JPH05509228A - 内因的甘味強化トランスジェニック植物プロダクト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内因的甘味強化トランスジェニック植物プロダクト本出願は、１９９０年３月３ ０Ｂｉこ出願された米国特許出願第０７１５０２２５７号の一部継続出願である 。該一部継続出願は、共にｌ９８７年６月１９日に出願された第４３４１および 第０６４３４３号並びに１９８７年１１月４日に出願された１１７１２４号の一 部継続出願並びに１９９０年１月１８日に出願された第４６５５８５号の継続出 願である。

合衆国政府の支援 本発明は、国立衛生研究所より授与された登録番号ＧＭ３３８５６およびＮ５１ ５１７４並びに合衆国農業省により授与された登録番号ＣＲＣＲ−８７−１−２ ５２６に基づき政府の支援を受けて行われた。合衆国政府は、本発明に関して一 定の権利を有する。

産業上の利用分野 本発明は、食品製造に有用な植物の組み換え操作に関する。より明確には、モネ リン（ｍｏｎｅ　１１　ｉｎ）およびタウマチン（ｔｈａｕｍａｔ　ｉｎ）遺伝 子を含む、甘味蛋白質をコードする遺伝子の制御された発現を示すトランスジェ ニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物により生産された、強化甘味および風味を 有する果実、野菜および種子に関する。

発明の背景 ある種の蛋白質性複合物は、飲食物に甘味を付与するについて、非常に効果的に 砂糖と代替することができることは良く知られている。これらの例のうち最も簡 単なものはアスパルテームであり、これはジペプチド誘導体て、現在市場に出回 っている。しかし、より複雑な二つの複合蛋白質、モネリンおよびタウマチンが 植物から分離された。

タウマチンはタウマドコツカス・ダニエリ−（Ｔｈａｕｍａ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌｌｉｉ）（地面に三角形の果実を有する西アフリカ産の植物）から 分離された。この天然の蛋白質プロダクト、タウマチンは、サッカロースの甘味 の２５００倍の平均甘味をもち、商標名タリノ（Ｔａｌｉｎ）として市販されｓ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８５） ８２　；　１４０６−１４０９）により発表された。少なくとも５種の密接に関 連するタウマチンの形状（１，ＩＩ、ＩＩＬ　ｂおよびＣ）が同定された（Ｊ。

Ｄ、Ｈｉｇｇｉｎｂｏｔｈａｍ：甘味剤における進歩（Ｄｅｖｅ　１　ｏｐｍｅ ｎｔｓ　ｉｎ　Ｓｗｅｅｔｎｅｒｓ−１）、Ｃ，Ａ、Ｍ、ヒユー　（Ｃ，Ａ、Ｍ 、Ｈ。

ｕｇｈ）他層、Ａｐｐｌｉｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＰｕｂＪｉｃａｔｉｏｎｓ 。

ロンドン、１９７９年、８７−１２３ページ）。さらに、タウマチンＩＩ蛋白を コードする遺伝子がクローニングさね、そのシーケンスがエダンスら（Ｌ、Ｅｄ ａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ（１９８２）１８：１）により確定された。ま た、タウマチンは細菌（Ｌ、Ｅｄａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　（１９８２ ）１８：１）およこ正号（Ｌ、Ｅｄａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　（１９８ ４）３７：６２９：Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８ ８）２７：５１０１）を用いて組み換えにより産生された。

もう−ツノ蛋白質は、西７７リカの植物Ｄｉｏｓｃｏｒｅｏｐｈｙｌ　ｌｕｍｃ ｏｍｍｉｎｉｓｉｉである”セレンディビイティーベリー”　（”５ｅｒｅｎｄ ｉｐｉｔｙ　Ｂｅｒｒｉｅｓ″）から分離されている。モネリンのアミノ酸シー ケンスは既知であり、この蛋白の三次元構造はオガタら（Ｃ，Ｏｇａｔａｅｔａ ｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）３２８　：　７３９−７４２）により確定さ れた。

モネリンの特性は、モリスら（Ｍｏｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、（１９７３）２４８：５３４−５３９）および他の者（Ｃａｇａｎ、５ ｃｉｅｎｃｅ　（１９７３）１８１：３２−３５；Ｂｏｈａｋ　ａｎｄ　Ｌｉ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ（１９７６）４２７：１５３−１７ ０；Ｈｕｄｓｏｎ　ａｎｄ　Ｂｅｅｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　ＢｉｏｐｈｙｓＲ ｅｓ　Ｃｏｍｍ（１９７６）７１：２１２−２２０；Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｌａ ｎｄ　Ｌｏｅｖｅ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　（１９７３）２９：１８１−１８３； Ｆｒａｎｋ　ａｎｄ　Ｚｕｂｅｒ　Ｈｏｐｐｅｓ−３ｅｙｌｅｒ’　ｓ　ＺＰｈ ｙｓｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９７６）３５７：５８５−５９２；Ｍｏｒｉｓａｎｄ Ｃａｇａｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　（＋９７２）２６１ ：１１４−１２２）により調へられた。米国特許第３９９８７９８号は天然モネ リンの調製を開示する。

天然モネリンのＡおよびＢｌのアミノ酸シーケンスを図］に示した。これは二つ の鎖から成る蛋白で、一つはＡ鎖で４５アミノ酸残基を含み、他方はＢ鎖で５０ アミノ酸残基を含む。この蛋白の三次元構造（図２に示す）は、その活性のため に明らかに必須のものである。なぜなら、天然モネリンを中性ｐＨて９ｏ″Ｃに 加熱し、または酸性ｐＨて５０°Ｃに加熱しその後冷やしたとき、甘味は失われ るからである。５０アミノ酸を含むＢ鎖は、４５アミノ酸を含むＡ鎖と多くの鎖 体相互反応により密接に関連している。この蛋白の加熱により、明らかにこれら の鎖が適切な構造を再現することが不可能なように分離される。

本明細書中の親出願（ＰＣＴ出願Ｗ０８８／１０２６５．欧州特許出願ＥＰ３１ ８５８０およびＥＰ３２３４８９として現在公開されている）およびキムら（Ｓ 、Ｈ，Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９ ８９）２；５７１−５７５）は、単一蛋白の部分として適切な割合のＡおよびＢ 鎖を合成することにより、さらに単−鎖形のモネリンの組み替え体産生により、 該構造の明白な安定性を開示する。種々のアミノ酸シーケンスを、Ｂ鎖の４６番 目アミノ酸（イソロイシン）とＡ鎖の６番目アミノ酸（グリシン）との間のリン ケージ形成に用いることができる。これらの文献に開示されたように、生した単 一鎖モネリンのＡおよびＢ鎖部分の限定的修飾も包含されるかもしれない。

これらの修飾は、単一鎖シーケンス（これは市販の方法を用いて合成できる）を コードする遺伝子が利用できれば可能である。

モネリンおよびタウマチンは、ヒトの甘味リセブターに対して強い特異性をもつ 、したがって強度の甘味効果を生じる、現在知られている唯一の蛋白である。

タウマチンとモネリンのアミノ酸シーケンスの比較では、アミノ酸シーケンスに も、三次元骨組み構造にも明瞭な相同関係は示されなかった（Ｓ、−Ｈ，Ｋｉｍ もつ他の蛋白が存在するかもしれない。その三次元構造の限定された領域のみが 、これらの蛋白のヒト味覚リセブター特異性（３条１要であるということは大い に考えられる。

遺伝子組み換え法を用いるモネリンおよびタウマチンの実質的な量の遺伝子組み 換え体製造に加え、トランスジェニック植物の果実、種子または菜食部分として 食用物質を生産することにより、植物の食用部分を”天然（ご甘味が強化された 形で提供することができる。この場合、トランスジェニック植物は、タウマチン もしくはモネリン遺伝子または単一鎖モネリン遺伝子の発現系を導入することに より、その天然体が修飾されている。発現系における制御シーケンスの選択によ り、植物のとの組織で発現させるか、さらに発育のどの時期で発現させるかを定 めることができる。

発明の開示 本発明は、ここにいう食品のもとになる植物の発育中にタウマチンまたはモネリ ンを産生ずることにより、内因的に甘味が強化さ札風味が改良された植物性食品 を提供する。甘味が強化された、例えば果実は、その成熟過程で活性化されるプ ロモーターの制鼾に、タウマチンまたはモネリンをコードする遺伝子を置くこと により生産することができる。種子の場合は、タウマチンまたはモネリンの制御 系として、種子保存蛋白の制御系を用いることにより甘味を強化することができ る。植物の菜食部分では、構成プロモーターとして働くシーケンスの制御下にタ ウマチンまたはモネリン遺伝子を導入するか、または野菜特異的（ｖｅｇｅｔａ ｂｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プロモーターを用いることにより、甘味を強化する ことができる。したがって、糸質転換植物は、所望の部位を所望の時期に甘味が 増進するように制御できるよう修飾できる。

したがって−局面では、本発明は、植物組織での単一鎖モネリン（少なくともモ ネリンの二量体蛋白の二つの鎖の一方）またはタウマチンの産生を可能にする発 現系を教示する。これらの発現系は、植物適合性制御シーケンスに作動できるよ うに連結された、モネリンコードシーケンスまたはタウマチンコードシーケンス からを含む＠このうちで特に興味深いものは、果実成熟に関連する制御シーケン スである。

他の局面では、本発明は、上記の発現系で糸質転換された植物細胞、これらの細 胞から再生されたもしくはこれらの細胞を含む植物、これらの植物の食用部分お よびこれらから調製された食品を教示する。別の局面では、本発明は、甘味が増 進された果実、種子および野菜の生産方法を教示し、該方法は、本発明のトラン スジェニック植物の培養とそれに続く所望の食用部分の回収を含む。

図面の簡単な説明 図１は、天然モネリンのＡおよびＢ鎖アミノ酸シーケンスを示す。

図２は、天然モネリン蛋白の三次元骨組み構造を示す。

図３は、融合モネリン遺伝子のＤＮＡシーケンスおよびそれに対応するアミノ酸 シーケンスを示す。

図４は、図３に示したコード領域を含む、合成挿入配列の完全なシーケンスを示 す。

発明実施態様 「甘味蛋白」なる用語は、サッカロースの少なくとも５０倍の甘味を付与する蛋 白を指す。これは−次的な作用態様であるが、植物の食用部分の全体的な風味は 、一般に改良されるであろうことは理解できるところである。したがって、「強 化甘味Ｊ　（’ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ”）という語が使用され る場合、甘味の他に感知されるものを変化させる、風味についての明瞭な効果も 指すということは理解されよう。モネリンおよびタウマチンは現在知られている 唯一の甘味蛋白であるが、他のものが存在し同様に用いられるかもしれない。

