JPH06253832A - 抗腫瘍性リンホカインの１種であるロイコレギュリン及びその治療用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 この発明は、ヒト腫瘍細胞を直接溶解し、ま
たその増殖を抑制することができ、かつナチュラルキラ
ーリンパ球が媒介する溶解に対するヒト腫瘍細胞の感受
性を高めことができる新規のリンホカイン即ちロイコレ
ギュリンとそのサブユニット、ロイコレギュリン遺伝子
含有トランスファーベクターで形質転換したロイコレギ
ュリン産生細胞、ロイコレギュリンの細胞表面レセプタ
ーに特異的なモノクローナル抗体及びその調製方法、並
びにロイコレギュリンの治療用途に関する。 【効果】 抗腫瘍細胞活性を有するため医薬として使用
できるし、また、腫瘍細胞上で発現するロイコレギュリ
ン細胞表面レセプターの定量化等に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト腫瘍細胞を直接溶
解し、またその増殖を抑制することができ、かつナチュ
ラルキラーリンパ球が媒介する溶解に対するヒト腫瘍細
胞の感受性を高めることができる新規なヒトリンホカイ
ン、すなわちロイコレギュリン（leukoregulin）に関す
る。これらの抗腫瘍活性は、以前はリンホトキシンによ
ると考えられていた。しかしながら、本発明者は、これ
らの抗腫瘍細胞活性を有するヒトリンホカイン試料が、
リンホトキシン並びにその他の、インターフェロン、イ
ンターロイキン１，２及びマクロファージ活性化因子活
性を含めた既に単離されているリンホカインから生化学
的に分離されることを発見した。

【０００２】本発明はさらに、この新規リンホカイン遺
伝子を含むトランスファーベクターで形質転換した新規
リンホカイン産生細胞、新規リンホカインの細胞表面レ
セプターに特異的なモノクローナル抗体及びその調製方
法、並びに新規リンホカインの治療用途に関する。

【０００３】

【従来の技術】免疫系のホルモンであるリンホカインは
癌の発達に影響を与え、腫瘍形性性細胞の増殖を抑制
し、更に腫瘍を破壊する能力を有している。これらのホ
ルモンはある種のリンパ球（様細胞）で産生分泌され、
他の特異的な細胞を標的としてこれと相互作用する糖蛋
白質である。特定のリンホカインは１種より多くの細胞
で産生され、１種より多くの細胞と相互作用することが
知られている。同様に、ほとんどのリンホカインの活性
は多岐にわたることが知られており、ある特定のリンホ
カインは種々の標的細胞と条件に関し阻害、刺激、増
強、反駁、その他の作用を示す。また、ある特定のリン
ホカインは異なった環境下での発癌の阻害と増強の両方
を行うことができる。例えば、インターフェロンはウイ
ルス発癌を抑制するが放射線発癌を増大することが知ら
れている。同様に、インターフェロンは腫瘍細胞のＮＫ
細胞溶解を増強する拮抗活性を示す一方、ＮＫ細胞作用
に対する腫瘍細胞の抵抗性を増大させる。インターフェ
ロンに暴露した後、前者は後者より早い時期に起る。

【０００４】リンホトキシンは、マウスＬ細胞の細胞溶
解性破壊を媒介する、抗原又はマイトジエンで刺激した
リンパ球の可溶性産生物を表わすために１９６９８年に
導入された用語である（９）。その後いくつかの研究所
で、リンホトキシン含有リンホカイン試料が種々の腫瘍
細胞に対する直接作用性の細胞溶解活性及び細胞増殖抑
制活性（７，３０，３１）や、腫瘍性悪性変換（neopla
stic transformation）を起こしている細胞に対する抗
発癌活性（６，２５，２６）や、ＮＫ−媒介破壊に対す
る腫瘍発現前細胞及び腫瘍細胞の感受性を高める能力
（２３，２７）を有することが示された。

【０００５】マウスＬ細胞の細胞溶解性破壊を媒介する
ものとは異なるハムスターリンホトキシン試料中の抗癌
性リンホカインが後に分子の電荷に基づいて同定された
（24）。この等電点ｐＨが５．０で分子量が５０，００
０の分子はハムスターの腫瘍細胞に対し細胞増殖抑制性
であり、正常のハムスター胎児繊維芽細胞の増殖を阻害
せず、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ
（ｉｎ ｖｉｖｏ）の両者においてハムスター胎児細胞
の化学物質及び放射線照射による腫瘍性悪性変換を抑制
した。この単一の抗癌性リンホカインはまた、インター
フェロン，インターロイキン１及び２並びにマイクロフ
ァージ遊走阻止因子活性とは異なるものとしても同定さ
れた。この発見によって結局新しい研究の道が開かれ、
ヒトリンホトキシン試料が独特な抗発癌特性及び抗腫瘍
特性を有するヒトリンホカインを含有しているかどうか
を評価するためにヒトリンホトキシン試料が研究され
た。

【０００６】

【発明の要約】本発明の目的は、腫瘍細胞を直接的に溶
解し、その増殖を抑制し、ナチュラルキラーリンパ球媒
介溶解に対するその感受性を高めると共に正常細胞の発
癌性変換（carcinogenic transformation ）を阻害する
という抗腫瘍特性を有する、本発明者が発見したヒトリ
ンホカインを生化学的及び生物学的に特性化し精製する
ことであった。解離すると分子量約３０，０００〜３
５，０００のサブユニットになる分子量約１２０，００
０〜１４０，０００のリンホカインであり、等電点電気
泳動によって約４．８〜５．５又は約７．５〜８．３の
ｐＨで精製されるロイコレギュリン（leukoregulin）を
同定単離することによりこの目的を達成した。

【０００７】もう１つの目的は、ロイコレギュリンの細
胞起源を同定し、その産生を刺激する手順を開発するこ
とであった。ロイコレギュリンの起源である末梢血白血
球をフイトヘマグルチニンに有効な時間暴露することに
より刺激してロイコレギュリンの産生を増強しうること
が発見された。暴露の最適時間は４８時間であり、程度
は低くなるが、これより長時間でもより短時間でも有効
であった。その他のインデューサー、例えばテトラデカ
ノイルホルボールアセテート，コンカナバリンＡ及びそ
の他の分裂を促進する植物レクチン類もロイコレギュリ
ン産生を増強することも発見された。更に、ある場合に
は、リンパ球の形質転換（transformation）及びハイブ
リドーマ細胞の形成により有効なロイコレギュリン産生
細胞を調製した。

【０００８】本発明の更に別の目的は、ロイコレギュリ
ンに対する細胞感受性の迅速なアッセイを提供すること
であった。これはロイコレギュリン細胞表面レセプター
に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ又は形質転換白血球を調製し、検査する標的細胞への
この抗体の結合を定量化することにより達成した。

【０００９】本発明の更なる目的及び属性は以下の考察
の中で明らかになろう。

【００１０】

【好ましい実施態様の説明】本発明者は、ヒトリンホカ
イン試料（preparation ）が、直接溶解（direct lysi
s）によりヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、細胞性増殖を
阻害し、かつナチュラルキラー細胞（ＮＫ）に媒介され
る破壊（destruction ）に対する腫瘍細胞の感受性を高
める能力を有する単一独特のリンホカインを含有するこ
とを発見した。本発明者はこのリンホカインに対してロ
イコレギュリン（leukoregulin）という名称を採用し
た。何故ならば、これは白血球（leukocyte ）の産物で
あり、しかもリンホトキシン，インターフェロン，イン
ターロイキン１及び２、並びにマクロファージ活性化因
子活性とは分子的かつ生物学的に異なる細胞増殖調節物
質（cell growth regulatory substance）だからであ
る。

【００１１】ロイコレギュリンは、勾配ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及びゲル濾過クロマトグラフィで測定
した分子量が約１２０，００００〜１４０，０００であ
り、解離すると約３０，０００〜３５，０００の分子量
のサブユニットになる。これは、等電点電気泳動によっ
て約５．０と７．５のｐＨで精製される。分子量及び等
電点電気泳動で分画したロイコレギュリンは、検出可能
なリンホトキシン，インターフェロン，インターロイキ
ン１及び２、並びにマクロファージ活性化因子活性を含
有しない形で得られる。

【００１２】ロイコレギュリンの属性と思われる特性が
リンホトキシンの特性とは異なることを確認するために
特別な検討を行なった。ロイコレギュリンがリンホトキ
シンとは異なることを示す証拠の概略は次の通りであ
る。（１）ヒト末梢血白血球由来のリンホトキシン及び
ＲＰＭＩ １７８８ヒトリンパ芽球細胞由来の高純度リ
ンホトキシンはネズミのαＬ９２９腫瘍細胞を容易に溶
解するとはいうものの検出可能な抗ヒト腫瘍細胞活性は
全く持っていない。（２）リンホトキシン活性はプロテ
アーゼ及びノイラミニダーゼ処理後の両方で減少したの
に対し、ロイコレギュリン活性はプロテアーゼ消化後に
減少したがノイラミニダーゼ消化後には減少しなかっ
た。（３）ロイコレギュリンは、等電点電気泳動により
リンホトキシンから、溶解、増殖阻害及びナチュラルキ
ラー細胞によるヒト腫瘍細胞溶解の増強を引き起こすが
ネズミＬ細胞を溶解（リンホトキシンの活性）しない種
（species ）に分離することができた。こうして、ＰＢ
Ｌリンホカイン試料中の異なるロイコレギュリン／リン
ホトキシン濃度、ノイラミニダーゼ及びプロテアーゼに
対する感応性、及び異なる等電点の組み合せによって、
ロイコレギュリンがリンホトキシンとは異なることが最
終的に示された。

【００１３】ロイコレギュリンは細胞性増殖を阻害しう
るもう１つの免疫性ホルモンであるインターフェロンと
も異なる。インターフェロンはある種の正常細胞及び腫
瘍細胞の増殖を阻害することが示されている（２，１
８）。しかしながら、α及びγインターフェロンは本明
細書中に記載のロイコレギュリン感受性腫瘍細胞のいず
れの増殖にも作用しなかった。ある種のヒトリンホカイ
ン試料（製剤）はロイコレギュリン及びインターフェロ
ンの両方を含有しているが、この２つのホルモンは分子
ふるいで分けることができる。更にインターフェロンに
富む画分はロイコレギュリン活性を示さない。

【００１４】ロイコレギュリンに富む精製画分は腫瘍細
胞増殖阻害に加えて、ＮＫ−媒介細胞毒性に対する腫瘍
細胞の感受性を高めることも示された。この活性はイン
ターフェロンのものと反対であり（33）、ロイコレギュ
リンに特有のものである。ＮＫ−媒介細胞毒性の増強
は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でロイコレギュリンが
腫瘍の増殖を抑制する重要な手段と思われる（27）。

【００１５】ロイコレギュリン活性のメカニズムの重要
な面は、腫瘍細胞の細胞表面膜の構造（conformation）
と透過性を変化させる能力である。流動細胞計測分析を
用い、標的細胞をロイコレギュリンに暴露した後の数分
間の変化を測定した。この方法は、ロイコレギュリン又
はロイコレギュリンレセプターに対するモノクローナル
抗体を検出するというような短いアッセイ時間を必要と
する研究に大きな力となる。

【００１６】ロイコレギュリンともう１つの腫瘍細胞阻
害性リンホカインである腫瘍壊死因子との関係も研究し
た。ヒト腫瘍壊死製剤はインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）に
おいてある種のマウス肉腫の出血性壊死を引き起し、リ
ンホトキシンと同じインビトロ活性を有する（34）。精
製したロイコレギュリンがリンホトキシンと同じ生物学
的活性を媒介しないので、ロイコレギュリンは腫瘍壊死
因子とは異なる。

【００１７】ハムスターのリンホカイン試料はリンホト
キシン、ロイコレギュリン活性（ハムスターの腫瘍細胞
の増殖は阻害するが正常細胞の増殖は阻害しない）及び
抗発癌活性を有している。これらロイコレギュリン活性
と抗発癌活性は同時に精製される。しかしながら、これ
ら２つの活性は２つの等電点ｐＨを持つ。すなわちハム
スターリンホトキシンと異なるものとハムスターリンホ
トキシンと同じものである（24）。このロイコレギュリ
ン活性と抗発癌活性はノイラミニダーゼの影響を受けな
いが、ハムスターリンホトキシンはノイラミニダーゼで
分解される。しかしながら、ハムスターのロイコレギュ
リン活性と抗発癌活性はプロテアーゼ消化に対し同様の
感受性を示す。これと他の生化学的データとを合せる
と、ハムスターロイコレギュリンは抗発癌活性も有して
いると結論される。ヒトロイコレギュリンはハムスター
ロイコレギュリンと同じ生物学的特性を示したのでやは
り抗発癌性であるはずである。

【００１８】ヒトの癌の治療に実験的にロイコレギュリ
ンを用いるための臨床試験に対する規制認可（regulato
ry approval ）が得られれば、進行期の腫瘍病（neopla
sticdiseases ）患者でのフェーズｌの臨床試験が実施
されよう。ロイコレギュリンは下記の如く患者に投与す
る。胃腸障害，貧血，白血球減少症，発熱又はその他の
臓器の損傷及び機能不全の証拠として現れる毒性反応を
評価することによって各治療形態に対する最大許容（投
与）量を確定するために用量を増加する。ロイコレギュ
リンは寛容性が非常に良好であり、大量投与が可能であ
ると予想される。ロイコレギュリンを含有していること
が確実な部分的に精製したＰＨＡ刺激末梢血リンパ球の
上清を用いて治療してみたところ、この物質がほとんど
毒性を有さないことが示された（13）。

【００１９】フェーズIIの臨床試験は、治療の有効性が
最も明白な限られた疾患の患者におけるロイコレギュリ
ンの評価に向けられよう。初期の試験では主たる外科療
法，化学療法又は放射線療法のアジュバントとしてロイ
コレギュリンを用い、その後の試験では主たる治療様式
（modality）としてロイコレギュリンを評価することに
なろう。

