JPH06153954A - レセプター同定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明はレセプターＤＮＡ配列の単離及びク
ローニングの方法に関する。本発明は又、新規ソマトス
タチンレセプターサブタイプをコードする新規ＤＮＡ配
列も与える。 【効果】 存在量の少ないレセプターを単離及びクロー
ニングすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】Ｇタンパク質−結合レセプターのスーパー
ファミリーは、多くの生理学的機能を制御する。これら
のレセプターは外的刺激（視覚、味及び臭い）からのト
ランスメンブラン信号伝達、内分泌機能（下垂体及び副
腎）、外分泌機能（膵臓）、心拍数、脂肪分解及び炭水
化物代謝を仲介する。このファミリーのための遺伝子の
断片のみの分子クローニングにより、７個の膜スパンニ
ングドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ
ｄｏｍｅｉｎ）、機能に決定的な保存アミノ酸、及びグ
リコシル化ならびにリン酸化の部位を含む多くの構造的
及び遺伝的類似性が明らかになった。多くの場合、これ
らのレセプターのための遺伝子はイントロンを欠いてお
り、真核遺伝子の間では珍しい。Ｇタンパク質−結合レ
セプタースーパーファミリーは５つの明確な群に分ける
ことができる：（ｉ）アミンレセプター（セロトニン、
アドレナリン性など）；（ｉｉ）小ペプチドホルモン
（ソマトスタチン、ＴＲＨなど）；（ｉｉｉ）大ペプチ
ドホルモン（ＬＨ−ＣＧ、ＦＳＨなど）；（ｉｖ）セク
レチンファミリー；及び（ｖ）オドラントレセプター
（ｏｄｏｒａｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）（２）。重要
な生理学的機能又は病気の状態にかかわる、あるいは動
物の能力の増強に重要な〔例えば成長ホルモン放出因
子、コルチコトロピン放出ホルモン、コレシストキニ
ン、バソアクチブインテスティナルペプチド（高親和性
サブタイプ）のためのレセプター、〕まだクローニング
されていないレセプターの単離は、非常に有益である。

【０００２】このレセプタースーパーファミリーのメン
バーをクローニングするための現在の方法は多様であ
り、困難に満ちている。これらの方法は特定のタンパク
質が実際に問題のレセプターであるかどうか決定するた
めに全長ｃＤＮＡ又は遺伝子の単離を必要とする。例え
ば異種系（キセノプスオオサイテス（Ｘｅｎｏｐｕｓｏ
ｏｃｙｔｅｓ）など）を用いた発現クローニングは全長
ｃＤＮＡの単離を必要とする（１５）。縮重オリゴヌク
レオチドを用いたＰＣＲの使用もＧタンパク質−結合レ
セプターのクローニングに採用されてきた。しかしこの
方法はほとんどアミンレセプターのみに適用され、ペプ
チドホルモンレセプターに適用されなかった（９）。そ
の方法の主な欠点は、それを活性化するホルモンの同定
を介したレセプターの同定が何年も未知のままの場合、
“オーファン（ｏｒｐｈａｎ）”レセプターを生成する
ことである。最後にこれらのレセプターは一般に存在量
が非常に低いので、タンパク質精製が困難である。従っ
てペプチド配列データを得ることは、困難な時間のかか
る仕事である。対照的に本出願は、ＰＣＲフラグメント
がその遺伝子の起源によると同定されるまで全長ｃＤＮ
Ａの単離を必要としない系につき記載する。さらに、他
の段階と組み合わせて高度に進行的（ｐｒｏｃｅｓｓｉ
ｖｅ）なＰＣＲ法を用いることにより、存在量の低さに
よる困難を防ぐことができる。

【０００３】

【発明の要約】本発明は新規レセプターＤＮＡの単離及
び同定の方法に関する。その方法は、（ａ）ポリメラー
ゼ連鎖反応において鋳型核酸を少なくとも１個の標的レ
セプター−特異的オリゴヌクレオチドプライマーと接触
させ、反応から生ずる核酸フラグメントを単離し；
（ｂ）単離フラグメントからのヌクレオチド配列に基づ
くアンチセンスオリゴヌクレオチドを、特定のレセプタ
ーを発現することができる細胞に与え；（ｃ）細胞中の
特定のレセプターの発現の存在又は不在を観察する段階
を含む。レセプター発現の不在はアンチセンスオリゴが
そのレセプターの発現を阻害したことを示し、それによ
りアンチセンスオリゴが基づく単離核酸フラグメント
が、ちょうど調べていたレセプターのすべて又は一部を
コードするという同定を確証する。

【０００４】本方法は実際にいずれのクラスからのレセ
プターの同定にも有用であるが、Ｇタンパク質−結合レ
セプターの同定及び単離に特に有用である。この型のレ
セプターの同定において使用するために、本発明は第１
段階ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして有用な１
系列の数個の新規オリゴヌクレオチドも与える。本方法
は、本文でＳＳＴＲ３と称するこれまで未知であったソ
マトスタチンレセプターサブタイプの同定も行い、従っ
て本発明はそのレセプターをコードする核酸配列、なら
びに配列を発現することができるベクター及び宿主細胞
も与える。

