JPH05503423A

JPH05503423A - Ｄｎａ切断用核酸酵素

Info

Publication number: JPH05503423A
Application number: JP3503580A
Authority: JP
Inventors: ジョイス　ジェラルド　エフ
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1991-01-11
Publication date: 1993-06-10
Also published as: EP0594584A4; US6194180B1; WO1991010674A1; EP0594584A1; AU7225591A; US20020081666A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ切断用核酸酵素産業上の利用分野本発明は、ＤＮＡを切断する核酸酵素に関する。

背景技術遺伝子の中には、非コードＤＮＡによって分断されるコード配列を育するものがある。これらの非コード配列はイントロンと呼ばれる。これらの遺伝子から成熟した転写物を得るには、−次ＲＮＡ転写物（前駆体ＲＮＡ）にＲＮＡスプライシングと呼ばれる切断一連結反応が起こらなければならない。このＲＮＡスプライシングにより、ポリペプチドコードメツセンジャーＲＮＡ　ＣｍＲＮＡ）の成熟転写物、リポソームＲＮＡ、またはトランスファーＲＮＡ　（ｔＲＮＡ）が生スル。

イントロンはその構造や、それらが行うスプライシング反応のタイプに基づいて４つのカテゴリー（グループＩ、■、■および■）に分類される。

本発明にとって特に興味深いのは、グループＩのイントロンである。グループ■ のイントロンは、分子内ＲＮＡスプライシング反応を行い、タンパク質のコファクターを必要としない環状化を起こす。チェック（Ｃｅｃｈ）、５ｃｉｅｎｃｅ、２３６　：１５３２−１５３９　（１９８７）。

テトラヒメナ・サーモフィラス（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈ触媒することが報告されている。ザング（Ｚ　ａ　ｎ　ｇ）およびチェック（ＣｅｃｈＬＳｃｉｅｎｃｅ、２２９：１０６０−１０６４　（１９８５）；およびケイ（Ｋａｙ）およびイノウ−？−（Ｉｎｏｕｅ）、Ｎａｔｕｒｅ、３２７：３４３−３４６（＋９８７）　この配列特異的リン酸エステル交換反応は、ＲＮＡスプライシングとして知られている過程における前駆体ＲＮＡからのグループＩイントロンの除去および２個のエクソンの連結を誘導する。グループ■イントロンによって触媒されるスプライシング反応は、２段階のエステル交換メカニズムを介して進行する。この反応の詳細は、チェック（Ｃｅｃｈ）、２３６：１５３２ −１５３９（１９８７）に最近論評されている。

グループＩイントロンのスプライシング反応は、グループＩイントロン構造内の部位ヘゲアノシンまたはグアノシンヌクレオチドが結合することによって開始する。グアノシンの３′水酸基が５′スプライス部位を攻撃することによって、介在イントロン配列の５″末端にグアノシンが共育結合する。この反応で５°エクソンの３″末端にあるウリジンに新しい３°水酸基が生ずる。引き続いて、５゜エクソンが３′スプライス部位を攻撃し、スプライスされたエクソンと全長線状グループ■イントロンか生成する。

通常、グループＩイントロンはスプライシングに続いて環状化する。この環状化は、イントロンの５′末端付近の部位に３′末端グアノシンが攻撃することを含む第三のエステル交換反応を介して起こる。また、イノウニ（Ｉｎｏｕｅ）等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１８９：１４３−１６５　（１９８６）に報告されているように、グループＩイントロンはスプライス部位配列において配列特異的加水分解を起こす。この活性を利用して配列特異的にＲＮＡ基質を切断した報告がなされた。ザング（Ｚｕｎｇ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３２４　：　４２９−４３３　（１９８６）。

最近、グループ■イントロンの構造がジエイ・パーク（Ｂｕｒｋｅ）、Ｇｅｎｅ、７３：２７３−２９４　（１９８８）に報告された。この構造は、パーク（Ｂｕｒｋｅ）等、Ｎｕｃ］、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５．７２１７−７２２１　（１９８７）に報告されているようにＰｉ−Ｂ９と呼ばれる９個の塩基対領域によって特徴付けられている。イントロンが変性する条件下ではその触媒活性が減少することから明らかなように、このホールディング構造がグループＩイントロンの触媒活性に重要である。さらに、グループ■イントロンの基本的な塩基対領域を破壊する突然変異によって、その触媒活性が減少する。パーク（Ｂｕｒｋｅ）。

Ｇｅｎｅ、７３：２７３−２９４　（１９８８）、また、この領域における塩基対を回復するような補償的突然変異または二次部位突然変異で触媒活性が回復する。

ウィリアムソン（Ｗｉ　Ｉ　１　ｉ　ａｍｓ　ｏｎ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２　：１４６７２−１４６８２　（＋９８７）およびパーク（Ｂｕｒｋｅ）、Ｇｅｎｅ、７３　：　２７３−２９４　（１９８８）。

ＲＮＡを切断する活性を破壊することなしにグループＩイントロンから大きいヌクレオチドセグメントを除去する種々の欠失か報告された（第２図）。パーク（Ｂｕｒｋｅ）、Ｇｅｎｅ、７３　：　２７３−２９４　（１９８８）、しかし、大量の欠失を組み合わせる試みでは、活性および非活性両方のイントロンを生じた。

ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１７：７８７９（１９８９）。

今日まで、グループ■イントロンはＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡのいずれかを含む基質を切断することが示された。ザング（Ｚ　ｕ　ｎ　ｇ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２３１：４７０−４７５　（１９８６）：スギモト（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１７：３５５−３７１　（１９８９）；チェック（Ｃｅｃｈ）、５ｃｉｅｎｃｅ、２３６＋１５３２−１５３９　（１９８７）。５個のデオキシシトシンを含むＤＮＡはテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｂｙｍｅｎａ）ＩＶＳ、グループＩイントロンに対する切断基質とはならないことがゾーグ（Ｚ　ａ　ｕ　ｇ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２３１：４７０−４７５　（１９８６）によって示された。

とが分かった。

そこで、本発明は一本鎖内に存在する所定のヌクレオチド配列の３′末端で一本鎖ＤＮＡを切断する方法を提供する。少なくとも２０ミリモル濃度のＭｇＣｌ２が存在することを含むＤＮＡ切断条件下、有効量の本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼで一本鎖ＤＮＡを処理する。

また、本発明は、本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼ酵素、−末鎖ＤＮＡおよび２０ミリモル濃度より高い濃度のマグネシウムイオンを含む組成物に関その認識部位の３′末端に存在する第一スペーサー領域と、その第一スペーサー領域の３゛末端に存在するＢ３〔５°〕領域と、そのＢ３　（５’　）領域の３′ 末端に存在する第ニスペーサ−領域と、その第ニスペーサ−領域の３°末端に存在する第一ステムループと、その第一ステムループの３゛末端に存在する第二ステムループと、その第二ステムループの３゛末端に存在する第三スペーサー領域と、およびその第三スペーサー領域の３°末端に存在する第三ステムループとを有し、その第三ステムループが、Ｂ３　（５’　）領域にハイブリダイズしうるＢ３〔３°〕領域を規定するヌクレオチド配列により中断される５゛ステム分を含む。

第１図は、パネルＩＡ、１Ｂ、ＩＣおよび】Ｄにおいて、それぞれ４個の主要な前駆体ＲＮＡのスプライシングメカニズム、即ちグループＴセルフスプライシング、グループ■セルフスプライシング、核ｍＲＮＡスプライスソーマルおよびＲＮＡと会合してスブライスソームを形成している。小さな核リボヌクレオプロティンＵｌおよびＵ２の２個のみ示している。核ｔＲＮＡスプライシングについては、ダリア（Ｇｒｅｅｒ）等、ＴｌＢ５　９：１３９−４１（１９８４）に報告されている。

