JPH0556951B2 - - Google Patents
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- JPH0556951B2 JPH0556951B2 JP87194332A JP19433287A JPH0556951B2 JP H0556951 B2 JPH0556951 B2 JP H0556951B2 JP 87194332 A JP87194332 A JP 87194332A JP 19433287 A JP19433287 A JP 19433287A JP H0556951 B2 JPH0556951 B2 JP H0556951B2
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- JP
- Japan
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- tpa
- stranded
- double
- eluted
- eti
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、一本鎖組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター（以下、tPAと言う）、または一本鎖
tPAおよび二本鎖tPAを含有する水性媒体から一
本鎖tPAを選択的に回収する新規方法に関するも
のである。
ベーター（以下、tPAと言う）、または一本鎖
tPAおよび二本鎖tPAを含有する水性媒体から一
本鎖tPAを選択的に回収する新規方法に関するも
のである。
より詳細には、一本鎖tPAおよび二本鎖tPAを
含有する水性媒体からエリスリナトリプシンイン
ヒビターを担持した担体を用い、一本鎖tPAと二
本鎖tPAを分離する方法に関する。
含有する水性媒体からエリスリナトリプシンイン
ヒビターを担持した担体を用い、一本鎖tPAと二
本鎖tPAを分離する方法に関する。
すなわち、「エリスリナ・ラテイシマ
（Erythrina latissima）および他のエリスリナ種
の種子中に生成し、かつトリプシン、プラシミン
およびtPAの阻害剤であるが、ウロキナーゼには
作用しない固定化クリニツツ型害剤」（F.J.
Joubert et al、Hoppe Seyler′s Z.Physiol.
Chem.、362、531〜538、1981）であるエリスリ
ナトリプシンインヒビター（以下、ETIと略す
る）を使用して、一本鎖tPAおよび二本鎖tPAを
含有する水性媒体から一本鎖tPAを高純度で分離
精製し、それぞれのtPAを分離する方法に関す
る。
（Erythrina latissima）および他のエリスリナ種
の種子中に生成し、かつトリプシン、プラシミン
およびtPAの阻害剤であるが、ウロキナーゼには
作用しない固定化クリニツツ型害剤」（F.J.
Joubert et al、Hoppe Seyler′s Z.Physiol.
Chem.、362、531〜538、1981）であるエリスリ
ナトリプシンインヒビター（以下、ETIと略す
る）を使用して、一本鎖tPAおよび二本鎖tPAを
含有する水性媒体から一本鎖tPAを高純度で分離
精製し、それぞれのtPAを分離する方法に関す
る。
（従来技術と発明が解決しようとする問題点）
ETIをtPAの精製に使用する例としては、次の
ようなことが知られている。すなわち、tPA生産
細胞として、ヒトメラノーマ細胞を用い、血清を
含まない培地でtPAを生産させ、これを収穫し、
収穫液をETIカラムに通し、tPAを吸着させ、
ETIに吸着したtPAを約１〜3Mのカリウムチオ
シアネート水溶液を用いて溶離する精製方法であ
る（特開昭59−118717）。
ようなことが知られている。すなわち、tPA生産
細胞として、ヒトメラノーマ細胞を用い、血清を
含まない培地でtPAを生産させ、これを収穫し、
収穫液をETIカラムに通し、tPAを吸着させ、
ETIに吸着したtPAを約１〜3Mのカリウムチオ
シアネート水溶液を用いて溶離する精製方法であ
る（特開昭59−118717）。
しかし、この精製方法は、tPAを精製する方法
であつて、一本鎖tPAと二本鎖tPAを分離精製す
る方法に関するものではない。
であつて、一本鎖tPAと二本鎖tPAを分離精製す
る方法に関するものではない。
本発明者らは、すでに、牛胎児血清を含む培養
培地に生成する抗ヒトtPA抗体に反応する分子量
11万±２万ダルトンのものを分離、除去する方
法、ならびに遺伝子組換え技法を用いてtPA遺伝
子を組み込んだ細胞を培養し、その宿主細胞由来
のtPAとヒト細胞由来tPAを分離する方法等につ
いて開発した（特願昭60−168601）。
培地に生成する抗ヒトtPA抗体に反応する分子量
11万±２万ダルトンのものを分離、除去する方
法、ならびに遺伝子組換え技法を用いてtPA遺伝
子を組み込んだ細胞を培養し、その宿主細胞由来
のtPAとヒト細胞由来tPAを分離する方法等につ
いて開発した（特願昭60−168601）。
このtPA活性を有する物質には一本鎖と二本鎖
とがあり、これらはともに約７万ダルトンの分子
量を有するが、一本鎖tPAと二本鎖tPAとは、プ
ラスミノーゲン活性化能およびフイブリンへの親
和性が異なることが明らかにされてきた。
とがあり、これらはともに約７万ダルトンの分子
量を有するが、一本鎖tPAと二本鎖tPAとは、プ
ラスミノーゲン活性化能およびフイブリンへの親
和性が異なることが明らかにされてきた。
すなわち、二本鎖tPAはプラスミノーゲン活性
化能が一本鎖tPAにくらべ約10倍ほど高く（特開
昭59−118717）、一方、一本鎖tPAはフイブリン
への親和性が二本鎖tPAにくらべて大きく、フイ
ブリンに吸着すると非常に速く二本鎖tPAに転化
されることが明らかになつた。従つて、凝血部分
で最大限の所望の活性を得るには一本鎖tPAが好
ましい（D.C.Rijken et al、J.Biol.Chem.257、
2920〜2925、1982）。
化能が一本鎖tPAにくらべ約10倍ほど高く（特開
昭59−118717）、一方、一本鎖tPAはフイブリン
への親和性が二本鎖tPAにくらべて大きく、フイ
ブリンに吸着すると非常に速く二本鎖tPAに転化
されることが明らかになつた。従つて、凝血部分
で最大限の所望の活性を得るには一本鎖tPAが好
ましい（D.C.Rijken et al、J.Biol.Chem.257、
2920〜2925、1982）。
一本鎖tPAを取得する公知の方法としては、細
胞培養する際に蛋白質分解酵素阻害剤を添加し、
一本鎖tPAから二本鎖tPAへの移行を素子する方
法が知られている（D.C.Rijken et al、J.Biol.
Chem.256、7035〜7041、1981）。しかし、この方
法では、細胞の種類、細胞培養の方法および培養
周期などさまざまに異なる条件下での二本鎖tPA
への移行を完全に抑えることが非常に難しい。す
なわち、一般に、細胞培養培地に含まれる蛋白分
解酵素の種類やその量は異なり、これら蛋白分解
酵素の作用を制御しようとするのは非常に困難で
ある。一方、蛋白分解酵素の阻害剤はその種類が
多く、細胞の増殖に抑制的に影響を与えるものも
あつて、細胞培養に使用できる蛋白質分解酵素阻
害剤の種類は限られてしまう。また、蛋白質分解
酵素阻害剤は、その種類によつて高価なものもあ
り、大量培養するには実用的ではない。
胞培養する際に蛋白質分解酵素阻害剤を添加し、
一本鎖tPAから二本鎖tPAへの移行を素子する方
法が知られている（D.C.Rijken et al、J.Biol.
