JPH06500991A - 骨および軟骨誘導蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 骨および軟骨誘導蛋白質 本出願は１９９０年５月１６日出願のアメリカ合衆国特許出願第０７１５２５３ ５７号および１９９１年１月１５日出願のアメリカ合衆国特許出Ｈ第０７／６４ １２０４号の一部継続出願である。

本発明は軟骨および／又は骨形成誘導能を示す精製蛋白質およびこれらを得るた めの方法に関する。これらの蛋白質は骨および／又は軟骨形成を誘導するためお よび傷の治療および組織の修復に用いることが出来る。

本発明は、ＢＭＰ−８蛋白質と称する新規蛋白質を提供する。うしおよびおそら くは他の種のＢＭＰ−８蛋白質は、 Ｖａｌ−工１ｅ−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　（配列表２）（３）、入ユａ　−Ｃｙｓ− ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−τｈｒ−Ｌｙｓ　（配列表３）（配列表４） を含むアミノ酸配列と同−又は実賞的に同一の少なくとも一種のアミノ酸配列を 含むことを特徴とする。

本発明のＢＭＰ−８蛋白質は更に、ドデンル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド ゲル電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）により測定した見かけの分子量が２８０００ 〜３８０００ダルトンであることを特徴とする。５ＤＳ−ＰＡＧＥの還元条件下 で、蛋白質は約１４０００〜２００００ダルトンの範囲である。

ＢＬＩＰ−８蛋白質はまた、少なくとも一種の以下のＤＮＡ配列を含むＢＭＰ− ８蛋白質をコ−ドするＤＮＡ配列を特徴とする ＧＴＧ　ＣＡＣＣＴ’Ｇ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＣＧ　ＣＡＣＧＣＧ　ＧＴＣＣＣ ＣＡＡＧ　ＧＣＧ　ＴＧＣＴＧＣＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＡ（：　ＣＴＧ　ＡＧＣ ＧＣＣＡＣＴ　ＴＣＣにＴＧ　ＣＴＣＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡ ＡＣＧＴＣＡＴＣＣＴＧ　ＣＧＣＡＡＧ　ＣＡＣＣＧＣＡＡＣＡ’ｌ”Ｇ　ＧＴ Ｇ　ＧＴＣＣＧＣＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＣＡＣ（配列表７） ＧＡＣＴＧＧ　ＧＴＣＡＴＣＧＣＣＣＣＣＣＡＡ　ＧＧＣＴＡＣＴＣＡ　ＧＣＣ ＴＡＴ　ＴＡＣＴＧＴ　ＧＡＡ　ＧＧＧＧＡＧ　ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＧ　Ｃ ＴＧ　ＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＴに　７ＪｌＩＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＧＣＣ ＡＴＣＣ１℃ＣＡＧ　ＴＣＣＣＴＧ　（配列表９）（コ） ＧＡＣＧＴＣＣＡＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＧＧＣＣＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＧＴＧＣＣ ＧＴ　ＣＧＧ　ＣＡＣＧＡＧ　ＣＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＧＡＣＣＴＧ　ＧＧＣ ＴＧＧ　ＣＴＧ（配列表１１） 本発明の蛋白質は軟骨および／又は骨の形成を刺激、促進、又はその他の方法で 誘導することが出来る。

前記のアミノ酸配列は本明細書において以下に記載するようにうしの骨調製品か ら得られる。他のｒＢＭＰＪ蛋白質の知見に基づくと、ひとの配列はうしの配列 と同−又は相同であると考えられる。本発明は更にひとＢＭＰ−８蛋白質および ＃　７５０１０で本明細書において開示されるひとＢＭＰ−８蛋白賀をコードす るＤＮＡを包含する。

本発明は更に、本発明のＢＩＩＦ−８蛋白質をコードするＤＮＡ配列を得るため の方法を包含する。本方法は標準的技術を用いてひと遺伝子又はそのフラグメン トに関してライブラリーをスクリーンするためのプローブをデザインするために 前記アミノ酸配列又はその一部を利用する。

本発明の蛋白質はＢＭＰ−８蛋白質をコードするＤＮＡ配列を用いて形質転換さ れた細胞を培養し、培地から （２）、Ｌａｕ−５＠ｒ−Ａｌａ−’Ｉｈｒ−５＠ｒ−Ｖａｌ−Ｌａｕ−Ｔｙｒ −Ｔｙｒ−Ａｓｐ−５＠ｒ−５ｉｒ−人１ｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−工１ｅ−シｔｕ −Ａｒｇ（配列表２）（３）　−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔ ｈｒ−Ｌｙｓ　（配列表３　）を含むアミノ酸配列と同一または実質的に同一の 少なくとも一種のアミノ酸Ｉ列を含むことを特徴とする蛋白質を回収し、精製す ることによりえられる。

発現された蛋白質は培地から単離され、回収され、精製される。精製され、発現 された蛋白質は、同時に生産される他の蛋白質性物質ならびに他の不純物を実質 的に含まない。回収された精製蛋白質は軟骨および／又は骨形成活性を示す。

本発明の蛋白質は更に以下に記載するラット骨形成検定において軟骨および／又 は骨形成活性を示す能力を有することを特徴とする。更に、本発明の蛋白質はこ のラット骨形成検定において形成された骨１ｇあたり０．５＋＋〜５００５ｇの 濃度で活性を示す。更にこれらの蛋白質はこの分析において骨１ｇ当たり１ｔ〜 ５ｈｇの濃度で活性を示す。更に詳細には、これらの蛋白質はラット骨形成検定 においてｌｓｇの蛋白質の能力が少なくとも＋２点であることを特徴とする。

本発明の他の態様は、医薬上許容される賦形剤または担体中に治療上有効な量の 本発明の蛋白質を含有する医薬組成物を提供する。本発明の組成物は骨および／ 又は軟骨形成を誘導するのに用いることが出来る。これらの組成物は、傷の治療 および組繊修復にも用いることが出来る。更に、本発明の組成物は本発明の蛋白 質のほかに少なくとも一種の他の医薬上有用な薬剤、例えｌ１ＰＣＴ公開ＷＯ１ ｔ８１００２０５号ｔ−；、Ｊ：１ＪＷ０１１９／１０４０９号＋：−オイｔＪ Ｊｌ示すｈテいルＢＭＰ−１％ＢＩＩＰ−２（以１ｔｉｊＢＭＰ−２人またはＢ ＭＰ−２・クラ刈とも称する）　ＢＩＩＰ−３、ＢＭＰ−４（以前Ｂ筐Ｐ２Ｂま たは８ｉｒ２・クラス２とも称した）、およびＰＯ公開ｆ０９（１／１１３６６ 号において開示されているＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７等と称する 蛋白質を含んでもよい。

他の医薬上有用な薬剤としては、表皮成長因子（ＥＧＦ）　、線維芽細胞成長因 子（ＦＧＦ）、および形質転換成長因子（ＴＧＦ−ａおよびＴＧＦ−ｂ）などの 成長因子を含む。本発明の組成物は例えば、組成物の支持および／又は骨および ／又は軟骨の成長のための表面を提供するための適切なマトリックスを含んでも よい。このマトリックスはＢＭＰ蛋白質をゆっくり放出するか又はＢＭＰ蛋白質 の呈示に適切な環壇を提供する。

該組成物は、多くの骨および／又は軟骨欠損、および歯周疾患の治療法に採用さ れる。これらはまた種々の傷の治療および組ａｔ修復においても用いられる。本 発明に基づくこれらの方法では、このような骨および／又は軟骨形成、傷の治療 又は組織修復を必要とするも者に治療上有効な量の本発明の蛋白質を投与する。

