JPH05292879A - 牛乳に含まれる非蛋白態窒素成分の精製法及び 精製物 - Google Patents
牛乳に含まれる非蛋白態窒素成分の精製法及び 精製物Info
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- JPH05292879A JPH05292879A JP4121053A JP12105392A JPH05292879A JP H05292879 A JPH05292879 A JP H05292879A JP 4121053 A JP4121053 A JP 4121053A JP 12105392 A JP12105392 A JP 12105392A JP H05292879 A JPH05292879 A JP H05292879A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 非蛋白態窒素成分（ＮＰＮ）含有原料を有機
溶媒処理し、生成した沈澱を除去した後の有機溶媒液を
ゲル濾過することを特徴とするＮＰＮの精製法。 【効果】 高度に精製されたＮＰＮが効率的に得られ、
特定保健用食品や医薬品等にも使用することが可能であ
る。
溶媒処理し、生成した沈澱を除去した後の有機溶媒液を
ゲル濾過することを特徴とするＮＰＮの精製法。 【効果】 高度に精製されたＮＰＮが効率的に得られ、
特定保健用食品や医薬品等にも使用することが可能であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、各種生理活性物質が含
有される牛乳の非蛋白態窒素成分（ＮｏｎＰｒｏｔｅｉ
ｎ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ，以下ＮＰＮということもある）
を簡便に精製する方法、及びそれらによって得られた精
製物に関する。更に詳細には、牛乳や山羊乳等の獣乳非
蛋白態窒素成分を有機溶媒を含む溶媒中に溶解し、有機
溶媒を含む溶媒中でゲル濾過を行うことによって特定保
健用食品、医薬品、並びに化粧品原料として利用可能な
高度に精製された精製物として得るものである。
有される牛乳の非蛋白態窒素成分（ＮｏｎＰｒｏｔｅｉ
ｎ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ，以下ＮＰＮということもある）
を簡便に精製する方法、及びそれらによって得られた精
製物に関する。更に詳細には、牛乳や山羊乳等の獣乳非
蛋白態窒素成分を有機溶媒を含む溶媒中に溶解し、有機
溶媒を含む溶媒中でゲル濾過を行うことによって特定保
健用食品、医薬品、並びに化粧品原料として利用可能な
高度に精製された精製物として得るものである。
【０００２】
【従来の技術】一般に牛乳や山羊乳等の獣乳中にはタン
パク質以外の非蛋白態窒素成分が全窒素の５〜６％も含
有されていることはよく知られている。便宜的には１２
％トリクロロ酢酸溶液に溶解する物質を非蛋白態窒素成
分と称する場合もある。この非蛋白態窒素成分には、尿
素、クレアチン、クレアチニン、オロチン酸、ホスホエ
タノールアミン等の含窒素化合物、グルタミン酸、タウ
リン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、アスパ
ラギン酸、セリン、トリプトファン、チロシン等のアミ
ノ酸、５’−ＣＭＰ、５’−ＡＭＰ、５’−ＧＭＰ、
５’−ＵＭＰ等の核酸関連物質、ホルモン、ペプチド類
等、極めて多種にわたる窒素化合物が含まれていること
が知られている。
パク質以外の非蛋白態窒素成分が全窒素の５〜６％も含
有されていることはよく知られている。便宜的には１２
％トリクロロ酢酸溶液に溶解する物質を非蛋白態窒素成
分と称する場合もある。この非蛋白態窒素成分には、尿
素、クレアチン、クレアチニン、オロチン酸、ホスホエ
タノールアミン等の含窒素化合物、グルタミン酸、タウ
リン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、アスパ
ラギン酸、セリン、トリプトファン、チロシン等のアミ
ノ酸、５’−ＣＭＰ、５’−ＡＭＰ、５’−ＧＭＰ、
５’−ＵＭＰ等の核酸関連物質、ホルモン、ペプチド類
等、極めて多種にわたる窒素化合物が含まれていること
が知られている。
【０００３】これらの成分を多量に含む画分を得る方法
として、原料の限外濾過処理で得られる透過液を濃縮し
て、２段階の結晶分離法により乳糖を除去した母液を脱
塩して粉末化する方法（特開昭６０−５４６３７）並び
にイオン交換樹脂にＮＰＮ成分を吸着させ、脱塩ホエイ
液を用いてこの樹脂よりＮＰＮを洗い出し、これらの成
分が強化されたホエイ濃縮物を製造する方法（特願平３
