JPH05504333A - 植物由来のグリコポリペプチドを含む組成物、蛋白質マルチマーおよびそれらの使用 - Google Patents

植物由来のグリコポリペプチドを含む組成物、蛋白質マルチマーおよびそれらの使用

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物由来のグリコポリペブチトを含む組成物、蛋白質マルチマーおよびそれらの 使用 （関連分野） 本発明は、植物における外来の蛋白質マルチマーの発現、これらの蛋白質マルチ マーを発現するトランスジェニック植物、植物中で生産される外来のグリコポリ ペプチドマルチマーおよび植物由来のグリコポリペプチドマルチマーの使用に関 する。
（関連技術） 広範囲の宿主細胞中でポリペプチドを発現しうろことが知られている。種々の構 造遺伝子が哺乳類およびウィルスから単離され、その構造遺伝子とは異なる起源 由来の翻訳開始および停止調節シグナルと結合して、これらの調節シグナルが機 能する宿主に導入された。
経済的理由から、遺伝子工学的に作成した単細胞微生物を使用して種々のポリペ プチドを生産することが望ましい。しかし、単細胞生物および哺乳類細胞の性質 が本質的に異なることから、単細胞微生物内でのポリペプチドのホールディング およびプロセシングは、哺乳類細胞内でのホールディングおよびプロセシングと 全く異なると考えられる。結果的に単細胞微生物由来の哺乳類ポリペプチドが、 必ずしもうまくホールディング、またはプロセシングしてそのポリペプチドの望 ましい生物学的、または生理学的活性を提供するとは限らない。
成功の度合いは別として、植物中で哺乳類ポリペプチドを発現する試みが行われ ている。
最初の外来遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ホーシュ（Ｈｏｒｓｃ ｈ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２２３：４９６　（１９８４）およびデブロック（Ｄ ｅＢｌｏｃｋ）等、ＥＭＢＯＪ、、３１：６８１　（１９８４）に述べられてい るアグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ ｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ベクターを使用して生産したタバコ植物である。この研究 で生産されたトランスジェニック植物は、導入されたトランスジーンにより特定 の抗生物質に対して耐性となった。これらの最初のトランスジェニック植物は、 植物のプロトプラスト、すなわち機械的、または酵素消化により細胞壁を除去し た植物細胞に、外来遺伝子を導入することにより生産した。葉、茎および根など 再生可能な植物部分に基づくトランスホーメーション法を利用することでいくつ かの双子葉植物のトランスホーメーションが可能となった。マイクロインジェク ション、エレクトロポレーションおよび粒子ガン技術を含む種々の遊離ＤＮＡ供 給システムで、トウモロコシおよび米等の単子葉植物のトランスホーメーション が可能となった。
蛋白質マルチマー、すなわち二つの異なるポリペプチド鎖からなる蛋白質の有意 な収率での発現は、まだ達成されていないっこれら蛋白質マルチマーのアッセン ブリをコントロールする因子としては、十分な量の各ポリペプチド鎖が同じ細胞 構造体の中に存在しなければならないこと以外は、まだ十分分かっていない。
植物細胞内での蛋白質マルチマーの発現には、同じ植物細胞内に各ポリペプチド 鎖をコードする遺伝子が存在することが必要である。同一細胞内に両遺伝子を導 入できる確率は、非常に低い。また、たとえこのような単一細胞のコトランスホ ーマントが生成しても、これから植物体が再生されなければ意味がない。
炭水化物残基を含む蛋白質マルチマー、グリコポリペプチドマルチマーは、動植 物体内に存在する。植物および動物画グリコポリペプチドマルチマーは、ポリペ プチドに存在するスパラギン残基に直接結合する共通のペンタサツカライドコア 、Ｍａｎαｌ−３（Ｍａｎαｌ−６１−６）β１−４ＧＬｃＮＡｃβ１−４ＧＬ 　ｃ　ＮＡ　ｃ−１を存する。コーンフェルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ）およびコー ンフェルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５４　 ：６３１（＋９８５）参照。
また、植物および動物のグリコポリペプチドマルチマーは、共通するペンタサツ カライドコアに直接結合するオリゴサツカライドのアウターブランチを有するっ 動植物のグリコポリペプチドアウターブランチは、Ｎ−アセチルグルコサミンを 有しているが、イーストに存在するアウターブランチだけは、マンノースを含ん でいる。
動植物のグリコポリペプチドは、存在するオリゴサッカライトのアウターブラン チに直接結合する種々の末端炭化水素を含んでいる。哺乳類のグリコポリペプチ ドを含む動物のグリコポリペプチドは、末端炭化水素として存在するシアル酸を 有している。一方、植物のグリコポリペプチドマルチマーは、それを含んでいな い。スターム（Ｓ　ｔ　ｕ　ｒｍ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２　： １３３９２（１９８７）参照。
分泌性１ｇＡは、鎖（Ｊ鎖）と分泌要素を繋ぐ二つのＩｇＡ分子からなるグリコ ポリペプチドマルチマーである。ＩｇＡは、ミルク、唾液、涙、呼吸系分泌物お よび腸分泌物等の分泌物中に存在する主要なりラスの抗体である。
分泌性１ｇＡは、過酷な環境による変性に対して耐性がある。この変性耐性には 、ＩｇＡ分子、Ｊ鎖および分泌要素を含む複合型分泌性ＩｇＡ分子が、正確かつ 効率的に集合することが必要である。
現在、特定の方法で生成したトランスジェニック植物中で、蛋白質マルチマーが 比較的高収率で発現できることが知られている。さらに、トランスジェニック植 物中でシアル酸を含まないグリコポリペプチドマルチマーの正確で効率的な発現 方法が開発された。
また、動物に対する種々の抗原特異性を有する種々の抗体を含むシアル酸含有可 溶性免疫グロブリンを提供することによりその動物を受動免疫化することが出来 ることが分かった。タケット（Ｔａｃｋｅｔ）等、Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＪ、 Ｍｅｄ、、３１８：１２４０　（１９８８）およびエイプル（Ｅｉｂｌ）等、Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｄ、、３１９　：　１−７　（１９８８）参照 。今日まで、所定の病原に結合しつるグリコポリペプチドマルチマーカプセルを 投与することにより動物を受動免疫化するという報告はない。
シアル酸を含まず、かつ所定の病原と結合しうるグリコポリペプチドマルチマー のカプセルを投与することによる受動免疫の誘導方法が発見された。
（発明の概要） 各々が、自己結合性ポリペプチドをコードする複数の哺乳類遺伝子を核ゲノムに 統合した形で含み、かつ自己結合性ポリペプチド自体を含む植物細胞によって構 成される有性的に再生可能なトランスジェニック植物中で、アブザイム、免疫グ ロブリン、酵素などの生物学的、または生理学的に活性な蛋白質マルチマーが比 較的効率的に生成された。これらのポリペプチドは、ホモマルチマーまたはヘテ ロマルチマーなどの生物学的に活性なポリペプチドマルチマーとして植物細胞中 に存在する。これらのトランスジェニック植物は、形態的には正常であるが、実 質的にすべての細胞には哺乳類遺伝子が存在する。各遺伝子産物は、実質的にそ の植物細胞の全て、あるいは一部に存在しつる。即ち、その産物は、特定の細胞 、組織あるいは器官に局在しうる。
先のトランスジェニック植物は、第一の植物種の核ゲノムに蛋白質マルチマーの 構成部分である自己結合性のモノマーポリペプチドをコードする第一の哺乳類遺 伝子を導入し、生存可能な第一のトランスホーマントを作製することにより生成 する。同様に、これも蛋白質マルチマーの構成部分であるもう一つの自己結合性 のモノマーポリペプチドをコードするもう一つの哺乳類遺伝子を、第二の同じ植 物種の核グラムに導入して生存可能な第二のトランスホーマントを作製する。
このようにして得た第一および第二のトランスホーマントを有性的に掛は合わせ て培養し、子孫の植物を作製して、そこから蛋白質マルチマーを生産するトラン スジェニック植物を単離する。
本発明を具現化するトランスジェニック植物は、目的の蛋白質マルチマーを経済 的に、かつ効率的に生産するのに有効なだけでなく、ガスや液体などの流体から 金属イオン等所定のリガンドを分離、および、または濃縮するための手段として 有効である。
このトランスジェニック植物は、グリコジル化したコア部およびアウターブラン チを含むアセチルグルコサミンを有するポリペプチドおよび免疫グロブリン分子 のアミノ酸残基配列を有し、かつ検出可能なシアル酸残基を含まないグリコポリ ペプチドを生産する。
所定の病原に対する受動免疫は、予防に十分なグリコポリペプチドマルチマー濃 度となる量の、病原抗原に結合可能で生物学的に活性なグリコポリペプチドマル チマーカプセルを動物に投与することにより誘導される。この投与されるグリコ ポリペプチドマルチマーには、検出可能なシアル酸残基は含まれず、グリコジル 化したコア部分およびアウターブランチを含むＮ−アセチルグルコサミンを有す るポリペプチドおよび免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列が含まれる。
また、本発明は、グリコジル化したコア部分およびアウターブランチを含むＮ− アセチルグルコサミンを有するポリペプチドおよび免疫グロブリンのアミノ酸残 基配列を含むグリコポリペプチドマルチマーで、かつ検出可能なシアル酸残基を 含まず、植物細胞などのような保護コート中にカプセル化されたグリコポリペプ チドマルチマーを含む生物学的に活性な組成物に関する。
（図面の簡単な説明） 第１図　ハイブリドーマ６Ｄ４由来のカッハ鎖ｃＤＮＡ　（第１図Ａ）およびガ ンマ鎖ｃＤＮＡ（第１図Ｂ）の主な特性を示す図である。重要な制限エンドヌク レアーゼ部位の位置が示されている。相補性決定領域、フレームワーク領域およ び不変領域の位置が示されている。
第２図　ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）等、Ｍｅｔｈ、Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、。
１５３：２５３　（１９８７）に述べられているｐＭＯＮ５３０　３５Ｓ−ＮＯ Ｓバイナリー力セントベクターの模式図である。ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター セグメント；３’、Ｎ０５３°非翻訳配列、また、ｐＢＲ３２２複製オリジンを 有する１、６ｋｂセグメント、ツバリンＴ−ＤＮＡの右境界および本来のツバリ ンシンテース（ＮＯＳ）遺伝子を含むツバリン型ｐＴｉＴ３７ブラスミドの２． ４ｋｂセグメント、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子を含む Ｉｎ７の２．２ｋｂセグメント、トランスホーム植物細胞に選択可能なカナマイ シン耐性を提供するキメラＮ０３−ＮＰＴＩ　Ｉ’　−ＮＯ８遺伝子をコードす る１、６ｋｂセグメントおよび他のＤＮＡセグメントの挿入用の単一の制限部位 を含む合成マルチリンカ−が存在する。
第３図　各カンパおよびガンマ鎖を含む植物を有性的に交配する事による植物中 での抗体分子の安定な発現を示す模式図である。
第４図　第４図Ａでは、トランスジェニック植物ゲノムへのカッパおよびガンマ 両遺伝子の組み込みを示すトランスジェニック葉ＤＮＡのサザンプロットが示さ れている。リーダー配列を含まない軽鎖ｃＤＮＡを発現するトランスホーマント （ｐＨｉ　ｌ　０１）由来のＤＮＡが、レーンｌに示されている。レーン２は、 リーダーを含まない重鎮を発現するｃＤＮＡトランスホーマント（ｐＨｉ２０１ ）由来のＤＮＡを含んでいる。レーン３は、リーダーを含む軽鎖全ｃＤＮＡを発 現するトランスホーマント（＋）Ｈｉ２０２）由来のＤＮＡを含んでいる。レー ン５は、全ガンマｃＤＮＡを発現する植物と全カッパｃＤＮＡを発現する植物の 交配に由来するＦｌ植物（ｐＨｉ１０２ｘｐＨｉ２０１）由来のＤＮＡを含んで いる。
第４図Ｂは、トランスジェニック植物の葉中でのカッパおよびガンマｍＲＮＡの 発現を示すトランスジェニックタバコ植物の葉のＲＮＡのノーサンプロットであ る。レーンｌは、リーダー配列を含まない軽鎖ｃＤＮＡを発現するトランスホー マント（ｐＨｉ　］　ＯＩ）由来のＲＮＡを含んでいる。レーン２は、リーダー を含まない重鎖ｃＤＮＡトランスホーマント（＋）Ｈｉ２０１）由来のＲＮＡを 含んでいる。レーン３は、リーダーを含む全軽鎖を発現するトランスホーマント （ｐＨｉ１０２）由来のＲＮＡを含み、レーン４は、リーダーを含む重鎮を発現 するトランスホーマント釦Ｈｉ２０２）由来のＲＮＡを含んでいる。レーン５は 、全ガンマｃＤＮＡを発現する植物および全カッパｃＤＮＡを発現する植物の交 配によるＦｌ植物（ｐＨｉ　１０２Ｘ＋）Ｈｉ２０１）由来のＲＮＡを含んでい る。別のハイブリダセーンヨン由来のレーンを、メチレンブルー染色による検出 されるプロット上の１８５（１９００ｂｐ）および２５Ｓ　（３７００ｂｌ）） リボゾームＲＮＡバントと共に整列させた。
第５図は、免疫グロブリンカッパ鎖、免疫グロブリンガンマ鎖または集合免疫グ ロブリンＩｇＧを発現するトランスジェニックタバコ植物由来の葉の蛋白質のウ ェスタンプロットを示している。レーンＩ−７の葉蛋白質抽出物はジチオスレイ トール（ＤＴＴ）を含んでおり、レーン８および９の葉蛋白質抽出物は、ＤＴＴ を含んでいない。レーン１は、ハイブリドーマ６０４由来の精製蛋白質＋００ｎ ｇを含んでいる。レーン２は、野生型植物抽出蛋白質１５　）、ｔ　ｇを含んで いる。
レーン３は、リーダー配列を含まない短縮型カッパ鎖ｃＤＮＡでトランスホーム し、た植物（ｐＨｉ　ｌ　Ｑ　ｌ）由来の蛋白質１５μｇを含んでいる。レー・ ン４は、短縮型プｊンマ鎖ｃＤＮＡでトランスホームした植物（ｐＨｉ１０２） 由来の植物抽出物１５μｇを含んでいる。レーン５は、全カッパｃＤＮＡトラン スホーマント（ｐ＋（ｉ２０２）由来の植物抽出物１５μｇを含んでいる。レー ン６は、全ガンマ鎖ｃＤＮＡｈランスホーマント（ｐＨｉ２０２）由来の植物抽 出物１５μｇを含んでいる。レーン７は、カッパおよびガンマトランスホーマン トの交配によるＦｌ植物由来の植物抽出物１５μｇを含んでいる。レーン８は、 ６Ｄ４抗体１０θｇを含む（ＤＴＴなし）。レーン９は、サンプル中にＤＴＴが 存在しない事以外はレーン７と同様である。左のガンマおよびカッパは、６Ｄ４ 重鎖および軽鎖の位置を示している。
第６図は、主要なスパラギン結合オリゴサツカライド（Ｎ−結合オリゴサツカラ イド）の構造を示している。ボックス領域は、全てのＮ−結合オリゴサンヵライ ドに共通なペンタサッカライトコア（グリコジル化した３７部分）を示している 。複合型およびハイブリッドＮ−結合オリゴサンカライドは、アウターブランチ を含むＮ−アセチルグルコサミンを有するが、高マンノースＮ−結合オリゴサソ カライドは、それを含まない。複合型、ハイブリッドおよび高マンノースオリゴ サツカライドをそれぞれ第６図Ａ、ＢおよびＣに示す。
第７図は、ハゲス（Ｈｕｇｈｅｓ）、糖蛋白質、チャツプマンアンドホール版、 ニューヨーク、ＮＹ（１９８３）に述べられているＮ−アセチルノイラミン酸お よび他のシアル酸の構造を示している。
第８図は、ジエスケ（Ｊｅｓｋｅ）およびカプラ（Ｃａｐｒａ）、基礎免疫学、 Ｗ、Ｅ、ポール（Ｐａｕｌ）編、レーベンプレス、ニューヨーク、ＮＹ（１９８ ４）に述べられているヒト軽鎖中の炭水化物の位置を示している。グルコサミン オリゴサツカライドは、縦の線で示した。二つ以上の鎖で同じ位置にある場合は 斜線で、単一の位置にある場合は白線で示しである。横の線は、ガラクトサミン オリゴサンカライドの位置を示している。上のスケールは上の五つの鎖の残基位 置を示し、下のスケールはμおよびε鎖の位置を示している。
第９図Ａは基質を示し、第９図Ｂはタバコ植物中で生産される６Ｄ４抗体が基質 を触媒するよう機能する事を示すのに用いるインヒビターを示している。
第１Ｏ図は、ガンマ重鎖の種々のレクチンへの結合を示している。植物またはマ ウス中で生産されるＩｇＧ抗体をＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅで分画し、チュ ー　（Ｃｈｕａ）、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、６９　：４３４−４４６　（１ ９８０）およびバーロー（Ｈａ　ｒ　Ｉ　ｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、抗 体、ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ（＋９８８） に述べられている操作にしたがってニトロセルロースに移した。レーンｌは、タ バコ植物で生産されたＩｇＧ６Ｄ４抗体１ｍｇを含み、レーン２は、マウス腹水 から単離したＩｇＧ６Ｄ４抗体１ｍｇを含む。レーン３は、フェイ（Ｆａｙｅ） およびクリスビールス（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、１４９：２１８−２２４（１９８５）に述べられているヒトのトランスフェリ ン（複合型炭水化物）各１ｍｇを含む。略号　Ｃｏｎ　Ａ　コンカナバリンＡ； ＲＣＡ：リシナス　コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）アグルチニ ン：　ＰＨＡ：ファセオラス　バルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒ ｉｓ）！リスロレクチン：Ｅｎｄｏ　ＨエントグリコンダーセＨ１α−ＭＧ　α −メチルグルコピラノシト。
（発明の詳細な説明） Ａ、定義 双子葉植物：胚が二つの種子葉または双子葉を有する開花植物。双子葉植物には 、タバコ、トマトアルファルファを含む豆類、樫、楓、薔薇、ミント、カポチャ 、ヒナギク、クルミ、サボテン、菫およびキンポウゲがある。
単子葉植物・胚が一つの子葉または種子葉を有する開花植物。単子葉植物には、 ユリ、芝、トウモロコシ、オーツ麦、小麦および大麦を含む穀類、ラン、菖蒲、 タマネギおよび椰子がある。
低級植物・シダ、裸子植物、毬果植物、トクサ、ヒカゲノカズラ、苔類、マッモ 、蘇類、紅藻類、褐藻類、配偶体、シダの芽胞体および緑藻類を含む非開花植物 。
真核性ハイブリッドベクター・真核細胞にポリペプチドをコードするＤＮＡ（挿 入物）を導入しうるＤＮＡ。
染色体外リボゾームＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）：リボゾームＲＮＡをコードするーっ 以上の遺伝子を有し、かつ自分自身で複製しうる（染色体の複製とは独立に）染 色体以外に存在する単細胞真核生物のＤＮＡ０パリンドロームＤＮＡニ一つ以上 の対称中心を有するＤＮＡ配列。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸。
Ｔ−ＤＮＡ：転移したＤＮＡのセグメント。
ｒＤＮＡ：リボゾームＤＮＡ。
ＲＮＡ　リボ核酸。
ｒＲＮＡ　リボゾームＲＮＡ。
Ｔｉ−プラスミド・腫瘍誘導プラスミド。
Ｔｉ−ＤＮＡ：Ｔｉ−プラスミド由来のＤＮＡのセグメント。
挿入物：ｒＤＮＡにとって外来の、構造遺伝子および場合によってはさらに別の ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列。
構造遺伝子・ポリペプチドをコードし、適当なプロモーター、ターミネーション 配列、場合によっては他の調節ＤＮＡ配列を含む正しい読み枠を有する遺伝子。
シグナル配列　ポリペプチドに結合し、小胞体への該ポリペプチドの結合および 蛋白質の分泌に必要なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。
（選択的）遺伝子マーカー：トランスホームした細胞を非トランスホーム細胞か ら選別しつる発現型をコードするＤＮＡ配列。
プロモーター　遺伝子の発現コントロール要素で、ＲＮＡポリメラーゼが特異的 にこれに結合しこの遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始する一つ、または一群の ＤＮＡ配列の認識部位。
誘導可能プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および合成開始速度を外部刺 激で調節できるプロモーター。このような刺激には、光、熱、嫌気的ストレス、 栄養条件の変化、代謝物の有無、リガンドの存在、微生物の攻撃、損傷などがあ る。
ウィルスプロモーター：ウィルスの遺伝子の５′末端にあるプロモーターと実質 的に同じのＤＮＡ配列を有するプロモーター。典型的プロモーターは、ハング（ Ｈｕａｎｇ）等、Ｃｅ１ｌ、２７：２４５　（１９８１）に述べられているＭＭ ＴＶの９２１蛋白質をコードする遺伝子の５”末端にある。（本明細書で引用し ているすべての文献は、参考として引用している。）合成プロモーター：生物的 にではなく化学的に合成したプロモーター。通常、合成プロモーターには、ＲＮ Ａポリメラーゼの開始効率を至適化する配列変異を含んでいる。
構成的プロモーター　ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始速度がほぼ一定で、 比較的に外部刺激には影響されないプロモーター。構成的プロモーターの例には 、ボスコツスキー（Ｐｏｓｚｋｏｗｓｋｉ）等、ＥＭＢＯＪ、、３．２７１９（ １９８９）およびオデル（Ｏｄｅｌｌ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０（１ ９８５）に述べられているカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓおよび１９Ｓプ ロモーターがある。
時間調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始速度が、発生の特 定の時間に調節されるプロモーター。時間調節プロモーターの例は、チュア（Ｃ ｈｕａ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４：１７４−１８１　（１９８９）に述べら れている。
空間調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始速度が葉、茎また は根など器官の特定の構造内で調節されるプロモーター。空間調節プロモーター の例は、チュア（Ｃｈｕａ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４：１７４−１８１（１ ９８９）に述べられている。
空間時間調節プロモーター　ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始速度の速度が 発生の特定の時間に特定の器官で調節されるプロモーター。典型的な空間時間調 節プロモーターの例には、チュア（Ｃｈｕａ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４：１ ７４−１８１　（１９８９）に述べられているＥＰＳＰシンテース−３５８プロ モーターがある。
一本鎖抗原結合蛋白質　免疫グロブリン軽鎖可変部のアミノ酸配列（ＶＬ）のカ ルボキシ末端を免疫グロブリン重鎮可変部のアミノ酸配列（ＶＨ）のアミノ末端 に結合するペプチド結合でＶ、に繋がったＶＨからなるポリペプチド。
一本鎖抗原結合蛋白質コード遺伝子　一本鎮抗原結合蛋白質をコートする組み換 え遺伝子。
蛋白質マルチマー、一つの球状蛋白質を形成するように互いに会合する二つ以上 のポリペプチドを含む球状蛋白質。
ポリペプチドおよびペプチド　隣り会うアミノ酸残基のαアミノおよびカルボキ シ基間のペプチド結合により互いに連結される一連の線状アミノ酸残基。
蛋白質　ポリペプチドのように互いに連結する約５０個以上の一連のアミノ酸残 基。
キレート剤・金属を結合しうる化合物、ペプチド、または蛋白質。キレート剤の 例には、エチレンノアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、エチレングリコール−ビス− （β−アミノエチルエーテル）Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’　−四酢酸（ＥＧＴ Ａ）　、２゜３−ジメルカプトプロパネル−１−スルホン酸（ＤＭＰＳ）および ２，３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）等がある。
金属キレート化複合体：キレート剤に結合した金属を含む複合体。
免疫グロブリン産物、少な（とも免疫グロブリン重鎮の免疫学的活性部を含み、 特定の抗原に特異的に結合しつるポリペプチド、蛋白質または蛋白質マルチマー 。
代表的な免疫グロブリン産物には、免疫グロブリン重鎮、免疫グロブリン分子、 実質的免疫グロブリン分子、当分野でＦａｂフラグメント、Ｆ　ａｂ’　フラグ メント、Ｆ（ａｂ’）フラグメントおよびＦｖフラグメントとして知られている 部分を含むパラトープを有する免疫グロブリンの一部分等がある。
免疫グロブリン分子：互いに結合する免疫グロブリン重鎮および免疫グロブリン 軽鎖の免疫学的活性部分を含み、抗原と特異的に結合しうる蛋白質マルチマー。
Ｆａｂフラグメント：互いに共有結合で結合する免疫グロブリン重鎮および免疫 グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含み、特定の抗原と特異的に結合しうる免 疫グロブリン分子の一部を含む蛋白質マルチマー。一般に、Ｆａｂフラグメント は、従来法を用いたパパインによる実質的免疫グロブリン分子の蛋白質分解的消 化によって調製する。しかし、Ｆａｂフラグメントは、従来法により免疫グ０プ リン重鎮と免疫グロブリン軽鎖の目的部分を適当な宿主細胞内で発現させる事に よっても調製できる。
Ｆｖフラグメント：互いに共有結合で結合する免疫グロブリン重鎮および免疫グ ロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含み、抗原と特異的に結合しうる蛋白質マル チマー。一般に、Ｆｖフラグメントは、従来法を用い免疫グロブリン重鎮可変部 と免疫グロブリン軽鎖可変部の目的部分を適当な宿主細胞内で発現させることに より調製する。
無性増殖・葉、茎または根の断片、単一の植物細胞（プロトプラスト）およびカ ルスから全植物体を再生することによる子孫の生産。
グリコジル化コア部分二全てのスパラギン結合オリゴサツカライドに共通するペ ンタサツカライドコア。このペンタサツカライドコアは、Ｍａｎαｌ−３１−３ （αｌ−６１−６）βｌ−４６ＬｃＮＡｃβｌ−４６ＳｃＮａｃ　（ＡＳＮアミ ノ酸）の構造を持つ。一般に、このペンタサツカライドは、これに結合する二つ のアウターブランチを有する。
Ｎ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチニスパラギン結合オリゴサツカ ライドのペンタサツカライド（グリコジル化コア部分）に結合する別のオリゴサ ツカライド。哺乳類および植物の両方に存在するアウターブランチは、マンノー スのみを含むイーストのアウターブランチと対照的にＮ−アセチルグルコサミン を含む。哺乳類のアウターブランチは、そのアウターブランチの末端に直接結合 するシアル酸残基を有する。
グリコペプチドマルチマー・単一の球状蛋白子を形成するように互いに結合する グリコジル化ポリペプチドまたは蛋白質および少なくとも一つのポリペプチドま たは蛋白質を含む球状蛋白質。ヘテロニ量体およびホモ二量体糖蛋白質の両方と も蛋白質マルチマーとなりつる。グリコジル化ポリペプチドおよび蛋白質は、ス パラギンのアミド基にＮ−アセチルグルコサミンのＣ（１）が結合するｎ−グリ カンである。
免疫グロブリンスーパーファミリー分子・免疫グロブリンまたは免疫グロブリン 関連ドメインに有意に相同的なドメインサイズおよびアミノ酸残基配列を有する 分子。その相同性の有意性は、デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）等、Ｍｅｔｈ、Ｅｎ ｚｙｍｏｌ、、９１：５２４−５４５　（１９８３）に述べられているアライン プログラムのようなコンピュータプログラムを用いて統計的に決定する。３以下 の典型的アラインスコアはテストした分子が免疫グロブリン遺伝子スーパーファ ミリーのメンバーであることを示している。
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーには、表Ａに示された、また、ウィリ アムス（Ｗｉ　ｌ　ｌ　ｉ　ａｍｓ）およびバークレー（Ｂａ　ｒｃ　１ａｙ） 　、免疫グロブリン遺伝子、ｐ３６１、アカデミツクプレス、ニューヨーク、Ｎ Ｙ（１９８９）に報告されているものを含むいくつかの主要クラスの分子が含ま れる。
表Ａ 免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの既知メンバー免疫グロブリン 重鎮（ＩｇＭ） 軽鎖カッパ 軽鎖ラムダ Ｔ細胞レセプター（Ｔｃｒ）複合体 ＣＤ３　ガンマ鎖 ＣＤ３　σ鎖 ＣＤ３　ε鎖 主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原 クラスＩＨ鎖 β２−ミクログロブリン βｔ−ｍ　関連抗原 ＴＬ　Ｈ鎖 Ｑａ−２Ｈ鎖 ＣＤ１ａ　Ｈ鎖 Ｔリンパ球抗原 ＣＤ２ ＣＤ４ ＣＤ？ ＣＤ８　鎖■ ＣＤ８　鎖ｎｄ 造血／内皮抗原 ＦＡ−３ 〜ＩＲＣ０Ｘ−４５ 脳／リンパ抗原 ｈｙ−ｔ ＭＲＣ０Ｘ−２ 免疫グロブリンレセプター ポリＩｇ　Ｒ Ｆｃ　ガン？　２ｂ／ガン７　１Ｒ ＦｃεＲ１（α） 神経分子 神経粘着分子（ＭＣＡ〜１） ミニリン関連ｇｐ　（Ｍ、ＡＧ） Ｐ、ミニリン蛋白質 腫瘍抗原 ガン胎児性抗原（ＣＥＡ） 成長因子レセプター 血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）レセプターコロニー活性化因子−１（Ｃ８ＦＩ ）レセプター非−細胞表面分子 α１Ｂ−糖蛋白質 基底膜結合蛋白質 ＊ウィリアムス（Ｗｉ　ｌ　Ｉ　ｉ　ａｍｓ）およびバークレー（Ｂａｒｃｌａ ｙ）。
免疫グロブリン遺伝子、ｐ３６１．アヵデミンクプレス、ＮＹ（１９８９）およ び、免疫学的に興味のある蛋白質の配列、第四編、Ｌｌ、Ｓ、　、デパートメン ト・オブ・ヘルス・アンド・ヒユーマン・サービング（＋９８７）参照。
触媒部位　反応物の結合および反応速度の改良を行いつる分子の一部。触媒部位 は、ポリペプチドまたは蛋白質、酵素、有機物、有機金属化合物、金属等に存在 しうる。一つの触媒部位は、一つ以上のポリペプチド鎖または化合物に存在する 幾つかの部分から成り立つこともある。これらの各触媒部位が会合して大きな触 媒部位領域が生成する。触媒部位は、金属に結合する一つのポリペプチドまたは 蛋白質によっても生成しうる。
酵素部位：触媒部位を含む蛋白質分子の一部分。はとんどの酵素部位は、非常に 高い選択的基質特異性を示す。一つの酵素部位は、同じポリペプチド鎖の異なる セグメント状に存在する二つ以上の酵素部位部分を含むこともある。これらの酵 素部位部分が、互いに会合しより大きい酵素部位が生成する。また、酵素部位の 一部が金属のこともある。
自家受粉　雄の花部分から同じ植物の雌の花部分への花粉の移動。一般に、この 過程で種子が生成する。
交雑受粉：雄の花部分から別の植物の雌の花部分への花粉の移動。一般に、この 過程で生育可能な子孫が生まれる種子が生成する。
エピトープ、免疫グロブリン産物によって特異的に認識される分子の一部分。
これは、決定基または抗原決定基とも呼ばれる。
アブザイム　酵素または触媒として作用しうる免疫グロブリン分子。
酵素、触媒作用により、しばしば特異的に基質の特定の変化を促進または生成し うる蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、ＲＮＡ分子、または蛋白質マルチマー。
Ｂ、蛋白質マルチマーを含むトランスジェニック植物の生成法。
本発明は、第一および第二のポリペプチドを含む蛋白質マルチマーを含む植物を 生成させる新しい方法を提供する。一般にこの方法は、以下の要素を合わせ持っ ている。
■、第一の植物種のゲノムに、第一ポリペプチドをコートする遺伝子を挿入して 第一トランスホーマントを作製する。
２、第二の植物種のゲノムに、第二ポリペプチドをコートする遺伝子を挿入して 第ニドランスホーマントを作製する。
３、第一および第ニドランスホーマントから子孫集団を生産する。
４、その集団から蛋白質マルチマーを有する子孫を単離する。
