溶液をゆっくり滴
下し、得られた懸濁液を氷上で３０分間放置した後、更
に緩やかに撹拌した。そして該懸濁液を前記細胞単層上
に静かに流し込んだ。約３０分室温で放置した後、ＲＰ
ＭＩ１６４０培地１０mlを培養器に加えた。次いで５％
（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で４時間培養した
後、該培養器から培地を除き、２５％（ｖ／ｖ）グリセ
ロール含有ＲＰＭＩ１６４０培地１０mlを加え、室温で
１００秒間静置した。次いで細胞を２０mlのＲＰＭＩ１
６４０培地で２回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０培地１
０mlを加え５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃の条
件で４８時間培養した。更に、上記培養器の培地を２０
０ｎＭ ＭＴＸを含む選択培地と交換し５％（ｖ／ｖ）
ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で１４日間培養を継続した。培
養後、培養器内には、形質導入された細胞に由来すると
考えられるコロニーが多数形成された。次に、更に培地
中のＭＴＸ濃度を段階的に高めることにより形質導入細
胞（ｈＴＧＦ−β１発現株）選抜を行なった。まず上
記、形成されたコロニー中の細胞を０．０２％（ｖ／
ｖ）ＥＤＴＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）のトリプシンを添
加したＰＢＳ（以下トリプシン−ＥＤＴＡ処理液とす
る）０．３mlを加え、２５℃２分間処理して遊離させ、
その約１×１０⁵ 細胞を３００ｎＭ ＭＴＸを含む選択
培地中で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で１４
日間培養した。培養器内に生じたコロニーから再び上記
と同様にトリプシン−ＥＤＴＡ処理液にて細胞遊離させ
た後、６００ｎＭ ＭＴＸを含む選択培地でコロニーが
形成されるまで培養した。これら一連の操作を順次ＭＴ
Ｘ濃度を高めた選択培地を用いてくり返すことにより、
最終的に５μＭのＭＴＸに耐性を示す細胞株として２９
Ａ１株が得られた。上記、選択培地とは種々濃度のＭＴ
Ｘ及び透析ＦＢＳ１０％（ｖ／ｖ）を含むＲＰＭＩ１６
４０培地という。透析ＦＢＳは、ＦＢＳをＰＢＳに対し
て、次いでイーグルＭＥＭ培地（日水製薬製）に対して
各々４℃２４時間透析することにより調製した。

