JPH06277098A - ヌクレオチドプローブ - Google Patents
ヌクレオチドプローブInfo
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- JPH06277098A JPH06277098A JP6023712A JP2371294A JPH06277098A JP H06277098 A JPH06277098 A JP H06277098A JP 6023712 A JP6023712 A JP 6023712A JP 2371294 A JP2371294 A JP 2371294A JP H06277098 A JPH06277098 A JP H06277098A
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- dna
- taqi
- apo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
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- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Ultrasonic Waves (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒトApo(ａ)遺伝子の多型性リーダーTaqＩ部
位の5'及び3'のすぐそばのTaqＩ部位の間のヒトゲノムD
NAにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドプローブで
あって、このヒトゲノムDNAが5'及び3'プライマー：
5'：5' CCT ATT TGG ATT TTG GAC GC 3'（配列番号
１）；3'：5' GAT AAC AGA CCA ATA GCT GT 3'（配列番
号２）を用いるApo(a)遺伝子のPCR増幅により検出し得
ることを特徴とする該ポリヌクレオチドプローブ、また
はヒトApo(ａ)遺伝子の多型性クリングルTaqＩ部位の5'
及び3'のすぐそばのTaqＩ部位の間のヒトゲノムDNAにハ
イブリダイズし得るポリヌクレオチドプローブであっ
て、前記ヒトゲノムDNAが5'及び3'プライマー：5'：5'
CTG CAG ACA ACC CCT TAA ACA 3'（配列番号３）;3'：
5'GGA TCC TTA GAG ATA ACC TGC 3'（配列番号４）を用
いるApo(a)遺伝子のPCR増幅により検出し得ることを特
徴とする該ポリヌクレオチド。 【効果】 プローブは、危険性の高い心臓疾患に関連す
る対立遺伝子を確認するために家族または集団の調査に
使用し得る。
位の5'及び3'のすぐそばのTaqＩ部位の間のヒトゲノムD
NAにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドプローブで
あって、このヒトゲノムDNAが5'及び3'プライマー：
5'：5' CCT ATT TGG ATT TTG GAC GC 3'（配列番号
１）；3'：5' GAT AAC AGA CCA ATA GCT GT 3'（配列番
号２）を用いるApo(a)遺伝子のPCR増幅により検出し得
ることを特徴とする該ポリヌクレオチドプローブ、また
はヒトApo(ａ)遺伝子の多型性クリングルTaqＩ部位の5'
及び3'のすぐそばのTaqＩ部位の間のヒトゲノムDNAにハ
イブリダイズし得るポリヌクレオチドプローブであっ
て、前記ヒトゲノムDNAが5'及び3'プライマー：5'：5'
CTG CAG ACA ACC CCT TAA ACA 3'（配列番号３）;3'：
5'GGA TCC TTA GAG ATA ACC TGC 3'（配列番号４）を用
いるApo(a)遺伝子のPCR増幅により検出し得ることを特
徴とする該ポリヌクレオチド。 【効果】 プローブは、危険性の高い心臓疾患に関連す
る対立遺伝子を確認するために家族または集団の調査に
使用し得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アポリポタンパク質
(ａ)遺伝子内の多型性及び遺伝子研究に於けるこれらの
多型性の利用に関する。
(ａ)遺伝子内の多型性及び遺伝子研究に於けるこれらの
多型性の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】西洋諸
国では、成人集団に於ける罹患及び死亡の最も一般的な
原因の一つとして心臓疾患が挙げられる。疫学的研究か
ら、冠状心臓疾患の高い危険性と相関する多くの因子が
知見された。高血圧、喫煙及び高コレステロール血症
は、冠状心臓疾患の発生に強く関連している。
国では、成人集団に於ける罹患及び死亡の最も一般的な
原因の一つとして心臓疾患が挙げられる。疫学的研究か
ら、冠状心臓疾患の高い危険性と相関する多くの因子が
知見された。高血圧、喫煙及び高コレステロール血症
は、冠状心臓疾患の発生に強く関連している。
【０００３】アテローム性動脈硬化症及びその心臓血管
性続発症の病因に関する研究から、リポタンパク質とそ
の代謝物の役割が指摘された。リポタンパク質は脂質と
タンパク質の高分子複合体であり、腸から肝臓及び他の
肝外の組織にコレステロール及びトリグリセリドを運搬
する。
性続発症の病因に関する研究から、リポタンパク質とそ
の代謝物の役割が指摘された。リポタンパク質は脂質と
タンパク質の高分子複合体であり、腸から肝臓及び他の
肝外の組織にコレステロール及びトリグリセリドを運搬
する。
【０００４】リポタンパク質には４種類：キロミクロン
(chilomicrons)、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密
度リポタンパク質(LDL)及び高密度リポタンパク質(HDL)
がある。これらは各々、主に８種類(apo A-I,A-IV,Apo
B,Apo C-I,C-II,C-III,D及びE)のタンパク質サブユニッ
ト、即ちアプロプロテイン(aproprotein)を含む。
(chilomicrons)、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密
度リポタンパク質(LDL)及び高密度リポタンパク質(HDL)
がある。これらは各々、主に８種類(apo A-I,A-IV,Apo
B,Apo C-I,C-II,C-III,D及びE)のタンパク質サブユニッ
ト、即ちアプロプロテイン(aproprotein)を含む。
【０００５】近年、アプロプロテイン遺伝子の構造及び
構成を研究するためのプローブとして働くcDNA及びある
場合にはゲノムDNAが得られた。これらのDNAプローブは