Chem.256、7035〜7041、1981）。しかし、この方
法では、細胞の種類、細胞培養の方法および培養
周期などさまざまに異なる条件下での二本鎖tPA
への移行を完全に抑えることが非常に難しい。す
なわち、一般に、細胞培養培地に含まれる蛋白分
解酵素の種類やその量は異なり、これら蛋白分解
酵素の作用を制御しようとするのは非常に困難で
ある。一方、蛋白分解酵素の阻害剤はその種類が
多く、細胞の増殖に抑制的に影響を与えるものも
あつて、細胞培養に使用できる蛋白質分解酵素阻
害剤の種類は限られてしまう。また、蛋白質分解
酵素阻害剤は、その種類によつて高価なものもあ
り、大量培養するには実用的ではない。
また、一本鎖tPAを精製して取得する手段とし
ては、これを特異的に吸着する固定化モノクロー
ナル抗体を使用する方法が知られている
（BioPoo−１社カタログ（Sweden））。しかしな
がら、この方法は固定化モノクロナール抗体に対
するtPAの吸着能力、およびこの抗体カラムの使
用時の安定性に問題がある。
ては、これを特異的に吸着する固定化モノクロー
ナル抗体を使用する方法が知られている
（BioPoo−１社カタログ（Sweden））。しかしな
がら、この方法は固定化モノクロナール抗体に対
するtPAの吸着能力、およびこの抗体カラムの使
用時の安定性に問題がある。
（問題点を解決するための手段）
このような状況のなかで、本発明者らは、一本
鎖tPAおよび二本線tPAを含有する水性媒体から
一本鎖tPAを分離精製する方法を鋭意検討し、一
本鎖tPAと二本鎖tPAはETIに対して親和性が異
なり、溶離液のPHを変化させると効果的に分離で
きることを見出し、本発明を完成した。
鎖tPAおよび二本線tPAを含有する水性媒体から
一本鎖tPAを分離精製する方法を鋭意検討し、一
本鎖tPAと二本鎖tPAはETIに対して親和性が異
なり、溶離液のPHを変化させると効果的に分離で
きることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、一本鎖tPAおよび二本鎖
tPAを含有する水性媒体を、一旦、ETIを担持し
ている担体に接触させてこれらtPAを吸着させ、
次いで、不純蛋白質を洗浄除去した後、特異的に
一本鎖tPAを溶離するPH領域の溶出液で一本鎖
tPAを溶離し、次いで、一本鎖tPAおよび二本鎖
tPAのいずれをも溶離するPH領域の溶出液で一本
鎖tPAと二本鎖tPAまたは二本鎖tPAを溶離させ
る方法であつて、一本鎖tPAおよび二本鎖tPAを
含有する水性媒体からETIを使用して一本鎖tPA
と二本鎖tPAとを分離する方法である。
tPAを含有する水性媒体を、一旦、ETIを担持し
ている担体に接触させてこれらtPAを吸着させ、
次いで、不純蛋白質を洗浄除去した後、特異的に
一本鎖tPAを溶離するPH領域の溶出液で一本鎖
tPAを溶離し、次いで、一本鎖tPAおよび二本鎖
tPAのいずれをも溶離するPH領域の溶出液で一本
鎖tPAと二本鎖tPAまたは二本鎖tPAを溶離させ
る方法であつて、一本鎖tPAおよび二本鎖tPAを
含有する水性媒体からETIを使用して一本鎖tPA
と二本鎖tPAとを分離する方法である。
本発明の方法で使用する一本鎖tPAおよび二本
鎖tPAを含む水性媒体とは、tPAを産生する細胞
の種類に限定されることなく、即ち、例えば、メ
トラノーマ細胞、ヒト正常細胞、および遺伝子組
み換え技法を用いてヒトtPA遺伝子を組み込んだ
細胞等の各種の細胞を用いて産生された、一本鎖
tPAと二本鎖tPAとを含有する水性媒体である。
鎖tPAを含む水性媒体とは、tPAを産生する細胞
の種類に限定されることなく、即ち、例えば、メ
トラノーマ細胞、ヒト正常細胞、および遺伝子組
み換え技法を用いてヒトtPA遺伝子を組み込んだ
細胞等の各種の細胞を用いて産生された、一本鎖
tPAと二本鎖tPAとを含有する水性媒体である。
また、これらtPAを含む液として、産生された
tPAを含む上記細胞の培養液を部分精製した液
も、また一本鎖tPAおよび二本鎖tPAの分離精製
が必要とされる各種工程で調製される一本鎖tPA
および二本鎖tPAを含む溶液であつてもよい。
tPAを含む上記細胞の培養液を部分精製した液
も、また一本鎖tPAおよび二本鎖tPAの分離精製
が必要とされる各種工程で調製される一本鎖tPA
および二本鎖tPAを含む溶液であつてもよい。
なお、上記のtPA遺伝子を組み込んだ細胞、す
なわち、形質転換された宿主細胞内において、活
性型ヒトtPAをコードしているDNA配列を発現
することができる、複製可能な発現ベクターで形
質転換された細胞としては、例えばチヤイニーズ
ハムスタ卵母細胞、マウス線維芽細胞、マウスミ
エロマー細胞、ヒト胎児羊膜細胞、Hela細胞、
酵母細胞等が挙げられる。
なわち、形質転換された宿主細胞内において、活
性型ヒトtPAをコードしているDNA配列を発現
することができる、複製可能な発現ベクターで形
質転換された細胞としては、例えばチヤイニーズ
ハムスタ卵母細胞、マウス線維芽細胞、マウスミ
エロマー細胞、ヒト胎児羊膜細胞、Hela細胞、
酵母細胞等が挙げられる。
本発明の方法で使用するETIを担持した担体と
は、ETI、すなわち、エリスリナ・ラテイシマ
（豆科植物Erythrina latissima、広葉エリスリ
ナ）および他のエリスリナ種の種子の中に生成
し、かつトリプシン、プラスミンおよびtPAの阻
害剤であるが、ウロキナーゼには作用しない型の
固定化クニツツ型阻害剤を担体に固定化したもの
である。
は、ETI、すなわち、エリスリナ・ラテイシマ
（豆科植物Erythrina latissima、広葉エリスリ
ナ）および他のエリスリナ種の種子の中に生成
し、かつトリプシン、プラスミンおよびtPAの阻
害剤であるが、ウロキナーゼには作用しない型の
固定化クニツツ型阻害剤を担体に固定化したもの
である。
ETIを固定化する担体の種類としては、不溶性
アガロース、デキストラン、セルロース、ポリア
クリルアミド、ポリエチレングリコールグリシジ
ルメタクリレートポリマー、ガラスビーズまたは
これらを２種以上組合せたもの等を使用できる。
アガロース、デキストラン、セルロース、ポリア
クリルアミド、ポリエチレングリコールグリシジ
ルメタクリレートポリマー、ガラスビーズまたは
これらを２種以上組合せたもの等を使用できる。
ETIを担体に固定化する方法としてはつぎのよ
うな方法が適用される。例えば、(a)臭化シアン活
性化アガロースを用いた固定化、(b)水溶性カルボ
ジイミドを用いたカツプリング、(c)前もつてアミ
ノアルキル形に転化したアガロースNH2基を結
合させるグルタルアルデヒドカツプリング、(d)Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化アガ
ロースへのカツプリング、(e)エポキシ活性化アガ
ロースによるカツプリング、(f)アルデヒド官能基
を生成し、次にETIのアミンと反応してシツフ塩
基を形成し、次いでナトリウムボロハイドライド
によつて還元する過ヨウ素活性化アガロース、(g)
ブロモアセチルアルキルアミンアガロースを用い
たカツプリング、(h)ジアゾニウム誘導体を用いた
カツプリング、等の方法があげられ、 また、担体については、(i)セルロースはヒドラ
ジド誘導体に転化させて、Parikh等の方法
（Methods in enzymology 34、77〜102、
editors、W.B.Jakobi and M.Wilcheck
Academie Press、N.Y.）に従つて使用してもよ
く、(j)ポリアクリルアミドは、直接グルタルアル
デヒド法またはｐ−アミノベンズアミドエチル誘
導体もしくはヒドラジド誘導体のジアゾ化によつ
て結合させて使用してもよく、さらに、(k)ガラス
ビーズは、H.H.Weetall＆A.M.Filbert等の方法
（Methodsin enzymology34、59〜72、editors、
W.B.Jakobi and M.Wilcheck Academie
Press、N.Y.）に従つて使用してもよい。
うな方法が適用される。例えば、(a)臭化シアン活
性化アガロースを用いた固定化、(b)水溶性カルボ
ジイミドを用いたカツプリング、(c)前もつてアミ
ノアルキル形に転化したアガロースNH2基を結
合させるグルタルアルデヒドカツプリング、(d)Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化アガ
ロースへのカツプリング、(e)エポキシ活性化アガ
ロースによるカツプリング、(f)アルデヒド官能基
を生成し、次にETIのアミンと反応してシツフ塩
基を形成し、次いでナトリウムボロハイドライド
によつて還元する過ヨウ素活性化アガロース、(g)
ブロモアセチルアルキルアミンアガロースを用い
たカツプリング、(h)ジアゾニウム誘導体を用いた
カツプリング、等の方法があげられ、 また、担体については、(i)セルロースはヒドラ
ジド誘導体に転化させて、Parikh等の方法
（Methods in enzymology 34、77〜102、
editors、W.B.Jakobi and M.Wilcheck
Academie Press、N.Y.）に従つて使用してもよ
く、(j)ポリアクリルアミドは、直接グルタルアル
デヒド法またはｐ−アミノベンズアミドエチル誘
導体もしくはヒドラジド誘導体のジアゾ化によつ
て結合させて使用してもよく、さらに、(k)ガラス
ビーズは、H.H.Weetall＆A.M.Filbert等の方法
（Methodsin enzymology34、59〜72、editors、