本発明で生産した植物は、生物学的機能構造を維持した形で互いに会合する第一 および第二ポリペプチドを含む蛋白質マルチマーを含んでいる。本発明の一つの 態様の蛋白質マルチマーは、所定のリガントに特異的に結合し、リガントと単離 する複合体を作るためのりガント結合部位間に十分に強い結合を有する複合体を 形成するリガント結合部位を形成するリガント結合ポリペプチド（レセプター） である。別の態様の蛋白質マルチマーは、免疫グ０プリン重鎖および免疫グロブ リン軽鎖を含む免疫グロブリン分子である。この免疫グロブリン重鎮および軽鎖 は互いに会合し、かつ競合的に阻害される能力で証明されるように所定の抗原に 特異的な抗原結合部位を有する構造を維持するっこの蛋白質マルチマーが抗原結 合蛋白質である場合、そのアフィニティーまたは結合性は一般に１０５Ｍ−’以 上、通常１０６〜１−１以上および好ましくは１０”〜１−１以上である。
また、別の態様の蛋白質マルチマーは、免疫グロブリン重鎮の一部分および免疫 グロブリン軽鎖のｍ一部分を含むＦａｂフラグメントである。この免疫グロブリ ン重鎮および軽鎖は互いに会合し、所定の抗原に特異的な抗原結合部位を有する 構造を維持するっＦａｂフラグメント状の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子 の抗原結合部位と同じ結合アフィニティーを有する。
また、別の態様のトランスジェニック植物には、少なくとも免疫グロブリン重鎮 可変部の一部および少なくとも免疫グロブリン軽鎖可変部の一部を含むＦｖフラ グメントをである蛋白質マルチマーを含む。この免疫グロブリン重鎮および軽鎖 可変部は、植物細胞内で自発的に会合し、所定の抗原に特異的な結合部位を有す る生物学的に活性な構造を維持する。Ｆｖフラグメント状の抗原決定部位は、免 疫グロブリン分子に存在する抗原結合部位が示すアフィニティーと同じアフィニ ティーを示す。
また、他の態様の蛋白質マルチマーは、基質を結合し、かつその基質からの産物 の生成を触媒する酵素である。触媒性蛋白質マルチマーの基質結合部位（リガン ト結合部位）のトポロジーは、おそら（基質に対するアフィニティー（会合定数 またはｐＫａ）よりも活性のほうに重要であるが、所定の基質に対するこの蛋白 質マルチマーの会合定数は、ＩＯ’Ｍ−’以上、通常１０５〜１−１またはＩＱ ’Ｍ−１、好ましくはＩＯ’Ｍ−’以上である。
本発明にしたがって作製した蛋白質マルチマーが、免疫グロブリン重鎮可変部の 少なくとも一部を他のポリペプチド鎖と会合した形で含むアブサイムである時、 この別のポリペプチド鎖には、免疫グロブリン軽鎖可変部の少なくとも生物学的 活性部分を含んでいる。また、これら二つのポリペプチドは、それぞれ単独のポ リペプチド、すなわちモノマーのアフィニティーまたは会合定数とは異なる、好 ましくはより高い所定のりガントに対する結合アフィニティーまたは会合定数を 有する構造を維持している。有用な蛋白質マルチマーは、免疫グロブリンの軽鎖 および重鎮の可変部由来の一つまたは両方のポリペプチド鎖を含んでいる。一般 に、所定の抗原の結合には軽鎖（ＶＬ）および重鎮（ＶＨ）可変部を含むポリペ プチドを一緒に使用する。
１、第一ポリペプチドをコートする遺伝子の第一植物種への挿入目的の第一ポリ ペプチドをコードする遺伝子を単離する方法はよく知られている。たとえば、１ 分子クローニング技術ガイド”、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、１５２巻、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキメル（Ｋｉｍｍｅ　ｌ）　７４ 、（１９８７）およびＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、オースベル（Ａｕｓｕｂｅ＋）等編、ジョンウィリー アンドサンズ版、ＮＹ（１９８７）参照（これらの文献は、参考として引用して いる）。
本発明の実施に有用な遺伝子には、免疫グロブリン産物、免疫グロブリン分子、 Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、酵素、レセプターおよびアブザイムに 含まれるポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。免疫グロブリン重鎮およ び軽鎖可変部をコードする遺伝子は、特に好ましい。典型的には、所定の抗原を 結合しうる免疫グロブリンの免疫グロブリン重鎮可変部および軽鎖可変部をコー ドする遺伝子を使用する。これらの遺伝子は、目的の活性を有する抗原性リガン ド、すなわち所定の抗原で免疫化したを椎動物、好ましくは哺乳動物の細胞から 単離する。免疫化は従来法で行い、またその動物中の抗体値をモニターすること で目的のアフィニティーに対応する目的の免疫段階を測定できる。一般に、部分 免疫動物は一回だけの免疫化で作製し、応答が検出された直後にそれらの動物か ら細胞を回収する。完全免疫化動物は、通常二、二連間間隔での宿主哺乳動物へ の複数回の抗原注射で達成されるピーク値を示す。
通常、最後の注射から３−５日後、膵臓を取り出し、標準的技術を用いて牌臓中 に存在する再配列Ｂ細胞から、免疫グロブリン重鎮および軽鎖をコードする遺伝 子を単離する。Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、オースベル（Ａｕｓｂｅｌ）等線、ジョンウィリーアンド サンズ版、ＮＹ（１９８７）および゛抗体”、ラボラトリ−マニュアル、バー０ −　（Ｈａ　ｒ　ｌ　ｏｗｅ）およびレーン（Ｌ　ａ　ｎ　ｅ）編、コールドス プリングハーバ−１ＮＹ（＋９８８）参照。
■□およびＶＬポリペプチドをコードする遺伝子は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ。
ＩｇＧまたはＩｇＭ、もっとも好ましくはＩｇＭおよびＩｇＧ生産細胞から得ら れる。クローニングのための免疫グロブリン可変部遺伝子を含むゲノムＤＮＡの ７ラグメントを調製する方法はよく知られている。たとえば、バーマン（Ｈｅｒ ｒｍａｎｎ）等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５２：１８０− １８３　（１９８７）；フリンヤフ（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５２：１８３−１９０（１９８７）；フリシャツ（ Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５２：１ ９９−２１２　（＋９８７）参照。（これらの文献は、参考として引用している 。）免疫グロブリン産物をコードする遺伝子を単離するのに有用なプローブには 、ｖＨおよび■、のフレームワーク部をコードするＶｌｌおよびＶＬ配列の不変 部をコードする配列および全再配列免疫グロブリン遺伝子の不変部に対するプロ ーブが含まれる。これらの配列は、使用可能な情報源から入手しつる。たとえば 、アーリー（Ｅａｒｌｙ）およびフード（Ｈｏｏｄ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ、セトロ＝（Ｓ　ｅ　ｔ　ｌ　ｏｗ）およびホレンダー（Ｈｏ ｌｌａｅｎｄｅｒ）編、３巻、＋５７−１８８．プレナムパブリジングコーポレ ーション、ＮＹ（１９８１）；およびカバ（Ｋａｂａｔ）等、免疫学的に重要な 配列、ナショナル・インキュベート・オブ・ヘルス、ヘセスダ、〜１Ｄ（１９８ ７）参照。
蛋白質マルチマーのポリペプチドサブユニットをコードする遺伝子は、そのポリ ペプチドを発現する遺伝子を含むゲノムＤＮＡまたはそのポリペプチドをコード するメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）のいずれからも単離できる。ゲノムポ リペプチドを使用する上での困難は、イントロンで分断されているそのポリペプ チドをコードする配列の繋ぎ合わせである。適当なエクソンを含むＤＮＡフラグ メントを単離し、イントロンを切りだし、適当な順番および方向でそのエクソン をつなぎ合わせなければならない。これらすべての操作が非常に困難であること から、配列が全ポリペプチドに渡り連続しているｍＲＮＡを用いるもう一つの方 法が選ばれる。ペプチドまたは蛋白質をコードするｍＲＮＡを単離する方法はよ く知られている。たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍ。
１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、オースベル（Ａｕｓｂｅｌ）等線、ジョンウ ィリーアンドサンズ版、ＮＹ（１９８７）、”分子クローニング技術ガイド”。
Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、バーガー（Ｂｅｒｇ ｅｒ）およびキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）編、（１９８７）およびモレキュラークロ ーニング、ラボラトリ−マニュアル、マニアチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ ）等、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハーバ− １ＮＹ（１９８２）参照。
一般に、単離したポリペプチドコード遺伝子は、発現ベクターに機能的に結合す る。本発明の遺伝子の発現には、宿主細胞に適合する発現ベクター、好ましくは 植物細胞に適合するものを使用する。植物における遺伝子発現に有用な典型的発 現ベクターはよく知られており、ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）等、Ｍｅｔｈ。
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５３：２５３−２７７　（１９８７）が述べている アグロバクテリウを　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミドに由来するベクターが含ま れる。しかし、その他の発現ベクターも植物内で機能しうろことが知られている 。
たとえば、バー７　（Ｖｅｒｍａ）等、ＰＣＴ　刊行番号ＷＯ３７１００５５１ ゜およびコツキング（Ｃｏｃｋｉｎｇ）およびダベイ（Ｄａｖｅｙ）、Ｓｃ　１ ｅｎｃｅ、２３６：１２５９−１２６２　（１９８７）参照。
先に述べた発現ベクターには、プロモーターなどの発現コントロール要素を含ん でいる。ポリペプチドコード遺伝子は、発現ベクターに機能的に結合しており、 プロモーター配列へのＲＮＡポリメラーゼの結合および目的のポリペプチドコー ト遺伝子の合成が可能である。このポリペプチドコード遺伝子を発現する上で有 効なのは、誘導可能な、ウィルス由来、合成由来、構成的、時間調節可能な、空 間調節可能な、および時間空間調節可能なプロモーターである。発現ベクターの 選択、および最終的にポリペプチドコート配列が機能的に結合するプロモーター の選択は、当分野でよく知られているように目的の機能性、たとえば、蛋白質発 現の位置や時間およびトランスホームする宿主細胞に直接依存する。これらは、 組み替えＤＮＡ分子を構築する上で本質的な制限となっている。しかし、本発明 を実施するのに有用な発現ベクターは、少なくとも複製、および好ましくは機能 的に結合したＤＮ、Ａセグメントに含まれるポリペプチドコート遺伝子の発現も 行いうる。
好ましい態様において、ポリペプチドコート遺伝子の発現に用いる発現ベクター には、植物細胞中で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーが含 まれる。好ましい薬剤耐性マーカーは、発現によりカナマイシン耐性となる遺伝 子、即ち、ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｆｏｒ　Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｏｇｙ、ワイスバッハ（Ｗｅｌｓｓｂａｃｈ） およびＨ，ワイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）編、アカデミツクプレス、サン ディエゴ、ＣＡ　（１９８８）に述べられているような、ノパリンンンテースプ ロモーター、Ｔｎ５　ネオマイシンホスホトランスフエラーセ■およびツバリン シンテース３゛非翻訳領域を含むキメラ遺伝子である。有用な植物発現ベクター は、ファルマシア（ビス力タウエイ、ＮＪ）から市販されている。
相補的粘着末端を介してベクターにＤＮＡを機能的に結合させる方法がいくつか 開発されている。たとえば、挿入するＤＮＡセグメントおよびベクターＤＮＡに 相補的なホモポリマートラックを付加する。ついで、その相補的ホモポリマーテ ール間の水素結合によりそのベクターおよびＤＮＡセグメントを結合し、組み換 えＤＮＡ分子を生成する。
また、ＤＮＡセグメントを発現ベクターに結合するのに、一つ以上の制限エント ヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ−も使用される。バクテリオファーンＴ４Ｄ ＮＡリガーセのような平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒しつる酵素の 存在下、過剰量の合成リンカ−分子と平滑末端ＤＮＡセグメントをインキュベー トすることにより合成リンカ−を平滑末端ＤＮＡセグメントを結合させる。
この反応の産物は、その末端に合成リンカ−配列を有するＤＮＡセグメントであ る。これらのＤＮＡセグメントを適当な制限エンドヌクレアーゼで切断し、合成 リンカ−の末端に適合する末端を生ずる酵素で切断した発現ベクターとライゲー ションする。種々の制限エントヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ−は、ニュー イングランドバイオラプス（バーバリー、ＭＡ）などの業者から市販されている 。
ポリペプチドコート遺伝子を植物に導入する方法には、アグロバクテリウム（Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介の植物トランスホーメーション、プロトブラス トトランスホーメーション、花粉への遺伝子転位、再生器官への注入、未熟胚へ の注入がある。これらの方法には、それぞれ長所、短所がある。特定の植物種に 遺伝子を導入する特定の方法が、必ずしも別の植物に有効とは限らない。
植物組織全体にＤＮＡを導入でき、プロトプラストから植物体を再生なる必要が ないことから植物細胞に遺伝子を導入する方法としてアグロバクテリウム　ツメ ファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）仲介転 移は、非常に応用性の高い方法である。植物細胞にＤＮＡを導入するためにアグ ロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介発現ベクターを使用するこ とはよく知られている。たとえば、フレーリー（Ｆｒａｌｅｙ）等、Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：６２９　（１９８５）およびロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ ）等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、＋５３：２５３−２７７ （１９８７）参照。さらに、Ｔｉ−ＤＮＡの組み込みは、はとんど再配列を起こ さない比較的精密なプロセスである。転移させるＤＮＡの領域は境界配列によっ て決まり、通常介在配列は、スピールマン（Ｓｐ　ｉ　ｅ　Ｉｍａｎｎ）等、Ｍ ｏｌ。
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、２０５：３４（＋９８６）およびジョウゲンセン（Ｊｏ ｒｇｅｎｓｅｎ）等、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、２０７：４７１　（１９ ８７）に述べられている方法で植物ゲノムに挿入される。最近のアグロバクテリ ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　トランスホーメーションベクターは、ア グロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）同様大腸菌でも複製可能で、 クリ−（Ｋｌｅｅ）等、Ｐｌａｎｔ　ＤＮＡ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ａｇｅｎ ｔｓ。
Ｔ、ホーン（Ｈｏｒｎ）およびＪ、シェル（Ｓｃｈｅｌｌ）編、スブリンガーバ ーラグ、ＮＹ（１９８５）、１）ｌ）、１７９−２０３に述べられているように 簡便な取扱が可能である。さらに、最近のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ）仲介遺伝子転移に関するベクターの技術的進歩は、ベクター中の 遺伝子および制限部位の配列の改良により種々のポリペプチドコード遺伝子の発 現か可能なベクターの構築を可能にした。ロンヤース（Ｒｏｇｅｒｓ）等、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：２５３　（＋９８７）に述 べられているベクターは、挿入したポリペプチドコード遺伝子の直接的発現を目 的として、プロモーターおよびポリアゾニレ−ジョン部位の隣に簡便なマルチリ ンカ−領域を有し、本目的に使用するのに適している。
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介トランスホーメーショ ンが有効な植物において、この方法は遺伝子転移が容易であり、かつ明確な気で 有用である。しかし、バイトビアぐＢｙｔｅｂｉｅｒ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８４　：５３４５　（１９８７）に報告さ れているように、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクター を用いてアスパラガスでトランスジェニック植物が作製されているか、アグロバ クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に適した単子葉植物は少ないっした がって、商業的に重要な米、トウモロコシ、および小麦等の穀物類は、他の方法 でトランスホームレなければならない。植物のプロトプラストのトランスホーメ ーションは、リン酸カルシウム沈殿法、ポリエチレングリコール処理、エレクト ロポレーション、およびこれらの処理の組み合わせに基づいて行いうる。たとえ ば、ポトリカス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）等、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、１９ ９１７ｇ　（＋９８５）；フロム（Ｆｒｏｍｍ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３１９ニア ９１（１９８６）：ウチミャ（Ｕｃｈｉｍｉｙａ）等、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎ ｅｔ。
２０４：２０４　（＋９８６）１カリス（Ｃａｌｉｓ）等、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ｌ　：１１８３　（１９８７）；およびマーコツト（ Ｍａｒｃｏｔｔｅ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３３５：４５４　（１９８８）参照。
種々の植物へのこれらのシステムの応用は、プロトプラストから特定の植物種を 再生する能力に依存する。プロトプラストからの穀物を再生する代表的方法は、 フ／ムラ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ）等、Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２ニア４　（１９８５）；ｈリヤ７　（Ｔｏｒ　ｉ　ｙａｍａ ）等、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ、、４：８５　（１９８６）；アブダラ（ 、Ａｂｄｕｌｌａｈ）等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４　：　１０８７　（ １９８６）に報告されている。
葉、および他の組織のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介 トランスホーメーションは、天然でアグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）か感染する植物に限られ るようである。従って、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲 介トランスホーメーションは、双子葉植物に対してもっとも効率的な方法である 。しかし、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いたアスパ ラガスのトランスホーメーションも成功している。たとえば、バイトビア（Ｂｙ ｔｅｂｉｅｒ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｅ、、８４：５３４５ 　（１９８７）参照。
プロトプラストからうま（再生できない植物をトランスホームするには、インタ クトの細胞または組織にＤＮＡを導入する別の方法が使用される。たとえば、未 熟な胚または移植物からの穀物の再生は、ダンル（Ｄａｓｉｌ）、Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇＬ　６　：　３９７　（１９８８）の方法で行いつる。さらに、” 粒子カン”または高速マイクロブロジェクティル法も使用できる。このような技 術を用いて、毎秒ｌから数１００メートルのスピードに加速した小さな（０，５ ２５μメートル）金属粒子状のＤＮＡを細胞膜を貫通させ、細胞質に取り込ませ る。
これらは、フレイン（Ｋｌｅｉｎ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ 、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８５：８５０２　（１９８８）；およびマガベ（ＭｃＣａｂｅ ）等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：９２３　（１９８８）に報告されてい る。
この金属粒子は、細胞の幾つかの層を貫通し、組織片内で細胞のトランスホーメ ーションを起こす。金属粒子を用いてうまくトウモロコシ細胞がトランスホーム され、また繁殖可能で安定な形質転換タバコおよび大豆植物が生産された。組織 断片のトランスホーメーションで、プロトプラスト段階の通過が必要でなくなり 、トランスジェニック植物生産のスピードが上がった。
ゾウ（Ｚｈｏｕ）等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、＋０１４ ３３　（＋９８３）；Ｄ、ヘス（Ｈｅｓｓ）、Ｉｎｔｅｒｎ　Ｒｅｖ、Ｃｙｔｏ ｆ、、＋０７：３６７　（１９８７）；ルー（Ｌ　ｏ　ｕ）等、Ｐｌａｎｔ　Ｍ ｏｌ。
Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、６：１６５　（１９８８）に報告されているよう に花粉に直接ＤＮＡを転移させることにより植物にＤＮＡを導入できる。ポリペ プチドコード遺伝子の発現は、ベナ（Ｐｅｎａ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３２５：２ ７４（＋９８７）に述べられているように植物の再生器官にＤＮＡを注入するこ とによっても達成される。また、ニューハウス（Ｎｅｕｈａｕｓ）等、Ｔｈｅｏ ｒ。
Ａｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、７５：３０　（１９８７）；およびペンブルーフ（Ｂｅ ｎｂｒｏｏｋ）等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｂｉｏ　Ｅｘｐｏ　１９８６．　 バターワース、スト−７ハム、ＭＡ、ｐｐ、２７−５４　（＋９８６）に報告さ れているように未ｆｉ［または乾燥胚の再水和物の細胞に直接ＤＮＡを注入でき る。
単一の植物プロトプラストまたは種々の植物断片からの植物の再生もよく知られ ている。たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ、、Ａ　ワイズバッハ（Ｗｅ　ｉ　ｓ　５ｂａｃｈ）およびＨ ，ワイズバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）！、アカデミツクプレス、サンディエゴ 、ＣＡ（１，９８８）参照。この再生および生育過程には、トランスホーマント 細胞および新芽の選択、トランスホーマント新芽の根づけ、土壌における植物の 生育のステップが含まれる。
葉断片からのアグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によって導入された外来遺伝子を含む植物の再 生は、ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２２７：１２２９−１２ ３１　（＋９８５）に述べられている方法で行いうる。この操作では、トランス ホーマンＳを選択剤の存在下、フレーリー（Ｆｒａｌｅｙ）等、Ｒｒｏｃ、Ｎａ ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８０　：４８０３　（１９８３）に 述べられているようにトランスホームされた植物種の新芽の再生を誘導する培地 中で生育させる。一般に、この操作で２−４週間以内に新芽が生産され、ついで これら新芽のトランスホーマントを選択剤とバクテリアの増殖を防ぐ抗生物質を 含む適当な根誘導性培地に移す。選択剤の存在下で植物を形成する新芽のトラン スホーマントを土壌に移植し、根を作らせる。これらの操作は使用する植物種に よって変わるが、その方法はよく知られている。
λ　第二ポリペプチドをコートする遺伝子の第二植物種への挿入自然に第一ポリ ペプチドと会合し生物学的に機能的な蛋白質マルチマーを形成しうる第二ポリペ プチドをコードする遺伝子が有用である。この第二ポリペプチドをコードする遺 伝子を第二植物種に導入するのに用いる方法は、遺伝子を第一の同じ植物種に導 入するのに用いた方法と同じであり、先に説明した。
３、第一および第ニドランスホーマントの子孫集団の生産第一および第ニドラン スホーマントから子孫集団を生産するには、メンデル（Ｍｅｎｄｅ　１）（１８ ６５）（メンデルのオリンナルベーバーの英語訳は、別の人のコメントとメンデ ルの書籍目録と共に、植物ハイブリダセーション実験、ニシンバラ、スコツトラ ンド、オリバー　ボイド（Ｏｌｉｖｅｒ　Ｂｏｙｄ）編、１９６５に見られる） によって述べられている交配として知られている方法で行いうるう ４、蛋白質マルチマーを含む子孫の単離目的の蛋白質マルチマーを含む子孫は、 従来法を用いて生物学的蛋白質マルチマーの存在を検定する事により同定しつる 。このような方法には、ウェスタンブロッティング、イムノアッセイ、結合検定 法および生物学的蛋白質マルチマーを検出するよう設計された全ての検定法が含 まれる。たとえば、免疫学、自己−非自己認識の科学、フレイン（Ｋ　ｌ　ｅ　 ｉ　ｎ）　、ジョンウィリーアンドサンズ版、ＮＹ、ＮＹ（１９８２）参照。
スクリーニング法としては、蛋白質マルチマー上の生物学的活性部位が検出可能 なシグナルを生成することにより検出される方法が好ましい。このシグナルは、 直接的または間接的に生成され、たとえば、このようなシグナルには、複合体の 生成、触媒反応物の生成、エネルギーの放出または取り込み等が含まれる。例え ば、この方法で生産される抗体分子を含む子孫を、抗体　ラボラトリ−マニュア ル、バーロー（Ｈａ　ｒ　ｌ　ｏｗ）およびレーン（Ｌ　ａ　ｎ　ｅ）編、コー ルドスプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ（１ ９８８）に述べられているイムノアッセイと同様のＥＬＩＳＡまたはラジオイム ノアッセイ等の標準的イムノアッセイにおいてその抗体が抗原に結合するように 処理する。
さらに、本発明の特徴には、第一および第二ポリペプチドを含む蛋白質マルチマ ーを生産する方法を提供することにある。一般に、この方法には、本発明の植物 を培養すること、および培養により目的の蛋白質マルチマーを生産する植物を収 穫することを含んでいる。
目的の第一および第二ポリペプチドからなる蛋白質マルチマーを含む本発明の植 物は、良く知られている方法で培養する。本発明のトランスジェニック植物は、 いずれも培養することによりそれらが含む目的の蛋白質マルチマーを単離しつる 。
培養後、そのトランスジェニック植物を収穫し、生成した蛋白質マルチマーを回 収する。この収穫ステップは、植物体、その葉または、その根の収穫を含む。
このステップでその植物を殺してしまう場合と、そのトランスノエニ・ツク植物 の一部のみを収穫する場合には、その残りの部分をさらに生育させることもでき る。
好ましい態様の収穫ステップには、さらに、（１）前記トランスジェニック植物 の少なくとも一部をホモジナイズして植物ノ々ルプを作る、 （２）前記植物パルプから前記蛋白質マルチマーを抽出し、蛋白質マルチマー含 有溶液を作る、および （３）前記溶液から前記蛋白質マルチマーを単離する以上（１）−（３）のステ ップを含む。
従来法により、トランスジェニック植物の少なくとも一部をホモジナイズして植 物バルブを調製する。このトランスジェニック植物の一部が細かく壊れ、植物バ ルブが生成するならこのホモシナイセ−ジョン操作は手を使っても、機械的、ま たは化学的手段を用いても構わない。この植物、（ルプはいろいろなサイズのト ランスジェニック植物粒子を含んでいる。許容しうる植物粒子のサイズおよびサ イズ分布は、植物パルプから蛋白質マルチマーを抽出するのに用いる方法に依存 し、それらのパラメーターはよく知られている。
先に示したように生成した植物パルプから蛋白質マルチマーを抽出し、蛋白質マ ルチマー含有溶液を調製する。この抽出操作は、一般的なもので、当分野でよく 知られているものである。たとえば、この抽出操作には、適当な溶媒中での植物 バルブの浸せきが含まれる。この適当な溶媒は、植物）くシブ中に存在する蛋白 質マルチマーを溶解し、蛋白質マルチマー含有溶液を作りうる。この抽出操作に 有用な溶媒は良く知られており、水性溶媒、有機性溶媒、およびこれらの組み合 わせ物が使用される。
蛋白質単離に関する従来法を用いて、先の溶液から蛋白質マルチマーを単離する 。これらの方法には、免疫アフィニティー精製および単離する蛋白質マルチマー の特定のサイズ、電気泳動移動度、生物学的活性および、または荷電に基づく精 製法が含まれる。
Ｃ，トランスジェニック植物の利用 本発明は、流体サンプルから所定のリガンドを分離する新しい方法を提供する。
この方法は、以下の要素を含んでいる。
１、流体サンプルを本発明のトランスジェニック植物由来の植物細胞と混ぜて、 混合物とする。
２、　リガンドが植物細胞内に入り、蛋白質マルチマーに結合してその植物細胞 内で複合体を生成するのに十分な時間この混合物を維持する。
３、　この混合物から複合体含有植物細胞を取り出すことにより、その流体サン プルからリガンドを分離する。
流体サンプルを蛋白質マルチマーを含む本発明のトランスジェニック植物由来の 植物細胞と混合する。この蛋白質マルチマーは、レセプター、酵素、免疫グロブ リン産物、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、またはアブザイムであ る。当業者は、この蛋白質マルチマーが所定のリガンドを結合できなければなら ないことを理解できよう。流体サンプルは、液体でも気体でもよい。いずれの場 合もその混合操作は、植物細胞を液体、または気体のなかに置くことを含む。
また、植物細胞をその流体サンプルと完全に混合することもできる。この混合操 作は、流体サンプルを植物細胞と良く接触させて混合物を調製しなければならな い。
この混合物を、流体サンプル中に存在するリガンドが細胞に入るのに十分な時間 維持する。この過程は、拡散などの受動的過程でも、また流体サンプルに高圧を 掛けてそれを植物細胞中に送るようなエネルギーを使う過程でもよい。リガント が植物細胞中に入るのに必要な時間は良く知られており、予めこの至適時間を決 定しうる。植物細胞への侵入後、リガンドは蛋白質マルチマーと結合して複合体 を形成する。この蛋白質マルチマーがレセプターのとき、生成する複合体はレセ プター−リガント複合体である。この蛋白質マルチマーが免疫グロブリン、免疫 グロブリン分子、免疫グロブリン分子の一部、ＦａｂフラグメントまたはＦｖフ ラグメントであるとき、生成する複合体は免疫反応複合体である。蛋白質マルチ マーが酵素で、力りリガントが基質のとき、生成する複合体は酵素−基質複合体 である。蛋白質マルチマーがアブサイムであるとき、生成する複合体は免疫反応 複合体である。