−８１０６３）が既に特許出願されている。
として、原料の限外濾過処理で得られる透過液を濃縮し
て、２段階の結晶分離法により乳糖を除去した母液を脱
塩して粉末化する方法（特開昭６０−５４６３７）並び
にイオン交換樹脂にＮＰＮ成分を吸着させ、脱塩ホエイ
液を用いてこの樹脂よりＮＰＮを洗い出し、これらの成
分が強化されたホエイ濃縮物を製造する方法（特願平３
−８１０６３）が既に特許出願されている。
【０００４】また、脱塩したＮＰＮ母液を強酸性陽イオ
ン交換樹脂と強塩基性イオン交換樹脂からなる２床式の
イオン交換体に通液し、ＮＰＮを吸着させ、吸着したＮ
ＰＮを酸及びアルカリ剤にて溶出させて乳糖含有量の少
ない高純度ＮＰＮを得る方法（特願平４−３４０６２）
が既に特許出願されている。
ン交換樹脂と強塩基性イオン交換樹脂からなる２床式の
イオン交換体に通液し、ＮＰＮを吸着させ、吸着したＮ
ＰＮを酸及びアルカリ剤にて溶出させて乳糖含有量の少
ない高純度ＮＰＮを得る方法（特願平４−３４０６２）
が既に特許出願されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特開昭
６０−５４６３７に記載の方法、あるいは特願平３−８
１０６３に記載の方法によって得られたＮＰＮには多量
の乳糖等不純物を含むため、前記製品はＮＰＮを強化し
た一般食品の原料としては利用可能でも、特定保健用食
品、医薬品、化粧品原料としては精製不十分と判断され
る。
６０−５４６３７に記載の方法、あるいは特願平３−８
１０６３に記載の方法によって得られたＮＰＮには多量
の乳糖等不純物を含むため、前記製品はＮＰＮを強化し
た一般食品の原料としては利用可能でも、特定保健用食
品、医薬品、化粧品原料としては精製不十分と判断され
る。
【０００６】また、脱塩したＮＰＮ母液を強酸性陽イオ
ン交換樹脂と強塩基性イオン交換樹脂からなる２床式の
イオン交換体に通液し、ＮＰＮを吸着させ、吸着したＮ
ＰＮを酸及びアルカリ剤にて溶出させて乳糖含有量の少
ない高純度ＮＰＮを得る方法（特願平４−３４０６２）
では、処理工程数が多く、簡便な精製方法ではない。
ン交換樹脂と強塩基性イオン交換樹脂からなる２床式の
イオン交換体に通液し、ＮＰＮを吸着させ、吸着したＮ
ＰＮを酸及びアルカリ剤にて溶出させて乳糖含有量の少
ない高純度ＮＰＮを得る方法（特願平４−３４０６２）
では、処理工程数が多く、簡便な精製方法ではない。
【０００７】本発明は可能な限り簡便な工程でＮＰＮか
ら乳糖等の不純物を除去し、ＮＰＮ含量を高め、特定保
健用食品はもとより、化粧品や医薬品の原料としても応
用することを目的とする。
ら乳糖等の不純物を除去し、ＮＰＮ含量を高め、特定保
健用食品はもとより、化粧品や医薬品の原料としても応
用することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、有機溶媒を含む溶
媒中に溶解させたＮＰＮを有機溶媒を含む溶媒中でゲル
濾過することによって、極めて簡便で、効率的にＮＰＮ
の精製が可能であるという新知見を得、この新知見をも
とにして更に研究を重ねた結果、本発明の完成に至った
ものである。
成するためになされたものであって、有機溶媒を含む溶
媒中に溶解させたＮＰＮを有機溶媒を含む溶媒中でゲル
濾過することによって、極めて簡便で、効率的にＮＰＮ
の精製が可能であるという新知見を得、この新知見をも
とにして更に研究を重ねた結果、本発明の完成に至った
ものである。
【０００９】本発明において、精製されるＮＰＮ原料と
しては、牛乳や山羊乳等の獣乳、それらの濃縮物及びそ
れらの粉末；脱脂乳、その濃縮物及びその粉末；ホエ
イ、その濃縮物及びその粉末；牛乳や山羊乳等の獣乳、
脱脂乳もしくはホエイの電気透析脱塩物、その濃縮物及
びその粉末；ホエイの限外濾過処理で得られた透過液、
及び透過液から乳糖製造時副産物として得られる母液、
その濃縮物及びその粉末からなる群から選ばれるものす
べてが該当する。また、必要があれば濃縮物の場合は希
釈し、また粉末の場合は溶解する等の調製処理を行う。
しては、牛乳や山羊乳等の獣乳、それらの濃縮物及びそ
れらの粉末；脱脂乳、その濃縮物及びその粉末；ホエ
イ、その濃縮物及びその粉末；牛乳や山羊乳等の獣乳、
脱脂乳もしくはホエイの電気透析脱塩物、その濃縮物及
びその粉末；ホエイの限外濾過処理で得られた透過液、
及び透過液から乳糖製造時副産物として得られる母液、
その濃縮物及びその粉末からなる群から選ばれるものす
べてが該当する。また、必要があれば濃縮物の場合は希
釈し、また粉末の場合は溶解する等の調製処理を行う。
【００１０】粉末の場合には、これを有機溶媒を含む溶
媒に懸濁・溶解し、溶液の場合には、これに有機溶媒を
含む溶媒を添加して、共存する高分子蛋白質等の本溶媒
