JPH05506721A - 生合成的脳脊髄液対照及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生合成的脳を髄液対照及び使用方法 本発明は安定な生合成的液状脳を髄液対照及びその使用に関する。加えて本発明 は、該生合成的脳を髄液対照中の一成分である、安定な液状のヒトプレアルブミ ンの単離及び精製に関する。

関連技術の記述 脳を髄液は血漿の限外濾過によって生成される。脳を髄液の分析項目の正常値は 血漿の値とは同じでない。この相違は、選択的である濾過の過程と化学的組成が 血液−脳関門によって調節されているという事実との結果である。この化学的組 成の分析は重要な診断手順である。疾患は、脳を髄液の蛋白質濃度を高める。上 昇した脳を髄液総蛋白質は、髄膜炎又は出血によって起こる血液−脳関門の損傷 のような、中枢神経形病理の指標である。ＩｇＧは脳を髄液の主要なイムノグロ ブリンである。それは、多発性硬化症及びウィルス性髄膜炎のような、いくつか の神経学的状態において高まる。多発性硬化症の診断においては、血清蛋白質電 気泳動法による脳を髄液の分析は重要な診断試験である。低いグルコース値は、 細菌性、結核性又は真菌性髄膜炎のような感染の兆候を示す。低値はまた、悪性 細胞による髄膜の浸潤の結果としても見られる。脳を髄液における高い乳酸レベ ルは、細菌性又は結核性の感染を示しウィルス性髄膜炎を除外する。低い脳を髄 液塩素イオンレベルは、結核性髄膜炎の指標として用いることができる。

脳を髄液の化学的組成が血漿に類似であることから、比較試験が実施されている 。しかしながら、これらの成分のレベルは同一ではなく、血漿について用いられ るものとは異なった正常値をもたらす。これらの診断試験の正確さ及び精密さを 評価するためには、脳を髄液に類似の対照を測定しなければならない。血清蛋白 質電気泳動法の場合には、別のウェルにおいて既知の蛋白質対照を常に測定しな ければならない。脳を髄液中の蛋白質成分は、必ずしも常に明瞭には検出される わけではない。従って、全ての血清蛋白質画分が明確に規定された対照が重要で ある。殆どの脳を髄液対照は、実際の髄液より調製される。しかしながら、髄液 における感染性疾患の存在を検出するための試験はない。加えて、髄液の採取は 困難であり、高価であり、そしてその質は変動する。他の脳を髄液対照は、グル コース及び塩素イオンを含有する希釈液で希釈し、次いで凍結乾燥した正常ヒト 血清より作られる。対照の再構成が、次いで、使用前に必要である。米国特許第 ３．７５３．９２５号を参照のこと。

発明の概要 本発明は、プレアルブミンを添加したヒト血清に基づく、生合成的脳を髄液対照 に関する。２つの対照が開示される。１つは模擬正常髄液であり、第２は模擬異 常髄液である。本製品は、ヒト脳を髄液を模するために処方された緩衝液マトリ クス中のヒト血清及び精製ヒトプレアルブミンより調整される。特に、本発明は 、下記よりなる方法によって作られる安定な液状の、ヒトに基づく脳を髄液対照 に関する。。

（ａ）正常ヒト脳を髄液を模するために緩衝液中で十分量の乳酸、塩素イオン、 グルコース、血清、精製プレアルブミン及びカリウムを組み合わせ、（ｂ）ヒト 脳を髄液の正常電気泳動パターンを得るために上記濾液に酸素を通気し、そして （Ｃ）　全ての微生物性汚染因子を除去するために前記液体を濾過する。