【００５０】ｃ）ｈＴＧＦ−β１のバイオアッセイ法 ｈＴＧＦ−β１のバイオアッセイ法として、ｈＴＧＦ−
β１により増殖が抑制されるミンク肺上皮細胞Ｍｖ１Ｌ
ｕ（受入番号ＣＣＬ−６４，アメリカン タイプ カル
チュア コレクション：以下ＣＣＬ−６４細胞とする）
に対する試料の成長阻止活性を指標とする方法を以下の
ように確立した。ＣＣＬ−６４細胞は非動化ＦＢＳ１０
％（ｖ／ｖ）を含むイーグルＭＥＭ培地（日水製薬社
製）１０mlで５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で
３日間培養した。次いでトリプシン−ＥＤＴＡ処理液
０．４mlにて３７℃、４分間処理した後４×１０⁴ 細胞
／mlとなるようにイーグルＭＥＭ培地で調製した細胞懸
濁液を２４ウエルのプレートに０．５mlずつ添加した。
５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で２時間培養
後、試料溶液または既知量の血小板由来ｈＴＧＦ−β１
を含む溶液０．１mlを各ウエルに加えピペットにより静
かに混合した後、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７
℃で３日間培養した。次いでニュートラルレッド試液
〔０．０５％（ｗ／ｖ）ニュートラルレッド（関東化学
社製）、４．５ｇ／ｌイーグルＭＥＭ培地〕０．２５ml
を各ウエルに加え、３７℃、２時間培養しＣＣＬ−６４
細胞を染色した。そしてＰＢＳ（＋）液（塩化カルシウ
ム１ｍＭ及び塩化マグネシウム０．５ｍＭを含むＰＢ
Ｓ）で２回洗浄し、その後７．８％（ｗ／ｖ）リン酸１
ナトリウムを含む５０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液（以
下リン酸ナトリウムエタノール溶液とする）を０．５ml
添加して細胞内にとり込まれたニュートラルレッドを抽
出し、分光光度計（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ社製）にて５４０
ｎｍの吸光度を測定した。図１にニュートラルレッドを
用いたＣＣＬ−６４細胞に対するｈＴＧＦ−β１の成長
阻止曲線を示す。そして図１の血小板由来ｈＴＧＦ−β
１のＣＣＬ−６４細胞成長防止標準曲線との比較によ
り、各形質転換株のｈＴＧＦ−β１発現量を算出した。
図１はニュートラルレッドを用いたＣＣＬ−６４細胞に
対するｈＴＧＦ−β１の成長阻止曲線である。図におい
て縦軸は、５４０ｎｍでの吸光度、横軸はｈＴＧＦ−β
１の濃度（ng／ml）を示し、図中の曲線は吸光度とｈＴ
ＧＦ−β１の相関曲線を示す。以上のバイオアッセイ法
により、比較例にある２９Ａ１株についてｈＴＧＦ−β
１活性の発現量を調べた。即ち、１×１０⁷ 個の２９Ａ
１細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０mlを含むシャーレ
（φ１０cm）に接種し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気
下、３７℃で２４時間培養し、得られた培養上清１mlに
１Ｍ酢酸溶液０．２mlを加え４℃で２時間放置した後、
１Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．２mlを加えて中和した。
これを測定検体として、上記バイオアッセイを行なった
結果、２９Ａ１株の培養上清中ｈＴＧＦ−β１活性の発
現量は１．０mg／ｌであった。

【００５１】ｄ）シングルセル分離増殖法によるｈＴＧ
Ｆ−β１高発現株の選択 １×１０⁶ 個２９３細胞をＦＢＳ１％（ｖ／ｖ）添加Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地１０ml中５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲
気下、３７℃で３日間培養した後、培地をＲＰＭＩ１６
４０培地１０mlに変えて、更に２４時間培養して培養器
内に細胞単層を形成させた。 実施例１ ａ）のプラスミドＣＭＶ−ＴＧＦ−β−ＳＶ２−ＤＨＦ
Ｒ ４０μｇを１mlの水に溶解した後、よく撹拌しなが
ら１Ｍ塩化カルシウム０．１２mlを加えプラスミド溶液
を調製した。そして２×ＨＢＳ緩衡液（２８０ｍＭ 塩
化ナトリウム及び ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；pH７．０
７〕１ml及び１００×リン酸溶液（７０ｍＭリン酸２ナ
トリウム及び７０ｍＭリン酸１ナトリウムを含む溶液）
２５μｌの混合液に、ピペットで空気を吹き込みながら
該プラスミド溶液をゆっくり滴下し、得られた懸濁液を
氷上で３０分間放置した後、緩やかに撹拌した。そして
該懸濁液を前記細胞単層上に静かに流し込んだ。約３０
分室温で放置した後、更にＲＰＭＩ１６４０培地１０ml
を培養器に加えた。次いで５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気
下、３７℃で４時間培養した後、該培養器から培地を除
き、２５％（ｖ／ｖ）グリセロール含有ＲＰＭＩ１６４
０培地１０mlを加え、室温で１００秒間静置した。次い
で細胞を２０mlのＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した
後ＲＰＭＩ１６４０培地１０mlを加え５％（ｖ／ｖ）Ｃ
Ｏ₂ 雰囲気下、３７℃の条件で４８時間培養した。次い
で、培養器から培地を除去し、トリプシン−ＥＤＴＡ処
理液０．３mlにて３７℃３分間処理して遊離させた細胞
をＲＰＭＩ１６４０培地１０mlに懸濁させた。以上の形
質導入処理で得た細胞懸濁液を２５０ｎＭ ＭＴＸ添加
選択培地中で培養すると約５００個のコロニーが得られ
ることが予備検討により確かめられた。そこで単一細胞
に由来する個々のコロニーを確実に単離するため該懸濁
液をハイブリドーマディッシュ（φ１０cmグライナー社
製）に移して５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で
２４時間培養した。ここで用いたハイブリドーマディッ
シュは格子状の浅いしきりにより７００個のセルがシャ
ーレ底面に形成されたもので、培地はシャーレ内を自由
に移動できるが、シャーレ底面に付着した細胞がしきり
を越して移動することはない。次いで該培養器内から培
地を除去し、２５０ｎＭ ＭＴＸを含む選択培地１０ml
を加えて５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で１２
日間培養した。その結果、ハイブリドーマディッシュの
大部分のセル内に単一細胞由来コロニーが形成されたの
で、各コロニーをＲＰＭＩ１６４０培地０．２mlを含む
９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエルに個別
に接種し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で４
日間培養した。その結果、単一細胞由来の形質導入細胞
株１１７１２個を分離した。得られた各形質導入株に対
してｈＴＧＦ−β１高生産株の選抜を一次スクリーニン
グとして行なった。実施例１．ｃ）記載のバイオアッセ
イ法によりｈＴＧＦ−β１発現量を測定し、２９Ａ１細
胞株を陽性対照として評価した。その結果２９Ａ１細胞
株と同時あるいはそれ以上のｈＴＧＦ−β１発現量を示
す９８８個のｈＴＧＦ−β１産生形質導入株を得た。