これらの方法では、本発明の蛋白質（又はその一部）を、前記出願において開示 されているｒＢＭＰＪ蛋白質（又はその−分）の少なくとも一種と組み合わせて 投与する。更に、これらの方法は、ＥＧＦ、　ＦＧＦ、丁ＧＦ−ａおよびＴＧＦ −ｂを含む他の成長因子とともに本発明の蛋白質を投与することも包含する。

本発明の更に他の態様は、本発明のＢＭＰ−８蛋白質の発現をフードするＤＮＡ 配列である。このような配列は、前記ペプチド配列と同−又は実質的に同一の少 なくとも一種のペプチド配列またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド 配列を含む。

本発明の別の態様では、前記のごとくその発現制御配列と操作可能に結合してい る本発明のＢＭＰ−８蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターを提供 する。

ＢＭＰ−８蛋白質の生産において用いるためにこのようなベクターを用いて形質 転換された宿主細胞も本発明により提供される。ＢＭＰ−８をコードするＩＩＮ Ａ配列を含有する宿主細胞は本発明の蛋白質の新規製造法において用いることが 出来る。この形質転換された宿主細胞を適当な培地中で培養し、本発明の蛋白質 を細胞、細胞溶解物、又は調整培地から通富の技術により単離し、精製する。こ の方法では、多くの公知の細胞（原核および真核の両方）をポリペプチドの発現 のための宿主細胞として用いてもよい。

本発明の他の態様および利尭は以下の詳細な記述および好ましい具体例の考察に より明らかである。

図面の簡単な説明 第１図は、ジチオスレイトールを用いた還元後の骨誘導性フラクシヨン（２８０ ００〜３８０００ダルトン、非還元）の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

発明の詳細な記載 本発明の精１１ｊＢＭＰ−８軟骨／骨蛋白質は、Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−工１ ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ　（配列表１）（２）、Ｌｅｕ− ｓａｒ−λ１ａ−Ｔｈｒ−５　ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌａｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ −５ｅｒ−５ａｒ−人ｓｎ−人５ｎ−Ｖａｌ−エユａ−Ｌａｕ−Ａｘｑ　（配列 表２）（３）、　Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　 （配列Ｉ表３〕（配列表４） を含むアミノ酸配列Ｉと同−又は実質的に同一の少なくとも一種のアミノ酸配列 を含むことを特徴とする。

精製ＢＩＩＰ−８蛋白質は、同時に生産される蛋白質性物質ならびに他の不純物 を実質的に含まない。これらの蛋白質は更に軟骨および／又は骨形成誘導能を特 徴とする。この活性は実施例３において記載するラット骨形成検定における活性 で示される。更に、これらの蛋白質は、検定において形成される骨１グラムあた り０゜５ｊ〜５００μｇの濃度で活性を示す。これらの蛋白質は更にこの分析に おいて骨１グラムあたりｌｊｇ〜５０＋＋ｇの濃度で活性を示す。この蛋白質は 更にもとの又は修飾された得点法のいずれかを用いてこの検定においてｌａｇの 能力が最低＋２であることを特徴とする。

本発明の蛋白質は更に、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳 動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）により測定すると見かけの分子量が２１！０００〜３８ ０００ダルトンであることを特徴とする。５Ｏ９−ＰＡＧＥにおける還元条件下 で、蛋白質は約１４０００〜２００００ダルトンの転回である。

更に別の態様では、本発明は、本発明のＢＭＰ−８骨／軟骨蛋白質をコードする ＤＮＡ配列を得る方法を提供する。ＤＮＡ配列を得る方法は前記アミノ酸配列を 利用して標準的方法を用いてライブラリーをスクリーンするためのプローブをデ ザインする。このようにして同定されたうし配列又はひと遺伝子はひとセルライ ン又は顕像の軟ｔ／骨蛋白質を合成する組織を同定するためのプローブとしても 用いられる。ｃＤＮＡライブラリーを合成し、ひとまたはうしコード化配列由来 のプローブでスクリーンする。このようにして同定されたひと配列を宿主細胞中 に形質転換し、該宿生細胞を培養し、蛋白質を培地から回収し、単離し、精製す る。精製蛋白質は実施例３のラット骨形成検定において軟骨および／又は骨形成 活性を示すことが予想される。

本発明で提供される蛋白質は、前記配列によりコードされる因子も含むが、その 配列に対する修飾は自然におこなわれるか（ｇ４えば、ポリペプチドにおけるア ミノ酸変更を誘導しうるヌクレオチド配列における対立遺伝子的改Ｉり又は慎重 な工学的処理により行われる。同様に、ＢＩＩＦ’−８蛋白質の蛋白質のアミノ 酸残基の連続配列を全体的又は部分的に複製する合成ポリペプチドも本発明に包 含される。

これらの配列は、本発明の他の軟骨／骨量白質と共有の一次、二次又は三次構造 および立体配座特性により、共通して骨および／または軟骨成長因子生物的特性 を有し得る。従って、これらは治療方法において天然に存在する蛋白質の生物学 的活性代用物として用いることも出来る。

本明細書において記載された本発明の蛋白質の配列の他の特異的突然変異体はグ リコジル化部位が修飾されていてもよい。これらの修飾は〇−結合又はＮ−結合 グリコノル化部位を含む。例えば、グリコノル化の不存在又は一部のみのグリコ ノル化は、本発明の蛋白質の配列に存在するアスパラギン結合グリコノル化認識 部位におけるアミノ酸置換又は欠失に起因する。アスパラギン結合グリコノル化 認識部位は、適当な細胞のグリコフル化酵素により特異的に認識されるトリペプ チド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−）レオニン 又はアスパラギン−Ｘ−セリン（但し、Ｘは通常任意のアミノ酸である）のいず れがでである。グリコノル化認識部位の第−又は第三アミノ部位の一方又は両方 における様々なアミノ酸置換又は欠失（および／又は第三位におけるアミノ酸欠 失）は、修飾トリペプチド配列における非グリコジル化をもたらす。このように 変更されたヌクレオチド配列の発現はその部位でグリコジル化されていない変種 をもたらす。

また本発明は、他の蛋白質性材料をコードするＤＩＩＡ配列との組み合わせを含 まず、本発明の蛋白質の発現をコードする新規ＤＮＡ配列を包含する。更に、ス トリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下で前記方法にしたがって単離さ れるＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションし、ラット骨形成検定における軟骨お よび／又は骨形成活性を示す配列を含む［ティー・マニアナスら、「モレキュラ ー・クローニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）、コールド・スプリング・ ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２）　、３８７〜３８９頁参照〕。このような ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件の一例としては、６５℃にて４ 　ｘｓｓｃでハイブリダイゼーションし、続いて、６５℃にて１時間０．　ｌＸ ５ＣＣ中で洗浄する。あるいは、ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条 件の一例としては、５０％ホルムアミド、ＡｘＳＳＣ中４２℃で行う。

同様に、前記のようにして単離されたＢＩＩＦ−８蛋白質をコードするが遺伝子 コードの退縮またはアレリック変異（アミノ酸変更を誘導する場合もしない場合 もありうる種の集団に起こる天然壇基の変形）故にコドン配列が異なるＤＩｆＡ 配列もまた、本明細書に記載された本発明の蛋白質をコードする。点突然変異又 は誘導修ｍ（挿入、欠失および置換を誘導）により起こるそれによりコードされ るポリペプチドの活性、半減期又は生産の向上が誘発されるＤＮＡ配列における 変形も本発明に包含される。

