JPH0632615B2

JPH0632615B2 - 酵素又は微生物菌体の粒状固定化成形物の製造方法

Info

Publication number: JPH0632615B2
Application number: JP3227186A
Authority: JP
Inventors: 高三飯田; 昌弘坂本
Original assignee: Kansai Paint Co Ltd
Current assignee: Kansai Paint Co Ltd
Priority date: 1986-02-17
Filing date: 1986-02-17
Publication date: 1994-05-02
Anticipated expiration: 2009-05-02
Also published as: JPS62190081A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は酵素又は微生物菌体の固定化法に関しさらに詳
しくは酵素又は微生物菌体を粒状成形物として固定化す
る方法に関する。

酵素又は微生物の固定化法としては、従来から包括法、
物理的吸着法、共有結合法等多くの方法が知られてい
る。これらの方法によって得られる塊状あるいはシート
状の固定化物は、微生物反応や酵素反応に使用する場合
には、細かく切断したり磨砕したりした後カラムに充填
するのが普通である。しかしその場合固定化物は面同志
で密着することが多く、微生物反応や、酵素反応の効率
が悪くなり、また、しばしばチャネリング現象を起こし
てカラムを閉塞する等の欠点もある。

これらの欠点は酵素又は微生物菌体を粒状成形物として
固定化することができれば、流動しやすくカラムへの充
填作業が容易になり、粒子同志の接触面積も少なく微生
物反応や酵素反応の効率をアップすることができる。酵
素又は微生物菌体を粒状成形物として固定化する方法に
ついては、固定化担体としてある種の親水性光硬化性樹
脂と多価金属イオンとの接触によりゲル化する能力のあ
る水溶性高分子多糖類との組合せにより、水性媒体から
粒状固定化物を製造する方法が公知である。（公開特許
公報昭５９−１１１８２）この方法は酵素又は微生物菌体の活性をそこなうことな
く水性媒体から極めて簡単に粒状固定化物を製造するこ
とができるが、固定化担体としてある種の親水性光硬化
性樹脂と多価金属イオンとの接触によりゲル化する能力
のある水溶性高分子多糖類を用い、これに光重合開始
剤、酵素又は微生物菌体を加えた液状組成物を、多価金
属イオンを含有する水性媒体中に滴下して該組成物を粒
状にゲル化させ、次いで得られる粒状ゲルに水性媒体中
で活性光線を照射して該粒状ゲル中の光硬化性樹脂を硬
化させる方法であるため、水性媒体中の溶存酸素濃度が
高いと光硬化性樹脂の光硬化性が低下するという欠点が
ある。特に光硬化性樹脂の重合禁止剤として、酸素と結
合して重合禁止作用を示すハイドロキノン等が用いられ
ているとこの傾向は著しい。光硬化性樹脂の硬化が不十
分であると包括固定化する酵素又は菌体の粒子からのも
れや水性媒体のにごりなど好ましくない結果を生じる。
溶存酸素の影響を除くには水性媒体中への粒状滴下と活
性光線照射を不活性ガス中で行うというめんどうな操作
を必要とする。

本発明者らはこれらの欠点を克服し、水性媒体中の粒状
固定化に際し、水性媒体中の溶存酸素や光硬化性樹脂中
の重合禁止剤の影響を除去する方法を鋭意研究した結果
本発明にいたった。

本発明の特徴は酵素又は微生物菌体の粒状固定化成形物
の製造に際して（ａ）１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結
合を有する親水性光硬化性樹脂（ｂ）光重合開始剤（ｃ）多価金属イオンとの接触によりゲル化する能力の
ある水溶性高分子多糖類（ｄ）酵素又は微生物菌体を含んでなる液状組成物を、多価金属イオンとアスコル
ビン酸又はアスコルビン酸ナトリウムを含有する水性媒
体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化させ、次いで得
られる粒状ゲルに活性光線を照射して該粒状ゲル中の光
硬化性樹脂を硬化させることにある。この水性媒体中に
含有されるアスコルビン酸又はアスコルビン酸ナトリウ
ムが、その還元作用により光硬化性樹脂中に含まれるハ
イドロキノンなどの水性媒体中の溶存酸素の酸化による
ベンゾキノンの生成を防いで、光硬化性樹脂の硬化性の
向上に著しい効果がある。その結果包括固定化した酵素
又は菌体の粒子からのもれや水性媒体のにごりを著しく
少なくすることができる。また、ベンゾキノンなどの様
な溶存酸素の存在にかかわりなく重合禁止作用を示す重
合禁止剤を光硬化性樹脂の重合防止に使用した場合で
も、水性媒体中のアスコルビン酸又はアスコルビン酸ナ
トリウムによりベンゾキノンを重合禁止作用の小さいハ
イドロキノンに還元して光硬化性を向上させることがで
きる。