本明細書で用いられる「モネリン」なる用語は、図１および２で表したよう゛な 実質的二量体蛋白の他、以下に定義するように単一鎖モネリンまたは融合モネリ ンを指す。「単一鎖モネリン」または「融合モネリン」なる用語を用いるのは便 利である。後者は、式Ｂ−Ｃ−Ａを育し、Ｂ鎖の１−４６残基のシーケンス（こ れは天然モネリンのサブユニットＩＩに一致する）と実質的に同等なペプチド部 分（Ｂ）が、共有結合により直接に、または１−１０個のアミノ酸残基から成る ペプチド残基から成る共有結合リンカ−（Ｃ）によってＣ末端を介して、天然モ ネリンのサブユニットＩに一致するＡ鎖の６−４５残基のシーケンスと実質的に 同等なペプチド（Ａ）のＮ末端と連結されている。「実質的に同等」とは、本発 明の複合物との関連において、サッカロースの甘味の少なくとも５０倍の甘味を 有する物質を生じ、さらにＢ鎖の１−４６残基により表されるペプチド、または Ａ鎖の６−４５残基により表されるペプチドと少なくとも３０−５０％相同性（ ホモロジー）、好ましくは８０％ホモロジーを有するペプチドを指す。少なくと も９０％ホモロジーが好ましく、特に保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　 ５ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）を含む。

同様なことが、本明細書て用いられるタウマチンの定義に適用される。上記の従 来の技術の項で述べたように、タウマチンＩＩをコードするＤＮＡおよびそれか ら推定されるアミノ酸シーケンスは既知であり、タウマチンの他の形態もタウマ チンＩＴと原則として相同である。本発明に有用なタウマチンは、これら天然に 生じるタウマチンの形と「実質的に同等」であり、ここで「実質的に同等」とは 、該ペプチドがサッカロースの甘味の少な（とも５０倍の甘味を有し、さらに天 然のタウマチン蛋白の少なくとも一つの形と少なくとも３．０−５０％ホモロジ ー、好ましくは８０％ホモロジー、最も好ましくは９０％ホモロジーを有し、特 に保存的置換を含む物質であることを意味する。

ホモロジーは、二つのシーケンスを最大適合が生じるように並へ該適合パーセン トを算定する、標準法により算定される。そこで、特に好ましい具体例では、本 発明の物質は、天然モネリンＡ鎖の６−４５残基により表される一次構造を有す るペプチドと、結合した（リンカ−を介して）天然モネリンＢ鎖の１−４６残基 のアミノ酸シーケンスを有するペプチドから成る。これらと実質的に同等な物質 には、天然のシーケンスの一つまたは二つ以上の残基が欠失し、置換さね、また は異なる一つもしくは複数のアミノ酸が挿入されているようなものが含まれる。

好ましい置換は、保存的なもの、すなわち、ｌ残基が同じ一般型の別のものによ って置き換えられているような場合である。天然に生じるアミノ酸は、酸性、中 性、塩基性および極性、または中性および非極性として下位分類することができ ることは、良く理解できよう。さらに、コードされるアミノ酸の三つは芳香族で ある。天然シーケンスと異なるペプチドは、置換されるアミノ酸のグループと同 しグループのものである置換物を含んでいるのが一般には好ましい。したがって 、一般には、塩基性アミノ酸のリジンとアルギニンは互いに変換でき、酸性アミ ノ酸のアスパルティックとグルタミックは互いに変換でき、中性極性アミノ酸の セリン、スレオニン、シスチジン、Ｇｌｎおよびアスパラギン酸は互いに変換で き、非極性鎖式酸のグリシン、アラニン、バリン、イソロイシンおよびロイシン は、互いに保存的で（ただサイズ故に、グリシンおよびアラニンはより密接な関 係にあり、バリン、イソロイシンおよびロイシンはより密接に関係する）、芳香 族アミノ酸のフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは互いに変換で きる。一方ブロリンは非極性中性アミノ酸であるが、構造上のその影響により問 題があるので、同じまたは同様な構造結果が得られる場合を除いて、プロリンに 変換することも、プロリンを他のものに変換することも好ましくない。保存的変 換を代表する極性アミノ酸には、セリン、スレオニン、Ｇｌｎ、アスパラギン酸 が、さらにその程度がより少ないものとしてメチオニンが含まれる。さらに、異 なるカテゴリーに分類されるが、アラニン、グリシンおよびセリンは、互いに変 換できるよって、シスチンはさらにこのグループにも適合し、または極性中性ア ミノ酸に分類することもてきる。異なる種類のアミノ酸によるいくつかの置換も また、甘味を修飾するのに有用である。

一般に、置換が行われるものばすへて、無傷の蛋白性分子の甘味および付随する 特性が保持さ札非毒性が実質的に損なわれないようなものである。

さらに、本発明の具体例の蛋白が、細胞内蛋白として組み換えにより製造される 場合は、Ｎ−末メチオニン残基は最終プロダクトにおいて保持しても良いことは 留意すべきであろう。天然のシーケンスを遊離させるためのこのＮ−末メチオニ ンの切断は、完全ても不完全ても良い。さらに、甘味ペプチドまたは蛋白は、付 加的な異種の上流または下流シーケンスとの融合蛋白として製造することもでき る。

モネリンの具体例に関して、Ｂ−Ｃ−Ａモネリン式におけるＣについては簡単に 共有結合または１−１０個のアミノ酸残基という。好ましい共有ペプチド結合シ ーケンスの一つは、 Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｙｓで、これは 、Ａ鎖（サブユニット■）の２−５番目のアミノ酸がその後に付いた、モネリン Ｂ鎖（サブユニットＴＨの４７−５００番目アミノ酸に一致する。Ａ鎖の１番目 のアミノ酸フェニルアラニンは天然蛋白の殆との種類で存在しない。

Ｃにより表されるペプチドは、少なくとも３０−５０％、好ましくは少なくとも およそ７５％の極性アミノ酸を含む。また好ましくは、少なくともおよそ２５％ 、より好ましくはおよそ５０％が、該サブユニットの対応する末端に天然に生し るアミノ酸である。

Ｃにより表されるペプチドの特に好ましいグループは、３−ＩＯ１好ましくは６ −８個のアミノ酸残基を含み、次の式の通りである：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４− Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−ＡＩ　Ｏここで、Ａｌ−Ａｌ０の各々はアミノ 酸残基であっても良く、また存在しなくても良いが、Ａｌ−Ａｌ０の少なくとも ３つはアミノ酸残基でなければならない。

特に好ましいグループの具体例では、Ａ５およびＡＩＯは存在せず、Ａ２、Ａ４ およびＡ６は酸性アミノ酸で、Ａ５およびＡ８は塩基性アミノ酸で、Ａ３は極性 ／中性アミノ酸で、ＡＩおよびＡ７は非極性アミノ酸である。

好ましい具体例の別の組み合わせては、Ａ９およびＡＩＯは存在せず、ＡＩはＡ ｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｙｓＳＡｒｇまたはＴｙｒで：Ａ２はＴｙｒ、Ａｌａ 、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、ＧｉｎＳＡｒｇ、ＴｈｒまたはＳｅｒで；Ａ３はＡ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＴｙｒで：Ａ４ はＰｈｅ、Ｔｒｐ、ＴｙｒＳＳｅｒ、ＴｈｒＳＡｓｐ、ＬｙｓまたはＡｒｇで： Ａ５はＡｓｐ、ＧｌｕＳＬｙｓ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＴｈｒで、Ａ６はＡｓｐ 、ＧｌｕＳＶａｌ、Ｉ　１　ｅ、Ｌｅｕ、ＬｙｓまたはＡｒｇで：Ａ７はＧｌｙ 、Ａｈａ、Ｖａｌ、ｌ１ｅＳＬｅｕ、ＬｙｓまたはＡｒｇで、八８はＬｙｓまた はＡｒｇである； ここで、これらのアミノ酸の少なくとも７５％は極性で、さらにＡｌ−Ａ３の一 つまたは二つ以上は存在しなくとも良い。好ましい具体例の別の組み合わせでは 、Ａ９およびＡＩＯは存在せず、残りのアミノ酸は次の具体例のように存在すＡ ＩはＴｙｒまたはＧｌｕで、Ａ２はＡｓｐＳＧｌｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓで。

Ａ３はＡｓｎ、ＴｈｒＳＡｌａまたは’ｌ’ｙｒ　；Ａ４はＡｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌ ｙｓまたはＧｌｕ；Ａ５はＧｌｕ、ＡｓｐまたはＴｈｒで：Ａ６はＬｙｓＳＡｓ ｐまたはＡｒｇで、Ａ７はＧｌｙ、ｌｉｅまたはＬｅｕで、Ａ８はＬｙｓまたは Ａｒｇである： ここで、残基の少なくとも７５％は極性で、Ａｔ−Ａ３の一つまたは二つ以上は 存在しなくとも良い。

特に好ましい具体例では、Ａ９およびＡＩＯは存在せず、ＡＩはＴｙｒまたはＰ ｈｅて、Ａ２はＧｌｕまたはＡｓｐで、Ａ３はＡｓｎまたはＧｉｎで、Ａ４はＧ ｌｕまたはＡｓｐ、Ａ５はＡｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓで、八６はＧｌｕまたは Ａｓｐで、Ａ７はＩｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕで、八８はＡｒｇＳＬｙｓまたは Ｈｉｓである。特に好ましいものは次の架橋：Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ −Ｇｌｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｙｓ　：Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｃ１ ｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｙｓ　；Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔ　１ｅ− Ｌｙｓ　：Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｌｙｓ　；Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−１１ ｅ−Ｌｙｓ　；Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌ ｙｓ　；Ｔｙｒ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　；Ｔｙｒ　−Ａｌａ−３ｅ ｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ　；Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　；Ｇｌｕ− Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；およびＧｌｕ−Ａ ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇである。

普通、該鎖には、少なくとも一つのＴｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＬｙｓまたはＡｒ ｇが存在し、より普通には、少なくとも一つのＧｌｕ、Ａｓｐ％ＬｙｓまたはＡ ｒｇが存在する。ブリッジとして好ましいアミノ酸は、Ｔｙｒ、Ｉ　ｌｅ、Ｓｅ ｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＡｓｎおよびＧｉｎてあり、こ の場合、ブリッジのアミノ酸の５０％以上がこのグループから選ばれるものであ る。