【０００５】本発明はレセプター配列の単離及びクロー
ニングの既知の方法を上回る重大な利点を与える。本発
明は、ほとんどの細胞で発現されたレセプターが少量で
あることが多いために必然的に困難な仕事であった、配
列の情報を得るためのレセプタータンパク質の単離の方
法への代替え法を与え、本方法におけるＰＣＲの利用が
この問題を克服する。本方法の同定の容易さにより、
“オーファンレセプター”、すなわちレセプタータンパ
ク質をコードすると仮定されるが信頼性のある分析及び
／又は完全配列の欠如のためにその同定が未知である単
離核酸フラグメントの古典的問題を避けることもでき
る。クレイムされている方法は、野生型細胞中のその活
性の迅速な分析により単離フラグメントのリガンド特異
性を直接同定する方法を与え、さらに宿主細胞における
異種発現のための全長ｃＤＮＡクローンを得る必要性を
避けることができる。

【０００６】

【発明の具体的な態様】本方法は、（１）共通配列を同
定することができる；（２）タンパク質を発現する細胞
系が利用できる；及び（３）機能分析が存在するいずれ
のタンパク質ファミリーからのタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列の単離及びクローニングにも使用でき
る。しかし本方法は種々のレセプターをコードするヌク
レオチド配列の単離において特に有用である。本明細書
で開示されている特定の実施例は小ペプチドホルモンの
ためのＧタンパク質−結合レセプターをコードする核酸
フラグメントの単離及び同定に関するが、当該技術分野
における熟練者は本文に記載の方法をいかにして他のレ
セプターに同様に適用できるかを容易に認識するであろ
う。

【０００７】本方法の第１段階は研究に使用できるレセ
プター核酸の量を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応
（以下「ＰＣＲ」という）を用いる。ＰＣＲで用いる核
酸はいずれの特定の供給源にも制限されないが、供給源
細胞は問題の特定のレセプターを発現することが知られ
ている組織から得るのが好ましい。種々のレセプターに
関する組織供給源は、例えばＴｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｊａｎ．１９９
２（２４）に見られるように、当該技術において周知で
ある。適した標的細胞又は組織の型が同定されると、ラ
イブラリからの、又はＲＮＡから合成されたゲノムＤＮ
Ａ、ｃＤＮＡあるいはＲＮＡ自身を標準的方法（２０）
によりそれから、ＰＣＲのための鋳型として用いるため
に単離する。

【０００８】ＰＣＲの方法は、米国特許第４，６８３，
２０２号、第４，６８３，１９５号及び第４，９６５，
１８８号に記載されており、これらの特許の内容は、引
用することにより本明細書の内容となる。簡単に述べる
と、ＰＣＲはＤＮＡの試料中の標的配列の増幅、クロー
ニング及び／又は検出に有用である。典型的に、本来の
二重らせんＤＮＡ鎖を変性して各鎖を分離する。分離さ
れた各鎖がプライマーと接触させる鋳型を構成し、プラ
イマーは通常鋳型上に含まれる標的配列の一部とアニー
リングすることができるように設計されたオリゴヌクレ
オチドである。その後各鎖のプライマーをＤＮＡポリメ
ラーゼを用いることにより伸ばし、それにより標的配列
の２個の新しいコピーが得られる。全過程は莫大な回数
繰り返され、おそらく何百万という標的配列のコピーが
得られ、発現の程度が非常に低い遺伝子の検出をかなり
容易にする。

【０００９】本方法に適用される場合、鋳型核酸は問題
のレセプターの１個又はそれ以上をコードする核酸を有
することが知られているか又は予想される細胞から誘導
する。その後核酸を、問題のレセプターに特徴的な配列
とアニーリングするように特別に設計されたプライマー
（オリゴ）と接触させる。例えば本明細書に示す実施例
において、既知のヌクレオチド配列（一般的に１９を参
照）、特にソマトスタチン（２５）、サブスタンスＫ
（２３）、サブスタンスＰ（２３，６，２６，４，２
１）、ニューロメジンＫ（ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ Ｋ）
（２２）、チロトロピン（８，９，１７，１９）、ＬＨ
／ｈＣＧ（１２，１４，１６）及びｍａｓ（２７）、ｍ
ｒ及びｒｔａと称される他のレセプターのヌクレオチド
配列を比較するとかなり高い保存度を示す領域が示され
る。この観察から、４倍から６４倍の縮重に加えて５−
２３％のイノシンを用いて５個のオリゴヌクレオチドプ
ライマーが設計される。（図３を参照。）これらのオリ
ゴはＰＣＲ法において、事実上ペプチドリガンドのため
のいずれのレセプターも認識することができ、実際に下
記に示す通り新規ソマトスタチンレセプターをコードす
る配列の単離に用いられる。これらのオリゴを用いてク
ローニングすることができるこれまで単離されていない
他のレセプター遺伝子には、ＣＲＦ（コルチコトロピン
放出因子）、ＧＮＲＨ（ゴナドトロピン放出ホルモ
ン）、フォリトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出
ホルモン、オクトパミン、ガラニン、アデノシンサブタ
イプ、アンジオテンシン（ＩＩ）サブタイプ、単球ケモ
アトラクタントタンパク質−１、及びバソプレッシンサ
ブタイプのレセプターが含まれるがこれらに限られるわ
けではない。

【００１０】もし異なる型のレセプターを求める場合
は、代わりのオリゴを容易に構築することができる。例
えばセクレチン型のレセプター（構造的にペプチドホル
モンレセプターに類似しているがアミノ酸配列が全く別
である）をコードする遺伝子を同定するために、セクレ
チン、カルシトニン及びパラチロイドレセプター遺伝子
配列を比較すると、このサブクラスのレセプターの認識
に用いることができる４個の新規オリゴの設計のための
情報が得られる（図４）。この群のレセプターにはセク
レチン、カルシトニン、パラチロイドホルモン、成長ホ
ルモン放出因子（ＧＲＦ）及びグルカゴンが含まれると
思われる。