W.B.Jakobi and M.Wilcheck Academie
Press、N.Y.）に従つて使用してもよい。
本発明の方法では、以上のようなETIを担持し
た担体に、前記の一本鎖tPAと二本鎖tPAとを含
有する水性媒体を接触させる。
た担体に、前記の一本鎖tPAと二本鎖tPAとを含
有する水性媒体を接触させる。
この水性媒体と担体とを接触させる操作は、と
くに限定されず、通常の方法、例えば、バツチ法
やカラム法で接触させる操作が適用できる。
くに限定されず、通常の方法、例えば、バツチ法
やカラム法で接触させる操作が適用できる。
カラム法の場合、液の流れは上昇流でも下降流
でもよい。カラムとしては、通常は円筒形のもの
が多用されるが、カラムの径の高さの比はとくに
限定されることなく決定できる。
でもよい。カラムとしては、通常は円筒形のもの
が多用されるが、カラムの径の高さの比はとくに
限定されることなく決定できる。
操作温度は、tPAが安定である温度範囲であ
り、好ましくは水性媒体が凍結しない温度から室
温の範囲である。
り、好ましくは水性媒体が凍結しない温度から室
温の範囲である。
以上の水性媒体と担体との接触操作によつて、
水性媒体中に含有される一本鎖tPAと二本鎖tPA
は、ETIを担持した担体に吸着される。
水性媒体中に含有される一本鎖tPAと二本鎖tPA
は、ETIを担持した担体に吸着される。
この吸着操作の後、必要に応じて、tPAを溶離
しない条件、例えば、中性ないし弱塩基性のPH範
囲で高濃度の塩溶液を用い、カラムを洗浄し、担
体上に非特異的に作用した各種の不純蛋白質を除
去する。
しない条件、例えば、中性ないし弱塩基性のPH範
囲で高濃度の塩溶液を用い、カラムを洗浄し、担
体上に非特異的に作用した各種の不純蛋白質を除
去する。
ついで、本発明の方法では、一本鎖tPAと二本
鎖tPAを吸着したETI担体を、先ず、特異的に一
本鎖tPAを溶離するPH領域の溶離液で処理し、一
本鎖tPAをETI担体から溶離して一本鎖tPAを取
得し、次いで、残余の一本鎖tPAを含むこともあ
る二本鎖tPAを吸着したETI担体を、一本鎖tPA
および二本鎖tPAを溶離するPH領域の溶離液で処
理して、一本鎖tPAと二本鎖tPAを含有するtPA
または二本鎖tPAを溶離させる。
鎖tPAを吸着したETI担体を、先ず、特異的に一
本鎖tPAを溶離するPH領域の溶離液で処理し、一
本鎖tPAをETI担体から溶離して一本鎖tPAを取
得し、次いで、残余の一本鎖tPAを含むこともあ
る二本鎖tPAを吸着したETI担体を、一本鎖tPA
および二本鎖tPAを溶離するPH領域の溶離液で処
理して、一本鎖tPAと二本鎖tPAを含有するtPA
または二本鎖tPAを溶離させる。
特異的に一本鎖tPAを溶離するPH領域、ならび
に次いで実施する一本鎖tPAおよび二本鎖tPAを
溶離するPH領域は以下に示す溶離液に使用する各
種の要因によつて変動する。しかし、各種要因の
組合せにおいて、適切な条件を選択して適用する
ことによつて一本鎖tPAと二本鎖tPAをそれぞれ
溶離し、目的の一本鎖tPAを取得することができ
る。
に次いで実施する一本鎖tPAおよび二本鎖tPAを
溶離するPH領域は以下に示す溶離液に使用する各
種の要因によつて変動する。しかし、各種要因の
組合せにおいて、適切な条件を選択して適用する
ことによつて一本鎖tPAと二本鎖tPAをそれぞれ
溶離し、目的の一本鎖tPAを取得することができ
る。
溶離液に使用され、上記PH領域に影響を与える
要因として、つぎのようなものが挙げられる。
要因として、つぎのようなものが挙げられる。
(1)緩衝液の種類；グリシン−塩酸緩衝液、クエ
ン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸
緩衝液、乳酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸
緩衝液、ベロナール緩衝液等、(2)塩の種類；チオ
シアン酸塩、過塩素酸塩等のカオトロピツクイオ
ンを含む塩や、食塩、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、塩化マグネシウム、硫安等、(3)緩衝液およ
び塩の濃度、(4)添加剤；(A)アルギニン、リジン等
の塩基性アミノ酸およびオルニチン、ε−アミノ
カプロン酸等の塩基性アミノ酸類似物質、(B)ベン
ズアミジン等のトリプシン様酵素に対する拮抗阻
害剤、(C)アミン類、アルコール類等の求核試薬、
(D)尿素、塩酸グアニジン等の淡白変成剤、(E)
Tween80、Triton Ｘ−100等の界面活性剤、等
である。
ン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸
緩衝液、乳酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸
緩衝液、ベロナール緩衝液等、(2)塩の種類；チオ
シアン酸塩、過塩素酸塩等のカオトロピツクイオ
ンを含む塩や、食塩、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、塩化マグネシウム、硫安等、(3)緩衝液およ
び塩の濃度、(4)添加剤；(A)アルギニン、リジン等
の塩基性アミノ酸およびオルニチン、ε−アミノ
カプロン酸等の塩基性アミノ酸類似物質、(B)ベン
ズアミジン等のトリプシン様酵素に対する拮抗阻
害剤、(C)アミン類、アルコール類等の求核試薬、
(D)尿素、塩酸グアニジン等の淡白変成剤、(E)
Tween80、Triton Ｘ−100等の界面活性剤、等
である。
これらは単独でも、２種以上の混合物としても
使用できる。
使用できる。
一本鎖tPAと二本鎖tPAとを吸着したETI担体
から一本鎖tPAを特異的に溶離するPH領域は、と
くに限定されるものではない。溶離液に使用する
緩衝液、塩の種類やそれらの濃度、必要に応じて
添加する添加剤の種類や濃度により溶離効果が変
動し、その上、ETIを担持させる担体の種類、担
持方法によつても溶離効果は変動するので、最適
のPH領域も変動する。通常、一本鎖tPAを特異的
に溶離するPH領域の下限は、約４から約５付近に
あり、一本鎖tPAを特異的に溶離するには、これ
以上の領域のPHの溶離液が使用すればよい。ま
た、一本鎖tPAを溶離後、さらにETI担体から一
本鎖tPAおよび二本鎖tPAを溶離するPH領域も、
同様に限定されない。一般には、一本鎖tPAを特
異的に溶離させた後、未だETI担体に吸着したま
まの一本鎖tPAと二本鎖tPAを溶離させるので、
一本鎖tPAも溶離し、更に二本鎖tPAを溶離させ
るに充分なPH領域であればよく、通常、約４から
約５付近から、それ以下のPH領域であれば一本鎖
tPAと二本鎖tPAとを溶離させることができる。
から一本鎖tPAを特異的に溶離するPH領域は、と
くに限定されるものではない。溶離液に使用する
緩衝液、塩の種類やそれらの濃度、必要に応じて
添加する添加剤の種類や濃度により溶離効果が変
動し、その上、ETIを担持させる担体の種類、担
持方法によつても溶離効果は変動するので、最適
のPH領域も変動する。通常、一本鎖tPAを特異的
に溶離するPH領域の下限は、約４から約５付近に
あり、一本鎖tPAを特異的に溶離するには、これ
以上の領域のPHの溶離液が使用すればよい。ま
た、一本鎖tPAを溶離後、さらにETI担体から一
本鎖tPAおよび二本鎖tPAを溶離するPH領域も、
同様に限定されない。一般には、一本鎖tPAを特
異的に溶離させた後、未だETI担体に吸着したま
まの一本鎖tPAと二本鎖tPAを溶離させるので、
一本鎖tPAも溶離し、更に二本鎖tPAを溶離させ
るに充分なPH領域であればよく、通常、約４から
約５付近から、それ以下のPH領域であれば一本鎖
tPAと二本鎖tPAとを溶離させることができる。
上記した各種添加剤のうち、アルギニン、ベン
ズアミジン、尿素または塩酸グアニニジン等を添
加すると、一本鎖tPAと二本鎖tPAとの分離効果
は一段と向上する。これらの添加剤を添加した場
合、さらに添加剤の添加によつて一本鎖tPAを特
異的に溶離するPH領域は変動し、最適のPH領域は
限定的ではないが、通常約PH4.5からPH６の範囲
であつて、PH4.5より低いPHの液によつて一本鎖
tPAと二本鎖tPとを溶離させることができる。
ズアミジン、尿素または塩酸グアニニジン等を添
加すると、一本鎖tPAと二本鎖tPAとの分離効果
は一段と向上する。これらの添加剤を添加した場
合、さらに添加剤の添加によつて一本鎖tPAを特
異的に溶離するPH領域は変動し、最適のPH領域は
限定的ではないが、通常約PH4.5からPH６の範囲
であつて、PH4.5より低いPHの液によつて一本鎖
tPAと二本鎖tPとを溶離させることができる。
一本鎖tPAを溶離させるためのアルギニン、ベ
ンズアミジン、尿素または塩酸グアニジン等の使
用濃度は1mMからそれらの溶解限界濃度までが
使用できる。例えば、PH4.5からPH6.0の範囲にお
いて、アルギニンまたはベンズアミジンの濃度は
PH4.5に近づく程近い濃度が使用でき、PH６に近
づく程高い濃度が必要となる。
ンズアミジン、尿素または塩酸グアニジン等の使
用濃度は1mMからそれらの溶解限界濃度までが
使用できる。例えば、PH4.5からPH6.0の範囲にお
いて、アルギニンまたはベンズアミジンの濃度は
PH4.5に近づく程近い濃度が使用でき、PH６に近
づく程高い濃度が必要となる。
ここで使用するアルギニンまたはベンズアミジ
ンが、セリンプロテエーゼの一種のトリプシン様
酵素の活性中心に拮抗的に結合した複合体を解離