第２図では、Ｔ、サーモフィラス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　ｌａ）のブレｒＲＮＡイントロンの二次構造が３図に分けて示しである（第２Ａ−２Ｃ図）。これらの関係は各図の矢印で示されており、認識配列およびグループｒイントロン中もっとも保存性の高いコア領域が太字で示しである。種々の構造特性を示すのに使用した命名法は、パーク（Ｂｕｒｋｅ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５ニア２１７−７２２１　（１９８７）の標準的命名法に従った。９箇所の保存された塩基対領域、ＰＩ−Ｂ９および種々のループが示されている。ヌクレオチド配７から２８および９４から９５、Ｐ３　（５’　）領域はヌクレオチド９６から１０３、第ニスペーサ−領域はヌクレオチド１０４から１０６、第一ステムループはヌクレオチド１０７から２１４、第二ステムループはヌクレオチド２１５から２５８、第三スペーサー領域はヌクレオチド２５９から２６１および第三ステムループはヌクレオチド２６２から３１４に存在する。

第３図は、Ｔ、サーモフィラス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）のブレｒＲＮＡイントロンの一部を除いた種々の欠失を３図に分けて示しである（第３Ａ−３Ｃ図）。

これらの関係は各図の矢印で示されている。命名法は、パーク（Ｂｕｒｋｅ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５ニア２１７−７２２１　（１９１３７）の標準的命名法に従った。各欠失で除去されたヌクレオチドセグメントは、ギリシャ文字のデルタと除去された塩基対領域の数で示されている。欠失の組み合わせは、例えばデルタＰ２／９のように記されている。

第４図は、基質としてＧＧＣＣＣＵＣＵ、Ａ、ＵＡ、ＵＡ２　（Ｓｌ）、ｄ　（ＧＧＣＣＣＴＣＵ、Ａ、ＴＡ！ＴＡ）（Ｓ２）、またはｄ　（ＧＣ；ＣＣＣＴＣＴ、Ａ、ＴＡ、ＴＡ）（Ｓ３）を用いた野生型および。Ｐ９変異体テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）リボザイムのトランススプライシング活性を示している。

第５図は、オリゴヌクレオチド基質（Ｓ）と反応する能力に基づいたテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）リボザイム（Ｅ）の選択的増幅を示している。

上部：Ｌ−１２型のりポザイムは、相補的塩基対によりオリゴピリミジン含有ＲＮＡ基質に結合する。このリボザイムの３′末端のＧＱＮがピリミジン配列に続くホスホジエステル結合を攻撃し、基質の３′側部分がりポザイムの３′末端に移行する。中部・ＲＮＡ触媒反応産物は、ｃＤＮＡ合成を開始するのに使用するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする特定の部位を提供する。下部　Ｔ７プロモーターを含むプライマーがｃＤＮＡにハイブリダイズし、このプロモーターの第二鎖が完全なものとなることによってＤＮＡがＲＮＡに転写される。

第６図は、ＤＮＡ基質とのトランススプライシング反応を行う能力に基づくテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）リボザイムの構造変異体群の選択的増幅を示す。レーン１−３・基質無し、ＲＮＡ基質ＧＧＣＣＣＵＣＵ、Ａ、ＵＡ、ＵＡ、およびＤＮＡ基質ｄ　（ＧＧＣＣＣＴＣＴ、Ａ、ＴＡ、ＴＡ）を用いたトランススプライシング。レーン４−５　：　ｈランススプライシング産物の選択的ｃＤＮＡ合成。レーン６−８：連続する転写および逆転写サイクル後の選択物質の増幅。

物質は５％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル電気泳動で分離さね、そのオートラジオグラムが示されている。

発明の詳細な説明Ａ、酵素本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼは、−末鎖ＤＮＡ基質を切断しつる。

一般に、エンドデオキシリボヌクレアーゼは、一本ｆｉＲＮＡ基質または切断部位にチミンではなくウラシルを含む修正ＤＮＡ基質も切断しつる。

リポザイムという言葉は、酵素として機能しうるＲＮＡ含有核酸を記述するのに使用される。リボザイムには、本発明のエンドリボヌクレアーゼおよびエンドデオキシリボヌクレアーゼが含まれる。

本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼは、ＲＮＡ、修正ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡポリマー、修正ＲＮＡ−ＤＮＡポリマー、修正ＤＮＡ−ＲＮＡポリマー、または修正ＲＮＡ−修正ＤＮＡポリマーでもよい。ＲＮＡはリボース糖およびその１′部位に塩基としてアデニン、グアニン、ウラシルまたはシトシンを含むヌクレオチドを含む。修正ＲＮＡには、リポース糖と、塩基としてアデニン、チミン、グアニンまたはシトシン、場合によってはウラシルとが含まれている。ＲＮＡ −ＤＮＡポリマーには、リポース糖を含むヌクレオチドおよび、デオキシリボース糖と、その糖のｌ°炭素に結合する塩基としてアデニスチミスおよび／またはウラシル、グアニンまたはシトシンとを含むヌクレオチドが含まれている。

修正ＲＮＡ−ＤＮＡポリマーには、修正ＲＮＡ、ＤＮＡ、および場合によってはＲＮＡが含まれている。修正ＤＮＡは、デオキシリポース糖を含むヌクレオチドおよび、塩基としてアデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、および場合によりチミンを含むヌクレオチドを含む。修正ＤＮＡ−ＲＮＡポリマーには、修正ＤＮＡ、ＲＮＡ、および場合によってはＤＮＡが含まれる。修正ＲＮＡ−修正ＤＮＡポリマーには、修正ＲＮＡ−修正ＤＮＡ、および場合によってはＲＮＡおよびＤＮＡが含まれる。

本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼは、所定の塩基配列の３′でＤＮＡを切断しうる。さらに、本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼは、そのヌクレオチド配列の５°末端に接続または隣接する認識部位を規定するヌクレオチド配列と、その認識部位の３゛末端に存在する第一スペーサー領域と、その第一スペーサー領域の３′末端に存在するＰ３〔５°〕領域と、そのＰ３〔５°〕領域の３゛末端に存在する第ニスペーサ−領域と、その第ニスペーサ−領域の３″末端に存在する第一ステムループと、その第一ステムループの３°末端に存在する第二ステムループと、その第二ステムループの３゛末端に存在する第三スペーサー領域と、およびその第三スペーサー領域の３゛末端に存在する第三ステムループであって、Ｐ３　（５’　）ｆｆｌ域にハイブリダイズしうるＰ３　（３’　）領域を規定する５°ステム部分を含む第三ステムループとによって特徴付けられる。

本発明のエンドデオキソリボヌクレアーゼの認識部位には、そのエンドデオキシリボヌクレアーゼに高い配列特異性を提供する基質該酸内の相補的な塩基配列にハイブリダイズしつる少なくとも２から約８個、好ましくは約４から７個の塩基が含まれる。例えば、認識部位塩基配列５″−〇〇ＡＧＧ−３’を育する本発明のエンドデオキソリボヌクレアーゼは、−末鎖ＤＮＡ基質内に存在する塩基配列５’　−ＣＣＣＴＣＴ−３’　を認識しつる（実施例２）。また、同様の認識部位によってエンドデオキシリボヌクレアーゼは、高い配列特異性をもって修正ＤＮＡを切断しつる（実施例２）。

認識部位に存在する塩基が切断を起こす塩基配列を決定する。基質核酸の切断は認識部位とハイブリダイズする基質ヌクレオチド配列のすぐ３″で起こる。この切断て基質切断配列上に３′　ヒドロキシル基および元の基質中の基質切断配列のすぐ３′側にあったヌクレオチド上に５′　リン酸基が生ずる。切断部位は、認識配列（インターナルガイドシーケンス）に存在する塩基を変えることにより変更できる。マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８６　：９２１８−９２２２　（＋９８９）。（本明細書中のすべての文厭は参考としてここに含める。）　さらに、ポリアミンが存在するなら認識部位中にいかなる塩基の組み合わせも使用しうる。例えば、ドーナ（Ｄｏｕｄｎａ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：５１９−５２２（＋９８９）番孔一般に、ポリアミンにはスペルミジン、パトレシンまたはスペルミンが使用される。