【００５２】２次スクリーニング：１次スクリーニング
により得た９８８個の候補株の細胞をトリプシン−ＥＤ
ＴＡ処理液で処理し、各細胞株ごとにＲＰＭＩ１６４０
培地を用いて細胞懸濁液を調製した。細胞浮遊懸濁液
０．５ml（各ウエル当り１０⁴ 細胞）を２４ウエルプレ
ート（Ｃｏｓｔｏｒ社製）に加え、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ
₂ 雰囲気下、３７℃で２４時間培養した。培地を除き、
４００ｎＭ ＭＴＸを含む選択培地２mlに交換し、５％
（ｖ／ｖ）ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で１８日間培養後、
培地を除去し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理液０．１mlを
加え３７℃、２分間処理して細胞懸濁液を調製した。各
ウエル当り１×１０⁴ 個の細胞となるよう２４ウエルプ
レート中にＲＰＭＩ１６４０培地２mlを接種し、５％
（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で２４時間培養し
た。そして各ウエルから分離した培養上清中のｈＴＧＦ
−β１の活性の発現量を実施例ｃ）で確立したＣＣＬ−
６４細胞を用いたアッセイ法により測定した。図２は実
施例１．ｃ記載のバイオアッセイ法に従い測定した５４
０ｎｍの吸光度にもとづき、各細胞株のｈＴＧＦ−β１
活性を度数分布で表示した結果であり、縦軸は細胞株の
数を示す。また図２中細矢印は０．１及び１ng／mlの血
小板由来ｈＴＧＦ−β１の、太矢印は２９Ａ１株の培養
上清の活性を示す。陽性対照の２９Ａ１細胞と同等また
はそれ以上のｈＴＧＦ−β１活性の発現量を示した９細
胞株について次の３次スクリーニングを行なった。