植物細胞内で複合体が生成した後、その混合物から複合体含有植物細胞を除くこ とにより流体サンプルからリガントを分離する。混合物から植物細胞を除く方法 はよく知られており、機械的除去、濾過、沈殿およびその他の分離手段が含まれ る。
この方法で使用する植物細胞が生植物を構成しているとき、この手段はリガント を植物内に濃縮する。リガントが重要な栄養の場合、その細胞内に特定の栄養が 濃縮され、その植物の栄養価が増加する。リガントが環境汚染物の場合、これが 植物細胞内に濃縮され環境から除去しうる。もちろん、応用する方法においてリ ガントが植物細胞に入らなければならない。植物細胞に入ることが出来るリガン ドは、当分野でよく知られている。
また、本発明は金属イオンを含む流体サンプルから金属イオンを分離する方法に 関する。この特定の方法には、以下のステップが含まれる。
■、流体サンプルをキレート剤と混合し混合物とする。
２、金属イオンがキレート剤と結合し、金属イオンキレート複合体を形成するの に十分な時間このキレート混合物を維持する。
３、金属イオンキレート複合体を本発明の植物細胞と混ぜ、結合混合物を作る。
４、金属イオンキレート複合体が植物細胞に入り、蛋白質マルチマーと結合して 反応複合体を生成するのに十分な時間この結合混合物を維持する。
５、　この結合混合物から反応複合体含有植物細胞を除去して、流体サンプルか ら金属イオンを分離する。
この方法を実施するのに有用なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤ ＴＡ）およびビス（ビス−カルボキシメチルアミノプロピル）フェニルイソチオ シアネート（Ｃ■ＴＣ）がある。たとえば、ミアレス（Ｍｅ　ａ　ｒ　ｅ　ｓ） 等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４２：６８−７８　 （１９８４）参照。流体サンプルは気体でも液体でもよく、キレート剤と混合し てキレート混合物を生成する。
このキレート混合物を、金属がキレート剤と結合し金属イオンキレート複合体を 生成するのに十分な時間維持する。金属イオンがキレート剤と結合するのに、必 要な時間は、少なくとも使用するキレート剤の種類および金属の濃度に依存する 。
少なくとも一つの金属イオンがキレート剤と会合し、それと結合して複合体を作 るとき金属イオンキレート複合体が生成する。
この金属イオンキレート複合体を本発明の植物細胞と混合する。これらの植物細 胞は、金属イオンキレート複合体を特異的に結合しうる蛋白質マルチマーを含む 。たとえば、この植物細胞は、レアトン（Ｒｅａｒｄｏｎ）等、Ｎａｔｕｒｅ。
３１６：２６５−２６８　（１９８５）およびミアレス（Ｍｅａｒｅｓ）等、Ａ ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４２：６８−７８　（＋９ ８４）に述べられている免疫グロブリン分子と同じ金属キレート複合体に免疫特 異的な免疫グロブリンを含みうる。
この結合混合物を、金属イオンキレート複合体が植物細胞に侵入し蛋白質マルチ マーに結合するのに十分な時間維持して、植物細胞との反応複合体を形成する。
この結合混合物は、金属イオンキレート複合体が蛋白質マルチマーと結合する条 件下に維持いなければならない。このような条件は、当分野でよく知られている 。
金属イオンキレート複合体が植物細胞に入るのに必要な時間は様々で、少なくと も金属キレート複合体の濃度およびサイズに依存する。金属イオンキレート複合 体は、拡散などで受動的に植物細胞に入れることもできるし、また、圧力で強制 的に植物細胞に入れることもできる。金属イオンキレート複合体が植物細胞に存 在する蛋白質マルチマーと結合するとき生成する反応複合体は、キレート剤に結 合した金属イオン、キレート剤、および蛋白質マルチマーを含む。それから反応 複合体含有植物細胞を結合混合物から除くことにより、流体サンプルから金属イ オンを分離する。植物細胞は、機械的除去、濾過、沈殿およびその他の分離手段 を含む従来法で除去できる。本方法で使用する植物細胞が、生植物を構成する場 合、本方法で植物中に金属が濃縮される。
本発明のトランスジェニック植物は、従来法を用いてトランスホームした有性的 に交配可能な植物種から生産しつる。有用な植物種には、タバコ、トマト、豆、 アルファルファ、樫、および楓を含む双子葉植物、芝、トウモロコシ、穀類、オ ーツ麦、小麦、および大麦を含む単子葉植物、および裸子植物、毬果植物、トク サ、ヒカゲノカズラ、苔類、マッモ、蘇類、藻類、配偶体、シダの胞子体が含ま れる。
本発明のトランスジェニック植物は、プロモーターに機能的に結合したポリペプ チドコード遺伝子を含んでいる。有用なプロモーターは良く知られており、これ には誘導可能プロモーター、ウィルスプロモーター、合成プロモーター、構成的 プロモーター、時間調節ブロモ−クー、空間調節プロモーター、および空間時間 調節プロモーターが含まれる。
本発明の好ましい態様のトランスジェニック植物は、免疫グロブリン産物を含む 。
有用な免疫グロブリン産物は良く知られており、これには免疫グロブリン重鎮、 重鎮および軽鎖を含む免疫グロブリン分子が含まれる。一本鎖抗原結合蛋白質と しては、免疫グロブリンの半分、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント等が知 られている。免疫グロブリン産物の構造はよく知られており、スタイッ（Ｓｔｉ ｔｅｓ）等、基礎および臨床免疫学、第四版、ラングメディカルパブリケーショ ン、ロスアラモス、ＣＡに示されている。一本鎖抗原結合蛋白質の構造は、バー ド（Ｂｉｒｄ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−４２６　（１９８８）お よびラトナー（Ｌａｄｎｅｒ）のアメリカ特許Ｎｏ、４．７０４，６９２に示さ れている。
免疫グロブリン、または抗体分子は、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、１ｇ〜丁および ＩｇＥなど幾つかのタイプの分子を含む非常に大きな分子群である。一般に、抗 体分子は、各々二つの重鎮（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）からなり、その各々の鎖は可 変部（Ｖ）と不変部（Ｃ）の両方を含んでいる。免疫グロブリンの幾つかの領域 には、ポリメレースチェーンリアクションを用いて免疫グロブリン遺伝子を単離 するのに有用な保存的配列が含まれている。免疫グロブリン分子に関する代表的 保存配列を示すアミノ酸および核酸配列データは、カバット（Ｋａｂａｔ）等、 免疫学的に重要な蛋白質の配列、ナショナルインスチチウートオブヘルス、ベセ スダ、ＭＤ（１９８７）に編集されている。ＨまたはＬ鎖のＶ領域は、一般的に 各々保存配列を含み比較的変化の少ない四個のフレームワーク（Ｆ　Ｒ）領域（ 第１図）を含む。ｖ８のＦＲＩおよびＦＲ４（Ｊ領域）フレームワーク領域由来 の保存配列の使用は好ましい態様の一つであり、実施例で説明する。一般に、フ レームワーク領域は、いくつか、または全ての免疫グロブリン型に保存されてお り、従ってそこに含まれる保存配列は、可変部の単離に特に適している。
特に有用な免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎮である。免疫グロブリン 重鎮は、免疫グロブリン重鎮可変部と免疫グロブリン重鎮不変部を含んでいる。
免疫グロブリン重鎮可変部は、抗原結合部位（あるいは抗体結合部位）を含むポ リペプチドである。それゆえ、免疫グロブリン重鎮可変部は、特定のエピトープ を特異的に結合しつる。Ｖｏは、約１１０乃至１２５アミノ酸残基長であること が望ましい。このアミノ酸残基配列は、■□が結合しうる特定の抗原に応じて様 々である。通常、ジスルフィド結合で互いに結合し、約６０−７５アミノ酸残基 で分離されている少なくとも二個のシスティン残基を含む。　免疫グロブリンネ 変部（ＣＭ）には、アルファ、ガンマ１１ガンマ２、ガンマ３、デルタ、ミュー 、またはイプシロンのヒトアイソタイプがある。もし、免疫グロブリン重鎮がマ ウス由来なら、ＣＨはアルファ、ガンマｌ、ガンマ２ａ、ガンマ２ｂ、ガンマ３ ゜デルタ、ミュー、またはイプシロンアイソタイプとなる。ＣＩ（は、通常それ が単離される動物種に存在するアイソタイプとなる。ＣＭが、種々のアイソタイ プに由来するドメインからなり、所定の生物学的機能を増加、または提供するこ ともある。いくつかの異なる不変部アイソタイプ由来のＤＮＡ配列を含む遺伝子 を組み合わせて、キメラＣＨポリペプチドをコードするキメラ遺伝子を生成しう る。
このＤＮＡおよび蛋白質は、使用可能な情報源から容易に得ることが出来る。た とえば、アーリー　フード（Ｅａｒｌｙ　Ｈｏｏｄ）、遺伝子工学、セトロ−（ Ｓｅｔｌｏｗ）およびボラック−（Ｈｏ　１１　ａｅｎｄｅ　ｒ）編、３巻、プ レナム・パブリッシング・コーポレーション、（＋９８１）、　ｐＩ）、１５７ −１８８、およびカバティー（Ｋａｂａｔｙ）等、免疫学的に重要な配列、ナシ ョナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ（＋９８７）参照。
これら二つの情報源は、Ｖ、、ＶＬ、およびＣＬ遺伝子および蛋白質に関する多 くの配列を含んでいる。
好ましい免疫グロブリン産物は、先に述べた免疫グロブリン重鎮および免疫グロ ブリン軽鎖を含むものである。免疫グロブリン軽鎖は、免疫グロブリン軽鎖可変 部（Ｖｌ）および免疫グロブリン軽鎖不変部（ＣＬ）からなる。ＶＬは、約９５ −１１５アミノ酸残基長である。ヒトおよびマウスに存在するＣ０には、二つの アイソタイプ、ラムダアイソタイプおよびカンパアイソタイプがあることは良く 知られている。
別の好ましい態様の免疫グロブリン産物は、■、のみか、またはＶｔ、と会合し たＶ。から成り立ちＦｖフラグメントを形成している。
本発明のトランスジェニック植物は蛋白質マルチマーを含んでいるっこの蛋白質 マルチマーは、上述の免疫グロブリン産物、酵素、特定のリガントを結合しつる レセプター、またはアブザイムである。
本発明の酵素は、少なくとも二つのポリペプチドを含む蛋白質マルチマーである 。これら二つのポリペプチドは、本発明の方法によりトランスジェニック植物に 導入される遺伝子によりコードされている。有用な酵素には、アスパラギンサン トランスカルバミラーセ等がある。別の好ましい態様には、特異的リガンドを結 合しうるレセプターがある。一般に、このレセプターは、本発明の方法でトラン スジェニック植物に導入される遺伝子によってコードされる少なくとも二つのポ リペプチドからなる。このようなレセプターおよびこれらの各リガンドには、ヘ モグロビン、０７、プロティンキナーゼ、ｃＡＭＰ等がある。
本発明の別の好ましい態様の免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎮および それに関連する可変部、または会合して免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆｖまた は免疫グロブリン分子の実質的部分を形成する免疫グロブリン重鎮および軽鎖に よって構成されるアブザイムである。代表的アブザイムは、トラモンタノ（Ｔｒ ａｍｏｎｔａｎｏ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４：１５６６−１５７０　（＋９ ８６）　ボラック（Ｐｏｌｌａｃｋ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４：１５７０− １５７３　（＋９８６）：ノヤンダ（Ｊａｎｄａ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４１ 　：１１８８−１１９１　（＋９８８）　およびジャンプ（Ｊ　ａ　ｎ　ｄ　ａ ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４・４３７−４４０　（１９８９）に報告されてい る。
一般的に、本発明の蛋白質マルチマーは、少なくとも二つのポリペプチドを含む 。敷かし、二つ以上のポリペプチドを含むこともできる。これらの各ポリペプチ ドは、別々のポリペプチドコード遺伝子によってコードされている。これらのポ リペプチドは、ジスルフィド結合、水素結合等により互いに会合し蛋白質マルチ マーを形成する。
本発明のトランスジェニック植物の子孫、またはその子孫によって生産されるト ランスジェニック植物も本発明の一部に含まれる。これらのトランスジェニック 植物は、親のトランスジェニック植物に含まｎているものと同じ蛋白質マルチマ ーを含む。このようなトランスジェニック植物は、親植物の無有性的増殖または 自家受粉により作製できる。植物の無有性的増殖または自家受粉の過程は、良く 知られている。
さらに、本発明は、複合体を含むトランスジェニック植物に関する。一般に、こ のような複合体含有トランスジェニック植物は、流体サンプルにキレート剤を添 加してキレート混合物を調製し、流体サンプル中に存在する金属がキレート剤と 結合して金属キレート複合体を形成した後、この金属キレート複合体を本発明の トランスジェニック植物細胞と混合して結合混合物を生成するのに十分な時間、 この混合物を維持し、さらに、この結合混合物を、金属キレート複合体が植物細 胞中に入り、その植物細胞中に存在する蛋白質マルチマーと結合してその細胞内 で複合体を形成するのに十分な時間維持することにより得られる。
また、本発明は、金属キレート複合体および免疫グロブリン産物を含む反応複合 体を含有するトランスジェニック植物に関する。一般に、このトランスジェニッ ク植物は、本発明の方法で作製される。
Ｄ、生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマ一本発明は、（ａ）免疫グロ ブリンアミノ酸残基配列、および（ｂ）コア部分、およびＮ−アセチルグルコサ ミン含有アウターブランチを含むオリゴサツカライドを有するポリペプチドを少 なくとも二つ含み、しかもシアル酸残基を含まない生物学的に活性なグリコポリ ペプチドに関する。
好ましい態様の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーには、免疫グロ ブリン、Ｔ−細胞レセプター複合体分子、主要組織適合性複合体抗原等のアミノ 酸残基配列のような免疫グロブリンスーパーファミリー分子のアミノ酸残基配列 が含まれる。免疫グロブリン重鎮、免疫グロブリン重鎮可変部、または免疫グロ ブリン重鎮可変部の一部のアミノ酸残基配列を含む生物学的に活性なグリコポリ ペプチドマルチマーが特に好ましい。免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン軽鎖 可変部、または免疫グロブリン軽鎖可変部の一部のアミノ酸残基配列を有するグ リコポリペプチドマルチマーも好ましい。
ある好ましい態様の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーには、グリ コリル化コア部分とＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチ、および池 のアミノ酸残基配列を含む少なくとも一つの別のポリペプチドに結合する免疫グ ロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドが含まれる。好ましい態 様の別のポリペプチドには、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、免疫グロ ブリン分子、免疫グロブリン重鎮、免疫グロブリン重鎮可変部、免疫グロブリン 軽鎖、免疫グロブリン軽鎖可変部、または免疫グロブリン軽鎖の一部のアミノ酸 配列が含まれる。
別の好ましい態様のグリコポリペプチドマルチマーには、さらにこのグリコポリ ペプチドマルチマーに存在する免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の 一部に結合する免疫グロブリン重鎖が含まれる。重鎖は、ＩｇＡおよび１ｇＭポ リマーおよびＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの他の免疫グロブリンおよび他の種々 のサブクラスの免疫グロブリンアイソタイプに会合するポリペプチドである。
ヒトおよびマウスの重鎖のアミノ酸組成は、モル（Ｍｏｌｅ）等、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ、Ｌ６：３５０７　（１９７７）、７ツクス（Ｍａｘ）およびコー スメイヤー（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ）、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６１：８３２（ ＋９８５）、カン（Ｃａｎｎ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　 ｉ、。
ＵＳＡ、７９：６６５６　（１９８２）、およびコシュランド（Ｋｏｓｈ　１ａ ｎｄ）。
Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、３　：４２５　（１９８５）に報告され ている。重鎖は、酸性アミノ酸を多く含み、グリシン、スレオニン、システィン は少な（、メチオニンはたった一つ含んでいる。重鎖には８個のシスティン残基 が含まれており、そのうちの６個は部間のジスルフィド結合に関与しており、他 の２個はアルファまたはミュー重鎖などの免疫グロブリン重鎮の末端から二個目 のシスティン残基に結合している。メンデス（Ｍｅｎｄｅｚ）等、Ｂｉｏｃｈｍ 、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、５５：１２９１　（１９７３）、 メステキー（Ｍｅｓｔｅｃｋｅｙ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、、ＵＳＡ、７１：５４４　（１９７４）、メステキ−（Ｍｅｓｔｅｃｋｅｙ） およびジュロヘンロバ−（Ｓｃｈｒｏｈｅｎ　１ｏｈｅｒ）、Ｎａ　ｔｕｒｅ、 ２４９゜６５０（１９７４）参照。
また、好ましい態様のグリコポリペプチドマルチマーには、グリコポリペプチド マルチマー中に存在する免疫グロブリン重鎮アミノ酸残基配列のＦｃ領域に結合 する分泌要素が含まれる。この分泌要素は、５４９−５５８アミノ酸残基の一本 のポリペプチド鎖および５−７個のオリゴサツカライド側鎖としてスパラギン残 基にＮ−グリコシド結合により結合する大量の炭水化物を含んでいる。モストフ （Ｍｏ　ｓ　ｔ　ｏ　ｖ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３０８：３７　（１９８４）；エ イフアート（Ｅｉｆｆｅｒｔ）等、Ｈｏｐｐｅ　５ｅｙｌｅｒ’　ｓ　Ｃ，Ｐｈ ｙｓｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、、３６５：１４８９　（１９８４）；ヘレマンズ（Ｈｅ　ｒｍａ　ｎ 　ｓ）　。
Ｎ、Ｔｈｅ　Ａｎｔ　ｉｇｅｎｓ、Ｍ、セラ（Ｓｅｒａ）編、２：３６５．アカ デミツクプレス、ニューヨーク（１９７４）；ドアす（Ｔｏｍａｎａ）等、Ａｎ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ−，８９：１１０　（１９７８）；ブルカヤスサ（Ｐｕｒ ｋａｙａｓｔｈａａ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５４　：　６５８３　 （１９７９）、およびミゾグチ（Ｍｉ　ｚｏｈｕｃｈ　ｉ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２５７：９６１２　（１９８２）参照。分泌要素には、部内ジスル フィド結合に関する２０個のシスティン残基が含まれている。好ましい態様の分 泌要素は、グリコポリペプチドマルチマーに存在する免疫グロブリン重鎮のＦｃ 領域に存在するシスティン残基にジスルフィド結合で結合している。
本発明は、グリコジル化したコア部分およびＮ−グルコサミン含有アウターブラ ンチを有するポリペプチドを含み、かつ、検出可能なシアル酸を含まないグリコ ポリペプチドに関する。このポリペプチドは、これに存在するスパラギンアミノ 酸残基のアミド基にＣ（１）炭素を介して直接結合するＮ−アセチルグルコサミ ンすりゴサッ力ライトを含むグリコジル化したコア部分を有している。このグリ コジル化したコア部分は、第６図のボックス領域で示したＭａｎαｌ−３１−３ （αｌ−６１−６）βｌ　１−４ＧＩ　ｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ という構造を有している。また、このポリペプチドは、Ｎ−アセチルグルコサミ ンを含むアウターオリゴサンカライドブランチ（アウターブランチ）を有する。
複合体およびハイブリッドアスパラギン結合オリゴサツカライドの両方とも、Ｎ −アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むが、高マンノースオリゴサ ッカライトは含まない。バクテリア細胞はアスパラキンに結合するグリコジル化 したコア部分を含まないつイースト細胞は複合体型またはハイブリッド型のいず れのアスパラギン結合オリゴサツカライドも含まない。それゆえ、イーストはＮ −アセチルグルコサミン含有アウターブランチを持たない。植物細胞は、アスパ ラギンに結合するグリコジル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含 有アウターブランチを有するポリペプチドを生産しうる。
グリコポリベブチトマルマーは、グリコジル化したコア部分およびＮ−アセチル グルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドを含み、かつこのマル チマーには、検出可能なシアル酸残基は含まれない。哺乳類の糖蛋白質の末端炭 水化物として存在するシアル酸は、植物蛋白質の炭水化物としては同定されてい ない。植物に存在する末端炭水化物残基には、キシロース、フコース、Ｎ−アセ チルグルコサミン、マンノースまたはガラクトースが含まれており、このことは スターム（Ｓ　ｔ　ｕ　ｒｍ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２　：１３ ３９２（１９８７）に報告されている。別の特徴として、植物の糖蛋白質および その蛋白質に結合する炭水化物は、哺乳類の糖蛋白質に非常に似ている。植物中 で生産されるグリコポリペプチドマルチマーには、グリコジル化したコア部分と Ｎ−アセチルグルサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドが含まれる が、検出可能なシアル酸残基は含まれないつアミノ酸残基配列内に、Ｎ−結合グ リコシル化シグナル、アスパラギン−Ｘ−セリン／スレオニン（Ｘは、おそらく プロリンまたはアスパラギン酸以外のアミノ酸残基）を有するポリペプチドをコ ードする遺伝子は、植物細胞内に導入されたときその配列のアスパラギン残基に 結合する（Ｎ−結合）オリゴサツカライドによりグリコジル化される。グリコジ ル化シグナルとして機能するポリペプチド配列の一般的しヴユーとしては、マー シャル（Ｍａｒｓｈａ　ｌ　１）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４１： ６７３　（１９７２）およびマーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｓｏｃ、Ｓｙｍｐ、、４０：１７　（１９７４）物細胞内でのこれらのシグナ ルは、哺乳類細胞内で見られるような末端シアル酸残基を含むアスパラギン結合 オリゴサツカライドは生成せず、Ｎ−結合グリコシル化シグナル配列を含むポリ ペプチドは、グリコジル化したコア部分とＮ−アセチルグルコサミン含有アウタ ーブランチを含むようにグリコジル化され、検出可能なシアル酸残基は含まれな い。
本発明のグリコリペプチドマルチマー、蛋白質、またはポリペプチドには、小麦 胚芽アゲルチンまたはりシナス　コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉＳ ）アゲルチン等のシアル酸に特異的なレクチンへの特異的結合が無いことで示さ れるように検出可能なシアル酸残基が含まれない。特定のレクチンへのグリコジ ル化したポリペプチド鎖の結合を測定する方法は良く知られている。たとえば、 フェイ（Ｆａｙｅ）等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１４９：２１８　（１９ ８５）およびゴールドスティン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）等、Ａｄｖ、Ｃａｒｂｏ ｈｙｄｒ、Ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３５　：Ｉ２７　（１９７８）参照。
グリコジル化したポリペプチド鎖か特定のレクチンに結合することを検定する方 法には、レクチンカラムを使用する方法やグリコジル化したポリペプチドをニト ロセルロースに結合させ、ビオチン化したレクチンで検出する方法が含まれる。
レクチンの特異性は、シアル酸残基等の特定のオリゴサツカライドとレクチンの 結合を競合させることにより測定できる。一般的シアル酸残基を第７図に示した 。
免疫グロブリンスーパーファミリー分子および免疫グロブリンは、結合する種々 の炭水化物残基を有する。一般にこの炭水化物残基は、その重鎮可変部内にトリ ペプチドアクセプター配列アスパラギン−Ｘ−セリン／スレオニン（Ｎ−結合シ グナル）が存在する場合以外、免疫グロブリン重鎮不変部に存在する。また、そ のアミノ酸残基配列内にトリペプチドアクセプター配列（Ｎ−結合グリコシル化 配列）を含む他の免疫グロブリンスーパーファミリー分子も、そのトリペプチド アクセプター配列のアスパラギンに結合する炭水化物を含む。第８図は、ジエス ケ（Ｊｅｓｋｅ）およびカブラ（Ｃａｐｒａ）、基礎免疫学、Ｗ、　Ｅ、ポール （Ｐａｕｌ）編、レーベンプレス、ニューヨーク、ＮＹ（１９８４）に報告され ている７個のヒトの重鎮に結合する典型的炭水化物を示している。炭水化物結合 部位は、種々の種および相当するクラスの免疫グロブリン重鎮間で非常によく保 存されている。表Ｂは、各ヒト免疫グロブリン重鎮に関する種々のオリゴサツカ ライドを示している。
グリコポリペプチドマルチマーに存在するポリペプチドには、その免疫グロブリ ン分子アミノ酸残基配列内にＮ−結合グリコリル化シグナルが含まれることが望 ましい。別の好ましい態様では、Ｎ−結合グリコシル化は、免疫グロブリン残基 配列ではないポリペプチドの領域に存在する。
好ましい態様の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、分泌性Ｉｇ Ａを含む。分泌性ＩｇＡは、４個の免疫グロブリンアルファ重鎮、４個の免疫グ ロブリン軽鎖、Ｊ鎖および分泌性要素からなり、これらがすべて結合してＩｇＡ ダイマーを含む分泌性ＩｇＡ分子を形成している。この分泌性ＩｇＡ分子は、特 定の抗原に特異的に結合する重鎮および軽鎖可変部を含む。この分泌性ＩｇＡ分 子は、Ｉ　ｇＡＩまたは１ｇＡ２を含みうる。分泌性１ｇＡに関する一般的議論 については、メステキー（Ｍｅｓｔｅｃｋｅｙ）等、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎＩ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４０：１５３　（１９８７）参照。
動物の最終的に集合した分泌性１ｇＡは、二つの異なる細胞型　Ｊ鎖を結合する ＩｇＡを生産する血漿細胞および分泌性１ｇＡを生産する上皮細胞の産物である 。複合体のトランシトシス、および分泌は、細胞のラミナー表面のみで起こる膜 の働きによる。この複合体の４個の成分（アルファ、ガンマ、Ｊ、ＳＣ）の相互 作用は、ムコサ表面に関連する分解的環境に対して例外的に耐性のある免疫グロ ブリン構造を生ずる。
池の好ましい態様の生物学に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、全てジス ルフィド結合で互いに結合する５個のＩｇＭ分子、３個のＪ鎖分子および分泌要 素を含んでいる。
いずれの分泌性免疫グロブリン（ＩｇＭおよびＩｇＡ）も、蛋白質分解や消化に 対して耐性があり、従って肺や消化管などムコサ表面に存在する場合にも活性を 有する。トラン（Ｔｏｍａｓ　ｉ）、Ｎ、基礎および臨床免疫学、ｐ、１９８゜ ラング　メディカル　バブリケーション、ロスアラモス、ＣＡ（１９８２）参照 。
好ましい態様の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、その中に触 媒部位を含む。この触媒部位は、一つ以上のポリペプチドから形成される酵素部 位である。一般に、この触媒部位は、単独で、または他のポリペプチドのアミノ 酸残基配列と共に触媒部位を形成することが知られているアミノ酸残基配列によ って規定される。この触媒部位は酵素の活性部位、または免疫グロブリンの結合 部位となる。たとえば、トラモンタノ（、Ｔｒａｍｏｎ　ｔａｎｏ）等、５ｃｉ ｅｎｃｅ、２３４：１５６６　（１９８６）参照。また、本発明は、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ、　ワース　バブリッシャー、ＮＹ（＋９７５）に述べられてい る酵素などの触媒部位を含む別の酵素に関する。
別の好ましい態様におけるように、本発明は、グリコジル化コア部分およびＮ− アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドを含む生物学 的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、かつ別の免疫グロブリン分子アミ ノ酸残基配列を含むポリペプチドに結合する免疫グロブリン分子アミノ酸残基配 列を含み、検出可能なンアル酸を含まないマルチマーに関する。
本発明は、グリコポリペプチドマルチマーの触媒部位が、第一および第二部分か らなる触媒性グリコポリペプチドマルチマーに関する。また、触媒性部位の第一 部分は、免疫グロブリンアミノ酸残基配列に規定される。触媒性部位の第二部分 は、別の免疫グロブリンアミノ酸残基配列に規定される。これらの触媒性部位の 第一および第二部分が会合して、より大きい触媒性部位を形成する。より好まし い態様では、触媒性部位の第一部分は免疫グロブリン重鎮可変部アミノ酸残基配 列により規定され、触媒性部位の第二部分は重鎮アミノ酸残基配列と会合しより 大きい触媒性部位を形成する免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ酸残基配列により 規定される。
また、本発明は、 （１）グリコジル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウター ブランチおよび免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有し、かつマウス免疫グ ロブリン結合レクチンを結合しないポリペプチド、および（２）前記ポリペプチ ドに結合し、前記免疫グロブリンアミノ酸残基配列とは異なる免疫グロブリンア ミノ酸残基配列を含む別のポリペプチド、以上（１）および（２）を含む生物学 的に活性なグリコポリペプチドマルチマーに関する。
マウス免疫グロブリン結合レクチンには、小麦胚芽アグルチニンおよびリシナス 　コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）アグルチニン等の末端シアル 酸残基に特異的に結合するレクチンが含まれる。マウス免疫グロブリン結合レク チンは、末端シアル酸残基に特異的であり、植物で生産された免疫グロブリンは 末端シアル酸残基を含まないことから植物細胞で生産された免疫グロブリンには 結合しない。レクチン結合性に関する一般的議論については、オサワ（Ｏｓａｗ 　ａ　）等、Ａｎａ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５６：２１−４２　（１９８ ７）参照。
Ｅ、植物で生産された免疫グロブリンを用いた受動免疫化本発明は、動物のムコ サ表面と所定のリガンドを結合しつる本発明の生物学的に活性なグリコポリペプ チドマルチマーを含む組成物を接触させることにより所定のリガントに対して動 物を受動免疫化する方法に関する。
所定の抗原を結合しつる免疫グロブリン分子などの生物学的に活性なグリコポリ ペプチトは、植物細胞で効率的、かつ経済的に生産される。これらの免疫グロブ リン分子にはシアル酸が含まれないが、グリコジル化したコア部分およびＮ−ア セチルグルコサミン含有アウターブランチが含まれる。好ましい態様における免 疫グロブリン分子は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、分泌性１ｇＭまたは分泌性ＩｇＡである 。