に溶解しない物質を不溶化させ、同時にＮＰＮを溶解さ
せる。
媒に懸濁・溶解し、溶液の場合には、これに有機溶媒を
含む溶媒を添加して、共存する高分子蛋白質等の本溶媒
に溶解しない物質を不溶化させ、同時にＮＰＮを溶解さ
せる。
【００１１】粉末状のＮＰＮ原料を有機溶媒を含む溶媒
に懸濁・溶解した場合でも、液状のＮＰＮ原料に有機溶
媒を含む溶媒を添加した場合でも、高分子の蛋白質等の
本溶媒に溶解しない物質が懸濁、もしくは沈澱する。そ
こで、この懸濁物もしくは沈澱物を遠心分離や膜濾過を
用いて除去する。懸濁物もしくは沈澱物を除去した溶液
をゲル濾過供試溶液とする。
に懸濁・溶解した場合でも、液状のＮＰＮ原料に有機溶
媒を含む溶媒を添加した場合でも、高分子の蛋白質等の
本溶媒に溶解しない物質が懸濁、もしくは沈澱する。そ
こで、この懸濁物もしくは沈澱物を遠心分離や膜濾過を
用いて除去する。懸濁物もしくは沈澱物を除去した溶液
をゲル濾過供試溶液とする。
【００１２】従って、有機溶媒を含む溶媒を添加するこ
とによって、１２％トリクロロ酢酸を添加した場合と同
様に除蛋白を行うことが可能である。また、図１にも示
したが、乳糖の一部を除去することも可能である。
とによって、１２％トリクロロ酢酸を添加した場合と同
様に除蛋白を行うことが可能である。また、図１にも示
したが、乳糖の一部を除去することも可能である。
【００１３】用いる有機溶媒には、メタノール、エタノ
ール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセ
トン等のケトン類、アセトニトリル等を用いることが可
能である。
ール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセ
トン等のケトン類、アセトニトリル等を用いることが可
能である。
【００１４】ただし、ＮＰＮを特定保健用食品や食品に
用いる場合を想定するならば、ＮＰＮ原料を溶解する／
またはＮＰＮ原料に添加する時に用いる有機溶媒は、食
品添加物として使用が認められている有機溶媒を使用す
ることが必要である。この場合には、エタノールが最も
適した有機溶媒である。なお、ＮＰＮを医薬品や化粧品
に用いる場合には、エタノール以外の有機溶媒を用いる
ことが可能である。
用いる場合を想定するならば、ＮＰＮ原料を溶解する／
またはＮＰＮ原料に添加する時に用いる有機溶媒は、食
品添加物として使用が認められている有機溶媒を使用す
ることが必要である。この場合には、エタノールが最も
適した有機溶媒である。なお、ＮＰＮを医薬品や化粧品
に用いる場合には、エタノール以外の有機溶媒を用いる
ことが可能である。
【００１５】添加する有機溶媒の濃度は、ＮＰＮは溶解
するが、乳糖は部分的に不溶化する濃度が好ましい。図
１にも示したが、例えばエタノールを用いた場合の濃度
は経済性も考慮に入れると、約５０％が好ましい。
するが、乳糖は部分的に不溶化する濃度が好ましい。図
１にも示したが、例えばエタノールを用いた場合の濃度
は経済性も考慮に入れると、約５０％が好ましい。
【００１６】例えば、下記の表１に示す操作に従って、
先ず、５％ＷＰＩプロテアーゼ分解物溶液と５％乳糖溶
液のそれぞれに、０〜９９．５％濃度のエタノール溶液
１００ｍｌを加え（終濃度０〜９０％）、３０分間放置
した後３０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上
澄液について、２８０ｎｍ及び４９０ｎｍでの吸光度を
測定してそれぞれ乳糖及びＮＰＮ（ＷＰＩプロテアーゼ
分解物）の定量を行い、その回収率を図１に示した。
先ず、５％ＷＰＩプロテアーゼ分解物溶液と５％乳糖溶
液のそれぞれに、０〜９９．５％濃度のエタノール溶液
１００ｍｌを加え（終濃度０〜９０％）、３０分間放置
した後３０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上
澄液について、２８０ｎｍ及び４９０ｎｍでの吸光度を
測定してそれぞれ乳糖及びＮＰＮ（ＷＰＩプロテアーゼ
分解物）の定量を行い、その回収率を図１に示した。
【００１７】
【表１】
【００１８】図１の結果から明らかなように、エタノー
ル濃度約５０％以上の場合にすぐれた分離効果が得られ
ることがわかる。なお、ＷＰＩは、ホエー蛋白質分離物
（Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｅ）を指
し、ＷＰＣ（ホエー蛋白質濃縮物、Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）とは区別されるもの
であって、ホエーを濃縮し、結晶してくる乳糖を分離し
て得られるＷＰＣよりも高純度に分離された未変性ホエ