本発明に従えば、独立したプロダクトとして甘味蛋白を提供する代わりに、モネ リンまたはタウマチンのコードシーケンスが、天然の植物性甘味プロダクトを産 生させるために、トランスジェニック植物を得る目的で用いられる高等植物に適 合した、特定の発現制御ＤＮＡシーケンスに挿入される。（モネリンを二量体の 形で提供する場合には、両方の鎖の発現系で植物をトランスフオームさせなけれ ばならない。各鎖のための系は別々のベクターに入れても良いし、または二つの 系を単一のベクターに入れても良い。）　本来の効果は甘味効果であるが、これ は全体的な風味に影響を与え、一般的な味覚を改良することは理解されるところ である。これらの具体例では、本質的な機能を有するか、または植物の特定の組 織で機能する制御領域が用いられる。転写開始領域には、例えば種々のすパイン 開始領域（例えばオクトピン、マンノピン、ツバリンなと）が含まれる。植物ウ ィルスプロモーターも用いることができる。例えば、カリフラワーモザイクウィ ルスの３５ＳブＣモーターである。さらに、植物プロモーター、例えばリブロー ス−１，３−ジホスフェートカルボキシラーゼ、果実特異的プロモーター、熱シ ヨツクプロモーター、種子特異的プロモーターなども用いることができる。この 発現系で基質転換された植物は、天然の甘味を有する果実、野菜および種子を産 生ずる。

大量の適切な制釦系が利用できる。例えば、カリフラワーモザイクウィルス（Ｃ ａＭＶ）３５Ｓプロモーターは、タバコやペチュニアを含むトランスジェニック 植物の染色体に組み込まれるとき、多くの植物器官および様々な成長段階で高い 活性を有することが示さ托さらに、双子葉類および単子葉類の両方のプロトプラ ストで発現を起こすことが示された。

ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、食用部分を有する少なくとも以下の単子葉類お よび双子葉類で活性があることが示された：−クロイチゴ、Ｒｕｂｕｓ　；クロ イチゴ／キイチゴ雑種、Ｒｕｂｕｓ、および赤キイチゴ（Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ（１９９０）２０：３５）ニーニンジン、Ｄａｕｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ　 （Ｔｈｏｍａｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（＋ ９８９）８：３５４．ＷｕｒｔｅｌｅＢｕｌｋａ、Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ 　（１９８）６１：２５３ニートウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ ｃｉｅｎｃｅ　（＋９８８）２４０：２０４）； 一馬鈴薯Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（＋９８９）８：３２５）ニーコメ、 ０ｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ 　（＋９８９）３３８　：２７４）：　−イチゴ、Ｆｒａｇａｒｉａ　ｘａｎａ ｎａｓｓａ（Ｎｅｈｒａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔ ｓ　（１９９０）９　：　１０）；−トマト、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓ ｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｓｈｅｅｈｙｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　 Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８８）８５：８８０５；Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａ ｔｕｒｅ（１９８８）３４ニア２４）。　ノパリンシンセターザ（Ｎｏｓ）プロ モーターは、食用部分を有する少なくとも以下の単子葉類および双子葉類植物で 活性を有することが示された・−リンゴ、Ｍａｌｕｓ　ｐｕｍｉｌａ（Ｊａｍｅ ｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ぐ１９８９）７： ６５８）　；−カリフラワー、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　（Ｓｒｉ ｖａｓｔａｖａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１ ９８８）７：５０４）。

−セロリ、Ａｐｉｕｍ　ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ（Ｃａｔｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８８）７：ｌ００）ニーキュウ リ、Ｃｕｃｕｍｊｓ　５ａｔｊｖｕｓ　（Ｔｒｕｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８６）７３：１１）；−ナス、Ｓ ｏｌａｎｕｍ　ｍｅｌｏｎｇｅｎａ　（Ｇｕｒｉおよび　５ｉｎｋ。

Ｊ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　（１９８８）＋３３：５２）；−レタス、Ｌ ａｃｔｕｃａ　５ａｔｉｖａ　（Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａ ｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（＋９８７）６：４３９）；−馬鈴薯、Ｓｏ ｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｌａｎｔ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８９）８：３２５）；−ライムギ、５ｅｃａｌ ｅ　ｃｅｒｅａｌｅ　（ｄｅ　ｌａ　Ｐｅｎａ　ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　（ ＋９８７）３２５　：２７４）；−イチゴ、Ｆｒａｇａｒｉａ　ｘ　ａｎａｎａ ｓｓａ　（Ｎｅｈｒａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ 　（１９９０）９：１０）；−トマト、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌ ｅｎｔｕｍ（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ ｐｏｒｔｓ（１９８６）５：８１）； 一りルミ、Ｊｕｇｌａｎｓ　ｒｅｇｉａ（ＭｃＧｒａｎａｈａｎ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ］Ｉ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９０）８：５１２）。

器官特異的プロモーターも既知である。例えばＥ８プロモーターは、トマトの果 実の成熟中にのみ転写が活性化さ托　トマトの実の成熟時に焦点を合わせた遺伝 子発現に用いることができる（ＤｅｉｋｉｍａｎおよびＦｉｓｃｈｅｒ、ＥＭＢ ＯＪ（１９８８）７：３３１５；Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ 　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ＋　（１９８９）１：５３）　Ｅ８プロモーターの活性は トマトの果実に限定されず、エチレンが生物学的プロセスを活性化させる、いず れの系にも適合すると考えられる。

所望の標的器官にとり適切な他の器官特異的プロモーターは、既知の手順を用い て分離することができる。これらの制御シーケンスは、所望の器官においてのみ 発現する遺伝子に一般に付随している。輿望的な高等植物では、各器官は、他の 器官系には存在しない数千のｍＲＮＡを含んている（Ｐｈｉｌ　Ｇｏｌｄｂｅｒ ｇにより概括、Ｔｒａｎｓ　ＲＳｏｃ　Ｌｏｎｄｏｎ　（１９８６）ＢａＩ２： ３４３）。

まず、これらのｍＲＮＡは、付随する天然の制御シーケンスが存在する適切な染 色体シーケンスの検索のための適切なプローブを得るために分離される。アボカ ドの果実に特異的なｍＲＮＡに関連するｃＤＮＡを得るための手技の使用例は、 クリストファーセンらの文献に見いだされる（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎｅ ｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８４）３ ：３８５）。簡単に記せば、ｍＲＮＡをアボカドの成熟果実から分離し、ｃＤＮ Ａライブラリーの作成に用いた。アボカドの未成熟果実から分離した標識ＲＮＡ とはハイブリダイズしないが、アボカドの成熟果実から分離した標識ＲＮＡとは ハイブリダイズする、該ライブラリーのクローンを同定した。これらのクローン の多くは、アボカドの果実の成熟開始時に転写が活性化される遺伝子によりコー ドされるｍＲＮＡを表している。

もう少し複雑な手順は、″細胞の分子生物学”　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ。

１ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ、第２版（１９８９）２６１−２６２ページ 、Ａｌｂｅｒｔｓら編、Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇｌｎｃｏｒｐｏ ｒａ　ｔ　ｅ　ｄ、ニューヨーク）に記載された。この手順では、器官特異的核 酸シーケンスに富むｍＲＮＡが、ｃＤＮＡライブラリーを構築するために用いら れた。この方法は、またリンカーンら（Ｌｉｎｃｏｌｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏ ｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（１９８７）８４：２７９３）によリドマドに も用いられ〜それにより、本明ｌ中に示したＥ８プロモーターの分離に用いるＥ ８ｃＤＮＡクローンを作成した。

それから器官特異的ｍＲＮＡをコードする遺伝子を、該植物の染色体ＤＮＡシー ケンスのライブラリー構築することにより分離する。該染色体ライブラリーを器 官特異的ｃＤＮＡクローンでスクリーニングし、そのシーケンスを確定する。

それから該プロモーターを分離する。これらの手順は今や日常的なものと考えら へサンプルーフらにより詳細に記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ 、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ、第２版（１９８９）コールドスプリングハーバ−研究所出版局、コール ドスプリングハーバ−）。

その後、構成プロモーター（例えば上記に例示したＣａＭＶまたはＮｏｓプロモ ーター）または所望の器官特異的プロモーター（例えばトマトのＥ８プロモータ ーまたは上記のように器官特異的ｃＤＮＡを用いて分離される他の特異的プロモ ーター）のいずれかを、単一鎖モネリンまたはタウマチンをコードする遺伝子に 、今や当業界で通常となっている標準的手技を用いて結び付ける。この発現系は さらに、補助的要素、例えば転写終結因子および／または増強エレメントを用い ることにより適正化される。

したがって、植物での発現のためには、組み換え発現カセットは、モネリンコー ドシーケンスに加え、植物プロモーター領域、転写開始部位（転写されるものが モネリンコードシーケンスの場合は同部位は無い）および転写終結シーケンスを 含むことになろう。元のベクターへの挿入を容易にするために、いつものように カセットの５′および３゛末端に制限酵素特異的部位が含まれる。真核細胞遺伝 子発現を制御するシーケンスが広範囲に研究された。プロモーターシーケンスエ レメントは、ＴＡＴＡボックスに一致するシーケンス（ＴＡＴＡＡＴ）を含むが 、これは、転写開始部位より通常２０から３０塩基対（ｂ　ｐ）上流に存在する 。

殆どの場合、ＴＡＴＡボックスは正確な転写開始のために必要である。申し合わ せにより、該開始部位は＋１と呼ばれる。５′方向に伸びる（上流）シーケンス には、マイナスの数字が与えられ、３′方向に伸びる（下流）シーケンスはプラ スの数字が与えられる。

植物では、ＴＡＴＡボックスからさらに上流、−８０から−１００の位置に、ア デニンか取り囲む一連のトリヌクレオチドＧ（またはＴ）ＮＧをもつプロモータ ーエレメントが、典型的には存在する（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、・植 物の遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ ｓ、Ｋｏｓａｇｅ、Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、Ｈｏｌ　Ｉａｅｎｄｅｒ編、（１９８３ ）２２１−２２７ページ）。組織特異性、環境信号に対する反応性または転写の 最大効率性を付与する他のシーケンスもまた、プロモーター領域に見いだされる 。そのようなシーケンスは、しばしば、転写開始部位から４００ｂｌ）以内で認 められるが、２０００ｂｐまたはそれ以上離れていることもある。

異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせを構築する場合、プロモーターは、 好ましくは異種の転写開始部位から、天然の状態の転写開始部位の場合とおよそ 同じ距離に位置する。しかし当業界で知られているように、この距離は、プロモ ーター機能を損なうことなくある程度の変化が許容される。

上記に述へたように、植物細胞において転写を指示するプロモーター数はいくっ ても適切である。プロモーターは、構造性でも誘発性でもいずれても良い。細菌 起源のプロモーターには、オクトピンシンセターゼプロモーター、ノパリンンン セターゼプロモーターおよび天然のＴｉプラスミツドに由来する他のプロモータ ーが含まれる（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒ ｅ　（１９８３）３０３：２０９−２１３）。