本発明の別の態様は、本発明の蛋白質の新規製造法を提供する。この方法は、既 知調節配列の制御下、本発明の蛋白質の発現をコードするＤＮＡ配列により形質 転換した適当なセルラインの培養を含む。ＴＪＪＢ配列は、プロモーターフラグ メント、ターミネータ−フラグメントおよび適当な宿主細胞におけるＢＭＰ−８ 蛋白賃の発現を行う他の適当な配列を含む。本発明の精製Ｂｌ！Ｐ−８蛋白質を 培地から回収し、単離し、精製する。精製蛋白質は、 （３）　、　Ａｌａ　−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−人１ａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　（ 配列表３）を特徴とする。

適当な細胞又はセルラインはは乳類細胞、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣 細胞（ＣＩＩＯ）であり得る。適当なは乳類宿主細胞の選択ならびに形質転換、 培養、増幅、スクリーニング、および製品の製造および精製の方法は当業界では 周知である。例えば、ゲ／ングおよびサンプルツク、ＦネイチャーＪ　、２９３ ．６２０〜６２５（１９８１）　ｔたは別法としてカウフマンら、「モレキュラ ー・アンド・セルラー・バイオロジーＪ　、”２　（７）　１７５０〜１７５９ 　（１９８５）又はハウレイら、アメリカ合衆国特許第４４１９４４６号参照。

後記実施例記載の別の適当なは乳類セルラインは、さるＣＯ５−１セルラインで ある。は乳類細胞ＣＩ’−１も適当である。更に、典型的なは乳類宿主ｍ＠とじ ては、特に霊長類セルラインおよび署歯類セルライン（形質転換セルラインを含 む）が挙げられる。通常の倍数細胞、−次組縁のインビトロ培養由来の細胞種、 ならびに−次移植片も適当である。候補となる細胞は、選択遺伝子が遺伝子型的 に欠失しているか又は圧倒的な活動選択遺伝子を含有する。他の適当なＩ；乳類 セルラインは、ヒーラ、マウスＬ−９２９細胞、スイスＢａ１ｂ−ｃまたはＮＩ Ｂマウス由来の３Ｔ３ライン、ＢＵＮまたはＨａＫハムスターセルラインである がこれに限定さｎない。

細菌細胞もまた適当な宿主である。例えば、エノニリヒア・コリのような様々な 株（例、ＨＢｌｏｌ、１ｌｃ１０６１）はバイオテクノロジー分野において宿主 細胞としてよく知られている。バシルス・サブチリス、プソイドそナス、他のか ん菌などの様々な株もまたこの方法において使用され得る。

当業界の熟練者には周知の多くの酵母細胞株もまた、この発明のポリペプチドの 発現用の宿生細胞として利用され得る。更に、所望により、昆虫細胞もこの発明 の方法における宿主細胞として利用され得る。例えば、ミラーら、「ジエネティ ック・エンジニアリング」、旦、２２７〜２９８（ブレナム・プレｘ１９８６） およびその引用文献参照。

本発明の別の態様は、本発明の蛋白質の発現方法で使用されるベクターを提供す る。好ましくは、これらのベクターは、本発明の新規軟骨／骨量白質をコードす る前述の完全な新規ＢＭＰ−３ＤＮＡ配列を含む。更にまた、これらのベクター は、蛋白質配列を発現させる適当な発現制御配列を含む。他方、上記切断又は修 飾配列が組み込まれたベクターはまた、この発明の具体例であり、本発明の蛋白 質の製造に有用である。これらのベクターはセルラインの形質転換方法で使用さ れ得、選択された宿生細胞におけるその復製および発現を指向し得る本発明のＤ ＮＡコード配列と機能的に組み合わせて選択された調節配列を含み得る。これら のベクターに有用な調節配列は当業界の熟練者には周知であり、選択された宿主 細胞に応じて選択され得る。この選択は常套的であり、本発明の一部を形成する ものではない。ベクターの成分、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサ− 、プロモーターなどは、天然源から得られるかまたは既知の方法により合成され る。カウフマンら、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ　、１ ５９　：　５１１〜５２１（１９Ｂ２）、およびカウフマン、「プロノーディン グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエノノーズ・オブ・ザ・ ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカＪ、８２：６８９〜６９３　（１９８ ５）参照。このようなベクターにより形質転換された宿主細胞および軟骨／骨量 白質の生産に用いるその子孫もまた本発明により提供される。

骨および／又は軟骨が正常には形成されない様な環境において軟骨および／又は 骨形成を誘導する本発明の蛋白質は、ひとおよび他の動物における骨折および軟 骨欠損の治癒に適用性を有する。本発明の蛋白質の一種を用いるｇ！荊は閉鎖お よび複雑骨折の縮小ならびに人口関節の固定改善における予防的用途を育し得る 前原性薬剤により新たに誘導される骨形成は、先天的、外傷性又は腫瘍切除によ る頭原欠損の修復に貢献し、美容形成外科においても有用である。本発明の蛋白 質は、歯周病の処置および他の田修復プロセスにおいて用いることが出来る。こ れらの薬剤は、骨形成細胞を誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、又は骨形成細 胞の原始細胞の分化を誘導する。数種の骨形成性、軟ｆ誘導性および骨誘導性因 子が既に報告されている。ヨーロッパ特許８１１Ｍ１４１１１５５号および第１ ６９０１６号参！ＩＪ、ｃ本発明の蛋白質は、傷の冶原および関連する組織の修 復に用いることが出来る。

傷の種りとしては、火傷、切り傷および潰瘍が挙げられるが、これに限定される わけではない（例えば、傷の治療および関連する組織修復の考察に関してはに丁 特許公開ｌｌ０ｇ４１０１１０６号参照）。

本発明の更に別の態様は骨折および骨および／又は軟骨欠損に関連した他の症状 又は歯周病の治療のための治療法および組成物を包含する。更に、本発明は、傷 の治療および組織修復のための治療法および組成物を含む。このような組成物は 、医薬上許容される賦形剤、担体またはマトリックスとの混合物中、治療上有効 量の少なくとも一種の本発明の蛋白質を含む。本発明の蛋白質は、他のｌＮ以上 の関連する蛋白質および成長因子と共同して、あるいはおそらくは相乗的に作用 すると考えられる。本発明の治療法および組成物はしたがって、１種以上の本発 明の蛋白質を含む。更に、本発明の治療法および組成物はしたがって、治療的量 の少なくとも工程の本発明の蛋白質を、前記同時係属中のアメリカ合衆国特許出 願に開示されている治療的量の少なくとも１種の他のｒＢＭＰＪ蛋白質とともに 含む。このような本発明の方法および組成物は、本発明の蛋白質又はその一部を 前述のｒＢＭＰＪ蛋白質又蛋白質一部と共に含む。このような組み合わせは各蛋 白之　質又は各蛋白質の一部により形成されるヘテロ分子由来の個々の分子を含 んでもｆ　よい。本発明の方法および組成物はしたがって、本発明の蛋白質又は 前記の異なる「ＢＭＰＪ蛋白賀の一部と結合した部分を含み、ヘテロ分子を形成 する。例えば、Ｓ　、　ＢＩＩＦ−８サブユニツトはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、 ＢＭＰ〜４、ＢＭＰ〜５、ＢＭＰ〜６、ＢＭＰ−７又は他のＢＭＰ蛋白質のサブ ユニットと結合していてもよい。このような結合は、ジスル３　フィト結合を含 む。