ー蛋白質であり、灰分、脂肪、炭水化物含量が減少して
おり、特に脂肪は１％以下になっている。
ル濃度約５０％以上の場合にすぐれた分離効果が得られ
ることがわかる。なお、ＷＰＩは、ホエー蛋白質分離物
（Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｅ）を指
し、ＷＰＣ（ホエー蛋白質濃縮物、Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）とは区別されるもの
であって、ホエーを濃縮し、結晶してくる乳糖を分離し
て得られるＷＰＣよりも高純度に分離された未変性ホエ
ー蛋白質であり、灰分、脂肪、炭水化物含量が減少して
おり、特に脂肪は１％以下になっている。
【００１９】このようにして溶媒の種類、濃度を選択し
た後、ゲル濾過を行う。ゲル濾過に用いるゲル濾過用充
填剤としては、球状蛋白質の分画範囲が１０4ダルトン
以下であり、有機溶媒の使用に耐え得るものであれば特
に規定しない。このようなゲル濾過用充填剤としては、
セファデックスゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、バイオゲル（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、バイオグラス
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ス
チラゲル（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎ
ｃ．社）、トヨパール（東ソー社）等があり、これらの
中から適宜選択することが可能である。
た後、ゲル濾過を行う。ゲル濾過に用いるゲル濾過用充
填剤としては、球状蛋白質の分画範囲が１０4ダルトン
以下であり、有機溶媒の使用に耐え得るものであれば特
に規定しない。このようなゲル濾過用充填剤としては、
セファデックスゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、バイオゲル（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、バイオグラス
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ス
チラゲル（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎ
ｃ．社）、トヨパール（東ソー社）等があり、これらの
中から適宜選択することが可能である。
【００２０】これらのゲル濾過用充填剤の中から選択さ
れた一つを用い、カラムに充填し、粉末状のＮＰＮ原料
を懸濁・溶解させた／あるいは液状のＮＰＮ原料に添加
したのと同じ種類、及び同じ終濃度の有機溶媒を含む溶
媒で十分に平衡化した後に、先のゲル濾過供試溶液を負
荷する。溶出液は、粉末状のＮＰＮ原料を懸濁・溶解さ
せた／あるいは液状のＮＰＮ原料に添加したのと同じ種
類、及び同じ終濃度の有機溶媒を含む溶媒とする。
れた一つを用い、カラムに充填し、粉末状のＮＰＮ原料
を懸濁・溶解させた／あるいは液状のＮＰＮ原料に添加
したのと同じ種類、及び同じ終濃度の有機溶媒を含む溶
媒で十分に平衡化した後に、先のゲル濾過供試溶液を負
荷する。溶出液は、粉末状のＮＰＮ原料を懸濁・溶解さ
せた／あるいは液状のＮＰＮ原料に添加したのと同じ種
類、及び同じ終濃度の有機溶媒を含む溶媒とする。
【００２１】一定の流速でカラムに溶出液を流し、溶出
する物質をモニターする。ヘキソース（獣乳の場合に
は、含有する糖類の大部分が乳糖である。乳糖にはヘキ
ソースが含まれているために硫酸−フェノール法で発色
させ、４９０ｎｍの吸光値を測定することによってヘキ
ソース、即ち乳糖の溶出位置を知ることが可能である）
の後に溶出するピークが乳糖含量の少ない生成されたＮ
ＰＮのピークである。以下に、本発明の実施例及び対照
例を示す。
する物質をモニターする。ヘキソース（獣乳の場合に
は、含有する糖類の大部分が乳糖である。乳糖にはヘキ
ソースが含まれているために硫酸−フェノール法で発色
させ、４９０ｎｍの吸光値を測定することによってヘキ
ソース、即ち乳糖の溶出位置を知ることが可能である）
の後に溶出するピークが乳糖含量の少ない生成されたＮ
ＰＮのピークである。以下に、本発明の実施例及び対照
例を示す。
【００２２】［実施例１］１０％ホエイ水溶液１０ｍｌ
に１０ｍｌの９９．５％エタノールを加えてよく混合
し、３０分静置した。次に、３０００×ｇ、１０分間の
遠心分離を行い、上澄液を得た。この上澄液１０ｍｌを
予め５０％エタノールで平衡化させたＴｏｙｏｐｅａｒ