以下本発明の方法についてさらに詳しく説明する。

（ａ）親水性光硬化性樹脂本発明の方法においては、固定化担体の１つとして、１
分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結合を有す
る親水性光硬化性樹脂を使用する。該光硬化性樹脂とし
ては、一般に３００〜３０，０００、好ましくは５００
〜２０，０００の範囲内の数平均分子量を有することが
でき、また、酵素又は微生物菌体を懸濁させた水性媒体
中に均一に分散するに充分なイオン性又は非イオン性の
親水性基、例えば水酸基、カルボキシル基、リン酸基、
スルホン酸基、アミノ基、エーテル結合などを含み、且
つ波長が約２５０〜約６００nmの範囲内の活性光線を照
射したとき、硬化して水に実質的に不溶性の樹脂に変わ
るものが好適に使用される。そのような光硬化性樹脂は
酵素又は微生物菌体の固定化担体として既に知られてお
り（例えば、特公昭５５−４０号公報、特公昭５５−２
０６７６号公報等参照）、代表的なものとして以下に記
載するものを挙げることができる： (i)高酸化不飽和ポリエステル類：例えば、無水マレイ
ン酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、無水イタコ
ン酸などの不飽和多価カルボン酸の少なくとも１種と、
トリメリット酸、無水トリメリット酸、ピロメリット
酸、無水ピロメリット酸などの飽和多価カルボン酸の少
なくとも１種とからなる多価カルボン酸成分と、多価ア
ルコールとのエステル化により得られる酸価が４０〜２
００の範囲内の不飽和ポリエステルの塩類；無水マレイ
ン酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、無水イタコ
ン酸などの不飽和多価カルボン酸の少なくとも１種と、
１分子中に３個より多いヒドロキシル基を有する多価ア
ルコールを少なくとも５重量％含む多価アルコール成分
とのエステル化物中の残存ヒドロキシル基に酸無水物を
反応させて得られる酸価が４０〜２００の範囲内の不飽
和ポリエステル類など。

(ii)高酸化不飽和エポキシド類：ポリグリシジル化合物
例えばシェルケミカル社製のエピコート８２８、エピコ
ート１００１、エピコート１００４などのｎ当量と多価
カルボン酸、例えばマレイン酸、アジピン酸、トリメリ
ット酸などの（ｎ−１）当量と（メタ）アクリル酸など
の不飽和カルボキシル化合物２当量との付加反応物に残
存するヒドロキシル基に酸無水物を付加して得られる酸
価が４０〜２００の範囲内の不飽和エポキシド類；上記
の如きポリグリシジル化合物ｎ当量と上記の如き多価カ
ルボン酸（ｎ＋２）当量との付加反応物に残存するヒド
ロキシル基に酸無水物を付加させて得られる化合物に
（メタ）アクリル酸グリシジルなどの不飽和グリシジル
化合物を反応させて得られる酸価が４０〜２００の不飽
和エポキシド類など。

(iii)アニオン性不飽和アクリル樹脂類：ここでアニオ
ン性不飽和アクリル樹脂とは、（メタ）アクリル酸及び
（メタ）アクリル酸エステルから選ばれる少なくとも２
種の（メタ）アクリル系モノマーを共重合させて得られ
るカルボキシル基、リン酸基及び／又はスルホン酸基を
含有する共重合体に光重合可能なエチレン性不飽和基を
導入した樹脂であり且つ下記式Ｃ＋５Ｐ＋１０Ｓ＝Ａ（１）［式中、Ｃは樹脂中のカルボキシル基の濃度（mol／k
g）であり、Ｐは樹脂中のリン酸基濃度（mol／kg）であ
り、Ｓは樹脂中のスルホン酸基濃度（mol／kg）であ
る］によって算出されるＡの値が０．８〜５（mol／kg）の
範囲内にあり、そして該樹脂中の光重合可能なエチレン
性不飽和基の濃度が０．１〜５（mol／kg）の範囲内に
ある樹脂をいう。かかる共重合体は公知の方法で合成す
ることができ、その際、コモノマーとしてアクリル酸、
メタクリル酸などの不飽和カルボン酸を使用すればカル
ボキシル基を含有する共重合体が得られ、コモノマーと
してホスマーＭ、ホスマーＣ１［両者とも油脂製品
（株）製］などの不飽和リン酸エステルを用いればリン
酸基を含有する共重合体が得られ、また、コモノマーと
して（メタ）アクリル酸−２−スルホエチル、（メタ）
アクリル酸−３−スルホプロピルなどの不飽和スルホン
酸エステルを使用すればスルホン酸基を含有する共重合
体が得られる。かくして得られる共重合体に光重合可能
なエチレン性不飽和基を導入するためには、該共重合体
中に存在するカルボキシル基、リン酸基又はスルホン酸
基に（メタ）アクリル酸グリシジルなどの不飽和グリシ
ジル化合物を反応させることによって可能となる。