制限断片長多型性(restriction fragment length polym
orphism:RFLP)分析と組み合わせると、冠状心臓疾患を
発症させる明らかな危険性やリポタンパク質異常と関連
するハプロタイプ(haplotypes)、個体のRFLPプロフィー
ルを識別し得た。RFLPは、制限酵素に関する切断部位の
存在または不在に関して異なるサイズの電気泳動バンド
として識別される遺伝子変異体である。
構成を研究するためのプローブとして働くcDNA及びある
場合にはゲノムDNAが得られた。これらのDNAプローブは
制限断片長多型性(restriction fragment length polym
orphism:RFLP)分析と組み合わせると、冠状心臓疾患を
発症させる明らかな危険性やリポタンパク質異常と関連
するハプロタイプ(haplotypes)、個体のRFLPプロフィー
ルを識別し得た。RFLPは、制限酵素に関する切断部位の
存在または不在に関して異なるサイズの電気泳動バンド
として識別される遺伝子変異体である。
【０００６】RFLPは、遺伝子座が臨床的表現型に含まれ
るかどうかという研究を可能にする強力な遺伝子道具で
ある。基本的には２つの調査報告がある。その一方の調
査報告では、RFLPの頻度を、臨床的表現型を含む個体と
これを含まない個体とを比較している。顕著な違いが観
察される場合、RFLPにより識別された対立遺伝子は臨床
的表現型に関連すると考えられる。RFLPにより表現型が
発生し得るか、またはRHLPは根元的な突然変異により連
鎖非平衡(linkage disequibrium)になり得る。
るかどうかという研究を可能にする強力な遺伝子道具で
ある。基本的には２つの調査報告がある。その一方の調
査報告では、RFLPの頻度を、臨床的表現型を含む個体と
これを含まない個体とを比較している。顕著な違いが観
察される場合、RFLPにより識別された対立遺伝子は臨床
的表現型に関連すると考えられる。RFLPにより表現型が
発生し得るか、またはRHLPは根元的な突然変異により連
鎖非平衡(linkage disequibrium)になり得る。
【０００７】他方の調査報告では、臨床的表現型を持つ
個体をプロバンド(proband)として使用して多世代に渡
って多くの家族を識別している。家族の構成員中で臨床
的表現型を分離し、所与の遺伝子座の対立遺伝子が各家
族の構成員中に存在するかどうかを識別するためにRFLP
を使用している。臨床的表現型が共遺伝(coinherite)す
るかまたは調査下の家族の特別な対立遺伝子と連鎖する
かどうかという疑問がある。連鎖(linkage)とは、遺伝
子がその異常のためにDNAプローブを供給する遺伝子に
隣接していることを示す。表現型に連鎖した対立遺伝子
は、別の家族では異なると予測される。
個体をプロバンド(proband)として使用して多世代に渡
って多くの家族を識別している。家族の構成員中で臨床
的表現型を分離し、所与の遺伝子座の対立遺伝子が各家
族の構成員中に存在するかどうかを識別するためにRFLP
を使用している。臨床的表現型が共遺伝(coinherite)す
るかまたは調査下の家族の特別な対立遺伝子と連鎖する
かどうかという疑問がある。連鎖(linkage)とは、遺伝
子がその異常のためにDNAプローブを供給する遺伝子に
隣接していることを示す。表現型に連鎖した対立遺伝子
は、別の家族では異なると予測される。
【０００８】この試みにより、心筋梗塞及びリポタンパ
ク質異常の頻度の高さと関係するApo A-I及びB-100に関
してRFLPを検出し得た。
ク質異常の頻度の高さと関係するApo A-I及びB-100に関
してRFLPを検出し得た。
【０００９】高コレステロール血症患者でのアポプロテ
イン(ａ)のイソ型、LDLサブユニット及び心筋梗塞の間
の関係に関する近年の報告は、本出願人をRFLPの存在を
調査するためにapo(ａ)の遺伝子及び冠状心臓疾患の発
生との関連の可能性を研究するように喚起させた。
イン(ａ)のイソ型、LDLサブユニット及び心筋梗塞の間
の関係に関する近年の報告は、本出願人をRFLPの存在を
調査するためにapo(ａ)の遺伝子及び冠状心臓疾患の発
生との関連の可能性を研究するように喚起させた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本出願人は、ヒト肝臓DN
AのYACライブラリー由来のLp(ａ)遺伝子の数個の重複部
分をクローン化した。これらのクローンから誘導し調製
されたDNAプローブは、冠状動脈疾患に罹患した患者に
於けるRFLPの研究及び該遺伝子の構成の研究に使用し得
る。本出願人の研究室に於いて、これらのプローブを既
に検出し、一般集団に於いて数種のRFLPを特徴付けた。
AのYACライブラリー由来のLp(ａ)遺伝子の数個の重複部
分をクローン化した。これらのクローンから誘導し調製
されたDNAプローブは、冠状動脈疾患に罹患した患者に
於けるRFLPの研究及び該遺伝子の構成の研究に使用し得
る。本出願人の研究室に於いて、これらのプローブを既
に検出し、一般集団に於いて数種のRFLPを特徴付けた。
【００１１】本出願人が検出した２種類のRFLPは、Apo
(ａ)遺伝子の２つの領域内のTaqＩ多型性である。TaqＩ
制限エンドヌクレアーゼ部位が数名の個体に存在するが
他の個体には存在しない場合、TaqＩ多型性が発生して
いる。TaqＩ部位は、多型性TaqＩ部位の5'及び3'のすぐ
そばの２個の通常保存的なTaqＩ部位の間にある。既に
記載の如く、「すぐそば(immedately)」とは、ヒトゲノ
ムはこのような部位を数千も含むので、ゲノム内の次の
TaqＩ部位を指す。従って、多型性は以下のように示さ
れ得る。
(ａ)遺伝子の２つの領域内のTaqＩ多型性である。TaqＩ
制限エンドヌクレアーゼ部位が数名の個体に存在するが
他の個体には存在しない場合、TaqＩ多型性が発生して
いる。TaqＩ部位は、多型性TaqＩ部位の5'及び3'のすぐ
そばの２個の通常保存的なTaqＩ部位の間にある。既に
記載の如く、「すぐそば(immedately)」とは、ヒトゲノ
ムはこのような部位を数千も含むので、ゲノム内の次の
TaqＩ部位を指す。従って、多型性は以下のように示さ
れ得る。
【００１２】
【化１】 Ｔ＊は個体のゲノムDNAの一部の多型性TaqＩ部位を表
し、Ｔ1及びＴ2は各々、5'及び3'のすぐそばの保存的Ta
qＩ部位である。個体が多型性TaqＩ部位を持たない場
合、TaqＩでそのDNAを切断すると、Ｔ1〜Ｔ2のDNAフラ
グメントが生じる。個体の切断DNAを大きさで分け、ブ
ロットし次いでＴ1〜Ｔ2フラグメントの任意の部分と相
同のプローブでプロービングすると、DNAの単一バンド
が現れる。（このDNA領域に関し同型接合の個体に関し