ｌ ＨＷ−４０（東ソー社、球状蛋白質の分画分子量範
囲：１０4ダルトン以下）のカラム（径２５ｍｍ×長さ
８００ｍｍ）に負荷した。
に１０ｍｌの９９．５％エタノールを加えてよく混合
し、３０分静置した。次に、３０００×ｇ、１０分間の
遠心分離を行い、上澄液を得た。この上澄液１０ｍｌを
予め５０％エタノールで平衡化させたＴｏｙｏｐｅａｒ
ｌ ＨＷ−４０（東ソー社、球状蛋白質の分画分子量範
囲：１０4ダルトン以下）のカラム（径２５ｍｍ×長さ
８００ｍｍ）に負荷した。
【００２３】このカラムに５０％エタノールを線速９．
２ｃｍ／ｈｒで供給し、溶出液を１５ｍｌずつ分取した
（表２）。各々のフラクションについて、２８０ｎｍ吸
光値、乳糖、尿素−アンモニア量を測定し、溶出図形
（図２）を得た。
２ｃｍ／ｈｒで供給し、溶出液を１５ｍｌずつ分取した
（表２）。各々のフラクションについて、２８０ｎｍ吸
光値、乳糖、尿素−アンモニア量を測定し、溶出図形
（図２）を得た。
【００２４】
【表２】
【００２５】排除画分（フラクションＮｏ．８）に乳糖
と２８０ｎｍの微少なピークが溶出し、続いて、乳糖の
大きなピークが溶出し、次に２８０ｎｍの大きなピーク
が溶出し、最後に尿素−アンモニアのピークが溶出し
た。
と２８０ｎｍの微少なピークが溶出し、続いて、乳糖の
大きなピークが溶出し、次に２８０ｎｍの大きなピーク
が溶出し、最後に尿素−アンモニアのピークが溶出し
た。
【００２６】各ピークの一部をＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ２０
００ＳＷ（東ソー社）を用いた高速液体クロマトグラフ
ィーでゲル濾過に供し、各々のピークの純度を検定し、
分画前と比較した。それを図３、図４に示した。
００ＳＷ（東ソー社）を用いた高速液体クロマトグラフ
ィーでゲル濾過に供し、各々のピークの純度を検定し、
分画前と比較した。それを図３、図４に示した。
【００２７】図面から明らかなように、当初、分画前は
種々のピークが存在した。このうち保持時間１０〜１３
分のピークがＮＰＮの一部である。これはフラクション
Ｎｏ．２２のピークに高純度に含有され、他のフラクシ
ョンには認められないことが示された。
種々のピークが存在した。このうち保持時間１０〜１３
分のピークがＮＰＮの一部である。これはフラクション
Ｎｏ．２２のピークに高純度に含有され、他のフラクシ
ョンには認められないことが示された。
【００２８】従って、本方法によってはじめて乳糖とＮ
ＰＮ画分の効率的分離が可能となった。即ち、フラクシ
ョンＮｏ．２２〜３１は、乳糖含量の少ない高純度に生
成されたＮＰＮ画分であり、全固形分当り８１．３％
（Ｎ×６．３８）のＮＰＮを含有していた。
ＰＮ画分の効率的分離が可能となった。即ち、フラクシ
ョンＮｏ．２２〜３１は、乳糖含量の少ない高純度に生
成されたＮＰＮ画分であり、全固形分当り８１．３％
（Ｎ×６．３８）のＮＰＮを含有していた。
【００２９】［対照例１］１０％ホエイ水溶液１０ｍｌ
に１０ｍｌの２４％トリクロロ酢酸を加えてよく混合
し、６０分静置した。次に３０００×ｇ、１０分間の遠
心分離を行い、上澄液を得た。本上澄液１０ｍｌを予め
水で平衡化させたＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−４０のカ
ラム（径２５ｍｍ×長さ８００ｍｍ）に負荷した。
に１０ｍｌの２４％トリクロロ酢酸を加えてよく混合
し、６０分静置した。次に３０００×ｇ、１０分間の遠
心分離を行い、上澄液を得た。本上澄液１０ｍｌを予め
水で平衡化させたＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−４０のカ
ラム（径２５ｍｍ×長さ８００ｍｍ）に負荷した。
【００３０】このカラムに水を線速９．２ｃｍ／ｈｒの
流速で供給し、溶出液を１５ｍｌずつ分取した（表
３）。各々のフラクションについて、２８０ｎｍ吸光
値、乳糖、尿素−アンモニア量を測定し、溶出図形（図
５）を得た。
流速で供給し、溶出液を１５ｍｌずつ分取した（表
３）。各々のフラクションについて、２８０ｎｍ吸光
値、乳糖、尿素−アンモニア量を測定し、溶出図形（図
５）を得た。
【００３１】
【表３】
【００３２】排除画分（フラクションＮｏ．８）に乳糖
と２８０ｎｍの微少なピークが溶出し、続いて、乳糖の
大きなピークが溶出し、このピークの後半に重なって２
８０ｎｍの大きなピークが溶出し、最後に尿素−アンモ
ニアのピークが溶出した。
と２８０ｎｍの微少なピークが溶出し、続いて、乳糖の
大きなピークが溶出し、このピークの後半に重なって２
８０ｎｍの大きなピークが溶出し、最後に尿素−アンモ
ニアのピークが溶出した。
【００３３】従って、本対照例では乳糖とＮＰＮ画分を