【００５３】３次スクリーニング：前記２次スクリーニ
ングにより得た各細胞についてトリプシン−ＥＤＴＡ処
理液で処理し、各細胞ごとにＲＰＭＩ１６４０培地を用
いて細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液を用い、１×
１０⁵ 細胞／シャーレとなる様に組織培養シャーレ（φ
１００mm Ｆａｌｃｏｎ社製）に５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂
雰囲気下、３７℃で２４時間培養し、細胞をシャーレに
付着させた。次に５００ｎＭ ＭＴＸを含む選択培地１
０mlに換え、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で
１５日間培養した。そして各シャーレ中の細胞に対し、
トリプシン−ＥＤＴＡ処理液０．３mlを添加し、３７
℃、２分間処理して細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁
液を各々２枚の細胞培養シャーレに１×１０⁷ 細胞ずつ
接種し培養した。1 枚は、10mlのＲＰＭＩ１６４０培地
を添加し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、２４時間培
養したのち、培養上清を分離し、実施例１．ｃ）に記載
したバイオアッセイ法により、ｈＴＧＦ−β１活性の発
現量を測定した。残り１枚については、１μＭ ＭＴＸ
を含む選択培地を添加し、同様の条件でコロニー形成が
確認されるまで培養した。９種の細胞株について選択培
地中のＭＴＸ濃度を１μＭ、５μＭ、５０μＭ及び１５
０μＭと順次上昇させ、前記の操作を繰り返すことによ
り、高度のＭＴＸ耐性を有する株を選抜した結果、最終
的に１５０μＭ ＭＴＸに対し耐性を示す株が得られ、
これを２９Ｅ６−２株〔微工研条寄第３２１８号（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３２１８）として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託〕とした。表１に示す通り、２９Ｅ６−
２株の培養上清中におけるｈＴＧＦ−β１発現量は６．
０４mg／ｌ（６４μg ／１０⁷ ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）と
すべての候補株中最高であった。そして１５０μＭ Ｍ
ＴＸ存在下での増殖は、親株である２９３株のＭＴＸ非
存在下でのそれと同様であった。即ち、２９Ｅ６−２株
は１５０μＭ ＭＴＸを含むＲＰＭＩ１６４０培地１０
mlに対してまたは２９３株はＲＰＭＩ１６４０培地１０
mlに対して、各々１．０×１０⁵ （ｃｅｌｌｓ／mlとな
る様に調製し１０mlの組織培養プレートで５％（ｖ／
ｖ）雰囲気下、３７℃で４日間培養した。得られた付着
細胞をＥＤＴＡ−トリプシン処理して血球計算盤（カヤ
ガキ医理化工業社製）で細胞数を測定した。その結果２
９Ｅ６−２株は１７．０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ml、２９
３株は１５．５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／mlとほぼ同等であ
った。

【００５４】

【表１】

【００５５】実施例２ 組換えｈＴＧＦ−β１の精製単
離 ａ）酸エタノール粗抽出 実施例１で得られた２９Ｅ６−２細胞をＲＰＭＩ１６４
０培地１０ml当り５×１０⁵ 個接種し、５％（ｖ／ｖ）
ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃で４日間培養した。該培養液１
ｌをＲＰＲ１０−２ロータ（日立工機社製）で３０分間
９５００ｒｐｍで遠心分離して得た上清に対し、０．０
５Ｎ塩酸を含む７０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液４ｌを
添加した。得られた懸濁液（pH３．５）を十分に撹拌し
た後、４℃で一晩放置した。次いで１Ｎ水酸化ナトリウ
ム溶液を加えてpH５．５に調整し、減圧下でエタノール
を留去した後、４℃ ９５００ｒｐｍで４５分間遠心分
離して沈澱を除去した。得られた粗抽出物（２．５ｌ）
中の蛋白質量は、標準物質として牛血清アルブミン（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い
たローリー法（Ｌｏｗｒｙ．Ｏ．Ｈ．等（１９５１）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３ ２５６）で測定した
結果６８７mgであり、また、ｈＴＧＦ−β１活性量は実
施例１．ｃ）の方法で測定した結果、５．５mgであっ
た。