【００２０】ロイコレギュリンは、静脈内又はリンパ管
内経路で全身的に投与するか、腫瘍内注射又は腹膜灌流
により局所的に投与するか、あるいはまたエクス−ビボ
（ｅｘ−ｖｉｖｏ）療法として投与する。この最後のも
のの１例は、患者から骨髄細胞を取り出し、ロイコレギ
ュリンで処理して腫瘍細胞を除去し、骨髄に大量の化学
療法又は放射線療法を施した後に患者の骨髄を再構成す
るのに用いることである。

【００２１】ロイコレギュリンは、循環系及び組織内の
ロイコレギュリンの必要量を維持するだけ持続注入又は
個別注射で投与する。

【００２２】直接投与の代りに、増殖不可能にしたヒト
のリンパ球様細胞中にロイコレギュリンをコードする遺
伝子をクローニングすると、インビボ（ｉｎ−ｖｉｖ
ｏ）での産生によってロイコレギュリン濃度を一定に維
持する道が開かれよう。インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で
の寿命が限られている細胞を使用すると比較的短期間に
亘りロイコレギュリン濃度を確実に調整できるようにな
ろう。

【００２３】直接投与に代わるその他の方法としては、
ウイルスゲノムにロイコレギュリンをコードする遺伝子
を挿入し、このウイルスを用いてこの遺伝子をロイコレ
ギュリンに翻訳する特定の群の細胞に遺伝子を運び、こ
うしなければロイコレギュリン産生を制限する正常な調
節物質を遮断する。例えば、エプスタイン−バール（Ep
stein −Barr）ウイルスはＢリンパ球のみに感染し、通
常は限られたむしろ緩和な感染を起すものであるが、こ
のウイルスゲノムを改変してウイルス感染による疾患の
進展を防止すると、これはロイコレギュリン遺伝子の適
当なウイルスベクターとして機能できるであろう。

【００２４】固形腫瘍の治療は、体内全体に亘って非常
に高濃度に維持しようとするよりは腫瘍の直接周囲の環
境のロイコレギュリン濃度を最大になることによって最
も効果的に実施される。腫瘍細胞表面の抗原に対し定性
的又は定量的な特異性を有するヒトモノクローナル抗体
は、ロイコレギュリンが結合して腫瘍内の高濃度を確保
できる適切な「留め金（hook）」となる。別の方法はリ
ポソーム内にロイコレギュリンをカプセル化することで
あり、このリポソームはその表面に腫瘍特異的モノクロ
ーナル抗体を有していてもよい。リポソーム性トリグリ
セリドを適切に選択すると、循環アミラーゼ酵素に抵抗
性があり、腫瘍細胞膜と融合して内部のロイコレギュリ
ンを細胞内に輸送させうるリポソームが得られる。腫瘍
標的細胞の膜脂質とリポソームの膜脂質との融合を増強
することにより内容物の輸送を増大させるために親油性
キャリア物質（ジメチルスルフォキシド、ホウ酸(boron
icacid)誘導体）をリポソーム中に含有せしめてもよ
い。

【００２５】ロイコレギュリンは毒性副作用を付加する
ことなく化学療法剤の抗腫瘍活性を上昇させるようであ
り（19）、その結果有効投与レベルがずっと高くなる。
従って、この抗腫瘍増強活性を評価するためにロイコレ
ギュリンは種々の化学療法物質や放射線療法と共に治療
規制（regimens）に適用されるであろう。

【００２６】細胞毒性のある化学療法剤又は放射線療法
手段と共に使用するときにはロイコレギュリンの抗発癌
活性が抗腫瘍活性と同様に重要である。放射線暴露や化
学療法に伴い特に潜行して起るのは治療している疾患と
は無関係な新しい腫瘍の出現である。ロイコレギュリン
を併用投与すると、ロイコレギュリンがこれら薬剤の発
癌性作用をブロックするために、化学療法又は放射線療
法においてずっと大量に投与することができる。自己免
疫疾患患者や臓器移植を受けた患者の治療において免疫
抑制剤と共にロイコレギュリンを併用すると同様に有用
であろう。

【００２７】ロイコレギュリンは、リンパ球や単球の補
充や不動化、種々のエフェクター機能を発現するための
活性化や分化、及び細胞毒性機能をロイコレギュリンの
ような因子の産生を包含するサイトカイン−リンホカイ
ンカスケード（cytokine−lymphokine cascade）の末端
要素である。カクテルとして用いるか又はたいてい適当
な順序で投与される種々のリンホカインは、腫瘍のリン
パ球様細胞湿潤を増強し（マクロファージ遊走阻止因
子、インターロイキン−１）、その細胞毒性機能を刺激
し（マクロファージ活性化因子、インターロイキン１及
び２、ロイコレギュリン及びインターフェロン）、直接
的に腫瘍細胞を攻撃し（ロイコレギュリン、ＮＫ細胞毒
性因子及びインターフェロン）、細胞毒性エフェクター
細胞に対する腫瘍標的細胞の感受性を高める（ロイコレ
ギュリン）はずである。この治療形態ではロイコレギュ
リンが非常に重要な役割を持っている。

【００２８】ロイコレギュリンは、腫瘍細胞増強調節活
性及びＮＫ細胞媒介細胞毒性増強活性（共に腫瘍塊の発
達を抑止し減少させ始めるものである）とに加え、生物
医学的診断法及び放射線又は化学療法（これら自体が発
癌を誘発する）に使用する物質と共に用いるのに特に有
用な抗発癌特性をも示す（26）。これらの起りうる副作
用を持つ方法を行う間のロイコレギュリンによる治療は
テスト又は治療期間中の発癌を防ぐであろう（20）。

【００２９】同様に、刺激後のＰＢＬロイコレギュリン
産生を測定することにより、患者の免疫抑制レベル及び
悪性（腫瘍）を形成する可能性のあるリスクを評価する
こともできる。

【００３０】ロイコレギュリン療法に付随して、患者の
癌性細胞のロイコレギュリンに対する感受性を測定する
とロイコレギュリン療法の有効性が予測できるであろ
う。ロイコレギュリンを含有する半固形培地の存在下で
の患者の腫瘍細胞の培養は、腫瘍細胞の増殖を完全に阻
害するに必要なロイコレギュリンの量を定量する手段で
ある。腫瘍細胞上で発現するロイコレギュリン細胞表面
レセプターの量を定量することにより腫瘍反応性を測定
することにより迅速なアッセイとなる。これは、酵素結
合イムノソルベントアッセイ、ラジオイムノアッセイ又
は免疫蛍光アッセイを用いて腫瘍細胞に結合しているロ
イコレギュリンレセプターに対するモノクローナル抗体
の量を測定することによって行われる。

【００３１】

【実施例】実施例１ 以下の考察で用いる略号は次の通り。ＰＢＳ、０．１４
Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．
４；ＰＥＧ、ポリエチレングリコール、分子量４００
０；ＦＢＳ、ウシ胎児血清；ＩＥＦ、等電点電気泳動；
ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＮＫ、ナチュ
ラルキラーリンパ球；ｄＴｈｄ、チミジン；ＭＴＴ、３
−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフ
ェニル−テトラゾリウム ブロマイド；ＦＤＡ、フルオ
レセインジアセテート；ＶＧＮ、コレラ菌（Vibrio cho
lera）ノイラミニダーゼ；ＰＨＡ、フイトヘマグルチニ
ン；ＰＢＬ、末梢血白血球；ＴＰＡ、テトラデカノイル
ホルボールアセテート；ＥＬＩＳＡ、酵素結合イムノソ
ルバントアッセイ；ＲＩＡ、ラジオイムノアッセイ。リ
ンホカイン試料。遠心ヒト正常ドナー血液の軟膜白血球
１０〜２０ｍｌをリンパ球分離培地［ＬＳＭ、リットン
バイオネティクス（Litton Bionetics）、ケンシングト
ン（Kensington）、メリーランド（Maryland）］１０ｍ
ｌ上に層にし、室温にて２０分間、７００×ｇで遠心し
た。ＬＳＭと血漿との界面で単核細胞を集め、ＲＰＭＩ
１６４０培地で２回洗浄し、０．０４％トリパンブル
ーの存在下で顕微鏡で計数して生存率を測定した。生存
率は常に９５％を超えていた。１００ｍｍのプラスチッ
ク製組織培養皿中のＰＨＡ１０μｇ／ｍｌ［ＰＨＡ IV
方白血球凝集素、シグマケミカル社（Sigma Chemical C
o.）、セントルイス（St.Louis ）、ミズーリ（Missour
i）］をを含むＲＰＭＩ １６４０ ２０ｍｌ中に２，
０００，０００個の細胞を載せ、５％ＣＯ₂ と９５％空
気の湿気を帯びたインキュベータ中３７℃でインキュベ
ートした。

【００３２】２４，４８又は７２時間後に、分泌された
リンホカインを含有するリンパ球培地を集め、１０００
×ｇで１０分間遠心して細胞を除去した。アミコン（Am
icon）セル［アミコン社（Amicon, Inc.）、ダンバース
（Danvers ）、ＭＡ］中、ＹＭ１０膜上でリンホカイン
培地を４０倍に濃縮し、ＰＢＳ−０．１％ＰＥＧに対し
透析濾過した。濃縮したリンホカインを濾過滅菌し、ア
リコートを取り、−３０℃で凍結させ、凍結後１カ月以
内に使用した（第１表参照）。

【００３３】リンパ芽球セルラインＲＰＭＩ １７８８
が産生する高純度ヒトリンホトキン（１）は、バーラッ
ト ビー．アガーワル（Bharat B. Aggarwal）博士［ジ
ェネンテク社（Genentech, Inc. ）、サンフランシスコ
（San Francisco ），ＣＡ］が豊富に供給してくれた。
この１７８８セルラインリンホトキシンを逐次ＤＥＡＥ
セルロースクロマトグラフィー，分取用（preparative
）等電点電気泳動，レンズマメ レクチン セファロ
ース（Sepharose ）クロマトグラフィー及び分取用ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で精製した（１）。精製リ
ンホトキシンの分子量は２０，０００、等電点は５．８
であり、蛋白質１ｍｇ当り４×１０⁷ 単位の比活性を有
していた。

【００３４】シリアンゴールデンハムスターのリンホカ
インは前述のヒトリンホカインと同様にして腹膜白血球
から製造された（24）。

【００３５】標的細胞。Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞はジ
ュリー ジュー（Julie Djeu）博士［生物学、食物及び
医薬品局（Bureau of Biologics, Food and Drug Admin
istration ）、ベテスダ（Bethesda）、ＭＤ］が供給し
てくれた。我々の研究室で培養樹立したＯＳＴ細胞は新
たに切除したヒト骨肉腫（osteosarcoma）由来のもので
あり、このヒト骨肉腫はエリザベス グリム（Elizabet
h Grimm ）博士［ＮＩＨ臨床センター（NIH Clinical C
enter ）、ベテスダ（Bethesda）、ＭＤ］が新設にも提
供してくれたものであった。正常なヒト皮膚繊維芽細
胞、ＣＲＬ １４５７（２０才、女）、ＣＲＬ １５０
５（２１才、男）、ＣＲＬ １５３７（１４才、男）、
正常な結腸粘膜細胞及び他の全てのヒト腫瘍セルライン
はアメリカンタイプカルチャーコレクション（American
Type Culture Collection［ロックビル（Rockville
），ＭＤ］から入手した。

【００３６】Ｋ５６２細胞以外の細胞は、全て１０％Ｆ
ＢＳを添加したイーグルス（Eagles）最小必須培地（Ｍ
ＥＭ）中に維持し、１週間に１回継代（subpass ）し
た。Ｋ５６２細胞はＲＰＭＩ １６４０−１０％ＦＢＳ
中に維持した。ネズミαＬ９２９細胞はゲール グラン
ガー（Gale Granger）博士［ＵＳＣ、イルビン（Irvin
e）、ＣＡ］から贈られたものであり、リンホトキシン
の標的として用いた（７）。７９９７細胞はシリアンゴ
ールデンハムスターのベンゾ（ザ）−ピレン誘発腫瘍セ
ルラインである（８）。

【００３７】リンホトキシンアッセイ。放射性核種放出
アッセイ（radionuclide release assay）を用い
（７）、ネズミαＬ９２９細胞の溶解としてリンホトキ
シン活性を測定した。試料中の細胞溶解リンホトキシン
単位数は、３日間のインキュベーションの間に１×１０
⁴ 個のαＬ９２９細胞中で［ ³Ｈ］−ｄＴｈｄラベルを
５０％放出させるサンプル希釈度の逆数の対数の回帰直
線（regression line ）をプロットすることにより測定
した（第２表参照）。

【００３８】ロイコレギュリンアッセイ。ヒトロイコレ
ギュリン活性はヒト腫瘍細胞の増殖阻害［細胞増殖抑制
（cytostatic）活性］として測定した。細胞増殖抑制活
性の場合は、０．５ｍｌの適当な培地中の１０⁴ 個の腫
瘍細胞を２４−ウエルの培養プレート［コスター社（Co
star Inc. ）、ケンブリッジ（Cambridge ）、ＭＡ］に
のせた。培地又は１００倍の範囲に亘って希釈したテス
トサンプルのいずれか０．５ｍｌを３つずつ加え、その
細胞を５％ＣＯ₂ ：９５％空気の湿気を帯びたチャンバ
ー中３７℃で３日間インキュベートした。非付着細胞
は、９ｍｌの血液（Hematal ）中に懸濁し、モデルＺＢ
Ｉコールターカウンター（Coulter Counter）［コール
ターインストルメンツ社（Coulter Instruments, In
c.）、ヒアリー（Hialeah ）、ＦＬ］で計数することに
より定量した。付着細胞は、付着細胞として計数する前
にＰＢＳ中０．０２％のトリプシン中、３７℃で１分間
インキュベートしてはがした（第２表参照）。