分泌性ＩｇＭおよび分泌性ＩｇＡ等の分泌性免疫グロブリンは、蛋白質分解およ び変性に対して耐性があり、厳しい環境で使用するには適している。この厳しい 環境には酸性環境、高温環境、その他の厳しい環境が含まれる。たとえば、動物 の消化管は、プロテアー七と酸が存在する厳しい環境である。コバヤシ（Ｋ。
ｂａｙａｓｈｉ）等、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ　ｔｒｙ、ｌ　Ｏ：　７３　（ １９７３）参照。動物の受動免疫は、動物のムコサ表面とグリコポリペプチドマ ルチマーを接触させることにより誘導する５）動物には、肺、消化管、上咽頭腔 、暗渠などを含む種々のムコサ表面がある。一般に、これらのムコサ表面には唾 液、涙、鼻汁、気管支液、腸液、胆汁、子宮液などを含む種々の分泌液を生産す る細胞が含まれる。
好ましい態様の免疫グロブリン分子などのグリコポリペプチドマルチマーは、所 定の抗原に対して免疫特異的である。一般に、この抗原は壊死化腸炎、下痢およ び腸における発癌性物質の吸収によるガンなどのムコサ表面に関連する病気を起 こす病原体上に存在する。たとえば、マクナブ（ＭｃＮａｂｂ）およびトマシ（ Ｔｏｍａｓｉ）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、３５　：４７７　（ １９８１）およびローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４３ ：１４６２（１９８９）参照。ムコサ表面関連病を引き起こす典型的病原体には 、大腸菌、Ｓ、チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｖ、　コレラ（ｃ ｈ。
１ｅｒａ）およびＳ、ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）等のバクテリアおよびウィ ルス病原体が含まれる。グリコポリペプチドマルチマーは、これらの病原体に結 合し、ムコサ関連またはムコサ侵入病を防ぐことが出来る。
動物のムコサ表面に接触させる好ましい態様の組成物には、植物物質および所定 のリガンドを結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーが含ま れる。この植物物質は、植物細胞壁、植物オルガネ乞植物細胞質、グリコポリペ プチドマルチマーを含む植物細胞そのもの、生植物などである。この植物細胞物 質は、約１００ナノグラムのグリコポリペプチドマルチマー当たり約１００００ グラムの植物物質の割合から、ｌＯダラムのグリコポリペプチドマルチマー当た り約１００ナノグラムの割合の範囲で存在する。より好ましい態様の植物物質は 、Ｉｍｇのグリコポリペプチドマルチマー当たり約１００００グラムの植物物質 の割合から、１グラム当たり１００ナノグラムの割合の範囲で存在する。他の好 ましい態様における植物物質は、ｌモリグラムのグリコポリペプチドマルチマー 当たり約１００００グラムの割合から、５００ｍｇのグリコポリペプチドマルチ マー当たり約１ｍｇの植物物質の割合の範囲で存在する。
好ましい態様における生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを含む組 成物は、治療組成物である。活性成分としてポリペプチドまたは蛋白質を含む治 療組成物の調製方法は、良く知られているっこの治療組成物は、溶液またはサス ペンシヨンなどの液体、または、摂取前に溶液またはサスペンジョンを調製する のに適した固体である。また、この治療組成物は、エマルジョンとすることもで きる。この活性治療成分は、一般に医薬的に許容可能で、かつ活性成分に適合す る無機および、または有機キャリヤーと混合する。一般に、このキャリヤーは、 治療組成物に混合したとぎ組成物に適度の濃度と形態を与える概ね不活性な物質 を含む生理学的に許容しうる賦形剤である。たとえば、キャリヤーとしては、水 、食塩水、デキストロース、グリセリンやこれらの混合物が適する。さらに、必 要な場合は、湿潤剤またはエマルジョン剤や活性成分の効果をあげるｐＨ緩衝剤 などの少量の補助物質が含まれる。また、本発明は、栄養価を有するキャリヤー を含む治療組成物にも関する。
好ましい態様のおける生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを含む組 成物には、病原体抗原に免疫特異的な免疫グロブリン分子が含まれる。病原体と は、他の生物に病気を起こす生物である。ムコサ病原体抗原に免疫特異的な免疫 グロブリンが特に好ましい。ムコサ病原体抗原は、ムコサ組織を通して生物に侵 入するか、またはムコサ関連病を引き起こす病原体にある。ムコサ病原体には、 肺病原体、重病原体、腸病原体、歯痛原体などがある。デービス（Ｄａｖｉｓ） 等、Ｍｉ　ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３編、ハーバ−アンドロー版、バーガース タウン、ＭＤ　（１９８０）参照。
病原体に免疫特異的な抗体は、標準的モノクローナル抗体生成技術を用いて生産 しうる。抗体・ラボラトリ−マニュアル、バーロー（Ｈａ　ｒ　Ｉ　ｏｗ）等、 編、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ（１９８８）参照。軽鎖および重鎮可変 部をコードする遺伝子は、ポリメレースチェーンリアクションおよび適当に選択 したプライマーを用いて単離しつる。オランディー（Ｏｒｌａｎｄｉ）等、Ｐｒ ｏｃ。
Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８６　：３８３３　（１９８９）お よびヒユーズ（Ｈｕｓｅ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５　（＋９８９ ）参照。
さらに、この可変部を、ハイヤット（Ｈｉａｔｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３４２ニ ア６−７８　（＋９８９）に述べられている発現ベクターなどの植物発現ベクタ ーに挿入する。
好ましい態様における生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、腸病 原体抗原に免疫特異的な免疫グロブリンである。大腸菌、サルモ不う（Ｓａｌｍ ｏｎｅ　ｌ　ｌ　ａｅ）、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ） 、サルモネラ　チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ ｍ）、およびストレプトコッカス　ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ 　ｍｕｔａｎｓ）等、消化管の病気を起こすバクテリア、ウィルスおよび寄生虫 などの腸病原体に免疫特異的な免疫グロブリンが特に好ましい。また、本発明は 、ハイブリドーマＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８３２９によって生産される抗体など、ジ フテリアトキシンに免疫特異的な免疫グロブリン、ハイブリドーマＤ２５３−１ ５−６　（ＡＴＣＣＮｏ、Ｈ８７８９）によって生産される抗体など、シュード モナス　エルジノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エクソ トキシンＡに免疫特異的な抗体、ハイブリドーマＴＰＴ　Ａｌ　（ＡＴＣＣＮｏ 、ＣＲＬ１７７１）またはＴＦＴＢＩ　（ＡＴＣＣＮｏ、１７５９）によって生 産される免疫グロブリン等、リシンＡまたはＢ鎖に免疫特異的な免疫グロブリン 、１１イブリド−７１３ＱＣ／２Ｂ／８　（ＡＴＣＣＮｏ、８０８８）によって 生産される抗体など、シストツマ　マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｍａｎ ｓｏｎｌ）糖蛋白質に免疫特異的な免疫グロブリン：ハイブリドーマ１３Ｃ４（ ＡＴＣＣＮｏ、１７４９）によって生産される抗体など、シゲラ５ＨＩＧＡトキ シンまたはシケラ様トキシンに免疫特異的な免疫グロブリン、ハイブリドーマ９ Ｆ１２　（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８１７７）およびバイブリド−７８Ａｌ　３　（ ＡＴＣＣＮｏ、　ＨＢ８５０１）によって生産される免疫グロブリンなど、破傷 風トキシンに免疫特異的な免疫グロブリン、ハイブリドーマ７Ｃ２Ｖ５Ｃ１２（ ＡＴＣＣＮｏ、　ＨＢ８６７８）などトリチネラ　スピラリス（Ｔｒ　１ｃｈｉ ｎｅ　Ｉ　１ａｓｐｉｒａｌｉｓ）に免疫特異的な免疫グロブリン；Ｄ３−２Ｈ ２−９−２１（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ　１１４）、　バイブリド−７１５Ｆ３−１ 　（ＡＴＣＣＮＯ，ＨＢ４７）、ハイブリドーマ３Ｈ５−１（ＡＴＣＣＮｏ、Ｈ Ｂ４６）、ハイブリドーマ５Ｄ４−１１　（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ４９）、ｔ１イ ブリドーマＩＨ１０−６（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ４８）によって生産される免疫グ ロブリンなど、デング熱ウィルスまたは複合体に免疫特異的な免疫グロブリン： ハイブリドーマＨ２５Ｂ１０　（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ８０１７）、ハイブリド ーマＨ２１Ｆ８−Ｉ　（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ８０１８）など、Ｂ型肝炎表面抗 原に免疫特異的な免疫グロブリン；ハイブリドーマ１Ｄ４８ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ ８０６８）。
ハイブリドーマ３９−８　（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８１８０）、ハイブリドーマ５ ２−８　（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８１８１）、ハイブリドーマ３Ｎｌ　（ＡＴＣＣ Ｎｏ、　ＨＢ８０６７）によって生産される免疫グロブリンなど、ヘルペスシン プレックスウィルスに免疫特異的な免疫グロブリン；ＨＫ−ＰＥＧ−１（ＡＴＣ ＣＮｏ、ＣＬ１８９）、　バイブリド−７Ｍ２−１ｃ６−４Ｒ３（ＡＴＣＣＮｏ 。
ＨＢ６４）によって生産される免疫グロブリンなど、インフルエンザウィルスに 免疫特異的な免疫グロブリン：ハイブリドーマ９−３−４　（ＡＴＣＣＮｏ、８ ９３５）によって生産される免疫グロブリンなど、パラインフルエンザウィルス に免疫基特異的な免疫グロブリン：および３Ｃ９−ＤＩ　１−Ｈｌ　１　（ＡＴ ＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　Ｉ　７４５）によって生産される免疫グロブリンなど、バ ルボウイルスに免疫特異的な免疫グロブリンであるグリコポリペプチドマルチマ ーに関する。
別の好ましい態様における組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマーは 、ストレプトコッカス　ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａ ｎＳ）などの歯痛原体抗原に免疫特異的な免疫グロブリン分子である。特にバイ ブリド−７１５８２（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８５１０）によって生産される免疫グ ロブリンなどのストレプトコッカス　ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ　ｍｕｔａｎｓ）に免疫特異的な免疫グロブリンが好ましい。
本発明は、を推動物などの動物の受動免疫化に関する。好ましい態様においては 、魚、鳥、爬虫類、両生類または昆虫が受動免疫化される。また、別の好ましい 態様では、ラン、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなどが受動免疫化される。特に好まし い態様では、成熟しだ哺乳類が受動免疫化される。
好ましい態様において、乳離れし、もはや母親からのミルクを摂取しない哺乳類 などの動物が受動免疫化される。そのような動物の受動免疫は、その動物に所定 のリガンドに免疫特異的なグリコポリペプチドマルチマーを含む十分な量の組成 物を投与し、動物体内に予防濃度のグリコポリペプチドマルチマーを提供するこ とにより誘導する。免疫グロブリンなどグリコポリペプチドマルチマーの予防濃 度とは、動物に存在する病原体と結合し、これが検出可能な病気が起こるのを防 ぐのに十分な量を意味するっ予防濃度を実現するのに必要なグリコポリペプチド マルチマーを含む組成物量は、当分野でよく知られているように動物のサイズ、 存在する病原体の量、その病原体に対する特定のグルコポリペプチドマルチマー のアフィニティー、特定のグルコポリペプチドマルチマーが動物体内の活性局部 に供給される効率などに依存して様々である。
また、本発明は、動物にグリコノル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサ ミン含有アウターブランチを有し、かつ免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列 を持つポリペプチドを含み、かつ検出可能なシアル酸残基を含まないマルチマー を予防濃度とするのに十分な量の、病原体抗原を結合しうるカプセル化した生物 学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを投与することにより、その動物に 病原体に対する受動免疫を提供する方法に関する。
好ましい態様において、生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは保護 コーティングでカプセル化している。カプセル物質には、メンブレン、ケル、ポ リマー等がある。カプセル物質は、含まれる物質の保護およびカプセル内外の物 質の流れのコントロールに働いている。好ましい態様では、グリコポリペプチド マルチマーは植物細胞壁、植物細胞、腸液覆物などにカプセル化されている。
好ましい態様において、組織プラスミノーゲン活性化因子、組み換えヒトインシ ュリン、組み換えアルファインターフェロン、および成長ホルモン等のグリコポ リペプチドマルチマーが種々の方法でうまく投与され、口、鼻および直腸のムコ サを通して治療効果をあげている。エプスタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）等、薬剤 としてのペプチドおよび蛋白質のもう一つの配給システム、ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃ ａ１．Ｒｅｖ、ｉｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　ＣａｒｒｉｅｒＳｙ ｓｔｅｍｓ、５：９９−１３９　（１９８８）。
好ましい態様では、生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、溶液状 の鼻孔内成形物として投与される。この成形物は、以下の三つの方法：カテーテ ルによる一回の投与；計量投与ポンプ（ネブライザーとも呼ばれる）による複数 回の投与；および計量加圧エアロゾルによる複数回の投与のうちの一つを用いて 投与される。必要な場合は、鼻孔ムコサを通したペプチドまたは蛋白質の吸収は 、非イオン性ポリオキシエチレンエーテル、グリココレート酸ナトリウム（ＳＧ Ｃ）およびデオキシコレート（ＤＯＣ）等の胆汁塩、およびトーロシハイドロフ シジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）などのフシジン酸誘導物を含む吸収促進剤の 添加により促進できる。
計量スプレーポンプを用いたスプレーにより投与した０、９％（Ｗ／Ｖ）塩化ナ トリウム、１％ＤＯＣおよび０．５Ｕ／ｋｇインシュリンを含む鼻孔インシュリ ン成形物は、血清インシュリン濃度を急速に上昇させた。モーゼス（ＭｏｓｅＳ ）等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３２：　１０４０　（１９８３）。鼻孔スプレー成形 物における生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーの投与量は、０６１ ５ｍｇ／ｋｇから６００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１５ｍｇ／ｋｇから２００ ｍｇ／ｋ　ｇ、およびもっとも好ましくは１ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの 範囲である。好ましい態様において、マルチマーはムコサメンブレンを通過せず 、従って吸収促進剤は必要としない。生物学的に活性なグリコポリペプチドマル チマーの直腸への配給には、幾つかの投与成形物が使用できる。これらには、座 薬（エマルジョンおよびサスペンション）、直腸セラチンカプセル（溶液および サスペンション）および浣腸薬（マクロ・１００ｍ１以上、ミクロ；１−２１− ２Ｏが含まれる。また、直腸供給用に２４−４０時間に２ｍｌを供給するよう設 計された浸透ポンプが開発された。直腸ムコサの通過量を増加させたいなら、こ の成形物に鼻孔成形物に関して述べた吸収促進剤を含める。生物学的に活性なグ リコポリペプチドマルチマーに直腸投与を目的とした好ましい成形物は、先に述 べた好ましい範囲の許容可能な投与形態で投与されることが望ましい。
生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、体腔のムコサメンブレンに 使用して投与することが出来るリポソーム（ミセル）成形物として投与すること が出来る。ジュリアーノ（Ｊｕ　Ｉ　ｉ　ａｎｏ）等、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ 、ＥＸｐ、Ｔｈｅｒ、、２１４：３８１　（１９８０）。リポソームは、直径約 ２０−５０ナノメーターのもっとも小さい単一ラミナーベシクルから直径数十ミ クロン単位のマルチラミナーベシクルまでの範囲の種々の物理学的構造を生ずる 種々の従来法によって調製する。グレゴリチディアス（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉａ ｓ）編、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉ：Ｃｒｃブレス（１９８ ４）。鼻孔用成形物についてリストした好ましい投与量の生物学的に活性なグリ コポリペプチドマルチマーをマルチラミナーベシクルの凍結乾燥パウダーで水和 しグリコポリペプチド含有リポソームを生成する。
より好ましい態様において、上述の好ましい投与量の生物学的に活性なグリコポ リペプチドマルチマーが、アシアロマチック架橋ポリマーでコートしたセラチン カプセルで経口的に投与される。アゾポリマーコートグリコポリペプヂマルチマ ーは、胃および小腸での消化から保護される。アゾポリマーコートグリコボリベ ブヂマルチマーが、大腸に到達したとき、そこに存在するマイクロフローラが、 アゾ結合を還元して架橋を壊し、ポリマーフィルムが消化される。この結果、結 腸のルーメンにグリコポレペプチドが放出され、続いて局所的な作用や吸収が起 こる。
病原特異的グリコポリペプチドマルチマーは、動物中の特定の位置のマルチマー 濃度が予防濃度に達するのに十分な量を投与することが好ましい。特定の予防濃 度となるように投与されるマルチマー量は、良く知られているように、存在する 病原体量、免疫化を必要とする動物内の位置、病原体に対するマルチマーのアフ ィニティー、変性や分解に対するマルチマーの耐性、病原体失活様式、投与物成 形法などに依存する。
このマルチマーは、毎日−回から四回に分けて、マルチマー約０．１ｍｇから２ ０００ｍｇを含む植物１０ｇから１００，０００ｇという形で投与することが好 ましい。このマルチマー量で、体重ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約２．０００ ｍｇの予防濃度が得られる。好ましい態様のマルチマー予防濃度は、体重ｋｇ当 たり約０．０１ｍｇから約６００ｍｇの範囲である。また、別の態様における予 防濃度は、体重ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約２００ｍｇの範囲にある。
本発明は、所定のりガントに対して動物に受動免疫を提供する方法に関する。
この方法には、動物体内の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー濃度 を予防濃度とするのに十分な量の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマ ーを動物に投与することが含まれる。投与するマルチマーには、グリコジル化し たコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリ ペプチドおよび免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が含まれ、かつ、このマルチ マーには、検出可能なシアル酸残基は含まれない。
病原体に対して動物に受動免疫を提供する方法で、動物体内の生物学的に活性な グリコポリペプチドマルチマー濃度が予防濃度となるのに十分な量のマルチマー を動物に投与することを含む方法が特に好ましい。投与するマルチマーには、グ リコジル化したコア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチ を有するポリペプチドおよび免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が含まれ、かつ 、このマルチマーには、検出可能なシアル酸残基は含まれない。
好ましい態様において、マルチマーは、そのマルチマーと栄養価を有する物質か ら構成される組成物として投与される。栄養価を有する物質とは、動物がカロリ ーを誘導しうる物質または化合物である。典型的な栄養価を有する物質には、蛋 白質、炭水化物、脂質、脂肪、糖蛋白質、グリコーゲンなどが含まれる。栄養価 を有する物質としては、植物物質、または動物物質が特に好ましい。
別の好ましい態様では、マルチマーは、マルチマーおよび生理学的に不活性な物 質から構成される組成物として投与される。生理学的に活性な物質には、水やキ ャリヤー化合物などの溶液が含まれる。
別の好ましい態様では、動物の消化管に植物細胞壁および所定の抗原を結合しう る生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、（ａ）免疫グロブリンア ミノ酸残基配列、および（ｂ）コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有ア ウターブランチを含むオリゴサツカライドを有するポリペプチドを含む、少なく とも二つのポリペプチドを含み、かつシアル酸残基を含まないマルチマーを含む 組成物を導入すること含む、所定のりガントに対して動物を受動免疫化する方法 が提供される。
別の好ましい態様は、（１）動物の消化管に所定の抗原を結合しつる生物学的に 活性なグリコポリペプチドマルチマーで、（ａ）免疫グロブリンアミノ酸残基配 列、および（ｂ）コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブラン チを含むオリゴサツカライドを有するポリペプチドを含む、少なくとも二つのポ リペプチドを含み、かつシアル酸残基を含まないマルチマーを含む植物細胞を含 有する組成物を導入すること、および（２）消化管内でその植物細胞を破壊し、 消化管内に生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを放出してその動物 を受動免疫化する、以上（１）および（２）を含む所定の抗原に対して動物を受 動免疫化する方法に関する。
Ｄ　グリコポリペプチドマルチマーを含む組成物本発明は、生物学的に活性なグ リコポリペプチドマルチマーで、（ａ）免疫グロブリンアミノ酸残基配列、およ び（ｂ）コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含む オリゴサツカライドを有するポリペプチドを含む、少なくとも二つのポリペプチ ドを含み、かつシアル酸残基を含まないマルチマーのカプセルを含む生物学的に 活性な組成物に関する。
好ましい態様におけるグリコポリペプチドマルチマーは、植物細胞、植物細胞壁 、腸外被などでカプセル化されている。
組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー１００ナノグラムに対し植物 物質約１０．０００グラムから組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマ ー１０グラムに対し植物物質約１００ナノグラムの割合で含む組成物が特に好ま しい。また、植物物質が、組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー１ ミリグラムに対し植物物質約１０．０００グラムから組成物中に存在するグリコ ポリペプチドマルチマー１グラムに対し植物物質約１００ナノグラムの割合で含 まれるのがより好ましい。別の態様では、植物物質が、組成物中に存在するグリ コポリペプチドマルチマー１ミリグラムに対し植物物質約１０，０００グラムか ら組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー５００ミリグラムに対し植 物物質約１ミリグラムの割合で含まれる。
別の態様では、組成物中に、さらにクロロフィル、共働薬、医薬、医薬植物由来 の化合物、種々の調合薬等が含まれる。医薬植物由来の化合物は、医薬植物中で グリコポリペプチドを発現させ、その植物を収穫することにより組成物に添加す る。
また、本発明は、（ａ）第一植物種のゲノムにグリコポリペプチドマルチマーの 構成部分であるＮ−結合グリコシル化シグナルを存する自己結合性モノマーポリ ペプチドをコードする第一哺乳類遺伝子を導入し、第一トランスホーマントを生 成する、（ｂ）第二植物種のゲノムにグリコポリペプチドマルチマーの構成部分 であるもう一つの自己結合性モノマーポリペプチドをコードするもう一つの哺乳 類遺伝子を導入し、第ニドランスホーマントを生成する、（Ｃ）前記第一および 第ニドランスホーマントから子孫集団を作製する、および（ｄ）前記子孫集団か らグリコポリペプチドマルチマーを生産するトランスジェニック植物種を単離す る、以上（ａ）乃至（ｄ）のステップを含む方法にしたがって生産したグリコポ リペプチドマルチマーに関する。
また、本発明は、本発明の方法で生産した他のマルチマーにも関する。
（実施例） 以下の実施例は、本発明の詳細な説明するもので、これを制限するものではない 。
ｌ、ハイブリドーマ細胞系列６Ｄ４からの免疫グロブリン重鎮コード遺伝子およ び免疫グロブリン軽鎖コード遺伝子の単離トラモンタノ（Ｔｒａｍｏｎ　ｔａｎ ｏ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４：１５６６−１５７０　（１９８６）に述べら れている抗体６Ｄ４を分泌する／１イブリトーマ細胞を、ｌＯ％ウシ胎児血清を 含むＤＭＥＭ培地で対数期まで増殖する。ウルリッヒ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）等、５ ｃｉｅｎｃｅ、１９６：１３１３　（１９７７）の方法で全ＲＮＡをハイブリド ーマ６Ｄ４の対数期培養液２す・ソトルから調製する。簡単にいうと、遠心でハ イブリトーマ６Ｄ４細胞を収穫し、ポリトロンホモノナイザーを用い、５ｍＭク エン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、Ｏ，１Ｍ　２−メルカプトエタノール（２Ｍ ｅ）および０．５９ｏラウリルサコシン酸ナトリウムを含む４Ｍグアニジンチオ シアネート溶液７０ｍＩ中、室温で２０秒間ホモジネートする。このホモジネー トを８０００Ｘｇで５分間遠心し、不溶性のデブリを除く。
このホモジネート約２８ｍ１を、ベックマン５Ｗ７０　Ｔｉローター中で、４ｍ Ｍエチレンレンミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中５．７Ｍ　ＣｓＣｌ　（ベセスダリサ ーチラボラトリー、ゲイサースバーグ、ＭＤ）溶液１０ｍ１のパド上に乗せた。
この溶液を、１５℃、毎分ｓｏ、ｏｏｏ回転（ｒｐｍ）で、少な（とも５時間遠 心した。上清を注意深く吸い取り、チューブの壁が乾くまで残存するホモジネー トを除去した。このＲＮＡペレットを１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４） 。
２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液 に溶解した。この溶液をフェノール溶液で二回抽出した。その水層を再びフェノ ール　クロロホルム　イソアミルアルコール（２５：２５：ｌ（容積））を含む 溶液で抽出した。この水層に１／１０倍容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍容の エタノールを加えてＲＮＡを回収した。この溶液を、−２０℃に１２−１８時間 維持してＲＮＡを沈殿させた。沈殿を含む溶液を４℃、１０，０００ｘｇで、２ ０分間遠心してＲ，ＮＡ含有ペレットとした。このペレットに７０％エタノール ５ｍｌを加えて、ＲＮＡペレットから過剰の塩を除去し、この溶液を４℃、１０ ゜ｏｏｏｘｇで、１０分間遠心した。このＲＮＡペレットを０．５ｍｌのＤＥＰ Ｃ−Ｈ，Ｏに溶解し、２６０ｎｍの吸収を測定するための少量の試料を分は取っ た後、−７０℃で保存した。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、編、コールドスプリングハーハーラボ ラトリー、ＮＹ（＋９８２）の方法で、全細胞ＲＮＡから長いポリＡテールを含 む配列に富むメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を調製した。簡単にいうと、 上記のように調製した全ＲＮＡを、１ｍｌのＤＥＰＣＨ２Ｏに溶解し、６５℃に ５分間維持した。このＲＮＡ溶液に、１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ、１Ｍ塩化ナト リウム（ＮａＣ１）、２．０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）およびｉ、ｏ％ド デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２×高塩ロ一ドバツフア１ｍｌを加え、 この混合物を室温まで冷やした。ついで、この混合物を予めＯ，１Ｍ水酸化ナト リウムおよび５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液で洗浄し、さらにＤＥＰＣ−Ｈ，Ｏで 平衡化したオリゴ−Ｔ（コラボレーティプ　リサーチ、タイプ２または３）カラ ムにかけた。溶出液を滅菌したポリエチレンチューブに回収し、これを６５℃に ５分間加熱した後、再び同カラムにかけた。ついで、このカラムを５０ｍＭトリ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐ Ｈ７，５）および０．５％ＳＤＳを含む高塩ロードバッファ２０ｍ１で洗浄した 。
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５） および０．０５％ＳＤＳを含むバッファ１ｍｌを用いて、オリゴｄＴカラムから メツセンジャーＲＮＡを溶出した。このメツセンジャーＲＮＡをエタノール沈殿 で濃縮し、ＤＥＰＣＨｙＯに溶解した。
このように調製したｍＲＮＡから、相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を調製した。第 −鎖合成、第二鎖合成、平滑末端化反応は、ワトソン（Ｗａ　ｔ　ｓ　ｏ　ｎ） 等、ＤＮＡクローニング、１巻、Ｄ、　Ｍ、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）編、の 操作に従って行った。簡単にいうと、１０μｇのｍＲＮＡを含む溶液を、６５℃ に５分間維持し、素早（氷水中で冷やした。この溶液に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ 　（ｐＨ８，３）８ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ　ＫＣＩ、２ｐｇオリゴ（ｄＴ ）、１ｍＭｄＡＴＰ、１ｍＭｄＧＴＰ、１ｍＭｄＴＴＰ、１ｍＭｄＣＴＰ、１０ ｍＭ　ＤＴＴ、６０ユニツトＲＮａｓｉｎ（プロメガコーポレーション、マジソ ン、ＷＩ）、４μｇアクチノマイシン、＋３５ユニットＡＭＶ逆転写酵素および ｌＯμＣｉ　α３２Ｐ−ｄＣＴＰを含む反応混合物１００μｌを混合することに より、第−ｃＤＮＡ鎖を合成した。この反応混合物を４４℃に１時間維持した。