約５ｍＭ濃度のスペルミジンが前動であることが示された。又、認識部位は、分離した核酸、つまりエンドデオキシリボヌクレアーゼの残りの部分に共有結合していない外部認識部位としても提供しうる。外部認識部位がエンドデオキシリボヌクレアーゼに特異的塩基配列の切断を指令しうることがドーナ（Ｄｏｕｄｎａ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：５１９−５２２　（１９８９）に報告されティる。外部認識部位を使用する場合、それとともに使用するエンドデオキシリボヌクレアーゼには認識部位は含まれないか、Ｐ３　（５’　）領域、第ニスペーサ− 領域、第一ステムループ、第二ステムループ、第三スペーサー領域およびＰ３　（５’　）領域にハイブリダイズしうるＰ３〔３″〕領域を規定する５゛ステム分を含む第三ステムループが含まれる。

外部認識部位とともに本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼを使用すると、外部認識部位配列を変えるだけで標的配列を変えることが出来る。本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼと種々の外部認識配列を使用すると、外部認識配列でコードされる種々の塩基配列の各所で基質核酸を切断することが出来る。

一般に、第一スペーサー領域には、長さ約３−約７塩基、好ましくは約５塩基のヌクレオチド配列が含まれる。第一スペーサーを構成しているヌクレオチドは配列５′−ＮＮＮＮＡ−３’　（Ｎは、その位置におけるいずれかのヌクレオチドを示す）を有していることか望ましい。第一スペーサー領域は、配列５°　−ＡＡＣＡＡ−３′で規定されることが更に好ましい。

他の好ましい態様における第一スペーサー領域には二つのスペーサーステムループを規定するヌクレオチドが含まれる。第一スペーサ−ステムループは、２５ヌクレオチド長、および第ニスペーサ−ステムループは、３６塩基長であることが望ましい。また、第一スペーサ−ステムループは、塩基配列〉５’　−ＡＧＵＵＡＣＣＡＧＧＣＡＵＧＣＡＣＣＬＩＧＧＵＡＧＵＣＡ−３’を、また第ニスペーサ−ステムループは、塩基配列：５’　−ＧＵＣＵＵＵＡＡＡＣＣＡＡＵＡＧＡＵＩＪ−ＧＧＡＵＣＧＧＵＵＬＩＡＡＡＡＧＧＣ−３’を有することが更に好ましい。

ステムループとは、それ自身上でホールディングしたヌクレオチド配列により形成される二次構造である。ステムループには、Ｐ（５°）の３゛に存在し、３塩基対セグメント（Ｐ〔３″〕）と呼ばれるヌクレオチド配列にハイブリダイズしうる、５゛塩基対セグメント（Ｐ〔５″〕）と呼ばれる５′　ヌクレオチド配列部分が含まれる。ステムループにおいてＰ　Ｃ５’　）とＰ　Ｃ３”　Ｅはループと呼ばれるヌクレオチド配列で連結されている。Ｐ　（５’　）とＰ　（３’ 　）はハイブリダイズして核酸二本鎖を形成する。Ｐ　（５’　）とＰ　［３’ 　）によって形成された核酸二本鎖は完全な二本鎖である必要はなく、ステムループの外側の配列と塩基対を形成しているか、または形成していない一連のヌクレオチドが含まれる。

好ましい態様のＰ３　Ｃ５’　）領域は、８個のヌクレオチドの配列を育する。

このＰ３　（５’　）領域に存在する８個のヌクレオチドは、Ｐ３　（５’　）領域がＰ３Ｃ３′〕領域とハイブリダイズし、第２図に示した第三塩基対セグメント、Ｐ３を形成しつる限りとのようなヌクレオチドでもよい。Ｐ３　（５’　）　ｉ域およびＰ３（３’）ＩＷ域によるＰ３の形成は、ジョン・パーク（Ｊｏｈｎ　Ｂｕｒ’ｋｅ）。

Ｇｅｎｅ、７３　：　２７３−２９４　（＋９８８）ｊ：概説されテいルヨウニ触媒活性に必須である。

Ｐ３〔５°）は、ヌクレオチド配列５’　−ＧＡＣＣＧＵＣＡ−３’　を育しテいることがより好ましい。しかし、Ｐ３〔５°〕領域ヌクレオチド配列は、Ｐ３が形成しうるか、もしくはウィリアムソン（Ｗｉ　１１　ｉ　ａｍｓ　ｏｎ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２：１４６７２−１４６８２　（１９８７）に示されているようにＰ３　（３’　）領域ヌクレオチド配列の補償的変化がある場合には変化させることが出来る。

好ましい態様の第ニスペーサ−領域は、約３ヌクレオチド長である。一般に、このスペーサーを含むリポザイムか望ましい触媒活性を保持するかぎり、この第ニスペーサ−の３個のヌクレオチドはどのようなものでもよい。

この第ニスペーサ−領域は、ヌクレオチド配列５″−ＡＡＵ−３’　を有することが更に好ましい。しかし、この配列は、望ましい触媒活性が保持されるかぎり変化させることが出来る。

好ましい態様の第一ステムループのヌクレオチド長は、約１０８である。この第一ステムループは、第２図のヌクレオチドＩ　０７−２１４に対応することが更３°　に好ましい。この第一ステムループの１０個の５′末端ヌクレオチド（第２図の（ヌクレオチド１０７−１１７）および１０個の３°末端ヌクレオチド（第２図のＩ■　ヌクレオチド２０４−２１４）は既知触媒機能にもっとも重要である。例えば、【　ジョン　パーク（Ｊｏｈｎ　Ｂｕｒｋｅ）、Ｇｅｎｅ、７３：２７３−２９４’　（１９８８）。

【　別の好ましい態様の第一ステムループの長さは、約３９ヌクレオチドである。

［この第一ステムループは、第２図のヌクレオチド１０７−１２６および１９６ −２１４に対応し、ヌクレオチド１２６が直接ヌクレオチド１９Ｇに結合しているものであることがより好ましい。

別の好ましい態様の第一ステムループの長さは、２ｏヌクレオチドである。この第一ステムループは、第２図のヌクレオチド１０７−１１６およびヌクレオチド２０５−２１４に対応し、ヌクレオチド１１６が直接ヌクレオチド２０５に結合しているものであることがより好ましい。

好ましい態様の第二ステムループの長さは、約４４ヌクレオチドである。この第二ステムループは、第２図のヌクレオチド２１５−２５８に対応することがより好ましい。５′末端の５個のヌクレオチド（第２図のヌクレオチド２１５〜２１９）および３°末端の５個のヌクレオチド（第２図のヌクレオチド２５４−２５８）は既知の触媒活性機能にもっとも重要である。例えば、ジョン　パーク（Ｊｏｈｎ　Ｂｕｒｋｅ）、Ｇｅｎｅ、７３：２７３−２９４　（１９８８）。

別の好ましい態様の第二ステムループの長さは、約２５ヌクレオチドである。

この第二ステムループは、実質的に第２図のヌクレオチド２＋５−２２７およびヌクレオチド２４７−２５８に対応し、ヌクレオチド２２７が直接ヌクレオチド２４７に結合しているものであることがより好ましい。別の好ましい態様の第二ステムループの長さは、約９ヌクレオチドである。この第二ステムループは、実質的に第２図のヌクレオチド２１５−２２０およびヌクレオチド２５５−２５８に対応し、ヌクレオチド２２０が直接ヌクレオチド２５６に結合しているものであることがより好ましい。

好ましい態様の第三スペーサー領域の長さは約３ヌクレオチドである。この第三スペーサー領域は第２図のヌクレオチド２５９−２６１に対応することがより好ましい。触媒活性が保持されるかぎりヌクレオチドの変化か可能である。例えば、ウィリアムソン（Ｗｊ　Ｉ　Ｉ　ｉ　ａｍｓ　ｏｎ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２６２：１４６７２−１４６８２　（１９８７）参照。ここでは、ヌクレオチド部位２５９かＡに、ヌクレオチド２６１がＣに変化しているが、スプライシング活性は保持されている。部位２６０のヌクレオチド（＊　２　ＩＮ）が、Ｇ、　ＡまたはＵに変化しても望ましい触媒活性は保持されるという報告がある。ジョン・パーク（Ｊｏｈｎ　Ｂｕｒｋｅ）、　Ｇｅｎｅ、　７３：２７３−２９４　（１９８８）、好ましい態様の第三ステムループの長さは約５１ヌクレオチドである。これらの５１個のヌクレオチドは、Ｐ３　（５’　）　ｉＷ域にハイブリダイズしうるＰ３　Ｃ３’　）領域を規定する５゛ステム分、ループおよび３゛ステム分に分けられる。Ｐ３〔３°〕領域の長さは約８ヌクレオチドであることが望ましい。しかし、Ｐ３〔３゛〕の長さはＰ３　（５’　）の長さに応じて変化させることが８来る。Ｐ３［３′〕領域は、第三ステムループの５゛末端から約１０ヌクレオチドのところから始まることが好ましい。