本発明はまた、高純度のプレアルブミン及びプレアルブミンを作るための方法に も関する。特に本発明は、下記よりなる方法によって作られる精製されたプレア ルブミンに関する：（ａ）第１の緩衝液でヒト血清を希釈し、（ｂ）第１の緩衝 液で希釈した正常血清から、イオン交換クロマトグラフィーを用いてグロブリン 、セルロブラスミン及びアルブミンを抽出し、（Ｃ）段階（ｂ）を（ぐり抜けた プレアルブミン含有画分を免疫拡散法により単離し、（ｄ）段階（Ｃ）のプレア ルブミン含有画分をプールし、濃縮しそして第２の緩衝液で緩衝液交換し、（ｅ ）段階（ｄ）のプレアルブミンを含有するプールした画分からアフィニティーク ロマトグラフィーによってアルブミンを除去し、（ｆ）段階（ｅ）から溶出した プレアルブミン含有画分を免疫拡散法によって単離し、（ｇ）プレアルブミン濃 度を高めるために、段階（ｆ）の前記プレアルブミン含有画分をプールし、濃縮 しそして第３の緩衝液で緩衝液交換し、（ｈ）段階（ｇ）の前記プールした画分 からイオン交換クロマトグラフィーによりグロブリンを除去し、（ｉ）プレアル ブミン濃度を高めるために、プールし、濃縮しそして第４の緩衝液で緩衝液交換 し、（ｊ）いかなる残存蛋白質をも除去するために、段階（ｉ）のプレアルブミ ン含有画分をゲル濾過によって精製し、（ｋ）段階（Ｄからの精製されたプレア ルブミン画分を電気泳動法及び免疫拡散法によって単離し、そして（１）段階（ ｋ）の前記精製されたプレアルブミン画分をプールし、濃縮しそして無菌濾過す る。

図面の簡単な説明 図１は、本方法により調製された脳を髄液の蛋白質電気泳動を示す。

図２は、本方法により調製された脳を髄液の蛋白質電気泳動を示す。

図３は、本方法により調製されたプレアルブミンの蛋白質電気泳動を示す。血清 蛋白質電気泳動法による分析。

図４は、本方法により調製されたプレアルブミンの蛋白質電気泳動の、正常ヒト 血清パターンへの重ね合わせを示す。

図５は、Ｒａｚ法により調製されたプレアルブミンの蛋白質電気泳動を示す。血 清蛋白質電気泳動法による分析図６は、Ｒａｚ法により調製されたプレアルブミ ンの蛋白質電気泳動の、正常ヒト血清パターンへの重ね合わせを示す。

発明の詳細な説明 開示された発明は、脳を髄液の範囲内に調整された成分によるヒト血清の希釈を 伴う。脳を髄液は、血清に比し非常に少量の蛋白質しか含有していない。蛋白質 の画分は血清中に見られるそれに類似である。しかしながら、血清中に存在する プレアルブミンの量は１％未満であるのに対し、脳を髄液中に存在する量は総蛋 白質量の２乃至７％である。この蛋白質のレベルを高めるために、プレアルブミ ン添加が追加された。この蛋白質は、カラムクロマトグラフィーを用いてヒト血 清から効果的に単離された。

本製品は各必要成分を５０乃至８０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液マトリクスに添加す ることによって処方される。該緩衝液マトリクスのｐＨは７．３である。血清及 びプレアルブミンは、各レベルのために必要な規格に添加される。グルコース、 乳酸、塩素イオン、ナトリウム、カリウムは表■に規定した所望濃度を得るよう に加えられる。緩衝化された溶液は、次いで、プレアルブミンよりも速く移動す る前アルブミン画分を除去するために１００％酸素で通気され、次いで無菌濾過 される。