(iv)カチオン性不飽和アクリル樹脂：例えば、（メタ）
アクリル酸−２−ジエチルアミノエチル、（メタ）アク
リル酸−ｔｅｒｔ−ブチルアミノエチル、ビニルピリジ
ンなどの不飽和アミノ化合物を５重量％より多い量を含
む（メタ）アクリル酸エステルの共重合体に、（メタ）
アクリル酸グリシジルなどの不飽和グリシジル化合物を
反応させて得られる不飽和アクリル樹脂；ポリスチレン
をクロロメチル化後、不飽和アミノ化合物で第４級化し
て得られる不飽和アクリル樹脂；ポリエチレンイミン不
飽和グリシジル化合物との付加物など。

(v)ポリエチレングリコールと（メタ）アクリル酸との
ポリエステル類：例えば、分子量４００〜１００００で
３０重量％未満のプロピレンオキシド基を含むポリエチ
レングリコールの（メタ）アクリル酸などの不飽和モノ
カルボン酸のジエステル；ｎモルの無水マレイン酸など
の２塩基酸と（ｎ＋１）モルの分子量６００〜１０００
０のポリエチレングリコールおよび２モルの（メタ）ア
クリル酸などの不飽和モノカルボン酸のエステル化物；
ｎモルのトリメリット酸などの３塩基酸とｎ＋２モルの
分子量６００〜１００００のポリエチレングリコールお
よび３モルの（メタ）アクリル酸などの不飽和カルボン
酸のエステル化物など。

(vi)ポリエチレングリコールと（メタ）アクリル酸２−
ヒドロキシエチルとのウレタン化付加物類：例えば、ｎ
モルのトリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシ
アネート、ヘキサメチレンジイソシアネートなどのジイ
ソシアネートと（ｎ−１）モルの分子量８００〜１００
００のポリエチレングリコールおよび２モルの（メタ）
アクリル酸２−ヒドロキシエチルなどの不飽和モノヒド
ロキシ化合物とのウレタン化物；ｎモルのデスモジュー
ルＬ（バイエル社製）などのトリイソシアネートと（ｎ
−１）モルの分子量８００〜１００００のポチエチレン
グリコールおよび（ｎ＋２）モルの（メタ）アクリル酸
２−ヒドロキシエチルなどの不飽和モノヒドロキシ化合
物とのウレタン化物；１モルのトリメチロールプロパン
などの３官能性ヒドロキシ化合物と４モルのジイソシア
ネートと２モルの分子量４００〜１００００のポリエチ
レングリコールおよび２モルの（メタ）アクリル酸２−
ヒドロキシエチルなどの不飽和モノヒドロキシ化合物と
のウレタン化物など。

(vii)不飽和セルロース類：例えば、セルロースアセテ
ートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース
フタレート、ヒドロキシエチルセルロースなどの水溶性
のセルロースと（メタ）アクリル酸グリシジルなどの不
飽和グリシジル化合物又は無水イタコン酸、無水マレイ
ン酸などの不飽和酸無水物との付加反応物。

(viii)不飽和ポリアミド：例えば、１モルのトリレンジ
イソシアネート、キシリレンジイソシアネートなどのジ
イソシアネートと１モルのアクリル酸２−ヒドロキシエ
チルなどの不飽和ヒドロキシ化合物との付加物をゼラチ
ンなどの水溶性ポリアミドに付加反応させた不飽和ポリ
アミド。

以上に例示した如き光硬化性樹脂はそれぞれ単独で使用
することができ、或いは２種もしくはそえ以上組合わせ
て使用してもよい。これら光硬化性樹脂のうち、本発明
において特に有利に使用しうるものとしては、前記(v)
のポリエチレングリコールと（メタ）アクリル酸とのポ
リエステル類及び(vi)のポリエチレングリコールと（メ
タ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルとのウレタン化付
加物を挙げることができる。