【００１１】アミンレセプターの同定については、多数
のオリゴがすでに記載されている（８）。同様に、オド
ラントレセプターのために適した配列も記載されている
（２）。それぞれの場合、これらは上記の記載のオリゴ
と同様の方法で用いることができる。

【００１２】前記のリストはＧタンパク質−結合レセプ
ターに関するが、この方法で用いるためのオリゴは他の
型のレセプター、例えば非Ｇタンパク質−結合ペプチド
ホルモンレセプター及びステロイドホルモンレセプター
のためにも形成することができる。適したオリゴヌクレ
オチドは、そのレセプターの型の数個の既知の関連遺伝
子を比較し、それらの間の相同の領域を決定し、その後
これらの共通配列の１個又はそれ以上に基づく縮重オリ
ゴを創造することにより設計することができる。

【００１３】ＰＣＲ法において、用いられるプライマー
の数は臨界的でないが、この目的に使用できる有用なオ
リゴの数にある程度支配される。一般にプライマーの最
適数は、用いられたプライマーの最初の対で得られた結
果に依存して実験的に決定される。典型的にオリゴ対の
数、オリゴが目的とする各レセプターサブクラス中に存
在する相同配列の数、及び生成物の分析の容易さの間に
釣り合いが取られる。ＰＣＲ反応の条件は当該技術にお
いて周知である。その後得られたクローンを単離し、ク
ローンの全体又は一部に関してヌクレオチド配列を決定
する。この時点でクローンはまだ“オーファン”であ
り、その同定はなされていない。しかしクローンにより
コードされるペプチドがレセプター分子、特に最初に選
ばれた型のレセプターの一般的証明を有するかどうかは
決定できる。例えば膜結合レセプターは細胞内（Ｉ
Ｃ）、外部及びトランスメンブラン（ＴＭ）ドメインの
パターンで配置されるが、これらのドメインの型はレセ
プターの各群に特異的である。特徴的ドメインの存在
は、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅヒドロパシーインデ
ックスを用いた分析による予想アミノ酸配列から決定す
ることができる（７；図７も参照）。タンパク質がレセ
プターらしいことが確認されたら、方法の次の段階を行
う前にそのサブクラスの同定をさらにいくらか細かく区
別することができる。例えば比較的短い（すなわち８−
２３アミノ酸）第３細胞内ループ（ＩＣ３）がＧタンパ
ク質−結合ペプチドリガンドレセプターに特徴的であ
り、対照的にアミンレセプターのＩＣ３は一般に４７−
１５５残基を有し、その第３トランスメンブランドメイ
ン中に保存Ａｓｐ残基を含む。この決定は方法の成功に
不可欠ではないが、レセプターＤＮＡから誘導されたの
ではないらしいクローンをふるい落とし、レセプター−
誘導であるらしいものを選択するのを助ける。

【００１４】レセプターの同定をより特定するために、
選ばれたクローンから得た配列を用いてその後アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを設計する。オリゴの特定の長
さは重要でないが、細胞が取り上げて最大の配列特異性
を与えることができる最大のオリゴを用いるのが好まし
い。典型的にオリゴは１５−２１ヌクレオチドを含む。
一般に１つをセンス配向で及び１つをアンチセンス配向
で少なくとも２つの相補的オリゴヌクレオチドを形成す
る。アンチセンスオリゴは最少量の予想二次構造を示す
ｍＲＮＡの領域に対応するように設計するのが好まし
い。各オリゴは５０−７０％のシトシン及びグアニンを
含み、ｍＲＮＡへのハイブリッド形成を最大とするのが
好ましい。アンチセンスオリゴは、いずれかのレセプタ
ー機能が野生型細胞中で阻害されるかどうかを評価する
のに用いられる。アンチセンス配列を誘導する基とした
オーファンクローンがレセプター遺伝子の全体又は一部
を示す場合、通常同レセプターを発現することができる
細胞にアンチセンスオリゴを与えるとそれはそのレセプ
ターの発現を阻害する。

【００１５】レセプターの所望のサブクラスは方法の開
始時に決定されているので、アンチセンスオリゴの効果
を評価するのに用いる細胞の型は、最初に求められてい
た型及びサブクラスのレセプターを通常発現することが
知られている細胞の中から選ばれる。選ばれた型の細胞
からの全細胞又は細胞膜をアンチセンスオリゴ、その相
補的センスオリゴ又はビヒクル（標準として）で処理す
る。処理された標本をその後観察し、通常レセプターに
結合するリガンドの存在下でレセプター機能の存在又は
不在を決定する。典型的な場合、多様なリガンドが調べ
られ、試験のために選ばれるリガンドは、求められてい
るサブクラス中のレセプターに結合することが知られて
いるリガンドである。