さらに、６０ユニツトのＲＮａｓｉｎおよび８０ユニツトの逆転写酵素を加え、 この反応液を４４℃で３０分間維持した。５０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１０％　Ｓ ＤＳを含む０，００５ｍ１を加えることで、この第−鎖ｃＤＮＡ合成反応を停止 した。この核酸をフェノール抽出で精製し、ついでエタノール沈殿で濃縮した。
このように生成した全第−鎖ｃＤＮＡ産物に、２０ｍＭ）リス−ＨＣ！（ｐＨ７ ，５）、１．００ｍＭ　ＫＣＩ、５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　（ＮＨ４）ｘ ｓｏ−、Ｉ　ＯｍＭ　ＤＴＴ、０．０５ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ）、５０ＭＭ　ｄＧＴＰ、５０ＭＭ　ｄＡＴＰ、５０ＭＭ　ｄＴＴＰ、５０Ｍ Ｍ　ｄＣＴＰ、１５０ＭＭ　β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β− ＮＡＤ”″）（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ）、１５μＣｉ／μＩ　（ α−”Ｐ）ｄＣＴＰ、３０ユニツト大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、２．５ユニツト ＲＮａｓｅＨおよび４ユニツト大腸菌ＤＮＡリガーゼを含む溶液１００μＩを混 合することにより、第二鎖ｃＤＮＡを合成した。この溶液を１４℃に１時間維持 したのち、さらに２５℃に１時間維持した。この反応は、０．０５Ｍ　ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）溶液５μｌ、１０％　ＳＤＳ溶液５μｌを添加することにより停 止した。この核酸をフェノール抽出で精製し、エタノール沈殿で濃縮した。
このように生成した二本鎖ｃＤＮＡの末端を以下の平滑化反応で末端平滑化し、 クローニングベクターに挿入する準備をした。この二本鎖のｃＤＮＡの半分を、 ３３．４ｍＭ　トリス−酢酸（ｐＨ７，８）、６６．６ｍＭ酢酸カリウム、１０ ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、８７．５Ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、３ ＩＯμ〜ｆｄＧＴＰ、３１０ＭＭｄＡＴＰ、３１０ＭＭｄ、ＴＴＰ、３１０ＭＭ ｄＣＴＰおよび８ユニツトＴ４ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液に加えた。この溶 液を、３７℃に３０分間維持し、０．０５Ｍ　ＥＤＴＡ溶液５μｌを加えること で反応を停止した。生成した平滑末端化ｃＤＮＡは、フェノール抽出およびエタ ノール沈殿で精製した。
この平滑末端化ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩアダプターをアニールし、ライゲーション した。簡単にいうと、ポリヌクレオチドＮｌ（表１）Ｉμｌおよび２ｏユニツト Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを７０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）。
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ、、５ｍＭ　ＤＴＴ、ｌｏｍＭ　２Ｍｅおよび５００１１ｇ ／ｍｌ　ＢＳＡを含む溶液に加えることで、このポリヌクレオチドを５″　リン 酸化した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、ついで６５℃に１０分間維持し て反応を停止した。ｌ／ｌ　Ｏ倍容の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４） 、２ｍＭＭｇＣｈおよび１５ｍＭ　ＮａＣ１を含む溶液とともに２０Ｍｇのポリ ヌクレオチドＮ２（表１）をキナーゼ反応液に加えた。この溶液を７０℃で５分 間加熱し、ついで水を入れた５００ｍ１ビーカー内で、１．５時間かけて室温、 約２５℃まで冷やした。この間に、溶液中に存在する二つのオリゴヌクレオチド がアニールし、二本鎖のＥｃｏＲＩアダプターが生成する。
表Ｉ　ＥｃｏＲＩアダプターポリヌクレオチド（Ｎ：Ｌ）　５’−ＣＣＴｒＧＡ ＣＣＧＴＡＡＧＡＣＡＴＧ−３’（Ｎ２）　ｓ’−ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＡ ＣＣ，にＴｃＡＡＧｃ−３’アニールしたアダプター５μｌを、５０ｍＭ　ト！ Ｊス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）。
７ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＡＴＰおよびｌｏユニットＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む溶液に加え、上述の平滑末端化ｃＤＮＡに二本鎖ＥｃｏＲ Ｉアダプターを共有結合させた。この溶液を、３７℃に３０分間維持し、ついで ７２℃に５分間維持してＴ４ＤＮＡリガーゼを失活させた。
上記反応液５μＩと、ｌ０ｍＭ　ＡＴＰおよび５ユニツトＴ４ボリヌクレオチド キナーゼを含む溶液を混ぜて、生成したｃＤＮＡの５′末端をリン酸化した。
この溶液を３７℃に３０分間維持し、ついで６５℃に１０分間維持してＴ４ポリ ヌクレオチドキナーゼを失活させた。
このように調製したｃＤＮＡを、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　マ＝アチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　 ｓ）等、編、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１ＮＹ（１９８２）の方 法と同様の方法でサイズ分画し、長いｃＤＮＡ挿入物を得た。簡単にいうと、上 述のように調製した反応１昆合物を、２０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０ ）、１．２Ｍ　Ｎａｃｌ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％サルコシルを含む等 倍容の２ＸＣＬＪＢカラムバツフアに加えた。この溶液を、予め膨潤したセファ ロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー、ビス力タウエイ、 ＮＪ）を用いて調製した５ｍｌのＣＬ−４Ｂカラムにロードした。この試料をカ ラムに入れてから、カラムをＩＯｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、６００ ｍＭ　ＮａＣｌ。
ＩｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．　］％サルコシルを含むｌＸカラムバッファで満た した。重力でこのカラムの溶液を流し、約２００μＩのフラクションを手で採取 した。各フラクションに存在する二本鎖ｃＤＮＡの大きさは、０．８％アガロー スゲル電気泳動で測定した。アガロースゲル電気泳動による測定で高分子量のｃ ＤＮＡを含むフラクションを集め、ブタノール抽出で濃縮し、エタノール沈殿で サイズ分画したｃＤＮＡを得た。
このサイズ分画したｃＤＮＡを、予め制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化 したラムダＺａｐ　（ストラタジーンクローニングシステム、ラジョラ、ＣＡ） に直接ライゲーションした。このライゲーション混合物を、ストラタジーンクロ ーニングシステムから市販されているギガパック■ゴールドパッケージングイク ストラクトを説明書に従って使用しパッケージ化し、ＢＢ４細胞（ストラタジー ンクローニングシステム、ラジョラ、ＣＡ）上にブレーティングしてプラークを 得た。
このプラークを、ヒト抗体の不変部を含むラジオラベル化したプローブでスクリ ーニングした。簡単にいうと、ラビノッ（Ｒａｂｂ　ｉ　ｔ　ｔ　ｓ）等、Ｃｏ ｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｏｇｙ　 ４５：８６７−８７８　（１９８０）、に報告されているヒトＩｇＧ不変部プロ ーブおよびラビッツ（Ｒａｂｂ　ｉ　ｔ　ｔ　ｓ）等、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　ＨａｒｂｏｒＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｏｇｙ　４５：８６７−８７ ８　（１９８０）に報告されているヒトカッパ軽鎖プローブを、Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、マ＝アチス （ＭａｎｉａｔｉＳ）等、纒、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ　（１９８２ ）に示されている標準法でニックトランスレーションした。この方法で調製し、 ｌＸｌ０’ｃｐｍ／μｇ以上の比活性を持つプローブを、従来法により先に調製 したライブラリー由来のプラークにハイブリダイズした。簡単にいうと、先に調 製したｃＤＮＡライブラリーのタイターは、このライブラリーを１００ｍＭ　Ｎ ａＣ１，５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および１０ｍＭ硫酸マグネシ ウムを含むバッファで段階的に希釈することにより測定した。各希釈物ｌＯμｍ を対数期の大腸菌細胞２００μｍと混合し、３７℃に維持してファージをバクテ リア細胞に吸着させた。５ｇ／ｌ　ＮａＣ１，２ｇ／Ｉ硫酸マグネシウム、５ｇ ／ｌイーストイクストラクト、ｌＯｇ／ｌ　ＮＺアミン（カセイン加水分解物） および０．７％モルテンアガロースを含むトップアガー３ｍｌを調製し、使用す るまで５０℃の水浴に保存した。ファージ、バクテリアおよびトップアガーを混 ぜ、保温しておいたバクテリア寒天プレート（５ｇ／Ｉ　ＮａＣ１，２ｇ／Ｉ硫 酸マグネシウム、５ｇ／Ｉイーストイクストラクト、ｌｏｇ／ｌ　ＮＺアミンお よび１５ｇ／ｌ　ディフコアガー）の表面に均等に広げた。このプレートを３７ ℃に＋　２−２４時間維持した。この間にバクテリアローン上にラムダプラーク が生成する。このラムダプラークを計数して、元のライブラリー中に存在した１ ｍｌ当たりの全プラーク形成ユニットを測定した。
検定したｃＤＮＡライブラリーをブレーティングして、レプリカフィルターを作 製した。このレプリカフィルターを用いて、免疫グロブリン重鎮または軽鎖をコ ードするｃＤＮＡを含む各クローンを分離した。簡単にいうと、１５０ミリメー タープレート当たり２００００プラークを生じる容積の検定したｃＤＮＡライブ ラリーを対数期の大腸菌６００μｌに添加し、３７℃に１５分間維持してバクテ リア細胞にファージを吸着させた。バクテリア細胞およびファージを含む溶液に ７．５ｍｌのトップアガーを加えた。ファージが吸着したバクテリアをトップア ガーと混合しこの混合物をあらかじめ温めておいたバクテリア寒天プレートの表 面上に均等に広げた。このプレートを３７℃に１６時間維持した。この間に、バ クテリアローン上にプラークが出現した。このプレート上にニトロセルロースフ ィルターを置き、各フィルターの方向をインクで印を付けた。このフィルターを バクテリアプレート上に１−５分間維持し、ついで先の丸いピンセットで取り上 げて、約１分間１．５Ｍ　ＮａＣｌおよび０．５Ｍ　ＮａＯＨを含む変性バブフ ７に浸したスポンジパッド上に乗せた。さらに、このフィルターを、５分間、１ ．５Ｍ　ＮａＣＩおよび０．５Ｍ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）を含む中和 バッファを含むスポンジパッド上に移した。その後、このフィルターを、０．３ ６Ｍ　ＮａＣＩ、２０ｍＭ　ＮａＨｚＰＯｓ　（ｐＨ７，４）および２ｍＭ　Ｅ ＤＴＡを含む溶液中で濯ぎ、ワットマン３ＭＭペーパー上で乾燥させた。各バク テリアプレートに関してこの操作を繰り返し、ハイブリダセーンヨン用の第二の レプリカフィルターを作った。全てのフィルターを乾燥後、そのシートをワット マン３ＭＭペーパーの間に挟み、フィルターを真空オーブンを用いて８０℃で２ 時間焼いた。これで特異的プローブによるハイブリダイーション用のフィルター が出来た。
下から完全に濡れるまで、０．９Ｍ　ＮａＣ１および０．０９Ｍクエン酸ナトリ ウム（ｐＨ７，０）を含む溶液の表面に焼いたフィルターを乗せた。このフィル ターを同溶液中５分間浸す。ついで、このフィルターを、５０ｍＭｈリスーＨＣ １（ｐＨ８，０）、ＩＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．　１％ＳＤＳ を含む予洗溶液に移した。この予洗溶液を４２℃に２時間維持した。
フィルターを予洗溶液から取り出し、２５％ホルムアミド、１．ＯＭ　ＮａＣ１ ，５０％硫酸デキストラン、０．０５Ｍ　Ｎａ５ＰＯ＋　（１）Ｈ７，７）、０ ゜００５Ｍ　ＥＤＴＡ、Ｏ，１％フィコール、０．　１％ＢＳＡ、０．１％ポリ （ビニルピロリドン）、０．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子Ｄ ＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液に入れた。このプレハイブリダイゼ ーション溶液中のフィルターを、穏やかに攪拌しながら４２℃で４−６時間維持 した。
ついで、このフィルターをプレハイブリダイゼーション溶液から取り出し、少な くとも］ＸＩＯ＠ｃｐｍ／μｇの比活性を有する２ｘｌ　Ｏ’ｃｐｍ／ｍＩのｆ ｆ２Ｐ＝ラベルしたプローブを含むプレハイブリダイゼーション溶液であるハイ ブリダイーション溶液に入れ、穏やかに攪拌しながら４２℃に１２−２４時間維 持した。
ハイブリダセーンヨン完了後、ハイブリダセーンヨン溶液を除き、大量の０．　 ９Ｍ　ＮａＣ１，０，０９Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）および０．１％ ＳＤＳを含む溶液を用い、６０℃、１０分間の洗浄を３−４回繰り返した。洗浄 溶液からフィルターを取り出し、室温で、ワットマン３ＭＭペーパーに乗せて空 気乾燥した。このフィルターを３ＭＭペーパーにテーピングし、プラスチックラ ップで包み、これを増感スクリーンを用いた一７０℃でのＸ線フィルム（コダッ クＸＲまたは相当品）の感光に用いてオートラジオグラムを作製した。このフィ ルムを説明書にしたがって現像した。ポジティブのハイブリリダイゼーションシ グナルを、ニトロセルロースフィルター上の非対称なインクスポットにより正し いプラークに合わせた。
ハイブリダセーンヨンプラークを純度良く単離し７、ストラタジーンクローニン グシステムズ（ラジョラ、ＣＡ）の説明書およびショート（Ｓｈｏｒｔ）等、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１６：７５８３−７６００　（１９８８ ）の基本的なインビボ切りだし法に従い、ラムダＺＡＰベクターから挿入物を切 りだした。このインビボ切りだし法でラムダＺＡＰヘクターからクローン化した 挿入物をファージミドに移し、操作やシーケンシングを容易にした。このハイブ リダイズ挿入物を、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃ ａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４　：　５４６３−５４６７　（１９７７）のダイデオキシ 法に従い、シークエネースＤＮＡシーケンーシングキット（ユナイティドステー トバイオケミカルコーポレーション、クリーブランド、ＯＨ）を用いてシーケン シングした。ｐＡＢＺｌ　００およびｐＡＢＺｌ　０１と命名した二つの全長軽 鎖クローンは、ＤＮＡシーケンシングで同定した。さらに、ｐＡＢＺ２００と命 名した一つの全長重鎮クローンも同定した。
これらの全長ｃＤＮＡクローンを、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、マ＝アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、編、 コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１ＮＹ（１９８２）の操作を用い、ｍ ｐ１８にサブクローニングした。簡単にいうと、全長′ｃＤＮＡクローンを含む ファージミドを制限エンドヌクレアーゼで消化し、その全長ｃＤＮＡ挿入物をゲ ル電気泳動で単離した。この挿入物を予めＥｃｏＲＩで消化したＭ１３ｍｐ１８ にライゲーションした。このライゲーション混合物を適当なバクテリア宿主細胞 上にブレーティングし、全長ｃＤＮＡ挿入物を含むファージプラークを単離した 。
このクローニングステップの正しさは、制限地図で確認した。
ミュータジーンＭ１３インビトロミュークジエネシスキット（バイオラド、リノ チモンド、ＣＡ）に示されている操作に従い、−重鎖ウラシル含有テンプレート ＤＮＡを調製した。簡単にいうと、ｄｕｔおよびｕｎｇ両変異を含むバクテリア ＣＪ２３６株の単離クローンを、３０Ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬ Ｂ培地（１０ｇ／ｌバクトドリブトン、５ｇ／ｌイーストイクストラクトおよび ５ｇ／Ｉ　ＮａＣ１）２０ｍｌと混合した４、この溶液を３７°Ｃｉ：Ｉ２−１ ６時間維持し、−晩培養物を調製した６、この培養物１ｍｌを２５０ｍ１フラス コ中、３０Ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含む２ＸＹＴ培地（１６ｇ／ｌ　バ クトドリブトン、５ｇ／ｌ　イーストイクストラクトおよび５ｇ／ｌ　ＮａＣＩ ）５０ｍｌと混合した。この溶液を振盪しながら３７°Ｃで約４時間維持するか 、または６００ｎｍの光学密度が０３になるまで維持した。この光学密度は、ｍ １当たり約ｌＸｌ０’個のコロニー形成ユニットに対応する。全長ｃＤＮＡ挿入 物を含むＭＩ３ファージを多重感染度０．２以下となるように添加した。この溶 液を振盪しながら３７°Ｃに４−６時間維持した。この培養物３０ｍ１を５０ｍ １遠心チユーブに移し、４℃、１７．ｏｏｏｘｇ　（１２，０００ｒｐｍ、ソー パル５Ｓ−３４０−ター）で１５分感遠心した。このファージ含有上清を新しい 遠心チューブに移し、４℃、！７．０００Ｘｇで１５分間遠心した。この上清を 新しいポリアロマ−遠心チューブに移し、１５０ＭｇのＲＮａｓｅＡを添加した 。この上清を室温に３０分間維持して存在するＲＮＡを分解した。４分の１倍容 の３．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２０％ポリエチレングリコール８０００　（ ＰＥＧ８０００）をこの上清に混合した。この上清を氷水中に３０分間維持した 。この間に存在するファージ粒子がＰＥＧ３０００によって沈殿する。沈殿した ファージ粒子を、４℃、１７．ＯＯＯＸｇ、１５分間の遠心で回収した。このペ レツトを高置バッフｙ　（３００ｍＭ　ＮａＣ１，１００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ 　（ｐＨ８，０）および１ｍＭ　ＥＤＴＡ）２００μｌに懸濁した。この溶液を 氷水中に３０分間維持し、マイクロフユージで２分間遠心して不溶性物質を除去 した。この上清を新しいチューブに移し、ファージストックとして使用するまで ４℃に保存した。
−重鎮ウラシル含有テンプレートＤＮＡは、２００μｌのファージストック全部 を等容量の中和フェノールで二度抽出することにより調製した。もう一度この水 層をフェノールクロロホルム溶液（２５：２５：ｌ　フェノール・クロロホルム ・イソアミルアルコール）で抽出し、さらい数回クロロホルムイソアミルアルコ ール（１：１／４８　クロロホルム：イソアミルアルコール）で抽出した。この 水層に、１０分の１倍容の７，８Ｍ酢酸アンモニウムおよび２．５倍容のエタノ ールを混合した。この溶液を一７０℃に少なくとも３０分間維持して、ＤＮＡを 沈殿させた。このＤＮＡを４℃で１５分間遠心することにより回収した。このＤ ＮＡベレットを９０％エタノールで一回抽出し、１０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ ７，６）および１〜Ｉ　ＥＤＴＡを含む２０μｍに懸濁した。この溶液に存在す るウラシル含有テンプレートＤＮＡの量は、ゲル電気泳動で測定した。さらに突 然変異誘発ステップでこのウラシル含有テンプレートＤＮＡを用いて、全長ｃＤ ＮＡに制限エンドヌクレアーゼ部位を導入した。変異した全長ｃＤＮＡは、ミュ ータシーンジット（バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）の操作にしたがって合成 した。簡単にいうと、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するように 設計したポリヌクレオチドを用いて、−重鎖ウラシル含有テンプレートＤＮＡか らの変異鎖合成を行った。このポリヌクレオチドは、選択した２００ピコモル（ ｐｍｏ　ｌ　ｅ）を１００ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ　Ｍ ｇＣ１ｔ、５ｍＭ　ＤＴＴ、０．４ｍＭ　ＡＴＰおよび４．５ユニツト　Ｔ４ポ リヌクレオチドキナーゼを含む溶液と混合してリン酸化した。この溶液を３７℃ に４５分間維持した。このキナーゼ反応は、６５℃に１０分間維持することによ り停止した。このリン酸化したポリヌクレオチドを、１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ 　（ｐＨ７，６）および１ｍｌ　ＥＤＴＡ）を含む溶液で希釈して６ｍｏｌｅ／ μｌとした。
２００ｎｇのウラシル含有テンプレートＤＮＡ、３ｍｏｌ　ｅのリン酸化ポリヌ クレオチド、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）　、２ｍＭ　ＭｇＣＬお よび５０ｍＭ　ＮａＣｌをを混合して、リン酸化したポリヌクレオチドを一重鎖 ウラシル含有ＤＮＡテンプレートにアニールした。この溶液を７０℃に５分間維 持し、ついで毎分的１℃の速度で３０℃まで冷やした。この溶液は使用するまで 氷水中に保存した。この溶液に、４ｍＭｄＡＴＰ、４ｍＭｄＣＴＰ、４ｍＭｄＧ ＴＰ、４ｍＭｄＴＴＰ、７．５ｍＭ　ＡＴＰ、１７５ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐ Ｈ７，４）、３７．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ、２１５ｍＭ　ＤＴＴを含む溶液ｌμｌ 、５ユニツトＴ４ＤＮＡリガーゼおよびｌユニットＴ４ＤＮＡポリメラーゼを混 合した。この溶液を氷水中に５分間維持し、ポリヌクレオチドがウランル含有テ ンプレートに結合する条件下でＤＮＡ合成を開始することによりポリヌクレオチ ドブライマーを安定化した。この溶液を２５℃に５分間維持してから、さらに３ ７℃に９０分間維持した。この溶液に停止バッファ（１０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ ｐＨ８０）および１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）９０μｍを混合することで、合成反応を 停止し凍結した。この合成反応液を使用するまで一２０°Ｃに保存した。
ミュータノーンキットの操作にしたがい、この合成反応物質をコンピテント細胞 ＭＶ１１９０にトランスホームした。簡単にいうと、コンピテント細胞ＭＶ１１ ９０は、ＭＶ１１９０細胞の単離コロニーを１０ｍ１のＬＢ培地に混合し、振盪 しながら３７℃に一晩維持することにより調製した。次の日、４０ｍ１のＬＢ培 地を十分量のＭＶ１１９０−晩培養物と混合し、６００ｎｍの光学密度を約０． １とした。この溶液を振盪しながら３７℃に約２時間維持した。この間にこの培 養物の光学密度は、０．　８−０．　９に達する。それから、ＭＶ１１９０細胞 を０℃、５０００ｒｐｍで５分間遠心した。このＭＶ１１９０細胞ペレットを氷 冷した５０ｍＭ　ＣａＣ１ｔ溶液１ｍｌに懸濁した。さらに、氷冷した５０ｍＭ ＣａＣＬ溶液１９ｍ１をこの溶液に混合した。この溶液を氷水中に３０分間維持 した。細胞を０℃、５０００ｒｐｍ、５分間の遠心で回収した。このＭＶＩＩ９ ０再報ペレットを氷冷した５０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ溶液１ｍｌに懸濁した。さらに 、氷冷した５０ｍＭ　ＣａＣｌ２溶液３ｍｌを加え、氷水中で冷やした。このよ うにして、トランスホーマンヨン用のＭＶＩＩ９０のコンピテント細胞が調製さ れる。冷やした１、５ｍｌ滅菌ポリスチレンチューブ中、先に調製した合成反応 物１０μｌをＭＶｌ１９０コンピテント細胞０．３ｍｌと穏やかに混合した。
この溶液を氷水中に９０分間維持した。この溶液を４２℃の水浴に３分間置き、 直ちに氷水中に戻した。このトランスホーム細胞を三種類の濃度のＭＶ１１９０ 細胞上にブレーティングした。０．３ｍｌのＭＶ１１９０−晩培養物を入れた各 チューブにＩＯμ！、５０μｌおよび１００μｌのトランスホーム細胞を入れた 。
この溶液を穏やかに、かつ完全に混合し、これに２％５−ブロモ−４−クロロ− ３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）５０μ＋、ｔｏ。
ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）２０μｌおよび予 め約５０℃に冷やしたモルテントツブアガー（０，７ｇバクトアガー／１００ｍ ＩＬＢ培地）２．５ｍｌを混合し、直ちに１５ｇ／ｌ　バクトアガーＬＢ培地を 入れたバクテリアプレート表面上に注いだ。寒天を約ＩＯ分間冷し、逆さにして ３７℃に一晩維持してＭＶ１１９０ローン上にプラークを出現させた。
各トランスホーメーション物から生じた単離プラークをピックアップし、ミュー タシーンキット（バイオラド、リッチモント、ＣＡ）の説明書にしたがって増殖 させた。Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ ｎｕａｌ、マニアチスＣＭａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）等、編、コールドスプリ ングハーバ−ラボラトリ−１ＮＹ（＋９８２）に述べられているアルカリ分解ミ ニプレツブ法を用いて各プラークから二本鎖ＲＦ　ＤＮＡを調製した。このＤＮ Ａを目的のポリヌクレオチドを含む変異体の同定が可能な制限エンドヌクレアー ゼで消化した。
このようにして同定した変異体をシーケンシングして免疫グロブリン重鎮または 軽鎖をコードする変異ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を確認した。
２、カッパ軽鎖遺伝子を含む発現ベクターの構築カッパリーダーを含む全カッパ 軽鎖遺伝子を含む発現ベクターを以下のように調製した。単離した全長カッパ軽 鎖遺伝子ｃＤＮＡをポリヌクレオチドＰ１およびＰ３（表２）および上述の突然 変異誘発法を用いて変異した。ポリヌクレオチドＰＩは、全長カッパｃＤＮＡの ５′末端にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。ポリヌクレオチ ドＰ３は、全長カッパ軽鎖ｃＤＮＡクローンの３°末端にＥｃｏＲＩ制限エンド ヌクレアーゼ部位を誘導する。変異体にポリヌクレオチドＰＩおよびＰ３が導入 したことを示す二つのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む変異トラン スホーマントを単離した。これらのトランスホーマントをシーケンシングし、そ れらがＰＩおよびＰ３両ポリヌクレオチド配列を含むことを確認した。
５°および３゛末端にある制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１部位で、全長カッ パ軽鎖ｃＤＮＡ　（第１図Ａ）を切りだし、その制限断片をゲル電気泳動で単離 した。この断片を予めＥｃｏＲｒで消化した発現ベクターｐＭＯＮ５３０に直接 ライゲーションした（第２図）。このライゲーション混合物で適当な宿主細胞を トランスホームし、各トランスホーマントを単離した。Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、マニアチス（Ｍａｎ ｉａｔｉｓ）等、編、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１ＮＹ（１９８ ２）に述べられている標準的方法を用い、各トランスホーマントからＤＮＡを調 製した。このトランスホーマントＤＮＡを種々の制限エントヌクレアーゼで消化 し、発現ベクター内のカッパ軽鎖ｃＤＮＡ遺伝子の方向を確認した。生成したカ ッパ軽鎖発現ヘクターは、カッパリーダーを含む全カッパ鎖を含んでいた。
リーダーを含まないカッパ軽鎖遺伝子を含む発現ベクターは、以下のように調製 した。単離した全長カッパ軽鎖遺伝子ｃＤＮＡをポリヌクレオチドＰ２およびＰ ３（表２）および先の突然変異誘発法を用いて変異した。ポリヌクレオチドＰ２ は、成熟カッパ軽鎖のＮ−末端アミノ酸をコードする配列の丁度５′側にＥｃ○ Ｒ１制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入し、野生型のｃＤＮＡで転写されるカッ パ軽鎖リーダー配列を除去する。ポリヌクレオチドＰ３は、全長カッパ軽鎖ＣＤ ＮＡクローンの３′末端にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。
変異体中にＰ２および２３両ポリヌクレオチドが導入されたことを示す二つのＥ ｃｏＲＩセイゲンエンドヌクレアーゼ部位を含む変異体トランスホーマントを単 離し、シーケンシングして実際にＰ２および２３両ポリヌクレオチドのＤＮＡ配 列を含むことを確認した。
この突然変異誘発で生成したリーダーレスカッパ軽鎖ｃＤＮＡを５′および３゛ 末端にある制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１部位で切りだし、その制限断片を ゲル電気泳動で単離した。このフラグメントを予めＥｃｏＲＩで消化した発現ベ クターｐＭＯＮ５３０に直接ライゲーションした（第２図）。このライゲーショ ン混合物で適当な宿主細胞をトランスホームし、各トランスホーマントを単離し た。各トランスホーマントからＤＮＡを単離し、種々の制限エンドヌクレアーゼ で消化することにより発現ベクター内のリーダーレスカッパ軽鎖ｃＤＮＡ遺伝子 の方向を確認した。このリーダーレスカッパ軽鎖発現ベクターは、通常のリーダ ー配列を含まないカッパ鎖をコードする遺伝子を含んでいた。
表２　変異用ポリヌクレオチド （Ｐ　１）　−５’　−ＴＧＴＧＡＡＡＡＣＣＡＴＡＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣ ＡＡＴＡＣＡＡＡ−３’（Ｐ２　）　−５’　−ＡＴＴＴＡＧｃｘＣＡＡＣＡＴ ＣＣＡＴＧＴＣにＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴ−（Ｐコ） −５’−ＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴにＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＴＴＧ ＴＣＴＣＴＡＡＣＡＣ−３’（Ｐ４）−５’−ＣＣＡＴＣＣＣＡＴにＧＴＴにＭ ＴＴＣＡＧＴＧＴＣにＴＣＡＧ−：ｌ　１（Ｐ５）−５’−ＣＴＧＣＡＡＣＴＧ ＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧ −（Ｐ６）−５’−ＣＣＴにＴＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＭＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡ ＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＴＴＡＣ−：］　’３、ガンマ重鎖遺伝子和合む発現ベク ターの構築ガンマリーダーを含む全ガンマ重鎖遺伝子を含む発現ベクターを以下 のように調製した。単離した全長ガンマ重鎖遺伝子ｃＤＮＡをポリヌクレオチド Ｐ４およびＰ６（表２）および先に述べた突然変異誘発法を用いて変異した。ポ リヌクレオチドＰ４は、本来の全長ガンマｃＤＮＡの５“末端にＥｃｏＲＩ制限 エンドヌクレアーゼ部位を導入する。ポリヌクレオチドＰ６は、全長ガンマ重鎮 ｃ　ＤＮＡクローンの３゛末端にＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入 する。ポリヌクレオチドＰ４およびＰ６の両方が変異体に導入したことを示す二 つの付加的ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む変異トランスホーマン トを単離し、これをシーケンシングしてＰ４および２６両オリゴヌクレオチドの ＤＮＡ配列を含むことを確認した。