させることは知られており、また尿素または塩酸
グアニジンは蛋白質変性剤であり、プロテアーゼ
とその蛋白性阻害剤との複合体を解離させること
が知られているが、一本鎖tPAと二本鎖tPAの分
離に効果を示すことは全く知られていない新規な
効果である。
ンが、セリンプロテエーゼの一種のトリプシン様
酵素の活性中心に拮抗的に結合した複合体を解離
させることは知られており、また尿素または塩酸
グアニジンは蛋白質変性剤であり、プロテアーゼ
とその蛋白性阻害剤との複合体を解離させること
が知られているが、一本鎖tPAと二本鎖tPAの分
離に効果を示すことは全く知られていない新規な
効果である。
使用する溶離液は、上記の緩衝液、塩等から目
的に合わせて選択した種類および濃度とし、必要
に応じて添加剤を加え、選択されたPH領域のもの
を調製する。
的に合わせて選択した種類および濃度とし、必要
に応じて添加剤を加え、選択されたPH領域のもの
を調製する。
本発明の方法において、ETI担体に吸着した一
本鎖tPAと二本鎖tPAとをそれぞれ溶離させる操
作はバツチ法またはカラム法等が適用できる。
本鎖tPAと二本鎖tPAとをそれぞれ溶離させる操
作はバツチ法またはカラム法等が適用できる。
バツチ法の場合、一本鎖tPAを特異的に溶離す
るにように設定したPH領域に調製された溶離液
と、一本鎖tPAと二本鎖tPAとを吸着したETI担
体とを攪拌混合し静置する。この操作により一本
鎖tPAはETI担体から溶離され、上澄液中に移行
する。この上澄液を回収して一本鎖tPAを高純度
で得ることができる。一方、もし溶離されないで
残つた一本鎖tPAが存在するならこの一本鎖tPA
と二本鎖tPAとを吸着したETI担体は、一本鎖
tPAと二本鎖tPAとを溶離するようなPH領域に調
整して調製された溶離液と攪拌混合し静置する。
るにように設定したPH領域に調製された溶離液
と、一本鎖tPAと二本鎖tPAとを吸着したETI担
体とを攪拌混合し静置する。この操作により一本
鎖tPAはETI担体から溶離され、上澄液中に移行
する。この上澄液を回収して一本鎖tPAを高純度
で得ることができる。一方、もし溶離されないで
残つた一本鎖tPAが存在するならこの一本鎖tPA
と二本鎖tPAとを吸着したETI担体は、一本鎖
tPAと二本鎖tPAとを溶離するようなPH領域に調
整して調製された溶離液と攪拌混合し静置する。
この操作により一本鎖tPAを含むこともある二
本鎖tPAがETI担体から溶離され、上澄液中に移
行する。この上澄液を回収して一本鎖tPAを含む
こともある二本鎖tPAを得ることができる。一本
鎖tPAを含む主として二本鎖tPAからなるtPA
は、必要に応じて適当な方法で一本鎖tPAと二本
鎖tPAとを、さらに分離すればよい。
本鎖tPAがETI担体から溶離され、上澄液中に移
行する。この上澄液を回収して一本鎖tPAを含む
こともある二本鎖tPAを得ることができる。一本
鎖tPAを含む主として二本鎖tPAからなるtPA
は、必要に応じて適当な方法で一本鎖tPAと二本
鎖tPAとを、さらに分離すればよい。
カラム法の場合、同じく一本鎖tPAを特異的に
溶離するように設定したPH領域に調製された溶離
液を、一本鎖tPAと二本鎖tPAとを吸着したETI
担体を充填したカラムに流し、一本鎖tPAをETI
担体から溶離させ、溶離液中に溶解させて一本鎖
tPAを高純度で得ることができる。つづいて、一
本鎖tPAと二本鎖tPAと溶離するPH領域の溶離液
を流す、これによりETI担体に吸着されたまま残
つていこともある一本鎖tPAと二本鎖tPAとを溶
離させ、溶離液中に溶解させて一本鎖tPAを含む
こともある二本鎖tPAを得ることができる。一本
鎖tPAを含む主として二本鎖tPAからなるtPA
は、必要に応じて適当な方法で一本鎖tPAと二本
鎖tPAとを、さらに分離すればよい。
溶離するように設定したPH領域に調製された溶離
液を、一本鎖tPAと二本鎖tPAとを吸着したETI
担体を充填したカラムに流し、一本鎖tPAをETI
担体から溶離させ、溶離液中に溶解させて一本鎖
tPAを高純度で得ることができる。つづいて、一
本鎖tPAと二本鎖tPAと溶離するPH領域の溶離液
を流す、これによりETI担体に吸着されたまま残
つていこともある一本鎖tPAと二本鎖tPAとを溶
離させ、溶離液中に溶解させて一本鎖tPAを含む
こともある二本鎖tPAを得ることができる。一本
鎖tPAを含む主として二本鎖tPAからなるtPA
は、必要に応じて適当な方法で一本鎖tPAと二本
鎖tPAとを、さらに分離すればよい。
これらの方法において、カラムへの溶離液の流
れは、上昇流または下降流のいずれでもよく、ま
た、流速に左右されずにtPAを溶離できる。しか
し、流速が速くなるとtPA溶出がブロードになる
傾向となるので好ましくない。
れは、上昇流または下降流のいずれでもよく、ま
た、流速に左右されずにtPAを溶離できる。しか
し、流速が速くなるとtPA溶出がブロードになる
傾向となるので好ましくない。
tPAの溶離は、tPAが安定である温度範囲、好
ましくは溶離液が凍結しない温度から室温の範囲
で実施する。
ましくは溶離液が凍結しない温度から室温の範囲
で実施する。
（作用）
この本発明の方法は、tPAを産生する細胞の種
類に関係なく適用可能である。すなわち、本発明
の方法によれば、メラノーマ細胞、ヒト正常細胞
および遺伝子組み換え技法を用いてヒトtPA遺伝
子を組み込んだ細胞等を用いて産生したtPAのい
ずれからも一本鎖tPA、二本鎖tPAを分離し精製
することが可能である。その上、培養培地の組成
にかかわらず、つまり血清添加培地からも血清無
添加培地と同様に一本鎖tPAと二本鎖tPAの分離
精製が可能である。
類に関係なく適用可能である。すなわち、本発明
の方法によれば、メラノーマ細胞、ヒト正常細胞
および遺伝子組み換え技法を用いてヒトtPA遺伝
子を組み込んだ細胞等を用いて産生したtPAのい
ずれからも一本鎖tPA、二本鎖tPAを分離し精製
することが可能である。その上、培養培地の組成
にかかわらず、つまり血清添加培地からも血清無
添加培地と同様に一本鎖tPAと二本鎖tPAの分離
精製が可能である。
このようなカラムを用いて一本鎖tPAと二本鎖
tPAとを分離し、かつ各々を単離できるのは、全
く新規に見出された方法である。
tPAとを分離し、かつ各々を単離できるのは、全
く新規に見出された方法である。
（実施例）
以下、本発明の方法を実施例によつて具体的に
説明する。
説明する。
実施例 １
親和試薬（ETI試剤）の調製：
本発明で用いるETI試剤は、以下のようにして
セフアローズカラムに調製して用いた。エリスリ
ナラテイシイマ種子をジヨーベール（Joubert）
らの方法（FJ.joubert et al、Heppe−Seyler′s
Z.Physiol.Chem.、362、531〜538、1981）にした
がつて採集し加工した。取水を擦り潰し、脱脂
し、0.5M／食塩水溶液により10℃で一夜抽出
した。
セフアローズカラムに調製して用いた。エリスリ
ナラテイシイマ種子をジヨーベール（Joubert）
らの方法（FJ.joubert et al、Heppe−Seyler′s
Z.Physiol.Chem.、362、531〜538、1981）にした
がつて採集し加工した。取水を擦り潰し、脱脂
し、0.5M／食塩水溶液により10℃で一夜抽出
した。
抽出液を遠心分離し、残渣を除去し、得られた
上澄液を硫酸アンモニウム沈澱し沈澱物を回収
し、続いてセフアデツクスＧ−50、DEAE−セル
ロースおよびDEAE−セフアローズのクロマトグ
ラフイーにかけた。
上澄液を硫酸アンモニウム沈澱し沈澱物を回収
し、続いてセフアデツクスＧ−50、DEAE−セル
ロースおよびDEAE−セフアローズのクロマトグ
ラフイーにかけた。
こうして得られた精製物は、0.1％ドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）を含有する15％ポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動に付すと、見掛けの分子
量22000ダルトンの単一バンドとして移動した。
酸ナトリウム（SDS）を含有する15％ポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動に付すと、見掛けの分子
量22000ダルトンの単一バンドとして移動した。
上記の精製物を臭化シアン活性化アガロースに
通常方法で結合させた。これを使用し、次のよう
にして一本鎖および二本鎖tPAを精製した。
通常方法で結合させた。これを使用し、次のよう
にして一本鎖および二本鎖tPAを精製した。
ボウズ（Bowes）メラノーマ細胞（ATCC
CRL 1424G361）培養液〔10％熱不活性化（56
℃、30分間）胎児牛血清およびアプロチニン
（20KIU／ml）を含む〕２をTween80（0.02％）
および食塩（1M／）で安定化後、ETI−セフ
アローズ（25mgETI／５ml樹脂）カラムに適用し
た。
CRL 1424G361）培養液〔10％熱不活性化（56
℃、30分間）胎児牛血清およびアプロチニン
（20KIU／ml）を含む〕２をTween80（0.02％）
および食塩（1M／）で安定化後、ETI−セフ
アローズ（25mgETI／５ml樹脂）カラムに適用し
た。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フイブリ
ン溶解活性を測定した。カラムに適用された活性
の10％が認められた。
ン溶解活性を測定した。カラムに適用された活性