【００１６】そのリガンドの存在下におけるレセプター
の活性は、多数の方法で決定することができる。リガン
ドは、例えば放射性同位体、化学発光分子又は当該技術
で通常用いられる他の検出可能な標識を用いて、検出で
きるように標識することができる。その後標識リガンド
を、処理細胞又は好ましくは処理細胞からの細胞膜と接
触させ、細胞又は細胞膜へのリガンドの結合の存在ある
いは不在を決定する。アンチセンス−処理細胞において
リガンド結合が観察されたら、それはアンチセンスオリ
ゴがそのリガンドのレセプターの発現に影響を及ぼさな
いことを示し、それによりそのレセプターがオーファン
クローンによりコードされるレセプターであるという考
えを除去する。他方、アンチセンス処理細胞からの細胞
膜への結合リガンドがないか、又は減少している場合、
それはセンス−処理細胞膜におけるリガンド結合の観察
と合わせて、最初のオーファンクローンがその特定のリ
ガンドに関するレセプターをコードする遺伝子の全体又
は一部であることを示す。別の場合、求めているレセプ
ターがその作用を第２メッセンジャーにより媒介される
型のものであるなら、第２メッセンジャーの蓄積を測定
することによりレセプターの機能を評価することができ
る。例えば多くのペプチドホルモンは、環状ＡＭＰ（ｃ
ＡＭＰ）の作用を用いてその最終的効果を媒介する。従
ってレセプターへの特定のリガンドの結合を、アンチセ
ンス−処理された完全な細胞内のｃＡＭＰの蓄積を測定
することにより評価することができる。特定のリガンド
の存在下のアンチセンス−処理細胞中にｃＡＭＰ蓄積の
賦活又は阻害（レセプターに依存して）がない場合、そ
のリガンドに関するレセプターが発現せず、オーファン
配列がそのリガンドに関するレセプターと同定性を共有
することが仮定される。環状ｃＡＭＰ蓄積分析は当該技
術において周知である（３，５）。しかし本発明の実施
は、活性がｃＡＭＰにより媒介される場合のペプチドホ
ルモンに関するレセプターの同定に制限されない。他の
第２メッセンジャー系も既知であり、例えばイオンチャ
ンネルはパッチクランプ（ｐａｔｃｈ ｃｌａｍｐ）に
より検出され、イノシトールホスフェート及びアラキド
ン酸は市販のキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃ
ｌｅａｒ）を用いて分析することができる。第２メッセ
ンジャー蓄積をレセプター阻害の中心指標として用いる
場合、標識リガンド結合をレセプター同定をさらに確認
するために用いることができる。

【００１７】最初のクローンがレセプターのフラグメン
トのみを示すものである場合、遺伝子全体の単離にはさ
らにスクリーニングが必要である。しかしフラグメント
はすでにレセプター−誘導であることが結論的に示され
ており、従ってフラグメントをレセプター全配列のため
のゲノム又はｃＤＮＡライブラリのスクリーニングのた
めのプローブとして確実に用いることができるので、こ
れはこの段階で容易に行うことができる。別法として、
ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＡＣＥ；１１）がライブラリのス
クリーニングを行わない完全遺伝子配列のクローニング
を可能にした。全配列の配列決定及びその後のクローニ
ングは、当該技術で使用できる標準的方法を用いて行う
ことができる。前記の方法を用い、新規ソマトスタチン
レセプターを同定する。

【００１８】本方法を多様なレセプターに適用できるこ
とが、当該技術における熟練者に理解されるであろう。
特に興味のあるレセプターの中には、ＧＲＦ、ＶＩＰ、
ゲラニン、グルカゴン、β−エンドルフィン、ＣＣＫ
Ｂ、ＧＨＲＨ、ＧＮＲＨ、フォリトロピン放出ホルモ
ン、ＣＲＦ、オクトパミン、アデノシンサブタイプ、ア
ンジオテンシンＩＩサブタイプ、単球ケモアトラクタン
トタンパク質−１及びバソプレッシン イソ型に関する
レセプターがある。アンチセンス分析において用いるた
めの簡便で公共的に使用できる宿主細胞系もあり、例え
ばＲｉｎ細胞は発現されたグルカゴン及びガラニンレセ
プターの供給源となり、ＲＣ−４Ｂ細胞はＧＲＦ、ＧＨ
ＲＨ、ＧＮＲＨ、及びフォリトロピン放出因子レセプタ
ーの場合に有用な細胞系である。ＮＧ１０８細胞はβ−
エンドルフィンレセプターの供給源である。ＡｔＴ２０
細胞はＣＲＦレセプターと関連して用いることができ
る。神経芽細胞腫細胞は、ＣＣＫＢの簡便な供給源であ
る。

【００１９】上記のレセプター及び細胞系の他に、クレ
イムされている方法の変法も当該技術における熟練者に
明らかになるであろう。

【００２０】本発明を以下の実施例にてさらに説明する
が、制限を与えるものではない。

【００２１】

【実施例】

１．一般的方法 他に特定しなければ以下の方法は下記の手順にて用い
る。

【００２２】ポリメラーゼ連鎖反応 Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＭｏｄｅｌＤＮＡ合成機上でオ
リゴヌクレオチドを合成する。鋳型としてＤＮＡを用い
る場合はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｇｅ
ｎｅＡｍｐ^RＰＣＲキットで、又は鋳型としてＲＮＡを
用いる場合は同製造者のＧｅｎｅＡｍｐ^RｒＴｔｈＲＮ
Ａ ＰＣＲキットでＰＣＲ反応を行う。反応は製造者の
薦めに従い、縮重オリゴヌクレオチドの場合の３９℃又
は特別なプライマーの場合の６０℃というアニーリング
温度で行うが、これに限られない。各反応は１μｇのＤ
ＮＡ又は全細胞ＲＮＡ及び１μｇの各プライマーを含む
（最終濃度が約１μＭ）。