更に、本発明の治療法および組成物は、本発明め蛋白質又はその一部を骨おより 　び／又は軟骨欠損、傷又は問題となる組織の治療に有用な他の薬剤と組み合わ せシ　て含む。これらの薬剤は、様々な成長因子、例えば、表皮成長因子（ＥＧ Ｆ　）　、線（・　維芽細胞成長因子（ＦＧＦ人血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−ａおよびＴＧＦ−ｂ）、およびインシュリン様 成長因子ＣＩＧＦ）などの成長因子を含む。これらの薬剤の一部もまた本発明の 組成物に用いてもよい。

ｐＨ１等張性、安定性などに関して必要な注意を払ったこのような生理学的に許 容しつる蛋白組成物の製造および製剤は当業界で知られている。また、この治療 組成物は軟骨および骨成長因子蛋白質における明らかな種特異性がないことのた めに現在獣医学的用途に関して有用である。ひとのほか、家畜およびサラブレッ ドの馬は本発明の蛋白質を用いたこのような治療の望ましい患者である。

この治り方法は、インブラント又は装！として、組成物を局所的、全身的または 局部的に投与することを含む。投与される場合、もちろんこの発明で使用される 治療組成物は、発熱物質を含まない、生理学的に許容しつる形態を呈する。更、 にこの組成物は、望ましくは軟骨および／または骨または組織損傷部位への送達 に適した粘稠性形態で封入又は注射され得る。局所投与は傷の治癒および組織修 復に有用であり得る。好ましくは、骨および／又は軟骨形成のために、この組成 物は、本発明の軟骨および／又は骨量白質を骨および／又は軟骨損傷部位に送達 し、成長する骨および軟骨構造を提供し、最適状態で体内に再吸収され得るマト リックスを含む。このようなマトリックスは、他の移植医学適応例で現在使用さ れている材料により形成され得る。

マトリックス材料の選択は、生理学的適合性、生物分解性、機械特性、美容的外 観および界面特性にもとづいて行われる。特定の本発明の組成物の適用性は適当 な製剤を限定する。組成物に適用され得るマトリックスは、生物分解性で化学的 に定義されるもの、例えば、硫酸カルシウム、燐酸トリヵルンウム、ヒドロキシ アパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物である。他の有効なマトリックスは、生 物分解性で生物学的に明確に定義されるもの、例えば骨もしくは皮膚コラーゲン である。他のマトリックスは純粋な蛋白質又は細胞外マトリックス成分を含む。

他の有効なマトリックスは、非生物分解性で化学的に定義されるもの、例えば、 焼結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩、又は他のセラミックで ある。マトリックスは、前述のタイプの材料の組み合わせ、例えばポリ乳酸およ びヒドロキシアパタイト又はコラーゲンおよび燐酸トリカルシウムであり得る。

生体セラミックもまた組成物、たとえばカルシウムーアルミン酸塩−燐酸塩にお いて改変され得、例えば、孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状および生物分解性の 改変が行われ得る。

投与量については、本発明の蛋白質の作用を修飾する様々な要因を考慮して担当 医が決定する。本発明の蛋白質の作用を修飾する要因としては、形成されるべき 骨の重量、骨の損傷部位、損傷した骨の状態、傷の大きさ、損傷組織の種類、患 者の年令、性別および治療食、感染の重症度、投与時間および他の臨床要因が挙 げられる。用量は、再構成および組成物中に存在する骨および／軟骨蛋白質のタ イプにより変動し得る。最終組成物への他の既知成長因子、例えばＥＧＰ、　Ｐ ＤＧＦ。

τＧＦ−ａＳＴＧＦ−ｂおよびＩＧＦ−Ｉの添加もまた用量に影響を与え得る。

経過は軟骨および／又は骨成長および／又は修復の定期的評僅によりモニターす ることが出来る。経過は、例えばＸ線、組機形態計測およびテトラサイクリンラ ベリングを用いてモニターすることが出来る。

以下、実施例により、本発明のうし軟骨および／又は骨量白質の回収および特性 検定、これらの蛋白質の使用による対応するひと蛋白質の回収および組み換え技 術による蛋白質の発現における本発明の実施態様を説明する。

実施例１ うし軟骨／を誘導蛋白質の単離 ウリストら、「ブロンーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー７・オブ・アメリカ」、７ ０　：　３５１１　（１９７３）の方法に従い、破砕したうしの青粉（２０〜１ ２０メツシユ、コーラ・チック）を製造する（但し、下記のとおりいくつかの抽 出工程を除く）。１０ｋｇの粉末を、４℃で４８時間激しい撹拌下、０．６Ｎの ［ＩＣ１を連続交換しながら脱塩する。

得られた懸濁液を２６リツトルの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ中に４時間かけて抽出する 。残さを蒸留水で２回洗浄した後、「クリニカル・オーソベディックス・アンド ・リレーテッド・レサーチＪ　、１７１・２１３　（１９８２）の記載に従い、 １０リツトルの４Ｍグアニジン塩酸塩［ＧｕＣ１コ、１１ＭＮ−エチルマレイミ ド、ＩＩＩＩＩヨード酢酸、１ａｌｌ　フェニルメチルスルホニルフルオリド中 に再懸濁する。１６〜２０時間後、上清を除去し、別の６リツトルのＧｕＣ１緩 衝液と置き換える。６リツトルのＧｕＣ１緩衝液での最終抽出を１６時間行う。

粗ＧｕＣ１抽出物を合し、０．４５ｍＭデニツラボアタンジエンンヤルフローフ ィルターパケットでペリコン装置を通してろ過し、１００００分子量遮断膜を備 えたアミコンビＡ２０００装置上で約５０倍に濃縮し、次いで、２０＋ａｌｌ　 トリス、０．０５Ｍ　ＮａＣ１，６Ｍ尿素（ＤＢ７１）、第一カラム用出発緩衝 液中で透析する。十分透析後、蛋白質を２リツトルＤＥＡＥセルロースカラムに 仕込み、非結合フラクションを集める。

非結合フラクションを濃縮し、６Ｍ尿素中５０＋＋Ｍ　ＮａＡｃ、　５０ｍＭ　 ＮａＣ１（ｐＨ４，６）Ｉニ一対して透析する。非結合フラクションをカルボキ シメチルセルロースカラムに適用する。カラムに結合していない蛋白質を出発緩 衝液で十分洗浄することにより除去し、ローゼン修飾サンバス・レディ検定（以 下の実施例３に記載）で測定される骨および／又は軟骨形成活性を有する蛋白質 を含有する材料を５ＱｗＭ　ＮａＡｃ、０２５ａＭ　ＮａＣ１，６Ｍ尿素（ｐＨ ４，６）によりカラムから脱着させる。この段階溶離がら得られた蛋白質を２０ −４０倍にＳ縮し、次いで８０ｍ１ｌ　ＫＰＯ４，６Ｍ尿素（ｐｉｔ　６．０） に対して十分透析する。８０ｄ　ｌ０Ｐｏ、、６ｘ尿素（ｐＨ６，０）中で平衡 状態にしたヒドロキシアパタイトカラム（ＩＢＦ）に試料を適用し、同緩衝液で カラムを洗浄することにより、未結合蛋白質をすべて除去する。骨および／又は 軟骨形成活性を有する蛋白質を１０軸Ｍ　ＫＰＯｌ（ｐＨ７，４）および６Ｍ尿 素により１ｇＭさせる。