【００５６】ｂ）カチオン交換分離 次いで、得られた粗抽出物を２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衡液（pH５．５）で予め平衡化させたＳＰ−トヨパール
カラム（φ４５mm×５０mm）上に添加し、０→３．０Ｍ
塩化ナトリウムを直線勾配で含む２５ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衡液で１４０分間にわたり流速４ml／分で溶離し、
２分毎にフラクションを採取した。ＳＰ−トヨパールカ
ラムクロマトグラフィーの結果を図３に示す。図３にお
いて左縦軸は２８０ｎｍの吸光度、右縦軸はｈＴＧＦ−
β１活性及び溶液中の塩化ナトリウム濃度（Ｍ）横軸は
フラクション番号を示す。実線は２８０ｎｍの吸光度、
白丸はｈＴＧＦ−β１活性量、破線は塩化ナトリウム濃
度を示す。この図３よりフラクション３１〜３９（７２
ml）がｈＴＧＦ−β１活性を示したので、これらのフラ
クションをプールした。プールした試料中の総蛋白質量
は約４．２mg、ｈＴＧＦ−β１活性量は４．１mgであっ
た。

【００５７】ｃ）逆相ＨＰＬＣ ｂ）にて得られた試料を６Ｎ塩酸でpH２．５に調整した
後、バイダック プロテインＣ４カラム（４．６mm×２
５０mm）（Ｔｈｅ ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＧｒｏｕｐ
社製）にアプライし、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を
用い、２種の溶離液、即ち、０．１％（ｖ／ｖ）トリフ
ルオロ酢酸（以下「ＴＦＡ」とする）水溶液である
〔Ａ〕及び０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含む９０％（ｖ
／ｖ）アセトニトリル水溶液である〔Ｂ〕を用いて１．
０ml／分の速度で溶出した。該溶出条件は当初の５分間
は１００→７０％〔Ａ〕／０→３０％〔Ｂ〕、引き続き
５５分間は７０→５５％〔Ａ〕／３０→４５％〔Ｂ〕、
更に引き続き５分間は５５→０％〔Ａ〕／４５→１００
％〔Ｂ〕のリニアグラジュエントとした。フラクション
を１分毎に回収し、２８０ｎｍの吸光度を測定した。ま
た、各フラクションにおけるｈＴＧＦ−β１活性量を実
施例１．ｃ）の方法にて測定した。その結果を図４に示
す。図４における左縦軸は２８０ｎｍの吸光度、右縦軸
はｈＴＧＦ−β１活性量及び溶出液中のアセトニトリル
濃度（％）そして、横軸はフラクション番号を示す。実
線は２８０ｎｍの吸光度、白丸を連続した直線はｈＴＧ
Ｆ−β１活性量、破線はアセトニトリル濃度を示す。こ
の図よりフラクション２２〜２６がｈＴＧＦ−β１活性
を示しており、これらのフラクションをプールした。プ
ールした試料中のｈＴＧＦ−β１活性量は２mgであっ
た。以下、本試料を精製組換えｈＴＧＦ−β１とする。
また精製過程の概要を表２に示す。

【００５８】

【表２】

【００５９】実施例３ 精製組換えｈＴＧＦ−β１の物
性の同定 ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析 実施例２で得た精製組換えｈＴＧＦ−β１並びに血小板
由来ｈＴＧＦ−β１５．０μｇに５．０％（ｖ／ｖ）２
−メルカプトエタノール６００μｌを加え１００℃５分
間反応させて還元した。次いで還元した各試料、及び還
元しなかった各試料をそれぞれレムリ（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ，Ｕ．Ｋ．）らの方法（Ｎａｔｕｒａ２２７ ６８０
〜６８５（１９７０））により調製したＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル（１８％，ｗ／ｖ）を用いて電気泳動
を行なった。更に該ゲルをクーマシーブリリアントブル
ー Ｒ−２５０（Ｃｏｏｍａｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎ
ｔｂｌｕｅ Ｒ−２５０）を用い、ウェーバー（Ｗｅｂ
ｅｒ．Ｋ．）等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４
４４０６〜４４１２（１９６９））の方法で染色した。
その結果を図５に示す。図において試料は左より分子量
マーカー、還元型血小板由来ｈＴＧＦ−β１、還元型組
換えｈＴＧＦ−β１、非還元型血小板由来ｈＴＧＦ−β
１、非還元型組換えｈＴＧＦ−β１であり、数字は分子
量マーカーから求めた分子量を示す。上記のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、組換えｈＴＧＦ
−β１は還元または、非還元条件でそれぞれ血小板由来
ｈＴＧＦ−β１と同一の挙動を示し、かつ単一バンドで
あった。このことから本発明により得られたｈＴＧＦ−
β１は均質でかつ、純度９５％以上であることが確認さ
れた。更に本発明組換えｈＴＧＦ−β１は血小板由来ｈ
ＴＧＦ−β１と同様に非還元条件下では２５Ｋダルトン
のダイマーであり、還元条件下では、１２．５Ｋダルト
ンのモノマーであることを確認した。