この第三ステムループの長さは５ヌクレオチドで、これらのヌクレオチドが実質的に第２図のヌクレオチド２６２−３１２に対応することがより好ましい。Ｐ３　（３’　）ＩＮ域の長さは約８ヌクレオチドで、これらのヌクレオチドか実質的に第２図のヌクレオチド２７＋−２７８に対応することが望ましい。欠失、突然変異、復帰突然変異および挿入を含む変化か第三ステムループおよびＰ３　Ｃ３’　）領域に起こり、カリ望ましい触媒活性が維持されることがある。例えば、パーク（Ｂｕｒｋｅ）等、Ｃｅ］］、４５：］］６７−１７６（１９８６）およびウィリアムソン（Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｉ　ａｍｓ　ｏｎ）等、Ｊ、ＢｉｏＬ　Ｃｈｅｍ、、２６２　：　１４６７２−１４６８２　（１９８７）参照。ここでは、ヌクレオチド２６６が６に変化し、かつヌクレオチド３０９がＣに変化する補償的突然変異が起きているが、望ましい触媒活性は保持されている。ヌクレオチド２６８のＣへの変化同時にヌクレオチド３０７のＣへの変（Ｌおよびヌクレオチド２６８のＵへの変化、並びにヌクレオチド３０７のＡへの変化も望ましい触媒活性か維持されることが示る。ヌクレオチド３０１のＣへの変化（第２図）、３０２の６への変イＩＺ、　３０３のＣへの変化はエステル転移活性を失活させるが、部位特異的切断またはＧＴＰ結合活性を失活させることはない。ウィリアムソン（Ｗｉ　ｌ　Ｉ　ｉ　ａｍｓ　ｏｎ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２　：１４６７２−１４６８２　（１９８７）参照。

ヌクレオチド２９６および２９８の補償的変化を伴うヌクレオチド２８０および２８２（第２図）の変化は、ジョン・パーク（Ｊｏｈｎ　Ｂｕｒｋｅ）、Ｇｅｎｅ、７３：’２７３−２９４　（１９８８）に報告されているように望ましい触媒活性を保持する。これらの突然変異は所定の２次構造を維持しており、同様の突然変異も目的の触媒活性を維持することが期待される。

ヌクレオチド１００および１０２の補償的変化を伴う、Ｐ３〔３°〕領域中ヌクレオチド２７２および２７４（第２図）の変化が起きても、目的の触媒活性は維持される。ウィリアムソン（Ｗｉ　Ｉ　］　ｉ　ａｍｓｏｎ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２：１４６７２−１４６８２　（１９８７）およびイノウ− ｒ−ＣＩｎ。

ｕｅ）等、Ｃｅ１ｌ、４３：４３１−４３７　（１９８５）参照。ステムループ、塩基対またはスペーサーなど特定の二次構造か維持されるかぎり、上述の変化と同様の変化は目的の触媒活性を維持するであろう。

また、本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼは、第三ステムループの３′末端に付加的なステムループを含むことが出来る。この付加的ステムループには目的の触媒活性が維持されるかぎり、どのような数のループも含むことができる。

この付加的ステムループは、実質的に′Ｍ２図のヌクレオチド３１６−４０２に対応するヌクレオチド配列を育することが好ましい。

好ましい態様において、本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼは、上述の突然変異を一つ以上含むことか出来る。一般に、これらの欠失はステムループ、Ｐ３　（５’　）、　Ｐ３　（３’　）　、スペーサー領域または認識配列のヌクレオチド配列の長さを変化させるか、またはその配列を修正する。一つの触媒的に活性なエンドデオキシリボヌクレアーゼの突然変異か別の触媒的に活性なエンドデオキシリボヌクレアーゼの変異と組み合わさって、両方の突然変異を含む新しいエンドデオキシリボヌクレアーゼを生ずることもある。

別の好ましい態様における本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼは、当分野でよく知られている種々の方法で導入されるランダムまたは限定された突然変異を有してもよい。例えば、ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋７：７１１−７１２　（１９８９）にＮ告されている方法には、二本鎖のコード鎖の切断、変異性オリゴヌクレオチドによるテンプレート鎖の再構築、および部分的にミスマツチしたテンプレートの転写が含まれる。このことで、所定の部位に既知のまたはランダムなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド含ませることにより、分子内のいずれかの部位に規定のまたはランダムな変異を導入することが出来る。別に、逆転写反応において、ＴＴＰの代わりに５ −Ｂｒ　ｄＵＴＰを用いることによりエンドデオキシリボヌクレアーゼに突然変異を導入することが出来る。５−ＢｒｄＵは、“ワブル（ｗｏｂｂｌｅ）’位置のｄＧ並びに標準的ワトランークリック位置のｄＡと塩基対を作ることが出来、この事は、ＡからＧ、およびＧからＡへのトランジションを可能にする。同様に、転写反応において、ＵＴＰの代わりに５−Ｂｒ　ＵＴＰを使用すると、引き続＜ＲＮＡ合成においてＣからＵおよびＵからＣへのトランジションが起こる。

Ｂ　方法本発明の方法は、−重鎖ＤＮＡ、修正ＤＮＡ、ＲＮＡおよび修正ＲＮＡを含む一本鎖核酸を切断するのに前動である。この−末鎖核酸は、本発明の酵素かその認識配列により基質切断配列にハイブリダイズできるように基質切断配列またはその近傍で一本鎖でなければない。

本発明の方法により切断される一本鎖核酸は、化学的に合成されたもの、酵素的に合成されたもの、またはファージ、ウィルス、または植物細胞、真核細胞、酵母細胞および細菌細胞を含む種々の細胞から単離されたものである。化学的に合成された一本鎖核酸は、リサーチ・ジエネティクス（ハンッピル、アラバマ）を含む種々の業者から市販されている。Ｍ＋３クローニングベクターなどの一本鎖ファージは、メンング（Ｍｅ　ｓ　ｓ　ｉ　ｎｇ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７４　：３６４２−３６４６　（１９７７）およびヤナッンユーぺ口−（Ｙａｎ　ｊｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｗ）等、Ｇｅｎｅ、３３：１０３− １１９（１９８５）に報告されている。−重鎖ファージを含む細菌細胞も適当な一本鎖ＤＮＡの単離源となる。パルボウイルス等の一本ｌＤＮＡウイルスまたは肝炎ウィルス等の部分的一本ｌＤＮＡウイルスなどのウィルスは、本発明の方法で切断しうる一本ｆｉｌｌＤＮＡを提供する。本発明の方法で切断しつる一本鎖ＤＮＡは、ピコルナウィルス、トガウィルス、オルソミクトウイルス、バラミクトウイルス、ラブドウィルス、コロナウィルス、アレナウイルス、またはレトロウィルス等のＲＮＡウィルスによっても提供される。

本発明の方法は、真核、原核、植物、哺乳類、酵母または細菌細胞を含む細胞内に存在する一本鎖核酸に使用できる。このような条件下、本発明の方法は、抗ウィルス剤、または遺伝子発現の調節剤として使用しうる。

本発明の方法は、所定の塩基配列の３゛末端で一本鎖ＤＮＡを切断する。この所定の塩基配列または基質切断配列には２から８個のヌクレオチドが含まれる。

この方法を用いると、このエンドデオキシリボヌクレアーゼの認識配列を修正することによりいかなるヌクレオチド配列も切断可能となる。この事はその位置に制限エンドヌクレアーゼ部位を持たない一本１ｇＤＮＡを切断することを可能にし含む一本１ｇＤＮＡが生ずる。さらに、この切断はエンドデオキシリボヌクレアーゼ酵素と元の一本１ＤＮＡ基質の残りを結合する。この切断反応およびその産物は、ジープ（Ｚ　ａ　ｕ　ｇ）およびチェック（Ｃｅｃｈ）、５ｃｉｅｎｃｅ、２３１：４７０−４７５　（１９８５）およびＴ、　Ｒ，チェック（Ｃｅｃｈ）、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ、ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５９：　（１９９０）に報告されているテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）リボザイムによる切断反応および産物と同様である。本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼは、イノウニ（Ｉｎ。