【００２３】配列分析 ＰＣＲ生成物を、１μｇ／ｍｌ
のエチジウムブロミドを含む１．２％アガローススラブ
ゲル中で分離する。予想した長さのＤＮＡフラグメント
を切り出し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ^R（ＢＩ０１０１）を
用いて精製する。末端を０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓの存
在下でＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて研磨し、Ｓｍ
ａＩで切断したｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒ
ｐ．）中に連結する。選ばれたクローンの配列を、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓダイプライマーＤＮ
Ａ配列決定キット及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ自動シーケンサーを用い
て決定する。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの
薦める案に従った。ヌクレオチド配列をＭａｃＶｅｃｔ
ｏｒ^Rソフトウェアパッケージを用いて分析する。

【００２４】２．レセプターフラグメントの単離 ペプチドレセプターを標的とするために、９個のラット
遺伝子から共通配列を同定する。その後これらの配列を
用いてペプチドレセプタークラスの新しい遺伝子の単離
のためのプローブを設計する。用いたレセプターは、ソ
マトスタチン、サブスタンスＫ、サブスタンスＰ、ニュ
ーロメジンＫ、チロトロピン、ＬＨ／ＣＧ及びｍａｓ、
ｍｒｇならびにｒｔａと称される他に関するレセプター
である。ヌクレオチド配列の４つの領域がＰＣＲのため
の縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計に十分な有
意さの保存を示すことがわかる。４倍から６４倍直接縮
重に加えて５％−２３％のイノシンを用いて５個のオリ
ゴを設計する（図３）。ラットセクレチンレセプターに
より特徴づけられるＧタンパク質−結合レセプターの種
類のための他のプローブを開発する。この種類では現在
わずか４つのメンバーしか知られていない（セクレチ
ン、カルシトニン、パラチロイドホルモン及びバソアク
ティブインテスティナルポリペプチドを認識）。これら
の遺伝子に関する配列を整列させ、このサブタイプを認
識するように４個のオリゴヌクレオチドを設計する。ど
の組のオリゴもアミンレセプター配列を増幅することは
予想されない。

【００２５】図３に記載の５個のオリゴは、Ｇタンパク
質−結合ペプチドレセプター遺伝子中の配列とアニーリ
ングするように設計されている。オリゴはＡｐｐｌｉｅ
ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ＤＮＡ合成機上
で合成する。オリゴはＰＣＲのための６種類のプライマ
ー対として用いられる。ＰＣＲ反応は、上記の通りに行
われる。ラットゲノムＤＮＡを鋳型として用い、６回の
反応はすべて予想された大きさのＤＮＡフラグメントを
製造し（ｔｍ３からｔｍ６フラグメントの場合の約４２
０ｂｐからｔｍ２からｔｍ７フラグメントの場合の約７
００ｂｐの範囲）、ＤＮＡフラグメントをクローニング
し、ＰＣＲ９及びＰＣＲ１１と称する２つの試料がＧタ
ンパク質−結合レセプターに特徴的な配列を含むことが
わかるが、ＧｅｎＢａｎｋ中に正確な一致は見いだされ
ない（表１）。これら２つのフラグメントのヌクレオチ
ド配列を図５〜６に示す。各フラグメントは単一の読み
取り枠を含む。他のレセプター配列と比較すると、ラッ
トソマトスタチンレセプター及びＰＣＲ１１の間に有意
な類似性が示され、ＰＣＲ１１が新規ソマトスタチンレ
セプターサブタイプであることを示唆している。両フラ
グメントは他のレセプターへの一次配列類似性のみでな
く、Ｇタンパク質−結合レセプターに特徴的なヒドロパ
シーパターンも示す（図７）。興味深いことに、各新規
配列に予想される第３細胞内ループ（ＩＣ３）は比較的
短く、８−２３アミノ酸の長さのＩＣ３を有するペプチ
ドレセプターであることを証明している（ＰＣＲ＃９の
ＩＣ３は１３残基であり、ＰＣＲ＃１１のＩＣ３は２３
アミノ酸である）。対照的にアミンレセプターのＩＣ３
は４７−１５５残基の範囲の長さである。それらの観察
は、ＰＣＲ生成物により示される新規Ｇタンパク質−結
合レセプターがペプチドリガンドサブクラスのものであ
ることを示唆している。

【００２６】

【表１】 表１新規ＰＣＲフラグメントのＧタンパク質−結合レセプターへの関連性 ^a レセプタークラス 遺伝子の名称 ^b ＰＣＲ＃９ ^c ＰＣＲ＃１１ ^c ペプチドリガンド ｓｒｉｆ ３７ ５７ ｎｅｕＫ ２４ ３０ ｓｕｂＫ ２２ ２５ ｓｕｂＰ ２０ ２６ ｍａｓ ２３ １６ ｍｒｇ １５ １８ ｔｈｙ １９ １８ ｌｈｃｇ １６ １３ アミンリガンド αｌｂ ２１ ２７ β２ ２４ ２０ ｄ２ １０ ２２記 ：^a 各ＰＣＲフラグメント（＃９又は＃１１と称する）
を翻訳し、ＧｅｎＢａｎｋで得られるＧタンパク質−結
合レセプターと比較^b 配列はすべてラットからのものである。名称は：ｓ
ｒｉｆ、ソマトスタチンレセプター；ｎｅｕＫ、ニュー
ロメジンＫレセプター；ｓｕｂＫ又はＰ、サブスタンス
Ｋ又はＰレセプター；ｍａｓ、ｍａｓがん遺伝子；ｍｒ
ｇ、ｍａｓ関連遺伝子；ｔｈｙ、チロトロピンレセプタ
ー；ｌｈｃｇ、黄体形成ホルモン及びコリオゴナドトロ
ピンレセプター；α１ｂ、α_1b−アドレナリン性レセプ
ター；β２、β₂−アドレナリン性レセプター；ｄ２、
Ｄ₂ドーパミンレセプターである。