ウィルス性プロモーターには、カリフラワーモザイクウィルスの３５３および＋ ９ｓＲＮＡプロモーターが含まれる（ＯＤｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ 　（１９８５）３１３：８１０−８１２）。植物プロモーターには、リブロース −１，３−ジスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットプロモーターお よびファセオリンプロモーターが含まれる。発現がエチレンにより誘発される、 Ｅ８遺伝子および他の遺伝子のプロモーターシーケンスも用いることができる。

Ｅ８プロモーターの分離およびそのシーケンスは、本明細書に文献として引用さ れている、ＥＭＢＯＪに詳細に記載されている（ＤｅｉｋｍａｎおよびＦｉｓｃ ｈｅｒ、ＥＭＢＯＪ　（１９８８）７：３３１５−３３２０）。

プロモーターシーケンスに加え、発現カセットは、効果的な終結のために、構造 遺伝子の下流に転写終結領域も含まなければならない。終結領域は同じ遺伝子か らプロモーターシーケンスとして得ることができるし、また異なる遺伝子から得 ることもてきる。構造遺伝子によってコードされるｍＲＮＡが効率的に処理され る場合には、該ＲＮＡのポリアデニル化を指令するＤＮＡシーケンスも、通常ベ クター構造物に付加される（Ａ　Ｉ　ｂ　ｅ　ｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｍｏ ｌ　ａｎｄ　ＡｐｐＩ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８２）１：４１９−４３４）、ポリ アデニル化は、植物細胞でのタウマチンまたはモネリンコードＲＮＡの発現に重 要である。

ポリアデニル化シーケンスには、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのオクトビンシン セターゼシグナル（Ｇｉｅｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ（１９８４）３： ８３５−８４６）またはツバリンシンセターゼシグナル（Ｄｅｐｉｃｋｅｒｅｔ 　ａｌ、、Ｍｏｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８２）１：５６１− ５７３）が含まれる。

得られる発現系またはカセットは、高等植物の形質転換に適した組み換えベクタ ーに組み込まれるように連結さ托または別な方法で構築される。典型的には、ベ クターはまた、形質転換された植物細胞を培養で識別させる選択マーカーも含む 。通常、マーカー遺伝子は抗生物質耐性をコードするであろう。これらのマーカ ーには、Ｇ４１８．　ヒグロマイシン、プレオマイシン、カナマイシンおよびジ エンタマイシン耐性か含まれる。植物細胞の形質転換後、ベクターを有する細胞 は、特定の抗生物質を含む培地中での増殖能力により識別Ｉされる。ベクターを 細菌またはファージ宿主でクローニングすることができるように、細菌またはウ ィルス起源の複製シーケンスも一般に含まれるが、広い宿主域の原核細胞起源の 複製シーケンスが好ましい。細菌用選択マーカーも、所望の構築物を含む細菌細 胞を選択できるように含まれるへきである。適切な原核細胞選択マーカーにも、 またカナマイシンやテトラサイクリンのような抗生物質耐性が含まれる。

当業界て知られているように、ベクターは、付加的な機能をコードする他のＤＮ Ａシーケンスもまた含むことができる。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の形質転換の場合には、その後の植物染色体への伝達のた めに、Ｔ−ＤＮＡシーケンスも含まれることになるだろう。

さらに、当業界で既知の手技を用いて、甘味蛋白をコードするシーケンスと興味 のある他の分子をコードするシーケンスとの間でフレーム丙連結（ｉｎ−ｆｒａ ｍｅ　ｌ　ｉｇａｔ　１ｏｎ）を行ったベクターも構築することができる。これ により融合蛋白が生じる。

適切なベクターが得られたとき、所望の発現系を含むトランスジェニック植物を 調製することができる。植物または植物細胞を形質転換するために、多くの技術 が利用できる。一般に植物のいずれのタイプも「直接的」形質転換に付すことが できるが、双子葉類だけは、アグロバクテリウム仲介感染を用いて形質転換する ことができる。

直接形質転換の１形態では、組み換えＤＮＡを機械的に移すために、マイクロピ ペットを用いて植物細胞に直接ベクターがマイクロインジェクトされる（Ｃｒｏ ｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９８５）　２０２　二　 １７９−１８５）。別の形態では、遺伝物質はポリエチレングリコールを用いて 植物細胞に移されるか（Ｋｒｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ（２９８２） ２９６　：　７２−７４）　、または小ビーズもしくは粒子の基質内もしくは表 面上のいずれかに核酸を含む小粒子による高速射出貫通（ｈｉｇｈ　ｖｅｌｏｃ ｉｔｙ　ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）が用いられる（Ｋｌｅ ｉｎ　ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）３２７　ニア０−７３）、また 別の方法でハ、プロトプラストを、導入したいＤＮＡを含む他の物質と融合させ る。この物質は、ミニ細胞、細胞、リソソームまたは他の融合可能脂質被覆体で ある（Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　 ＵＳＡ（１９８２）７９　：１８５９−１８６３）。　ＤＮＡはエレクトロポレ ーションによっても植物細胞に導入できる（Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏ ｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８５）８２：５８２４）、この技 術では、植物プロトプラストに、発現カセットを含むＤＮＡの存在下で高電圧を かける。強い界磁強度の電流刺激は生物膜の透過性を可逆的に高め、プラスミド の導入を許す。高圧電流をかけられた細胞は、細胞壁をリフォームし、分裂して 再生する。

細菌感染により仲介される形質転換では、植物細胞を、前板て導入すべきＤＮＡ で形質転換した種類がん腫病菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓ）または毛根病菌（Ａ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）に感染させる。アグロ バクテリウムは、グラム陰性Ｒｈ１ｚｏｂｉａｃｅａｅ科の代表的な属である。

その種はクラウンゴール（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）および毛根病（Ａ、ｒ ｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の原因となる。クラウンゴール腫および毛状根の植物細胞 は、オパインとして知られるアミノ酸誘導体（これは該細菌によってのみ代謝さ れる）を導入されている。オパインの発現に関与する該細菌遺伝子は、キメラ発 現カセットのための制御エレメントの便利な提供先である。さらに、オパインの 存在を調べるアソセーを、形質転換細胞の識別に用いることができる。

異種遺伝子シーケンスは、種類がん腫病菌のＴｉプラスミドまたは毛根病菌のＲ ｉプラスミドを用いて、適切な植物細胞に導入することができる。ＴｉまたはＲ ｉプラスミドはアグロバクテリウムの感染により植物細胞に伝達さ托植物染色体 に安定的に組み込まれる（Ｊ、５ｃｈｅｌｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　（＋９８７）２ ３７：１１７６−１１８３）。ＴｉおよびＲｉプラスミドは、形質転換細胞の産 生のために必須の二つの領域を含んでいる。その一つは伝達ＤＮＡ（ｔｒａｎｓ ｆｅｒｒｅｄ　ＤＮＡ、Ｔ−ＤＮＡ）と名付けられるもので、植物細胞の核に伝 達さ札腫瘍または根の形成を誘発する。他のものは（ビルレンス（ｖ　ｉ　ｒ） 領域と名付けられる）　、Ｔ−ＤＮＡの伝達に必須であるが、それ自体は伝達さ れない。Ｔ−ＤＮＡは、ｖｉｒ領域が異なるプラスミド上に存在する場合でも、 植物細胞に伝達されるであろう（Ｈｏｅｋｅｍａ　ｅｔ　ａ　Ｉ５．Ｎａｔｕｒ ｅ（１９８３）３０３　：１７９−１８９）。伝達ＤＮＡ領域は、異種ＤＮＡを 挿入することにより、その伝達される能力に影響を及ぼされることなくサイズを 大きくすることができる。したがって、修飾ＴｉまたはＲｉプラスミドは、病気 を発生させる遺伝子を欠失させた形で、本発明の遺伝子構成物を適切な植物細胞 に伝達させるベクターとして用いることができる。

組み換えＴｉおよびＲｉプラスミドの構築は、一般に、より普遍的な細菌ベクタ ー、例えばｐＢＲ３２２で用いられる典型的な方法に従う。ある場合には天然の プラスミドと共に見いださね、ある場合には外来シーケンスから構築される付帯 的な遺伝子エレメントもまた使用することができる。これらには、シャトルベク ター（ＲｕｖｋｕｍおよびＡｕ５ｕｂｅ１．Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）２９８ ：８５−８８）、選択因子としての抗生物質耐性のためのプロモーター（Ｌａｗ ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８７）９：３１ ５−３２４）および構造遺伝子（Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａ ｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（１９８３）８０：４８０３−４８０７）含まれるが 、これらに制限されるものではない。

現在使用されている組み換えＴｉおよびＲｉプラスミドベクター系には二つのク ラスがある。２クラスの内の一つ（”コインテグレート”　（複合組み込み）と 呼ばれる）では、興味のある遺伝子を含むシャトルベクターは遺伝的組み換えに より、植物形質転換に必要なシス−アクティングおよびトランス−アクティング エレメント、例えばデブロックらのｐＭＬＪＩシャトルベクター（ＤｅＢｌｏｃ ｋ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ（１９８４）３：１６８１−１６８９）およびザ ンブリスキーらの記載した非腫瘍性ＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０　（Ｚａｍｂ ｒｙｓｋｊ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ（＋９８３）２：２＋４３−２１５０） におけるように両方を含む非腫瘍性Ｔｉプラスミドに挿入される。第二のクラス （バイナリ−系）では、興味のある遺伝子は、植物形質転換に必要なシス−アク ティングエレメントを含むシャトルベクターに挿入される。その他の必要な機能 は、ビーパンにより記載されたｐＢＩＮ１９シャトルベクター（Ｂｅｖａｎ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１９８４）１２：８７１１− ８７２１）およびヘクマらにより記載された非腫瘍性Ｔ１プラスミドＰＡＬ４４ ０４（Ｈｏｅｋｍａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０３：１７９ −１８０）により例証されたように、非腫瘍性Ｔｉプラスミドにより離れた位置 から（ｉｎ　ｔｒａｎｓ）提供される。これらのベクターのいくつかは市販され ている。

アグロバクテリウムで植物細胞を形質転換するためには一般的な二つの方法があ る一培養し分離したプロトプラストとアグロバクテリウムと←緒の培養するか、 または無傷の細胞もしくは組織をアグロバクテリウムで形質転換する。最初のも のでは、プロトプラスト培養し、さらに培養プロトプラストからその後の植物の 再生を可能にする樹立培養系が必要となる。第二の方法では、（ａ）無傷の植物 組織、例えば子葉をアグロバクテリウムで形質転換し、（ｂ）この形質転換細胞 または組織を完全植物体に再生させるべく誘発することができる。