ｕｅ）等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１８９：１４３−１６５　（１９８６）ｔ、：よりＲＮＡへのりボザイムの作用に関して述べられている位置における部位特異的切断と同様に、エンドデオキシリボヌクレアーゼの３′末端グアノシンに続くホスホジエステル結合における部位特異的加水分解により一本１ＤＮＡ基質の残りの部分から分離される。基質からのエンドデオキシリボヌクレアーゼの分離で、そのエンドデオキシリボヌクレアーゼによる別の切断反応が可能となる。

一本ｆｉＤＮＡをＤＮＡ切断条件下、有効量の本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼで処理する。このＤＮＡ切断条件には、少なくとも２０ｍＭ以上のＭｇＣｌ２の存在が含まれる。

エンドデオキシリボヌクレアーゼの有効量とは、一本ｌＤＮＡ内に存在する所定の塩基配列を切断するのに必要なエンドデオキシリボヌクレアーゼの量である。

エンドデオキシリボヌクレアーゼは、基質切断部位に対しｌ／１−１／２０のモル比で存在することか望ましい。この比は、使用する特定のＤＮＡ切断条件下の特定のエンドデオキソリボヌクレアーゼの処理時間および効率に依存して変化しつる。

一般に、処理には、水性溶液中での一本鎖ＤＮＡ、酵素およびＭｇＣ１ｘの混合によるＤＮＡ切断混合物の生成、およびＤＮＡ切断条件下、エンドデオキシリボヌクレアーゼが一本鎖ＤＮＡ中に存在する所定のヌクレオチド配列における一本鎖ＤＮＡを切断するのに十分な時間生成した混合物を維持することが含まれる。

エンドデオキシリボヌクレアーゼが一本鎖ＤＮＡを切断するのに必要な時間は、あらかじめ測定しておくことが望ましい。その時間は、約５分から約２４時間であるが、反応物の濃度や反応温度により変わるであろう。通常、この時間は、エンドデオキシリボヌクレアーゼが存在するいずれかの所定のヌクレオチド配列を切断するように約３０分から約４時間の間となる。

このＤＮＡ切断条件には、少なくとも２０ｍＭのＭｇ　ＣＩ　２の存在が含まれることが望ましい。一般に、ＤＮＡ切断条件には、約２０ｍＭから約１５０ｍＭのＭｇ　Ｃ］　２か含まれる。ＤＮＡ切断条件に含まれる至適ＭｇＣＬａ度は、所定のＭ　ｇ　Ｃｌ　１濃度において切断される一本ｌＤＮＡ量を測定することで決定される。当業者には、至適ＭｇＣＬ１１度が使用するエンドデオキシリボヌクレアーゼに依存して変化することか理解されよう。

ＤＮＡ切断条件には、約ｐＨ６，０から約ｐＨ９，０のｐＨ条件か含まれることか望ましい。当業者には、ＤＮＡ切断に使用するｐＨがエンドデオキシリボヌクレアーゼの活性構造を維持させつるかぎり、本発明の方法を広いｐＨ範囲で使用できることが理解できよう。活性構造を持つエンドデオキシリボヌクレアーゼは、所定のヌクレオチド配列のところで一本１ＪｉＤＮＡを切断しつる能力で容易に検出できる。ＤＮＡ切断条件には、約ｐＨ７，０から約ｐＨ８，０のｐＨ値が使用されることがより望ましい。また、約ｐＨ７，５のＤＮＡ切断条件が使用されることか最も望ましい。

ＤＮＡ切断条件には、約１５°Ｃから約６０゛Ｃの温度が含まれることか望ましく、さらに約３０°Ｃから約５６°Ｃの温度が含まれることがより望ましい。ＤＮＡ切断条件の温度は、特定の温度におけるエンドデオキシリボヌクレアーゼの切断速度および安定性によってのみ制約を受ける。もつとも望ましいＤＮＡ切断条件温度は、約３７°Ｃから約５０℃の範囲にある。

別の好ましい方法において、本発明はポリアミン存在下におけるＤＮＡ切断条件に関する。本発明を行うのに前動なポリアミンには、スペルミジン、パトレシン、スペルミンなとか含まれる。ポリアミンとしてはスペルミジンを使用し、その濃度は約１ｍＭから約１５ｍＭの範囲にあることが望ましい。また、約２ｍＭから約５ｍＭの濃度範囲のスペルミジンが存在するＤＮＡ切断条件がもつとも望ましい。

また、本発明は所定の活性を有する核酸の生産方法に関する。目的の活性は触媒活性であることか望ましい。

グループＩ核酸集団を変異条件で処理して、多様な変異核酸集団を生成する。

好ましい態様におけるグループＩ核酸集団は、少なくとも２個のグループＩ核酸から成り立っている。グループＩ核酸は、少なくともそのヌクレオチド配列の５ °末端に連続、または隣接する認識部位を規定する核酸、認識部位の３′末端に存在する第一スペーサー領域、第一スペーサー領域の３′末端に存在するＰ３〔５′〕領域、Ｐ３　（５’　）領域の３′末端に存在する第ニスペーサ−領域、第ニスペーサ−領域の３′末端に存在する第一ステムループ、第一ステムループの３′末端に存在する第二ステムループ、第二ステムループの３°末端に存在する第三スペーサー領域、および第三スペーサー領域の３′末端に存在し、かつＰ３（５’）領域にハイブリダイズしつるＰ３　（３’　）領域を規定する５゛ステム分を含む第三ステムループを育する核酸である。

好ましい態様における変異条件には、グループ■核酸内に所定の、またはランダムなヌクレオチド置換を誘導する条件か含まれる。典型的な変異条件の例には、本明細書の別の部分に述べられている条件およびジョイス（Ｊｏｙｃｅ）等、１７：７１１−７２２　（１９８９）およびジョイス（Ｊｏｙｃｅ）、Ｇｅｎｅ、Ｅ２：８３−８７　（１９８９）に述べられている方法が含まれる。

好ましい態様において、多様な変異核酸集団には全く同じ配列を持たない少九くとも２個以上の核酸分子が含まれる。

所定の活性を育する核酸が所定の活性を示す能力に基づいて多様な変異核酸身回から選択される。

好ましい態様における選択には、多様な変異核酸集団から所定の活性を有すイ変異核酸を物理的に分離する何らかの手段が含まれる。一般に、選択には、サイズによる分離、触媒活性の存在による分離および溶液中または固体マトリクスに固定した他の核酸へのハイブリダイゼーションによる分離が含まれる。所定の活性は、その活性を有する変異核酸がその活性によって何らかの様式でラベル化されるものであることが望ましい。例えば、その活性はエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性であり、その基質に変異核酸が作用することによりその変異核酸が基質に共有結合する。その共有結合によって変異核酸か選択される。

他の好ましい態様における所定の活性を有する変異核酸の選択には、ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）、Ｇｅｎｅ、８２：８３−８７　（＋９８９）に述べられている変異核酸の増幅が含まれる。

Ｄ１組成物本発明は、本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼ酵素、一本１ＪＤＮＡおよび２０ｍＭより高い濃度のマグネシウムイオンを含む組成物に関する。

エンドデオキシリボヌクレアーゼは、約０．０５ｇＭから約２ｍＭの濃度で存在することが望ましい。一般に、エンドデオキシリボヌクレアーゼは、エンドデオキシリボヌクレアーゼ対一本ｍＤＮＡが約１対５から約１対５０の濃度比で存在することが好ましい。さらに、エンドデオキシリボヌクレアーゼは約０．１μＭから約１μＭの濃度で存在することがより望ましい。また、エンドデオキソリボヌクレアーゼを約０．　１μＭから約０．５μＭの濃度で含む組成物がもっとも望ましい。