（ｂ）光重合開始剤上記（ａ）に述べた光硬化性樹脂の光重合反応を促進す
る目的で、本発明に従う液状組成物には光重合開始剤
（光増感剤）を含ませる。使用しうる光重合開始剤は光
照射により分解してラジカルを生成し、このものが重合
開始種となって重合性不飽和基を有する樹脂間に橋かけ
反応を起こさせるもので、例えばベンゾイン、アセトイ
ンなどのα−カルボニルアルコール類；ベンゾインメチ
ルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンゾインプ
ロピルエーテル、アニソインエチルエーテル、ピバロイ
ンエチルエーテル等のアシロインエーテル類；ナフトー
ル、ヒドロキシアントラセンなどの多環芳香族化合物
類；メチルベンゾイン、α−メトキシベンゾインなどの
α−置換アシロイン類；２−シアノ−２−ブチルアゾホ
ルムアミドなどのアゾアミド化合物類；硝酸ウラニル、
塩化第２鉄などの金属塩類；メルカプタン類；ジスルフ
ィド類；ハロゲン化合物類；染料類等をあげることがで
きる。

これらの光重合開始剤は単独又は２種以上組合せて通常
０．０１〜１０pHR(per handred Resin)の割合で使用で
きる。

（ｃ）水溶性高分子多糖類本発明の方法は、酵素又は微生物菌体の固定化担体の水
性媒体中でのゲル化を達成するために、固定化担体とし
て、前（ａ）項に述べた光硬化性樹脂と組合わせて水溶
性高分子多糖類を使用することに１つの大きな特徴があ
る。

本発明において使用する水溶性高分子多糖類は、水溶性
であり、水性媒体中で多価金属イオンと接触したときに
水に不溶性又は難溶性のゲルに変化する能力のある高分
子多糖類で、一般に約３，０００〜約２，０００，００
０の分子量を有し、また、多価金属イオンと接触させる
前の水溶性の状態で通常少なくとも約１０ｇ／（２５
℃）の溶解度を示すものが好適に使用される。

かかる特性をもつ水溶性高分子多糖類の具体例として
は、アルギン酸のアルカリ金属塩、カラギーナン、マン
ナン、キトサン等が包含される。

これら水溶性高分子多糖類は水性媒体中に溶解した状態
で、多価金属イオン、例えばマグネシウムイオン、カル
シウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン
等のアルカリ土類金属イオン或いはアルミニウムイオ
ン、セリウムイオン、ニッケルイオン等の他の多価金属
イオンのうちの少なくとも１種の多価金属イオンと接触
するとゲル化しうる。なお、本発明において使用しうる
水溶性高分子多糖類は、すべての多価金属イオンの接触
に対してゲル化能を有している必要はなく、少なくとも
１種の多価金属イオン、好ましくはアルカリ土類金属イ
オンと接触した時にゲル化する能力を有していれば充分
である。ゲル化が起る多価金属イオンの濃度は水溶性高
分子多糖類の種類等により異なるが、一般には少なくと
も０．１mol／である。

（ｄ）酵素又は微生物菌体本発明の方法により固定化しうる酵素又は微生物菌体の
種類には特に制約はなく、本発明の方法によれば、どの
ような種類の酵素又は微生物菌体でも、その酵素活性を
実質的に失活させることなく固定化することができる。