この製品のためにアッセイされた成分は、蛋白質、グルコース、乳酸、塩素イオ ン、ナトリウム、カリウム、イムノグロブリン及び電気泳動法による蛋白質画分 である。

レベルＩは正常髄液を示す。レベルＩＩは異常髄液を示す。両対照レベルに観察 される状態は、髄膜炎、多発性硬化症、及び脳外傷又は損傷において最も普通に 見られる。

表Ｉ 微生物学的規格：　米国薬局方の試験法で増殖なし実施例１−　血清からのプレ アルブミンの単離正常ヒト血清の複数単位をプールし、体積を約２１とした。プ ールした血清を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５、アジド０．１％ ）で５０％に希釈した。希釈した血清を０．２２μｍのフィルターを通して無菌 容器中へと無菌濾過した。１ｌＩｉｌ！シた血清を、次いで、５０ｍＭリン酸カ リウム緩衝液（ｐＨ７，５、アジド０．１％）で予め平衡させておいたＤＥＡＥ 　５ｅｐｈａｃｅｌ（登録商標）又はＤＢＡＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（登録商 標ＸＰｈａｒｍａｃｉａ）を含むイオン交換カラムに負荷した。サンプルを負荷 し終わった後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５、アジド０．　１％ ）で、紫外分光光度計による測定で２８０ｎｍの吸光度が０．　２未満となるま でカラムを洗浄した。結合した蛋白質を、０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７，５、アジド０．　１％）中の０乃至ＩＭのＮａＣ１勾配により溶出した。該 勾配が尽きるまで各１２ｍ１の画分を収集した。二〇カラムは、セルロブラスミ ン、グロブリン及びアルブミンをサンプルから除去した。

該両分は、プレアルブミンの存在につき免疫拡散法により試験される。プレアル ブミンを含有する画分が同定されると、それらをプールし、濃縮し、そして２０ ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７゜１、アジド０．０２％）で緩衝液交換する 。プールした画分を約４乃至５ｇ／ｄＩ！の総蛋白質となるまで濃縮した。この 画分プールを、次いで、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，１、アジド０ ．０２％）で平衝させておいたＡｆｆｉ　Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ　（ＢＩＯＲＡＤ） 又はＢｌｕｅ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（登録商標）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を 含むアフィニティーカラムに負荷する。このクロマトグラフィー媒体は、アルブ ミンに対する親和性を有するＣ１ｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ　Ｄｙｅ　Ｆ３Ｇ−Ａ を含有する。サンプルを負荷した後、フラクションコレクターを始動させ、２０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，１，アジド０．０２％）でカラムを洗いつつ各６ｍ ｌの両分を収集した。サンプルを負荷すると、アルブミンは該青色色素に結合し 、そして残りの蛋白質はカラムを通過した。プレアルブミン含有画分をプールし 、濃縮しそして、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５、アジド０．　１ ％）で緩衝液を交換した。該画分を約３乃至４ｇ／ｄｉの総蛋白質になるまで濃 縮した。濃縮した画分を、次いで、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５ 、アジド０．　１％）で予め平衡させておいたＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｃｅｌ（登 録商標）又はＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（登録商標）　（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）を含むイオン交換カラムに負荷した。蛋白質を、５０ｍＭリン酸カリウム 緩衝液（ｐＨ７，５、アジド０，１％）中の０乃至ＩＭのＮａＣ１塩類勾配を用 いて溶出させた。該勾配が尽きるまで各３ｍｌの両分を収集した。

各画分のプレアルブミンの存在につき、免疫拡散法を用いて試験した。

プレアルブミン含有画分が同定されると、これらの画分をプールし、濃縮しそし て、１７０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５、アジ ド０．０２％）で緩衝液交換した。該画分ブールを約２乃至７ｇ／ｄｌの総蛋白 質になるまで濃縮した。

この画分サンプルを、１７０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ ｐＨ７，５、アジド０．０２％）で平衡させたＬＩＬＴＲＯＧＩＥＬ　（登録商 標）　ＡｃＡ　５４　（ＩＢＦ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）を含むゲル濾過カラ ムに負荷した。このカラムを、次いで、１７０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５、アジド０．０２％）で洗浄した。両分は３ｍ！ ！ずつ収集した。２つの蛋白質ピークが収集された。プレアルブミンは大半が第 ２のピークに含まれていた。免疫拡散法を用いて、プレアルブミンの存在につき 各画分を試験した。

プレアルブミンを含有する画分を、次いで、他の血清蛋白質の存在につき血清蛋 白質電気泳動法により試験した。精製されたプレアルブミン画分を選別し、プー ルしそして約１乃至４ｇ／ｄｊ！の総蛋白質となるまで濃縮した。これらのプー ルした両分を無菌濾過し、そして２乃至８°Ｃにて貯蔵した。