ては正しいが、これはゲノムDNAの単一コピーを参照し
て記載されている。）プローブが、Ｔ1〜Ｔ2領域の任意
の部分を特異的に検出する限りプローブの正確な特徴は
殆ど重要ではない。以下に、特定のＴ1〜Ｔ2領域内でハ
イブリダイズする特定のDNAプローブを記載する。これ
らの特別なプローブを使用することは重要ではなく、他
のプローブをDNAの同一領域から誘導することも可能で
ある。Ｔ1〜Ｔ2領域を検出するのに使用するプローブの
適合性は、以下に記載するプローブを参照としてチェッ
クし得る。即ち、任意の候補プローブはその多型現象が
公知のプローブによりチェックされたDNAサンプル上で
試験し得、候補プローブ及び公知プローブを用いて得ら
れた結果を比較してこれらが同一かどうかを確認する。
し、Ｔ1及びＴ2は各々、5'及び3'のすぐそばの保存的Ta
qＩ部位である。個体が多型性TaqＩ部位を持たない場
合、TaqＩでそのDNAを切断すると、Ｔ1〜Ｔ2のDNAフラ
グメントが生じる。個体の切断DNAを大きさで分け、ブ
ロットし次いでＴ1〜Ｔ2フラグメントの任意の部分と相
同のプローブでプロービングすると、DNAの単一バンド
が現れる。（このDNA領域に関し同型接合の個体に関し
ては正しいが、これはゲノムDNAの単一コピーを参照し
て記載されている。）プローブが、Ｔ1〜Ｔ2領域の任意
の部分を特異的に検出する限りプローブの正確な特徴は
殆ど重要ではない。以下に、特定のＴ1〜Ｔ2領域内でハ
イブリダイズする特定のDNAプローブを記載する。これ
らの特別なプローブを使用することは重要ではなく、他
のプローブをDNAの同一領域から誘導することも可能で
ある。Ｔ1〜Ｔ2領域を検出するのに使用するプローブの
適合性は、以下に記載するプローブを参照としてチェッ
クし得る。即ち、任意の候補プローブはその多型現象が
公知のプローブによりチェックされたDNAサンプル上で
試験し得、候補プローブ及び公知プローブを用いて得ら
れた結果を比較してこれらが同一かどうかを確認する。
【００１３】個体が調査されたゲノムDNA片の一方また
は両方のコピーの上にＴ＊部位を保持する場合、ゲノム
DNAをTaqＩで切断すると、DNAの２個のフラグメント、
即ちＴ1-Ｔ＊バンド及びＴ＊-Ｔ2バンドが得られる。Ｔ
1-Ｔ＊バンドと相同のプローブを使用して消化物の結果
を調査する場合、Ｔ＊-Ｔ2バンドは検出されない。しか
しながら、このようなプローブをＴ1-Ｔ＊バンドの代わ
りに使用して、上記方法で誘導し得た。
は両方のコピーの上にＴ＊部位を保持する場合、ゲノム
DNAをTaqＩで切断すると、DNAの２個のフラグメント、
即ちＴ1-Ｔ＊バンド及びＴ＊-Ｔ2バンドが得られる。Ｔ
1-Ｔ＊バンドと相同のプローブを使用して消化物の結果
を調査する場合、Ｔ＊-Ｔ2バンドは検出されない。しか
しながら、このようなプローブをＴ1-Ｔ＊バンドの代わ
りに使用して、上記方法で誘導し得た。
【００１４】時折、部位Ｔ1またはＴ2の一方または他方
を持たない個体も存在し得る。幾つかの場合、これはゲ
ノムの大規模な再配列によるものであるが、他の場合で
は、Ｔ１及び/またはＴ2がこれ自身ほんの少し多型性で
あるためである。このような場合、通常この変異はＴ＊
部位自身が存在するかまたは存在しないかという決定を
妨げないが、これらの個体由来のDNAを分析する場合に
は変異は明白である。
を持たない個体も存在し得る。幾つかの場合、これはゲ
ノムの大規模な再配列によるものであるが、他の場合で
は、Ｔ１及び/またはＴ2がこれ自身ほんの少し多型性で
あるためである。このような場合、通常この変異はＴ＊
部位自身が存在するかまたは存在しないかという決定を
妨げないが、これらの個体由来のDNAを分析する場合に
は変異は明白である。
【００１５】図１に示されている多型性TaqＩ部位は、
本発明の目的に関しては「多型性クリングルTaqＩ部
位」を指す。この部位は、図１の制限マップ及び以下に
定義されるPCR-産生可能なプローブを参照して定義且つ
さらに決定され得る。
本発明の目的に関しては「多型性クリングルTaqＩ部
位」を指す。この部位は、図１の制限マップ及び以下に
定義されるPCR-産生可能なプローブを参照して定義且つ
さらに決定され得る。
【００１６】図２に示されている多型性TaqＩ部位は、
本発明の目的に関しては「多型性リーダーTaqＩ部位」
を指す。この部位は、図２の制限マップ及び以下に定義
されるPCR-産生可能なプローブを参照して定義且つさら
に決定され得る。
本発明の目的に関しては「多型性リーダーTaqＩ部位」
を指す。この部位は、図２の制限マップ及び以下に定義
されるPCR-産生可能なプローブを参照して定義且つさら
に決定され得る。
【００１７】従って、本発明は、ヒトApo(ａ)遺伝子の
多型性リーダーTaqＩ部位の5'及び3'のすぐそばのTaqＩ
部位の間のヒトゲノムDNAにハイブリダイズし得るポリ
ヌクレオチドプローブであって、前記ヒトゲノムDNAが
5'及び3'プライマー： 5'：5' CCT ATT TGG ATT TTG GAC GC 3'（配列番号１）
及び 3'：5' GAT AAC AGA CCA ATA GCT GT 3'（配列番号２） を用いるApo(a)遺伝子のPCR増幅により製造したプロー
ブで検出可能である該ポリヌクレオチドプローブを提供
する。
多型性リーダーTaqＩ部位の5'及び3'のすぐそばのTaqＩ
部位の間のヒトゲノムDNAにハイブリダイズし得るポリ
ヌクレオチドプローブであって、前記ヒトゲノムDNAが
5'及び3'プライマー： 5'：5' CCT ATT TGG ATT TTG GAC GC 3'（配列番号１）
及び 3'：5' GAT AAC AGA CCA ATA GCT GT 3'（配列番号２） を用いるApo(a)遺伝子のPCR増幅により製造したプロー
ブで検出可能である該ポリヌクレオチドプローブを提供
する。
【００１８】ポリヌクレオチドプローブは通常DNAであ
るが、例えばRNAまたは変性DNA若しくは変性RNAプロー
ブなどの他のポリヌクレオチドプローブも使用し得る。
プローブは、顕示標識(revealing label)、例えば32Ｐ
またはビオチンを保持し得る。
るが、例えばRNAまたは変性DNA若しくは変性RNAプロー
ブなどの他のポリヌクレオチドプローブも使用し得る。
プローブは、顕示標識(revealing label)、例えば32Ｐ
またはビオチンを保持し得る。
【００１９】「ハイブリダイズし得る」という用語は、
プローブが高度に厳密な条件下でApo(ａ)遺伝子のその
ターゲット領域にハイブリダイズし得るが、他のヒトゲ
ノムDNAではハイブリダイズしないことを意味する。プ
ローブはそのターゲット配列に正確に相同であるのが好
ましいが、プローブが他のヒトDNAの存在下でそのター