【００６０】ｂ）逆相ＨＰＬＣ溶出パターンの比較 実施例２で得た精製組換えｈＴＧＦ−β１及び血小板由
来ｈＴＧＦ−β１各５μｇを実施例２−ｃ）記載の
〔Ａ〕を７５％及び〔Ｂ〕を２５％の混合液で予め平衡
化させたバイダック プロテイン Ｃ４カラムにアプラ
イした。溶出条件は当初３０分間は７５→５０％〔Ａ〕
／２５→５０％〔Ｂ〕で、引き続く５分間は５０→０％
〔Ａ〕／５０→１００％〔Ｂ〕のリニアグラジュエント
とした。その結果を図６に示す。図において左縦軸は２
８０ｎｍの吸光度、右縦軸はアセトニトリル濃度（％）
及び横軸は溶出時間（分）を示し、連続線は吸光度をそ
して破線はアセトニトリル濃度を示す。また、上部は精
製組換えｈＴＧＦ−β１、下部は血小板由来ｈＴＧＦ−
β１の挙動を示した。これらを比較すると精製組換えｈ
ＴＧＦ−β１と血小板由来ｈＴＧＦ−β１の溶出時間は
完全に一致した。

【００６１】ｃ）アミノ酸分析 実施例２で得た精製組換えｈＴＧＦ−β１及び血小板由
来ｈＴＧＦ−β１各２０μｇを、１％フェノール（和光
純薬社製）を含む６Ｎ ＨＣ１（和光純薬社製）２００
μｌを入れたテフロン密封ガラス加水分解バイアル（Ｗ
ａｔｅｒｓ社製）中でＮ₂ 存在下１３０℃２４時間加水
分解した。得られた加水分解物を６３００Ｅ型アミノ酸
分析計（ベックマン社製）で分析した結果を表３に示
す。精製組換えｈＴＧＦ−β１のアミノ酸組成は理論値
（Ｄｅｒｙｎｃｋ．Ｒ．等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ
３１６ ７０１）及び血小板由来ｈＴＧＦ−β１のアミ
ノ酸組成と一致した。

【００６２】

【表３】

【００６３】ｄ）Ｎ−末端アミノ酸配列分析 実施例２で得た精製組換えｈＴＧＦ−β１ ２０μｇを
還元カルボキサミドメチル化処理した後、モデル４７０
Ａアミノ酸シークエンサー（アプライドバイオシステム
ズ社製）を用いアミノ酸配列分析を行なった。その結果
を配列番号１に記載する。精製組換えｈＴＧＦ−β１の
アミノ酸配列はＮ末端から６１番目まで決定したが、こ
の配列は配列番号２に示したｈＴＧＦ−β１のアミノ酸
配列（１−１１２番目）（Ｄｅｒｙｎｃｋ．Ｒ．ら（１
９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６７０１）のＮ末端以下の
配列と完全に一致した。上記のＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル分析、逆相ＨＰＬＣ溶出パターン比較、アミノ
酸分析及びＮ−末端アミノ酸配列分析の結果から、精製
組換えｈＴＧＦ−β１は血小板由来ｈＴＧＦ−β１と同
一の物性を有することが確認された。