分離することが不可能であることが立証された。
分離することが不可能であることが立証された。
【００３４】［実施例２］７５％電気透析脱塩ホエイ１
００ｌに９９．５％エタノール１００ｌを添加し、混合
撹拌した後、生成した沈澱をクラリファイアーで除去し
た。上澄液を１０ｌに濃縮し、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈ
Ｗ−４０のステンレス製カラム（径４０ｃｍ×長さ１０
０ｃｍ）に負荷した。
００ｌに９９．５％エタノール１００ｌを添加し、混合
撹拌した後、生成した沈澱をクラリファイアーで除去し
た。上澄液を１０ｌに濃縮し、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈ
Ｗ−４０のステンレス製カラム（径４０ｃｍ×長さ１０
０ｃｍ）に負荷した。
【００３５】このカラムに５０％エタノールを１０ｃｍ
／ｈｒの線速で供給し、溶出液を示差屈折計（東ソー
社、ＲＩ−８０１０）と紫外検出器（東ソー社、ＵＶ−
８０１０）でモニターした。乳糖以後の画分１４６ｌを
集め、噴霧乾燥した。得られた粉末は、乳糖を含まず、
全固形分当り８２．４％（Ｎ×６．３８）のＮＰＮを含
有していた。
／ｈｒの線速で供給し、溶出液を示差屈折計（東ソー
社、ＲＩ−８０１０）と紫外検出器（東ソー社、ＵＶ−
８０１０）でモニターした。乳糖以後の画分１４６ｌを
集め、噴霧乾燥した。得られた粉末は、乳糖を含まず、
全固形分当り８２．４％（Ｎ×６．３８）のＮＰＮを含
有していた。
【００３６】
【発明の効果】本発明を用いれば、ＮＰＮを極めて簡便
な方法で高純度に精製することが可能である。本発明で
得られるＮＰＮは、高純度であるために特定保健用食
品、医薬品、化粧品等に広範に用いることが可能であ
る。
な方法で高純度に精製することが可能である。本発明で
得られるＮＰＮは、高純度であるために特定保健用食
品、医薬品、化粧品等に広範に用いることが可能であ
る。
【００３７】また、本発明で使用する有機溶媒は一般に
水よりも低い温度で気化するために、本方法で精製した
ＮＰＮ成分を濃縮・噴霧乾燥する場合に用いるエネルギ
ーを節約することが可能である。また、蒸留塔の設備を
用いればＮＰＮの精製に用いた有機溶媒を回収して再使
用することが可能であり経済的効果も高い。
水よりも低い温度で気化するために、本方法で精製した
ＮＰＮ成分を濃縮・噴霧乾燥する場合に用いるエネルギ
ーを節約することが可能である。また、蒸留塔の設備を
用いればＮＰＮの精製に用いた有機溶媒を回収して再使
用することが可能であり経済的効果も高い。
【００３８】また、本発明で用いるゲル濾過担体は比較
的硬質のゲル濾過担体であり、溶出時に速い流速を負荷
することが可能であり、カラムを長くしても圧密化する
ことが少なく、操作方法が簡便なゲル濾過担体であるた
めに作業者に煩雑な操作を要求しない長所がある。
的硬質のゲル濾過担体であり、溶出時に速い流速を負荷
することが可能であり、カラムを長くしても圧密化する
ことが少なく、操作方法が簡便なゲル濾過担体であるた
めに作業者に煩雑な操作を要求しない長所がある。
【００３９】更に、本実施例で用いたＴｏｙｏｐｅａｒ
ｌ ＨＷ−４０は上述のゲル濾過担体の中でも極めて硬
質のゲル濾過担体であり、溶出時に速い流速を負荷する
ことが可能であり、カラムを長くしても圧密化すること
なく、かつ、スケールアップも容易である。従って、作
業者に煩雑な操作を要求しないばかりでなく、精製のた
めの時間の節約が可能であり、高度な精製が可能であ
り、工業化に適するという利点を有する。
ｌ ＨＷ−４０は上述のゲル濾過担体の中でも極めて硬
質のゲル濾過担体であり、溶出時に速い流速を負荷する
ことが可能であり、カラムを長くしても圧密化すること
なく、かつ、スケールアップも容易である。従って、作
業者に煩雑な操作を要求しないばかりでなく、精製のた
めの時間の節約が可能であり、高度な精製が可能であ
り、工業化に適するという利点を有する。
【００４０】また、本実施例で用いたＴｏｙｏｐｅａｒ
ｌ ＨＷ−４０は分取用の高速液体のクロマト装置中で
も使用可能であり、ＮＰＮの精製に要する時間を大幅に
短縮することが可能である。
ｌ ＨＷ−４０は分取用の高速液体のクロマト装置中で
も使用可能であり、ＮＰＮの精製に要する時間を大幅に
短縮することが可能である。
【図１】乳糖とＷＰＩプロテアーゼ分解物（ＮＰＮ）の
溶解性に及ぼすエタノールの濃度との関係を図示したも
のである。５％ＷＰＩプロテアーゼ分解物溶液（○）、
５％乳糖溶液（△）（これらはＮＰＮ成分のモデル系と
して用いた）のそれぞれにエタノールを終濃度が０〜９
０％となるように添加し、室温で３０分静置した後に３