ゲットDNAに選択的にハイブリダイズし得る限り、この
ような相同性は必ずしも必要ではないことが理解されよ
う。例えば、プローブは、相同性の度合いが選択的なハ
イブリダイゼーションを可能にする限り、DNAのそのタ
ーゲット領域に対して少なくとも約75%、例えば80%また
は90%相同性であってもよい。
プローブが高度に厳密な条件下でApo(ａ)遺伝子のその
ターゲット領域にハイブリダイズし得るが、他のヒトゲ
ノムDNAではハイブリダイズしないことを意味する。プ
ローブはそのターゲット配列に正確に相同であるのが好
ましいが、プローブが他のヒトDNAの存在下でそのター
ゲットDNAに選択的にハイブリダイズし得る限り、この
ような相同性は必ずしも必要ではないことが理解されよ
う。例えば、プローブは、相同性の度合いが選択的なハ
イブリダイゼーションを可能にする限り、DNAのそのタ
ーゲット領域に対して少なくとも約75%、例えば80%また
は90%相同性であってもよい。
【００２０】プローブはオリゴヌクレオチドプローブ、
例えば配列番号１若しくは配列番号２のプローブであっ
てもよく、またはDNAのフラグメント、例えばこれらの
オリゴヌクレオチドにより定義されるEcoRIフラグメン
ト、即ち、これらのオリゴヌクレオチドを用いるApo
(ａ)遺伝子のPCR増幅により産生し得るApo(ａ)遺伝子の
フラグメントであってもよい。
例えば配列番号１若しくは配列番号２のプローブであっ
てもよく、またはDNAのフラグメント、例えばこれらの
オリゴヌクレオチドにより定義されるEcoRIフラグメン
ト、即ち、これらのオリゴヌクレオチドを用いるApo
(ａ)遺伝子のPCR増幅により産生し得るApo(ａ)遺伝子の
フラグメントであってもよい。
【００２１】プローブは、ハイブリダイゼーションの必
要な特異性を提供する任意の好適なサイズであり得る。
例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、約15〜50、例
えば18または20〜25または30ヌクレオチド長であっても
よい。制限フラグメントから誘導したプローブは、例え
ば、50塩基対〜約10kbの大きさ、例えば200〜1000bpで
あってもよい。選択されたDNA片のPCRにより産生された
プローブは、この方法により産生し得る任意の所望の大
きさ、100〜500bp、典型的には例えば200〜300bpであっ
てもよい。
要な特異性を提供する任意の好適なサイズであり得る。
例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、約15〜50、例
えば18または20〜25または30ヌクレオチド長であっても
よい。制限フラグメントから誘導したプローブは、例え
ば、50塩基対〜約10kbの大きさ、例えば200〜1000bpで
あってもよい。選択されたDNA片のPCRにより産生された
プローブは、この方法により産生し得る任意の所望の大
きさ、100〜500bp、典型的には例えば200〜300bpであっ
てもよい。
【００２２】プローブは、多型性リーダーTaqＩ部位の
5'若しくは3'部位のいずれかにターゲットし得るか、ま
たはこの部位をスパン(span)し得る。プローブが部位の
一方または他方の部位に対して特異的である(且つTaqＩ
消化ヒトDNAをプロービングするのに使用する)場合、プ
ローブは、多型性リーダーTaqＩ部位を持たない個体に
6.4kbのTaqＩフラグメントが存在すること及び、この部
位を持つ個体に1.4kb若しくは5kbのフラグメントの一方
が存在することを顕示するだろう。プローブがこの部位
を持つこれらの個体内で多型性部位をスパンする場合、
プローブは、(プローブがTaqＩ部位の各サイドにハイブ
リダイズするのに十分な大きさのものであると仮定する
と、)1.4kb及び5.5kbフラグメントの両方を顕示するだ
ろう。
5'若しくは3'部位のいずれかにターゲットし得るか、ま
たはこの部位をスパン(span)し得る。プローブが部位の
一方または他方の部位に対して特異的である(且つTaqＩ
消化ヒトDNAをプロービングするのに使用する)場合、プ
ローブは、多型性リーダーTaqＩ部位を持たない個体に
6.4kbのTaqＩフラグメントが存在すること及び、この部
位を持つ個体に1.4kb若しくは5kbのフラグメントの一方
が存在することを顕示するだろう。プローブがこの部位
を持つこれらの個体内で多型性部位をスパンする場合、
プローブは、(プローブがTaqＩ部位の各サイドにハイブ
リダイズするのに十分な大きさのものであると仮定する
と、)1.4kb及び5.5kbフラグメントの両方を顕示するだ
ろう。
【００２３】本発明は、ヒトApo(ａ)遺伝子の多型性ク
リングルTaqＩ部位の5'及び3'のすぐそばのTaqＩ部位の
間のヒトゲノムDNAにハイブリダイズし得るポリヌクレ
オチドプローブであって、前記ヒトゲノムDNAが5'及び
3'プライマー： 5'：5' CTG CAG ACA ACC CCT TAA ACA 3'（配列番号
３）及び 3'：5' GGA TCC TTA GAG ATA ACC TGC 3'（配列番号
４） を用いるApo(a)遺伝子のPCR増幅により検出し得る該ポ
リヌクレオチドプローブも提供する。
リングルTaqＩ部位の5'及び3'のすぐそばのTaqＩ部位の
間のヒトゲノムDNAにハイブリダイズし得るポリヌクレ
オチドプローブであって、前記ヒトゲノムDNAが5'及び
3'プライマー： 5'：5' CTG CAG ACA ACC CCT TAA ACA 3'（配列番号
３）及び 3'：5' GGA TCC TTA GAG ATA ACC TGC 3'（配列番号
４） を用いるApo(a)遺伝子のPCR増幅により検出し得る該ポ
リヌクレオチドプローブも提供する。
【００２４】プローブは、多型性リーダー部位と結合し
た上記DNA、RNA、変性DNAまたは変性RNAプローブであり
得、これらのプローブは顕示標識も保持し得る。好適な
プローブとしては、配列番号３及び配列番号４並びにこ
れらのオリゴヌクレオチドにより定義されたPstＩフラ
グメントが挙げられる。
た上記DNA、RNA、変性DNAまたは変性RNAプローブであり
得、これらのプローブは顕示標識も保持し得る。好適な
プローブとしては、配列番号３及び配列番号４並びにこ
れらのオリゴヌクレオチドにより定義されたPstＩフラ
グメントが挙げられる。
【００２５】プローブは、多型性クリングルTaqＩ部位
の5'若しくは3'部位のいずれかにターゲットし得るか、
この部位をスパンし得る。プローブが部位の一方若しく
は他方の部位に対して特異的である（且つTaqＩ消化ヒ
トDNAをプローブするのに使用する）場合、プローブ
は、多型性クリングルTaqＩ部位を持たない個体に1.6kb