【００６４】実施例４ 精製組換えｈＴＧＦ−β１の生
物活性の同定 ａ）ＣＣＬ−６４細胞成長阻止活性測定 平底２４ウエル組織培養プレート（コスター社製）を用
い、ウエル当り４×１０³個のＣＣＬ−６４細胞と、非
動化ＦＢＳ１０％を加えたイーグルＭＥＭ培地（日水製
薬社製）５００mlを添加した。３７℃で２時間培養後、
実施例２で得た精製組換えｈＴＧＦ−β１をイーグルＭ
ＥＭ培地で希釈し、各ウエルに加えた。細胞を５％（ｖ
／ｖ）ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃７２時間培養した。次い
で２５０μｌのニュートラルレッド試液を各ウエルに添
加し、３７℃で２時間培養した。そして、細胞をＰＢＳ
（＋）液で２回洗浄後５００μｌのリン酸ナトリウムエ
タノール溶液を添加し、５４０ｎｍの吸光度を測定し
た。その結果を図７に示す。図７において縦軸は５４０
ｎｍの吸光度、横軸はｈＴＧＦ−β１濃度（ｎｇ／ml）
を示し、白丸を連続する連続線は血小板由来ｈＴＧＦ−
β１、そして黒丸を連続する連続線は精製組換えｈＴＧ
Ｆ−β１を示す。この図より精製組換えｈＴＧＦ−β１
と血小板由来ｈＴＧＦ−β１は同一の用量依存的な増殖
抑制活性を有することを確認した。

【００６５】ｂ）軟寒天中の増殖能分析 ０．６％（ｖ／ｖ）寒天、６％ウシ血清を含むダルベッ
コ変法イーグル培地（日水製薬社製）を６マルチウエル
プレート（コーニング社製）に１ウエルあたり２mlずつ
分注し、静置して固化させた。一方、５％（ｖ／ｖ）ウ
シ血清、ｈＥＧＦ２ｎｇ及び０．０５〜１０mgのｈＴＧ
Ｆ−β１を含む０．３％寒天１mlに３×１０³ 個の正常
ラット線維芽細胞（１ＮＲＫ−４９Ｆ細胞、理化学研究
所より分与された）を加え、これを上記固化培地上に添
加し、室温で固化させた。該プレートを５％（ｖ／ｖ）
ＣＯ₂ 雰囲気下、３７℃７日間培養した後、直径６０μ
ｍ以上のコロニーの数を測定した。その結果を図８に示
す。図８において縦軸は直径６０μｍ以上のコロニー数
（×１０³ 個）を、横軸はｈＴＧＦ−β１濃度（ｎｇ／
ml）を示し、白丸を連続する連続線が血小板由来ｈＴＧ
Ｆ−β１を、黒丸を連続する連続線は精製組換えｈＴＧ
Ｆ−β１を示す。精製組換えｈＴＧＦ−β１は１ｎｇ／
mlで最大となる用量依存性のコロニー形成促進活性を示
し、そのパターンは血小板由来ｈＴＧＦ−β１と同一で
あった。ＣＣＬ−６４細胞成長阻止活性及びＮＲＫ細胞
軟寒天中の増殖能解析の結果により、精製組換えｈＴＧ
Ｆ−β１は血小板由来ｈＴＧＦ−β１と同一の生物活性
を有することが証明された。

【００６６】

【発明の効果】本発明により、有用ポリペプチドの高産
生細胞の製造法を確立し、更に該製造方法により新規な
ｈＴＧＦ−β１産生細胞株２９Ｅ６−２等が得られ、更
に該細胞により均質なｈＴＧＦ−β１の大量製造が可能
となり創傷治癒、骨折、炎症、自己免疫疾患、ガン等に
対する治療薬として、あるいはｈＴＧＦ−β１に係る疾
患の診断薬の分野に有用な物質を提供し得るものであ
る。

【００６７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６１ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 1 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg 20 Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro 40 Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu 60 Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val

【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：１１２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 1 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg 20 Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro 40 Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu 60 Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala 80 Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr 100 Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser 112 Cys Lys Cys Ser