自然条件でアグロバクテリウムの植物宿主であるすべての種は、試験管内で（ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ）形質転換できるので、はとんどの双子葉種はアグロバクテリウ ムで形質転換することができる。　単子葉植物、特に穀類はアグロバクテリウム の天然の宿主ではない。アグロバクテリウムを用いてそれらを形質転換する試み は、最近まで成功しなかった（Ｈｏｏｙｋａｓ−Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ（＋９８４）３１１ニア６３−７６４）。しかし、 今やある種の単子葉類がアグロバクテリウムで形質転換できるという証拠ができ つつある。新規な実験的アプローチを用いて、今や穀ｍｆ！、例えばライ麦（ｄ ｅ　Ｉａ　Ｐｅｎａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５：２７４ −２７６）、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ（１ ９８８）２４０：２０４−２０７）およびコメ（Ｓｈ　ｉｍａｍｏ　ｔ　ｏ　ｅ 　ｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８９）３３８：２７４−２７６）形質転換で きるかもしれない。

形質転換細胞または植物の識別は、−（躊こは選択マーカーを形質転換用ベクタ ーに含ませることにより、または細菌か感染した証拠を得ることにより行われる 。

形質転換された植物細胞は、また既知の手技を用いて再生することができる。

培養プロトプラストからのＭ物再生はエバンスら（Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、。

植物細胞培養ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＣ ｕｌｔｕｒｅ）、１巻：ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ。

ニューヨーク、１９８３年）およびバーシル（ｆ、　Ｒ，Ｖａｓ　ｉ　Ｉ４！、 　Ｍ物の細胞培養および体細胞遺伝（Ｃｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｏ ｍａｔｉｃＣｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ）、アカデミツク プレス、オーランド、１巻（１９８４）および２巻（１９８６））により記載さ れている。

実際には、サトウキビ、サトウダイコン、綿花、果樹およびマメの主な種のすべ てを含む（これらに限られないが）培養細胞または組織から再生することができ る。

再生方法は植物の種により異なるが、一般には、まず形質転換プロトプラストの 懸濁液または形質転換細胞片を含むペトリ皿を用意する。カルス組織が形成さね 、カルスから新芽を誘導し、続いて根を誘導する。また別に、体細胞胚形成をカ ルス組織で誘発する。これらの体細胞胚は、天然の胚芽のように生長し、植物を 形成する。培地は一般に種々のアミノ酸および植物ホルモン、例えばオーキシン およびサイトキニンを含むであろう。また、培地にグルタミン酸およびプロリン を加えることが、特にトウモロコシおよびアルファルファのような種には有利で ある。再生の効率の良さは、培地、遺伝子型および培養層により左右される。

これら３項目が制御されるならば、再生は通常再現性があり、反復可能である。

多数の植物が、個々の形質転換細胞から、トランスジェニックな完全植物体を得 るために再生することができることが示され？、例えば双子葉類については以下 のように、再生が示された。

一リンゴ、Ｍａｌｕｓ　ｐｕｍｉｌａ（Ｊａｍｅｓ　ｅｔ　ａｔ、、Ｐｌａｎｔ 　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８９）７：６５８）：−クロイチゴ、Ｒｕ ｂｕｓ　クロイチゴ／キイチゴ雑種、Ｒｕｂｕｓ　アカキイチゴ、Ｒｕｂｕｓ　 （Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ 　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ（１９９０）２０：３５）；−ニンジン、Ｄａｕ ｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ（Ｔｈｏｍａｓ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＩａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　 Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８９）８：３５４；Ｗｕｒｔｅｌｅａｎｄ　Ｂｕｌｋａ、 Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８９）６１：２５３）ニ ーカリフラワー、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　（Ｓｔｒｉｖａｓｔａ ｖａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８８）７： ５０４）。

一セロリ、Ａｐｉｕｍ　ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ　（Ｃａｔｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ、 。

Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８８）７：１００）；−キュー リ、Ｃｕｃｕｍｉｓ　５ａｔｉｖｕｓ　（Ｔｒｕｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８６）７３：１１）；−ナス、Ｓ ｏｌａｎｕｍ　ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（Ｇｕｒｉ　ａｎｄ　５ｉｎｋ。

Ｊ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　（１９８８）＋３３：５２）；−レタス、Ｌ ａｃｔｕｃａ　ｓａｔｉｖａ（Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎ ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８７）６：４３９）；−馬鈴薯、Ｓｏｌ ａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（Ｓｈｅｅｒｍａｎ　ａｎｄＢｅｖａｎ、Ｐｌａ ｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（＋９８８）７：１３）： 一セイヨーアブラナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　（Ｒａｄｋｅ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８８）７５：６８５；Ｍｏｌ 。

ｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎ、ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８９） ８：２３８）： 一ダイズ（野生種）、Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｃａｎｅｓｃｅｎｓ　（Ｒｅｃｈ　ｅｔ ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８９）８：３３）；− イチゴ、Ｆｒａｇａｒｉａ　ｘ　ａｎａｎａｓｓａ（Ｎｅｈｒａ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９９０）９：１０）；−トマト 、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８６）５：８１）； 一りルミ、Ｊｕｇｌａｎｓ　ｒｅｇｉａ　（ＭｃＧｒａｎａｈａｎ　ｅｔ　ａｌ 。

、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９９０）８：５１２）；−メロ ン、Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ　（Ｆａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、第８６回園芸科学 学会年次総会、Ｈｏｒｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）２４：８９）；−ブド ウ、Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ　（Ｃｏｌｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、植物遺伝子 伝達シンポジウム、分子および細胞生物学に関するＵＣＬＡシンポジア、Ｊ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　５ｕｐｐｌ　（１９８９）１３Ｄ：２５５）；−マン ゴウ、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ　１ｎｄｉｃａ　（Ｍａｔｈｅｗｓ　ｅｔ　ａｌｏ、 植物遺伝子伝達シンポジウム、分子および細胞生物学に関するＵＣＬＡシンボジ ア、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　５ｕｐｐｌ　（１９８９）１３Ｄ：２６４ ）：さらに以下の単子葉類について再生が示されたニーコメ、０ｒｙｚａ　ｓａ ｔｉｖａ（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８９）３ ３８：２７４）：　−ライムギ、５ｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ（ｄｅ　Ｉａ　 Ｐｅｎａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５：２７４）ニ ートウモロコシ、（Ｒｈｏｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８８） ２４０・２０４）。

さらに、細胞（必ずしも形質転換されていない）から完全な植物体か以下のもの で再生された ーアンズ、Ｐｒｕｎｕｓ　ａｒｍｅｎｉａｃａ　（Ｐｉｅｔｅｒｓｅ、Ｐｌａｎ ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ（＋９８９ ）１９　：１７５）ニ ーアスパラガス、Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　（Ｅｌｍｅｒ ｅｔ　ａｌ、、Ｊ　Ａｍｅｒ　Ｓｏｃ　Ｈｏｒｔ　Ｓｃｉ　（＋９８９）１１４ ：１０１９）ニ ーバナナ、雑種Ｍｕｓａ　（ＥｓｃａｌａｎｔおよびＴｅ１ｓｓｏｎ、Ｐｌａｎ ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８９）７：６６５）；−マメ、Ｐｈａｓ ｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　（ＭｃＣＩｅａｎおよびＧｒａｆｔｏｎ、Ｐｌ ａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）６０：］１７）；−サクランボ、雑種Ｐ ｒｕｎｕｓ　（Ｏｃｈａｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒ ｔｓ　（＋９８８）７：３９３）；−ブドウ、Ｖｉｔｉｓ　ｖｊｎｉｆｅｒａ　 （ＭａｔｓｕｔａおよびＨｉｒａｂａｙａｓｈｉ、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ ｐｏｒｔｓ　（１９８９）７：６８４）ニ ーマンゴウ、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ　１ｎｄｉｃａ（ＤｅＷａｌｄ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｊ　Ａｍｅｒ　Ｓｏｃ　Ｈｏｒｔ　Ｓｃｉ　（１９８９）１１４ニア１２）； −メロン、Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ（Ｍｏｒｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎ ｔ　Ｓｃｉ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８５）３４：１９５）；−Ａｂｅｌｍｏｓｃ ｈｕｓ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ　（ＲｏｙおよびＭａｎｇａｔ、Ｐｌａｎｔ　５ ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）６０ニア７；Ｄｉｒｋｓおよび■ａｎ　Ｂｕｇｇｅ ｎｕｍ、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（＋９８９）７・６２６）； 一タマネギ、雑種ＡｌｌｉＡｌ１１ｕ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲ ｅｐｏｒｔｓ　（１９８９）７：６９６）；−オレンジ、Ｃ１ｔｒｕｓ　５ｉｎ ｅｎｓｉｓ　（Ｈｉｄａｋａ及びＫａｊｉｋｕｒａ、５ｃｉｅｎｔｉａ　Ｈｏｒ ｉｃｕｌｔｕｒａｅ　（＋９８８）３４　：８５）。

−パパイヤ、Ｃａｒｒｉｃａ　ｐａｐａｙａ（ＬｉｔｚおよびＣｏｎｏｖｅｒ。

Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８２）２６：１５３）；−モモ、Ｐ ｒｕｎｎｕｓ　ｐｅｒｓｉｃａおよびプラム、Ｐｒｕｎｕｓ　ｄ。

ｍｅｓｔｉｃａ（Ｍａｎｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓ ｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８９）＋９：１）；−ナシ、 Ｐｙｒｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ　（Ｃｈｅｖｒｅａｕ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（＋９８８）７：６８８：０ｃｈａｔ ｔ及びＰｏｗｅｒ、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ°　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８９）７ ：５８７）； 一パイナツプル、Ａｎａｎａｓ　ｃｏｍｏｓｕｓ　（ＤｅＷａｌｄ　ｅｔ　ａｌ 。

、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８８）７：５３５）；−スイ カ、Ｃ１ｔｒｕｌｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａｅｔ　ａ ｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８９）８：３００）： 一コムギ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ（Ｒｅｃ！ｗａｙ　ｅｔ　ａｌ 。

、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９０）８ニア１４）。

再生植物は、通常の土壌環境に移さ托慣用的方法で育成させる。

以下の植物細胞は外来ＤＮＡで遺伝的に形質転換されたが、これらの報告では再 生については記載されていないニ ーブドウ、Ｖｉｔｕｓ　ｖｅｎｊｆｅｒａ　（Ｂａｒｉｂａｕｌｔ　ｅｔ　ａｌ 。

、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８９）８：１３７）；−オレ ンジ、Ｃ１ｔｒｕｓ　５ｉｎｅｎｓｉｓ　（ＫｏｂａｙａｓｈｉおよびＵｃｈｉ ｄａ、Ｊａｐａｎ　Ｊ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８９）６４：９１）ニーパパイヤ、 Ｃａｒ　ｉｃａ　ｐａｐａｙａ　（Ｐａｎｇおよび５ａｎｆｏｒｄ。

Ｊ　Ａｍｅｒ　Ｓｏｃ　Ｈｏｒｔ　Ｓｃｉ　（１９８９）１１３：２８７）；− エンドウ、Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ（Ｐｕｏｎｔｉ−Ｋａｅｒｌａｓｅｔ　 ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８９）８：３２１）。