のTaqＩフラグメントが存在し、及びこの部位を持つ個
体に1.3kb若しくは0.3kbのフラグメントの一方が存在す
ることを顕示するだろう。プローブがこの部位を持つこ
れらの個体内で多型性部位をスパンする場合、プローブ
は、(プローブがTaqＩ部位の各側にハイブリダイズする
のに十分な大きさのものであると仮定して、)1.3及び0.3
kbフラグメントの両方を顕示するだろう。
の5'若しくは3'部位のいずれかにターゲットし得るか、
この部位をスパンし得る。プローブが部位の一方若しく
は他方の部位に対して特異的である（且つTaqＩ消化ヒ
トDNAをプローブするのに使用する）場合、プローブ
は、多型性クリングルTaqＩ部位を持たない個体に1.6kb
のTaqＩフラグメントが存在し、及びこの部位を持つ個
体に1.3kb若しくは0.3kbのフラグメントの一方が存在す
ることを顕示するだろう。プローブがこの部位を持つこ
れらの個体内で多型性部位をスパンする場合、プローブ
は、(プローブがTaqＩ部位の各側にハイブリダイズする
のに十分な大きさのものであると仮定して、)1.3及び0.3
kbフラグメントの両方を顕示するだろう。
【００２６】本発明はさらに配列番号１及び２または配
列番号３及び４のオリゴヌクレオチドの一対を含むキッ
トも提供する。このようなキットを使用して、Apo(ａ)
遺伝子を含むDNAまたはPCRプライマーが結合する該遺伝
子の領域を含むそのフラグメントのサンプル上でPCRを
使用して本発明のプローブを産生する。
列番号３及び４のオリゴヌクレオチドの一対を含むキッ
トも提供する。このようなキットを使用して、Apo(ａ)
遺伝子を含むDNAまたはPCRプライマーが結合する該遺伝
子の領域を含むそのフラグメントのサンプル上でPCRを
使用して本発明のプローブを産生する。
【００２７】さらに、本発明は、ヒトApo(ａ)遺伝子内
でTaqＩ多型性を検出する方法で使用するための上記定
義のプローブまたはキットを提供する。
でTaqＩ多型性を検出する方法で使用するための上記定
義のプローブまたはキットを提供する。
【００２８】本発明のプローブ及びキットは、上記定義
のプローブとヒトDNAサンプルを接触させ、次いでサン
プル中に存在するTaqＩ多型性を決定することを含む、
ヒトDNAサンプル中のヒトApo(ａ)遺伝子内でTaqＩ多型
性を測定するために使用し得る。
のプローブとヒトDNAサンプルを接触させ、次いでサン
プル中に存在するTaqＩ多型性を決定することを含む、
ヒトDNAサンプル中のヒトApo(ａ)遺伝子内でTaqＩ多型
性を測定するために使用し得る。
【００２９】DNAのサンプルは、任意のヒト組織由来の
ものであり得る。血液サンプルからサンプルを得ると都
合がよい。
ものであり得る。血液サンプルからサンプルを得ると都
合がよい。
【００３０】本発明のプローブは、家族の調査に使用し
得る。従って、本発明は、個体に存在するリーダーTaq
Ｉ多型性を決定するために請求項１〜３のいずれか１項
に記載のプローブまたは、クリングルTaqＩ多型性を決
定するために請求項４〜６のいずれか１項に記載のプロ
ーブと個体のDNAサンプルとを接触させ、次いで得られ
た結果と生物学的両親の片方または両方からのDNAを同
一多型性を検出し得るプローブを用いる検査にかけて得
られた結果とを比較することを含む、個体のApo(ａ)遺
伝子の両親起源を測定する方法を提供する。
得る。従って、本発明は、個体に存在するリーダーTaq
Ｉ多型性を決定するために請求項１〜３のいずれか１項
に記載のプローブまたは、クリングルTaqＩ多型性を決
定するために請求項４〜６のいずれか１項に記載のプロ
ーブと個体のDNAサンプルとを接触させ、次いで得られ
た結果と生物学的両親の片方または両方からのDNAを同
一多型性を検出し得るプローブを用いる検査にかけて得
られた結果とを比較することを含む、個体のApo(ａ)遺
伝子の両親起源を測定する方法を提供する。
【００３１】個体のDNAを検査するために使用したプロ
ーブは、両親のDNAを検査するために使用したのと同一
プローブであると望ましいが、ゲノムのターゲット領域
を使用して別のプローブを規定し得るので、同一プロー
ブを使用することは重要ではない。個体及び両親のDNA
の検査を一回の実験で実施する場合、例えば１回のサザ
ンブロットで実施すると都合がよい。
ーブは、両親のDNAを検査するために使用したのと同一
プローブであると望ましいが、ゲノムのターゲット領域
を使用して別のプローブを規定し得るので、同一プロー
ブを使用することは重要ではない。個体及び両親のDNA
の検査を一回の実験で実施する場合、例えば１回のサザ
ンブロットで実施すると都合がよい。
【００３２】幾つかの家族の調査に於いては、特定のAp
o(ａ)対立遺伝子の遺伝を測定するために個体の生物学
的祖父母または兄弟姉妹(siblings)の一名以上に由来す
るDNAを試験するのが望ましい。
o(ａ)対立遺伝子の遺伝を測定するために個体の生物学
的祖父母または兄弟姉妹(siblings)の一名以上に由来す
るDNAを試験するのが望ましい。
【００３３】家族の調査では、個体の両親または祖父母
の一名以上が高い血中レベルのアポリポタンパク質(ａ)
及び/または心臓疾患の病歴を持つ場合の個体に遺伝し
たApo(ａ)の対立遺伝子を調べるのに特に有用である。
の一名以上が高い血中レベルのアポリポタンパク質(ａ)
及び/または心臓疾患の病歴を持つ場合の個体に遺伝し
たApo(ａ)の対立遺伝子を調べるのに特に有用である。
【００３４】上記のタイプの調査で情報を得るために
は、Apo(ａ)遺伝子内で別のTaqＩ多型性を検出し得る第
２のプローブで検査したDNAのサンプルを分析すること
が必要な場合もあり、且つともかく通常望ましい。例え
ば、DNAをクリングルTaqＩプローブを用いて検査する場
合、個体をさらにリーダーTaqＩプローブを用いて検査
してもよく、またはその逆を実施してもよい。TaqＩ多
型性バンドの各々の検出物は異なるサイズであるので、
両方のプローブを同時に使用し得る。本発明のプローブ
はまた、Apo(ａ)遺伝子に関しては他のプローブを、ま
たは他の遺伝子に関しては他のプローブを使用してもよ
い。このような遺伝子としては、リポタンパク質または
コレステロール代謝物と関連する他の遺伝子が挙げられ
る。
は、Apo(ａ)遺伝子内で別のTaqＩ多型性を検出し得る第
２のプローブで検査したDNAのサンプルを分析すること
が必要な場合もあり、且つともかく通常望ましい。例え
ば、DNAをクリングルTaqＩプローブを用いて検査する場
合、個体をさらにリーダーTaqＩプローブを用いて検査
してもよく、またはその逆を実施してもよい。TaqＩ多
型性バンドの各々の検出物は異なるサイズであるので、
両方のプローブを同時に使用し得る。本発明のプローブ