しかして、本発明の方法によって固定化しうる酵素及び
微生物菌体の代表例を示せば次のとおりである。

（イ）酵素の例ラクテートデヒドロゲナーゼ（１．１．２．３）、ラクテートオキシダーゼ（１．１．３．２）、グルコースオキシダーゼ（１．１．３．４）、ホルメートデヒドロゲナーゼ（１．２．１．２）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（１．２．１．３）、アルデヒドオキシダーゼ（１．２．３．１）、キサンチンオキシダーゼ（１．２．３．２）、ピルビン酸オキシダーゼ（１．２．３．３）、ピルビン酸リダクターゼ（１．２．４．１）、コルチゾン−α−リダクターゼ（１．３．１．４）、アシルＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ（１３．９９．３）、３−ケトステロイドΔ^１−デヒドロゲナーゼ（１．３．
９９．４）、３−ケトステロイドΔ^４−デヒドロゲナーゼ（１．３．
９９．５）、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ（１．４．１．１）、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（１．４．１．
３）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（１．４．３．２）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（１．４．３．３）、ピリドキサールリン酸オキシダーゼ（１．４．３．
５）、カタラーゼ（１．１１．１．６）、カテコールメチルトランスフェラーゼ（２．１．１．
６）、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ（２．３．１．
７）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（２．３．
１．９）、アスペルテートアミノトランスフェラーゼ（２．６．
１．１）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．
２）、ピリドキサミンピルベートトランスフェラーゼ（２．
６．１）、ヘキソキナーゼ（２．７．１１）、グルコキナーゼ（２．７．１．２）、フルコトキナーゼ（２．７．１．４）、ホスホグルコキナーゼ（２．７．１．１０）、ホスホフルクトキナーゼ（２．７．１．１１）、ピルベートキナーゼ（２．７．１．４０）、カルボキシエステラーゼ（３．１．１．１）、アリールエステラーゼ（３．１．１．２）、リパーゼ（３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ（３．１．１．４）、アセチルエステラーゼ（３．１．１．６）、コレステロールエステラーゼ（３．１．１．１３）、グルコアミラーゼ（３．２．１．３）、セルラーゼ（３．２．１．４）、イヌラーゼ（３．２．１．７）、 α−グルコシダーゼ（３．２．１．２０）、 β−グルコシダーゼ（３．２．１．２１）、 α−ガラクトシダーゼ（３．２．１．２２）、 β−ガラクトシダーゼ（３．２．１．２３）、インベルターゼ（３．２．１．２６）、ペプシン（３．４．４．１）、トリプシン（３．４．４．４）、キモトリプシンＡ（３．４．４．５）、カテプシンＡ（３．４）、パパイン（３．４．４．１０）、トロンビン（３．４．４．１３）、アミダーゼ（３．５．１．４）、ウレアーゼ（３．５．１．５）、ペニシリンアシダーゼ（３．５．１．１１）、アミノアシラーゼ（３．５．１．１４）、アデニンデアミナーゼ（３．５．４．２）、Ａ．Ｔ．Ｐ．アーゼ（３．６．１．３）、ピルベートデカルボキシラーゼ（４．１．１．１）、オキザレートデカルボキシラーゼ（４．１．１．２）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（４．１．１．２
７）、アルドラーゼ（４．１．２．１３）、マレートシュターゼ（４．１．３．２）、トリプトファンシンターゼ（４．２．１．２０）、アスペルターゼ（４．３．１．１）、リジンラセマーゼ（５．１．１．５）、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（５．３．１．
９）、ステロイドΔ−イソメラーゼ（５．３．３．１）、マクシニルＣｏＡシンセターゼ（６．２．１．５）、など。

（註）カッコ内の数字は酵素番号を表わす。

（ロ）微生物菌体の例：ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgari
cus)、アエロバクター・アエロゲネス(Aerobacter aerogene
s)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、アゾトバクター・ビネランディ(Azotobacter vinelandi
i)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、アースロバクター・シンプレックス(Arthrobacter simp
lex)、エッシェリシア・コリー(Escherichia coli)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、アクロモバクター・リクイダム(Achromobacter liquidu
m)、クルブラリア・ルナータ(Curvularia lunata)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium g
lutamicum)、ノカルディア・ロドクラス(Nocardia rhodcrous)、サッカロミセス・フオルモセンシス(Saccharomyces for
mosensis)、サッカロミセス・セルビシア(Saccharomyces cerevisia
e)、サッカロミセス・カルスベルゲンシス(Saccharomyces c
arlsbergensis)、サッカロミセス・ロブスタス(Saccharomyces robustu
s)、サッカロミセス・ロキシイ(Saccharomyces rouxii)、ジゴサッカロミセス・ジャポニカス(Zygosaccharomyces
japonicus)、ジゴサッカロミセス・マジャール(Zygosaccharomyces m
ajar)、ジゴサッカロミセス・ソヤ(Zygosaccharomyces soya)、チゾサッカロミセス・ポンボ(Schizosaccharomyces pom
bo)、チゾサッカロミセス・オクトスポルス(Schizosaccharom
yces octosporus)、チゾサッカロミセス・メラセイ(Schizosaccharomyces m
ellacei)、など。

液状組成物の調製：以上に述べた（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の各成
分は、水性媒体中で相互に充分に混合することにより液
状組成物にすることができる。使用しうる水性媒体とし
ては、水又は緩衝水溶液が好適であるが、場合によって
は水溶性アルコール類と水又は緩衝水溶液との混合液、
水溶性ケトン類と水又は緩衝水溶液との混合液、水や緩
衝水溶液と均一に混合しうるエステル系溶剤溶液などを
使用することもできる。