この蛋白質をＱ、　１８７５Ｍ　ＮａＣ１，５Ｍ尿素溶液で５倍に希釈し、最終 濃度を２０＋１Ｍ　ＫＰＯ，，１５軸Ｍ　ＮａＣ１、６Ｍ尿素とする。この材料 を、２軸Ｍ［１’Ｏ，，１５０１Ｍ　ＮａＣ１，６Ｍ尿素中で平衡状繋にしたヘ パリン−セファ０−ス力ラムｌ二適用する。出発緩衝液でカラムを十分洗浄後、 骨および／軟骨誘導活性を有する蛋白質を２ｈＭ　ＫＰＯ４，７００ｍＭＮａＣ １，６Ｍ尿素（ｐＨ７，４）により溶離させる。このフラクションを１０〜２０ 倍に濃縮し、５０ｍＭ　ＮａＡｃ、６Ｍ尿素（ｐＨ４，６’）に対して透析し、 ファルマンア・モノＳ　曲カラムに適用する。カラムを１．ＯＭ　ＮａＣ１，５ （ｍｌｌ　ＮａＡｃ、　６Ｍ尿素（ｐＨ４，６）への勾配により展開する。吸光 度２８０ＩＩＩＭのフラクションをすべてプールする。このモノＳステップは現 在かならずしも必要でないと考えられており、将来省略できるであろう。この材 料を０１％■＾中４．７ｘ３０ｃ＋ａウォーターズ・プレバック５００Ｃ４カー トリツンに適用し、カラムを９５％アセトニトリル、０．１％ＴＦ＾への勾配に より１分あたり４５ｍ１で１００分間展開する。フラクションを軟骨および／又 は骨形成活性に関して検定する。

マノコナヘイら、「イノターナショナル・アーカイブス・オブ・アラ−ジー」、 ２９　：　１８５〜１８９　（］９６５）　、ポルトンら、「バイオケミカル・ ジャーナルＪ、１３３：５２９　（＋９７３）およびポーウエンーポーブ、［ジ ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリーＪ　、２３７　：　５１６１　 （１９８２）の中の一法により、適当なフラクションのアリコートをヨウ素化す る。これらのフラクション中に存在するヨウ素化蛋白質をＳＤＳゲル電気泳動に より分析する。

実施例２ うし軟ｔ／骨誘導因子の特性検定 へ分子量 実施例１により得られたＯｊ％ＴＦＡおよび約４５％アセトニトリル中フラクシ ョンを含有する活性ＢＭＰ由来の約２．５ｍｇの蛋白質をサバント・スピード・ ヴアック濃縮器で乾燥し、レムリ試料緩衝液で可溶化し、１２．５％ポリアクリ ルアミドゲルに適用し、５ＯＳ−ＰＡＧＥ［レムリ、ネイチャー、亜、６８０〜 ６８５（１９７０）］に付す（試料をジチオスレイトールで還元しない）。分子 量をヨウ素化バイオ−ラド分子量標準と比べて測定する。固定されていないゲル のオートラジオグラフィーの後、約２８０００〜３８０００ダルトンのバンドを 切除し、蛋白質を電気泳動でゲルから溶離する［バンカピラーら、メソッズ・イ ン・エンザイモロジー、財・２２７〜２３６　（１９８３）　］。

前記同時係属中のｒＢＭＰＪ出願中に記載されている同様の精製骨フラクション においては骨および／又は軟骨活性は約２８０００〜３８０００領域において見 られるが、これにもとづいて、このバンドは骨および／又は軟骨誘導フラクショ ンを含むと推定される。

Ｂ、サブユニット特性検定 単離されたうし骨量白質のサブユニット組成物も測定する。前記の溶離蛋白質を 完全に還元し、ヨードアセテートおよび標準的方法を用いて２％ＳＤＳ中でアル キル化する。完全に還元し、アルキル化された試料を次いで更に１２．５にゲル 上５０５−ＰＡＧＥに適用し、得られたダブレット／トリブレットを呈する約１ ４０００〜２００００ダルトンの領域は未固定ゲルのオートラジオグラフィーに より検出される。試料の銀染色法［メリルら、サイエンス、２１１　：　１４３ ７　（１９８１）　］を分子量標識と共に第１図に示す。１４０００〜２０００ ０ダルトン領域は括弧で示す。したがって、約２８０００〜３００００ダルトン 蛋白質は１４０００〜２００００の広い領域をもたらす。

実施例３ ０−ゼン修飾サンバス−レディ検定 サンパスおよびレディ、［ブロンーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンンーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーク・オブ・アメ リカＪ　、８０　：　６５９１〜６５９５　（１９８３）に記載されたラット骨 形成検定の変法を用いて、本発明の蛋白質の骨および／又は軟骨活性を評価する 。この修飾検定を、本明細書においては、ローイン修飾サンバスーレディ検定と 称する。サンパス−レディ法のエタノール沈殿工程の代わりに検定フラクノヨノ の水に対する透析（組成物が溶液の場合）またはダイアフィルタリング（溶液が 懸濁液の場合）を行う。溶液又は懸濁液を０１％ＴＦへ中に再溶解し、得られた 溶液を２Ｑｚｇのラット・マトリックスに加える。蛋白質で処理していない七ツ ク・ラット・マトリックス試料を対照とする。この材料を冷凍し、凍結乾燥し、 生成した粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入する。カプセルを２１〜４９日令の 雄ロング・エバ７ス・ラットの腹部胸領域に皮下内植する。７〜１４日後イ後先 ラントを除去する。各インブラントの半分を用いてアルカリ性ホスファターゼ分 析をする。［レディら、ブロノーデインブズ・オブ・す・ナノヨアル・アカデミ −・オブ・サイエンンーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーク・オブ・アメリ カＪ　、６９　：　１６０１　（１９７２）　ｅｑコ。

各インブラントの残り半分を固定し、組織分析を行う。グリコメタクリレート部 分（１；ＩＱ＋）をボン・コッサおよび酸性フー／ン（ｆｕｓｃｈｉｎ）又はト ルイジンブルーで染色することにより、各インブラント中存在する誘導された骨 および軟骨形成の量を採点する。＋１〜↓５は新しい骨および／又は軟骨細胞お よび新たに形成された骨およびマトリックスに占められたインブラントの各組織 片の領域を示す。＋５点は、インブラントの５０％以上がインブラント中の蛋白 質の直接の結果として生成する新しい骨および／又は軟骨であることを示す。＋ ４Ａ、＋３点、＋２点および一１屯はそれぞれインブラントの４０％、３０％、 ２０％、１０％以上が新しい軟骨および／又は骨を含有することを示す。

マトリックス試料の試料を含有する軟骨および／又は骨誘導性蛋白質の用量応答 性は、形成された骨および／又は軟骨の量が試料中の軟骨／骨誘導蛋白質の量と 共に増加することを示す。対印試料はいかなる骨および／又は軟骨形成も示さな い。

他の軟骨および／′又は骨誘導蛋白ｉ、例えば前記ｒＢＭＰＪ蛋白質に関しては 、形成された骨および／′又；＝軟骨はマトリックスによりふさがれた空間に物 理的ｉ開閉じ込められる。試灯をＳＤＳケル電気泳動および等重重、電気泳動で 分析し、次し１でオートラジオグラフィーを行う。活性は蛋白質バンドおよびｐ ｌと相関関係を示す。１０Ｄ／　ｃｇ−Ｃｍの消衰係数を蛋白質に関する推定値 として使用し、特定フラクション中の蛋白質の純度を評価し、蛋白質をＳＤＳ　 ＰＡＧＥにかけ、続いて銀染色法またはラジオヨード不一ンヨンおよびオートラ ジオグラフィーにかける。