の10％が認められた。
この画分はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動後のザイモグラフイーで調べると、プラスミノ
ーゲンアクチベーターとして11万±２万ダルトン
および約７万ダルトンの二種類のバンドが認めら
れた。
動後のザイモグラフイーで調べると、プラスミノ
ーゲンアクチベーターとして11万±２万ダルトン
および約７万ダルトンの二種類のバンドが認めら
れた。
この後、ETI−セフアローズカラムを、20倍カ
ラム容量の0.2％Tween80を含む2M食塩水でカラ
ムを洗つた。この方法により、カラムに適用され
た活性の約５％が検出され、ザイモグラム上で11
万±２万および約７万ダルトンのバンドがプラス
ミノーゲンアクチベーターとして認められた。
ラム容量の0.2％Tween80を含む2M食塩水でカラ
ムを洗つた。この方法により、カラムに適用され
た活性の約５％が検出され、ザイモグラム上で11
万±２万および約７万ダルトンのバンドがプラス
ミノーゲンアクチベーターとして認められた。
吸着した蛋白質は、0.2Mベンズアミジンと
0.15M食塩を含む0.5Mベロナール緩衝液を用い、
PH6.5からPH3.0までのリニアグラジエント法で溶
出した。
0.15M食塩を含む0.5Mベロナール緩衝液を用い、
PH6.5からPH3.0までのリニアグラジエント法で溶
出した。
この方法によりPH6.0からPH4.5の範囲で一つの
ピークが得られ、またPHからPH3.5の範囲でもう
一つのピークが得られた。この二つの画分をあわ
せるとカラムに適用した活性の80〜85％を示し
た。
ピークが得られ、またPHからPH3.5の範囲でもう
一つのピークが得られた。この二つの画分をあわ
せるとカラムに適用した活性の80〜85％を示し
た。
メルカプトエタノールで還元した試料をポリア
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べた結
果、PH6.0からPHの範囲で溶出されるものは還元
しても分子量に変化はなく約７万ダルトンを示し
たが、PH4.5からPH3.5の範囲で溶出されるものは
還元すると大部分の約７万ダルトンのバンドは消
失し、３万から４万ダルトン付近にバンドが出現
した。
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べた結
果、PH6.0からPHの範囲で溶出されるものは還元
しても分子量に変化はなく約７万ダルトンを示し
たが、PH4.5からPH3.5の範囲で溶出されるものは
還元すると大部分の約７万ダルトンのバンドは消
失し、３万から４万ダルトン付近にバンドが出現
した。
この結果からPHからPH4.5の範囲で溶出される
tPAは一本鎖tPAであり、PH4.5からPH3.5の範囲
で溶出されるtPAはほとんど二本鎖tPAと認めら
れた。なお、カラム操作は室温で行つた。
tPAは一本鎖tPAであり、PH4.5からPH3.5の範囲
で溶出されるtPAはほとんど二本鎖tPAと認めら
れた。なお、カラム操作は室温で行つた。
実施例 ２
ボウズ（Bowes）メラノーマ細胞（ATCC
CRL 1424 G361）を10％熱不活性化（56℃、30
分間）胎児牛血清を補充したRPMI−1640組織培
養媒体中で培養後、培養物を一度洗い血清を含ま
ない媒体中で24時間培養後、媒体を集め、収穫液
とした。収穫液50に最終濃度1Mになるように
食塩を加えた、この液を1.0M食塩を含む0.05M
リン酸緩衝液PH7.5で平衡化したETI−ポリアク
リルアミドゲルカラム（250mgETI／50ml樹脂）
に通した。全培養液をカラムに通貨させた後、
2M食塩を含む0.05Mリン酸緩衝液PH7.5でカラム
を洗つた。カラムの通過液及び洗浄液を合わせ、
プラスミノーゲン依存フイブリン溶解活性を測定
したところ、カラムにかけた全活性の約10％が検
出された。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
後のザイモグラム上で分子量11万±２万ダルトン
のバンドが確認された。カラムに吸着した蛋白は
0.5Mチオシアン酸アンモニウムを含む0.05
NaH2PO4−NaOH溶液（PH5.0）で溶出した。こ
の方法によりカラムにかけた活性の約50％が溶出
液中に回収され、SDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動後の銀染色で分子量７万ダルトンの単一バ
ンドが確認され、メルカプトエタノールによる還
元でも低分子量のバンドは検出されなかつた。
CRL 1424 G361）を10％熱不活性化（56℃、30
分間）胎児牛血清を補充したRPMI−1640組織培
養媒体中で培養後、培養物を一度洗い血清を含ま
ない媒体中で24時間培養後、媒体を集め、収穫液
とした。収穫液50に最終濃度1Mになるように
食塩を加えた、この液を1.0M食塩を含む0.05M
リン酸緩衝液PH7.5で平衡化したETI−ポリアク
リルアミドゲルカラム（250mgETI／50ml樹脂）
に通した。全培養液をカラムに通貨させた後、
2M食塩を含む0.05Mリン酸緩衝液PH7.5でカラム
を洗つた。カラムの通過液及び洗浄液を合わせ、
プラスミノーゲン依存フイブリン溶解活性を測定
したところ、カラムにかけた全活性の約10％が検
出された。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
後のザイモグラム上で分子量11万±２万ダルトン
のバンドが確認された。カラムに吸着した蛋白は
0.5Mチオシアン酸アンモニウムを含む0.05
NaH2PO4−NaOH溶液（PH5.0）で溶出した。こ
の方法によりカラムにかけた活性の約50％が溶出
液中に回収され、SDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動後の銀染色で分子量７万ダルトンの単一バ
ンドが確認され、メルカプトエタノールによる還
元でも低分子量のバンドは検出されなかつた。
このことにより、この画分に二本鎖tPAが含ま
れていないことが確認された。一方、残りの吸着
蛋白は0.5M食塩を含む0.1Mグリシン−塩酸緩衝
液PH3.5で溶離した。この方法によりカラムにか
けた活性の約40％が溶出液中に確認され、SDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で分子
量７万ダルトンおよび約３万ダルトンのバンドが
確認され、メルカプトエタノールによる還元後の
試料では約７万ダルトンのバントはほとんど消失
し、新たに分子量約３万〜４万ダルトンの範囲で
バンドが確認された。このことより、この画分は
ほとんど二本鎖tPAであることが確認された。な
お、カラム操作はすべて４℃で行つた。
れていないことが確認された。一方、残りの吸着
蛋白は0.5M食塩を含む0.1Mグリシン−塩酸緩衝
液PH3.5で溶離した。この方法によりカラムにか
けた活性の約40％が溶出液中に確認され、SDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で分子
量７万ダルトンおよび約３万ダルトンのバンドが
確認され、メルカプトエタノールによる還元後の
試料では約７万ダルトンのバントはほとんど消失
し、新たに分子量約３万〜４万ダルトンの範囲で
バンドが確認された。このことより、この画分は
ほとんど二本鎖tPAであることが確認された。な
お、カラム操作はすべて４℃で行つた。
実施例 ３
人胎児包皮細胞（Flow7000：大日本製薬社品）
培養液〔10％、熱不活性化（56℃、30分間）胎児
牛血清およびアプロチニン（20KIU／ml）を含
む〕２をTween80（0.02％）および1M食塩で安
定化後、ETIを臭化シアン活性化アガロースに固
定化したETIセフアローズカラム（25mgETI／５
ml樹脂）に適用した。
培養液〔10％、熱不活性化（56℃、30分間）胎児
牛血清およびアプロチニン（20KIU／ml）を含
む〕２をTween80（0.02％）および1M食塩で安
定化後、ETIを臭化シアン活性化アガロースに固
定化したETIセフアローズカラム（25mgETI／５
ml樹脂）に適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フイブリ
ン溶解活性を測定したところカラムに適用された
活性の約45％が認められた。
ン溶解活性を測定したところカラムに適用された
活性の約45％が認められた。
この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動後のザイモグラフイーで調べたところ、プラス
ミノーゲンアクチベーターとして10万ダルトン付
近に２〜３本、５〜７万ダルトン付近に２〜３
本、３万５千ダルトン付近に１本のバンドが認め
られた。
動後のザイモグラフイーで調べたところ、プラス
ミノーゲンアクチベーターとして10万ダルトン付
近に２〜３本、５〜７万ダルトン付近に２〜３
本、３万５千ダルトン付近に１本のバンドが認め
られた。
tPAを吸着したETI−セフアローズカラムの洗
浄に2.0M食塩を含む20倍カラム容量の0.1M
Na2HPO4−NaOH緩衝液（PH9.5）でカラムを洗
つた。
浄に2.0M食塩を含む20倍カラム容量の0.1M
Na2HPO4−NaOH緩衝液（PH9.5）でカラムを洗
つた。
この方法によりカラムに適用された活性の約５
％が検出され、ザイモグラム上で上記と同じバン
ドが認められた。