【００３９】いくつかの実験では、マイクロアッセイを
用いて細胞増殖の阻害を測定した。このアッセイでは、
ＲＰＭＩ １６４０−１０％ＦＢＳ １００μｌ中２×
１０³ 個の細胞を９６−ウエルのマイクロタイタープレ
ートにのせた。次いで、培地、０．５％ＳＤＳ又はリン
ホカインサンプル１００μｌを４つずつ加え、プレート
を湿気のある９５％空気：５％ＣＯ₂ のチャンバー中、
３７℃で３日間インキュベートした。平底プレートは付
着細胞用に、丸底プレートはＫ５６２非付着細胞用に用
いた。各ウエルに２０μｌのＭＴＴ［シグマ（Sigma
）］（５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ−激しく撹拌して溶解さ
せ、使用前に新しく調製した）を加えた。プレートを３
７℃でさらに４時間インキュベートし、１８ｇニードル
で緩和に吸収することにより培地を除去した。還元ＭＴ
Ｔである紫色の沈澱ホルマザンはイソプロパノール中の
０．０５Ｍ ＨＣｌ １００μｌを添加することにより
溶解した。アーテック（ＡＲＴＥＫ）自動垂直ビームリ
ーダー［アーテックシステムズ社（ARTEK Systems, In
c. ）、ファーミングダール（Farmingdale ）、ニュー
ヨーク（New York）］を用い染料の吸光度を５４０ｎｍ
で読み取った。ブランクとしてＳＤＳを含有するサンプ
ルウエルを用い、他の全てのサンプルの読み取った値か
ら差し引いた。予備実験で、細胞を種々の密度でまき、
形成した還元沈澱の量はウエル当りの細胞数と直接的に
比例することが判った。このマイクロアッセイの感度は
細胞計数アッセイと同等であった。

【００４０】いずれかのアッセイでの細胞増殖のパーセ
ント阻害は、テストサンプルの平均細胞数又は吸光度単
位を培地コントロールウエルの細胞数又は吸光度単位で
割った比から１を引き１００％をかけて計算した。ロイ
コレギュリンの細胞増殖抑制単位は、％阻害に対するサ
ンプルの希釈度の逆数の対数の回帰直線をプロットする
ことによって決定し、細胞増殖の５０％阻害を引き起こ
す希釈度の逆数に等しくした。ヒト結腸癌セルラインＨ
Ｔ−２９はロイコレギュリンの増殖阻害活性に対して感
受性が高く、ロイコレギュリンを測定するスタンダード
としてこれを用い、他の細胞はこれに対して比較した。

【００４１】細胞溶解活性の場合は、腫瘍細胞を
［ ³Ｈ］−ｄＴｈｄで前もってラベルし（７）、２４−
ウエルプレートに０．５ｍｌ／ウエルで１０⁴ 個の細胞
をのせた。培地１／２ｍｌ、０．５％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）、又は１００倍の範囲に亘って希釈し
たテストサンプルを３つずつ加え、細胞を３日間インキ
ュベートした。

【００４２】プレートを２００×ｇで１０分間遠心し、
上清の２００μｌアリコートを取り、ウルトラフルワー
（Ultrafluor）［ＮＥＷ、ボストン（Boston）、ＭＡ］
２．８ｍｌ中に懸濁し、ＬＫＢシンチレーションカウン
ター［ＬＫＢインストルメンツ社（LKB Instruments, I
nc. ）、ロックビル（Rockville ）、ＭＤ］で計数し
た。放出された％比（特異的）［ ³Ｈ］−ｄＴｈｄは次
のように計算した：

【００４３】

【数１】％比［ ³Ｈ］放出＝（サンプル平均ＣＰＭ−培
地平均ＣＰＭ）／（平均ＣＰＭ_SDS −平均ＣＰＭ培地） リンホトキシンの細胞溶解単位と同様にして細胞溶解ロ
イコレギュリン単位数を計算した。

【００４４】発癌アッセイ。化学物質及び放射線で誘発
されたシリアンゴールデンハムスター胎児細胞の悪性変
換（transformation）のシリアンゴールデンハムスター
リンホカイン試料による抑制を、前述の如くインビボ
（ｉｎ ｖｉｖｏ）−インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
経胎盤変換アッセイを用いて研究した（２４，２５）。
（第３表参照）。

【００４５】インターフェロンアッセイ。インターフェ
ロンは、バイオフルイズ社（Biofluids, Inc. ）［ロッ
クビル（Rockville ）、ＭＤ］でヒト新生児包皮の繊維
芽細胞すなわちＷＩＳＨ細胞の牛小疱性口内炎感染によ
るセミ−マイクロ細胞変性効果（semi-microcytopathic
effect ）の抑制を測定することによってアッセイし
た。このヒトＷＩＳＨセルラインはγ−インターフェロ
ンに対する感受性がヒト包皮細胞より５〜１０倍高い。
このアッセイの検出限界は、ＮＩＨ基準ヒト繊維芽細胞
インターフェロンに対して規格化した抗ウイルス活性１
単位である（第４表参照）。

【００４６】いくつかの実験では、細胞バイオアッセイ
に対するα及びγ−インターフェロンの作用を測定し
た。［シグマ（Sigma ）社から購入した］α−インター
フェロンはセンダイ（Sendai）ウイルスでの誘発により
バーキット（Burkitt ）リンパ腫細胞［ナマルバ（Nama
lva ）］中で産生されたもので、１．１×１０⁶ 国際基
準単位／ｍｇ蛋白質の比活性を有していた。１０⁵ 抗ウ
イルス単位／ｍｌの比活性を有するγ−インターフェロ
ンは親切にもガーリー ターマン（Gary Thurman）博士
［ＮＣＩ、フレデリック癌研究所（Frederick Cancer R
esearch Facility，フレデリック（Frederick ）ＭＤ］
から供給されたもので、フローラボラトリーズ社（Flow
Laboratories, Inc. ）［マクリーン（McLean）、Ｖ
Ａ］及びメロイラボラトリーズ（Meloy Laboratorries
）［スプリングフィールド（Springfield ）、ＶＡ］
によって生物学的反応モディファイヤーズプログラム
（Biological Response Modifiers Program ）［ＮＣＩ
フレデリック癌研究所（NCI Frederick Cancer Researc
h Facility）、フレデリック（Frederick ）、ＭＤ］用
に調製されたものであった（第５表参照）。

【００４７】インターロイキン１及び２。インターロイ
キン１活性は、ＰＨＡに反応するＣ３Ｈ／ＨｅＪネズミ
胸腺細胞の増殖のリンホカインによる増強を測定するこ
とにより決定した（18）。胸腺細胞増殖は１０⁵ 抗ウイ
ルス単位／ｍｌの存在も反映し得る。これは親切にもガ
ーリー ターマン（Gary Thurman）博士［ＮＣＩ、フレ
デリック癌研究所（Frederick Cancer Research Facili
ty）、フレデリック（Frederick ）、ＭＤ］から供給さ
れたものであり、フローラボラトリーズ社（FlowLabora
tories, Inc. ）及びメロイラボラトリーズ（Meloy Lab
oratorries ）［スプリングフィールド（Springfield
）、ＶＡ］によって生物学的反応モディファイヤーズ
プログラム（Biological Response Modifiers Program
）［ＮＣＩフレデリック癌研究所（NCI Frederick Can
cer Research Facility）、フレデリック（Frederick
）、ＭＤ］用に調製されたものである（第５表参
照）。

【００４８】インターロイキン１及び２。ＰＨＡに反応
するＣ３Ｈ／ＨｅＪネズミ胸腺細胞増殖のリンホカイン
による増強を測定することによりインターロイキン１活
性を決定した（18）。胸腺細胞増殖は又インターロイキ
ン２の存在も反映するであろう。従って、ヒトインター
ロイキン２に感受性のＯＨ−１マーモセット連続Ｔセル
ラインのインターロイキン２依存性増殖に基づく標準マ
イクロアッセイを用い、リンホカインをインターロイキ
ン２についてもテストした（３，２２）。ヒトインター
ロイキン２スタンダード［ピー．ジャガナス（P. Jagan
nath）博士、リットン バイオネティック社（Litton B
ionetics, Inc.）、ケンシングトン（Kensington）、Ｍ
Ｄから提供された］は１：１５００の希釈度で半最大増
殖（half maximal proliferation）増強を示した。ヒト
インターロイキン１のスタンダードは、本明細書中に記
載のリンホカイン製造法を用いて我々の研究室で調製し
た（第４表参照）。

【００４９】マクロファージ活性化及びエンドトキシン
アッセイ。この２つのアッセイは親切にもガーリー タ
ーマン（Gary Thurman）博士、ＮＣＩ、フレデリック癌
研究所（Frederick Cancer Research Facility）、フレ
デリック（Frederick ）、ＭＤが実施してくれた。マク
ロファージ活性化活性は、リンホカインがヒト腫瘍細胞
に対するヒト単球の細胞毒性活性を増強する能力として
測定した（14）。エンドトキシンは、約０．１ｎｇまで
の感度の色素源アッセイ［エンドトキシン色素源アッセ
イキット、Ｍ．Ａ．、バイオプロダクツ（Bioproducts
）、ワーカーズビル（Walkersville）、ＭＤ］で測定
した。腫瘍細胞増殖阻害に対するエンドトキシンの影響
の可能性についても検討した。血清型番号０５５：Ｂ５
と０１１１：Ｂ４のエンドトキシン（リポポリサッカラ
イド）［シグマ（Sigma ）］は０．０１、０．１、１．
０、１０．０及び２０ｎｇ／ｍｌの濃度で腫瘍細胞の細
胞増殖抑制アッセイに添加した。腫瘍細胞増殖に対する
作用は上記の如く測定した（第４表参照）。

【００５０】等電点電気泳動。濃縮リンホカインサンプ
ルの分取用カラム等電点電気泳動は１１０ｍｌの等電点
電気泳動カラム（ＬＫＢ）中、ｐＨ３．５−１０のアン
ホリン（ampholine ）［ＬＫＢ、ロックビル（Rockvill
e ）、ＭＤ］勾配で行った（28）。３ｍｌの画分を集
め、各画分のｐＨを測定した。選んだ画分をプールし、
ＰＢＳ−０．１％ＰＥＧに対し透析濾過し、０．２２μ
ミレックス（Millex）フイルター［［ミリポア社（Mill
ipore Corp. ）、ベッドフォード（Bedford ）、ＭＡ］
で濾過殺菌し、生物学的活性を測定した（第４表と第８
図参照）。

【００５１】ＨＰＬＣ。分取用東洋ソーダ（Toya soda
）Ｇ３０００ＳＷＧゲルＨＰＬＣカラム（ＬＫＢが販
売）を用い、分子サイズによる分離を行った。０．１％
ＰＥＧ含有０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐ
Ｈ７．４）を用い、４ｍｌ／分の流速で２ｍｌのサンプ
ルを均等（isocratically ）に溶出した。４ｍｌの画分
を集め、濾過滅菌し、生物学的活性についてアッセイし
た（第４図参照）。

【００５２】分子の電荷によるＨＰＬＣ分離は東洋ソー
ダ（Toyo soda ）ＤＥＡＥ−５４５分析用アニオン交換
カラムで行った。０．１％ＰＥＧ含有２０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）中のサンプルを０．７５ｍｌ／分の
流速で０．５ｍ ＮａＣｌの直線１時間勾配で溶出し
た。２分間の画分を集め、濾過滅菌し、アッセイした
（第９図参照）。

【００５３】ポリアクリルアミドゲル電気泳動。濃縮し
たロイコレギュリンサンプル（未分画又はＨＰＬＣゲル
濾過及びイオン交換クロマトグラフィーで分離）を４〜
３０％直線勾配ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し
た（１６）。電気泳動後、ゲルを０．２５ｍｍの切片に
スライスし、培地−１０％ＦＢＳ中でスライスを１晩溶
出した。溶出液を濾過滅菌し、アッセイした（第５図参
照）。

【００５４】¹²⁵Ｉでラベルした精製ロイコレギュリン
も１％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する５％アクリ
ルアミド積層ゲルを用いて１５％ポリアクリルアミドゲ
ル上で電気泳動した（１５）。オートラジオグラフィー
でサンプルを可視化した（第７図参照）。

【００５５】精製したロイコレギュリンの放射性標識
（ラベル）。逐次ＨＰＬＣ及びポリアクリルアミドゲル
電気泳動で精製したロイコレギュリン２５単位を、クロ
ラミンＴ法（１７）を用い、かつセファデックス（Seph
adex）Ｇ−１０カラム上で未反応¹²⁵Ｉからラベルした
ロイコレギュリンを分離するためのキャリア蛋白質とし
てウシ血清アルブミンを添加して、 ¹²⁵Ｉでラベルし
た。

【００５６】ゲル濾過カラムクロマトグラフィー。 ¹²⁵
Ｉでラベルした精製ロイコレギュリンをＳ−３００［フ
ァルマシア ファイン ケミカルズ（Pharmacia Fine C
hemicals）、ウプサラ（Upsala）、スウェーデン（Swed
en）］カラム上でｐＨ７．４の１０ｍＭ ＮａＰＯ₄ バ
ッファー１．０Ｍ ＮａＣｌで溶出した。２ｍｌの画分
を集め、計測（カウント）した（第６図参照）。