はまた、Apo(ａ)遺伝子に関しては他のプローブを、ま
たは他の遺伝子に関しては他のプローブを使用してもよ
い。このような遺伝子としては、リポタンパク質または
コレステロール代謝物と関連する他の遺伝子が挙げられ
る。
【００３５】本発明のプローブは、集団調査でも使用し
得る。特定の対立遺伝子は、多くの場合、集団内で特定
の表現型形質の存在または不在と関連することが知見さ
れた。例えば、特定のヒト組織適合性(HLA)遺伝子と関
連する公知のこの現象は、連鎖非平衡(linkage disequi
brium)として公知である。本発明のプローブは、心臓疾
患の危険性、例えば心臓疾患の高い危険性と本発明の多
型性対立遺伝子のいずれかまたは両方の対立遺伝子との
間の連鎖非平衡を確定するのに使用し得る。
得る。特定の対立遺伝子は、多くの場合、集団内で特定
の表現型形質の存在または不在と関連することが知見さ
れた。例えば、特定のヒト組織適合性(HLA)遺伝子と関
連する公知のこの現象は、連鎖非平衡(linkage disequi
brium)として公知である。本発明のプローブは、心臓疾
患の危険性、例えば心臓疾患の高い危険性と本発明の多
型性対立遺伝子のいずれかまたは両方の対立遺伝子との
間の連鎖非平衡を確定するのに使用し得る。
【００３６】従って本発明は、心臓疾患の危険性に関し
て参照集団から個体成員を評価する方法であって、個体
由来のDNAサンプル中のApo(ａ)遺伝子のリーダーTaqＩ
及び/またはクリングルTaqＩ多型性を測定し、次いで同
一Apo(ａ)リーダーTaqＩ及び/またはクリングルTaqＩ多
型性を保持する他の個体の参照集団中の心臓疾患の判定
された罹患率を参照して心臓疾患の危険性を評価するこ
とを含む該方法を提供する。
て参照集団から個体成員を評価する方法であって、個体
由来のDNAサンプル中のApo(ａ)遺伝子のリーダーTaqＩ
及び/またはクリングルTaqＩ多型性を測定し、次いで同
一Apo(ａ)リーダーTaqＩ及び/またはクリングルTaqＩ多
型性を保持する他の個体の参照集団中の心臓疾患の判定
された罹患率を参照して心臓疾患の危険性を評価するこ
とを含む該方法を提供する。
【００３７】場合により、特定の対立遺伝子の連鎖非平
衡及び疾病の危険性は、特定の民族集団には知見され得
るが、他の集団では知見され得ない。従って、個体の心
臓疾患の危険性を評価する際、参照集団は個体と同一民
族起源であるのが望ましい。例えば、集団は、心臓疾患
の発生率が他の集団より比較的高い西欧または北米白色
人種集団であり得る。
衡及び疾病の危険性は、特定の民族集団には知見され得
るが、他の集団では知見され得ない。従って、個体の心
臓疾患の危険性を評価する際、参照集団は個体と同一民
族起源であるのが望ましい。例えば、集団は、心臓疾患
の発生率が他の集団より比較的高い西欧または北米白色
人種集団であり得る。
【００３８】
【実施例】以下の実施例により、本発明を説明する。
【００３９】実施例１：Taq RFLPを検出するApo (ａ)イ
ンタークリング ルプローブ(inter-Kringle Probe)のク
ローニング ベクターpWE1Sを用いて作製したヒトコスミドライブラ
リーをStratagene,LaJolla,Californiaから入手し、以
下のオリゴヌクレオチドプライマー(Mc Lean J.ら、Natu
re 300:132-239,1987)： 上流プライマー5'-TTT CTG TGG TCC TAT TAT GTT GA-3'
(配列番号５) 下流プライマー5'-CAC CTG AGC AAA GCC ATG T-3'(配列
番号６) を使用して遺伝子増幅により得られた第１のApo(ａ)ク
リングルIVから誘導したプローブでスクリーニングし
た。
ンタークリング ルプローブ(inter-Kringle Probe)のク
ローニング ベクターpWE1Sを用いて作製したヒトコスミドライブラ
リーをStratagene,LaJolla,Californiaから入手し、以
下のオリゴヌクレオチドプライマー(Mc Lean J.ら、Natu
re 300:132-239,1987)： 上流プライマー5'-TTT CTG TGG TCC TAT TAT GTT GA-3'
(配列番号５) 下流プライマー5'-CAC CTG AGC AAA GCC ATG T-3'(配列
番号６) を使用して遺伝子増幅により得られた第１のApo(ａ)ク
リングルIVから誘導したプローブでスクリーニングし
た。
【００４０】遺伝子増幅をゲノムDNA上で32サイクル(94
℃で300秒変性、55℃で60秒アニーリング、92℃で60秒
伸長)実施した。
℃で300秒変性、55℃で60秒アニーリング、92℃で60秒
伸長)実施した。
【００４１】コスミドライブラリーをアンピシリン(50m
g/l)を含むLB培地の20個のペトリ皿(150mm)上にプレー
ティングした。約40,000コロニーを接種した皿を37℃で
一晩インキュベートした。プレートのニトロセルロース
膜リフト(lifts)を調整し、3×SSC/デンハート溶液中ク
リングルIVプローブで65℃で一晩ハイブリダイズし、0.
3×SSC中65℃で洗浄した。陽性の組換体をManiatis.Tら
(Molecular Cloning：a Laboratory Manual.Cold Sprin
g Harbor Laboratory.Cold Spring Harbor,NewYork 198
9)による記載通りに単離した。
g/l)を含むLB培地の20個のペトリ皿(150mm)上にプレー
ティングした。約40,000コロニーを接種した皿を37℃で
一晩インキュベートした。プレートのニトロセルロース
膜リフト(lifts)を調整し、3×SSC/デンハート溶液中ク
リングルIVプローブで65℃で一晩ハイブリダイズし、0.
3×SSC中65℃で洗浄した。陽性の組換体をManiatis.Tら
(Molecular Cloning：a Laboratory Manual.Cold Sprin
g Harbor Laboratory.Cold Spring Harbor,NewYork 198
9)による記載通りに単離した。
【００４２】陽性の組換体１個を幾つかの酵素(Eco RI,
Bgl II,Asp I,Kpn I,Taq I)で別個に及び組み合わせて
消化させた。Apo(ａ)遺伝子の特別な繰り返しクリング
ル構造により、ゲノムクリングル単位は、繰り返しの5.
5Kb Eco RI及びBgl IIフラグメント中に含まれることが
知見された。
Bgl II,Asp I,Kpn I,Taq I)で別個に及び組み合わせて
消化させた。Apo(ａ)遺伝子の特別な繰り返しクリング
ル構造により、ゲノムクリングル単位は、繰り返しの5.