０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行った。遠心分離前
の全懸濁液中の乳糖及びＷＰＩプロテアーゼ分解物に対
する遠心分離後上澄液中の乳糖及びＷＰＩプロテアーゼ
分解物の割合を計算し、上澄液中の回収率を溶解性の指
標とした。
溶解性に及ぼすエタノールの濃度との関係を図示したも
のである。５％ＷＰＩプロテアーゼ分解物溶液（○）、
５％乳糖溶液（△）（これらはＮＰＮ成分のモデル系と
して用いた）のそれぞれにエタノールを終濃度が０〜９
０％となるように添加し、室温で３０分静置した後に３
０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行った。遠心分離前
の全懸濁液中の乳糖及びＷＰＩプロテアーゼ分解物に対
する遠心分離後上澄液中の乳糖及びＷＰＩプロテアーゼ
分解物の割合を計算し、上澄液中の回収率を溶解性の指
標とした。
【図２】実施例１に示した５０％エタノール中でのＴｏ
ｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−４０ゲル濾過溶出図形である。
図中の○印は２８０ｎｍの吸光値を示した。これはペプ
チド中のチロシンやトリプトファンに由来する吸収であ
り、ＮＰＮ成分の一部の指標として用いた。図中の△印
はフェノール−硫酸法でヘキソースを発色させた時の４
９０ｎｍの吸光値を示した。これは乳糖の指標として用
いた。図中の▽印は尿素−アンモニアＦ−キット（ベー
リンガーマンハイム社）で測定した尿素−アンモニア濃
度を３４０ｎｍの比吸光値で示した。
ｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−４０ゲル濾過溶出図形である。
図中の○印は２８０ｎｍの吸光値を示した。これはペプ
チド中のチロシンやトリプトファンに由来する吸収であ
り、ＮＰＮ成分の一部の指標として用いた。図中の△印
はフェノール−硫酸法でヘキソースを発色させた時の４
９０ｎｍの吸光値を示した。これは乳糖の指標として用
いた。図中の▽印は尿素−アンモニアＦ−キット（ベー
リンガーマンハイム社）で測定した尿素−アンモニア濃
度を３４０ｎｍの比吸光値で示した。
【図３】図２の実験において、ゲル濾過に供試前のサン
プルとフラクションNo.２２のサンプルのＴＳＫ−ｇｅ
ｌ Ｇ２０００ＳＷを用いたＨＰＬＣ溶出図形（１）を
図示したものである。
プルとフラクションNo.２２のサンプルのＴＳＫ−ｇｅ
ｌ Ｇ２０００ＳＷを用いたＨＰＬＣ溶出図形（１）を
図示したものである。
【図４】図２の各溶出フラクションのＴＳＫ−ｇｅｌ
Ｇ２０００ＳＷを用いたＨＰＬＣ溶出図形（２）を図示
したものである。図２に示したフラクションＮｏ．８，
１６，２２，３０の一部をＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ２０００
ＳＷを用いたＨＰＬＣに供した。溶出液に０．１Ｍ Ｎ
ａ2ＳＯ4，０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．８）を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でゲル濾過を行
い、溶出液を２３０ｎｍの紫外吸収でモニターし、溶出
液図形（１）、（２）を得た。
Ｇ２０００ＳＷを用いたＨＰＬＣ溶出図形（２）を図示
したものである。図２に示したフラクションＮｏ．８，
１６，２２，３０の一部をＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ２０００
ＳＷを用いたＨＰＬＣに供した。溶出液に０．１Ｍ Ｎ
ａ2ＳＯ4，０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．８）を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でゲル濾過を行
い、溶出液を２３０ｎｍの紫外吸収でモニターし、溶出
液図形（１）、（２）を得た。
【図５】対照例１に示した水中でのＴｏｙｏｐｅａｒｌ
ＨＷ−４０ゲル濾過溶出図形を図示したものである。
図中の各記号は図２に示したものと同じである。
ＨＷ−４０ゲル濾過溶出図形を図示したものである。
図中の各記号は図２に示したものと同じである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/17 8413−4Ｃ 31/195 8413−4Ｃ 31/70 8314−4Ｃ 37/02 8314−4Ｃ (72)発明者 高 野 耕 次 東京都東村山市栄町１−21−３ 明治乳業 株式会社中央研究所内 (72)発明者 桑 田 有 東京都東村山市栄町１−21−３ 明治乳業 株式会社中央研究所内 (72)発明者 山 本 良 郎 東京都東村山市栄町１−21−３ 明治乳業 株式会社中央研究所内