精製したプレアルブミンは、血清蛋白質電気泳動法を用いて総プレアルブミン含 量につき、そしてプレアルブミンの定量のために半径方向免疫拡散法を用いて試 験した。蛋白質電気泳動法により単一のピークが観察され、そしてプレアルブミ ンは９０乃至１００％純度であった。図３を参照のこと。正常血清の電気泳動パ ターンと比べたとき、ピークはプレアルブミン領域に観察され、他の血清蛋白質 は存在しない。図４を参照のこと。正常血清に添加したとき、得られる電気泳動 パターンは、プレアルブミン領域にピークを示した。図１及び２を参照のこと。

ＳＤＳ　ＰＡＧＥｉ気泳動は、ただ一つの蛋白質が存在していることを示してい る。この蛋白質はプレアルブミンについて正しい分子量範囲（５４，０００）に 見出される。プレアルブミンの量は、要求されるプレアルブミンの純度に応じて ８０乃至１００％に収率を示した。Ｒａｚ、　Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　 Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２４４：　１２（１９６９）により規定された方法 を用いてヒト血漿より調製されている商業的に入手しつるプレアルブミンを、純 度について評価した。

このプレアルブミンは、蛋白質電気泳動では、僅か７５％の純度であることが見 出された。図５を参照のこと。正常血清の電気泳動パターン比較したとき、夾雑 蛋白質がアルブミン及びα−グロブリン領域に観察される。図６を参照のこと。

冷蔵及び凍結して貯蔵する間の安定性につき、該精製されたプレアルブミンをモ ニターした。該プレアルブミンを、量については半径方向免疫拡散法により、そ して純度については蛋白質電気泳動法によって試験した。これらの条件において 、１０ケ月の貯蔵の後、プレアルブミンは安定に保たれていた。

表Ｕ プレアルブミンの安定性 月　２乃至８°Ｃにおける貯蔵 月　−２０℃における貯蔵 実施例２−　脳を髄液対照の調製 攪拌装置つきの清浄な容器を用意する。８００ｍｌの蒸留水を容器に入れる。混 合しつつ、次の化学物質を加える。：全ての化学物質が溶解した後、溶液の全量 を蒸留水でＩＡとする。全ての成分を分析し、上述の規格内に調整する。酸素の ガスボンベを２段式レギュレーターに連結する。ゴムチューブ又は同等のものを レギュレーターに及びバッチ製造容器に連結する。レギュレーターの第１段を開 く。溶液を通る気流が約０．　４３ＣＦＨ（平方立法フィート／時）となるまで 第２段を徐々に開く。攪拌しながら、該プールをこの仕方で室温にて曝気する。

曝気後、溶液のサンプルを採取し約６０倍に濃縮する。この濃縮サンプルを、次 いで、血清蛋白質電気泳動法により評価する。電気泳動のパターンがプレアルブ ミン領域の単一のピークを示さないならば、再曝気が必要である。

正常の電気泳動パターンが得られた後、０．２２μｍの膜を通して溶液を滅菌済 み容器中へ無菌濾過する。該無菌溶液を、次いで、３ｍｌずつ滅菌済みバイアル に充填する。

該脳を髄液対照を、診断用製品の安定性評価のためのプロトコールに従って、安 定性につき評価した。このプロトコールは、加速安定性試験のための指針を述べ ている。このプロトコールによれば、３７°Ｃにて１週間貯蔵される製品は２乃 至８°Ｃで１年間安定である。加速安定性試験は、製品の推奨される使用及び取 扱い条件に比して製品にストレスを加える貯蔵条件下での製品の性能特性を決定 するために使用した。該脳を髄液対照を、２５°Ｃにて３ケ月間及び３７°Ｃに て４週間貯蔵した後に分析した。これらの分析の結果は、該製品が安定であり、 従って、３年より長い予測貯蔵寿命を有することを示している。該製品を２乃至 ８°Ｃにて１年を超えてモニターした。表ＩＩＩを参照のこと。

表ＩＩＩ 脳を髄液対照の安定性 電気泳動： 電気泳動： 本脳を髄液対照はまた、開放バイアル安定性についても評価した。

バイアルは、２週間の開放後に試験した。開放バイアルの分析項目は、新たにサ ンプリングしたバイアルと比較して何らの変化も示さなかった。表【Ｖを参照の こと。

表１■ 開放バイアル安定性　レベルＩ 電気泳動： 開放バイアル安定性　レベルｒ【 電気泳動： 実施例３ 実施例２で調製した脳を髄液対照を数例の診断試験において使用した。これらの アッセイの結果を表Ｖに示す。