【００５７】酵素的消化。ノイラミニダーゼ及びプロテ
アーゼ消化に対するヒト及びハムターロイコレギュリン
及びリンホトキシン活性の感受性を評価した（29）。５
０μｌのＶＣＮ［５００単位／ｍｌ、カルビオケム−ベ
ーリング社（Cal-biochem-Behring Corp. ）、ラジョラ
（Lajolla ）、ＣＡ］及び０．５ｍｌのｐＨ５．１の
０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーに、０．５ｍｌの濃
縮ヒト又はハムスターリンホカイン試料を添加した。コ
ントロールとして、同じ酢酸塩バッファー０．５ｍｌ、
５０μｌのＶＣＮ及び０．２Ｍのシアル酸５０μｌ［シ
グマ（Sigma ）］（この濃度のシアル酸は酵素を不活性
化する）を含有する同酢酸塩をバッファー０．５ｍｌ、
又は０．５ｍｌの培地に０．５ｍｌのリンホカインを添
加した。サンプルを３７℃で６０分間インキュベート
し、ＹＭ１０メンブレンを持つアミコン（Amicon）セル
中でＰＢＳ−ＰＥＧに対して透析し、サンプル容量を３
ｍｌに調整した。蛋白質分解的消化には、ＰＢＳ中のト
リプシン１ｍｌ［３２単位／ｍｌ、比活性１９５単位／
ｍｇ、ワーチングトン酵素社（Worthington Enzymes In
c.)、フリーホールド(Free old）、ＮＪ］、ＰＢＳ中のキモトリ
プシン１ｍｌ［６単位／ｍｌ、比活性５９単位／ｍｇ、
シグマ（Sigma ）］、又は３ｍＭ ＣａＣｌ₂ 及び３％
トルエン含有０．１Ｍトリス塩基中のプロナーゼ１ｍｌ
［６単位／ｍｌ、比活性６単位／ｍｇ、シグマ（Sigma
）］にリンホカインサンプル１ｍｌを加えた。プロナ
ーゼは、サンプルに添加する直前に、１０ｍｇプロナー
ゼ／ｍｌ ０．１Ｍトリス−１５ｍＭ ＣａＣｌ₂ （ｐ
Ｈ７．８）を３７℃で３０分間インキュベートして活性
化した。プロテアーゼを含むサンプル又はプロテアーゼ
バッファーコントロールは３７℃で６０分間インキュベ
ートした。１ｍｌのＦＢＳを各サンプルに加え、アッセ
イ用にサンプルを１００倍の範囲に亘って培地で希釈し
た（第３表参照）。

【００５８】ＮＫ細胞毒性アッセイ。ＮＫ−媒介細胞毒
性に対するロイコレギュリン処理後の標的細胞感受性の
増強は主として前述の如く測定した（23）。ＬＳＭ勾配
遠心分離で単離した正常ヒト末梢血単核細胞をナイロン
ウールに通してマクロファージとＢ細胞を除去し、ＮＫ
細胞を多くした。１００μＣｉの⁵¹Ｃｒをクロム酸ナト
リウム［ＮＥＮ、ボストン（Boston）、ＭＡ］として添
加することにより、Ｋ５６２標的細胞を１８時間ラベル
した。標的細胞を１６４０−１０％ＦＢＳで３回洗浄
し、培地又は培地中に希釈したリンホカインサンプル１
ｍｌ当り２．５×１０⁵ 細胞となるように懸濁した。次
いで、標的細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、
２８０×ｇで５分間遠心し、１０⁵ 細胞／ｍｌの濃度で
１６４０−１０％ＦＢＳ中に再懸濁した。１００μｌの
培地又は標的細胞に対するエフェクターの比、２５：
１、１０：１もしくは２．５：１でエフェクター細胞を
含有する試験管に１００μｌの細胞を添加した。次に、
４時間の⁵¹Ｃｒ放出アッセイを行った（23）。細胞を培
地でプレインキュベートしてもリンホカイン中でプレイ
ンキュベートしても自然に起る⁵¹Ｃｒの放出は１５〜２
０％の範囲であった。培地中でインキュベートした標的
細胞とリンホカイン中でインキュベートした標的細胞と
のＮＫ細胞毒性の溶解単位を比較してリンホカインの増
強の程度を測定した。標的細胞から⁵¹Ｃｒを１５％特異
的に放出させるリンパ球数として定義される１溶解単位
はバン クローグ（Van Krough）式を用いて計算した
（２１，３２）（第６表及び図３参照）。

【００５９】流動細胞計測分析。Ｋ５６２細胞をＲＰＭ
Ｉ １６４０−１０％ＦＢＳ中に４×１０⁶ ／ｍｌで再
懸濁した。２５０μｌの細胞懸濁液を１２×７５ｍｍの
プラスチック製チューブ中に入れると共に２５０μｌの
リンホカインサンプルを加えて処方した。６サイクル／
分のプラットホーム ロッカー［ベルコ グラス社（Be
llco Glass Co.）、バインランド（Vineland）、ＮＪ］
上、５％ＣＯ₂ ：９５％湿潤空気雰囲気下、３７℃でチ
ューブを３０分〜６時間インキュベートした。

【００６０】装置：流動細胞計測分析は、励起源として
の５Ｗアルゴン−イオンレーザー、２５６チャンネルの
パルス高アナライザー、及び対数増幅器を備えたＦＡＣ
ＳIV蛍光活性化セルソーター［ベクトン−デイキンソン
（Becton-Dickinson）、サニーバイル（Sunnyvale ）、
ＣＡ］を用いて行った。細胞は、ＭＩＬＬＩ−Ｑ濾過し
た［ミリポア社（millipore Corp. ）、ベッドフォード
（Bedford ）、ＭＡ］Ｈ₂ Ｏのシース流体中で直径７０
μのノズルを通して通過させた後の小角前方光散乱（na
rrow angle forward light scatter）及び蛍光について
分析した。小角前方光散乱シグナルは細胞の大きさ及び
計上の指標であり、全ての分析のトリガーシグナルとし
て用いた。他に特記しない限り、全ての光学フィルター
は機器と共にベクトン−デイキンソン（Becton-Dickins
on）から得た。

【００６１】ＦＤＡ蛍光染色（fluorochromasia ）：細
胞膜透過性を測定するためにＦＤＡを用いた（５）。５
ｍｇＦＤＡ／ｍｌの濃度でアセトン中にＦＤＡの結晶を
溶かしてＦＤＡ［ポリサイエンス社（Polyscience, In
c. ）、ワーリングトン（Warrington）、ＰＡ］の保存
溶液（stock solution）を作製した。使用直前に、最終
濃度６．２５μｇＦＤＡ／ｍｌとなるように保存溶液を
ＲＰＭＩ １６４０−１０％ＦＢＳで希釈した使用溶液
（working solution）を調製した。Ｋ５６２細胞をリン
ホカインで処理した後、細胞をＲＰＭＩ １６４０−１
０％ＦＢＳで１回洗浄し、６．２５μｇ／ｍｌの使用Ｆ
ＤＡ溶液１ｍｌ中に再懸濁し、室温で５分間インキュベ
ートし、次いで流動細胞計測計で分析した。

【００６２】ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）
蛍光染色：ヨウ化プロピジウムも細胞膜透過性測定に使
用した。５００μｇ／ｍｌの濃度でｐＨ７．４のＰＢＳ
中にヨウ化プロピジウム［カルビオケム−ベーリング社
（Calbiochem-Behring Corp.）、ラジョラ（La Joll
a）、ＣＡ］を溶かしてヨウ化プロピジウムの保存溶液
を作製した。使用直前に、０．２μｇヨウ化プロピジウ
ム／ｍｌの最終濃度となるように保存溶液をＰＢＳで希
釈して使用溶液を調製した。リンホカイン処理後に、細
胞をＲＰＭＩ １６４０−１０％ＦＢＳで１回洗浄し、
ヨウ化プロピジウムの使用溶液１ｍｌに再懸濁し、室温
で５分間インキュベートし、次いで流動細胞計測計で分
析した。

【００６３】蛍光測定：ＦＤＡ及びヨウ化プロピジウム
の両者に使用する励起波長は同じで、４００ｍＷで４８
８ｎｍであった。蛍光検出電子倍増管の正面に長いパス
の５１５及び５２０ｎｍの光学ガラスフィルターを置い
た。ヨウ化プロピジウムでラベルしたサンプルメを分析
するときには、電子倍増管の正面に更に赤色付加二色フ
ィルター［コリオン社（Corion Corp.）、ホリスター
（Hollister ）、ＭＡ］を置いた。各実験の前に、培地
で処理したＫ５６２細胞を使って流動細胞計測器を微調
整した。ゲインコントロールと電子倍増管電圧とを調整
して、分析した２×１０⁴ 細胞の９０％が、２５６チャ
ンネルの全スケール内の予め決めた範囲のチャンネルに
入るようにした。この研究では、調べる３つのパラメー
タ（前方小角光散乱、フルオレセイン蛍光及びヨウ化プ
ロピジウム蛍光）の各々についてこれを行った。培地処
理したコントロール細胞については、散乱及びフルオレ
セイン蛍光はチャンネル範囲の上部に、ヨウ化プロピジ
ウム蛍光は下部にセットして、リンホカイン処理細胞中
の適切なシフトを測定するようにした。各Ｋ５６２細胞
サンプルの処理では、２×１０⁴ 細胞を分析し、予め決
めたマーカー領域内にある細胞のパーセントを計算し
た。次いで、培地処理したコントロールのパーセント
（約９０％）から前記のパーセントを引いて、サンプル
のパーセント変化を得た。パーセント変化は−５〜＋７
０であった。プラスの方向への変化は測定するパラメー
タについてリンホカイン処理で起ったＫ５６２細胞に対
する効果を示す（図１０参照）。

【００６４】実施例２ ヒトＢセルラインとロイコレギュリンを分泌するハイブ
リドーマの生成 癌患者を、２０，０００ｒａｄの照射によって解離して
１０⁷ 個のＢＣＧ生菌と混合した自分自身の腫瘍細胞で
皮内免疫した。これらの患者の静脈血から調製した末梢
血白血球を、、骨髄腫１当りＰＢＬ３の比で、ネズミＮ
Ｓ−１骨髄腫細胞と混合し、遠心し、１００μｌの無血
清培地に再懸濁した。３７℃に予熱したポリエチレング
リコール（５０％ｗ／ｖ）１ｍｌを、チューブを常に攪
拌しながら１分間に亘り細胞ペレットに滴加した。５０
ｍｌのチューブが一杯になるまで、１分間に亘り細胞懸
濁液に前量の２倍量の予熱した無血清培地を加えた。８
００ＲＰＭ、１５分間で細胞はペレットになった。２．
５×１０⁶ 細胞／ｍｌ（融合前のカウント）の濃度でＨ
Ｔ培地（２０％胎児ウシ血清、ヒポキサンチン１３．６
μｇ／ｍｌ及びチミジン３．９μｇ／ｍｌを含有するＤ
ＭＥＭ）中に細胞を緩やかに再懸濁し、１００μｌをマ
イクロタイターの各ウェルに加えた。２４時間後に、各
ウェルにＨＡＴ培地（０．１８μｇ／ｍｌアミノプテリ
ン含有ＨＴ培地）１００μｌを加えた。３日毎に培地の
半量を新しいＨＡＴ培地と取り替えた。ＨＡＴ培地中に
１４日間維持した後、更に２週間細胞をＨＴ培地上に維
持した。この時点で、２０％胎児ウシ血清を含有するＭ
ＥＭ培地上で細胞を増殖した。

【００６５】又、ＰＢＬを骨髄腫細胞と共培養したもの
を用い形質転換した二倍体Ｂ細胞を創成してもよい。前
述の如く、ＰＢＬと骨髄腫細胞とを（３：１の比で）混
合し、８００ＲＰＭでペレット化し、ＨＡＴ培地中で選
択した。

【００６６】標的としてＨＴ−２９細胞を用いるマイク
ロアッセイで、ハイブリドーマ又は形質転換した二倍体
Ｂ細胞の上清中の分泌ロイコレギュリンをテストした。
ロイコレギュリンを産生する細胞をＭＥＭ−１０％ＦＢ
Ｓ中に拡げ、十分な数が得られたときに、無血清培地中
でのロイコレギュリン産生の最適条件を決定するための
実験を行った。２×１０⁵ ／ｍｌＲＰＭＩ １６４０の
濃度で細胞を懸濁し、３７℃で３日間インキュベートし
た。いくつかの実験では、ロイコレギュリン産生を刺激
するために培養物にテトラデカノイルホルボールアセテ
ート１０ｎｇ／ｍｌを添加した。上清を集め、８０×ｇ
で遠心し、ロイコレギュリン活性についてアッセイし
た。

【００６７】実施例３ ロイコレギュリン細胞表面レセプターに対するモノクロ
ーナル抗体の調製 ２週間隔で３回、Ｋ５６２膜を皮下注射してＢａｌｂ／
ｃマウスを免疫した。モーター駆動テフロン製ホモジナ
イザーで均一にして調製し、低速遠心で清澄化し、次い
で１００，０００×ｇで１時間超遠心して集めた１０⁷
個の細胞と同等の膜を各々マウスに与えた。各ブースタ
ー用には膜を完全フロインドアジュバントと混合した。
ハイブリッド形成の３日前に、ＰＢＳ中のＫ５６２細胞
膜をマウスに腹腔内注射した。融合の日に脾臓を取り出
し、単個細胞を得、脾臓細胞：骨髄腫細胞が３：１の割
合でＰＥＧを用いて融合した。融合後、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地で培養
することによりハイブリッドを選択した（１０）。ロイ
コレギュリンレセプターに対する抗体を産生するコロニ
ーを限界希釈法でクローン化した。

【００６８】ＨＴ−２９細胞のロイコレギュリン指向の
増殖遅滞の阻害を測定する生物学的アッセイを用い、ロ
イコレギュリンレセプターに対する抗体を検出した。９
６−ウエルプレートのウエル中の０．１ｍｌのＭＥＭ−
１０％ＦＢＳ中に２０００個のＨＴ−２９細胞を載置し
た。ＨＴ−２９細胞の増殖を５０％阻害するに十分な
０．１ｍｌ中のロイコレギュリンを加え、次にテスト抗
体含有上清２５μｌを加えた。３日間インキュベートし
た後、前述の如くＭＴＴで染色して存在する細胞の量を
測定した。ロイコレギュリン活性を２５％以上阻害する
サンプルを陽性と考えた。このアッセイの原理は、モノ
クローナル抗体がロイコレギュリンレセプターと結合
し、それにより、ロイコレギュリンの結合及びその後の
増殖阻害活性を抑制するということである。