実施例４ うし蛋白質組成物 実施例２Ｂに記載された約１４０００〜２００００ダルトン領域のゲルスライス を切除し、蛋白質を電気泳動でゲルから溶離する（バンカピラーら、前掲）。こ の単離された蛋白質試料を次いで５容積の９０％ローブロバノールで希釈後３０ Ｘ２．　ＩＭＭブラウンリ−ＲＰ−１８に結合させることによりＳＤＳから除く Ｕシンプソンら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、Ｉ６ 計２１〜２９　（１９，！１７）　）。４０％ｎ−プロパツール、０１％ＴＦ＾ の段階を用いて溶離することにより蛋白質を回収する。溶離された蛋白質ビーク を含有するフラクションをプールし、サバント・バック濃縮器中で乾固寸前にす る。蛋白質を次いで０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムで再溶解し、ｌｊｇＴＰｃＫ 処理トリプシン（ワーノントン）で１６時間３７℃にて消化する。別のｌｘｇ用 量のトリプシンを添加し、消化を更に４時間続ける。得られた消化物を次にＣ４ Ｖｙｄａｃ　ＲＰＨＰＬＣカラムおよび０，１％ＴＦＡ−水、０，１％ＴＦ＾水 −アセトニトリル勾配を用いてＲＰＨＰＬＣに付す。得られたペプチドピークを ２１４および２８０ｎｉでのＵｖ吸光度によりモニターし、アプライド・バイオ システム気相配列分析装置（４７０Ａ型）を用いて直接アミノ末端アミノ酸配列 分析に付す。アミノ酸の標準的な３文字で表示した（括弧内のアミノ酸は配列中 で不明確であることを示す）以下のアミノ酸配列を有する３種のトリブノン消化 性フラグメントを標準的方法により単離する。

（３）、λ１ａ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　（配列表 ３）（配列表４） ４種のアミノ酸配列はＰＣＴ公開出願ＷＯ３８１００２０５号および＊Ｏｇ９／ １０４０９号において開示すｈ　’７：　イルＢＭＰ−２、ＢＩＩＰ−３オ、ｋ 　ヒＢＭＰ−４、オ、Ｊ：ヒｔｔｓｓ１４３７４０９号、ＪＩＥ４９００３３号 、および箪４３ｇ９１９号（それぞれ、１９８９年１１月１５日、１９８９年１ １月１５日、１９８９年１１月１７日出願）中に開示されているＢＭＰ−５、Ｂ ＭＰ−６およびＢＭＰ−７等の他のＢＭＰ蛋白質と相同性を示す。特に、前記ア ミノ酸配列（１）、Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−５ａｒ −Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｌａｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌ４！ｕ−λ５ｐ−Ｔｒ ｐ−Ｖａ１−工１ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−’ｒｙｒは以下の人相 同性配列を含有するＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＬＩＰ−４、ＢＭＰ〜５、ＢＩ ＩＰ−６およびＢＭＰ−７と相同性を示す。

５ａｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−工１＠−工１ｅ−５ａｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−５ａｒ− ＰｈａＢＭＰ−４：　Ａｒｇ−Ｈｌｓ−５ｅｒ−ＩＡｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓ ｐ−Ｐｈａ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ＜１ｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ −工１ｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＴｙｒＢＭＰ−５：　Ｌ ｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｎ−５ａｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａ ｓｐ−Ｌａｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ　−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−工１ｃ−工１ｅ− Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−？ｙｒＢＫＰ−６：　Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌ ｕ−Ｌａｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−５ａｒ−Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−工１ｅ−工１ｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙ ｓ−Ｇｌｕ−７’ｙｒＢＭＰ−１：　Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ｔｙｒ −Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌａｕ−に１ｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ −Ａｓｐ−Ｔｒｐ−工１ｅ−工１ｃ−人ユａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ 第二のアミノ酸配列 （２＞、　Ｌｅｕ−（Ｓｅｒ）−λ１ａ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔ ｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−５ａｒ−５ａｒ−人５ｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−工１ｅ−Ｉ 、ｅｕ−ＡｒｇはこれらのＢＭＰ分子の以下のひと配列と相同性を示す。

ＥＭＰ−２：　Ｌａｕ−ｓｅｒ−λ１ａ−工１ｅ−５＠ｒ−Ｍｅ：　−Ｌｅｕ− Ｔｙｒ−Ｌａｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−λ５ｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ− Ｌｅｕ−Ｌｙｓｔ、、Ｐ−６：　Ｌｅｕ−λＳ：’ｌ−λｌａ−：二ｅ−５ｅｘ −Ｔａ：−シｅと一：）・ｒ−Ｐｈｅ−人５ｐ−Ａｓｐ−Ａｓ＊−５ｅｒ−Ａｓ ｎ−Ｖａｌ−エユｅ−Ｌａｕ−ＬｙｓＢＭＰ−７：　Ｌａｕ−ＡＳｎ−人ユａ− 工１ｅ−５ａｒ−ＶａニーＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−５ｅｒ− ５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ第三のアミノ酸配列 （コ）、入ユａ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−人ユａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓはこれらの ８〜１２分子 ＢＭＰ−２：　入１ａ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔ？−ｒ−ＧｌｕＢ ＭＰ−３：　Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＬｙｓＢＭＰ −４：　Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−τｈｒ−ＧｌｕＢＭＰ−５ 　：　Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＬｙｓＢＭＰ−６： 　Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐ＝。−Ｔｈｒ−ＬｙｓＢｌ’Ｊ’−７： 　Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｒ＋と相同性を示す 。

第四のアミノ酸配列は、ＰＣ丁公開出願！０８ｇ１００２０５号およびＷＯ３９ ／１０４０９号において開示されている聞Ｐ−３と相同性（即ち、Ａｓｎ−Ｇｌ ｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−）を示す。

本発明のＢＭＰ−８蛋白質はこれらのＢＭＰ蛋白質ＢＭＰ−２〜ＢＭＰ−７と構 造的に類似している。成１１ＬＢＭＰ−８蛋白質はポリペプチドサブユニットと 結合したジスルフィドのダイマーを含む。

実施例５ ＤＮＡのＭＡＭ ＢＩＩＦ−８蛋白質をコードするＤＮＡ配列は当業界において周知の８１ケな技 術を用いてＩ！ｉ離することができる。以下に記載するように、オリゴヌクレオ チドプローブを前項で同定したトリプンンフラグメントのアミノ酸配列にもとづ いて設計し、自動ＤＮＡノンセサイザーで合成する。プローブは、レイズ、「ジ ャーナル・オブ・モレキュラ町バイオロジーＪ、１８３（１）：ｌ〜１２　（１ ９８５）の方法にしたがってトリブノン配列から設計されたオリゴヌクレオチド のプール又は特有のオリゴヌクレオチドからなる。

３種の前記アミノ酸配列のＢＭＰ−２からＢＭＰ−７との同義性にもとづいて、 本発明のＢＭＰ−８蛋白質はアミノ酸配列（３）およびアミノ酸配列（２〕が以 下のように互いににすぐ隣に位置する構造を有し得る。

以下の４種のオリゴヌクレオチドは前項で同定されたトリブ／ンフラグメント［ ＢＭＰ−８アミノ酸配列（２）　Ｌｅｕ−（Ｓｅｒ）−＾１ａ−Ｔｈｒ−５ｅｒ Ｊａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−＾５ｐ−５ｅｔ−５ｅｒ−へｓｎ−＾ｓｎＪ ａｌ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ］にもとづいて設計され、自動ＤＮＡ　ノンセサ イザーで合成される。