【００２７】^c 数字は翻訳された長さのＰＣＲフラグ
メント上の同一又は保存アミノ酸のパーセントを示す。
１５以上のパーセントは有意性が高いと考えられる。

【００２８】３．アンチセンスオリゴを用いたソマトス
タチンレセプター及び発現機能の阻害 Ａ．リガンド結合分析 ＧＨ₄Ｃ₁（下垂体細胞系）細胞を、加湿室（３７℃、９
５：５、空気 ＣＯ₂）内の１０％牛胎児血清、Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅｓ培地中で５０％の集密度
に成育する。その後ＧＨ₄Ｃ₁細胞をビヒクル（Ｈ₂Ｏ）
（標準）、アンチセンスオリゴ（１８ｍｅｒ、ＧＧＧＴ
ＣＧＣＣＴＣＣＡＴＴＴＣＧＧ、５μＭ）又は相補的セ
ンス鎖（１８ｍｅｒ、ＧＣＣＡＡＡＴＧＧＡＧＧＣＧＡ
ＣＣＣ、５μＭ）と共に、血清を含まないＤｕｌｂｅｃ
ｃｏの修正Ｅａｇｌｅｓ培地中で３７℃にて４時間培養
する。４時間の最後に熱−不活性化牛胎児血清を１０％
まで加える（最終的濃度）。細胞をさらに２０時間成育
する。細胞を収穫し、Ｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２
８）に記載の通りに粗膜を調製する。〔¹²⁵Ｉ〕ｔｙｒ
−ソマトスタチン、Ｓ−１４（５０ｆｍｏｌ／管、最終
的に２５０ｐＭｏｌ）を用い、以下のような標準的結合
分析法を用いて放射性リガンド結合を行う：結合分析は
５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．５％のＢＳ
Ａ及び５ｍＭのＭｇＣｌ₂を含む結合緩衝液中で行う。
ＧＨ₄Ｃ₁膜への〔¹²⁵Ｉ〕ＳＲＩＦ類似体結合に関する
標準的濾過分析は以下の要領で行う：１．放射性リガン
ドを結合緩衝液＋ＰＭＳＦ／Ｂａｃｉ中で１０μｌの体
積当たり所望のｃｐｍに希釈し、その後１８０μｌのア
リコートをテーブルに加える。非−特異的結合試料とし
て、結合緩衝液＋ＰＭＳＦ／Ｂａｃｉ中で所望の濃度
（１０−３０μｇ膜タンパク質／ウェル）に希釈した膜
のウェル当たり１０μｌの２０μＭ冷Ｓ１４も加えた。
０．３％のポリエチレンイミンを予備浸漬したＷｈａｔ
ｍａｎ ＧＦ／Ｃフィルターを通して試料を急速濾過す
ることにより結合を止める。結合は３０℃で１−２時間
進行させる。０．３％のポリエチレンイミンを予備浸漬
したＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃフィルターを通して試料
を急速濾過することにより結合を止める。各試料を氷−
冷結合緩衝液（５ｍｌ）で３回洗浄する。最後に各ウェ
ルを１２ｘ７５ｍｍの管に入れ、ＬＫＢ Ｇａｍｍａｍ
ａｓｔｅｒカウンターで計数する（効率７８％）。図８
に示す結果は、それぞれ二重に行った２回の実験の平均
である。ビヒクル及びセンスオリゴで処理した細胞から
の膜は同程度の結合〔¹²⁵Ｉ〕ｔｙｒ−ソマトスタチン
を示すことが分かる（４０８ ｖ ３５０ ｆｍｏｌ／
ｍｇ）。アンチセンスオリゴで２４時間処理した膜で
は、〔¹²⁵Ｉ〕ｔｙｒ−ソマトスタチン結合が６０％減
退するのが観察される（１６６ｍｏｌ／ｍｇ）。かくし
てアンチセンスの場合レセプター発現が阻害されるがセ
ンスオリゴの場合阻害されないことは特別な意味を示し
ており、それによって機能の消失をオーファンレセプタ
ーの特性化及び同定に用いることができる。