【００６９】ロイコレギュリンレセプターの発現の定量
を３つの方法で行ったが、いずれもロイコレギュリンレ
セプターに対するモノクローナル抗体のパーセントを定
量した。免疫蛍光アッセイでは、２×１０⁵ 個の細胞を
モノクローナル抗体と共に３７℃で１時間インキュベー
トした。細胞を２回洗浄し、蛍光結合ヤギ抗マウス免疫
グロブリン［キルケガード及びペイリーラボス［Kirkeg
ard and Peiry Labs）、ロックビル（Rockville ）、Ｍ
Ｄ］を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細
胞を洗浄し、ＰＢＳ ０．５ｍｌ中に再懸濁し、緑色蛍
光を励起するための４８８レーザー線を用いるＥＰＩＣ
Ｓ ５流動細胞計測計［コールター インストルメンツ
（Coulter Instruments ）、ヒアリー（Hialeah ）、Ｆ
Ｌ］で分析した。結合体（conjugate ）としてＥＬＩＳ
Ａではホースラディッシュペルオキシダーゼヤギ抗−マ
ウス免疫グロブリンを用い、ＲＩＡでは ¹²⁵Ｉ−ラベル
ヤギ抗−マウス免疫グロブリンを用いたことを除いて
は、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡは同様の方法で行った。ＥＬ
ＩＳＡアッセイでは、ＡＲＴＥＫ自動読み取り機で水解
された基質量を測定することにより比色定量した。ＲＩ
ＡはＬＫＢガンマカウンター［ＬＫＢインストルメンツ
（LKB Instruments ）、ロックビル（Rockville ）、Ｍ
Ｄ］を用い結合した ¹²⁵Ｉ−ラベルを測定して定量した
（第８表参照）。

【００７０】実施例４ 寒天クロノジェニックアッセイ（agar clonogenic assa
y ）を用いた、患者腫瘍細胞のロイコレギュリンに対す
る感受性の測定 腫瘍細胞は正常細胞に比べ、半固形培地で増殖する独特
の能力を有している。この腫瘍細胞の特性により、切除
したヒト腫瘍の解離したばかりの細胞に対する癌治療剤
の作用を定量する手段が提供される。手術で得られた結
腸腫瘍を細切し、コラゲナーゼ及びＤＮＡ分解酵素（Ｄ
ＮＡａｓｅ）で解離して単個細胞懸濁物を得た（11）。
ロイコレギュリンを種々の濃度で加えること以外はケル
ン（Kern）の方法（12）に従って、細胞を培地内の０．
１５％寒天に懸濁した。寒天培地中に懸濁して増殖する
腫瘍細胞コロニーの発達を１０〜１４日のインキュベー
ション後に定量した（第９表参照）。

【００７１】実施例５ ロイコレギュリン遺伝子のクローニング 上記の如く、生物学的及び生化学的の両者でロイコレギ
ュリンが定義され、従って、ロイコレギュリンを同定し
単離する方法が得られたので、従来の広く公表されてい
るアプローチ及びプロトコール［例えば、マニアチス
（Maniatis）ら、分子クローニング：実験マニュアル
（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、コール
ド スプリング ハーバー出版（Cold Spring Harbor P
ress）、コールド スプリング ハーバー（Cold Sprin
g Harbor）、ＮＹ、１９８２年］を用いて、ロイコレギ
ュリンのクローン化及び発現が行われる。これらの手順
は前記実施例に開示された感度のあるバイオ−アッセイ
に基く。アッセイを開発し、ロイコレギュリンを生物学
的及び生化学的に定義したので、大腸菌（E. coli ）又
は他の適切な宿主生物中で、アミノ酸配列と生物学的活
性が真正天然ロイコレギュリンと同等である蛋白質又は
その生物学的に活性なサブユニットを産生するために、
標準的な組換えＤＮＡ及びクローニング手法を用いるこ
とができる。クローニング手順の外観を図１１に示す。
この方法は、グレイ．ピー．ダブリュ．（Gray. P.W.）
らがネイチャー（Nature）３１２巻、７２１頁（１９８
４年）に報告したものと同様のプロトコールを用いて細
菌内で発現した多くの生物学的に関連する真核性遺伝
子、特にヒトリンホカイン、すなわちリンホトキシンで
行った方法と等価である。この実験例で引用したこの論
文及び他の論文はその全体を参考文献として本明細書中
に含むものとする。

【００７２】クローン化の例は６つの異なる段階として
検討できる（図１１参照）。これら各ステップの原理を
下記に示す。

【００７３】第Ｉ段階 バイオアッセイ、精製及び生物学的特性化 この分析は、クローン化実験を行う前に必ず行わなけれ
ばならない。この研究の詳細は本出願で示すデータであ
る。上記の如くこのデータを解明した後、次に遺伝子工
学を続けることができる。

【００７４】第ＩＩ段階 大腸菌（E. coli ）の遺伝子ライブラリー 天然起源のロイコレギュリンの特性化に基き細菌のクロ
ーンを構築する。本出願はヒト末梢血リンパ球（ＰＢ
Ｌ）によるロイコレギュリン産生の刺激方法を開示して
いるので、これらの細胞はロイコレギュリン合成に必要
な遺伝情報を持っていなければならず、明らかにロイコ
レギュリン遺伝子の起源である。刺激した細胞集団を用
いて、ロイコレギュリンのｍＲＮＡを含有するｍＲＮＡ
を単離する。このＰＢＬｍＲＮＡを使用して、例えば大
腸菌（E. coli ）又は他の宿主生物中でｃＤＮＡライブ
ラリーを構築する。

【００７５】第ＩＩＩ段階 生化学的特性化、アミノ酸配列 上記で検討したように、ロイコレギュリン蛋白質は生化
学的に特性化され、均質に精製された。次のようなステ
ップはこの天然材料を用いてロイコレギュリン蛋白質ア
ミノ酸配列を明らかにすることである。この研究は、得
られた遺伝子クローンが真正ロイコレギュリンに対応す
ることを確認するために必要であり、従来の生化学的配
列決定法で行う。

【００７６】第ＩＶ段階 免疫スクリーニングによる遺伝子の単離 遺伝子単離のこのアプローチは第ＩＩ段階完了直後に開
始できる。この実験用の重要な試薬は天然ロイコレギュ
リンに対する抗−ロイコレギュリン抗体であり、これは
動物を免疫するに充分な天然ロイコレギュリンを精製し
た後に調製できる。この技術は種々の遺伝子に関して大
腸菌（E. coli ）遺伝子ライブラリーをスクリーンする
のに用いてうまくいっており、ヘルフマン，ディー．エ
ム．（Helfman, D.M. ）ら、ＰＮＡＳ，８０巻、３１〜
３５頁（１９８３年）及びヤング、アール．エー．（Yo
ung R.A.）及びアール．ダブリュ．デイビス（R.W. Dav
is）、ＰＮＡＳ，８０巻、１１９４〜１１９８頁（１９
８３年）に教示されている。

【００７７】第Ｖ段階 ＤＮＡプローブによる遺伝子の単離 これはもう１つの最も広く使われている、組換えＤＮＡ
大腸菌（E.coli）ライブラリーからの遺伝子単離方法で
ある。ノイエス（Noyes ）ら［ＰＮＡＳ、７６巻、１７
７０〜１７７４頁（１９７９年）］が最初に示したよう
に、真核性ｍＲＮＡを単離し特性化するために合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドプローブを用いる。このプロー
ブは、天然の蛋白質の部分的なアミノ酸配列を先ず決定
し、次いでこの部分的なアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列を合成することにより調製したロイコレギ
ュリン用のＤＮＡ配列の小部分である。この合成ヌクレ
オチド配列は、例えばイタクラ ケー．（Itakura K.）
らがジェー．アム．ケム．ソク．（J. Am. Chem. Soc.
）９７巻、７３２６頁（１９７５年）に記載したよう
に、化学的に調製できる。１例として、ガストリンｍＲ
ＮＡと特異的にハイブリダイズするドデカヌクレオチド
ｄ（ＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡ）を特定するためにガス
トリンからのアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕを用いた。同様に、ロイコレギュリン用にはロイコ
レギュリン産生細胞からの天然のｍＲＮＡとハイブリダ
イズするプローブとして合成ＤＮＡ断片を用いる。例え
ば、放射性同位元素（ｔａｇ）と従来の方法を用い、ロ
イコレギュリン用のｍＲＮＡをＲＮＡ混合物から分離す
る。これらの手順に用いる方法はマニアチス（Maniati
s）ら、上掲：グッドマン（Goodman ）ら、米国特許第
４，２８３，４８９号及び第４，３６３，８７７号及び
そこに引用されている参考文献中で論じられている。

【００７８】これらの結果を拡張してｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングにこのようなプローブが用いられ
た［クレア，アール．（Crea, R.）及びホーン，ティ
ー．（Horn, T.）、ヌク．アシッド リス（Nuc Acid R
es）８巻、２３３１〜２３４８頁（１９８０年）］。最
近、アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｙｓ−Ａ
ｓｐで予期されるテトラデカヌクレオチドのセット

【００７９】

【化１】 を用いて、大腸菌（E. coli ）中でヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子遺伝子ｃＤＮＡのクローンを検出し
た［ペニカ．ディー．（Pennica, D. ）ら、ネイチャー
（Nature）３０１巻、２１４〜２２０頁、１９８３
年］。

【００８０】第ＶＩ段階 遺伝子の組み立て、微生物発現 クローン化の最後の段階は真核生物構造遺伝子の完全な
コピーの慣用の組み立てと、ロイコレギュリン又は生物
学的に活性なそのサブユニットを産生する遺伝子の翻訳
である。この遺伝子を遺伝子工学的に微生物で発現させ
る手順は種々の宿主により異なる方法で行う。ベクター
の調製、宿主細胞の形質転換及び翻訳や発現の実施には
種々の選択があり、リストするには多すぎるが、手順は
従来のものであり、多数の総説、例えばマニアチス（Ma
niatis）ら、上掲、遺伝子増幅及び分析：原核及び真核
細胞におけるクローン化遺伝子の発現（Gene Amplifica
tion and Analysis: Expression of Cloned Genes in P
rokaryotic and Eukaryotic Cells ）、パパス．ティ
ー．エス．（Papas, T. S.）、ローゼンベルグ，エム．
（Rosenberg, M. ）、及びキリグキジイアン，ジェー．
ジー．（Chirigkjian,J. G.）エルセピア サイエンス
出版社（Elsevier Science Publishing Co., Inc. ）、
ＮＹ、１９８３年、バーマン（Berman）ら、米国特許第
４，５０３，１４２号及びそこに引用されている参考文
献中に述べられている。

【００８１】分子構造に修飾をもつ可能性のあるロイコ
レギュリンの修飾型又は生物学的に活性なそのサブユニ
ットを合成できるということも本発明の範囲内と考えら
れる。このような修飾ロイコレギュリンは効果が増強さ
れ、副作用が減少し安定性が増加するというように高ま
った有用性を示すことができる。又はこのような修飾ロ
イコレギュリンは、それによってロイコレギュリンが特
定されている同等な活性又はそれ以下だが適当な活性を
示し得る。しかしながら、分子構造や生物学的活性の大
部分が本明細書中に定義したロイコレギュリンと同じで
ある全ての場合、これは均等又は正常な修飾であると考
えるべきであり、それ故、本出願の一部と考えるべきで
ある。

【００８２】図面及び表の説明 図１ ヒト腫瘍細胞の細胞溶解 リンホトキシン濃度が等価であるときの、ロイコレギュ
リン含有ヒトＰＢＬリンホカインによるもの（白丸−−
白丸）及び精製１７８８セルラインリンホトキシンによ
るもの（黒丸−黒丸）。サンプル平均の標準偏差は最
大２％であった。

【００８３】しかしながら、ヒトリンホカインとリンホ
トキシンとはヒトの白血病、肉腫及び癌細胞に対する細
胞溶解活性をほとんど又は全く持っていなかった。１０
００単位のリンホトキシン／ｍｌを含有するリンホカイ
ンサンプルで、最大のＲＰＭＩ２６５０癌細胞の５０％
の溶解が観察された。

【００８４】図２ ヒト腫瘍細胞の増殖阻害 等価のリンホトキシン濃度で、ロイコレギュリン含有ヒ
トリンホカインによるもの（白丸−−白丸）及び精製１
７８８セルラインリンホトキシンによるもの（黒丸−
黒丸）。サンプル平均の標準偏差は最大で５％であっ
た。細胞計数アッセイを用いて％増殖阻害を測定した。

【００８５】高純度の１７８８セルラインリンホトキシ
ンは３種の腫瘍細胞の各々を溶解しなかった。ヒト腫瘍
細胞に対する溶解活性は低いにもかかわらず、ヒトリン
ホカインはヒト腫瘍細胞の増殖を有意に阻害した。しか
しながら、精製１７８８セルラインリンホトキシンは５
００及び１０００リンホトキシン単位／ｍｌの濃度での
み有意に増殖を阻害した。更に、これらの濃度での増殖
阻害は、そこで精製リンホトキシンを調製したｐＨ８．
４の炭酸アンモニウムバッファの増殖抑制の影響による
ものであっただろう。

【００８６】図３ ＮＫ−媒介細胞毒性に対する標的細胞の感受性の増強 ロイコレギュリン含有ヒトリンホカインによるもので精
製ヒトリンホトキシンによるものではない。４０リンホ
トキシン単位／ｍｌのヒトリンホカイン（白丸−−白
丸）、４０単位／ｍｌの精製１７８８リンホトキシン
（黒丸−黒丸）、又は培地（三角−三角）を、ＮＫ
−エフェクター細胞添加前に、標的細胞と共に３０分間
インキュベートした。サンプル平均の標準偏差は最高１
％であった。

【００８７】腫瘍細胞増殖阻害に加え、精製１７８８リ
ンホトキシンでなくヒトリンホトキシンはヒトの癌、白
血病、及び肉腫細胞のＮＫ−媒介細胞毒性に対する感受
性を高めた。ヒトリンホカインは、ＮＫ溶解に耐性のＲ
ＰＭＩ ２６５０癌細胞の溶解さえ生じさせた。精製１
７８８リンホトキシンは癌、白血病又は肉腫細胞のＮＫ
による溶解に対する感受性を増強しなかった。未分画の
ヒトＰＢＬリンホトキシン含有リンホカインと精製１７
８８セルラインリンホトキシンの生物学的活性がばらば
らに異なるということは、リンホトキシン以外のリンホ
カインが抗腫瘍細胞活性を媒介していることを示してい
る。