＃ｌ：　ＱＣ窓＝ン込Ｍ下ＡＣＲＴＴＲＴＴＮにＡ）ＪＧ＃２：　Ω式−二ムｑ 込”λｃＲ″ｒＴＲｇに７山Ｃ＃３：　９に１＝Ａλ込ＴＮＡｃＲＴＴＲ雇ＣＴ ？ＪＧ１七ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＮＡα貫ｒｌ”ＲＣ’！’ＲＣオリゴヌクレ オチド＃１〜＃４のはじめの９種のヌクレオチド（下線部）は特異的に増幅され た、ＢＭＰ−８蛋白質をコードし、前記アミノ酸配列（２）由来でないＤＮＡ配 列の操作を促進するために、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩの認識配列を含有 する。

以下のオリゴヌクレオチドは他のすでに同定したトリプシンフラグメント［ＢＰ Ｍ−８アミノ酸配列（３）　Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ −Ｌｙｓコのアミノ酸配列にもとづいて設計され、自動ＤＮＡンンセサイザーで 合成される。

＃５：　ΩΩＧｑΔ工ｇΩＧＯｆＴＧＹＴＧＹＧＣＮＣＣＮＡＣオリゴヌクレオ チド＃５のはじめの８種のヌクレオチド（下線部）は制限エンドヌクレアーゼＢ ａｒａ［ｌＩの認識配列を含有し、前記の理由のために、アミノ酸配列（３）由 来でない。

すでに同定した標準的ヌクレオチドのノンポルは以下のとおりである　＾、アデ ノンン、Ｃントンン、Ｇ　グアニン、Ｔ　チミン、Ｎ　アデノノン又は／トノン 又はグアニン又はチミン、Ｒアデノノンまたはグアニン、Ｙ：／トンン又はチミ ン、およびＨアデノノンまたはントノンまたはチミン。

すでに同定したオリゴヌクレオチド＃４および＃５は、プライマーとして用いら れ、うしゲノムＤＮＡ由来の特定のヌクレオチド配列を増幅させる。増幅反応は り下のようにして行う。

うしゲノムＤＮ＾（源　うしの肝臓）を１００℃にて５分間変性させ、次いで氷 上で冷却し、それぞれ２００■のトリ燐酸デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、　 ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰおよびｄＴ丁Ｐ）、１０１１Ｎトリス−１１ＣＩ　ｐＨ８ ，３，５０ｄ　ＫＣＩ、１．５ＩＩＭ　ＭｇＣ１□、０．００１％ゼラチン、１ ２５単位Ｔａｑ　ＤＮ＾ポリメラーゼ、１１００ｐオリゴヌクレオチド＃４およ び１００９ｐオリゴヌクレオチド＃５を含有する反応混合物に添加する。この反 応混合物を９４℃にて２分間培養し、以下の方法で熱的サイクルに付す。９４℃ にて１分、４０℃にて１分、７２℃にて１分を３サイクル、次いで９４℃にて１ 分、５５℃にて１分、７２℃にて１分を３７サイクル、続いて７２℃にて７分。

この反応で特異的に増幅されたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、制限エンドヌク レアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、アカロースゲル電気泳動にかける 。ゲルの領域を切断し、ＤＮＡを電気的に溶離し、８０塩基対の生成物をプラス ミドベクターｐＧＥＭ３中ポリリンカーのＸｂａｉおよびＢａｄＩ位間にサブク ローン化する。得られたサブクローンのＤＮＡ配列分析により、特異的に増幅さ れたＤＮＡ配列生成物がトリブ／ンフラグメント（２）および（３）においての べたアミノ酸配列をコードすることがわかる。

ＤＮＡ配列（配列表５）及びこの特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントの誘導 されたアミノ酸配列（配列表６）は以下のとおりである。

この配列のヌクレオチド１〜２４は、オリゴヌクレオチド＃５の一部を含み、ヌ クレオチド５８〜８０は、特異的増幅反応を行うために用いられるオリゴヌクレ オチド：４のリバースコンブリメントの一部を含む。増幅反応を開始する際のオ リゴヌクレオチド＃４および＃５の機能のために、これらは正確に、ＢＭＰ−８ 蛋白質をコードする実際の配列に対応せず、したがって、前記アミノＭ誘導体中 に翻訳されない。

以下のオリゴヌクレオチドプローブは前記うしＤＮＡ配列にもとづいて設計され 、自動ＤＮ＾ンンセサイザーで合成される。

このオリゴヌクレオチドプローブを３２ｐで放射性標識を行い、ベクターλＥＩ ＩＢＬ３中に構築されたうしゲノムライブラリーをスクリーニングするために用 いる。

４０００００のうしゲノム組換え体ライブライリーを５０のプレート上、１プレ ート当たり組換え体１１１０００個の割合で培養する。これらの培地から組換え バクテリオファージプラークの重複ニトロセルロースレプリカを作成し、増幅す る。オリゴヌクレオチドプローブ＃６をハイブリダイゼーションしてニトロセル ロースレプリカを６５℃にて５ＩＩＢ　（標準的ハイブリダイゼーション緩衝液 ）中に増幅し、６５℃にてｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳで洗浄する。１１の陽性 ノ＼イブリダイゼーンヨン組換え体を得、プラーク精製する。バクテリオファー ジプレートストックを作威し、ノくクテリオファージＤＮＡを１１のプラーク精 製組換え体の各々から単離する。λ９８００−１０で示される組み換え体の１種 のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を０．４ｋｂＰｓｔＩフラグ メントに対して局在化する。このフラグメントをプラスミドベクター（ｐＧＥＭ −３）中にサブクローン化し、ＤＮＡ配列分析を行う。クローンλ９８００−１ ０のこの領域の部分的ＤＮＡ配列（配列表７）および誘導されたアミノ酸配列（ 配列表８）を第１表に示す。バクテリオファージλ９８００−１０を１９９１年 ５月１５日に受託番号１２３０１としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション（「＾ＴＣＣＪ）（メリーランド、ロックビル、バークローン・ドライ ブ１２３０１）に寄託した。この寄託物は、特許手続きを目的とする微生物の寄 託の国際的承認に関するブダペスト条約ヌクレオチド９５はｒＴＪであるので、 前記ＤＮＡフラグメント中で対応するヌクレオチドは「Ｃ」である。このλ９８ ００−１０クローンは本発明のうしＢＩＩＰ−８蛋白質少なくとも一部をコード する。このクローン由来のＢＩＩＰ−８ペプチド配列は４９アミノ酸長で、ヌク レオチド３０からヌクレオチド１７６のＤＮＡ配列によりコードされる。牛骨２ ８〜３０ｋＤ材料から単離されたトリプンンフラグメント（２）および（３）１ こ対応するアミノ酸配列はｉ！！１表の下線部分である。インフレーム停止コド ン（ＴＧ＾）［ヌクレオチド１７７〜］７９］は、このクローンが、本発明のう しＢＭＰ−８蛋白質のカルボキン末端部分をコードすることを示す。このヌクレ オチドｌ〜２９はコンセンサススプライス部位（ジヌクレオチドＡＣの前のピリ ミジン濃厚＃Ｒ）の存在およびコードされたアミノ酸の他のＢＭＰ蛋白質との相 同性の欠如に基づきイントロン配列であると考えられる。

以下の２Ｎのオリゴヌクレオチドは前記トリプシンフラグメントのアミノ酸配列 （配列表１）にもとづいて設計される。

番１：　７１；ＧＧＴＮ入τＨＧ（ＮＣ（？ＮＣＫＣＩｌ：　ＡＴＩ（ＧＣＮＣ ＣＮＣＡＲＧＧ）ＩＴＡこれらのオリゴヌクレオチドは４２℃にてＳＨＢ中クロ りンλ９８００−１０とハイブリダイゼーションされ、４２℃で５　ｘ　５ＳＣ １０，１％ＳＤＳで洗浄する。前記オリゴ＃７および＃８の両方のハイブリダイ ゼーション領域を含有するクローンλ９８００−１０の制限フラグメントをプラ スミドベクター（ｐＧＥＭ−３）中にサブクローン化し、ＤＮＡ配列分析を行う 。クローン１　９８００−１０のこの領域の部分的ＤＮＡ配列（配列表９）およ び誘導されたアミノ酸配列（配列表１０）を第２表示す。