【００２９】Ｂ．ｃＡＭＰ分析 ＡｔＴ２０細胞を、加湿室（３７℃、９０：１０、空
気：ＣＯ₂）内の１０％牛胎児血清、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ
の修正Ｅａｇｌｅｓ培地中で５０％の集密度に成育す
る。その後ＡｔＴ２０細胞をビヒクル（Ｈ₂Ｏ）（標
準）、オーファンＧタンパク質−結合レセプターＰＣＲ
１１に向けられたアンチセンスオリゴ（２０ｍｅｒ、Ｃ
ＧＡＧＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＴＴＧＡＧＧ、５μＭ）又
はセンス鎖（２０ｍｅｒ、ＡＣＧＣＡＧＡＡＣＧＣＣＧ
ＴＣＴＣＣＴＡ５μＭ）と共に、血清を含まないＤｕｌ
ｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅｓ培地中で３７℃（９０：
１０、空気：ＣＯ₂）にて４時間培養する。このオーフ
ァンレセプターをコードするｍＲＮＡを、ＡｔＴ−２０
マウス下垂体細胞中でＰＣＲノザン分析により検出す
る。４時間の最後に熱−不活性化牛胎児血清を１０％
（最終濃度）まで加える。細胞を収穫し、牛血清を１０
％（最終濃度）まで加える。細胞を収穫し、２ｍＭのＣ
ａＣｌ₂、１００μＭのイソブチル−メチルキサンチン
（環状ＡＭＰ−依存ホスホジエステラーゼ活性の阻害の
ため）を含むクレブスリンガーリン酸塩緩衝液中に再懸
濁する。完全な細胞中でフォルスコリン−賦活環状ＡＭ
Ｐ蓄積のソマトスタチン−媒介による阻害を行う。環状
ＡＭＰはＡｍｅｒｓｈａｍから購入したキットを用いて
測定する。細胞を、１ｍＭのＣａＣｌ₂を含むクレブス
リンガーリン酸塩（ＫＲＰ）緩衝液で２回洗浄する。細
胞（５０−１００，０００／管、三重）を、１００μＭ
のイソブチル−メチルキサンチンを含むＫＲＰ緩衝液
（最終体積＝１００μｌ）中でアデニリルサイクラーゼ
の賦活剤及び／又は阻害剤と共に１５分間培養する。１
０μｌの０．１Ｎ ＨＣｌを加えることにより反応を停
止する。試料を５分間煮沸し、その後１００ｍＭのトリ
ス、ｐＨ７．５を含む０．１ＮのＮａＯＨで中和する。
各管に〔³Ｈ〕環状ＡＭＰ（〜１５，０００ｃｐｍ）及
び１０μｌのアドレナール結合タンパク質を加える。試
料を標準と共に９０分間氷上で培養し、活性炭（１００
μｌ）を加え、遠心する（４℃、２０００ｘｇにて５分
間）。試料を既知濃度の標準と比較し、液体シンチレー
ション分光分析により定量する。結果を図９に示す。図
はｃＡＭＰ蓄積のソマトスタチン媒介による阻害の効率
が減衰していることを示す。又、ソマトスタチン媒介応
答に関するＥＤ５０が右に移動している。標準及びセン
ス処理細胞では、ソマトスタチンレセプターに関するＥ
Ｄ５０はそれぞれ１及び１．２ｎＭと算出される。

【００３０】アンチセンスオリゴで処理した細胞では、
ソマトスタチンに対するＥＤ５０応答は９ｎＭであり、
力価における９倍の移動である。これらのデータはソマ
トスタチンの効率及び力価の両方がアンチセンスオリゴ
を用いた細胞の処理により変化することを示す。従って
ＰＣＲ１１フラグメントは新規ソマトスタチンレセプタ
ーサブタイプを同定すると思われる。フラグメントを既
知のレセプターサブタイプＳＳＴＲ１及びＳＳＴＲ２
（２５）と比較する。現在使用できる領域（コード配列
の５０％以上を与える）上でＳＳＴＲ３レセプターはＳ
ＳＴＲ２と５７％同一であり、同類アミノ酸置換を考慮
すると７４％相同であり（図１１）；ＳＳＴＲ３はＳＳ
ＴＲ１に対する相同性はわずかに低く：４９％が同一で
あり、７０％が同一又は保存残基である。

【００３１】さらに実験を続け、マウス相同染色体も単
離する。このフラグメントのヌクレオチド配列を図１０
に示す。

【００３２】生物学的材料の寄託 以下の材料を１９９２年６月４日、Ｂｕｄａｐｅｓｔ条
約によりＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、以下に示す受託番号
が与えられた。

【００３３】 記 受託番号 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２，０Ｚ９（ＰＣＲ９） ６９００５ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２，０Ｚ１１（ＰＣＲ１１） ６９００６

【００３４】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】方法のまとめ。この例では４個のオーファンＧ
タンパク質−結合レセプター遺伝子フラグメントを単離
する。ビヒクル、各クローンから誘導されたセンス
（＋；負の標準として）及びアンチセンスオリゴ（−）
をｃＡＭＰ蓄積分析（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｓ
ｓａｙ）で試験し、アデニリルサイクラーゼを活性化す
ることが知られているリガンドへの応答を減衰するかど
うかを決定する。この場合、オーファン＃３へのアンチ
センスオリゴが応答を抑制し、それによりその配列を分
析されたレセプターをコードする遺伝子の一部として同
定する。

【図２】方法のまとめ。この例では４個のオーファンＧ
タンパク質−結合レセプター遺伝子フラグメントを単離
する。ビヒクル、各クローンから誘導されたセンス
（＋；負の標準として）及びアンチセンスオリゴ（−）
をｃＡＭＰ蓄積分析（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｓ
ｓａｙ）で試験し、アデニリルサイクラーゼを活性化す
ることが知られているリガンドへの応答を減衰するかど
うかを決定する。この場合、オーファン＃３へのアンチ
センスオリゴが応答を抑制し、それによりその配列を分
析されたレセプターをコードする遺伝子の一部として同
定する。

【図３】ＰＣＲプライマーとして用いられるオリゴヌク
レオチドの記載。箱を有する線はＧタンパク質−結合レ
セプターをコードする遺伝子を示す。各々の箱はトラン
スメンブランドメインを示す。矢印は記載のオリゴに関
する結合部位に対応する。ヌクレオチド配列は不完全特
定塩基のためのＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法を用いる。一
般的種類のペプチドリガンドレセプターに向けられたオ
リゴヌクレオチド。