表Ｖ 方法比較 カリウム　ｍＭ　Ｎ０ＶＡ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　２．７　４．１表Ｖ（続き ） 電気泳動：　全体に対する％ 要約書 本発明は、生合成的脳を髄液対照及び使用方法に関する。加えて、この発明は、 該生合成的脳を髄液対照中の構成成分である安定な液状のヒトプレアルブミンの 単離及び精製に関する。

国際調査報告　。、□、１１．。９．。、４１、

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．　下記よりなる方法によって作られる、安定な液状の、ヒトに基づく脳脊髄 液対照： （ａ）正常ヒト脳脊髄液を模擬するために緩衝液中において十分量の乳酸、塩素 イオン、グルコース、血清、精製プレアルブミン、及びカリウムを組み合わせ、 （ｂ）ヒト脳脊髄液についての正常の電気泳動パターンを得るために前記濾液に 酸素を通気し、そして （ｃ）全ての微生物性汚染因子を除去するために前記濾液を濾過する。 ２．　約２乃至８℃にて貯蔵するとき約２４ヶ月までの安定性によって更に特徴 付けられる、請求項１に記載の対照。 ３．　約２乃至８℃にて貯蔵するとき約７日の開放バイアル安定性によって更に 特徴付けられる、請求項１に記載の対照。 ４．　請求項１に記載の対照を標本ヒト脳脊髄液の電気泳動パターンと比較する ことよりなる、ヒト脳脊髄液を評価するための電気泳動法。 ５．　下記よりなる方法によって作られる精製されたプレアルブミン： （ａ）第１の緩衝液でヒト血清を希釈し、（ｂ）前記希釈血清から、イオン交換 クロマトグラフーを用いてグロブリン、セルロプラスミン及びアルブミンを抽出 し、（ｃ）段階（ｂ）より溶出したプレアルブミン含有画分を免疫拡散法により 単離し、 （ｄ）段階（ｃ）のプレアルブミン含有面分をプールし、濃縮しそして第２の緩 衝液で緩衝液交換し、 （ｅ）段階（ｄ）の前記プレアルブミン含有プール面分から、アフィニティーク ロマトグラフィーによりアルブミンを除去し、（ｆ）段階（ｅ）から溶出したプ レアルブミンを含有面分を免疫拡散法によって単離し、 （ｇ）プレアルブミン濃度を高めるために、段階（ｆ）の前記プレアルブミン含 有面分をプールし、濃縮しそして第３の経費液で緩衝液交換し、 （ｈ）段階（ｇ）の前記ブールした面分からイオン交換クロマトグラフィーによ りグロブリンを除去し、 （ｉ）プレアルブミン濃度を高めるために、段階（ｈ）のプレアルブミン含有面 分をプールし、濃縮しそして第４の緩衝液で緩衝液交換し、 （ｊ）いかなる残序蛋白費をも除去するために、段階（ｉ）の前記プレアルブミ ン含有面分をゲル重過によって精製し、（ｋ）段階（ｊ）からの精製されたプレ アルブミン面分を単離し、そして （１）段階（ｋ）の前記精製されたブレアルブミン面分をブールし、濃縮しそし て無菌置過する。 ６．該アフィニティークロマトグラフィー媒体がＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅＤｙ ｅである、請求項５に記載の方法。 ７．段階（ｋ）の前記精製されたプレアルブミン面分を電気泳動法及び免疫拡散 法により単薩するものである、請求項５に記載の方法８．　該イオン交換媒体が 、ＤＥＡＥ　ＳｅｐｈａｃｅｌまたはＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）よりなる群より選ばれるものである、請求項５に記載の方法。 ９．　　該ゲル濾過媒体がＵＬＴＲＯＧＥＬ　ＡｃＡ　５４（ＩＢＦ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｉｃｓ）である、請求項５に記載の方法。