【００８８】図４ ２種の異なるヒトリンホカイン試料のゲル浸透ＨＰＬＣ ２ｍｌのサンプルを、０．１％ＰＥＧ含有２０ｍＭリン
酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．４）を用いて東洋ソーダ
（Toyosoda）ＴＳＫＧ−３０００ ＳＷＧカラムから均
等に（isocratically ）希釈した。４ｍｌの画分を集
め、ＲＰＭＩ １６４０−１０％ＦＢＳで１００倍の範
囲に亘って希釈し、αＬ９２９細胞のリンホトキシン細
胞溶解及びヒトＫ５６２及び２６５０腫瘍細胞のロイコ
レギュリン細胞増殖抑制についてアッセイした。２８０
ｎｍでの蛋白質吸収プロフィールをαＬ９２９アッセイ
パネルに示す。

【００８９】ヒトＰＢＬリンホトキシン及びロイコレギ
ュリンの見かけの分子量をＨＰＬＣ分子ふるい（モレキ
ュラーシーブ）クロマトグラフィーで検討した。リンホ
トキシン活性の大部分は３０，０００〜４０，０００の
分子量範囲内の画分に溶出した。しかしながら、異なる
個体からのサンプルでは多少変化があり、またいくつか
の場合には５０，０００〜７０，０００及び１２，００
０〜２０，０００の分子量範囲内にもリンホトキシン活
性がみられた。ロイコレギュリン活性は５０，０００〜
７０，０００の分子量範囲内の画分に溶出したが、少量
の成分が１０，０００〜１５，０００の分子量範囲内に
溶出した。

【００９０】図５ ロイコレギュリンの直線勾配ポリアクリルアミドゲル電
気泳動 勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ロイコレ
ギュリンの分子量をより正確に決定した。ヒトロイコレ
ギュリン試料１ｍｌを一晩電気泳動した。次いでゲルを
スライスし、ＭＥＭ−１０％ＦＢＳで３７℃にてスライ
スを１晩溶出した。標的としてＨＴ−２９癌細胞を用い
るマイクロアッセイでロイコレギュリン活性を測定した
（白丸）。ロイコレギュリンは分子量１１０，０００〜
１４０，０００の蛋白質と共に移動した。逐次ＨＰＬＣ
ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び直線勾配
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した ¹²⁵Ｉ−ラ
ベルしたロイコレギュリンの電気泳動パターンもこの図
に示す（黒丸）。

【００９１】図６ 精製ロイコレギュリンのゲル濾過 ファルマシア（Pharmacia ）Ｓ−３００ゲル濾過を用い
るもう１つ別の方法で分子量を測定した。ＨＰＬＣゲル
濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び直線勾配ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で精製したロイコレギュリ
ンを ¹²⁵Ｉでラベルし、Ｓ−３００カラム上で１０ｍＭ
ＮａＰＯ₄ バッフファー（ｐＨ７．４）−１．０Ｍ
ＮａＣｌで溶出した。この手法では精製ロイコレギュリ
ンの見掛け上の分子量は１２０，０００〜１４０，００
０であった。

【００９２】図７ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動 変性条件においたときに天然の蛋白質がサブユニットに
解離するかどうかを決定するために、 ¹²⁵Ｉでラベルし
た精製ロイコレギュリンをドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動した。このゲルのオー
トラジオグラフで示されているように、ロイコレギュリ
ンは３０，０００〜３５，０００の分子量の分子と共に
電気泳動した。

【００９３】図８ ２種の異なるヒトリンホカイン試料の等電点電気泳動 ２ｍｌのサンプルをｐＨ３．５〜１０の勾配で電気泳動
した。３ｍｌの画分を集め、各画分のｐＨを測定し、
０．５ｐＨ単位の連続する画分をプールして、ＰＢＳ−
ＰＥＧに対して透析濾過し、濾過滅菌し、１００倍の範
囲に亘って希釈し、αＬ９２９細胞に対するリンホトキ
シンの細胞溶解活性（黒丸−黒丸）又はＫ５６２（四
角−−四角）及びＯＳＴ（白丸−−白丸）細胞に対する
ロイコレギュリンの細胞増殖抑制活性についてアッセイ
した。

【００９４】分子ふるいで分けた時にはヒトリンホトキ
シン及びロイコレギュリン活性はかさなり合ったにもか
かわらず、２つの活性は分子電荷の違いに基いて分離で
きた。リンホトキシンの等電点ｐＨは６．５〜７．２で
あった。ロイコレギュリンは２つの等電点ｐＨを持ち、
１つは５．０と５．８の間であり、２番目は７．５と
８．３の間であった。

【００９５】図９ ロイコレギュリン及びリンホトキシンのＨＰＬＣイオン
交換クロマトグラフィー ヒトリンホカイン試料の２ｍｌのサンプルを０〜０．５
Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出することによりＤＥＡＥ
−５４５ＨＰＬＣカラムで分離した。画分を濾過滅菌
し、マイクロアッセイとＨＴ−２９標的細胞を用いロイ
コレギュリンについて、又はリンホトキシンについてア
ッセイした。ロイコレギュリンは０．１ＭＮａＣｌ濃度
で溶出し、０．１５Ｍ ＮａＣｌ濃度で溶出したリンホ
トキシンと別れた。

【００９６】図１０ ロイコレギュリン活性の流動細胞計測分析 作用機作に関連し得るロイコレギュリンのもう１つの生
物学的活性を流動細胞計測分析で評価した。小角前方光
散乱の変化（丸）又はフルオレセインジアセテート（四
角）もしくはヨウ化プロピジウム（三角）蛍光染色（fl
uorochromasia）で検出できるＫ５６２細胞容量又は膜
透過性の変化をＦＡＣＳ IV 流動細胞計測計で４８８ｎ
ｍのアルゴンレーザー線励起（line excitation ）を用
いて評価した。上のチャートでは、細胞のリンホカイン
に対する反応を確立するために、１０（−−−）、４０
（−…−）、又は１００（−・−）単位の透析濾過した
リンホトキシン又は５００（−）単位のαインターフ
ェロンを含有するリンホカイン試料でＫ５６２細胞を０
〜６時間処理した。

【００９７】リンホカインをＫ５６２細胞に加えると、
細胞からの小角前方光散乱は減少し、ヨウ化プロピジウ
ム蛍光染色は増加し、ＦＤＡ蛍光染色は減少した。小角
前方光散乱の変化は、アクコンポ（Accucomp）細胞容量
分析プログラミングを加えたモデルＺＢ１コールターカ
ウンター（Coulterr Counter）［コールターインストル
メンツ社（Coulter Instruments, Inc.,ヒアリー（Hial
eah ）、ＦＬ］での細胞容量分析で確認された細胞容量
の増加に伴う細胞の形状及び／又は大きさの変化を反映
していた。ＦＤＡ蛍光染色の減少は、蛍光性の細胞内フ
ルオロセインが細胞から出てしまうのであるから膜透過
性の増加を反映していた。ヨウ化プロピジウム蛍光染色
の増加も、ヨウ化プロピジウムが細胞内に入り、核酸の
間に入り込んだので、膜透過性の増加を反映していた。
ヒトリンホカインによる流動細胞計測の変化は、Ｋ５６
２細胞処理３０分後には検出可能であり、２時間まで最
高であった。この期間には、α−インターフェロンは細
胞表面の構造又は形質膜透過性の変化を引き起こさなか
った。下のチャートでは、ＨＰＬＣ−等電点電気泳動画
分（サンプル番号は第４表から）でＫ５６２細胞を２時
間処理し、光散乱（−）、フルオレセインジアセテー
ト（−−−）及びヨウ化プロピジウム（……）の蛍光染
色の変化を測定した。リンホカインの細胞構造及び膜透
過性活性はＨＰＬＣと等電点電気泳動で精製したロイコ
レギュリン画分にのみ存在した。リンホトキシン又はイ
ンターロイキンとインターフェロンとの多い画分では検
出しうる細胞構造又は形質膜透過性の変化を生じなかっ
た。

【００９８】図１１ ロイコレギュリン遺伝子のクローニング このフローチャート図はロイコレギュリン遺伝子のクロ
ーン化で行なう６つの異なる段階を表わしている（実施
例５参照）。

【００９９】第１表 正常ヒト末梢血白血球による、又はネズミ骨髄腫とハイ
ブリダイゼーションした後に形成されたかもしくは培養
中に自然に形質転換したヒトＢセルラインによるロイコ
レギュリン産生の最適条件を決定した。末梢血白血球で
産生するロイコレギュリンは、培地１ｍｌ当たりＰＨＡ
５μｇの存在下で４８時間培養したときに最大レベルと
なった。血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地中で培
養すると、連続ヒトＢセルライン又はヒトＢ−マウス骨
髄腫のヘテロハイブリドーマは３日間に亘り構成的に
（constitutively）ロイコレギュリンを産生した。培地
１ｍｌに１０μｇのテトラデカノイルホルボールアセテ
ートを添加するとロイコレギュリンの産生は３倍になっ
た。

【０１００】第２表 リンホトキシンとは異なる独特な抗腫瘍性リンホカイン
の存在の証拠が、別々の６人からのリンホカイン試料に
おけるリンホトキシン（αＬ９２９細胞溶解活性）とヒ
ト腫瘍細胞増殖抑制活性との相対割合を比較したときに
示された。試料中でネズミ腫瘍細胞溶解活性とヒト腫瘍
細胞増殖抑制活性とは各々独立して変化し、２つの生物
学的活性は各々異なる実体によって媒介されていること
が示された。ＰＨＡで刺激しなかったか又は培養の最後
の３０分間にＰＨＡを添加した、３人の個体の白血球か
らの濃縮リンホカインは腫瘍細胞を全く溶解せず、増殖
阻害活性はなかった。しかしながら、同じ白血球をＰＨ
Ａで２４時間刺激すると、顕著な量の溶解及び増殖阻害
活性を分泌した。このように、抗腫瘍細胞活性は２４時
間培養した細胞の培地栄養の不足、ＰＨＡ、又はバッフ
ァーによるものではなかった。

【０１０１】第３表 リンホトキシンとは異なる新規なリンホカイン（以下ロ
イコレギュリンと称する）の存在を更に支持する証拠
は、ノイラミニダーゼ及びプロテアーゼ消化に対するリ
ンホカインの細胞溶解及び腫瘍細胞増殖阻害活性の感受
性を調べることにより得られた。０．２及び０．４単位
のノイラミニダーゼでは、リンホカインの腫瘍細胞増殖
阻害（ロイコレギュリン）活性は顕著には抑制されず、
αＬ９２９細胞に対するヒト細胞溶解リンホカイン活性
（リンホトキシン）が４９及び９２％減少した。１０ｍ
Ｍのシアル酸の存在下でのノイラミニダーゼ消化ではい
ずれの活性にも影響がなく、ノイラミニダーゼ消化では
いずれの活性にも影響がなく、ノイラミニダーゼ中にプ
ロテアーゼが混在することによるリンホトキシンに対す
る作用の可能性が除外された。一方、程度は異なるがリ
ンホトキシン及びロイコレギュリン活性は双方ともプロ
テアーゼで阻害された。６単位のプロナーゼでリンホト
キシン活性は完全に破壊されたが、ロイコレギュリン活
性はサンプル中に５２％残存した。従って、プロナーゼ
消化により活性ヒトロイコレギュリンサンプルはリンホ
トキシンを含まない状態になった。

【０１０２】シリアンゴールデンハムスターのリンホト
キシン試料もハムスター腫瘍細胞に対するロイコレギュ
リン型の活性と抗発癌活性を有していた（24）。ハムス
ターにおけるのと比較してヒト細胞の定量的変換アッセ
イが利用できないので、ヒトリンホカイン試料の抗発癌
活性は利用できないので、ヒトリンホカイン試料の抗発
癌活性は測定されたことがない（４）。ヒトリンホトキ
シン及びロイコレギュリンと同様に、ハムスターのリン
ホトキシン及びロイコレギュリン活性が、ノイラミニダ
ーゼ及びプロテアーゼ消化に対する感受性に基いて分離
されうるかどうかを決定しようと試みた。ハムスターの
抗発癌活性とロイコレギュリンとが同一であり、従って
多分１つでありヒトと同じであるかどうかを評価するた
めに、抗発癌活性がロイコレギュリンと共に精製される
かをも測定した。ヒトリンホトキシンと同様に、ハムス
ターリンホトキシンはノイラミニダーゼ及びトリプシン
で分解された。ヒトロイコレギュリンと同様に、発癌物
質に暴露したハムスター細胞に対する抗発癌活性とハム
スター腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制活性とはノイラミ
ニダーゼで分解されなかったが、トリプシンでは４２％
減少し、２つの種においてノイラミニダーゼ及びプロテ
アーゼ消化に対するロイコレギュリン及びリンホトキシ
ンの感受性が平行して異なる（分化）ことを示してい
た。

【０１０３】第４表 ＨＰＬＣ分子サイズ分子サイズ排除クロマトグラフィー
及び等電点電気泳動による２段階での分画手順を実施し
て、ヒトロイコレギュリンの抗癌活性が他のいくつかの
リンホカイン及びモノカイン（monokines ）から分離で
きかつ異なるもであるかどうかを決定した。以前のデー
タから予想されたように、リンホトキシン活性は高分子
量（45,000〜74,000）、中間分子量（30,000〜38,00
0）、及び低分子量（17,000〜20,000）画分で認めら
れ、電気泳動後にはｐＨ６．５〜６．８の画分に濃縮さ
れた。ロイコレギュリンは高分子量物質中にのみ存在
し、等電点がｐＨ４．２〜５．６及び７．１〜８．４の
２つの種に分れた。ロイコレギュリンに富む画分がリン
ホトキシン活性をいくらか含有していたとはいうもの
の、画分１及び３は１７０単位より多いリンホトキシン
を含有していたがロイコレギュリン活性は全くなかっ
た。従って、刺激したヒトＰＢＬ由来のリンホトキシン
活性はロイコレギュリンから分離しうる。低分子量画分
はインターロイキン１及びインターロイキン２の全活性
およびインターフェロン活性の大部分を含有していた。
どの画分でもマクロファージ活性化活性は検出されなか
ってた。画分は全てエンドトキシンも含有していた。エ
ンドトキシンの量はロイコレギュリンと相関していなか
った。エンドトキシンがロイコレギュリン活性を媒介し
ないことを示す別の証拠は、リポポリサッカライド血清
型０．５５：Ｂ５及び０１１１．Ｂ４を２０ｎｇ／ｍｌ
まで添加するとＫ５６２１細胞の増殖を阻害しなかった
ことである。