【図面の簡単な説明】

【図１】ニュートラルレッドを用いたＣＣＬ−６４細胞
に対するｈＴＧＦ−β１の成長阻止曲線を示す図面であ
る。

【図２】実施例１．ｃ）記載のバイオアッセイ法に従っ
て測定した５４０ｎｍの吸光度にもとづき、各細胞株の
ｈＴＧＦ−β１活性を度数分布で表した図面である。

【図３】ｈＴＧＦ−β１粗抽出物のＳＰ−トヨパールカ
ラムクロマトグラフィーの結果を示す図面である。

【図４】ｈＴＧＦ−β１抽出物の逆相−ＨＰＬＣの結果
を示す図面である。

【図５】精製組換えｈＴＧＦ−β１と血小板由来ｈＴＧ
Ｆ−β１のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果
を示す図面である。

【図６】精製組換えｈＴＧＦ−β１と血小板由来ｈＴＧ
Ｆ−β１の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図面である。

【図７】組換えｈＴＧＦ−β１と血小板由来ｈＴＧＦ−
β１のＣＣＬ−６４細胞に対する成長阻止活性を示す図
面である。

【図８】組換えｈＴＧＦ−β１と血小板由来ｈＴＧＦ−
β１の軟寒天中におけるＮＲＫ細胞増殖能を示す図面で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ ＡＢＥ ＡＢＪ ＡＤＳ ＡＤＵ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリペプチドをコードしているヌクレオ
   チド配列（１）、ヌクレオチド配列（１）を増幅し、か
   つ選択薬剤に対する耐性能を哺乳動物細胞に付与するヌ
   クレオチド配列（２）、並びにこれらヌクレオチド配列
   （１）及び（２）の発現を調節するヌクレオチド配列
   （３）を有するベクターを、哺乳動物細胞に導入し、得
   られた組換え細胞群より選択薬剤を用いてポリペプチド
   高発現性組換え細胞を選択する場合において、（ａ）当
   該組換え細胞群より選択薬剤に対する薬剤耐性を有する
   組換え細胞を、各単一細胞由来の組換え細胞として分離
   し、（ｂ）当該単一細胞由来の組換え細胞についてポリ
   ペプチドの発現性を定量的に確認し、ポリペプチド高発
   現性候補組換え細胞として選択した後、（ｃ）当該高発
   現性候補組換え細胞を、段階的に選択薬剤濃度を高くし
   た培地中で培養することにより、ポリペプチド高発現性
   組換え細胞を選択することを特徴とするポリペプチド高
   発現性組換え細胞の製造方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の製造方法により得られる
   ポリペプチド高発現性組換え細胞。
3. 【請求項３】 ポリペプチドがトランスフォーミング成
   長因子βである請求項１記載のポリペプチド高発現性組
   換え細胞の製造方法。
4. 【請求項４】 ポリペプチドがヒトトランスフォーミン
   グ成長因子β１である請求項１または３記載のポリペプ
   チド高発現性組換え細胞の製造方法。
5. 【請求項５】 ポリペプチドがトランスフォーミング成
   長因子βである請求項２記載のポリペプチド高発現性組
   換え細胞。
6. 【請求項６】 ポリペプチドがヒトトランスフォーミン
   グ成長因子β１である請求項２または５記載のポリペプ
   チド高発現性組換え細胞。
7. 【請求項７】 請求項６記載のポリペプチド高発現性組
   換え細胞を培養し、当該培養液よりヒトトランスフォー
   ミング成長因子β１を採取することを特徴とするヒトト
   ランスフォーミング成長因子β１の製造方法。
8. 【請求項８】 ５０μg ／ml以上のメトトレキセート存
   在下で安定であり、その培養上清が６８０fg／cell／２
   ４時間 以上のＣＣＬ−６４細胞成長阻害活性を有する
   ことを特徴とするトランスフォーミング成長因子β高発
   現性組換え細胞。