Claims (7)
- 【請求項１】 非蛋白態窒素成分（以下、ＮＰＮと略す
るときもある）含有原料を粉末の場合には有機溶媒を含
む溶媒に懸濁・溶解し、溶液の場合には有機溶媒を含む
溶媒を添加して、不溶物及び／または生じた沈澱を除去
した後に有機溶媒を含む溶媒中でゲル濾過を行うことを
特徴とする非蛋白態窒素成分の精製法。 - 【請求項２】 使用する有機溶媒の濃度が、５〜９５
％、好ましくは４０〜７５％、さらに好ましくは５０％
であることを特徴とする請求項１記載の非蛋白態窒素成
分の精製法。 - 【請求項３】 使用する有機溶媒がエタノールであるこ
とを特徴とする請求項１記載の非蛋白態窒素成分の精製
法。 - 【請求項４】 使用するゲル濾過用充填剤の球状蛋白質
の分画範囲が１０4ダルトン以下であり、有機溶媒の使
用に耐え得ることを特徴とする請求項１記載の非蛋白態
窒素成分の精製法。 - 【請求項５】 非蛋白態窒素成分含有原料が、牛乳や山
羊乳等の獣乳、それらの濃縮物及びそれらの粉末；脱脂
乳、その濃縮物及びその粉末；ホエイ、その濃縮物及び
その粉末；牛乳や山羊乳等の獣乳、脱脂乳もしくはホエ
イの電気透析脱塩物、その濃縮物及びその粉末；ホエイ
の限外濾過処理で得られた透過液、及び透過液から乳糖
製造時副産物として得られる母液、その濃縮物及びその
粉末からなる群から選ばれるものであり、必要があれ
ば、濃縮物の場合は希釈し、また粉末の場合には溶解す
ることを特徴とする請求項１記載の非蛋白態窒素成分の
精製法。 - 【請求項６】 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記
載の精製法によって得られた非蛋白態窒素成分含量が高
く、乳糖含量が低い精製された非蛋白態窒素成分。 - 【請求項７】 請求項６記載の精製された非蛋白態窒素
成分を濃縮及び／または粉末化してなる精製された非蛋
白態窒素成分。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4121053A JPH05292879A (ja) | 1992-04-16 | 1992-04-16 | 牛乳に含まれる非蛋白態窒素成分の精製法及び 精製物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4121053A JPH05292879A (ja) | 1992-04-16 | 1992-04-16 | 牛乳に含まれる非蛋白態窒素成分の精製法及び 精製物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292879A true JPH05292879A (ja) | 1993-11-09 |
Family
ID=14801672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4121053A Pending JPH05292879A (ja) | 1992-04-16 | 1992-04-16 | 牛乳に含まれる非蛋白態窒素成分の精製法及び 精製物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05292879A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001300293A (ja) * | 2000-04-25 | 2001-10-30 | Nipro Corp | 無機無水物または有機無水物の製造法 |
| WO2019131497A1 (ja) * | 2017-12-25 | 2019-07-04 | 株式会社 明治 | 脱脂粉乳 |
-
1992
- 1992-04-16 JP JP4121053A patent/JPH05292879A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001300293A (ja) * | 2000-04-25 | 2001-10-30 | Nipro Corp | 無機無水物または有機無水物の製造法 |
| WO2019131497A1 (ja) * | 2017-12-25 | 2019-07-04 | 株式会社 明治 | 脱脂粉乳 |
| JPWO2019131497A1 (ja) * | 2017-12-25 | 2020-12-10 | 株式会社明治 | 脱脂粉乳 |
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