【０１０４】第５表 ロイコレギュリンに富む画分は少量のインターフェロン
を含んでいたので、インターフェロンが腫瘍細胞の増殖
阻害に寄与する度合を測定するためにもう１つ別の実験
を行った。１つの出所（ＭＬ）からのγ−インターフェ
ロンはαＬ９２９細胞を溶解せず、ヒトＫ５６２腫瘍細
胞の増殖を阻害しなかった。もう１つの起源（ＦＬ）か
らのγ−インターフェロンは２０００リンホトキシン単
位／ｍｌを有していたが、ロイコレギュリン活性は持た
なかった。α−インターフェロンはリンホトキシンもロ
イコレギュリンも含有しなかった。従って、ロイコレギ
ュリン活性はα又はγ−インターフェロンによって媒介
されるものではなく、リンホトキシンとγ−インターフ
ェロンとの相乗作用の結果でもない。

【０１０５】第６表 未分画リンホカイン試料は、ＭＫ−媒介細胞毒性に対す
る腫瘍細胞の感受性を高める活性を含有していた。ヒト
リンホカインのＨＰＬＣ及び等電点電気泳動による逐次
分画の後、ロイコレギュリン及びリンホトキシンに対す
る標的細胞感作活性の相関関係を検討した。ロイコレギ
ュリンの多い画分は有意な腫瘍細胞ＮＫ−細胞毒性増強
活性を有していた。リンホトキシンの多い画分及びイン
ターフェロンの如き低分子量リンホンカインを含有する
画分はＮＫ−媒介細胞毒性に対するＫ５６２白血病細胞
の感受性を増強しなかった。従って、ＮＫ増強活性はロ
イコレギュリンと共に精製され又は同一である。

【０１０６】第７表 ヒト腫瘍と正常細胞のパネルをロイコレギュリンに対す
る感受性について検討した。消化器癌の群はロイコレギ
ュリンに対して感受性が高いことが判明した。ロイコレ
ギュリンは正常の結腸粘膜細胞又は皮膚繊維芽細胞のい
ずれかの増殖にも影響を与えなかった。

【０１０７】第８表 ロイコレギュリン細胞表面レセプターに対するモノクロ
ーナル抗体の結合の定量から、ロイコレギュリンの増殖
阻害作用に対する細胞の相対的感受性が予測される。こ
の間接的免疫蛍光流動（フロー）細胞計測アッセイにお
いて、抗ロイコレギュリンレセプター抗体は１５〜２３
％のＨＴ−２９細胞に有意に結合したが、Ｋ５６２細胞
については２％と１０分の１の結合だけだった。

【０１０８】第９表 ヒト癌に対するロイコレギュリンのインビボ（ｉｎ ｖ
ｉｖｏ）での強力な効果を測定するために、解離したば
かりの結腸腫瘍細胞を調製し、ロイコレギュリンを含有
する半固形寒天培地で培養した。結腸癌セルラインはロ
イコレギュリンに対して感受性が高いので結腸癌を評価
の標的対象とした。テストした４人の患者からの腫瘍細
胞は全て、種々な程度にではあるが、ロイコレギュリン
の用量依存性で増殖阻害された。１人の患者の細胞は５
０単位のロイコレギュリンで９８％阻害されたが、もう
１人の患者では４０００単位のロイコレギュリンで４２
％阻害された。このことは、ロイコレギュリンがヒト結
腸癌の増殖を抑制する能力を持つことを示唆している。

【０１０９】参考文献 １． アガーワル，ビー．ビー．（Aggarwal, B.B.），
モファット，ビー（Moffat, B.）及びハーキンズ，アー
ル．エヌ．（Harkins, R.N. ），「ヒトリンホトキシ
ン：リンパ芽球セルラインによる産生、精製及び最初の
特性化（Human lymphotoxin: production by a lymopho
blastoid cell line, purification and initial chara
cterization ）ジェー．バイオール．ケム．（J. Biol.
Chem.） 259：686-691, 1984 。

【０１１０】２． ブルーティ−ボイエ，ビー．（Brou
ty-Boye, P. ）、「細胞増殖に対するインターフェロン
の阻害作用（Inhibiotory effects of interferon on c
ell multiplication）」、リンホカインレポーツ（Lymp
hokine Reports ）、１：９９−１１２，１９８０。

【０１１１】３． ブラウン，アール．エル，（Brown,
R.L. ）、グリフィス，アール．エル．（Griffith, R.
H.）、ノイバウワー，アール．エイチ．（Neubauer, R.
H. ）及びラビン，エイチ．（Rabin, H. ）、「原始Ｔ
細胞の細胞サイクルに対するＴ−細胞成長因子の作用
（The effect of T-cell growth factor on the cell c
ycle of primate T cells ）」、ジェー．イムノール．
（J. Immunol. ），１２９：１８４９−１８５３，１９
８２。

【０１１２】４． デイパオロ，ジェー．エー．（DiPa
olo, J. A.）、「インビトロでのヒト及び動物細胞の形
質転換における相対的難易性（Relative difficulties
in transforming human and animal cell in vitr
o）」、ジェー．ナトル．キャンサーインスト．（J. Na
tl. Cancer Inst. ），７０：３−８，１９８３。

【０１１３】５． ドルベア，エフ．エー．（Dolbear
e, F. A. ）及びスミス，アール．イー．（Smith R. E.
）、「流動細胞酵素学：単細胞の迅速な酵素分析（Flo
w cytoenzymology: Rapid enzyme analysis of single
cells）」、Ｉｎ，エム．アール．メラミッド（M. R. M
elamid ）、ピー．エフ．ムラネイ（P. F. Mullane
y）、及びエム．エル．ミンデルソーン（M. L. Mindels
ohn）編、フロー サイトメトリー アンド ソーティ
ング（Flow Cytometry and Sorting）、３１７〜３３４
頁、ニューヨーク（New York）、ジョン ウイレイ ア
ンド サンズ（John Wiley & Sons ）、１９７９。

【０１１４】６． エバンス，シー．エイチ．（Evans,
C.H. ）及びデイパオロ，ジェー．エー．（DiPaolo,
J. A.）、「リンホトキシン：シリアンハムスター細胞
の化学的発癌物質又は紫外線照射による変換の阻害で測
定した抗発癌性リンホカイン（Lymphotoxin: an antica
rcinogenic lymphokine as measured by inhibition of
chemical carcinogen or ultraviolet-irradiation-in
duced transformation ofSyrian hamster cells）」イ
ント．ジェー．キャンサー（Int.J.Cancer）、２７：４
５〜４９、１９８１。

【０１１５】７． エバンズ，シー．エイチ．（Evans,
C. H.）及びハインバウ，ジェー．エー．（Heinbaugh,
J. A.）、「リンホトキシン細胞毒性：細胞溶解性及び
細胞増殖抑制細胞反応の組み合せ（Lymphotoxin cytoto
xicity; a combination of cytolytic and cytostatic
cellular responses）」、イムノファーマコロジー（Im
munopharmacology）３：３４７−３５９，１９８１。

【０１１６】８． エバンス，シー．エイチ．（Evans,
C. H.），ハインバウ，ジェー．エー．（Heinbaugh,
J. A.）及びジパオロ，ジェー．エー．（DiPaolo, J.
A.）、「リンホトキシン抗発癌性活性と腫瘍細胞増殖阻
害活性の比較効果（Comparative effectivenes of lymp
hotoxin anticarcinogenic and tumor cell growth inh
ibitory activities）」、セル．イムノール．（Cell.
Immunol.）７６：２９５〜３０３、１９８３。

【０１１７】９． グランガー，ジェー．エー．（Gran
ger, G. A.）及びコルブ，ダブリュー．ビー．（Kolb,
W. P. ）、「インビトロのリンパ球細胞毒性：免疫及び
非免疫小リンパ球媒介標的Ｌ細胞破壊の機構（Lymphocy
te in vitro cyto-toxicity: mechanisms of immune
and non-immune small lymphocyte mediated target L
cell destruction ）」、ジェー．イムノール．（J. Im
munol. ）１０１：１１１〜１１６，１９６８。

【０１１８】10． ハスペル，エム．ブィ．（Haspel,
M. V. ）ら、サイエンス（Science ）２２０：３０４〜
３０６，１９８３。

【０１１９】11． フーバー，エイチ．シー．（Hoove
r, H. C. ）ら、キャンサー リス．（Cancer Res.
）、１９８４年４月。

【０１２０】12． ケルン（Kern）ら、イント．ジェ
ー．キャンサー（Int.J.Cancer）、３０：７２５〜７２
９，１９８２。

【０１２１】13． カーン，エー．（Kahn, A.）ら、ヒ
ューマンリンホカインズ（Human Lymphokines ）、６２
１〜６２９頁、アカデミックプレス（Academic Pres
s）、ニューヨーク（New York）、１９８２。

【０１２２】14． クライナーマン，イー．エス．（Kl
einerman, E. S. ）シュロワ，エー．ジェー．（Schroi
t, A. J.）フォグラー，ダヴリュ．イー．（Fogler, W.
E. ）、及びフィドラー，アイ．ジェー．（Fidler, I.
J. ）、「遊離及びリポソーム内包ヒトリンホカインに
よるインビトロでのヒト単球活性の殺腫瘍活性化（Tumo
ricidal activation of human monocyte activity in
vitro by free and liposome encapsulated human lym
phokines）」、ジェー．クリン．インベスト．（J. Cli
n. Invest.），７２：３０４〜３１５，１９８３。

【０１２３】15． レムリ，ヴイ．（Laemmli, V. ）ネ
イチャー（Nature），２２７：６８０〜６８５， １９
７０。

【０１２４】16． ランビン，ピー（Lambin, P.）及び
ファイン，ジェー．エム．（Fine, J.M. ）、アナル．
バイオケム．（Anal. Biochem.），９８：１６０〜１６
８，１９７９。

【０１２５】17． マクコナヘイ，ピー．ジェー．（Mc
Conahey, P. J.）及びディクソン，エフ．ジェー．（Di
xon, F. J.）、イント．アーク．アレルギー アプル
イムノール．（Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.
）、２９：１８５〜１８９，１９６６。

【０１２６】18． ミゼル，エス．ビー．（Mizel, S.
B.）、オペンハイム，ジェー．ジェー．（Oppenheim,
J. J.）及びローゼンストライヒ，ディー．エル．（Ros
enstreich, D. L. ）、「マクロファージセルラインＰ
３８８Ｄ１が産生するリンパ球活性化因子の特性化（ch
aracterization of lymphocyte-activating factor pro
duced by the macrophage cell line P388D1）Ｉ．活性
化Ｔリンパ球によりＬＡＦ産生の増強（Enhancement of
LAF production by activated T lymphocytes）、ジェ
ー．イムノール．（J. Immunol. ）、１２０：１４９７
〜１５０５，１９７８。

【０１２７】19． ペーパーマスター，ビー．ダヴリュ
ー．（Papermaster, B. W.）ら、「リンホカイン及び胸
腺ホルモン（Lymphokines and Thymic Hormones ）」、
アカデミックプレス（Academic Press）、ニューヨーク
（New York）、７８９〜７９９頁。

【０１２８】20． ペン，アイ．（Penn, I.）、「免疫
抑制と癌の発達（Depressed Immunityand the Developm
ent of Cancer）」、クリニカル エクスペリメンタル
イムノロジー（Clinical Experimental Immunolog
y）、４６：４５９，１９８１。

【０１２９】21． プロス，エイチ．エフ．（Pross,
H. F.）、バインズ，エム．ジー．（Baines, M. G.
）、ルビン，ピー．（Rubin, P. ）、シュラーグ，ピ
ー．（Shragge, P. ）、及びパターソン，エム．エス．
（Patterson, M. S.）、「腫瘍標的細胞に対する自然の
ヒトリンパ球媒介細胞毒性．ＩＸ．ナチュラルキラー細
胞活性の定量（Spontaneous human lymphocyte-mediate
d cytotoxicity against tumortarget cells. IX. The
quantitation of natural killer cell activity
）」、シェー．クリン．イムノール．（J. Clin. Immu
nol. ）、１：５１〜６３，１９８１。

【０１３０】22． ラビン，エイチ．（Rabin, H. ）ホ
プキンズ，アール．エフ．（Hopkins,R. F.）、ラセッ
ティ，エフ．ダヴリュ．（Ruscetti, F. W. ）、ノイバ
ウワー，アール．エイチ．（Neubauer, R. H. ）、ブラ
ウン，アール．エル．（Brown,R. L.）及びカワカミ，
ティー．ジー．（Kawakami, T. G. ）、「原発癌Ｔ細胞
の連続ラインから因子の自然放出（Spontaneous releas
e of a factor from a continuous line of primate tu
mor T cells ）」、ジェー．イムノール．（J. Immuno
l. ）、１２７：１８５２〜１８５６，１９８１。

【０１３１】23． ランソン，ジェー．エイチ．（Rans
om, J. H. ）及びエバンズ，シー．エイチ．（Evans,
C. H.）、「リンホトキシンはナチュラルキラー細胞媒
介破壊に対する癌及び前癌細胞の感受性を増大させる
（Lymphotoxin enhances the susceptibility of neopl
astic and preneoplastic cells to natural killer ce
ll mediated destruction ）」、イント．ジェー．カン
サー（Int. J. Cancer）、２９：４５１〜４５８，１９
８２。