−モモ、Ｐｒｕｎｕｓ　ｐｅｒｓｉｃａ（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｌａｇ　ｅｔａ＋ 、、Ｊ　Ａｍｅｒ　Ｓａｃ　Ｈｏｒｔ　Ｓｃｉ　（１９８９）１１４：５０８） ニ ーサトウダイコン、Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　（ＬｉｎｄｓｅｙおよびＪｃ ｎｅｓ、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９８９）８ニア１）。

発現カセットが再生されたトランスジェニック植物に安定に取り込まれた後は、 それは有性交配により他の植物に伝達される。多数の標準的育種技術はいずれも 、交配される種にしたがって用いることができる。

該植物は慣用的な手順を用いて育成し、収穫して、所望の食用部分を回収する。

いくつかの場合には、食用部分は、例えば果実（例えばトマト、モモ、ナシなと ）の場合のように、そのまま消費される。これは菜食部分、例えばニンジン、セ ロリおよび馬鈴薯についても、さらに食用種子、例えばピーナ゛人ピーカンまた はヒマワリの種についても当てはまる。食用部分が調理食品として用いられる場 合は、その調理法では、いつも用いられる甘味成分を減らすことができる。バン ブキンプディングまたはパイの中身に、例えば内因的に甘味を強化されたカポチ ャを用いる場合、アップルソースまたはアップルパイに内因的甘味強化リンゴを 用いる場合およびライスプディングにコメを使用する場合は、下記の実施例６に 説明するように、砂糖の内容量を減らした調理法を用いることができるであろう 。特定の具体例で示される、選択されたモネリンまたはタウマチンの熱不安定性 にしたがって、調理のクツキックステップに応して砂糖の量の調製が必要かもし れない。これら内的甘味強化食用部分を用いる調理法の修飾および調節は明白な ものであり、調理業者により容易に行われるであろう。

したがって、タウマチンまたはモネリンの構成体または特定の器官での産生を提 供する、適切なベクターに含まれる発現カセットは、植物細胞または植物体を形 質転換する。その後、これら植物細胞または植物体は、内因的に強化された甘味 を有する食用部分をもつ、安定に形質転換されたトランスジェニック植物に再生 される。これらの植物はそれから慣用的に育成され、強化甘味をもつ食用部分か 収穫される。

実施例 以下の実施例は本発明を説明しようとするものであるが、その範囲を制限するも のではない。

図１のＢ鎖およびＡ鎖の直接融合により得られたアミノ酸シーケンスをもつ単一 鎖蛋白が、以下のように構築された合成りＮＡシーケンスによりコードされる。

合成遺伝子では、メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンの後、１−１４１番 までのヌクレオチドが天然ＢＭのｌ−４６番までの残基をコードし、＋４２−１ ６５ヌクレオチドが、天然Ｂ鎖の４７−５０残基および天然Ａ鎖の２−５残基か ら成る８アミノ酸の連結”Ｃ”部分をコードし、さらに１６６−２８５ヌクレオ チドが天然Ａ鎖の６−４５残基をコードする。完全な構築物を図４に示す。要約 すれば、該構築物は天然Ｂサブユニットの１−４６残基、天然Ａサブユニットの ６−４５残基、およびｔｙｒ−ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−１１ ｅ−Ｌｙｓのシーケンスをもつ″Ｃ″リンカーをコードする。

この合成遺伝子は以下のオリゴマーから調製さね、アプライドバイオシステム（ Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ｂ　ＤＮＡ合成機を用いて合成 された。

二のオリゴマーを尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、セブパック （Ｓｅｐ−ｐａｋ）ＣＩ　８カラム（ワットマン）を通して精製し、以下のよう にアニールし、つなぎ合わせ− ５°末端にＮｄｅＩまたはＮｃｏＴさらに３°末端に５ａ１１によるブラケット を入れた、図３に示す合成遺伝子を得た。そのような例の一つを図４に示す。

つなぎ合わせ（ライゲーション）には、各オリゴマーを３７°Ｃで４５分、５０ ｍＭｈリスーＭＣＩ　（ｐＨ８，０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２．ｌ　ＯｍＭのＤ ＴＴ、ＩｍＭのＡＴＰおよび５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む３０ μｍの反応混合物中でリン酸化した。各反応混合物をまとめ、フェノール／クロ ロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、高速真空機（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ） で乾燥させた。この乾燥ベレットを５０μＩの蒸留水に溶かし、７μｍのライゲ ーション緩衝液（０，２Ｍ１−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、０．　ＩＩＶＩ ＭｇＣ＋２．０゜１ＭＤＴＴ）を加えた。この溶液を９５°Ｃの水槽に置き、− 晩ゆっくりと室温まで冷ました。該混合物に７μＩのｌｏｍＭＡＴＰ、４ｅ単位 のＴ４ＤＮＡリガーセにゴーイングラントバイオ５１社）および２μＩの水を加 えた。

反応混合物を室温に１０分置き、フェノール／クロロホルムで抽出し、沈殿させ 乾燥し、さらに８５μｍの水に溶かした。つなぎ合わせたオリゴマー混合物を制 限エンドヌクレアーゼＮｄｅｌおよび５ａｌｌにニーイングランドバイオ９１社 ）で処理し、７％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により２９０塩基対フラグ メントを分離し、該バンドを電気的に溶出させ、エラティップ−Ｄ（Ｅｌｕｔｉ ｐ−Ｄ）カラム（Ｓ＆Ｓ　Ｃｏ、　）を用いて精製した。

この合成モネリン遺伝子のクローニングには、Ｍｌ　３ｍｐ　１９ＲＦを用いた 。

Ｍｌ　３ｍｌ　９ＲＦをＸｂａ　Ｉ／Ｓａ　１１　にニーイングランドバイオ９ １社）で切断し、大きいほうのフラグメンとを分離、精製した。合成した以下の Ｘｂａｌ／Ｎｄｅｌアダプター、 を精製し、Ｎｄｅ　Ｉ／Ｓａ　］　Ｉ消化し、上記で調製されたアニールした合 成モネリンＤＮＡフラグメントを、Ｘｂａ　Ｔ／Ｓａ　Ｉ　１−処理Ｍｌ　３ｍ ｐ　１９ＲＦおよびＸｂ　ａ　Ｉ／Ｎｄ　ｅ　Ｉアダプターと、２０ｍＭｔ−リ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ１２、ｌｏｍＭのＤＴＴ、２００ 単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにゴーイングラントバイオ５１社）のｌＯμｌ中で結 合させ、４°Ｃで一晩インキユベーションし、Ｍ１３ｍｐ１９ＭＯＮ　ＩＲＦを 用意した。５μｍのこのライゲーション混合物をＥ、ｃｏｌｉＪＭ１０１適合細 胞（Ｊ、　Ｍｅ　ｓ　ｓ　ｉｎｇ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ（１９８３）　＋０１：２Ｏ−７８）の２００μｌに加えることにより、こ のライゲーション混合物で宿主を形質転換した。所望のシーケンスはジデオキシ シーケンシング（Ｔ、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａ ｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８５）７４：５４６３−５４６７）で確認された。

Ｅ８ブＯモーターを含む２．０ｋｂ７ラグメントを、ｐＥ８ｍｕｔＲＮ２．０（ Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ（１９８ ９）ｌ：５３）から、ＮｃｏＩで切断することにより分離した。Ｎｃｏｌ切断部 位（サイト）の５°側に張り出している部分をＤＮＡポリメラーゼの大きいほう のフラグメント（クレノーフラグメント）で充填し、直鎖状プラスミドＥｃ。

ＲＩて消化した。生じた２、０ｋｂのＥｃｏＲＩ／充填ＮｃｏＩフラグメントを 、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩて切断したｐＵｃ１１８につなぎ合わせた。生じた 構築物、ｐＥ８ｍｕｔＲＮ２．０　（＋）は、本来のＮｃｏｌサイトを保持しな がら、ＢａｍＨＩＳＸｂａ、Ｌ　Ｓａ　１１、Ｐｓｔｌ、ｓｐｈ　Ｉ、およびＨ ｉｎｄｌｌＩサイトをそれぞれ含んでいる。

実施例１のＮｃｏｌ−３ａｉｌ融合モネリン遺伝子は、ＮｃｏＩおよび５ａｌＩ で切断したｐ　Ｅ　８ｍｕ　ｔ　ＲＮ２．０　（＋）につなぎ合わされた。それ から、このつなぎ合わせたプラスミドでＥ、ｃｏｌｉＨｂｌｏｌをトランスフオ ームし、生じたクローンからプラスミドＤＮＡを分離した。ＮｃｏＩおよび５ａ ｉｌによる切断で、適切なサイズの挿入が行われたことが示された。ｐｃＵ１１ ８中に形成された２、３ｋｂＥ８−モネリン挿入は、ＥｃｏＲＩおよび５ａｉｌ による消化とそれに続くアガロースゲルによる精製で分離された。２．３ｋｂＥ ８−モネリンフラグメント（ＥｃｏＲＩ−３ａ１１）を、ｐＵＣｎｏｓ−ｔｅｒ から精製された０、　２５　ｋｂのＳａｌ■／ＥｃｏＲｉアグロバクテリウムの ツバリンシンターゼ遺伝子転写ターミネータ−フラグメントおよびＥｃｏＲＩ切 断ｐＵｃ１１８とに３方向ライゲーシヨンで結合した。（ｐＵＣｎｏｓ−ｔｅｒ は、ｐＢｒ＋２１　（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、’、パロアルト、カリフォ ルニア）の０．２５ｋｂの５ｓｔｌ／ＥｃｏＲＩツバリンシンターゼ遺伝子転写 終結シーケンスを、ＥｃｏＲＩおよび５ｓｔｌで消化したｐＵＣ１１８でサブク ローニングすることにより作成された。）　生じたクローンから分離されたミニ ブレツブＤＮＡの制限酵素による消化およびジデオキシシーケンシング分析によ り、生じたベクター、ｐＥ８ｍｏｎは、該融合モネリン遺伝子と翻訳開始のＡＴ Ｇで正確につなぎ合わされたＥ８の５′制御シーケンスを含むことが明らかとな った（なお、この３゜ＳａＮサイトは、ツバリンシンターゼ転写ターミネータ− フラグメントの５ａＩＩサイトに連結されている）。　ｐＥ８−ｍｏｎのこの２ ．５５　ｋｂ挿入物は、ＥｃｏＲＩて遊離させ、さらに中間体の複合組み込み性 （ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）植物形質転換ベクターｐＭＬＪｌ（デブロッ クら（Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ（１９８４）２：１６８１− １６８９）により記載されたものと同様のもの）に両方向につなぎ、ｐＭＬＪｌ ：Ｅ８−モネリン（Ｄ）およびｐＭＬＪｌ：Ｅ８−モネリン（１）を作成した。