【図４】ＰＣＲプライマーとして用いられるオリゴヌク
レオチドの記載。箱を有する線はＧタンパク質−結合レ
セプターをコードする遺伝子を示す。各々の箱はトラン
スメンブランドメインを示す。矢印は記載のオリゴに関
する結合部位に対応する。ヌクレオチド配列は不完全特
定塩基のためのＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法を用いる。セ
クレチンレセプター−様サブクラスに向けられたオリゴ
ヌクレオチド。

【図５】オーファンレセプターＤＮＡフラグメントのヌ
クレオチド配列。下線の配列はＰＣＲプライマーを示
す。両フラグメントは５’末端にオリゴ＃８を、３’末
端にオリゴ＃１０を含む。

【図６】オーファンレセプターＤＮＡフラグメントのヌ
クレオチド配列。下線の配列はＰＣＲプライマーを示
す。両フラグメントは５’末端にオリゴ＃８を、３’末
端にオリゴ＃１０を含む。

【図７】新規ＰＣＲフラグメントによりコードされたペ
プチドのヒドロパシープロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ
ｐｌｏｔ）。各ＰＣＲフラグメントのペプチド生成物
をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅヒドロパシーインデッ
クスにより分析する。各配列は第２トランスメンブラン
ドメイン内で始まり、第６トランスメンブランドメイン
内で終わる。疎水性トランスメンブランドメイン３、４
及び５は容易に明らかになる。ラットのソマトスタチン
（ＳＲＩＦ）レセプターの対応する領域から誘導したプ
ロットを比較のために示す。

【図８】アンチセンスオリゴがＧＨ₄Ｃ₁細胞におけるソ
マトスタチンレセプターの発現を阻害する：放射性リガ
ンド結合による分析。ＧＨ₄Ｃ₁細胞をビヒクル（標
準）、アンチセンスＤＮＡ又は対応するセンス鎖で本文
に記載の通り２４時間処理する。細胞を収穫し、粗形質
膜を調製し、〔¹²⁵Ｉ〕ソマトスタチン（５０ｆｍｏｌ
／管、最終的に２５０ｐＭｏｌ）を用いて放射性リガン
ド結合を行う。１μＭのソマトスタチンの存在下で非−
特異的結合を決定する。示されている結果は、二重に行
った２回の別々の実験の平均である。

【図９】ＡｔＴ２０コルチコトローフス（ｃｏｒｔｉｃ
ｏｔｒｏｐｈｓ）におけるソマトスタチンレセプター機
能のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害。ＡｔＴ２０
コルチコトローフスをビヒクル（標準）、オーファンＧ
−タンパク質−結合レセプターＰＣＲ１１に対するセン
スオリゴ（５μＭ）又はアンチセンスオリゴ（５μＭ）
で２４時間処理する。細胞を収穫し、環状ＡＭＰ応答曲
線のソマトスタチン−媒介阻害を３回行い、同等の結果
を得る。下のパネルは３回の別々の実験の平均である。

【図１０】マウスＳＳＴＲ３ ＤＮＡフラグメントのヌ
クレオチド配列。下線の配列はＰＣＲプライマーを示
す。オリゴ＃８は５’末端を固定し、オリゴ＃１２は
３’末端である。

【図１１】ソマトスタチンレセプターペプチドの整列。
ＳＳＴＲ１及びＳＳＴＲ２のアミノ酸配列をＳＳＴＲ３
に並べる。配列上の線は疎水性トランスメンブランドメ
インを示す。トランスメンブラン領域２からトランスメ
ンブラン領域７までの配列のみを示す。小文字は同類ア
ミノ酸置換を示し、大文字は非同類変化を示す。整列を
最大にするために、ＳＳＴＲ１及びＳＳＴＲ２のトラン
スメンブランドメイン４のＣ−末端近辺の３個の残基を
欠失する。さらにＳＳＴＲ１はｔｍ６中の残基が１少な
く、ｔｍ７中の残基が３少ない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブラドレイ・アルトン・オゼンバーガー アメリカ合衆国ペンシルベニア州ヤードレ イ・エメラルドドライブ379 (72)発明者 マーク・ヘンリー・ポーシユ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州プレイ ンズボロ・フオツクスランドライブ103

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応において鋳
   型核酸を少なくとも１個の標的レセプター−特異的オリ
   ゴヌクレオチドプライマーと接触させ、反応から生ずる
   核酸フラグメントを単離し；（ｂ）単離フラグメントか
   らのヌクレオチド配列に基づくアンチセンスオリゴヌク
   レオチドを、特定のレセプターを発現することができる
   細胞に供給し；そして（ｃ）細胞中の特定のレセプター
   の発現の存在又は不在を観察する段階を含む、レセプタ
   ーをコードする核酸フラグメントの単離及び同定の方
   法。
2. 【請求項２】 図３で示されるオリゴヌクレオチドから
   成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 図４で示されるオリゴヌクレオチドから
   成る群より選ばれるオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列ＧＧＧＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＴＴＣ
   ＧＧを有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列ＣＧＡＧＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＴＴ
   ＧＡＧＧを有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 図５に示されるＳＳＴＲ３のアミノ酸配
   列を含むソマトスタチンレセプターをコードする核酸フ
   ラグメント。
7. 【請求項７】 フラグメントが図１０に示される配列を
   含む、ソマトスタチンレセプターをコードする核酸フラ
   グメント。
8. 【請求項８】 図１１に示されるＳＳＴＲ３のアミノ酸
   配列を含むソマトスタチンレセプターをコードする核酸
   フラグメント。
9. 【請求項９】 図５〜６に示されるＰＣＲ９の配列を含
   む核酸フラグメント。