％が検出され、ザイモグラム上で上記と同じバン
ドが認められた。
溶離緩衝液は、0.3Mリジンと0.15M食塩を含
む0.1Mリン酸緩衝液（PH5.5）と0.15M食塩を含
む0.2Mクエン酸緩衝液（PH3.0）を使用した。
む0.1Mリン酸緩衝液（PH5.5）と0.15M食塩を含
む0.2Mクエン酸緩衝液（PH3.0）を使用した。
分離されたPHの異なる２種の画分をあわせると
カラムに適用された活性の40〜50％を示した。
カラムに適用された活性の40〜50％を示した。
メルカプトエタノールで還元した試料をポリア
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH5.5で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく約７万ダルトンを示したが、PH3.0
で溶出されるものは還元すると約７万ダルトンの
バンドはほとんど消失し３万から４万付近にバン
ドが出現した。
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH5.5で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく約７万ダルトンを示したが、PH3.0
で溶出されるものは還元すると約７万ダルトンの
バンドはほとんど消失し３万から４万付近にバン
ドが出現した。
この結果からPH5.5で溶出されるtPAは一本鎖
tPAであり、PH3.0で溶出されるtPAは二本鎖の
tPAであると認めた。なお、カラム操作は室温で
行つた。
tPAであり、PH3.0で溶出されるtPAは二本鎖の
tPAであると認めた。なお、カラム操作は室温で
行つた。
実施例 ４
ヒトtPA遺伝子（特開昭60−264918）を組み込
んだマウス繊維芽細胞（Mo−use C1271 ATCC
CRL 1616）の培養液〔２％、熱不活性化（56
℃、30分間）胎児牛血清およびアプロチニン
（20KIU／ml）を含む〕２を1M食塩で安定化
後、ETIを臭化シアン活性アガロースに固定化し
たETIセフアローズカラム（25mgETI／５ml樹
脂）に適用した。
んだマウス繊維芽細胞（Mo−use C1271 ATCC
CRL 1616）の培養液〔２％、熱不活性化（56
℃、30分間）胎児牛血清およびアプロチニン
（20KIU／ml）を含む〕２を1M食塩で安定化
後、ETIを臭化シアン活性アガロースに固定化し
たETIセフアローズカラム（25mgETI／５ml樹
脂）に適用した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フイブリ
ン溶解活性を測定したところカラムに適用された
活性の約10％が認められた。
ン溶解活性を測定したところカラムに適用された
活性の約10％が認められた。
この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動後のザイモグラフイーで調べると、プラスミノ
ーゲンアクチベーターとして11万±２万および約
７万ダルトンの二種類が認められた。
動後のザイモグラフイーで調べると、プラスミノ
ーゲンアクチベーターとして11万±２万および約
７万ダルトンの二種類が認められた。
全溶液をETI−セフアローズカラムに通過させ
た後、20倍カラム容量の2.0M食塩水でカラムを
洗つた。この方法によりカラムに適用された活性
の約５％が検出され、ザイモグラム上で11万±２
万および約７万ダルトンのバンドがプラスミノー
ゲンアクリベーターとして認められた。
た後、20倍カラム容量の2.0M食塩水でカラムを
洗つた。この方法によりカラムに適用された活性
の約５％が検出され、ザイモグラム上で11万±２
万および約７万ダルトンのバンドがプラスミノー
ゲンアクリベーターとして認められた。
ETI−セフアローズカラムに吸着されている蛋
白質は、0.15M食塩を含む0.1Mクエン酸緩衝液
（PH4.7）と0.15M食塩を含む0.1Mクエン酸緩衝液
（PH3.0）を用いて溶出された。
白質は、0.15M食塩を含む0.1Mクエン酸緩衝液
（PH4.7）と0.15M食塩を含む0.1Mクエン酸緩衝液
（PH3.0）を用いて溶出された。
この２つの画分をあわせるとカラムに適用され
た活性の約80％を示した。
た活性の約80％を示した。
メルカプトエタノールで還元した試料をポリア
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH4.7で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく、約７万ダルトンを示したが、PH
3.0で溶出されるものは還元すると大部分の約７
万ダルトンのバンドは消失し３万から４万付近に
バンドが認められるようになつた。
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH4.7で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく、約７万ダルトンを示したが、PH
3.0で溶出されるものは還元すると大部分の約７
万ダルトンのバンドは消失し３万から４万付近に
バンドが認められるようになつた。
この結果からPH4.7で溶出されるtPAは一本鎖
tPAであり、PH3.0で溶出される。tPAは大部分
二本鎖のtPAであると認めた。なお、カラム操作
上、吸着したtPAは吸着させたときとは、逆方向
の流れで溶離し、また温度は４℃で行つた。
tPAであり、PH3.0で溶出される。tPAは大部分
二本鎖のtPAであると認めた。なお、カラム操作
上、吸着したtPAは吸着させたときとは、逆方向
の流れで溶離し、また温度は４℃で行つた。
実施例 ５
ヒトtPA遺伝子（特開昭60−264918）を組み込
んだマウス繊維芽細胞（Mouse Ｃ 1271 ETCC
CRL 1616）の培養液〔２％、熱不活性化（56
℃、30分間）胎児牛血清およびアプロチニン
（20KIU／ml）を含む〕10を1M食塩で安定化
後、ETIをAH−アガロース（Pharmacia）に固
定したETIセフアローズ（100mgETI／５ml樹脂）
を加え、４℃30分間攪拌後、ガラスフイルターで
濾過し、樹脂を集め、その後、20倍樹脂容量の
20M食塩水でこの樹脂を洗浄する。tPAを吸着し
た樹脂に、初めに2M尿素を含む0.1Mリン酸ソー
ダ緩衝液（PH6.0）、その後、0.15M食塩を含む
0.1Mクエン酸緩衝液（PH3.0）を用いてtPAを溶
離した。この２つの分画をあわせると培養収穫中
に含まれる活性の約80％を示した。
んだマウス繊維芽細胞（Mouse Ｃ 1271 ETCC
CRL 1616）の培養液〔２％、熱不活性化（56
℃、30分間）胎児牛血清およびアプロチニン
（20KIU／ml）を含む〕10を1M食塩で安定化
後、ETIをAH−アガロース（Pharmacia）に固
定したETIセフアローズ（100mgETI／５ml樹脂）
を加え、４℃30分間攪拌後、ガラスフイルターで
濾過し、樹脂を集め、その後、20倍樹脂容量の
20M食塩水でこの樹脂を洗浄する。tPAを吸着し
た樹脂に、初めに2M尿素を含む0.1Mリン酸ソー
ダ緩衝液（PH6.0）、その後、0.15M食塩を含む
0.1Mクエン酸緩衝液（PH3.0）を用いてtPAを溶
離した。この２つの分画をあわせると培養収穫中
に含まれる活性の約80％を示した。
メルカプトエタノールで還元した試料をポリア
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH6.0で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく、約７万ダルトンを示したが、PH
3.0で溶出されるものは還元すると約７万ダルト
ンのバンドは大半は消失し３万から４万付近にバ
ンドが認められるようになつた。
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH6.0で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく、約７万ダルトンを示したが、PH
3.0で溶出されるものは還元すると約７万ダルト
ンのバンドは大半は消失し３万から４万付近にバ
ンドが認められるようになつた。
この結果からPH6.0で溶出されるtPAは一本鎖
tPAであり、PH3.0で溶出されるtPAはほとんど
二本鎖のtPAであると認めた。
tPAであり、PH3.0で溶出されるtPAはほとんど
二本鎖のtPAであると認めた。
実施例 ６
ヒトtPA遺伝子を組み込んだチヤイニーズハム
スター卵母細胞（CHO）細胞（ATCC CCL61
cells）培養液〔10％熱不活性化（56℃、30分間）
胎児牛血清および40KIU／mlアプロチニンを含
む〕２に終濃度で1Mの食塩を加え、この液を
1.0M食塩を含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5）で
平衡化したETI−セフアロースカラム（25mg
ET／５ml樹脂）に通した後、2.0M食塩および10
ｍＭアルギニンを含む0.05M NaHPO4−NaOH
溶液（PH9.5）で洗浄した。
スター卵母細胞（CHO）細胞（ATCC CCL61
cells）培養液〔10％熱不活性化（56℃、30分間）
胎児牛血清および40KIU／mlアプロチニンを含
む〕２に終濃度で1Mの食塩を加え、この液を
1.0M食塩を含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5）で