上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の各成分の相互
の使用割合は厳密に制限されるものではなく、各成分の
種類等に応じて広範にわたって変えることができるが、
一般には、（ａ）成分の親水性光硬化性樹脂１００重量
部に対し、下記の割合で使用するのが適当でる（カッコ
内は好適範囲である）。

（ｂ）光重合開始剤：０．５〜５重量部（１〜３重量
部）（ｃ）水溶性高分子多糖類：０．５〜１５重量部（１〜
８重量部）（ｄ）酵素又は微生物菌体：０．００１〜５０重量部
（０．０１〜２０重量部）また、水性媒体は上記（ａ）〜（ｄ）の合計に対して１
０〜１５００重量部（５０〜９００重量部）の範囲で使
用することができる。

ゲル化：上記の如くして調製された液状組成物は次いで多価金属
イオンとアスコルビン酸又はアスコルビン酸ナトリウム
を含有する水性媒体中に滴下することにより粒状にゲル
化される。

上記水性媒体中に含ませうる多価金属イオンとしては、
該液状組成物中の水溶性高分子多糖類をゲル化させる能
力のあるものが選ばれる。その際該多価金属イオンが該
水溶性高分子多糖類をゲル化させる能力を有しているか
否かは、例えば、親水性光硬化性樹脂と水溶性高分子多
糖類を均一に含む混合水溶液を該多価金属イオン液に滴
下して粒状にゲル化するかどうか観察することにより容
易に決定することができる。

また、上記水性媒体中に含ませるアスコルビン酸、また
はアスコルビン酸ナトリウムは、滴下する液状組成物中
の光硬化性樹脂に含まれるハイドロキノンなどが、水性
媒体中の溶存酸素による酸化で重合禁止性の強いベンゾ
キノンなどに変化して光硬化性を低下させるのを防ぐ働
きをする。

選ばれた多価金属イオンンとアスコルビン酸又はアスコ
ルビン酸ナトリウムを含有する水性媒体の調製は、水性
媒体中に、該多価金属の水溶性化合物、例えば該多価金
属のハロゲン化物、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、硝酸
塩等を溶解した後、アスコルビン酸又はアスコルビン酸
ナトリウムを溶解することにより行なうことができる。
その際の水性媒体中の多価金属イオンの濃度は、一般に
０．０１〜５mol／、好ましくは０．１〜２mol／の
範囲内とすることができる。一方、アスコルビン酸又は
アスコルビン酸ナトリウムの濃度は、一般に０．００１
〜１mol／、好ましくは０．００５〜０．１mol／の
範囲内とすることができる。

かかる多価金属イオンとアスコルビン酸又はアスコルビ
ン酸ナトリウムを含有する水性媒体中への前記液状組成
物の滴下は、例えば注射針のような先の細い管の先端か
ら該液状組成物を滴下する方法、遠心力を利用して該液
状組成物を粒状に飛散さえる方法、スプレーノズル先端
から該液状組成物を霧化して粒状として滴下する方法な
どの方法により行なうことができる。滴下する液滴の大
きさは最終の粒状固定化物に望まれる粒径に応じて自由
に変えることができるが、通常は直径が約０．１〜５m
m、好ましくは約０．５〜３mmの液滴として滴下させる
のが好都合である。

滴下した液状組成物は水性媒体中で多価金属イオンと接
触し、直ちにゲル化して、粒状のゲルとなる。その際の
ゲル化の機構は正確にはわからないが、水溶性高分子多
糖類がハロゲン化物又は塩溶液により凝集し、ついで水
溶性高分子多糖類に含まれるアニオン基が多価金属イオ
ンを介して、イオン結合することにより三次元的に架橋
してゲル化するものと推定される。

上記ゲル化の温度は通常室温で充分であるが、必要によ
り酵素又は微生物菌体が失活しない程度の加温下にゲル
化を行なってもよく、あるいは冷却下に行なってもよ
い。

光硬化：上記の如くして生成せしめた粒状ゲルは、そのまま水性
媒体中に分散させた状態で、活性光線を照射することに
より、該粒状ゲル中の親水性光硬化性樹脂を硬化せしめ
る。この際、水性媒体中に含まれるアスコルビン酸又は
アスコルビン酸ナトリウムは、光硬化性樹脂中に含まれ
るハイドロキノンなどが、水性媒体中の溶存酸素による
酸化で、重合禁止性の強いベンゾキノンなどに変化して
光硬化性を低下させるのを防ぐ。これは、アスコルビン
酸又はアスコルビン酸ナトリウムがその還元性によりベ
ンゾキノンなどを重合禁止性の弱いハイドロキノンなど
に還元するためと思われる。光硬化性樹脂に含まれるハ
イドロキノンなどが、樹脂保存中あるいは液状組成物配
合時にベンゾキノンなどに酸化されて粒状ゲル中に含ま
れる場合、光硬化性樹脂の重合禁止剤としてベンゾキノ
ンなどが使用されて粒状ゲル中に含まれる場合も同様に
水性媒体中でアスコルビン酸又はアスコルビン酸ナトリ
ウムにより、重合禁止作用の弱いハイドロキノンなどに
還元されて光硬化性が向上する。光硬化性樹脂の硬化に
より粒状ゲルは水に実質的に不溶性で機械的強度の大き
い酵素又は微生物菌体の粒状固定化物が得られる。