全長ガンマ重鎖ｃＤＮＡをその５°および３′末端にある制限エンドヌクレアー ゼＥｃｏＲ１部位（第１図Ｂ）で切りだし、ゲル電気泳動でそのフラグメントを 単離した。この制限フラグメントを予めＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＭ ＯＮ５３０に直接ライゲーションした（第２図）。このライゲーション混合物を 適当な宿主にトランスホームし、各トランスホーマントを単離した。各トランス ホーマントからＤＮＡを調製し、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化して発現 ベクター内のカンマ重鎮ｃＤＮＡの方向を確認した。このガンマ重鎖発現ベクタ ーは、ガンマリーダーを含むガンマ重鎖をコードする遺伝子を含んでいた。
リーダーを含まないガンマ重鎖遺伝子を含む発現ベクターを以下のように調製し た。単離した全長ガンマ重鎖遺伝子ｃＤＮＡを、ポリヌクレオチドＰ５およびＰ ６（表２）および先に述べた突然変異誘発法を用いて変異させた。ポリヌクレオ チドＰ５で、成熟蛋白質のＮ−末端をコードする配列のすぐ５°側にＥｃｏＲ■ 制限エンドヌクレアーゼ部位を導入し、通常のガンマリーダー配列を除去する。
また、ポリヌクレオチドＰ６は、全長ガンマ重鎖ｃＤＮＡクローンの３”末端に ＥｃｏＲＩ制限エントヌクレアーゼ部位を導入する。Ｐ５および２６両ポリヌク レオチドの変異体への導入を示す二つの新たなＥｃｏＲＩ制限エントヌクレアー ゼ部位を含む変異体トランスホーマントが単離された。これらの変異体をシーケ ンンングし、Ｐ５および２６両ポリヌクレオチドが含まれていることを確認した 。
このリーダーレスガンマ重鎖ｃＤＮＡをその５°および３′末端にある制限エン ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切りだし、その制限フラグメントをゲル電気泳動で 単離した。このフラグメントを、予めＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＭＯ Ｎ５３０に直接ライゲーションした（第２図）。このライゲーション混合物を適 当な宿主にトランスホームし、各トランスホーマントを単離した。各トランスホ ーマントからＤＮＡを単離し、種々の制限エントヌクレアーゼで消化して発現ベ クター内のガンマ重鎖ｃＤＮＡの方向を確認した。生成したガンマ重鎖発現ベク ターには、本来のガンマリーダーを含まないガンマ重鎖をコードする遺伝子が含 まれていた。
４、植物への免疫グロブリン遺伝子の導入先の実施例で調製したリーダースカッ パ発現ベクター、リーダーレスガンマ発現ベクター、本来のカンパ発現ベクター および本来のガンマ発現ベクターを、ジッタ（Ｄｉｔｔａ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、？７７３４７−７３５１　（＋９８０）のト リペアレンタル・コンシュケーション・システムを用い、アグロバクテリウム（ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＶ３１１Ｉ−３Ｅ株に導入した。簡単にいうと 、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔ　ｅ　ｒ　ｉ　ｕｍ）　（アクセプタ ー）ＧＶ３１１１−３Ｅを、２．６ｇ／ｌ　イーストイクストラクト、５ｇ／ｌ 　トリプトファン、５ｇ／ｌ　ＮａＣ１，５ｇ／ｌマニトール、１．１６ｇ／Ｉ 　グルタミン酸−ナトリウム、０．２５ｇ／ＩＫＨ，ＰＯ２，０，Ｉｇ／Ｉ　Ｍ ｇ５Ｏ，−７８！Ｏおよび１ｍｇ／ｌヒオチン（ｐＨ７，０）を含むＭＧＬ培地 を入れた寒天プレート中、２８℃で１２−１８時間培養した。ペター（Ｂｅｔｔ ｅｒ）等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５５：３１１　（１９８３）に述べら れているモービライゼーションプラスミドｐＲＫ２０７３を含む大腸菌（ヘルパ ー）をＬＢ寒天培地（５ｇ／ｌ　イーストイクストラクト、ｌＯｇ／ｌ　トリプ トファン、１０ｇ／ｌ　ＮａＣ１，１５ｇ／ｌバクトアガー、ｐＨ７，０）中、 ３７°Ｃで１２−１８時間培養した。各発現ベクターを含む大腸菌を、３７℃で １２−１８時間、３μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび１Ｏａｇ／ｍｌカナマイ シンを補ったＬＢ培地を含むバクテリア培養寒天培地で培養した。同量（約ｌＸ ｌ０’細胞）の三種のバクテリア、アクセプターアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘルパー大腸菌、および発現ベクターを含む大腸菌を混 合し、１００μｇ／ｍｌ　カナマイシン、２００μｇ／ｍｌ　スペクチノマイシ ンおよび５Ｏａｇ／ｍｌ　クロラムフェニコールを含むＡＢ寒天培地（ｌリット ル当たりＩｇ　ＮＨ，Ｃ１，０，３ｇ　Ｍｇ５Ｏａ−Ｈ２Ｏ，０，１５ｇ　ＫＣ Ｉ、Ｏ，Ｏｌｇ　ＣａＣ１ｔ、２．５ｍｇ　ＦｅＳＯ４−７ＨｔＯ，３ｇ　Ｋｔ ＨＰ○４．１．１５ｇ　ＮａＨｚＰＯａ−Ｈｚｏ。
５ｇ　グルコースおよび１５ｇ　バクトアガーを含む）を含むバクテリアプレー トで培養した。このバクテリア培養プレートを２−４日間２８℃でインキュベー ションした。単一のトランスホーマントコロニーを、１００μｇ／ｍｌカナマイ シン、２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンおよび５Ｏａｇ／ｍｌクロラムフェ ニコールを補ったＬＢ培地を入れた培養フラスコ内に入れ、穏やかに振盪しなが ら２８℃で１２−１８時間維持した。先の実施例で調製した各発現ベクターは、 このアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物中に存在し、こ れで植物中の導入する準備が完了した。
ロノヤース（Ｒｏｇｅｒｓ）等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｍ。
１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　アカデミツクプレス、サンディエゴ、ＣＡ （１９８８）の方法でタバコ葉ディスクをトランスホームした。健康で若いタバ コの葉を、２０％家庭用ブリーチ（ｗ／ｖ）および０．　１％ＳＤＳ　（ｗ／ｖ ）を含む溶液に８分間浸すことにより表面を滅菌した。この葉を９８％エタノー ルを含む溶液に６０分間移し、二回蒸留滅菌水で二回濯いだ。この葉ディスクを ６−ｍｍペーパーパンチでバンチした。このディスクをＭＡｌ　Ｏ溶液（ＭＳ塩 、ギブコ、グランドアイランド、ＮＹ、０．Ｏ１ｍｇ／ｍｌ塩酸チアミン、０． ００１ｍｇ／ｍｌ塩酸ブリトキシン、０．００１ｍｇ／ｍｌニコチン酸および０ ．１ｍｇ、／ｍｌｍソイトール、３０ｇスクロース、Ｏ，Ｏ１μｇ／ｍｌ１μタ レンアシン／酸（ＮＡＡ）、１．Ｏμｇ／ｍｌヘンンルアデニン（ＢＡ）、およ びｆｏｇ／ｌハクトアガー、ｐｉ４６．　Ｏ）に沈めた。各ディスクを発現ベク ターを含むアクロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物と５秒間 混合した。さらに、このディスクを滅菌濾紙上で乾燥し、ＭＳ　Ｉ　Ｏ培地に移 してから通常の生育条件に４８時間維持した。その後、各ディスクを滅菌水て洗 浄して発現ベクターを含むほとんどのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ）　を除いたうこの葉ディスクを滅菌したワットマンＮｏ、９濾紙上で 乾燥し、ついで２００μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシンおよび５００μｇ／ｍｌカル ベニシリンを含むＭＳＩＯ選択培地プレート上に裏返して乗せた。このプレート を通常の生育条件に二連間維持した。二連間以内にカルスが出現し、すぐ後に芽 が現れる。芽が現れたのち、それらをＭＳＯ（ＮＷＡまたはＢＡを含まないＭＳ ＩＯ）および２００μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシンおよび５００μｇ／ｍｌカルベ ニシリンを含む再生プレートに移した。再生プレートに根づいた芽を土壌に移し 、植物体に生育させた。この植物を成熟するまで標準的生育条件に維持した。
先の実施例で構築した各発現ベクターから、概説した操作を用いて植物群を調製 した。各植物群の葉抽出物を、エングバル（Ｅｎｇｖａ　ｌ　Ｉ）等、Ｊ、１ｍ ｍｕｎｏ１．、＋０９：１２９−１３５　（１９７２）の方法に基づ＜ＥＬＩＳ Ａ法を用いて免疫グロブリン重鎮または軽鎖の存在に関してスクリーニングした 。簡単にいうと、１５０ｍＭ　ＮａＣ１および２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ −８，０）（ＴＢＳ）を含む溶液５０μｌおよび、ヤギ抗マウス重鎮または軽鎖 特異的ＩｇＧ（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）をマ イクロプレートのウェル中で混合した。水でウェルを四回洗浄したのち、５％脱 脂肪ドライミルクを含むＴＢＳ　２００μｌをマイクロプレートのウェルに入れ た。このウェルを２０℃に少なくとも３０分間維持した後、振ってウェルを空に し、乾燥して固体サポート、即ち、ヤギ抗体を機能的に結合する固体マトリクス を作製した。
各トランスホーマントの葉を葉脈除去後乳鉢でホモジナイズした。１／４倍容の ５ＸＴＢＳ　（７５０ｍＭ　ＮａＣ１および１００ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ ８，０））をホモジナイズしたトランスホーマント葉に混合した。ＴＢＳ（１５ ０ｍＭ　ＮａＣ１および２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０））でホモジネ ートの一連の二倍希釈物を調製した。これらの各希釈物５０μｍを各マイクロプ レートウェルに入れ、これを４℃に少なくとも１８時間維持して固相免疫反応生 成物を生成させた。その後、ウェルを常温の蒸留水で洗浄した。ホースラディッ シュパーオキシダーセ（ＨＲＰＯ）　（フィッシャーサイエンティフィック、ピ ッツバーグ、ＰＡ）に結合したヤギ抗マウス重鎮または軽鎖特異的抗体の１００ ０分のＩＴＢＳ希釈物５０μＩをマイクロプレートの各ウェルに入れた。このウ ェルを３７℃に２時間維持し、説明書にしたがって検出を行った。コントロール のウェルにはベクターのみでトランスホームした植物由来の抽出物を入れ、同様 に操作したが、検出可能な免疫グロブリン産物の発現は無かった。
各植物の免疫グロブリン含量は二度測定し、表３にはその平均値を示した。各植 物群のうちの少なくとも９個をこのように検定した。免疫グロブリン重鎮または 軽鎖を発現する植物で免疫グロブリン遺伝子でトランスホームしていることが示 され、これらをトランスホーマントまたはトランスジェニック植物とした。
表３　タバコにおける免疫グロブリンガンマおよびカッパ鎖の発現ガンマ−ＮＬ 　ガンマ−Ｌ ３０±１６　１４１２±２７０ カッパーＮＬ　カッパーＬ １、４±１．２　５６±５ （３，５）　（８０） 表３に示した結果は、個々の免疫グロブリン鎖の蓄積にシグナル配列が重要であ ることを示している。シグナル配列がｃＤＮＡに存在するとカッパ鎖の蓄積は、 （平均）４０倍増加し、ガンマ鎖の蓄積は、４７倍増加した。
５．免疫グロブリン重鎮および軽鎖の両方を発現する子孫集団の生成各免疫グロ ブリン鎖を発現する実施例４で生成したトランスホーマントを有性的に交配し、 両鏡を発現する子孫を作製した。簡単にいうと、一つの免疫グロブリン鎖を発現 する一つのトランスホーマントから巧を取り除き雌のトランスホーマントを作製 することにより、去勢した未成熟の花を作ることでハイブリットの子孫を調製し た。この雌のトランスホーマントを別の免疫グロブリン鎖を発現する別のトラン スホーマント（雄）と交配した。交配受粉後、ハイブリッド種が生産されるまで 雌のトランスホーマントを通常の生育条件下で維持した。このハイブリット種を 発芽させ、免疫グロブリン重鎮および軽鎖の両方を含む／Ｘイブリッド子孫を生 成した。ハイブリッド子孫を作製する模式図を第３図に示す。その葉をホモジナ イズし、実施例４で述べたＥＬＴＳＡ法を用い免疫グロブリン重鎮または軽鎖に 関し、そのホモジネートを検定した。免疫グロブリン重鎮または軽鎖を発現する ハイブリッド子孫の数を表４に示す。カッパリーダー構築物およびガンマリーダ ー構築物を発現するトランスホーマントの交配から生成したハイブリッドは、ガ ンマ重鎖およびカッパ軽鎖の両方を含む集合型免疫グロブリン分子を含んでいた 。
表４　ハイブリッドにおける免疫グロブリンガンマおよびカッパ鎖の発現ガンマ −Ｌ　ガンマ−ＮＬ （カッパーＬ）　（カッパーＮＬ） ３３３０±２０００　３２±２６ カンバーＬ　カッパーＮＬ （ガンマ−Ｌ）　（ガンマ−ＮＬ） ３７００±２３００　６．５±５ 表５　ハイブリッドにおける免疫グロブリンガンマおよびカッパ鎖の発現および 集合 カンバーＮＬｘ　４　６　３　５ ガンマ−ＮＬ　（集合物Ｏ％） カッパーＬＸ　３　１０　１１　４ ガンマ−し　（集合物９５±１ ６％） 表４および５に示した結果は、二つの免疫グロブリン鎖の集合の重要性を示して いる。親のトランスホーマントと比較して、両免疫グロブリン鎖を同時に発現す る子孫は、重鎖をより多く蓄積する。平均してガンマ鎖は２．５倍も蓄積し、カ ッパ鎖は６６倍も蓄積した。リーダーを含まないｃＤＮＡを発現するトランスホ ーマントと比べて、有性的に交配してリーダー配列および両方の鎖の発現に関す る蓄積量の増加は、驚（はど大きい。ガンマ鎖は１１０倍増加し、カッパ鎖は２ ６００倍増加した。
６、トランスジェニック植物の於ける免疫グロブリン重鎮コード遺伝子および免 疫グロブリン軽鎖コード遺伝子の検出 トランスジェニック植物またはハイブリッド子孫における免疫グロブリン重鎮コ ート遺伝子または免疫グロブリン軽鎖コード遺伝子の存在は、マニアチス（Ｍａ ｎｉａｔｉｓ）等、Ｍｏ１ｅｃｕｒａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１ＮＹ（１９ ８２）のサザンブロツティング法を用いたトランスジェニック植物由来のＤＮＡ を分析することにより示された。簡単にいうと、液体窒素で凍結した重鎮遺伝子 トランスホーマント、軽鎖遺伝子トランスホーマントまたはハイブリッド子孫か ら収穫した１グラムの成熟した葉の断片からＤＮＡを抽出した。このｌｔ結上セ グメント、シュア（Ｓｈｕｒｅ）等、Ｃｅ１ｌ、２５：２２５−２３３（１９８ ６）の方法にしたがって乳鉢を用いてウレアミックス（４２０ｇ／ｌ尿素、３１ ２．５ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭｈリスーＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、２０ｍＭ　 ＥＤＴＡおよび１％サルコシン）中でホモジナイズした。この葉のホモノ不−ト をフェノール　ＣＨＣｌ、（１：　ｌｖ／ｖ）で抽出し、その溶液に１ｌ６倍容 の４．４Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５，２）および１倍容のイソプロピルアルコ ールを添加し、−２０°Ｃに３０分間維持することにより核酸を沈殿させた。
核酸沈殿を含む溶液を４℃、７５００Ｘｇで１５分間遠心し、核酸沈殿を回収し た。このペレットを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）および１ｍＭＥ ＤＴＡを含むＴＥ溶液に溶かした。この溶液中のＤＮＡ濃度は、分光学的に測定 した。
上述の方法を用いて各トランスホーマントからＤＮＡを調製した。トランスホー マント２０μｇを製造業者ストラタジーンクローニングシステム、ラジョラ、Ｃ Ａか推薦する条件下、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで消化した。生じ た制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、マニアチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　 ｉ　ｓ）等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１ＮＹ（１９８２） の方法を用い、アガロースゲルでサイズ分画したのちニトロセルロースにブロッ ティングした。
簡単にいうと、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡをサイズ分画したのち、エチジ ウムブロマイドで染色してゲルの写真を撮った。このＤＮＡを含むゲルを１．　 ５Ｍ　ＮａＣｌおよび０．５Ｍ　ＮａＯＨを含む溶液中、室温で１時間穏やかに 娠盪した。ついで、このＤＮＡを含むゲルをＩＭ　ｌ−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８ ，０）および１．５Ｍ　ＮａＣｌを含む溶液中、室温で１時間穏やかに振盪した 。ゲルの小片を取り出し、少量の蒸宙水のｐＨを測定することによりゲルのｐＨ を周期的にチェックした。ゲルのｐＨがおよそ８．０になったとき、８７．６５ ｇ／ｌＮａＣ１，１３，８ｇ／Ｉ　ＮａＨｆＰＯ＜−ＨｔＯおよび３．　７ｇ／ Ｉ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，４）（ｌ　０ＸＳＳＣ）を含む溶液に浸した厚いガー ゼの上に乗せた。あらかじめゲルと同じサイズに切り、ｌ　０ＸＳＳＣに浸した ニトロセルロースフィルター（シュレイチャーアンドシュエル　ＢＡ８５．キー ン、ＮＨ）をケルの上に置き、間の気泡を除いた。ニトロセルロースフィルター と同じ大きさに切ったワットマン３ＭＭペーパー二枚を２ｘＳＳＣ（１７，５３ ｇ／Ｉ　ＮａＣ１，２，７６ｇ／ｌ　ＮａＨｔＰＯ，−ＨｔＯおよび０．７４ｇ ／Ｉ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，４）　）に浸し、ニトロセルロースフィルターの上 において間の気泡を除いた。積み重ねたペーパータオル（５−８ｃｍの高さ）を ワットマン３ＭＭペーパーよりも少し小さい大きさに切り、それをワットマン３ ＭＭペーパーの上に置いた。この上に硝子プレートを置き、さらに５００グラム の重りを乗せた。
１２−２４時間かけ毛細管現象によりゲルのＤＮＡをニトロセルロースフィルタ ーに移した。この重ね合わせ物を解体し、ニトロセルロースフィルターを室温で ５分間、６ＸＳＳＣ（５２，５９ｇ／Ｉ　ＮａＣ１，８，２８ｇ／ｌ　ＮａＨｚ ＰＯ，−ＨｔＯおよび２．２２ｇ／ｌ　ＥＤＴＡ（１）Ｈ７，４））に浸した。
このフィルターを乾燥したワットマン３ＭＭペーパーの上に置き、空気乾燥させ た。
乾燥したフィルターを二枚の３ＭＭペーパーの間に挟み、減圧下、８０℃で２時 間焼き、ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに機能的に結合させた。
焼いたフィルターを下から完全に湿るまで０．９Ｍ　ＮａＣ１および０．０９Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）を含む溶液の上に乗せた。このフィルターを 同じ溶液に５分間浸した。
このフィルターを、５０％ホルムアミド、０．９Ｍ　ＮａＣ１，０，０５ＭＮａ ＰＯａ　（ｐＨ７，７）、０．Ｏ（１５Ｍ　ＥＤＴＡ、０．１％フィコール、０ 、　１％ＢＳＡ、０．１％ポリビニルピロリドン、０．　１％ＳＤＳおよび１０ ０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液に入れ た。
この溶液を穏やかに攪拌しながら４２℃に１２−１８時間維持した。この溶液か らフィルターを取り出し、ｌｘｌ　０”ｃｐｍ／ｍｌの３２ｐラベルガンマ鎖プ ローブ（全ガンマ発現ベクターラベル化物）およびｌＸ１Ｏ”ｃｐｍ／ｍｌの３ ！Ｐラベルカツパ鎖プローブ（全カッパ発現ベクターラベル化物）を含むプレハ イブリダイゼーション溶液であるハイブリダイーション溶液に浸した。この溶液 を穏やかに攪拌しながら４２℃に１２−２４時間維持した。ハイブリダゼーシミ ンか完了したのち、ハイブリダイーション溶液を除去し、室温の０．３Ｍ　Ｎａ Ｃ１゜０．０３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）および０．　１％ＳＤＳを 含む大量の溶液による１０分間の洗浄を４回繰り返した。さらに、このフィルタ ーを、穏やかに攪拌しながら４２℃で１時間、０．２ｘＳＳＣ（０，０３Ｍ　Ｎ ａＣ１゜０．００３Ｍ’）ｘン酸ナトＩＪウム（ｐＨ７，０））および０．１Ｘ ＳＤＳを含ム溶液に移して洗浄した。洗浄液からフィルターを取り出し、室温で ワットマン３ＭＭペーパー上で乾燥した。このフィルターを３ＭＭペーパーにテ ーピングし、プラスチックラップで包み、増感スクリーンを用いて一７０’Ｃで Ｘ線フィルム（コダックＸＲまたは相当品）を感光させオートラジオグラムを作 製した。このフィルムを説明書にしたがって現像した。
このオートラジオグラムを第４図Ａに示す。リーダー無しくレーン１）またはリ ーダー配列有り（レーン３）のカッパ軽鎖ｃＤＮＡを発現するトランスポーマン トで検出されるハイブリダイズＤＮＡフラグメントが示されている。リーダー無 しくレーン２）またはリーダー配列有り（レーン４）のガンマ重鎖ｃＤＮＡを発 現するトランスホーマントで検出されるハイブリダイズＤＮＡフラグメントが示 されている。本来のリーダーを含むカッパ軽鎖および本来のリーダーを含むガン マ重鎮の両方を含むハイブリッド子孫で検出されるハイブリダイズＤＮＡフラグ メントも示されている（レーン５）。
７、トランスジェニック植物の於ける免疫グロブリン重鎮および軽鎖をコードす るｍＲＮＡの検出 トランスジェニック植物またはハイブリッドにおける免疫グロブリン重鎮または 免疫グロブリン軽鎖遺伝子をコードするｍＲＮＡの存在が、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（上述）の方法 を用い、トランスジェニック植物から抽出したＲＮＡを分析することで示された 。
簡単にいうと、重鎮遺伝子トランスホーマント、軽鎖遺伝子トランスポーマント またはハイブリッド子孫から収穫した成熟葉組織１グラムがらＲＮＡを調製した 。
この葉組織を小さく切り、Ｏ，１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ９，０）およびこの バッフ７で飽和したフェノールを含む溶液１０ｍ１を混合する。この葉組織をこ の溶液中、高速で１分間ポリトンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。こ のホモジネートを室温で４０００ｒｐｍの遠心を１５分間行った。水層を取り除 き、３〜１酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）１ｍｌおよびイソプロパツール２５ｍ １を混合することによりＲＮＡを沈殿させた。この溶液を一２０℃に２０分間維 持してＲＮＡを沈殿させた。この溶液を４℃、４０００Ｘｇで１５分間遠心する ことにより沈殿したＲＮＡを回収した。このＲＮＡペレットを４００μｍのＤＥ ＰＣ−Ｈ２Ｏに溶かし、１．５ｍｌのエツベントルフチューブに移した。この溶 液をエッペンドルフ遠心機を用い最高速度で５分間遠心した。この上清を新しい エッペンドルフチューブに移し、３〜■酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）４０μｍ およびエタノール１ｍｌを混合した。この溶液を一２０℃に２０分間維持してか ら、エッペンドルフ遠心機で５分間遠心した。生成したＲＮＡベレットを４００ μＩのＤＥＰＣ−Ｈ，Ｏに溶かし、少量の試料を取り、２６０ｎｍの吸光度から ＲＮＡ濃度を測定した。残りの溶液は、使用するまで一７０°Ｃで凍結して保存 した。
このようにして調製したＲＮＡを変性ホルムアルデヒドアガロースゲルでサイズ 分画し、ついでナイロンメンブレンに移した。使用した方法は、Ｍｏ１ｅｃｕｊ ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、マニアチス （Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１ＮＹ（１ ９８２）の方法である。簡単にいうと、７３．３ｍｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ液中１ ．４ｇのアガロースを融解し、この溶液を６０℃まで水浴で冷却することにより 変性ホルムアミドアガロースゲルを調製した。この溶液に、５０ｍＭＮａＨ２Ｐ Ｏ４，５０ｍＭ　ＮａｔＨＰＯ４，５０ｍＭ酢酸ナトリウム、および１０ｍＭ　 ＥＤＴＡを含むバッファｌ０ｍ１を加えた。さらに、３７％ホルムアミド１６． ６６ｍ１を加え、ゲルモールドに注いで固化させた。これで変性ホルムアミドア ガロースゲルが使用できる。
先に調製したＦ、ＮＡ２０μｇを、１５μｍのホルムアミド、５μｌの３７％ホ ルムアルデヒド、および５０ｍＭ　ＮａＨｔＰＯ＜、５０ｍＭ　ＮａｔＨＰＯ＜ 。
５０ｍｈｉ酢酸ナトリウムおよび１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含むバッファ３μｌと混 合した。この溶液を５５℃に１５分間維持し、直ちに氷水中で冷却した。５０％ グリセリン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．４％ブロモフェノールブルーおよび０，４ ％キシレンシアツールを含む１／１０倍容の溶液と完全に混合してから、上述の 変性ホルムアルデヒドゲルに乗せた。このゲルを、５ｍＭ　ＮａＨｘＰＯａ、５ ｍＭ　ＮａｔＨＰＯ＋、５ｍＭ酢酸ナトリウム、および１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む バッファ中、室温で２時間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを数回水を取り 替えながら水中に１０−１５分間浸した。その後、このゲルを、０１Ｍトリス− ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）を含む溶液に４５分間浸した。さらに、このゲルを、３ ＭＮａＣ１および０．３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）を含む溶液に入れ た。１．５Ｍ　ＮａＣ１および０．１５〜丁クエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０） を含む溶液に浸した厚いガーゼの上にケルを置き、さらに予めケルと同じ大きさ に切り、ｌ　０ＸＳＳＣに浸したナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ、アマ− ジャム、アーリントンハイツ、ＩＬ）を乗せて間の気泡を除いた。ナイロンメン ブレンと同じ大きさに正確に切った二枚のワットマン３ＭＭペーパーを２ＸＳＳ Ｃ（０，３Ｍ　ＮａＣｌおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）） に浸し、ナイロンメンブレンの上において間の気泡を除いた。ワットマン３ＭＭ ペーパーよりわずかに大きいサイズに切った重ねたペーパータオル（高さ５−８ ｃｍ）をワットマン３ＭＭペーパーの上に置いた。この上に硝子プレートを置き 、さらに５００ｇの重りを置いた。＋２−２４時間かけ、毛細管現象でゲルのＲ ＮＡをナイロンメンブレンに移した。この重ね合わせ物を解体し、ナイロンメン ブレンを６ＸＳＳＣ（０，９Ｍ　ＮａＣｌおよび０．０９Ｍクエン酸ナトリウム （ｐＨ７，０））に室温で５分間浸した。このナイロンメンブレンを１０分間紫 外線照射ボックスに入れ、ＲＮＡをナイロンメンブレンに機能的に結合させた。
力ｌパ軽鎖コード配列またはガンマ重鎖コード配列を含むＲＮＡを実施例６で述 べた方法を用いてナイロンメンブレンをプレハイブリダイズおよびハイブリダイ ズすることにより検出した。このオートラジオグラムを第４１ｆｆｌＢに示した 。リーダー配列無しくレーンｌ）または本来のリーダー配列有り（レーン３）の カッパ軽鎖ｃＤＮＡを発現するトランスホーマント由来のＲＮＡ中の検出される ハイブリダイズＲＮＡ種が示されている。また、リーダー配列無しくレーン２） または本来のリーダー配列有り（レーン４）のガンマ重鎖ｃＤＮＡを発現するト ランスホーマント由来のＲＮＡ中の検出されるハイブリダイズＲＮＡ種が示され ている。本来のリーダーを存するカッパ軽鎖および本来のリーダーを有するガン マ重鎖の両方を含むハイブリッド子孫中に検出されるハイブリダイズＲＮＡ種も 示されている（レーン５）。
８、トランスジェニック植物における免疫グロブリン重鎮および軽鎖の検出トラ ンスジェニック植物およびハイブリット子孫における免疫グロブリン重鎮および 軽鎖の発現は、重鎮および軽鎖の両方が検出されるウェスタンブロッティングで 示された。ウェスタンブロッティングは、Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ　Ｌａｂｏｒａ 　ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ　ｌ、　バーロー　（Ｈａｒ　ｌｏｗ）およびレーン（ Ｌａｎｅ）！、コールドスプリングハーバーラホラトリー、ＮＹ（＋９８８）に 従った。簡単にいうと、成熟した植物の葉セグメントＩｇを０．０５Ｍトリス− ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および１ｍＭフウニルメチルスルホニルフルオライド（ ＰＭＳＦ）を含む溶液１ｍｌ中、乳鉢でホモジナイズし、生成した葉抽出物を指 示されているように２ｍＭ　ＤＴＴ有り、または無しの条件下、最終濃度４Ｍ尿 素および＋　９６’　Ｓ　Ｄ　Ｓとなるように溶液を加え、３分間煮沸した。そ の後、この溶液を、Ｎ、　Ｈ，チュア（Ｃｈｕａ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍｏ＋、、６９：４３４−４４６　（１９８０）に述べられているＳＤＳ 含有１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。この電気泳動した蛋白質を 、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、バー０− （Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）！、コールドスプリングハーバ−ラ ボラトリ−１ＮＹ（１９８８）に述べられているようにニトロセルロースシート に固定化した。簡単にいうと、ニトロセルロースシートを、５％ウシ血清アルブ ミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）および０．５％脱脱脂トドライミルク補ったバッファ（２０ ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０％ポリオキ シエチレン　ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０））（ＴＢＳＴ）に浸 し、４℃に６時間維持した。このニトロセルロースをビオチン化ヤギ抗マウスＩ ｇＧ抗体（カペル、マルベリー、ＰＡ）のＩ：５００　ＴＢＳＴ希釈物を含む溶 液に浸し、４℃に２４時間維持した。この間に、ニトロセルロースシートに固定 化した免疫グロブリン重鎮および軽鎖が、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体ど 免疫反応し、ニトロセルロースシート上に免疫反応物が生成する。この溶液から ニトロセルロースシートを取り出し、ＴＢＳＴ溶液で洗浄してからストレプトア ビジン結合アルカリホスファターゼ（フィッシャーサイエンフィック、ピッツバ ーグ、ＰＡ）を含むＴＢＳＴ溶液の浸して、２５℃に１時間維持した。この溶液 からニトロセルロースシ−トを取り出し、ＴＢＳＴで洗浄した。