5Kb Eco RI及びBgl IIフラグメント中に含まれることが
知見された。
【００４３】組換体コスミドは、Eco RI(E)またはBgl I
I(Bg)酵素のいずれかとの消化により容易に切断され得
るこのような繰り返しを約７個含んでいた。5.5Kb Bgl
IIクリングル含有フラグメントの１個をBgl II切断プラ
スミドpGEM 7(Promega)(Madison,Winsconsin)にサブク
ローン化した。この制限マップを図１に示す。クリング
ル含有配列がApo(ａ)に特異的であり、他の関連遺伝子
から誘導されたものでないということを示すために、Ap
o(ａ)cDNA(Mc.Lean J.ら、Nature 300:132-139,1987)か
ら誘導したオリゴヌクレオチドを用いて配列決定を実施
した。DNA分析をBiggin M.D.ら(Proc.Natl.Acad.Sci US
A 80:3963-3965,1683)によるジデオキシヌクレオチド鎖
終結法に従って実施し、配列データより、コスミドから
誘導されたクローンがApo(ａ)特異的領域を含み、Mc Le
an J.ら(Nature 300:132-139,1987)によるDNA配列と完
全に一致することが判明した。
I(Bg)酵素のいずれかとの消化により容易に切断され得
るこのような繰り返しを約７個含んでいた。5.5Kb Bgl
IIクリングル含有フラグメントの１個をBgl II切断プラ
スミドpGEM 7(Promega)(Madison,Winsconsin)にサブク
ローン化した。この制限マップを図１に示す。クリング
ル含有配列がApo(ａ)に特異的であり、他の関連遺伝子
から誘導されたものでないということを示すために、Ap
o(ａ)cDNA(Mc.Lean J.ら、Nature 300:132-139,1987)か
ら誘導したオリゴヌクレオチドを用いて配列決定を実施
した。DNA分析をBiggin M.D.ら(Proc.Natl.Acad.Sci US
A 80:3963-3965,1683)によるジデオキシヌクレオチド鎖
終結法に従って実施し、配列データより、コスミドから
誘導されたクローンがApo(ａ)特異的領域を含み、Mc Le
an J.ら(Nature 300:132-139,1987)によるDNA配列と完
全に一致することが判明した。
【００４４】２個のクリングルIVの間のイントロンか
ら、1.2Kb Pst I-PstI Iプローブを誘導し、次いでこれ
を制限長多型性(RFLP)を検出するためのサザンブロット
をスクリーニングするために使用した。
ら、1.2Kb Pst I-PstI Iプローブを誘導し、次いでこれ
を制限長多型性(RFLP)を検出するためのサザンブロット
をスクリーニングするために使用した。
【００４５】ハイブリダイゼーションを3×SSC/デンハ
ート溶液中65℃で一晩実施し、ポスト-ハイブリダイゼ
ーション洗浄を0.3×SSC中65℃で実施した。
ート溶液中65℃で一晩実施し、ポスト-ハイブリダイゼ
ーション洗浄を0.3×SSC中65℃で実施した。
【００４６】酵素TaqＩは、TaqＩ部位の１個が存在する
か存在しないかにより分子量が1.6及び1.3Kbである２個
の対立遺伝子をもつ多型性であることが分かった。集団
スクリーニングからマイナー(minor)な対立遺伝子の頻
度は40%で、多型性のメンデル遺伝を情報源である２家
族で証明した。
か存在しないかにより分子量が1.6及び1.3Kbである２個
の対立遺伝子をもつ多型性であることが分かった。集団
スクリーニングからマイナー(minor)な対立遺伝子の頻
度は40%で、多型性のメンデル遺伝を情報源である２家
族で証明した。
【００４７】実施例２：頻度の高い RFLPを明示するAp o
(ａ)イントロンプロ ーブのクローニング ヒトApo(ａ)遺伝子の予想される大きなサイズにより、Y
AC(Yeast ArtificialChromosome)ライブラリーを、Apo
(ａ)インタークリングルプローブ(上記参照)(Mc.Lean
J.ら,Nature 300:132-139,1987)をクローニングするの
に使用したのと同一のオリゴヌクレオチド対を用いる遺
伝子増幅によりスクリーニングした。遺伝子増幅はゲノ
ムDNA上で32サイクル(94℃での変性300秒,55℃でのアニ
ーリング60秒,72℃での伸長60秒)実施した。スクリーニ
ングは、Centre d'Etude du Polymorphisme Huamine(Pa
ris)で実施した。１個の陽性組換体を増殖し、DNAをLit
tleR.ら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1598-1602,1989)
の記載の方法に従って抽出した。
(ａ)イントロンプロ ーブのクローニング ヒトApo(ａ)遺伝子の予想される大きなサイズにより、Y
AC(Yeast ArtificialChromosome)ライブラリーを、Apo
(ａ)インタークリングルプローブ(上記参照)(Mc.Lean
J.ら,Nature 300:132-139,1987)をクローニングするの
に使用したのと同一のオリゴヌクレオチド対を用いる遺
伝子増幅によりスクリーニングした。遺伝子増幅はゲノ
ムDNA上で32サイクル(94℃での変性300秒,55℃でのアニ
ーリング60秒,72℃での伸長60秒)実施した。スクリーニ
ングは、Centre d'Etude du Polymorphisme Huamine(Pa
ris)で実施した。１個の陽性組換体を増殖し、DNAをLit
tleR.ら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1598-1602,1989)
の記載の方法に従って抽出した。
【００４８】YAC DNAをSau 3Aで一部切断し、Maniatis
T.ら(Molecular Cloning:a Laboratory manual. Cold S
pring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,New Yor
k 1989)に記載の蔗糖勾配上で分画した。大きさ15-20kb
の画分をXho Iで消化したラムダFixベクター(stratagen
e)に連結し、製造業者の条件に従ってパッケージング(G
igapack II-Stratagene)及びプレーティングを実施し
た。
T.ら(Molecular Cloning:a Laboratory manual. Cold S
pring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,New Yor
k 1989)に記載の蔗糖勾配上で分画した。大きさ15-20kb
の画分をXho Iで消化したラムダFixベクター(stratagen
e)に連結し、製造業者の条件に従ってパッケージング(G
igapack II-Stratagene)及びプレーティングを実施し
た。
【００４９】ラムダライブラリーをApo(ａ)リーダード
メイン(Mc.Lean J.ら,Nature 300:132-139,1987)をスパ
ンするプローブ及び第１のApo(ａ)クリングルIV(Mc.Lea
n J.ら,Nature 300:132-139,1987)由来のプローブを用
いて同時にスクリーニングした。幾つかの陽性が得られ
たが、そのうち２個だけが両方にハイブリダイズした。
図２はそのうちの一つの制限マップを示す。
メイン(Mc.Lean J.ら,Nature 300:132-139,1987)をスパ
ンするプローブ及び第１のApo(ａ)クリングルIV(Mc.Lea
n J.ら,Nature 300:132-139,1987)由来のプローブを用
いて同時にスクリーニングした。幾つかの陽性が得られ
たが、そのうち２個だけが両方にハイブリダイズした。
図２はそのうちの一つの制限マップを示す。
【００５０】第１のApo(ａ)クリングルIV由来のリーダ
ーを分離するイントロン配列をEcoRIで切断し、pGEM 7
プラスミド(Promega)にサブクローン化した。1.1kb Eco
RI-EcoRIフラグメント(図２参照)をTaqＩで切断したサ
ザンブロットにハイブリダイズし、制限長多型性を明ら
かにした。6.4及び5kbの多型性バンドを条件:3×SSC中6
5℃で一晩でのハイブリダイゼーション及び、0.3×SSC
中65℃での洗浄で検出した。情報を提供する１家族に於
ける家族調査により、多型性がメンデルの方法で遺伝し
たことが分かった。
ーを分離するイントロン配列をEcoRIで切断し、pGEM 7
プラスミド(Promega)にサブクローン化した。1.1kb Eco
RI-EcoRIフラグメント(図２参照)をTaqＩで切断したサ
ザンブロットにハイブリダイズし、制限長多型性を明ら
かにした。6.4及び5kbの多型性バンドを条件:3×SSC中6
5℃で一晩でのハイブリダイゼーション及び、0.3×SSC
中65℃での洗浄で検出した。情報を提供する１家族に於
ける家族調査により、多型性がメンデルの方法で遺伝し
たことが分かった。
【００５１】