上記光硬化に使用しうる活性光線の波長は該粒状ゲル中
に含まれる光硬化性樹脂の種類等に応じて異なるが、一
般に約２５０〜約６００nmの範囲内の波長の光を発する
光源を照射に使用するのが有利である。そのような光源
の例としては、低圧水銀灯、高圧水銀灯、蛍光灯、キセ
ノンランプ、カーボンアーク灯、太陽光等があげられ
る。照射時間は光源の光の強さ、光源からの距離等に応
じて変える必要があるが、一般には約０．５〜約１０分
間の範囲内とすることができる。照射は生成せしめた全
粒子ゲルに活性光線が出来るだけまんべんなく行きわた
るようにすべきである。

このように照射処理が終った粒状ゲルは水あるいは、緩
衝水溶液で洗浄し、そのまま保存に供したりあるいは粒
状ゲルを凍結乾燥して保存することができる。

かくして本発明により粒径が約０．５〜約５mmの酵素又
は微生物菌体の粒状固定化物が、極めて簡単な操作で製
造することができ、連続的生産も可能である。

本発明の利点は、光硬化性樹脂を固定化担体として水性
媒体中へ滴下した粒状ゲルに光照射して酵素又は微生物
菌体を粒状固定化するに際して、光硬化性樹脂の重合禁
止剤や水性媒体中の溶存酸素による硬化不良を防止する
ことにある。これにより包括固定化した酵素又は菌体の
粒子からのもれや水性媒体のにごりを著しく少なくする
ことができ、粒状固定化酵素又は菌体の活性を向上させ
る効果がある。

次に実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１ハイドロキノン２ｇを含み、数平均分子量４０００のポ
リエチレングリコール２０００ｇとイソホロンジイソシ
アネート１モル（２２２ｇ）およびメタクリル酸２−ヒ
ドロキシエチル１モル（１３０ｇ）からなる光硬化性樹
脂１００重量部と、ベンゾインイソブチルエーテル２重
量部および蒸留水１００重量部をよく混合する。これに
２％アルギン酸ナトリウム水溶液１００重量部および
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５）にとかした酵素インベ
ルターゼ（０．１％濃度）１００重量部を加えると共に
よく混合し、得られる光硬化性樹脂−酵素混合液を０．
５Ｍ塩化カルシウム溶液と０．０５Ｍアスコルビン酸溶
液の１：１混合液中に注射器先端の注射針から液面高さ
１０cmより滴下したところ粒径約２mmの粒状物が得られ
た。

この粒状物を平らな底面を有するペトリ更に単層となる
ようにアスコルビン酸を含む塩化カルシウム液と共に移
し深さ１cmの水溶液中に粒状物が存在するようにしてペ
トリ皿の上面及び下面から波長３００〜４００nmの活性
光線を３分照射したところ圧縮強度３０kg／cm²の粒状
固定化酵素が得られた。滴下した塩化カルシウム−アス
コルビン酸液のにごりを３７５nm吸光度で測定したとこ
ろ０．０１であった。

この粒子のインベルターゼ活性をショ糖を基質として測
定したところ、固定化しないインベルターゼに対する比
活性が８５％であった。

比較のため上記光硬化性樹脂−酵素混合液をアスコルビ
ン酸を含まない０．５Ｍ塩化カルシウム溶液に滴下し光
照射して得られた粒状固定化酵素の圧縮強度は２０kg／
cm²、インベルターゼ比活性は６５％であった。また、
滴下した塩化カルシウム溶液のにごりは３７５nm吸光度
として０．１を示した。

実施例２ベンゾキノン０．１ｇを含み、数平均分子量１０００の
ポリエチレングリコール１０００ｇとメタクリル酸２モ
ルとからなる光硬化性樹脂１００重量部に蒸留水１００
重量部を加えてから約５０℃に加温してよく混合して均
一な樹脂水溶液とし、これにベンゾインエチルエーテル
２重量部を加えて混合溶解した。