■　−重鎖ＤＮＡは、組成物中に約０．５μＭから約１０００μＭ存在することが８　望ましい。当業者には、合成りＮＡ、ファージＤＮＡ、変性二本ＭＤＮＡ、ウィルスＤＮＡおよび細胞ＤＮＡを含む多くの一重鎖ＤＮＡ＆があることが理解されな　よう。

組成物中のマグネシウムの濃度は、約２０ｍＭから約２００ｍＭの範囲にある醜　ことか望ましく、さらに、約２０ｍＭから約１５０ｍＭの濃度範囲にあることがより望ましい。当業者は、このマグネシウムイオン濃度が水性溶液におけるマグる　７　ネシウムの溶解度の限界および同組成物中に存在する活性構造のエンドブオキシイ　リボヌクレアーゼに必要とされる量によってのみ規定されることが理解されよう。

二　また、本発明は、本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼ酵素、一本！ＩＤＮ舌　Ａ、２０ｍＭより高い濃度のマグネシウムイオンおよびポリアミンを含む組成物さ　に関する。

ノ　ポリアミンはスペルミジン、バトレシン、またはスペルミンが望ましい。ポリを　アミンがスペルミジンであり、その濃度が約２ｍＭから約１０ｍＭの範囲にあることがより望ましい。

ζ　また、本発明は、本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼ酵素、第一の一本２　鎖ＤＮＡ、２０ｍＭより高い濃度のマグネシウムイオン、３′末端に水酸基を育する第二の一本ｌＤＮＡ分子、および５゛末端にグアニンヌクレオチドを有する第三の一本ｊＪＩＤＮＡ分子を含む組成物に関する。

また、本発明は、本発明のエンドデオキシリボヌクレアーゼ酵素、一本＠ＤＮＡ、および２０ｍＭより高い濃度のマグネシウムイオンを含む組成物であって、該 −重鎖ＤＮＡの長さが、エンドデオキシリボヌクレアーゼ酵素上に存在する認ｒ　識部位よりも長い組成物に関する。

実施例以下の実施例は本発明を説明するものであって、これを制限するものではない。

１、エンドデオキシリボヌクレアーゼの調製野生型および変異体リポザイムは、まず、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等、纒、ノヨン・ウィリー・アンド・サンズ版、ニューヨーク（１９８７）に述へられている標準的方法を用い、ジープ（Ｚ　ａ　ｕ　ｇ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７：９８２４　（＋９８８）に報告されているプラスミドＰＴ７−２１から４４３塩基対のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［ｒ制限エンドヌクレアーゼフラグメントを単離することにより生成した。

この４３３塩基対のフラグメントには、ダン（Ｄ　ｕ　ｎ　ｎ）等、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１６６：４７７−５３５　（１９８３）に報告されているＴ７プロモーターおよびビーン（Ｂｅｅｎ）等、Ｃｅ１ｌ、４７：２０７−２１６　（１９８６）に報告されているテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）ＩＶＳの残基２２−４１４および３゛テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）　エクソンの残基ニー２５が含まれている。このＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｆｆフラグメントを、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等、纏、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ版、ニューヨーク（１９８７）に述べられている標準的サブクローニング法を用い、あらかじめＥｃｏＲＴおよびＨｉｎｄｌｌｒで切断した、ヤニッシ・ベロー（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｗ）等、Ｇｅｎｅ、３３　：　１０３−１１９　（１９８５）に述べられているベクターと同様のＭ１３ベクター、Ｍ１３ｍｐ１８に挿入した。

生成したＭｌ　３Ｔ７Ｌ−２１ＤＮＡ構築物を、マニアチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　−Ｍａｎｎｕａｌ、コールドスプリングハーバ−ラボラトリーズ、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ（１９８９）に述べられている形質転換操作にしたがって大腸菌宿主細胞に形質転換した。Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇＹ、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等、纒、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ版、ニューヨーク（１９８７）に述べられている操作にしたがい、Ｍｌ　３Ｔ７Ｌ−２１形質転換細胞から、−重鎖ＤＮへを調製した。

この構築物の同定は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＴのクレノー（ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント（ベーリンガー・マツハイム・バイオケミカルズ、インデアナポリス、ＩＮ）およびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、７４　：５４６３−５４６７　（＋　９７７）に報告されているジデオキシヌクレオチド・ソーケンシング法を用いたＤＮＡシーケンシングで確認した。

野生型および変異体リボザイムは、ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）およびイノウニ（Ｉｎｏｕｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１７：７１１− ７２２　（１９８９）に述べられている方法の修正法を用いて直接−重鎮Ｍ１３Ｔ７Ｌ−２１ＤＮＡから調製した。この方法には、場合によっては一つ以上の変異オリゴデオキシヌクレオチドを含むテンプレート鎖の構築が含まれる。生成した部分ミスマツチ二本１１ＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて直接転写した。簡単にいうと、５倍モル過剰量のターミネータ−ポリヌクレオチドおよびミューチーターオリゴを５μｇの一本鎖Ｍｌ　３Ｔ７Ｌ−２１ＤＮＡおよびＨＣＩでｐＨ７，５に調整した２０ｍＭトリス〔ヒドロキシメチルコアミノメタン（トリス−ＨＣＩ）、５０ｍＭ　Ｎａ（ｌおよび２ｍＭ　ＭｇＣｌｘを含む溶液と混合した。この溶液を７０’Ｃに５分間推持し、ついで、４０分間かけて３０°Ｃまてゆっくり冷やした。この溶液に、最終濃度２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、５０ｒｎＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、２ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＩｍＭ　アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および各０．５ｍＭ　ｄＧＴＰ。

ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびｃｌｃＴＰ　（ｄＮＴＰ）とするのに十分な量の試薬とともに、１５ユニツトのＴ７ＤＮＡリガーゼ（Ｕ、Ｓ、バイオケミカルズ、クリーブランド、オハイオ）および７．５ユニツトの７４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕ、　Ｓ。

バイオケミカルズ）を添加した。この溶液を３７°Ｃで６０分間維持し、変異鎖の合成を完了させた。生成したＤＮＡはエタノール沈殿により精製し、変異体ＲＮＡの転写に使用した。

転写は、１８ｇの変異ＤＮＡ、２μＣｉ（α”Ｐ）ＧＴＰおよびダバンロー（Ｄａｖａｎ　］　ｏｏ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、、ＵＳＡ。

８１　：　２０３５−２０３９　（１９８４）で述べられているようニ調製した５０ＬニツトのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む混合物中ＣＩＯμｍ）で行い、パトラ−（Ｂｕｔｌｅｒ）およびチャンバレイン（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ）、Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、、２５７：　５７７２−５７７９　（１９８２）で最初に開発された操作に従って精製するか、もしくは、１０ｇｇの変異ＤＮＡ、４０μ Ｃｉ（’Ｈ）ＵＴＰおよび２，４００ユニツトのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む混合物中（４００μｍ）で行った。いずれの場合も、この転写混合物のなかには４０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１５　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２．１０ｍＭ　ジチオスレイトール、２ｍＭ　スペルミジン、および各１ｍＭ　ｄＮＴＰが含まれ、これを３７℃で９０分間インキュベートした。Ｔ７ＲＮＡポリラーゼをフェノールで抽出し、転写産物をエタノールで精製し總変異ＲＮＡを５％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル電気泳動、ゲルからの溶出、エタノール沈殿による精製およびセファデックスＧ−５０によるクロマトグラフィーによって単離した。

デルタＰ２変異体は、変異オリゴヌクレオチド０１（表１および第３図）を用いて調製した。部分ランダム化デルタＰ２変異体は、変異オリゴヌクレオチド０２（表１および第３刀を用いて調製し九デルタＰ５変異体は、変異オリゴヌクレオチド０３または０４（表Ｉおよび第３６を用いて調製した。デルタＰ５変異体は、変異オリゴヌクレオチド０５（表１および第３図）を用いて調製した。

デルタＰ５ｂ変異体は、変異オリゴヌクレオチド０６（表１および第３図）を用いて調製した。デルタＰ９変異体は、変異オリゴヌクレオチド０７（表１および第３図）を用いて調製した。