ｐＭＬＪｌ：Ｅ８−モネリン（Ｄ）では、Ｅ８−モネリンターミネータ−挿入の ５′末端は、細菌のアンピシリン耐性遺伝子座に一番近接しており、ｐＭＬＪ、 １：Ｅ８−モネリン（１）では、ツバリンシンターゼターミネータ−シーケンス がこの遺伝子座に一番近い。

０．８ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｓｍａｌ　ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターフラグメント を、ｐＢ１１２１　（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、、パロアルト、カリフォル ニア）から分離されたカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーターの制 御シーケンスの５′末端にＥｃｏＲＩリンカ−を付加することにより調製した。

このフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し７−、ｐＥ８ｍｏｎ（実施 例２）をＮｃｏｌて切断し、このＮｃｏｌ切断５′側の張り出しをＤＮＡポリメ ラーゼ（クレノー）で充填して、上記の精製ＣａＭＶ３５ＳプロモーターのＳｍ ａｌサイトに連結するのに適した平滑端を作成し、生じた直線状プラスミドをＥ ｃｏＲＩて消化した。この０．５５ｋｂの平滑端／ＥｃｏＲＩモネリンターミネ ータ−フラグメントをアガロースゲルで分離し、０．８ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｓｍ ａｌｃａＭＶ３５ｓプロモーターおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１１９を用 いた３分子ライゲーションで使用し、ｐＣａＭＶ−モネリンを作成した。制限エ ンドヌクレアーゼサイトによるマツピングで、ｐＣａＭＶ−モネリンは、ＣａＭ Ｖ３５Ｓプロモーターから成る挿入物（これは、その３’Ｓｍａｌサイトで融合 モネリン遺伝子（その３′末端はひるかえって、その５ａｌｌサイトて、ノパリ ンシンターセ転写終結シーケンスに対してつながれている）の平滑端５’　Ｎｃ 。

■サイトに対してつながれている）を、そのＥｃｏＲＩサイトに連結しているｐ ＵＣ１１８から成ることが示された。

ｐＣａＭＶ−モネリンのこの１．３５　ｋｂの挿入物をＥｃｏＲＩで遊離させ、 アガロースゲルで精製した。生した１、３５ｋｂフラグメントをｐＭＬＪｌのＥ ｃｏＲエサイトに両方向につないだ。ｐＭＬＪｌ　：ＣａＭＶ−モネリン（Ｄ） では、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター−モネリンーターミメーター構築物のＣａＭ Ｖ３５３制御シーケンスはｐＭＬＪｌのアンピシリン耐性遺伝子座に最も近＜： ｐＭＬＪｌ　：ＣａＭＶ−モネリン（１）では、ツバリンシンターゼ遺伝子転写 終結シーケンスがこの遺伝子座に最も近い。

ｐＭＬＪｌ：Ｅ８−モネリン（Ｄ）　、ｐＭＬＪｌ　：Ｅ８−モネリン（１）、 ｐＣａＭＶ−モネリン（Ｄ）またはｐＭＬＪｌ　：ＣａＭＶ−モネリン（１）を 宿すＥ、ｃｏｌｉ　ＭＶ１１９３（７）、複合組み込み植物形質転換べ’）９− ｐＧＶ３８５０　（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ　（１９８ ３）２＋２１４３−２１５０）を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆ ａｃｉｅｎｓ′およびヘルパーＥ、ｃｏｌｉ株ｐＧＪ２３　（Ｖａｎ　Ｈａｕｔ ｅ　ｅｔ　ａｌ、。

（１９８３）上掲）によるトリバレンタルメーティング（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａ Ｉ　ｍａｔｉｎｇ）（Ｖａｎ　Ｈａｕｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ（１９８ ３）２：４１１−４１７）で、該構築物のｐＧｖ３８５０への複合組ミ込ミ（コ インテグレーション）を行った。生じたベクター、ｐＧＶ３８５０・Ｅ８−モネ ’Ｊン（Ｄ）、Ｉ）ＧＶ３８５０：Ｅ８−モネｌＪ：／　（Ｉ）、ｐＧＶ３８５ ０　：ＣａＭＶ−モネリン（Ｄ）およびｐＧＶ３８５０　：ＣａＭＶ−モネリン （１）を、その後トマトおよびレタスの遺伝子に融合キメラモネリン遺伝子を挿 入するために利用した。

トマトまたはレタスの滅菌子葉片を、実施例４の複合組み込みプラスミド（これ は、トランスジェニック植物にカナマイシソ耐性を付与することができるネオマ イシンホスフすトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）を、移されたｔ−ＤＮ Ａ内に含むＴｉプラスミドである）を含むアグロバクテリウムに感染させた。

実施例４に記載したように調製された、この複合組み込みＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＴｉベクター、ｐＧＶ３８５０（これは、その 中に組み込まれたプラスミド、ｐＭＬＪ］：Ｅ８−モネリン（Ｄ）　、ｐＭＬＪ ｌ、Ｅ８−モネリン（１）　、Ｉ）ＭＬＪＩ　：ＣａＭＶ−モネリン（Ｄ）また はｐＭＬＪＩ：ＣａＭＶ−モネリン（１）をもつ）を、それぞれ別個のトマト染 色体への該融合モネリン遺伝子構築物のＤＮＡトランスファーを促進するために 用いた。

一方、実施例４にも記載されたこれらベクター構築物のうち、ＣａＭＶ含有ベク ターのみがそれぞれ別個のレタス染色体に挿入された。その手順は以下の通りで ある 形質転換のための宿主植物を調製するために、トマトまたはレタスの種子を子葉 形成のために記載されたように発芽させた。子葉をその後フィーダープレートに 移し、該細菌と共に培養し、それから再生培地に置いた。新芽が形成された後、 該新芽および暗線カルスを新芽育成（ｓｈｏｏｔｉｎｇ）培地に移し、さらに新 芽の発生を刺激した。それから根形成を刺激するために、新芽を根育成（ｒｏｏ ｔｉｎｇ）培地に移した。この植物をその後土壌に移し、さらに鉢に移した。

イーダープレートの調製 フィーダープレートは、およそ４０ｍ１のキサンチ（Ｘａｎｔｈｉ）培地（８ｇ ／］の寒天含有）を含む深いベトリ皿を用いて調製し、キサンチの密集懸濁培養 液（７日経過）１ｍｌを接種した。

キサンチ培地は以下のものを含む。

（ストック） ＫＣＭＳ塩（ＭＭｌｏｏ）１瓶：４．３ｇ１−イノシトール＋　１００ｍｇ サツ力ロサッカロースニ　３０ｇ ＫＨ２ＰＯ４：　２ｍ１　１００ｍｇ／ｍＩチアミン：　１．３ｍｌ　１ｍｇ／ ｍ１２．４−Ｄ：　２ｍｌ　１００ｍｇ／ｌキネチン：　０．４ｒｎｌ　０．２ ５ｍｇ／ｍｌこの培地はＫＯＨでｐＨを５，５に調製し、１リツトルのＨ２Ｏで 希釈して調製される。１００ｍ１容量を５００ｍ１のフラスコに入札栓をしてア ルミホイルで蓋をする；それからこの培地を２０分間オートクレーブする。

タバコキサンチ浮遊培養液をそれから４０メツシユで１週間に１回濾過し、濾液 の１０ｍ１を、５００ｍ１のフラスコに入れた１００ｍ１の牛すンチ培地に加え た。

このプレートをバラフィルムでシールし、照明機に置いた育成チャンバー（２５ ゛Ｃ）で１２時間インキュベートした。

子葉の発生 トマトおよびレタスの種子を、ゼラチンのシードコートを外すために、５０ｍ１ のビーカーに１度に５０個の種子を用いて、７０％エタノール２０ｍ１中で２分 以内撹拌することによりフローフード中で滅菌した。この種子を滅菌蒸留水で１ 度洗浄し、２滴のトウイーン８０（シグマ）を混合した２０％ピューレツクスブ リーチ（Ｐｕｒｅｘ　ｂｌｅａｃｈ）中で５分間撹拌し、さらにその後滅菌蒸留 水で洗浄した。

滅菌したピンセントを用いて、１２から１５の種子を発芽培地を含む各ペトリ皿 に人ね、これをバラフィルムさらにその後アルミホイルで包んだ。これらのプレ ートは以下のように調製した： ”トマト発芽培地”は、ＫＣＭＭ−１００および３％シュークロース（８０Ｏｍ ｌの８２０に３０ｇのサッカロース）を混合したｌｐｋｇのＭＳ培地から調製し た。この培地はＫＯＨでｐＨを５．７に調整し、容量を１リツトルとしてから８ ｇのバクトアーガー（ｂａｃｔｏ　ａｇａｒ）（０，８％寒天）を加えて完成す る。この培地を２０分間オートクレーブし、深いペトリ皿に注いだ（プレート当 たりおよそ３０ｒｎｌ）。

この種子を２５°Ｃで発育させ、５日後（発芽およそ６０％に達したとき）、そ れらからアルミホイル取り去り、２５００ルクスで１６時間の照射間隔で発育さ せ總苗木を全部で８日間生育させた。

”レタス発芽培地”は、濃度が半分のホアグランドの溶液（Ｈｏａｇｌａｎｄ’ 　ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｅ、Ｊ、Ｈｅｗｉｔｔ　（１９６６）Ｓａｎｄ　ａ ｎｄ　Ｗａｔｅｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、コモンウエルス農業局） および１０μｇ／ｍｌのジベレリン酸（シグマカタログ番号Ｇ−３２５０）を含 む１％寒天から調製された。この培地を２０分間オートクレーブし、深いベトリ 皿に注いだ（３０ｍｌ／プレート）。

種子は２５°Ｃで２５００ルクス、１６時間照射間隔で４日間発育させた。

フィーダープレート上でのコカルティベーショントマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃ ｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、培養室、Ａ１１ｓａ　ＣｒａｉｇおよびＣａｓ　 ｔ　１　ｅｍａｒ　ｔ）およびレタス（Ｌａｃｔｕｃａｓａｔｉｖａ、培養室、 ダークグリーンボストンＭＴ）の子葉片をタバコフィーダープレート上で４８時 間細菌と共に培養した。

上記のように発芽させた子葉を、以下のようにフィーダープレートに入れた。

子葉をベトリ皿の１ｍのＨ２Ｏ中に外科用メスで切り出し總組織を引きちぎった り押し潰したりするのを最小限にとどめた切り出し物を得るために、外科用メス は静かに動かした。子葉の末端のみを切り出した。子葉の切片を外皮側を下にし て、フィーダープレート上に置いた滅菌ワットマン＃１フィルターペーパー上に 置いた。およそ５０の子葉片を各プレートに置いた。このプレートをバラフィル ムでシールし、１６時間生育チャンバーに置いた。