この樹脂混合液に３％アルギン酸ナトリウム水溶液７５
重量部、２％グルコースイソメラーゼ菌体酵素液（重炭
酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８）２５重量部を加えて均一な
混合液を作成した。この均一な混合液を注射針先端から
５％の塩化カルシウムと２％のアスコルビン酸ナトリウ
ムを含む水溶液中に液面より２０cmの位置から滴下した
ところ粒径１．５mmの粒状物が得られた。

この粒状物を平らな底面を有するペトリ皿に単層となる
様にアスコルビン酸ナトリウムを含む塩化カルシウム液
と共に移し、深さ１cmの水溶液中に粒状物が存在するよ
うにして上面より３分及び下面より３分間波長３００〜
４００nmの活性光線を照射したところ圧縮強度４０kg／
cm²の粒状固定化菌体酵素が得られた。滴下した塩化カ
ルシウム−アスコルビン酸液のにごりを３７５nmの吸光
度で測定したところ０．０５であった。

この粒状グルコースイソメラーゼの活性をブドウ糖を基
質としてｐＨ８の重炭酸ナトリウム緩衝液中で６０℃に
て測定したところ固定化しないグルコースイソメラーゼ
に対する比活性が９０％であった。

比較のため上記光硬化性樹脂−菌体酵素混合液をアスコ
ルビン酸ナトリウムを含まない５％塩化カルシウム溶液
に滴下し光照射して得られた粒状固定化菌体酵素の圧縮
強度２５kg／cm²、グルコースイソメラーゼ比活性は８
０％であった。また滴下した塩化カルシウム溶液のにご
りは３７５nm吸光度として０．５を示した。

実施例３ハイドロキノン０．２ｇを含み、重合度が５００のポリ
ビニルアルコール５００ｇに、１．０モルのＮ−メチロ
ールアクリルアミドを付加して得た光硬化性樹脂の２５
％水溶液１００重量部にベンゾインイソブチルエーテル
０．５重量部を均一に混合し、３％Ｋ−カラギーナン水
溶液１００重量部及び酵母サッカロミセス・セルビシア
（ＡＴＣＣ１０２７５）の菌体ペースト１０重量部
（１０％濃度）を均一に混合分散した。しかる後その分
散液を注射器先端から５％の塩化カリウムと２％のアス
コルビン酸ナトリウムを含む水溶液へ滴下したところ球
状にゲル化した。その球状ゲルをアスコルビン酸ナトリ
ウムを含む塩化カリウム液と共にぺトリ皿に移し、上面
及び下面から波長３００〜４００nmの活性光線をそれぞ
れ３分づつ照射したところ直径３mmの球状固定化酵母が
得られた。この球状ゲル内の酵母総菌数を測定したとこ
ろ１×１０^７個／mlであった。

この粒状固定化酵母３ｇに対しグルコース２０％、酵母
エキス０．５％から成るグルコース培地３０mlを加え、
３０℃２４時間静置培養させたところ粒状ゲル中の酵母
総菌数は６×１０^９個／mlに増殖し、生成アルコール濃
度は１０％であった。また培地への漏菌数は２×１０^７
個／mlであった。

これと比較して上記光硬化性樹脂−酵母混合液をアスコ
ルビン酸ナトリウムを含まない５％塩化カリウム溶液に
滴下し光照射して得られた粒状固定化酵母中の酵母総菌
数は１×１０^７個／mlであった。この粒状固定化酵母３
ｇに対しグルコース２０％、酵母エキス０．５％から成
るグルコース培地３０mlを加え、３０℃２４時間静置培
養させたところ粒状ゲル中の酵母総菌数は５×１０^８個
／mlであり、生成アルコール濃度は５％であった。また
培地への漏菌数は９×１０^７個／mlであった。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）１分子中に少なくとも２個のエチレ
ン性不飽和結合を有する親水性光硬化性樹脂（ｂ）光重合開始剤（ｃ）少なくとも１種の多価金属イオンとの接触により
ゲル化する能力のある水溶性高分子多糖類、及び（ｄ）酵素又は微生物菌体を含んでなる液状組成物を、多価金属イオンとアスコル
ビン酸又はアスコルビン酸ナトリウムを含有する水性媒
体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化させ、次いで得
られる粒状ゲルに活性光線を照射して該粒状ゲル中の光
硬化性樹脂を硬化させることを特徴とする酵素又は微生
物菌体の粒状固定化成形物の製造方法。