【０１３２】24． ランソン，ジェー．エイチ．（Rans
om, J. H. ）及びエバンズ，シー．エイチ．（Evans,
C. H.）、「シリアンハムスターリンホトキシンの抗発
癌活性及び腫瘍細胞増殖阻害活性の分子的及び生物学的
特性化（Molecular and biological characterization
of Syrian hamster lymphotoxin’s anticarcinogeni
cand tumor cell growth inhibitory activities
）」、キャンサー リス．（Cancer Res. ）、４３：
５２２２〜：５２２７，１９８３。

【０１３３】25． ランソン，ジェー．エイチ．（Rans
om, J. H. ）及びエバンズ，シー．エイチ．（Evans,
C. H.）及びジパオロ，ジェー．エー．（DiPaolo, J.
A.）、「インビボにおけるジエチルニトロソアミン発癌
性のリンホトキシンによる予防（Lymphotoxin preventi
on of diethylnitrosamine carcinogenesis in vivo
）」、ジェー．ナトル．キャンサー インスト．（J.
Natl. Cancer Inst. ）、６９：７４１〜７４４，１９
８２。

【０１３４】26． ランソン，ジェー．エイチ．（Rans
om, J. H. ）、エバンズ，シー．エイチ．（Evans, C.
H.）、ズーン，アール．エイ．（Zoon, R. A. ）、ジパ
オロ，ジェー．エイ．（DiPaolo, J. A.）、「免疫免疫
ホルモンリンホトキシンによるテクネチウム９９ｍの発
癌能の調整（Control of carcinogenic potential of 9
9m technetium by the immunologic hormone lymphotox
in）」」キャンサー イムノール．イムノテル．（Canc
er Immunol. Immunother. ）、１５：１２６〜１３０，
１９８３。

【０１３５】27． ランソン，ジェー．エイチ．（Rans
om, J. H. ）、ピンタス，シー．（Pintus, C.）及びエ
バンズ，シー．エイチ．（Evans, J. H.）、「腫瘍細胞
増殖阻害のリンホトキシンによる増幅はナチュラルキラ
ー細胞に特異的であり、マクロファージに特異的ではな
い（Lymphotoxin amplification of tumor cell growth
inhibition is specific for natural killer cells bu
t not for macrophages）」、イント．ジェー．キャン
サー（Int. J. Cancer）、３２：９３〜９７，１９８
３。

【０１３６】28． ランソン，ジェー．エイチ．（Rans
om, J. H. ）、ランデル，ジェー．オー．（Rudnell,
J. O.）、ハインバッフ，ジェー．エー．（Heinbaugh,
J.A. ）及びエバンズ，シー．エイチ．（Evans, J.
H.）、「アオガイヘモシアニンによるモルモットリンホ
トキシンの生物学的物理化学的特性化（Biological and
physiocochemical charcterization of keyhole limpe
t hemocyanin-iduced guineapig lymphotoxin）」、セ
ル．イムノール．（Cell. Immunol.）、６７：１〜１
３，１９８２。

【０１３７】29． リモールド，エイチ．ジー．（Remo
ld, H. G. ）及びメドニス，エー．デー．（Mednis, A.
D. ）、「密度及びノイラミニダーゼとプロテイナーゼ
に対する感受性が異なる２個の遊走阻止因子（Two migr
ation inhibitory factors differ in density and sus
ceptibility to neruaminidase and proteinases）」。
ジェー．イムノール．（J. Immunol. ）、１２２：１９
２０〜１９２５，１９７８。

【０１３８】30． ローゼンベルグ，エス．エー．（Ro
senberg, S. A.）、ヘリコン，エム．（Henrichon, M.
）、コイネ，ジェー．エー．（Coyne, J. A.）及びデ
ビッド，ジェー．エー．（David, J. A.）、「リンパ球
の抗原刺激に応答して産生されたＬＴのインビトロの研
究（In vitro studies of LT produced in response t
oantigen stimulation of lymphocytes）」、ジェー．
イムノール．（J.Immunol.）、６：１６２３〜１６２
９，１９７３。

【０１３９】31． サワダ，ジェー．（Sawada, J.）、
シオリ−ナカノ，ケー．（Shiori-Nakano, K. ）、オサ
ワ，ティー．（Osawa, T. ）、「種々のセルラインに対
する精製モルモットリンホトキシンノ細胞毒性活性（Cy
totoxic activity of purifiedguinea pig lymphotoxin
against various cell lines）」、ジプン．ジェー．
エクスプ．メド．（Jpn. J. Exp. Med. ）、４：２６３
〜２７１，１９７６。

【０１４０】32． トリンキエリ，ジー．（Trinchier
i, G.）、ドマルチ，エム．（DeMarchi, M.）、メイヤ
ー，ダブリュー．（Mayer, W. ）、サビ，エム．（Sav
i, M.）及びセッペリン，アール．（Ceppelline,
R.）、「ＨＬＡに対する特異的増強とリンパ球抗体のリ
ンパ溶解性相互作用（Lymphocyte antibody lymphocyto
lytic interaction(LALI) with special emphasis on H
LA）、トランスプラント．プロク．（Transplant. Pro
c. ）、５：１６３１〜１６４６，１９７３。

【０１４１】33． トリンキエン，ジー．（Trinchier
i, G.）、及びサントリ，デー．（Santoli, D. ）、
「腫由来又はウイルス−形質転換した細胞と一緒にリン
パ球を培養することにより誘導される抗ウイルス活性
（Anti-viral activity induced by culturing lymphoc
ytes with tumor-derived or virus-transformed cell
s）」、ジェー．エクスブ．メド．（J. Exp. Med.）、
１４７：１３１４〜１３３３，１９７８。

【０１４２】34． ウィリアムソン，ビー．ディー．
（Williamson, B. D. ）、カースウェル，イー．エー．
（Carswell, E. A. ）、ルビン，ピー．ワイ．（Rubin,
B. Y.）、プレンダーガスト，ジェー．エス．（Prende
rgast, J. S.）、及びオールド，エル．ジェー．（Old,
L. J.）、「ヒトＢ−セルラインが産生するヒト腫瘍壊
死因子：ヒトインターフェロンとの細胞毒性の相乗的相
互作用（Human tumor necrosis factor produced by hu
man B-cell lines : synergistic cytotoxic interacti
on with human interferon）、プロク．ナトル．アカ
ド．サイ．（Proc. Natl. Acad. Sci.）、８０：５３９
７〜５４０１，１９８３。

【０１４３】

【表１】

【０１４４】

【表２】

【０１４５】

【表３】

【０１４６】

【表４】

【０１４７】ａ ７５０単位のリンホトキシンと５５単
位のＫ５６２細胞増殖抑制ロイコレギュリンを含有する
２ｍｌのヒトリンホカイン試料をゲル浸透クロマトグラ
フィーによって分子量４５，０００〜７４，０００、３
０，０００〜３８，０００及び１７，０００〜２２，０
００の画分に分けた。１７，０００〜２２，０００の画
分は４℃に維持し、一方、分子量がこれより大きい２つ
の画分は更に等電点電気泳動でｐＨ７．２〜８．４，
６．１〜６．９及び４．２〜５．６の画分に分けた。電
気泳動後の画分プールをＰＢＳ−ＰＥＧに対し透析し、
アッセイ前に濾過滅菌した。

【０１４８】ｂ 活性は全て単位／ｍｌで表わす。

【０１４９】ｃ αＬ９２９細胞の溶解。

【０１５０】ｄ 増殖阻害単位。

【０１５１】ｅ 溶解単位。

【０１５２】ｆ Ｎｇ／ｍｌ。

【０１５３】

【表５】

【０１５４】

【表６】

【０１５５】ａ 分子ふるいＨＰＬＣクロマトグラフィ
ーを用い、２ｍｌのヒトリンホカイン試料を４５，００
０〜７４，０００及び１７，０００〜２２，０００の分
子量の画分に分けた。分子量の大きい方の画分を等電点
電気泳動を用いｐＨ４．５〜５．５，６．０〜６．７及
び７．４〜８．５の画分に分けた。画分プールは全てを
ＰＢＳ−ＰＥＧに対して透析し、アッセイ前に濾過滅菌
した。

【０１５６】ｂ αＬ９２９細胞の溶解（単位／ｍ
ｌ）。

【０１５７】ｃ Ｋ５６２細胞の増殖阻害（単位／ｍ
ｌ）。

【０１５８】ｄ １：５に希釈したテスト画分又は培地
１ｍｌ中のＫ５６２細胞を１時間インキュベートし、次
いでＮＫ細胞を用いて４時間の⁵¹Ｃｒ放出アッセイでア
ッセイした。

【０１５９】ｅ 処理群の細胞１０⁴ 個当りのＮＫ溶解
単位とＮＫ培地コントロールのＮＫ溶解単位との比。

【０１６０】ｆ スチューデントのｔ−検定(Student′
s t-test)によるとコントロールとは統計的に有意差
（ｐ＜０．０５）。

【０１６１】

【表７】

【０１６２】ａ ７２時間の培養後に２×１０³ のＨＴ
−２９細胞の増殖を５０％阻害する量を１単位と定義す
る。

【０１６３】ｂ ロイコレギュリンは逐次ＨＰＬＣ−ゲ
ル濾過、次いでイオン交換クロマトグラフィー及び直線
勾配のポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。

【０１６４】ｃ ４５０単位／ｍｌで最大１４％の細胞
溶解が起った。

【０１６５】ｄ ７００単位／ｍｌで最大２５％の細胞
溶解が起った。

【０１６６】

【表８】

【０１６７】

【表９】

【０１６８】本発明の範囲は特許請求の範囲で定義され
ており、その均等物，変形，及び改良，修正及び変異も
全て含むことを意図しているので。上述の実施態様は本
発明を説明するためのものであり、限定を意図するもの
ではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】ロイコレギュリン含有ヒトＰＢＬリンホカイン
（白丸）及び精製１７８８セルラインリンホトキシン
（黒丸）によるヒト腫瘍細胞の細胞溶解の結果を示す。

【図２】ロイコレギュリン含有ヒトリンホカイン（白
丸）及び精製１７８８セルラインリンホトキシン（黒
丸）によるヒト腫瘍細胞の増殖阻害の結果を示す。

【図３】ヒトリンホカイン（白丸）及び精製１７８８リ
ンホトキシン（黒丸）による、ＮＫ−媒介細胞毒性に対
する標的細胞の感受性の増強結果を示す。

【図４】２種の異なるヒトリンホカイン試料のゲル浸透
ＨＰＬＣの結果を示す。

【図５】ロイコレギュリンの直線勾配ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果を示す。

【図６】精製ロイコレギュリンのゲル濾過の結果を示
す。

【図７】ロイコレギュリンのドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。

【図８】２種の異なるヒトリンホカイン試料の等電点電
気泳動の結果を示す。

【図９】ロイコレギュリン及びリンホトキシンのＨＰＬ
Ｃイオン交換クロマトグラフィーの結果を示す。

【図１０】ロイコレギュリン活性の流動細胞計測分析の
結果を示す。

【図１１】ロイコレギュリン遺伝子のクローニング手順
を示すフローチャートである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/19 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 35/12 7431−4Ｃ 35/74 Ｚ 7431−4Ｃ 37/02 ＡＤＵ 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 15/04 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9050−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 リチヤード・ピー・マツカベ アメリカ合衆国、メアリーランド・20850、 ロツクヴイル、カリア・ドライヴ・204 (72)発明者 マーテイン・ヴイ・ハスペル アメリカ合衆国、メアリーランド・20902、 シルヴアー・スプリング、ケンプ・ミル・ ロード・11804 (72)発明者 ニコラス・ポマト アメリカ合衆国、メアリーランド・21701、 フレデリツク、ミルストリーム・ドライ ヴ・1809

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腫瘍細胞を直接溶解し、腫瘍細胞の増殖
   を抑制し、ＮＫ細胞媒介溶解に対する腫瘍細胞の感受性
   を高め、腫瘍細胞表面の構造及び透過性を変え、かつ正
   常細胞の発癌性変換を阻害することによって、正常細胞
   の増殖に影響を与えることなく、悪性腫瘍細胞の生理及
   び増殖を調節する能力を有するロイコレギュリン又はそ
   の生物学的に活性なサブユニットの遺伝子を含有するト
   ランスファーベクターで形質転換したヒトロイコレギュ
   リン産生細胞。
2. 【請求項２】 ロイコレギュリンの細胞表面レセプター
   に特異的なモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ロイコレギュリン反応性細胞又はロイコ
   レギュリン反応性細胞からの細胞膜の部分で動物を免疫
   し、免疫した動物から抗体産生細胞を抽出し、抗体産生
   細胞を骨髄腫細胞と融合し、ロイコレギュリンの細胞表
   面レセプターに特異的なモノクローナル抗体を分泌する
   ハイブリドーマを選択することからなる、ロイコレギュ
   リンの細胞表面レセプターに特異的なモノクローナル抗
   体の調製方法。
4. 【請求項４】 請求項２記載のモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ。
5. 【請求項５】 標的細胞に対するモノクローナル抗体の
   結合を定量することからなる、請求項２記載のモノクロ
   ーナル抗体を用いるロイコレギュリンに対する腫瘍細胞
   の感受性のアッセイ。
6. 【請求項６】 ロイコレギュリン又はその生物学的に活
   性なサブユニットを含有する培地中で患者の腫瘍細胞を
   培養することからなる治療効果及び用量の決定方法。
7. 【請求項７】 培地が半固形寒天培地である請求項６記
   載の方法。
8. 【請求項８】 ヒトロイコレギュリン又はその生物学的
   に活性なサブユニットに腫瘍細胞を暴露することからな
   る正常細胞の増殖に影響せず腫瘍細胞の生理及び増殖を
   調節する方法に使用するロイコレギュリン又はその生物
   学的に活性なサブユニット。
9. 【請求項９】 腫瘍細胞のエクス−ビボ（ex−vivo）暴
   露からなる組織中の腫瘍細胞治療法に使用するロイコレ
   ギュリン又はその生物学的に活性なサブユニット。
10. 【請求項１０】 患者の骨髄を再構成するために使用す
    べき骨髄生細胞を先ずロイコレギュリン又はその生物学
    的に活性なサブユニットに暴露する請求項９記載の治療
    法に使用するロイコレギュリン又はその生物学的に活性
    なサブユニット。