野生型およびデルタＰ９欠失を含むもの以外の変異ＲＮＡの３′末端は、オリゴヌクレオチド０８（表１および第３図）で規定し九デルタＰ９欠失を含む変異体は、３′エクソンの１０ヌクレオチドを含む転写物を生成するデルタＰ９変異オリゴで規定された。

表１ＯＸ）　５’−Ｔｊ−ゝＧＡＣＧＩ：、ＴαｒＴＧ買ＣＣごＣごｊＹＡＧＴＧ八Ｇ−３１へ２）　５’−ＴＩ’ＴＧＡＣＧＧＴＣＴトドＮ’ＮＣＣＣＴＣＣＴＡＴλＧＴＧｋＧ−’Ｊ　１０ｗ１）　５ｌ−ＴＧＣＧＴＧＧ？ｒλσｍｃｃｃＧ ωＧ−３１０４１５１−ＧにＡＣＴＴＧにＣＴＧＣＧＴ’ＧにＴＴＡＣＴＴ丁ＣＣＣにＣＡＡ−３１０５１５’−Ｔ’ＩＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＣＴ（？ｒＧにＣ−３０６１５’−ＴＣＴＧＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴ？’ＡＧＧＡＣＴＴＧＧ−３’０７）　５嘗−ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＡＣＧＡにＴＡＣＴＣＣＧＡＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＴ−３’０８）　５’−ＣＧＡＧＴＡＣＴＣＣ入入Ａ入Ｃ−３１３へ人工クソンｅすは、イノウニ（Ｉｎｏｕｅ）等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、。

１８９：１４３−１６５　（１９８６）に述べられているＲＮＡ触媒による部位特異的加水分解で除去した。簡単にいうと、ＲＮＡを５０ｍＭ　ＣＨＥＳ　（ｐＨ９゜０）およびｌ　ＯｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１２の存在下、４２°Ｃで１時間インキュベートした。

野生型および変異体ＲＮＡを５％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル電気泳動、ゲルからの溶出、およびデュポン・ネンソーブ（デュポン、ウィルミントン、ＤＥ）によるアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。このＲＮＡは、デルタＰ９欠失を含むものに対してドニス・ケラ−（Ｄｏｎ　ｉ　５−Ｋｅ　Ｉ　Ｉ　ｅ　ｒ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１５：８７８３− ８７９８　（１９８７）に述べられているＲＮａｓｅによる部分消化で３°末端からシーケンソングしたこと以外は、サンが−（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７４：５４６３−５４６７　（＋９７７）の方法の修正法を用い、ジデオキシヌクレオチドの存在下ＡＭＶｉ！転写酵素（ライフ・テクノロジー、ゲイサースバーグ、ＭＤ）を用いたプライマー伸長分析でシーケンシングした。

ＲＮＡ基質５’　−ＧＧＣＣＣＵＣＵＡＩ２−３’　は、ミリガン（Ｍｉ　１１　ｉ　ｇａｎ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、４：２５２７−２５３８（１９７７）の方法に従い、部分的−重鎖合成りＮＡテンプレートを用いたインビトロ転写により調製した。このテンプレートには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（部位−１７から＋１）とこれに続く一本鎖テンプレート配列３′−ＣＧＧＧＡＧ−ＡＴ、０−５″の両鎖が含まれている。これで、５’　 −ＧＧＣＣＣＵＣＵＡ、−３°ｆｆ１（ｎ＝９−１６）のラン・オフ転写物か得られる。この生成物を２０％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル電気泳動、ゲルからの溶出、デュポン・ネンソーブによるアフィニティークロマトグラフィーで分離し、ドニス・ケラ−（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅ目ｅｒ）等、ＮｕｃＩｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅｓ、。

１５：８７８３−８７９８　（１９８７）に述べられているＲＮａｓｅによる部分消化でシーケンシングした。配列５“　−ＧＧＣＣＣＵＣＵＡ、２−３”　を有するＲＮＡ基質を本実験を通じて使用した。

ＤＮＡ基質は、業者から購入するか（例えば、リサーチ・ジエネティクス、ハンツビル、ＡＬ）、または使用説明書に従いアプライド・バイオシステムズ（フォスターシティ−１ＣＡ）を用いて合成した。

Ｚ　エンドデオキシリボヌクレアーゼによる一本ｉ［ＤＮＡの切断３個の異なる基質を切断するデルタＰ９変異体および野生型リポザイムの能力を測定した。反応は、０．０２Ｍ　リボザイム、２．０μＭのＧＧＣＣＣＵＣＵＡ２ＵＡ２ＵＡ２　（Ｓｌ）、ｄ　（ＧＧＣＣＣＴＣＵ、Ａ、ＴＡ、ＴＡ）（Ｓ２）またはｄ　（ＧＧＣＣＣＴＣＴ、Ａ、ＴＡ、ＴＡ）（Ｓ３）のいずれか、３０ｍＭＮ−〔２ −ヒドロキシエチルゴーピペラジン−Ｎ’−（３−プロパン−スルホン酸］　（ＥＰＰＳ）（ｐＨ７，５）、５０　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃｌ　２および２ｍＭ　スペルミジンを混合することにより行った。この溶液を５０°Ｃに１時間維持した。反応産物は、５％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル電気泳動で分離した。このゲルでＸ線フィルムを感光しオートラジオダラムを作成した（第４図）。

デルタＰ９リボザイムは、ＤＮＡ基質Ｓｌ、修飾ＤＮＡ基質Ｓ２およびＤＮＡ基質Ｓ３を切断した（第４図）。

３、ＤＮＡを切断しうる変異体リボザイムの選択ＤＮＡ基質を切断しつる変異体リボザイムを、ＧＦ、ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）。

Ｇｅｎｅ、８２：８３−８７　（１９８９）に報告されているインビトロ進化システムを用いて選択した。この技術で、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）リボザイム構造変異体集団の中から特異的反応を触媒しつるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）リポザイムの構造変異体を選択的に増幅できる。

このインビトロ進化技術を用いて、ポリデオキシリポ核酸を切断しつるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）リボザイム構造変異体を選択した（第５図）。

この方法の第１ステツプは、ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）、Ｇｅｎｅ、８２：８３− ８７（１９８９）に述へられているＲＮＡ基質に存在するピリミジン配列に続くホスホジエステル結合をその３′末端グアノンンか攻撃することを含むリポザイムのトランス・スプライシング反応である。この反応の産物は、目標のホスホジエステルの下流に存在する基質配列に結合したりポザイムである（第５図、上）。

オリゴヌクレオチドブライマーか連結結合部にまたかってハイブリダイズし、逆転写酵素による相補的ＤＮＡの合成開始に使用される場合に選択か起こる（第５図、下）。このプライマーによる連結は未反応の原料では起こらず（反応産物と比較すると１０１以下、検出限界以下）、従って反応産物の選択的逆転写が可能となる。この選択された物質を増幅するために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの一方の鎖を含むプライマーをこのｃＤＮＡの３′末端にハイブリダイズし、このプロモーターの第２＠をＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼで完全なものとした後、ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）、Ｇ、Ｆ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＲＮＡ、ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ　Ｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、チェック（Ｃｅｃｈ）、ＴＲ４等纒、９４：３６１−３７１．アラン（Ａｌａｎ）、Ｒ，リス（Ｌｉｓｓ）。

ニューヨーク、　（１９８９）およびつ才つ（Ｋｗｏｈ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６　：１１７３−１１７７　（１９８９）に報告されているようにＤＮＡをＲＮＡに転写する。

選択した物質を、シャンバリン（Ｃｈａｍｂｅｒ　Ｉ　ｉｎ）等、Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｐ、ボイヤー（１３ｏｙｅｒＮＩ、Ｉ）Ｉ）、８７−１０８．アガデミックプレス、ニューヨーク（１９８２）で報告されている高ターンオーバーのＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写レベルに増幅する。突然変異は、ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）およびイノウニ（Ｉｎｏｕｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１７：７１１−７２２　（１９８９）に報告されているようにｃＤＮＡの一部を一つ以上の変異オリゴヌクレオチドで置換し、部分的にミスマツチしたテンプレートを転写することにより導入できる。また、このようにして得たりポザイムは”Ｐ−ＧＴＰで内部をラベル化することが出来る。

テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のりポザイムの野生型および変異体集団のＲＮＡ基質ＧＧＣＣＣＵＣＵＡＡＡＵＡＡＡＵＡ　（ＳＩ）、修正ＤＮＡ基質ｄ　（ＧＧＣＣＣＴＣＵＡＡＡＴＡＡＡＴＡ）（Ｓ２）およびＤＮＡ基質ｄ　（ＧＧＣＣＣＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡ）（Ｓ３）を切断する能力を測定した。

簡単にいうと、各１μＭの内部ラベル化した野生型、デルタＰ６、デルタＰ２、デルタＰ９、デルタＰ６／Ｐ９、およびデルタＰ　２／Ｐ　９リポザイムを、２ μＭの８３ＤＮＡ基質またはＳ］ＲＮＡ基質のいずれか、３０ｍＭ　ＥＰＰＳ　（ｐＨ７゜５）、５０　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ］　ｔδよび２ｍＭ　スペルミジンと混合しエンドデオキシリボヌクレアーゼ反応混合物として、５０°Ｃ１時間インキュベートした。各リボザイムによる基質の切断は、リボザイムへの切断基質の連結によるリボザイムの移動度の低下で検出した１６図、レーン２および３）。

ＤＮＡ基質Ｓ３に関しては選択増幅を２サイクル行い、野生型、デルタＰ６、デルタＰ２、デルタＰ９、デルタＰ６／Ｐ９、デルタＰ２／Ｐ９を含むリボザイム構造変異体集団からＤＮＡを切断しつる核酸酵素、この場合はエンドデオキシリボヌクレアーゼを回収した。これらの構造変異体（１μＭ、ＩμＣ４／ｎｍ。

１　”Ｐ−ＧＴＰで内部ラベルイυを２μＭ　ＤＮＡ基質Ｓ３．３０ｍＭ　ＥＰＰＳ（ｐＨ７，５）、５０ｍＭ　ＭｇＣｈおよび２ｍＭ　スペルミジンと混合し、５０°Ｃで１時間インキユベートシ總第１サイクル目のｃＤＮＡ合或は、２０倍過剰量のｄ　（ＴＡＴ、ＡＴ、ＣＧＡＧＴ）プライマーと混合し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および５ｍＭ　ＤＴＴの存在下６５°Ｃ１５分間この溶液を加熱してから、急速に０℃に冷やすことにより開始した。それから、この溶液を６ｍＭ　ＭｇＣ１＋、１００μＭ（各）ｄＮＴＰおよびｌユニット／ μＩ　ＡＭＶ逆転写酵素となるように調製し、３７°Ｃｌ２Ｏ分間インキュベートし總この溶液の一部を取り出し、５％ポリアクリルアミド／尿素ゲル電気泳動で分析した。第一回のｃＤＮＡ合成後のデルタＰ６、デルタＰ２、デルタＰ９およびデルタＰ　２／Ｐ　９リボザイムから選択された逆転写物は第６図のレーン５に見られる。

アルカリ加水分解てＲＮＡを分解し、エタノール沈澱でモノマーを除いた。２０倍過剰量のプライマーｄ（入ＴＣＧＡＴλ入ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＧにＧ入へ人λＧＴＴ入ＴＣ入ＣＣＣ）を話力口し、この溶液を５０ｍＭ　）−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および５ｍＭＤＴＴ存在下６５℃、５分間加熱した後、０°Ｃに急冷することによりｃＤＮＡからＲＮＡを転写した。更に、この溶液を１５　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２．２ｍＭ　スペルミジン、１００μＭ（各）ｄＮＴＰ、２ｍＭ（各）ＮＴＰ、ＩＵ／μｌ　ＡＭＶ逆転写酵素、０．２０／μｌ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノーフラグメント）および２０Ｕ／μＩ　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとなるように調製し、３７℃、１時間インキュベートして、ｃＤＮＡからＲＮＡを転写した。このステップで目的の触媒活性を有するリボザイムか大量に増幅される（第６図、レーン６、産物の１１５０）。

第２サイクルのｃＤＮＡ合或は、ＲＮＡの３′末端を保存するためプライマーｄ　（ＣＧＡＧＴＡＣＴＣＣＡＡＡＣ）およびｄ（ｃＧＡＧＴＡｃＴｃｃＧＡＣ）を用いて行った。ｃＤＮＡ合成のその他の部分は上述の操作にしたがった。この反応産物を電気泳動で分析した（第６図、レーン７）。

第２サイクルのＲＮＡ合或は、上述のＲＮＡ合成条件下、残りの反応混合物を用いて行った。この反応産物の１１５０を電気泳動で分析した（第６図、レーン８）。

このシステムでリホザイム混合物から目的の触媒活性を有するリボザイムを選択する事か可能となる。

特定の態様および実施例を含むこれまで述べてきた明細は、本発明を説明するものであってこれを制限するものではない。本発明の精神および範囲を逸脱すること無しに種々の修正または変化が可能である。

ＦＩＧ、　ＩＣＦＩＧ、　ＩＤＦＩＧ、　２ＢＬ２．ＩＴｏ　ＦＩＧ、２ＡＰ５ｂ　Ｐ５ｃＦＩＧ、　３ＧＦＩＧ、　６トランユスプライツングｃＤＮＡ　ｃＤＮＡ　ＲＮＡ’　ｃＤＮＡ’　ＲＮＡ” ヵａ、・　−−１１− 要約書本発明は、部位特異的に一本鎖ＤＮＡを切断し得る核酸酵素に関する。

“°”°゛°°ゝ“°　゛　ｒ堕９１廖Ｕ％

Claims

【特許請求の範囲】

１．所定のヌクレオチド配列の箇所で一本鎖ＤＮＡを切断しうるエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素であって、該酵素が、前記ヌクレオチド配列の５′末端に連続または隣接する認識部位を規定するヌクレオチド配列と、該認識部位の３′ 末端に存在する第１スペーサー領域と、該第１スペーサー領域の３′末端に存在するＰ３〔５′〕領域と、該Ｐ３〔５′〕領域の３′末端に存在する第２スペーサー領域と、該第２スペーサー領域の３′末端に存在する第１ステムループと、該第１ステムループの３′末端に存在する第２ステムループと、該第２ステムループの３′末端に存在する第３スペーサー領域と、および該第３スペーサー領域の３′末端に存在する第３ステムループであって、該Ｐ３〔５′〕領域にハイブリダイズしうるＰ３〔３′〕領域を規定する５′ステム部分を含む第３ステムループとを有する酵素。
２．前記魂認識部位が２乃至８ヌクレオチド長である請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリボヌクレアーゼ酵素。
３．前記第１スペーサー領域が少なくとも４ヌクレオチド長である請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリボヌクレアーゼ酵素。
４．前記第１スペーサー領域がさらに付加的ステムループを含む請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素。
５．前記Ｐ３〔５′〕領域が８ヌクレオチド長である請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素。
６．前記第２スペーサー領域が３ヌクレオチド長である請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素。
７．前記第１ステムループが１０８ヌクレオチド長である請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素。
８．前記第２ステムループが４４ヌクレオチド長である請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素。
９．前記第２ステムループが２５ヌクレオチド長である請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素。
１０．前記第３スペーサー領域が３ヌクレオチド長である請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素。
１１．前記第３ステムループが５１ヌクレオチド長である請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素。
１２．前記Ｐ３〔３′〕領域が８ヌクレオチド長である請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素。
１３．前記酵素がＲＮＡである請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素。
１４．一本鎖ＤＮＡ内に存在する所定の配死の３′末端において該一本鎖ＤＮＡを切断する方法であって、少なくとも２０ミリモル濃度のＭｇＣ１２の存在を含むＤＮＡ切断条件下、該一本鎖ＤＮＡを有効量の請求の範囲第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼで処理することを含む方法。
１５．前記ＤＮＡ切断条件にポリアミンの仔在が含まれる請求の範囲第１４項記載の方法。
１６．請求項第１項記載のエンドデオキシリポヌクレアーゼ酵素、一本鎖ＤＮＡおよび２０ミリモルより高い濃度のマグネシウムイオンを含む組成物。
１７．さらにポリアミンを含む請求の範囲第１６項記載の組成物。