配列番号:１ 配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列 CCTATTTGGA TTTTGGACGC 20 配列番号：２ 配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列 GATAACAGAC CAATAGCTGT 20 配列番号:３ 配列の長さ：21塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列 CTGCAGACAA CCCCTTAAAC A 21 配列番号:４ 配列の長さ：21塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列 GGATCCTTAG AGATATCCTG C 21 配列番号:５ 配列の長さ：23塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列 TTTCTGTGGT CCTATTATGT TGA 23 配列番号:６ 配列の長さ：19塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列 CACCTGAGCA AAGCCATGT 19
【図１】図１は、クリングルIV繰り返し領域内のApo
(ａ)遺伝子の領域を示す図である。この領域の一部を、
多型性TaqＩ部位並びにすぐそばの5'及び3'TaqＩ部位を
示すために拡大した。プローブとして使用したPstＩフ
ラグメントも表示する。
(ａ)遺伝子の領域を示す図である。この領域の一部を、
多型性TaqＩ部位並びにすぐそばの5'及び3'TaqＩ部位を
示すために拡大した。プローブとして使用したPstＩフ
ラグメントも表示する。
【図２】図２は、Apo(ａ)遺伝子の5'領域を示し、この
領域の一部が単一のラムダファージクローン中に得られ
たことを示す図である。この領域中に記載されたTaqＩ
多型性を検出するために使用し得るEcoR1フラグメント
も示されている。この図は、第１のApo(ａ)クリングルI
V配列にリーダーを結合するλ組換えクローンの制限マ
ップであり、黒四角は各々リーダー及びクリングルIVを
コードするエキソンを表す。SacＩクローニング部位は
四角で囲んである。また、Ｋ＝KpnI、Ｅ＝EcoRI、Ｈ＝H
indIII、Ｘ＝XbaＩ、Ｂ＝BamIIIを表す。
領域の一部が単一のラムダファージクローン中に得られ
たことを示す図である。この領域中に記載されたTaqＩ
多型性を検出するために使用し得るEcoR1フラグメント
も示されている。この図は、第１のApo(ａ)クリングルI
V配列にリーダーを結合するλ組換えクローンの制限マ
ップであり、黒四角は各々リーダー及びクリングルIVを
コードするエキソンを表す。SacＩクローニング部位は
四角で囲んである。また、Ｋ＝KpnI、Ｅ＝EcoRI、Ｈ＝H
indIII、Ｘ＝XbaＩ、Ｂ＝BamIIIを表す。
Claims (19)
- 【請求項１】 ヒトApo(ａ)遺伝子の多型性リーダーTaq
Ｉ部位の5'及び3'のすぐそばのTaqＩ部位の間のヒトゲ
ノムDNAにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドプロ
ーブであって、前記ヒトゲノムDNAが5'及び3'プライマ
ー： 5'：5' CCT ATT TGG ATT TTG GAC GC 3'（配列番号１） 3'：5' GAT AAC AGA CCA ATA GCT GT 3'（配列番号２） を用いるApo(a)遺伝子のPCR増幅により検出し得ること
を特徴とする前記ポリヌクレオチドプローブ。 - 【請求項２】 場合により顕示標識を保持する配列： 5' CCT ATT TGG ATT TTG GAC GC 3'（配列番号１） のプローブであることを特徴とする請求項１に記載のポ
リヌクレオチドプローブ。 - 【請求項３】 場合により顕示標識を保持する配列： 3'：5' GAT AAC AGA CCA ATA GCT GT 3'（配列番号２） のプローブであることを特徴とする請求項１に記載のポ
リヌクレオチドプローブ。 - 【請求項４】 ヒトApo(ａ)遺伝子の多型性クリングルT
aqＩ部位の5'及び3'のすぐそばのTaqＩ部位の間のヒト
ゲノムDNAにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドプ
ローブであって、前記ヒトゲノムDNAが５'及び３'プラ
イマー： 5'：5' CTG CAG ACA ACC CCT TAA ACA 3'（配列番号
３） 3'：5' GGA TCC TTA GAG ATA ACC TGC 3'（配列番号
４） を用いるApo(a)遺伝子のPCR増幅により検出し得ること
を特徴とする前記ポリヌクレオチドプローグ。 - 【請求項５】 場合により顕示標識を保持する配列： 5' CTG CAG ACA ACC CCT TAA ACA 3'（配列番号３） のプローブであることを特徴とする請求項４に記載のポ
リヌクレオチドプローブ。 - 【請求項６】 場合により顕示標識を保持する配列： 3'：5' GGA TCC TTA GAG ATA ACC TGC 3'（配列番号
４） のプローブであることを特徴とする請求項４に記載のポ
リヌクレオチドプローブ。 - 【請求項７】 配列： 5' CCT ATT TGG ATT TTG GAC GC 3'（配列番号１）及び 5' GAT AAC AGA CCA ATA GCT GT 3'（配列番号２） のDNAプローブ対を含むキット。
- 【請求項８】 配列： 5' CTG CAG ACA ACC CCT TAA ACA 3'（配列番号３）及
び 5' GGA TCC TTA GAG ATA ACC TGC 3'（配列番号４） のDNAプローブ対を含むキット。 - 【請求項９】 ヒトApo(ａ)遺伝子内のTaqＩ多型性の検
出法に使用するための請求項１〜６のいずれか１項に記
載のプローブまたは請求項７若しくは８に記載のキッ
ト。 - 【請求項１０】 ヒトDNAサンプル中のヒトApo(ａ)遺伝
子内のTaqＩ多型性の測定方法であって、請求項１〜６
のいずれか１項に記載のプローブとヒトDNAサンプルと
を接触させ、次いでサンプル中に存在するTaqＩ多型性
を決定することを含む前記方法。 - 【請求項１１】 ヒトDNAサンプルが血液サンプルから
得られた全ゲノムDNAであることを特徴とする請求項１
０に記載の方法。 - 【請求項１２】 個体中に存在するクリングルTaqＩ多
型性を決定するために請求項４〜６のいずれか１項に定
義されたプローブまたはリーダーTaqＩ多型性を決定す
るために請求項１〜３のいずれか１項に定義のプローブ
と個体のDNAサンプルとを接触させ、次いで得られた結
果と生物学的両親の一方または両方由来のDNAを同一多
型性を検出し得るプローブを用いる試験にかけて得られ
た結果とを比較することを含む、個体のApo(ａ)遺伝子
の両親起源を測定する方法。 - 【請求項１３】 個体のDNA及び両親のDNAを検査するた
めに使用するプローブが同一であることを特徴とする請
求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 個体の生物学的祖父母または兄弟姉妹
の１名以上からのDNAサンプルも検査することを特徴と
する請求項１２または１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 個体の両親または祖父母の１名以上が
高血中レベルのアポリポタンパク質（ａ）及び/または
心臓疾患の病歴を持つことを特徴とする請求項１２〜１
４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 Apo(ａ)遺伝子内の別のTaqＩ多型性を
検出し得る第２のプローブを用いて、検査されるべきDN
Aサンプルを検査することをさらに含む請求項１２〜１
５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１７】 個体由来のDNAサンプル中のApo(ａ)遺
伝子のリーダーTaqＩ及び/またはクリングルTaqＩ多型
性を測定し、次いで同一Apo(ａ)リーダーTaqＩ及び/ま
たはクリングルTaqＩ多型性を保有する他の個体の参照
集団に於ける心臓疾患の判定された罹患率を参照して心
臓疾患の危険性を評価することを含む、心臓疾患の危険
性に関して参照集団から個体成員を評価する方法。 - 【請求項１８】 参照集団が個体と同一民族起源である
ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 集団が日本人であることを特徴とする
請求項１８に記載の方法。
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|---|---|---|---|---|
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| JP2009524404A (ja) * | 2002-12-20 | 2009-07-02 | アプレラ コーポレイション | 心筋梗塞に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用 |
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| GB9301453D0 (en) | 1993-03-17 |
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