平衡化したETI−セフアロースカラム（25mg
ET／５ml樹脂）に通した後、2.0M食塩および10
ｍＭアルギニンを含む0.05M NaHPO4−NaOH
溶液（PH9.5）で洗浄した。
この方法でカラムに通した活性の約10％が流出
し、ザイモグラム上で分子量11万±２万および約
７万ダルトンのバンドが確認された。
し、ザイモグラム上で分子量11万±２万および約
７万ダルトンのバンドが確認された。
吸着されている蛋白は、0.01Mアルギニンおよ
び0.1M食塩を含む0.05M NaH2PO4−NaOH溶
液（PH4.4）で溶離した。
び0.1M食塩を含む0.05M NaH2PO4−NaOH溶
液（PH4.4）で溶離した。
溶出液の活性はカラムにかけた活性の約65％を
示した。
示した。
残りの吸着蛋白は0.1M食塩を含む0.1Mクエン
酸緩衝液（PH3.0）で溶離したところ、カラムに
かけた活性の約25％を示した。
酸緩衝液（PH3.0）で溶離したところ、カラムに
かけた活性の約25％を示した。
メルカプトエタノールで還元した試料をポリア
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH4.4で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく約７万ダルトンを示したが、PH3.0
で溶出されたものは還元すると約７万ダルトンの
バンドの大半は消失し、３万から４万ダルトン付
近にバンドが出現した。
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH4.4で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく約７万ダルトンを示したが、PH3.0
で溶出されたものは還元すると約７万ダルトンの
バンドの大半は消失し、３万から４万ダルトン付
近にバンドが出現した。
この結果からPH4.4で溶出されるtPAは一本鎖
tPAであり、PH3.0で溶出されたtPAはほとんど
二本鎖tPAであると認めた。
tPAであり、PH3.0で溶出されたtPAはほとんど
二本鎖tPAであると認めた。
実施例 ７
ヒトtPA遺伝子を組み込んだチヤイニーズハム
スター卵母細胞（CHO）細胞（ATCC CCL61）
培養液〔10％熱不活性化（56℃、30分間）胎児牛
血清および40KIU／mlアプロチニンを含む〕50
に終濃度で1Mの食塩を加え、この液にETIセ
フアローズ（1.0ｇETI／50ml樹脂）を加え、４
℃で30分間攪拌後ガラスフイルターで濾過し、樹
脂を集め、その後、2.0M食塩を含む0.05M
Na2HPO4溶液（PH9.5）で洗浄した。tPAを吸着
した樹脂をカラムに詰めた後、吸着されている蛋
白は、２％エタノールおよび0.1M食塩を含む
0.05M乳酸緩衝液（PH4.8）で溶離した。
スター卵母細胞（CHO）細胞（ATCC CCL61）
培養液〔10％熱不活性化（56℃、30分間）胎児牛
血清および40KIU／mlアプロチニンを含む〕50
に終濃度で1Mの食塩を加え、この液にETIセ
フアローズ（1.0ｇETI／50ml樹脂）を加え、４
℃で30分間攪拌後ガラスフイルターで濾過し、樹
脂を集め、その後、2.0M食塩を含む0.05M
Na2HPO4溶液（PH9.5）で洗浄した。tPAを吸着
した樹脂をカラムに詰めた後、吸着されている蛋
白は、２％エタノールおよび0.1M食塩を含む
0.05M乳酸緩衝液（PH4.8）で溶離した。
溶出液の活性は培養収穫液中に含まれる活性の
約60％を示した。
約60％を示した。
残りの吸着蛋白は0.1M食塩を含む0.1M乳酸緩
衝液（PH3.0）で溶離したところ、培養収穫液中
に含まれる活性の約25％を示した。
衝液（PH3.0）で溶離したところ、培養収穫液中
に含まれる活性の約25％を示した。
メルカプトエタノールで還元した試料をポリア
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH4.8で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく約７万ダルトンを示したが、PH3.0
で溶出されたものは還元すると約７万ダルトンの
バンドは大部分消失し、３万から４万ダルトン付
近にバンドが出現した。
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH4.8で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく約７万ダルトンを示したが、PH3.0
で溶出されたものは還元すると約７万ダルトンの
バンドは大部分消失し、３万から４万ダルトン付
近にバンドが出現した。
この結果からPH4.8で溶出されるtPAは一本鎖
tPAであり、PH3.0で溶出されたtPAは大部分二
本鎖tPAであると認めた。
tPAであり、PH3.0で溶出されたtPAは大部分二
本鎖tPAであると認めた。
実施例 ８
ヒトtPA発言プロモーターとしてヒトサイトメ
ガロウイルス（HCMV）を用い、ヒトtPA遺伝
子を組み込んだヒト胎児羊膜細胞（FL、ATCC
CCL−62）培養液〔２％熱不活性化（56℃、30
分間）胎児牛血清および20KIU／mlアプロチニ
ンを含む〕２に終濃度1Mの食塩を加えた後、
ETIを臭化シアン活性化アガロースに固定化した
ETIセフアローズカラム（25mgETI／５ml樹脂）
に通した。
ガロウイルス（HCMV）を用い、ヒトtPA遺伝
子を組み込んだヒト胎児羊膜細胞（FL、ATCC
CCL−62）培養液〔２％熱不活性化（56℃、30
分間）胎児牛血清および20KIU／mlアプロチニ
ンを含む〕２に終濃度1Mの食塩を加えた後、
ETIを臭化シアン活性化アガロースに固定化した
ETIセフアローズカラム（25mgETI／５ml樹脂）
に通した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フイブリ
ン溶解活性を測定したところカラムに適用された
活性の約10％が認められた。
ン溶解活性を測定したところカラムに適用された
活性の約10％が認められた。
この画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動後のザイモグラフイーで調べると、プラスミノ
ーゲンアクチベーターとして11万±２万および約
７万ダルトンの二種類が認められた。
動後のザイモグラフイーで調べると、プラスミノ
ーゲンアクチベーターとして11万±２万および約
７万ダルトンの二種類が認められた。
全溶液をETI−セフアローズカラムに通過させ
た後、20倍カラム容量の2.0M食塩水でカラムを
洗つた。この方法によりカラムに適用された活性
の約５％が検出され、ザイムグラム上に11万±２
万および約７万ダルトンのバンドがプラスミノー
ゲンアクチベーターとして認められた。
た後、20倍カラム容量の2.0M食塩水でカラムを
洗つた。この方法によりカラムに適用された活性
の約５％が検出され、ザイムグラム上に11万±２
万および約７万ダルトンのバンドがプラスミノー
ゲンアクチベーターとして認められた。
ETI−セフアローズカラムに吸着されている蛋
白質は、0.3Mアルギニンと0.15M食塩を含む
0.1M酢酸緩衝液（PH5.5）と．0.15M食塩を含む
0.1Mクエン酸緩衝液（PH3.0）を用いて溶出され
た。この２つの画分をあわせるとカラムに適用さ
れた活性の約80％を示した。
白質は、0.3Mアルギニンと0.15M食塩を含む
0.1M酢酸緩衝液（PH5.5）と．0.15M食塩を含む
0.1Mクエン酸緩衝液（PH3.0）を用いて溶出され
た。この２つの画分をあわせるとカラムに適用さ
れた活性の約80％を示した。
メルカプトエタノールで還元した試料をポリア
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH5.5で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく、約７万ダルトンを示したが、PH
3.0で溶出されるものは還元すると大部分の約７
万ダルトンのバンドは大部分消失し３万から４万
付近にバンドが認められるようになつた。
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べる
と、PH5.5で溶出されるものは還元しても分子量
に変化はなく、約７万ダルトンを示したが、PH
3.0で溶出されるものは還元すると大部分の約７
万ダルトンのバンドは大部分消失し３万から４万
付近にバンドが認められるようになつた。
この結果からPH5.5で溶出されるtPAは一本鎖
tPAであり、PH3.0で溶出されるtPAは大部分二
本鎖のtPAであると認めた。
tPAであり、PH3.0で溶出されるtPAは大部分二
本鎖のtPAであると認めた。
実施例 ９
ヒトtPA遺伝子を組み込んで形質転換された宿
主酵母細胞（Saccharomyces cerevisiae）を、
公知の方法（Principles and Practice of
Recombin ant DNA Reserch with Yeast in
The Molecular Biology of Yeast
Saccharomyces：Metabolism and Gene
Expression、pp603−636、Cold Spring Harbor
Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.