このニトロセルロースンートを室温で３０分間、１００ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐ Ｈ９，５）、Ｉ　００ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣＬ、０．３ｍｇ／ｍ１　 ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および１５０μｇ／ｍｌ　５−プロミル −４−クロリルー３−インドリルホスフェ−１−（ＢＣＩＰ）を含む溶液に浸す ことにより免疫反応産物を観察した。フィルターに残存する発色溶液を、２０ｍ ＭｈリスーＨＣｌ　（＋）Ｈ７，５）および１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含む溶液で 濯いだ。このフィルターを、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８）を含む停止溶液に浸 した。
強い紫色の発色は、免疫反応物の位置を示している。
軽鎖トランスホーマントにおける免疫グロブリン軽鎖、重鎮トランスホーマント における免疫グロブリン重鎮、およびハイブリッド子孫における免疫グロブリン 重鎮および軽鎖の発現は、ウェスタンプロットを用いて示されたく第５図）。
さらに、非還元条件で見られる高分子量免疫反応性ガンマおよびカッパ鎖で明ら かなように、ハイブリッド子孫で生成した免疫グロブリン重鎮および軽鎖は会合 していた。
９、トランスジェニック植物中で発現する免疫グロブリン分子は、抗原を結合す る。
トランスジェニック植物中で発現される免疫グロブリン分子による抗原の結合は 、実施例４で述べたＥＬＩＳＡ法と同様の方法で示された。この抗原結合ＥＬＩ ＳＡ検定は、以下のように修正した。マイクロプレートのウェルにヤギ抗体を吸 着する代わりに、トラモンタノ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３：６７３６−６７４Ｇ　（１９８６）の方 法に従いＢＳＡに結合した抗原Ｐ３をマイクロプレートのウェルに吸着させた。
各植物群由来の葉抽出物をウェルに入れ、ホモジネート中に存在する免疫グロブ リン分子の結合が、実施例４に述べたＨＲＰＯに結合したヤギ抗マウス重鎮を用 いて検出した。
トランスジェニック植物中で発現する免疫グロブリン分子は、この抗原結合ＥＬ ＩＳＡ検定においてその特異的抗原Ｐ３に直接結合した。この抗体抗原相互作用 の特異性を示すために、別の競争ＥＬＩＳＡ検定を行った。この検定法は、葉ホ モジネートの一連の希釈前に、５００μＭのＰ３溶液５μｍを二つのウェルに添 加し、ウェルに吸着したＰ３−ＢＳＡに結合する抗体の対する競争者として作用 させること以外は、先に述べた抗原結合ＥＬＩＳＡ検定法と同様である。この競 争ＥＬＩＳＡ検定の残りの部分は、実施例４と同様に行った。
トランスジェニック植物中で発現する抗体とその特異的抗原Ｐ３の相互作用は、 ＢＫ競争ＥＬＩＳＡ検定において遊離した抗原により特異的に阻害された。
１０．１−ランスジェニック植物で発現する触媒性免疫グロブリントランスノエ ニソク植物で発現される免疫グロブリン分子の触媒活性は、機能性免疫グロブリ ンを発現するタバコ植物由来の免疫グロブリン分子６Ｄ４を精製し、その触媒活 性を測定することにより示された。
簡単にいうと、集合型免疫グロブリン分子を含む植物は、実施例１．　２．　３ ゜４、　５．　６および８で述べた方法および操作を用いて作製した。マウスで 生産される通常のグリコジル化した抗体６Ｄ４は、カルボン酸エステルの加水分 解を触媒することから、植物中での発現に免疫グロブリン分子６Ｄ４を選択した 。トラモンタノ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４：１５６ ６　（１９８６）参照。
免疫グロブリン６Ｄ４は、セファクリル分画およびプロティンＡ−セファロース への吸着により免疫グロブリンを発現するタバコ植物の葉から精製した。簡単に いうと、若い葉ｌＯグラムから葉脈を除去し、これを５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ ｐＨ８，０）および１ｍＭ　ＰＮＳＦを含むホモシネ−ジョンバラフッ５０ｍＩ 中で手でホモジネートした。このホモジネートを１１００００Ｘで遠心し、その 上清をセントリコン３０（アミコン、デンバース、ＭＡ）を用い最終的に１０ｍ １まで濃縮した。この濃縮ホモジネートを予め調製したセファクリルＳ−３００ カラムにロードした。このカラムを０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）で溶 出し、１ｍｌの溶出液フラクションを採取した。各フラクションの存在する免疫 グロブリン量は、実施例４で述べたＥＬＩＳＡ検定法て堰す定した。
溶出した大部分の免疫グロブリンを含むフラクションを集め、１．５Ｍグリシン （ｐＨ８，９）および３．０Ｍ　ＮａＣｌをふくむ結合バッファに対して十分に 透析した。透析後、この免疫グロブリンを、２ｇのプロティンＡ−セファロース （ファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ）を含むカラムにゆっくり通し、免疫グ ロブリンをカラムに結合させた。プロティンＡ−セファロースを２０ｍ１の結合 バッファで洗浄した。結合した免疫グロブリンは、０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ６ ，０）を含む溶出バッファ１０ｍ１で溶出した。この溶出物を、セントリコン３ ０を用いて１ｍｌ当たり免疫グロブリン５０μｇとなるまで濃縮した。濃縮した 免疫グロブリンを５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ８，０）に対して透析した。
この溶液中に存在する免疫クコプリンの最終濃度は、実施例８に述べたＥＬＩＳ Ａ検定を用いて測定した。
この６Ｄ４免疫グロブリンのアミノ酸配列を、マツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒ ａ）、Ｐ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２：１００３５−１００３８（１ ９８７）の方法を用いて測定した。簡単にいうと、約ｌμｇの免疫グロブリン６ Ｄ４の１０％ポリアクリルアミドケルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリア クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により免疫グロブリンガンマ重 鎖およびカッパ軽鎖を分離した。この免疫グロブリンの電気泳動は、ガンマ重鎖 およびカッパ軽鎖が分離するまで行った。分離したガンマ重鎖およびカッパ軽鎖 を、マツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）、Ｐ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。
２６２：１００３５−１００３８　（１９Ｂ？）の方法によりポリビニリデンジ フルオライドメンブレンにブロッティングし、アミノ酸配列を決定した。
マウス由来の６Ｄ４モノクローナル抗体を植物のは由来の抗体を精製したのに用 いた方法を使用してマウスの腹水から精製した。簡単にいうと、モノクローナル 抗体６Ｄ４を含むマウス由来の腹水をセファクリル（Ｓ−３００）カラムおよび プロティンＡ−セファロースカラムを用いて分画した。この精製したマウスモノ クローナル抗体６Ｄ４を０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ６，０）バッファで５００μ ｇ／ｍｌとした。
トラモンタノ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４：１５６６ −１５６９　（＋９８６）の方法を用い、特異的インヒビクー有無の条件下で基 質と精製した抗体をインキュベートすることにより植物由来およびマウス由来の 抗体６Ｄ４の触媒活性を検定した（第９図）。簡単にいうと、約１１００ｎのマ ウス由来または植物由来の抗体６Ｄ４を５０ｍＭリン酸バッフｙ　（ｐＨ８，０ ）中、２５℃でプリインキュベートした。基質を含む種々の量の７オキサンスト ツク溶液を混合することにより、５％ンオキサンおよびｌ乃至８ｍＭの範囲の基 質を含む一連の反応混合物を調製した。この反応混合物を、２５°Ｃに１時間維 持し、ついで、エステル基質の加水分解をヒユーレットパンカード８４５２Ａダ イオ一ドアレイ分光光度計を用い、２４５ナノメーター（ｎｍ）での吸光度変化 をモニターすることで測定し１こ。コントロール反応混合物に非特異的エステラ ーゼ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を加えることにより最高の吸光度変化が得 られた。
その速度パラメーターは、トラモンタノ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）等、５ｃｉｅ ｎｃｅ、２３４：１５６６　（１９８６）に述べられているラインライ−バー・ パーク・データ処理を用い、バックグランド加水分解値を差し引いて得た。阻害 定数は、１１００ｎおよび３００ｎＭリン酸塩で得られる傾斜をプロットするこ とで―り定した。
ＫＭ、に１．Ｖ−９−および凰１．で測定される精製した植物由来およびマウス 由来の抗体６Ｄ４の触媒活性を表６に示す。植物由来およびマウス由来の抗体６ Ｄ４には、約桁の差があった。
表６６Ｄ４の触媒活性１ 程！　ム望　熟 に、　ｌ、４１ｘｌＯ−’Ｍ　９．８ｘｌ　Ｏ−’ＭＶ−，，０７０５７ｘｌＯ −’Ｍｓｅｃ−’　０．３１ｘｌＯ−”Ｍｓｅｃ−’に、　０．４７ｘｌＯ−’ Ｍ　１．０６ｘｌＯ−’Ｍ（競争）　（競争） Ｋｏｌ、　０．００８ｓｅｃ−’　０．０２５ｓｅｃ−’ｂ、このデータは、直 線回帰で分析した。
１１、植物における異種リーダー配列による免疫グロブリンの生産植物における 免疫グロブリン集合に関する異種リーダー配列の効果を測定するために、実施例 １で述べた本来のマウスリーダー配列の代わりにサツ力ロミセスセレビシェ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα−メイティング因子由 来のシグナル配列を含む免疫グロブリンｃＤＮＡを調製した。サツカロミセス　 セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα−メイ ティング因子の配列は、カーザン（Ｋｕｒｚａｎ）等、Ｃｅ　ｌ　ｌ。
３０：９３３−９４３　（１９８２）に報告されており、これを表７に示した。
表７　ガンマまたはカッパ鎖に結合したα−メイティング因子リーダー配列の配 列 ｃ　ｍ　ｃ！、−ＴｃｙｃＡＡＴｘｃ、ｃ　ｃｙｃｙＧｘｙｈｃＭいｃＴ＞Ｔｃ ｙｉｃｈＣＴ　ＣＧＡ　Ｇ　ＭＲＦＰＳ工ＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮ ＴＴＴＥＤＥＴＡＱ工ＰＡＥＡＶ工ＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴ ＮＮＧＬＬＦＩＮＴ’ＭＡＳ工ＡＡＸＥＥＧＶＳＬＤＬＫＲ／ＤＷＬ（カッパ鎖 ）；／ＥＶＥＬ　（ガンマ鎖）下線の文字は、イーストプレプロ配列の５゛非翻 訳ヌクレオチドを示している。
残りの文字はアミノ酸である。／は、プレプロ配列とカッパまたはガンマ鎮の結 合部を示している。
簡単にいうと、カーザン（Ｋｕｒｚｑｎ）等、Ｃｅ１１．３０：９３３−９４３ （＋９８２）に述べられているサツカロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−メーティング因子由来のプレプロ配列 を、ｐ６９Ａ由来のα−メーティング因子を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［［制 限エンドヌクレアーゼフラグメントを単離することによりＭｌ　３ｍｐ　ｌ　８ にサブクローニングした。このα−メーティング因子含有制限エンドヌクレアー ゼフラグメントを、予めＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エントヌクレアー ゼで消化したＭ１３ｍｐ１８ベクターにライゲーションした。このクローニング ステップの正確性は、α−メーティング因子ＤＮＡを含むＭ１３クローンの制限 エントヌクレアーゼ消化により検定した。
実施例１で調製した内在性マウスリーダー配列を含まない６Ｄ４カツパおよびガ ンマ鎖ベクターをＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、生成する５゛　リン酸基を除去した 。このα−メーティングベクターを、制限エントヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで 消化し、α−メーティング因子を含むＨｉｎｄｎＩ制限エンドヌクレアーゼフラ グメントを作製した。このフラグメントは、アガロースゲル電気泳動による分離 後、エレクトロエリュウター（ＢＲＬ、ベセスダ、ＭＤ）を用いて単離した。
単離したα−メーティング因子含有制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、別 のライゲーション反応でＨｉｎｄＩ［［消化したガンマおよびカッパベクターに ライゲーションしたつオリゴヌクレオチド依存突然変異誘発を用い、α−メーテ ィング因子プレプロ配列の末端およびＧｉｎフトン（ガンマ鎖）またはＡ　Ｓ　 ＋）フトン（カッパ鎖）の間の余分のヌクレオチドを除去して、キメラＣＤＮＡ を生成した。オリゴヌクレオチド依存突然変異誘発の正確性は、ＤＮＡシーケン シングで確認した。
α−メーティング因子プレプロ配列およびガンマまたはカッパ免疫グロブリンコ ード配列を含むキメラｃＤＮＡを、ロノヤース（Ｒｏｇｅｒｓ）等、Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５３：２５３　（１９８７）に述べられているｐＭＯＮ５３ ０ベクターに挿入した。簡単にいうと、このキメラｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガー セによりｐＭＯＮ５３０ヘクターに結合した。このライゲーション反応の生産物 を、ベセスダリサーチラボラトリーズ（ベセスダ、ＭＤ）のバクテリア種および 方法を用いて大腸菌に導入した。各プラスミド（キメラｃＤＮＡを含む組み換え ｐＭＯＮ５３０）を、制限エンドヌクレアーゼ消化およびシーケンシングで分析 した。
このキメラガンマおよびカッパｃＤＮＡ発現ベクターを用い、ホーシュ（Ｈ。
ｒｓｃｈ）等、５ｃｉｅｎｃｅ、２２７：１２２９−１２３１　（１９８５）お よび実施例４に述べられているように葉ディスクをトランスホームした。
ガンマ３１．鎖またはカッパ１．、鎖のいずれかを発現する各再生物を内在性マ ウスリーダーペプチドを含む本来の６Ｄ４抗体を発現する植物と交配し、本来の ガンマ鎖およびカッパ、、、を含む子孫、またはガンマ、ヮ１および本来カッパ 鎖を含む子孫を作製した。また、これらの子孫を、実施例４に述べたＥＬＩＳＡ 検定法でスクリーニングした。
各子孫の抗体発現レベルは、実施例４で述べたＥＬＩＳＡ検定法を用いて測定し 、その結果を表８に報告した。
表８　ガンマまたはカッパ鎖の蓄積およびガンマ／′カンパ複合体を結合する抗 原ガンマｍａｔ”　力、ｌパｍａｔ ７４３±２６０　４８±８ ガンマｍａｔ（カッパｍａｔ）’　カッパｍａｔ（ガンマｍａｔ’）２４１０＝ １２３０　２２８０±１３００ガンマｍａｔ（カッパマウス）　カッパｍａｔ（ ガンママウス）２６１５＝１５０５　２４９０±１１７５ガンマ−ｔ　（カッパ リーダー・無し）　カッパｍａｔ（ガンマリーダー無し） ７０５＝：３００　３８±８ 水精製したマウス腹水由来の抗体８Ｄ４をＥＬＩＳＡ標準物質として用い、値は 、ｎｇ／ｍｇ−全蛋白質で表した。括弧のなかの数値は、もっとも高い発現レベ ルを示しでいる。
Ｃα（Ｋ）は、ＥＬＩＳＡで測定されたようにに鎖を発現する植物における豊富 なα鎖およびその逆を意味する（有性的交配の子孫）。この場合の括弧のなかの 値は、ＢＳＡに結合したホスホネート抗原（Ｐ３）（先に、トラモンタノ（Ｔｒ ａｍｏｎｔａｎｏ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ。
８３：６７３６−６７４０　（＋９８６）に報告されている）でコーティングし たＥＬＩＳＡプレートに結合する抗体の結果である。ハイアット（Ｈｉａｔｔ） 等、Ｎａｔｕｒｅ、３４２ニア６−７８　（１９８９Ｌもっとも高いレベルのに 複合体を発現する植物のみを、抗原結合検定に使用した。
サツカロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ）リーダー配列を含む各ガンマおよびカッパ鎖は、すでにハイアント（Ｈｉ ａｔｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３４２ニア６−７８　（＋９８９）に報告されてい る本来のマウスリーダーを発現する構築物とほぼ間じレベルで蓄積した。さらに 、機能的抗体は、同じシグナル（ガンマ１．１×カッパ１．１）または異なるシ グナル（カッハ、、ｌ×ガンマｆｉａＩｒｙｓ　ｊカッパ。５ｔｉｒｓ×ガンマ 、、ｌ）を含むガンマおよびカッパ鎖を交配することにより生成した。この事は 、リーダーを含まない免疫グロブリンを発現する親が、ハイアット（Ｈｉａｔｔ ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３４２ニア６−７８　（１９８９）に報告されているよう に機能性抗体を生産しない場合の植物の交配と対照的である。
植物エンドメンブレンシステムによるマウス免疫グロブリンＮ−末端のプロセシ ングの信頼性は、マッダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、、２６２：１００３５−１００３８　（１９８７）に述べられている自動配 列分析で確認した。一般に、哺乳類カッパ鎖Ｎ末端アミノ酸は、カバット（Ｋａ ｂａｔ）等、５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、パブリックヘルスサービス、ナショナル・ インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、メリーランドに報告されているよ うにアスパラギン酸である。ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）等、Ｂｉｏｃｈ 。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、６６　：８４３−８４７　（１９７ ５）に報告されているように、多くのマウスＩｇＧＩガンマ鎖はピログルタミン 酸でブロックされる。配列分析は、本来のマウスリーダーを発現する植物由来の ガンマ鎖が、ブロックされたＮ末端を含むことを示している。本来のマウスリー ダーを発現するカッパ鎖の末端配列は、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｌｅｕであり 、カッパ鎖の適当な蛋白質分解的ブ０セシングを示している。
１２、植物由来の免疫グロブリン分子のグリコジル化植物由来の免疫グロブリン のガンマ鎖グリコジル化パターンを測定するために、フエイ（Ｆａｙｅ）等、Ａ ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、＋４９：２１８−２２４（１９８５）に述べられて いるように精製した抗体をニトロセルロースにブロッティングし、ビオチン化し たレクチンで探った。簡単にいうと、ｌμｇ／ｍｌのビオチン化レクチン（ピア ス、ロックフォード、ＩＬ）を含むバッファ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　Ｏ，５ Ｍ　ＮａＣ！、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ２．０．１ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　ｚ、および ０．１ｍＭ　ＭｎＣＬ）（ＴＩＢＳ）中、室温で１時間ニトロセルロースメンブ レンでインキュベートした。このフィルターをＴｌＢ５で洗浄し、室温で１時間 、ｌμｇ／ｍｌストレプトアビジン・アルカリホスファターゼを含むＴｌＢ５中 でインキュベートした。ハイアット（Ｈｉａｔｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３４２ニ ア６−７８　（１９８９）に述べられているように、結合したアルカリホスファ ターゼは、プロモークロロ−インドリルホスフェートを用いて観察した。
ある場合には、プロッティング前に２００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８）５ ０μｌ中、３７°Ｃで２時間４０ミリユニツトのエンドグリコシダーセＨ（シグ ナルケミカル、セントルイス、ＭＯ）と共に精製した抗体をインキュベートして 、高マンノース型糖を除去した。
第１０図に示した結果は、マンノースおよびグルコースに特異的なコンカナバリ ンＡのみが植物由来の抗体に結合するが、一方、マウス腹水由来の抗体は、リシ ナス　コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）由来のレクチン同様、末 端ガラクトース残基（Ｎ−アセチルガラクトサミン）に特異的なコンカナバリン Ａにより、並びに比較的程度は小さいが末端シアル酸残基を有するＮ−アセチル グルコサミンダイマーに特異的な小麦胚芽アグルチニンにより認識された。種々 のレクチンの特異性はキジモトーオチアイ（Ｋｉ　ｊｉｍｏｔｏ−Ｏｃｈｉａｉ ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２５７　：４３−４９　（１９８９）に議論され ている。
Ｎ−アセチルグリコサミンオリゴマーおよびＮ−アセチルラクトサミンに特異的 なダツラ　ストラモニウム（Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）由来のレク チンおよびＧａｌ　］ｌ、４ｇ１ｃＮａｃ　βｌ、２マンノースに特異的なファ セオラス　バルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のレクチ ンは、植物またはマウス腹水由来のガンマ鎖のいずれにも結合しなかった。　α −メチルグルコシドを用いたニトロセルロースプロットからのレクチンの溶出を 用いてコンカナバリンＡの植物およびマウス腹水由来の抗体に対する相対的アフ ィニティーを比較した。ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）等、Ｂｉｏｃｈ、Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　６６：８４３−８４７　（１ ９７５）参照。この検定法を用いて、植物およびマウス腹水由来の抗体を、コン カナバリンＡへのアフィニティー並びにガンマ鎖μｇ当たりのコンカナバリンＡ 結合量に関して区別しつる。
トリムプル（Ｔｒｉｍｖｌｅ）等、Ａｎａ　１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１４１　： 　５１５−５２２　（１９８４）に述べられている条件を用いたエンドグリコシ ダーセＨによる植物およびマウス腹水由来の抗体の消化を行い、その抗体をニト ロセルロースに移した。エンドグリコシダーセで消化した抗体は、コンカナバリ ンＡのオバルブミンへの結合が減少する条件下で、コンカナバリンＡへの結合は 減少しなかった。
これらの結果は、植物由来の免疫グロブリンがマウス腹水由来の抗体と同様の細 胞成分を介して処理されることを示している。ガンマ鎖のコンカナバリンＡへの 結合およびこのグリカンのエンドグリコトダーゼＨによる消化に対する耐性は、 正しいカッパ鎖Ｎ−末端と共に抗体が小胞体からゴルジ体に移動し、細胞膜から 分泌されることを示している。つすルター（Ｗａ　ｌ　ｔ　ｅ　ｒ）等、Ａｎｎ ｕ、Ｒｅｖ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、２：４９９−５１６　（１９８６）参照。
いくつかのレクチンの植物由来の抗体への結合の差異は、植物由来の抗体および マウス腹水由来の抗体の最終的なグリコジル化パターンが異なることを示してい る。植物由来の抗体は、末端ガラクトースおよび末端シアル酸に特異的なレクチ ンに結合せず、一方マウス腹水由来の抗体は結合した。
１３、植物細胞壁における免疫グロブリンの保持細胞壁を含まない植物プロトプ ラストからの免疫グロブリンの分泌速度は、本来の植物壁からの免疫グロブリン の分泌速度と比較した。植物細胞がらのプロトプラストの調製は、トリコリ（Ｔ ｒｉｃｏｌｅ）等、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔ、５：３３４−３３７ 　（１９８６）に報告されている。簡単にいうと、タバコの葉’１ｃｍ２片をセ ルリシン（カルバイオケム）、マセラーゼ（カルバイオケム）およびトリセラー セ（シグマ）を含む混合物中、１８時間インキュベートして細胞壁を消化し、そ の葉からプロトプラストを放出させた。このプロトプラストを、０．４Ｍマニト ール中での遠心で（１００Ｘｇ、２分間）精製した。
２ＸｌＯ’個のプロトプラストをｌＯμＣｉ　ｍＣｉの２５Ｓ−メチオニンを含 むマニトール培地０．５ｍｌに懸濁することにより、プロトプラストまたは元の 植物細胞から生産される免疫グロブリンをラベル化した。この細胞をラヘル化培 地中で２時間維持し、細胞および培地の一部を採取して抗体６Ｄ４へのラベル化 メチオニンの取り込みを測定した。インキュヘーション培地におけるラベル化６ Ｄ４抗体の量は、プロティンＡ−セファロースカラムへの培地中に含まれる免疫 グロブリンの吸着およびカラムに吸着した全ラベル量の測定により決定した。細 胞中で抗体６Ｄ４に取り込まれたラベル化メチオニン量は、ハイアット（Ｈｉ　 ａ　ｔｔ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１：　１２９３−１２９８　（ １９８６）に述べられているように、細胞の調製およびその分解物の１０％５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により測定した。抗体６Ｄ４を含む５ＤＳ−ＰＡＧＥ ゲルの部分を切りだし、そのゲルからラベル化した抗体を溶出した。存在する全 ラベル化抗体量を測定した。さらに、１．００ｍＭメチオニン存在下で更に２時 間維持したのちに同様の測定を行った。
ハイアット（Ｈｉａｔｔ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１　：１２９３ −１２９８　（１９８６）に述べられているように、適当な成長ホルモン中で葉 セグメントをインキュベートすることにより８週間に渡ってカルス細胞系列を成 長させた。液体サスペンション細胞系列はカルス細胞の塊から調製し、さきに述 べた３５５−メチオニンの取り込みに使用した。
この分泌分析の結果を表９に示す。２時間のラベル後、新たに合成された抗体の 一部が、プロトプラストから有意に分泌された。１００ｍＭメチオニンによる２ 時間のチェイス後、ラベル化抗体のほとんどがプロトプラストから培地中に分泌 されていた。このことは抗体の分泌が起こっていることを示している。一方、約 ４０％のラベル化抗体が元の細胞壁を存するカルスサスペンション細胞系列内に 保持された。これらの細胞は、薄い一次細胞壁を有しており、したがってその細 胞壁内に抗体を保持してしまう。
表９２時間での６Ｄ４への３５８−メチオニンの取り込み（培地／細胞）プロト プラスト　プロティンＡ　０．３３”　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　０．３１ カルスサスヘンジヨン細胞　プロティンＡ　Ｏ，３９ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　０．２ ５ ２時間チェイス後の６Ｄ４への取す込みプロトプラスト　プロティン、Ａ　６． ６０ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　６．３１ カルスサスペン／コン細胞　プロティンＡ　２．７７８ＤＳ−ＰＡＧＥ　２．１ ４ １４、植物細胞における分泌性１ｇＡの生産Ａ、病原特異的可変部をコードする メツセンジャーＲＮＡの単離所定の抗原に免疫特異的な分泌性ＩｇＡは、まず所 定のハイブリドーマから可変部コード遺伝子を単離することにより植物中で生産 する。メツセンジャーＲＮＡは、ストラタジーン（ラジョラ、ＣＡ）によって製 造されているＲＮＡ単離キットおよびその説明書を用い、チョムジンスキー（Ｃ ｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１６２：１５６−１ ５９　（１９８７）の方法に従って調製した。簡単にいうと、ガラスホモジナイ ザーを使用して約ｌＸｌ０’個の細胞を、４．０Ｍグアニンイソチオシアネート 、０．２５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）およびＯ，１Ｍ　２−メルカプ トエタノールを含む変性溶液１０ｍ１中でホモジナイズする。ｐＨ４，０の２Ｍ 　酢酸ナトリウム１ｍｌをホモジナイズした細胞を含む変性溶液に混合する。こ のホモジネートに、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４゜ｌｖ／ｖ）２ ｍｌを添加する。このホモジネートを１０秒間激しく攪拌し、氷水中で１５分感 維持した。このホモジネートを厚みのある５０ｍ１ポリプロピレン遠心チユーブ （フィッシャーサイエンティフィックカンパニー、ピッツバーグ、ＰＡ）に移す 。この溶液を４℃、１１０００ＱＸで２０分間遠心し、上のＲＮＡ含有水層を新 しい５０ｍ１ポリエチレン遠心チユーブに移して等容量のイソプロピルアルコー ルを混合する。この溶液を−２０℃に少なくとも１時間維持してＲＮＡを沈殿さ せる。沈殿したＲＮＡを含む溶液を、４℃、Ｉｏｏｏｏｘｇで、２０分間遠心す る。ペレット化した全細胞ＲＮＡを回収し、先に述べた変性溶液３ｍｌに溶かし た。
この全細胞性ＲＮＡに、イソアミルアルコール３ｍｌに溶かした。イソアミルア ルコール３ｍｌを全細胞性ＲＮＡに添加し、激しく撹拌するっこの溶液を一２０ ℃に少なくとも１時間維持してＲＮＡを沈殿させる。ＲＮＡの沈殿を含む溶液を ４℃、１１００００ｘで１０分間遠心する。ペレット化したＲＮＡを７５％エタ ノールを含む溶液で洗浄した。ペレット化したＲＮＡを減圧化で１５分間乾燥し 、ついでツメチルピロカーボネート処理した（ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ）Ｈ２Ｏに懸濁 した。
このように調製したメンセンジャーＲＮＡについて、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第二編、サムブロック （Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、編、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ（１９８９） に述べられているように長いポリＡテールを含む配列を濃縮した。簡単にいうと 、ハイブリドーマ細胞から単離した全ＲＮＡの半分を１ｍｌのＤＥＰＣ−Ｈ，Ｏ に溶解し、６５℃に５分間維持した。１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１Ｍ塩化ナト リウム、２．０ｍＭエチレンノアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７， ５）。