この子葉に、ｐＭＬＪｌ：Ｅ８−モネリン（Ｄ）、ｐＭＬＪｌ：Ｅ８−モネリン （１）、ｐＭＬＪＩ　：ＣａＭＶ−モネリン（Ｄ）またはｐＭＬＪｌ　：ＣａＭ Ｖ−モネリン（１）を含むアグロバクテリウムの培養液を用いて感染させた。細 菌は、２５μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン補充１０ｍ１ＹＥＢ培地で１晩増殖 させ、発芽培地（上記）で４倍希釈（ＯＤ５９０が０．５）した。５ｍｌの希釈 細菌をペトリ皿に分注し、その後前板てタバコフィーダー細胞と共に培養してお いた３０の子葉片を加えた。このアグロバクテリウム／子葉混合物を５分間、湿 らせるためにかき混ぜた。

この子葉を滅菌ペーパータオルに１度触れさせ、外皮を下にして同じフィーダー プレートに戻し、さらに４８時間コカルティベーションした。

細菌と共に培養した後、トマトの子葉を′再生培地”に外皮を上にして置いた。

端が寒天中にカールさせ、傷の表面が直接薬剤に接触していることを確認した。

各プレートに１５の子葉片を置いた。この段階から、アグロバクテリウム（Ｃｅ 　ｆ　ｏ　ｔ　ａｘ　ｉｍｅ）の増殖を抑制し、形質転換植物細胞（カナマイシ ン）を選別するために抗生物質を用いた。

”トマト再生培地”は１リツトル中に以下のものを含む：４．３ｇ　ＭＳ塩（Ｋ ＣＭＭ−１００）３０ｇ　グルコース ０．５９ｇ　ＭＥＳ ２ｍｌの５００Ｘガンポルグの（Ｇａｍｂｏｒｇｓ’　Ｓ）ビタミンｌ註１：５ ００Ｘのガンボルグのビタミン５ｇ　ミオ−イノシトール ０．５ｇ　チアミンＨＣＬ ５０ｍｇ　ニコチン酸 ５０ｍｇ　ピリドキシンＨＣ１ １００ｍｌ　滅菌水 ＩＮのＫＯＨでｐＨを５．８に調整し容量を１リツトルとする。８ｇの組織培養 グレードの寒天を加え、２０分間オートクレーブし、５０℃に冷ます。

添加：１ｍｇの滅菌セアチン（トランス−アイソマー）３００ｍｇ／ｍＩのセフ オタキシム（カルビオケム、カタログ番号２１９５０ｍｇ／］のカナマイシン （セフォタキシムは光感受性である。セフオタキシムを含むプレートは使用前日 に調製された。） 細菌との培養後、レタス子葉を外皮を上にして“カルス培地”に置いた。

”レタスカルス培地”は、１リツトル中に以下のものを含む　４．３ｇＭ５塩（ ＫＣＭＭ−１００） ３０ｇ　シュークロース ２ｍｌ　５００ＸのガンボルグのビタミンＩＮのＫＯＨでＩ）Ｈ５，８とし、容 量を１リツトルとする。８ｇの組織培養グレードの寒天 オートクレーブで２０分、５０℃に冷ます。

添加・０．５ｍｇ　滅菌キネチン ０．１ｍｇ　インドール−３−酢酸（ジグ７Ｉ−１２５０）３００ｍｇ　セフォ タキシム（カルビオケム２１９３８０）５０ｍｇ　カナマイシン １２日後（暗所で５日、１６時間の照射間隔で光の下で７日）、このレタスの子 葉をレタスカルス培地からレタス再生培地に移した。

“レタス再生培地”は、１リツトル中に以下のものを含む。

４．３ｇ　ＭＳ塩（ＫＣＭＭ−１００）３０ｇ　サッカロース ２ｍｌ　５００ＸガンボルグのビタミンＩＮＫＯＨでｐＨ５，８とし、容積を１ リツトルとする。８ｇの組織培養グレードの寒天添加 オートクレーブ２０分 ５０°Ｃに冷ます。

添加：　０．０５ｍｇ　キネチン ０．０５ｍｇ　ゼアチン ３００ｍｇ　セフオタキンム ５０ｍｇ　カナマイラン 新芽形成および根形成手順 トマトもレタスも、１０日以内にカルスが感染し、再生した子葉の端に認められ た。子葉片を２週間毎に新鮮なプレートに移し總新芽および暗緑色カルスを新芽 育成（Ｓｈｏｏｔ　ｉ　ｎｇ）培地（ゼアチン濃度を０．１ｍｇ／ｍＩに減少さ せること以外は再生培地と同じ）に移した。６週間後（３回プレート交換）、す べてのカルスおよび新芽を新芽育成培地に移した。

トマトの苗木はその後以下のように根形成された：シャーヒン（Ｅ、　Ａ、５ｈ ａｈｉｎ、Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎ　（１９８５）６９：２３５−２４０ ）により記載された７Ｍ５根形成培地を用いたが、根形成手順のためにはカナマ イシンおよびセフアトキシムの量は２５ｍｇ／ｍｌおよび１２５ｍｇ／ｍＩまで それぞれ減らした。

根誘発のためのＴＭ５は以下を含む： Ｖリットル ＭＳ塩　４．３ｇ 馬鈴薯ビタミン（２００Ｘ）（、註２）　５ｍｌサッカロース　３０ｇ ＩＢＡ（インドール−３−酪酸、　Ｏ，Ｉｍｇ　（オートシグマ製）　クレープ 前に添加）精製寒天ｇ 註２・馬鈴薯ビタミン（２００Ｘ） ミオ−イノシトール　２０ｇ チアミン−ＨＣ１１００ｍｇ ピリドキシン−ＨＣｌ　１００ｍｇ ニコチン酸　１ｇ グリシン　５００ｍｇ ビオチン　１０ｍｇ 葉酸　１００ｍｇ 清澄溶液となるまでｐＨを５．８から６．０に調節。−２０°Ｃで保存。

上記の７Ｍ５根形成培地を含むベトリ皿を調製した。上記のように調製したトマ トの新芽を切り出し、板形成培地に上向きに置いた。２−４週間後に根を観察し た。

完全に同じ方法で、形質転換レタスから得られた新芽も根形成させた。

移植 はとんどの寒天を取り除くためにスパーチルを用いて、静かに寒天から根形成ト マトの植物体を取り出し、土壌に移した。根は暖かい水で洗浄し、できるだけ多 くの寒天を取り除いた。その後、根を陶製ポットに植え、これらをＧＡ−７ボツ クス内に置いた。該ボックスの覆いを数Ｂにわたり開け、さらに！／２濃度のホ アグランドの溶液を水やり毎に与えた。２週間後生前箱で完全に覆いを取り、植 物を大型のポットに移植し、温室に移した。全く同じ方法で根形成レタス植物体 も移植しｔら 生じたトランスジェニックトマトおよびレタスは、組み込まれたモネリン遺伝子 により甘味が増強した。Ｅ８プロモーターの制［でモネリン遺伝子により形質転 換されたこれらトマトでは、トマトの果実のみが甘味増強を示した。ＣａＭＶプ ロモーターの制御下でモネリンで形質転換されたレタスおよびトマトでは、植物 体のすべての部分で甘味が増強された。

モネリンで内因的に甘味を増強したレタスおよびトマトを得るために、上記で述 べたものと全く同じ方法で、タウマチンで内因的に甘味を増強したレタスおよび トマトも得られた。

実施例６ 食物調製における甘味増強食用植物の使用本発明のトランスジェニック植物また はその食用部分を用いいて食品調製を行う場合に、可能な改変を以下で説明する 。

Ａ　煮込みトマトの調製 １　標準調理法 細切れトマト　カップ２ 砂糖　小匙　１ ベイリーフ 塩、コシヨウで味付け ２、内因的甘味増強トマト使用調理法 細切れトマト　カップ２ ベイリーフ　小匙　ｌ 塩、コシヨウて味付け Ｂ、サラダドレッシング： Ｉ　天然レタスを用いたサラダの場合 オリーブオイル　カップ１／２ 赤ワイン　カップ１／４ 砂糖　小匙　２ 塩、コシヨウで味付け ２、甘味増強レタスを用いたサラダの場合オリーブオイル　カップ１／２ ニンニク酢　カップ１／４ 赤ワイン　カップｌ／４ 塩、コシヨウで味付は 上記で説明したように、砂糖または他の炭水化物甘味剤を用いる調理食品の甘味 付加は、内因的に甘味を増強した本発明の食品を用いることにより減少させるこ とかできる。

モネリンまたはタウマチンのような甘味蛋白質を生成するように修飾された、国 際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．高等植物に挿入されたとき、甘味蛋白をコードする遺伝子を発現することが できる組み換え発現系であって、該高等植物で有効な制御シーケンスに、機能で きるようにリンクされている、該甘味蛋白をコードするＤＮＡシーケンスを含む 上記組み換え発現系。 ２．該甘味蛋白がモネリンまたはタウマチンである請求項１に記載の発現系。 ３．該制御シーケンスが、器官特異的果実成熟プロモター、構成プロモーター、 種子保存蛋白プロモーターおよび野菜特異的プロモーターから成る群から選ばれ るプロモーターを含む請求項１に記載の発現系。 ４．該プロモーターが、トマトＥ８プロモーターまたはカリフラワーモザイクウ イルス３５Ｓプロモーターである請求項３に記載の発現系。 ５．請求項１の発現系で形質転換された植物細胞６．該細胞が、食用果実、食用 種子または食用野菜部分を生産する高等植物の細胞である、請求項５に記載の植 物細胞。 ７．食用果実、種子または野菜を生産するトランスジェニック植物であって、そ のトランスジェニックな特性が請求項１の発現系の存在により付与される当該ト ランスジェニック植物。 ８．請求項１の発現系を含むか、または請求項１の発現系を含むトランスジェニ ック植物により生産される食用果実、種子もしくは野菜。 ９．甘味蛋白がモネリンまたはタウマチンである請求項８に記載の食用果実、種 子または野菜。 １０．蛋白モネリンを含む食用果実、種子もしくは野菜であって、それら果実、 種子もしくは野菜がセレンディピティーベリー由来のものでない、または蛋白タ ウマチンを含む食用果実、種子もしくは野菜であって、それら果実、種子もしく は野菜がタウマトコッカス・ダーエリー由来のものでない、当該食用果実、種子 もしくは野菜。 １１．請求項７の植物を育成すること及び食用果実、種子または野菜を回収する ことを含む食用果実、種子または野菜の調製方法。 １２．内容物として、請求項８の食用果実、種子または野菜を含む食品。