（1982））に記載の方法で増殖させた。
主酵母細胞（Saccharomyces cerevisiae）を、
公知の方法（Principles and Practice of
Recombin ant DNA Reserch with Yeast in
The Molecular Biology of Yeast
Saccharomyces：Metabolism and Gene
Expression、pp603−636、Cold Spring Harbor
Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.
（1982））に記載の方法で増殖させた。
細胞はガラスビーズを用いて破砕し、tPAを
1M食塩および0.02％Tween80を含む0.05Mリン
酸緩衝液（PH7.5）で抽出し、抽出液を濾過して
濾液を得た。
1M食塩および0.02％Tween80を含む0.05Mリン
酸緩衝液（PH7.5）で抽出し、抽出液を濾過して
濾液を得た。
この液１をETI−セフアローズカラム（25mg
ETI／５mlセフアローズ）に通した。その後、20
倍カラム容量の0.02％Tween80を含む2.0M食塩
水で洗浄する。吸着したtPAは、初めに0.02％
Tween80および0.5M硫安を含む0.1Mクエン酸緩
衝液（PH5.0）その後0.02％Tween80および0.1M
食塩を含む0.1Mクエン酸緩衝液（PH3.0）を用い
て溶出した。
ETI／５mlセフアローズ）に通した。その後、20
倍カラム容量の0.02％Tween80を含む2.0M食塩
水で洗浄する。吸着したtPAは、初めに0.02％
Tween80および0.5M硫安を含む0.1Mクエン酸緩
衝液（PH5.0）その後0.02％Tween80および0.1M
食塩を含む0.1Mクエン酸緩衝液（PH3.0）を用い
て溶出した。
メルカプトエタノールで還元した試料をポリア
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べた結
果、PH5.0から溶出されるものは還元しても分子
量に変化はなく約７万ダルトンを示したが、PH
3.0から溶出されるものは還元すると約７万ダル
トンのバンドは大部分消失し３万から４万ダルト
ン付近にバンドが発生した。
クリルアミドゲル電気泳動後の銀染色で調べた結
果、PH5.0から溶出されるものは還元しても分子
量に変化はなく約７万ダルトンを示したが、PH
3.0から溶出されるものは還元すると約７万ダル
トンのバンドは大部分消失し３万から４万ダルト
ン付近にバンドが発生した。
この結果からPH5.0で溶出されるtPAは一本鎖
tPAであり、PH3.0で溶出されるtPAはほとんど
二本鎖tPAであると認められた。
tPAであり、PH3.0で溶出されるtPAはほとんど
二本鎖tPAであると認められた。
Claims (1)
- １ 一本鎖tPAと二本鎖tPAを含む水性媒体を、
一旦、ETIを担持した担体と接触させてこれら
tPAを吸着させ、その後、特異的に一本鎖tPAを
溶離するPH領域で一本鎖tPAを溶離し、次いで、
一本鎖tPAおよび二本鎖tPAを溶離するPH領域で
一本鎖tPAと二本鎖tPAまたは二本鎖tPAを溶離
することを特徴とする一本鎖tPAと二本鎖tPAを
分離する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62194332A JPS6463378A (en) | 1986-08-11 | 1987-08-05 | Separation of single stranded tpa and double standard tpa |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18685086 | 1986-08-11 | ||
| JP11597687 | 1987-05-14 | ||
| JP62194332A JPS6463378A (en) | 1986-08-11 | 1987-08-05 | Separation of single stranded tpa and double standard tpa |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6463378A JPS6463378A (en) | 1989-03-09 |
| JPH0556951B2 true JPH0556951B2 (ja) | 1993-08-20 |
Family
ID=26454387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62194332A Granted JPS6463378A (en) | 1986-08-11 | 1987-08-05 | Separation of single stranded tpa and double standard tpa |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4978620A (ja) |
| EP (1) | EP0276328B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6463378A (ja) |
| AU (1) | AU594186B2 (ja) |
| DE (1) | DE3784688D1 (ja) |
| DK (1) | DK196288A (ja) |
| FI (1) | FI881653A7 (ja) |
| NO (1) | NO881454L (ja) |
| WO (1) | WO1988001294A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6001355A (en) * | 1982-12-14 | 1999-12-14 | Dowdle; Eugene Bernard Davey | Pro-tPA for the treatment of thrombosis, embolism and related conditions |
| DE3903581A1 (de) * | 1989-02-07 | 1990-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gewebs-plasminogenaktivator-derivat |
| WO1991008303A1 (fr) * | 1989-11-28 | 1991-06-13 | Teijin Limited | Anticorps contre l'activateur de plasminogene tissulaire bicatenaire humain |
| US5731186A (en) * | 1996-02-05 | 1998-03-24 | Schering Aktiengesellschaft | Method for the production of rDSPA α1 |
| JP2002267642A (ja) * | 2001-03-13 | 2002-09-18 | Tosoh Corp | アルカリ土類金属イオン測定用イオンクロマトグラフィー溶離液およびそれを用いたアルカリ土類金属イオン分析方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU554862B2 (en) * | 1982-12-14 | 1986-09-04 | Implico B.V. | Plasminogen activator isolated by affinity chromatography |
| EP0112122B1 (en) * | 1982-12-14 | 1991-08-28 | South African Inventions Development Corporation | Plasminogen activator |
| PH22337A (en) * | 1983-11-21 | 1988-08-12 | Ciba Geigy Ag | Synthesis of fibrinolytic agents by yeast |
| JPS60168601A (ja) * | 1984-02-14 | 1985-09-02 | 田之内 寅雄 | 外周駆動ロ−ラを備えたベニヤレ−スに於ける駆動力伝達装置 |
| JPS6229975A (ja) * | 1985-08-01 | 1987-02-07 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 粗ｔＰＡの精製法 |
| AU606582B2 (en) * | 1985-09-06 | 1991-02-14 | Codon | Methods for the recovery of tissue plasminogen activator |
| IL80230A (en) * | 1985-10-04 | 1993-03-15 | South African Inventions | Protein binding reagent |
| JP3036282B2 (ja) * | 1993-02-08 | 2000-04-24 | トヨタ自動車株式会社 | ヒータ付き酸素濃度センサ |
-
1987
- 1987-08-05 JP JP62194332A patent/JPS6463378A/ja active Granted
- 1987-08-10 DE DE8787905281T patent/DE3784688D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-10 AU AU77565/87A patent/AU594186B2/en not_active Ceased
- 1987-08-10 EP EP87905281A patent/EP0276328B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-10 WO PCT/JP1987/000598 patent/WO1988001294A1/ja not_active Ceased
- 1987-08-10 FI FI881653A patent/FI881653A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1987-08-10 US US07/183,757 patent/US4978620A/en not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-04-05 NO NO881454A patent/NO881454L/no unknown
- 1988-04-11 DK DK196288A patent/DK196288A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI881653A0 (fi) | 1988-04-08 |
| NO881454D0 (no) | 1988-04-05 |
| EP0276328A4 (en) | 1990-04-10 |
| FI881653L (fi) | 1988-04-08 |
| FI881653A7 (fi) | 1988-04-08 |
| US4978620A (en) | 1990-12-18 |
| WO1988001294A1 (fr) | 1988-02-25 |
| EP0276328A1 (en) | 1988-08-03 |
| AU7756587A (en) | 1988-03-08 |
| DK196288D0 (da) | 1988-04-11 |
| JPS6463378A (en) | 1989-03-09 |
| NO881454L (no) | 1988-04-05 |
| EP0276328B1 (en) | 1993-03-10 |
| DK196288A (da) | 1988-04-11 |
| DE3784688D1 (de) | 1993-04-15 |
| AU594186B2 (en) | 1990-03-01 |
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