および０２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２×高塩ロ一ドバツフア １ｍｌをこのＲＮＡサスペンションに加え、室温まで冷却する。ついで、この混 合物を、予め０．１Ｍ水酸化ナトリウムおよび５ｍＭＥＤＴＡを含む溶液で洗浄 し、ＤＥＰＣ−Ｈ，Ｏで平衡化したオリゴ−ｄＴ（コラボラティブリサーチ、タ イプ２または３）カラムにロートする。このカラム溶出物を滅菌したポリプロピ レンチューブに回収し、６５℃に５分間加熱した後、再び同じカラムにかけたつ このカラムを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、５００ｍＭ塩化ナト リウム、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）およびＯ，Ｉ％ＳＤＳを含む高置ロ ードバッファ２ｍｌで洗浄する。さらに、このカラムを、５０ｍＭトリス−ＨＣ Ｉ（ｐＨ７，５）、ｌ　Ｏ０ｍＭ塩化ナトリウム、ＩｍＭ　ＥＤＴＡおよびＯ， １％ＳＤＳを含むｌ×中塩バッファ２ｍｌで洗浄する。このカラムから、１０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）および ０．０５％ＳＤＳを含むバッファ１ｍｌを用いてメツセンジャーＲＮＡを溶出す る。この溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、ついで１０（１％クロロホ ルムで一度抽出することによりメツセンジャーＲＮＡを精製した。このメツセン ジャーＲＮＡをエタノール沈殿で濃縮し、ＤＥＰＣ−８２０に溶解して使用する まで一７０℃で保存した。
このように精製したメンセンジャーＲＮ　Ａは、ハイブリドーマにより生産され た抗体を構成する重鎮および軽鎖両可変部をコートするメソセンジャーＲＮＡを 含んでいる。
Ｂ、ポリメレースチェーンリアクションを用いた可変部の単離ＰＣＲ増幅を目的 とした調製物では、プライマー伸長反応にょるｃＤＮＡ合成用のテンプレートと して先の実施例で調製したｍＲＮＡを使用する。典型的な５０μｍの転写反応で は、まず５−１０μｇのハイブリドーマｍＲＮＡの水溶液を、６５℃で５分間か けて５００ｎｇ　（５０，０ｐｍｏｌ）の３°　ＶＨプライマーとハイブリダイ ズ（アニール）する。オランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ）等、Ｐｒｏｅ。
Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８６：３８３３−３９３７　（１９ ８９）参照。つづいて、この混合物を、１．５ｍＭ　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよび ｄＴＴＰ、４０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，（１）、８ｍＭ　ＭｇＣＬ、 ５ＱｍＭＮａＣｌ、および２ｍＭ　スペルミジンとなるように調整する。この溶 液にモロニー・ムライン白血病ウィルス逆転写酵素（２６ユニツト、ストラタジ ーン）を添加し、３７℃に１時間維持する。
ＰＣＲ増幅は、逆転写反応産物（約５μｇのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）、 オランディ　（Ｏｒｌａｎｄｉ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、。
ＵＳＡ、８６：３８３３−３９３７　（１９８９）に述べられている３“　ＶＨ ジブライー３００ｎｇ、オランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ）等、（上述）に述べられ ている８個の５°ＶＨプライマー各３００ｎｇ、２００ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物、 ５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ　（ｐＨ８，３）　、１５ｍＭ　 Ｍｇ　ＣＩ　２゜０．１％ゼラチンおよび２ユニツトＴａｑ　ＤＮＡポリメラー ゼを含む１００μｍの反応液で行う。この反応物にミネラルオイルを重層し、増 幅を４０サイクル行う。各増幅サイクルには、９２℃、１分間の変性、５２℃、 ２分間のアニーリング、および７２°Ｃ１１，５分間のプライマー伸長によるポ リヌクレオチド合成（伸長反応）が含まれる。増幅されるＶ。−コートＤＮＡホ モログ含有サンプルを、フェノール−クロロホルムで２回およびクロロホルムで １回抽出し、エタノール沈殿後、１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）お よび１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液に溶解して一７０℃で保存した。
ラムダまたは力７バ軽鎖に特異的な３°　ＶＬプライマーおよび５“　■、プラ イマーを使用すること以外は先の方法と同様に軽鎖可変部を単離する。ＰＣＲ増 幅条件は、重鎮可変部について述べたものと同じである。
Ｃ植物発現へフタ−への病原体特異的重鎮および軽鎖可変部の挿入矢に述べたよ うに、病原体特異的重鎮および軽鎖可変部を単離し、ＩｇＡの不変部を含む植物 発現ベクターに挿入する。標準的分子生物学的技術を用いて、このベクターを構 蘂する。このベクターは、実施例１で述べた抗体６Ｄ４由来の免疫グロブリンン グナル配列および完全に配列決定され、オーフレー（Ａｕｆｆｒａｙ）等、Ｇｅ ｎｅ、１３：３６５−３７４　（１９８１）に報告されているＭＯＰＣ３１５か ら単離した免疫グロブリンα不変部の両方を含むｐＭＯＮ５３０の誘導体である 。また、このベクターには、免疫グロブリンシグナル配列およびＩｇＡ不変部遺 伝子の間にポリリンカ一部分が含まれ、病原体特異的重鎮可変部の挿入が容易と なっている。ポリリンカー中に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位は、重鎮可 変部の単離に使用するＰＣＲＣラプライマー中在する制限エンドヌクレアーゼ部 位に一致する。ベクターを適当な制限酵素で切断し、かつ可変部を単離するのに 用いたＰＣＲＣラプライマー中在する適当な制限酵素部位で病原体特異的可変部 を切断することにより、病原体特異的重鎮可変部をベクターに挿入する。ついで 、このベクターに病原体特異的可変部をライゲーションする。
このベクターを実施例４で述べた方法を用いて植物に導入する。病原体特異的Ｉ ｇＡ重鎮を含む植物が同定され、これを病原体特異的重鎮可変部含有植物と交配 する。
病原体特異的重鎮可変部含有植物と同様の技術を用いて、適当な軽鎖に結合した 病原体特異的軽鎖可変部を含む植物を作製する。
有性的交配を用いて同一の植物中に病原体特異的重鎮および軽鎖を含ませ、集合 型ＩｇＡを含む植物を作製する。
ｐＭＯＮ５３０ベクターなどの植物発現ベクターに分泌要素をコードする遺伝子 を導入することにより、ＴｇＡの分泌要素を含む植物を作製する。分泌要素の配 列は、モストフ（Ｍｏｓｔｏｖ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３０８：３７　（１９８４ ）に報告されている。標準的分子生物学的技術を用い、適当なシグナル配列とと もに分泌要素遺伝子をｐＭＯＮ５３０ヘクターに挿入する。この分泌要素含有ベ クターを用いて植物細胞をトランスホームし、分泌要素を含み、これを発現する 植物を作製する。
分泌要素、軽鎖および重鎮に関して述べられているように、植物発現ベクターに Ｊ鎖をコードする遺伝子を挿入することにより、免疫グロブリンＩｇＡのＪまた は結合鎖を含む植物を作製する。Ｊ＃１遺伝子の配列は、マックス（Ｍａｘ）等 、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６１：８３２−８４９　（１９８５）に報告されて いる。
さらに、他のＪ鎖の配列は、免疫学的に重要な蛋白質の配列、第四編、アメリカ 、デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒユーマン・サービス、（１９１１ １７）から入手できる。このベクターを用いＪ鎖を発現する植物を作製する。
これらのＪ鎖発現植物を分泌要素を発現する植物と交配し、分泌要素およびＪ鎖 の両方を発現する植物を作製する。これらの植物を病原体特異的ＩｇＡ抗体を発 現する植物と交配し、二つのＩｇＡ分子、分泌要素およびＪ鎖からなる真の分泌 性１ｇＡを発現する植物を作製する。
Ｄ６選択した病原体に対する受動免疫の誘導分泌性ＩｇＡを生産する植物を実施 例１１にしたがって生産する。これらの植物は、赤痢菌トキシンに免疫特異的な 分泌性ＩｇＡを生産した。この分泌性ＩｇＡは、１３Ｃ２（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ］ ７９４）と命名したハイブリドーマから重鎮および軽鎖可変部を単離することに より生産した。分泌性１ｇＡを発現する植物は、植物物質１０−１００グラム当 たり約ｌミリグラムの分泌性ＩｇＡを含んでいた。これらの植物を収穫し、この 植物が新鮮なうちに受動免疫に使用する。
毎日１−４回、分泌性ＩｇＡを発現する植物１０−１００グラムを摂取させるこ とにより受動免疫が必要とされる成人を免疫化する。この免疫グロブリン摂取は 、全部で三日間行い、ついで赤痢菌トキシンを含むバクテリアを摂取することに より受動免疫の誘導を分析する。成人は、炭酸水素ナトリウムを含む水１オンス に懸濁した赤痢菌約１．２ＸｌＯ’コロニー形成ユニツトを摂取する。約１５分 から３０分後、その成人は、分泌性１ｇＡを含む植物１０−１００グラム以上を 摂取する。
バクテリア摂取から１から２日後、その成人について下痢の状態をモニターする 。分泌性１ｇＡ含有植物を摂取せず、同じバクテリアを摂取した成人に比べ、分 泌性１ｇＡを含む植物を摂取した成人の下痢の発生は非常に減少する。
赤痢菌トキシンおよび赤痢菌様トキシン（ＳＬＴＩ）に免疫特異的な分泌性植物 を、ハイブリドーマＩ　３　Ｃ２（ＡＴＣ（ＪＣＲＬ　Ｉ　７９４）由来の重鎮 および軽鎖可変部を単離することにより調製する。この植物は、植物物質１０− １００グラム当たり約１ｍｇの抗赤痢菌抗体を含んでいる。抗赤痢菌抗体を含む 植物を単離し、ホモジナイズして小児用に使用する。
小児には、通常の食事への補填物として、ミロ以上に分けてＩＢｉこ必要な植物 物質量に存在する６−６００ｍｇの抗体等価物を与える。小児を通常の赤痢菌に 曝した後、赤痢の症状を測定する。分泌性１ｇＡを含む植物物質を摂取せず同様 の赤痢菌を受けた小児に対して赤痢菌トキシンに特異的な分泌性１ｇＡを含む植 物物質を受けた小児の赤痢の症状は非常に減少する。
これまでの事項は本発明を説明するためのものであり、これを制限するものでは ない。これらを本発明の精神および範囲を逸脱すること無しに修正および変化し うろことは明白である。
浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 重鎮植物　アヨ植物 ＦＩＧ、３ ＋２　３４５　６　７８９ −゛ −１、−４−−＃に″″′ ＦＩＧ、　５ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　６Ａ Ｓ、Ａ、　Ｓ、Ａ。
複合体 浄書・′内容に変更なし） ハイブリ、ド 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、６Ｃ ＭＡＮ　ＭＡＮ　ＭＡＮ 高マンノース 浄！（内容に変更なし） ＦＩＧ、　８ 平成　年　月　日

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも二つのポリペプチドを含む生物学的に活性なグリコポリペプチド マルチマーであって、該ポリペプチドの一つが、（ａ）免疫グロブリンアミノ酸 残基配列、および（ｂ）コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウター ブランチを有し、かつ該マルチマーかシアル酸残基を含まないグリコポリペプチ ドマルチマー。 ２．前記アミノ酸残基配列が、免疫グロブリン重鎖可変部アミノ酸残基配列を含 む請求項１記載の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー。 ３．前記アミノ酸残基配列か、免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ酸残基配列を含 む請求項１記載の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー。 ４．請求項１記載の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、さらに 前記ポリペプチドに結合した別のアミノ酸残基配列を含む別のポリペプチドを含 むマルチマー。 ５．請求項１記載の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、少なく とも一つの触媒部位を含むマルチマー。 ６．請求項１記載の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、少なく とも一つの酵素部位を含むマルチマー。 ７．前記アミノ酸残基配列が触媒部位を規定している請求項１記載の生物学的に 活性なグリコポリペプチドマルチマー。 ８．グリコシル化コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブラン チおよび免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有するポリペプチドであって、 別の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含む別のポリペプチドに結合するポ リペプチドを含む生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、検出可能 なシアル酸を含まないマルチマー。 ９．前記別の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、免疫グロブリン重鎖可変 部アミノ酸残基配列を含む請求項８記載の生物学的に活性なグリコポリペプチド マルチマー。 １０．前記別の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、免疫グロブリン軽鎖可 変部アミノ酸残基配列を含む請求項８記載の生物学的に活性なグリコポリペプチ ドマルチマー。 １１．前記免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、免疫グロブリン重鎖可変部 アミノ酸残基配列および免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求 項８記載の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー。 １２．前記免疫グロブリンアミノ酸残基配列か触媒部位の第一部分を規定し、な らびに前記別の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列か該触媒部位の第二部分を 規定し、かつ該第一および第二部分が会合して該触媒部分のより大きい部分を形 成する請求項８記載の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー。 １３．前記免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の一部を規定する 免疫グロブリン重鎖可変部のアミノ酸残基配列を含む請求項８記載の生物学的に 活性なグリコポリペプチドマルチマー。 １４．前記別の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の一部を規定 する免疫グロブリン軽鎖可変部のアミノ酸残基配列を含む請求項８記載の生物学 的に活性なグリコポリペプチドマルチマー。 １５．前記免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の第一部分を規定 する免疫グロブリン重鎖可変部のアミノ酸残基配列を含み、ならびに前記別の免 疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の第二部分を規定する免疫グロ ブリン軽鎖可変部のアミノ酸残基配列を含み、かつ該第一および第二部分会合し て該触媒部分のより大きい部分を形成する請求項８記載の生物学的に活性な複合 グリコポリペプチドマルチマー。 １６．生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーであって、（ｉ）Ｎ−ア セチルグルコサミン含有アウターブランチを含むグリコシル化コア部分で規定さ れるオリゴサッカライドおよび免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有するポ リペプチドで、マウス免疫グロブリン結合レクチンに結合しないポリペプチド、 および （ｉｉ）別の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含む別のポリペプチドで、 前記ポリペプチドに結合するポリペプチド、１７．前記免疫グロブリン分子アミ ノ酸残基配列が免疫グロブリン重鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項１６記 載の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー。 １８．前記別の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が免疫グロブリン軽鎖可変 部アミノ酸残基配列を含む請求項１６記載の生物学的に活性なグリコポリペプチ ドマルチマー。 １９．前記マウス免疫グロブリン結合レクチンが小麦胚芽アグルチニンである請 求項１６記載の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー。 ２０．前記マウス免疫グロブリン結合レクチンがリシナスコムニス（Ｒｉｃｉｎ ｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）アグルチニンである請求項１６記載の生物学的に活性な グリコポリペプチドマルチマー。 ２１．所定のリガンドを結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチ マーであって、グリコシル化コア部分およびＮ−アセチルグリコサミン含有アウ ターブランチを含み、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列を有するポリペプチド を含み、かつ検出可能なシアル酸残基を含まないマルチマーを含む予防量の組成 物を動物のムコサ表面と接触させることを含む所定のリガンドに対する動物の受 動免疫化の方法。 ２２．動物に所定のリガンドに対する受動免疫を提供する方法であって、所定の リガンドを結合しうる生物学的に活性なカプセル化されたグリコポリペプチドマ ルチマーを該動物体内で予防濃度となるのに十分な量で該動物に投与することを 含み、、該マルチマーがグリコシル化コア部分およびＮ−アセチルグリコサミン 含有アウターブランチを含み、ならびに免疫グロブリン分子のアミノ酸配列を有 するポリペプチドを含み、かつ検出可能なシアル酸残基を含まないマルチマーで ある方法。 ２３．動物に病原体に対する受動免疫を提供する方法であって、動物体内で予防 濃度に達するのに十分な量の該病原体抗原に結合しうるカプセル化した生物学的 に活性なグリコポリペプチドマルチマーであって、グリコシル化コア部分および Ｎ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含み、ならびに免疫グロブリ ン分子のアミノ酸残基配列を有し、かつシアル酸を含まないマルチマーを該動物 に投与することを含む方法。 ２４．前記マルチマーが、植物細胞壁にカプセル化されている請求項２２記載の 方法。 ２５．植物細胞にカプセル化されている前記マルチマーおよび該細胞を含む組成 物を投与する請求項２２記載の方法。 ２６．前記マルチマーが、腸外皮にカプセル化されている請求項２２記載の方法 。 ２７．動物に所定のリガンドに対する受動免疫を提供する方法であって、所定の リガンドを結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーであって 、グリコシル化コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチ を含み、かつ免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含 み、かつ検出可能なシアル酸残基を含まないマルチマーの該動物中の濃度が、予 防的濃度となるのに十分な量のマルチマーを投与する事を含む方法。 ２８．動物に特定の病原菌に対する受動免疫を提供する方法であって、特定の病 原菌を結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーであって、グ リコシル化コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含 み、かつ免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含み、 かつ検出可能なシアル酸残基を含まないマルチマーの該動物中の濃度が、予防的 濃度となるのに十分な量のマルチマーを投与する事を含む方法。 ２９．前記マルチマーが、該マルチマーおよび栄養価を有する物質で構成される 組成物として投与される請求項２７記載の方法。 ３０．前記栄養価を有する物質が植物物質である請求項２９記載の方法。 ３１．前記栄養価を有する物質が動物物質である請求項２９記載の方法。 ３２．前記マルチマーが、該マルチマーおよび生理学的に不活性な物質から構成 される組成物として投与される請求項２７記載の方法。 ３３．前記組成物が、さらに植物物質を含む請求項２１記載の方法。 ３４．前記生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーがＩｇＡ分子である 請求項２１記載の方法。 ３５．前記生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーが分泌性ＩｇＡであ る請求項２１記載の方法。 ３６．前記生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーがＩｇＡ不変部アミ ノ酸残基配列を含む請求項２１記載の方法。 ３７．前記所定のリガンドがムコサ病原菌抗原である請求項２１記載の方法。 ３８．前記所定のリガンドが腸病原菌抗原である請求項２１記載の方法。 ３９．前記腸病原菌抗原が大腸菌抗原である請求項３８記載の方法。 ４０．前記腸病原菌抗原がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ）抗原である請 求項３８記載の方法。 ４１．前記腸病原菌抗原がビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）抗 原である請求項３８記載の方法。 ４２．前記腸病原菌抗原かサルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔ ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）抗原である請求項３８記載の方法。 ４３．前記所定のリガンドが歯病原菌抗原である請求項２１記載の方法。 ４４．前記歯病原菌抗原がストレプトコッカスミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）抗原である請求項４３記載の方法。 ４５．前記動物が脊椎動物である請求項２１記載の方法。 ４６．前記動物が哺乳動物である請求項２１記載の方法。 ４７．前記動物が魚である請求項２１記載の方法。 ４８．前記動物が烏である請求項２１記載の方法。 ４９．前記動物が単胃動物である請求項２１記載の方法。 ５０．前記動物が離乳した動物である請求項２１記載の方法。 ５１．前記動物が成熟動物である請求項２１記載の方法。 ５２．所定のリガンドに対して動物を受動免疫化する方法で、植物細胞壁および 所定のリガンドを結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで 、一つのポリペプチドが（ａ）免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および（ｂ） コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペ プチドである少なくとも二つのポリペプチドを含み、かつシアル酸残基を含まな いマルチマーを含む組成物を動物の消化管に導入することを含む方法。 ５３．所定のリガンドに対して動物を受動免疫化する方法で、（ａ）所定のリガ ンドを結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、一つのポ リペプチドが、（ａ）免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および（ｂ）コア部分 およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むオリゴサッカライ ドを有するポリペプチドである少なくとも二つのポリペプチドを含み、かつシア ル酸を含まないマルチマーを含む植物細胞を含む組成物を動物の消化管に導入す ること、および（ｂ）該消化管内で該植物細胞を破壊することにより該生物学的 に活性なグリコポリペプチドマルチマーを消化管内に放出し、該動物を受動免疫 化すること以上（ａ）および（ｂ）のステップを含む方法。 ５４．一つのポリペプチドが、（ａ）免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および （ｂ）コア部分およびＮ−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有する ポリペプチドである少なくとも二つのポリペプチドを含むカプセル化した生物学 的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、シアル酸残基を含まないマルチマ ーを含む生物学的に活性な組成物。 ５５．前記カプセルが植物細胞である請求項５４記載の組成物。 ５６．前記カプセルが腸外皮である請求項５４記載の組成物。 ５７．グリコポリペプチドマルチマーで、（ａ）該グリコポリペプチドマルチマ ーの構成部分であるＮ−結合グリコシル化シグナルを有する自発結合性モノマー ポリペプチドをコードする第一哺乳類遺伝子を第一植物種のゲノムに導入し、第 一トランスホーマントを生成する、（ｂ）該グリコポリペプチドマルチマーの構 成部分である別の自発結合性モノマーポリペプチドをコードする別の哺乳類遺伝 子を第二の同じ植物種のゲノムに導入し、第二トランスホーマントを生成する、 （ｃ）該第一および第二トランスホーマントから子孫集団を生成する、および（ ｄ）該子孫集団から該グリコポリペプチドマルチマーを生産するトランスジェニ ック植物を単離する、 以上（ａ）乃至（ｄ）のステップを含む方法で生産するマルチマー。 ５８．前記植物物質が存在するグリコポリペプチド１ミリグラム当たり植物物質 １ミリグラム以上の割合で存在する請求項３０記載の方法。 ５９．前記植物物質が存在するグリコポリペプチド１ミリグラム当たり植物物質 １ミリグラム以下の割合で存在する請求項３０記載の方法。 ６０．複数の自発結合性ポリペプチドコード哺乳類遺伝子、および該遺伝子によ ってコードされ、互いに会合して生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマ ーとなる少なくとも二つの自発結合性ポリペプチドを含む植物細胞を含むトラン スジェニック植物。 ６１．前記マルチマーかホモマルチマーである請求項６０記載の植物。 ６２．前記マルチマーがヘテロマルチマーである請求項６０記載の植物。 ６３．前記生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーが酵素である請求項 ６０記載の植物。 ６４．前記生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーか所定のリガンドを 特異的に結合しうるレポーターである請求項６０記載の植物。 ６５．前記生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーが抗体結合部位を形 成する請求項６０記載の植物。 ６６．前記生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーがアブザイムである 請求項６０記載の植物。 ６７．双子葉植物である請求項６０記載の植物。 ６８．単子葉植物である請求項６０記載の植物。 ６９．低級植物である請求項６０記載の植物。 ７０．生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを生産しうるトランスジ ェニック植物の作製方法で、 （ａ）免疫学的に活性な免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチドをコードする 第一遺伝子を第一植物種のゲノムに導入し、第一トランスホーマントを生成する 、 （ｂ）前記免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチドとは異なるが、これと結合 しうるポリペプチドをコードする別の遺伝子を第二の同じ植物種のゲノムに導入 し、第二トランスホーマントを生成する、（ｃ）該第一および第二トランスホー マントから子孫集団を生成する、および（ｄ）該子孫集団から免疫グロブリン重 鎖部分含有ポリペプチドを含むヘテロダイマーを生産するトランスジェニック植 物を単離する、以上（ａ）乃至（ｂ）のステップを含む方法。 ７１．前記別の遺伝子が、免疫学的に活性な免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペ プチドをコードし、かつ前記子孫集団から免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプ チドおよび免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチドから構成されるヘテロダイ マーを生産する植物種を単離する請求項７０記載の方法。 ７２．前記第一遺伝子が免疫グロブリン重鎖をコードし、前記別の遺伝子か免疫 グロブリン軽鎖をコードし、かつ前記子孫集団から相当するＦａｂフラグメント を生産する植物種を単離する請求項７０記載の方法。 ７３．前記第一遺伝子が免疫グロブリン重鎖可変部をコードし、前記別の遺伝子 が免疫グロブリン軽鎖遺伝子をコードし、かつ前記子孫集団から担当するＦｖフ ラグメントを生産する植物種を単離する請求項７０記載の方法。 ７４．ヘテロダイマーの製造方法で、 （ａ）免疫学的に活性な免疫グロブリン部分含有ポリペプチドをコードする少な くとも一つの遺伝子および該ポリペプチドと自発的に結合可能なポリペプチドを コードする別の遺伝子を含む複数のポリペプチドコード哺乳類遺伝子を含む植物 細胞を有するトランスジェニック植物を培養する、（ｂ）該トランスジェニック 植物を収穫する、および（ｃ）収穫した植物から前記ヘテロダイマー抗体を回収 する、以上（ａ）乃至（ｃ）のステップを含む方法。 ７５．前記回収ステップが、（ｉ）収穫した植物の少なくとも一部をホモジナイ ズし、パルプとすること、および（ｉｉ）該パルプからヘテロダイマー抗体を抽 出することを含む請求項７４記載の方法。 ７６．金属イオンを流体サンプルから分離する方法で、（ａ）該流体サンプルを 該金属イオンに対するキレート剤と混合し、キレート混合物を生成する、 （ｂ）該キレート混合物を、該イオンが該キレート剤と結合し金属イオンキレー ト複合体組成物を形成するのに十分な時間維持する、（ｃ）該金属イオンキレー ト複合体に特異的なヘテロダイマー抗体を含む植物細胞を該組成物と接触させて 結合混合物を生成する、（ｄ）該結合混合物を、該金属イオンキレート複合体が 該植物細胞に入り、該植物細胞内で該ヘテロダイマー抗体との反応生産物を形成 するのに十分な時間維持する、 （ｅ）該結合混合物から該反応生産物含有植物細胞を除去する、以上（ａ）乃至 （ｅ）のステップを含む方法。 ７７．前記植物細胞か生植物を構成する請求項７６記載の方法。 ７８．金属イオン濃度が増加したトランスジェニック植物で、（ａ）金属イオン 含有流体サンプルを該金属イオンに対するキレート剤と混合し、キレート混合物 を生成する、 （ｂ）該キレート混合物を、該金属イオンが該キレート剤と結合し、金属イオン キレート複合体を形成するのに十分な時間維持する、（ｃ）該金属イオンキレー ト複合体を、該金属イオンキレート複合体に特異的なヘテロダイマー抗体を含む 植物細胞と混合し、結合混合物を生成する、（ｄ）該結合混合物を、該金属イオ ンキレート複合体が該植物細胞に入り、該植物細胞内の該ヘテロダイマー抗体と 反応産物を生成するのに十分な時間維持する、 以上（ａ）乃至（ｄ）のステップを含む方法で生産されるトランスジェニック植 物。 ７９．金属イオンキレート複合体および該金属イオンキレート複合体と特異的に 結合しうるヘテロダイマー抗体からなる免疫反応複合体を含むトランスジェニッ ク植物。
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