箪２表 ＴＣＣＴＴＣＣＣＧ　ＣＴＧ　ＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧ　ＡＡＣＧＣＣＡＣＣ ＡＡＣＣＡＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧｓａｒ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｓ ａｒ　Ｃｙｓ　ＭＥＴ　Ａｇｎ　ｊｕａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｌａ工１ ｅ　Ｌｅｕクローンλ９８００−１０のこの領域は、本発明のうしａｍｐ−ｇ蛋 白質の他の部分をコードする。このクローンから得られるＢＭＰ−８ペプチド配 列は３７アミノ酸長であり、ＤＮＡ配列のヌクレオチド５１からヌクレオチド１ ６１によりコードされる。牛骨２８〜３゜ｋＤ材料から単離されるトリプシンフ ラグメント（１）（配列表１）の対応するアミノ酸配列の一部は罵２表の下線部 である。ヌクレオチド１〜５ｏはコンセンサススプライス部位の存在および誘導 されたアミノ酸のトリプシンフラグメント（１）の残りとの相同性の欠如に基づ きイントロン配列であると考えられる。同様に、ヌクレオチド配列１６２〜１７ ２もまたイントロン配列であると考えられる。

クローンλ９８００−１０の別のＰｓｔＩ制限フラグメントをサブクローン化し 、前記と同様の方法で配列決定する。部分的ＤＮＡ配列（配列表１１）およびク ローンλ９８００−１０のこの領域の誘導されたアミノ酸配列（配列表１２）を ｓ３表に示す。

第３表 クローンλ９８００−１０のこの領域は、本発明のＢＭＰ−８蛋白質の他の部分 をコードする。このクローンのＢＭＰ−８ペプチド配列は２６アミノ酸長であり 、ヌクレオチド２０からヌクレオチド９９の配列によりコードされる。牛骨２８ 〜３０ｋＤ材料がら単離されるトリプシンフラグメント（１）に対応するアミノ 酸配列の残りの部分は第３表の下線部分である。この配列は、牛骨２８〜３０ｋ Ｄ材料から１Ｍされるトリプシンフラグメント（４〕の一部 ［（Ｔｈｒ）　−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ｐｒｏ−Ｆ”ｚｏ−（贈ｏ）−Ａｎ ｎ−Ｌｙｓ−Ｌａｕ−（Ｐｒｏ）−Ｇｌｙ−工１ａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｉｐ− Ｖａｌ−１（ｉｓ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｈｉｓ−ｃｌｙ−Ａｒｇ）　（配列表４　 ）を含むペプチド配列をコードすることも重要である。このトリブノンベブチド に対応するアミノ酸配列も第３表の下線部分である。ヌクレオチド配列１〜１９ およ：　び１ｏｏ〜１２０もすでに記載したような理由に基づきイントロン配列 であると考えられる。

第１．２および３表においてすでに記載した誘導されたアミノ酸配列に基づき、 ）　本発明のうしＢＭＰ−８蛋白質は第４表のアミノ酸配列（配列表１３）を含 有する。

Ｗｉ４表 Ｔｙｒ　Ｖａｌ　ｓｔｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｎ　Ｊｕｍｐ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ 　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ工１ｅ　ＪＬｌａ　ＰｒB Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　’ｒｙｒ　Ｂａｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｌａ■ ａｍｐ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ｍａｔ　Ａｓｎ　Ａｌａ　τｈｒＡＩＬｎ　Ｈｉｓ　 Ａｌａ　工１ｅ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｂａｒ　Ｌａｕ　ＶａｌＨｌｓ　ＴＡｕ　Ｌ ａｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｃ ｙｓ　Ｃｙｓ　入１ａ　Ｐｒｏ　ＴｈｘＬｙｓ　シｕ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ 　Ｅａｒ　Ｖａｌシｕ　Ｔｙｒ　’！’ｙｒ　Ａｓｐ　ｓｉｒ　ｓａｒ　Ａｊｎ 　Ａｓｎ　Ｖａｌエユａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｎｎ　 Ｍａｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＡｒｇＡユａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｉｕｓ１工 ２ この配列は他のＢＩＩＰ蛋白賀蛋白量性であることがわかる。例えば、カルボキ ン末端ンスティン濃厚域（第４表のアミノ酸＃１１〜＃１１２）は以下のアミノ 酸同一性を示す：　ＢＭＰ−２：　５鴎、ＢＭＰ−３：　４１％、ＢＭＰ−４： 　５５％、Ｂｌ［Ｐ−５＋　７４％、ＢＭＰ−６：　７５駄Ｂ輩Ｐ−７：　７５ ％ 実施例５ ひとＢＬＩＰ−８ 第１表において記載した配列を含む０．４ｋｂ　ＰｓｔＩうしゲノムＢＭＰ−８ ７ラグメントを３！Ｐで放射線標識を行い、ベクターλＦＩＸ中に構築されたひ とゲノムライブラリーＥストレートシーン−クローニング・システム（カタログ ＃９４４２０１）　］をスクリーニングするためのプローブとして用いる。この ひとゲノムライブラリーの１００００００の組換え体を、■プレート当たりバク テリオファージ２００００個の割合で培養する。組換え体バクテリオファーンブ ラークの重複ニトロセルロースレプリカを作成し、６５℃にてＳＢＲ中うしゲノ ムプローブとハイブリダイゼーションし、６５℃にて０．２　ｘ　５ＳＣ１０， ＩＳ　ＳＯＳ′Ｔ：洗浄する。２５陽性を得、再培養する。

以下のオリゴヌクレオチドプローブを第２表において記載したＤＮＡ配列のヌク レオチド５７からヌクレオチド８６にもとづいて設計し、自動ＤＮＡンンセサイ ザーで合成する。

＄９：　ＧＴＣＡＴＣＧＣＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＴＡＴ以下 のオリゴヌクレオチドプローブを第３表において記載したＤＮＡ配列のヌクレオ チド２０からヌクレオチド４３にもとづいて設計し、自動ＤＮＡノンセサイザー で合成する。

番１０　：　ｋｃＧｋｃＧＴｃｃ）、ＣＧＧＣＴＣＣＯ，ＣＧＧＣＣ二次フィル ターの１セツトを５ｌＩＢ中６５℃にてプローブ＃９とハイブリダイゼーション し、６５℃にてｌ　ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで洗浄し、二次フィルターの別 のセットを５ｉＩＢ中５０℃１．１．テブローフ＃１０トハイブリダイゼーショ ンシ、５０℃Ｉ：−テ５ｘｓｓｃ、　０．１％ＳＤＳで洗浄する。２種のクロー ンは両方のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションすることがわ かる。オリゴヌクレオチド＃９およびＨＯのこれらの２種のひとゲノムクローン との陽性ハイブリダイゼーションにより、これらは本発明のＢＭＰ−８蛋白質の ひと同等体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含有することがわ がる。これらのクローンの１種は、λＨ８１２−１と称し、１９９１年５月１５ 日受託番号：：７５０１０としてｒＡＴＣＣＪに寄託された。この寄託物は、特 許手続きを目的とする微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約および その下での規則の必要条件を満たしている。

ひと軟骨および／又は骨誘導因子分子の一部をコードするＤＮＡを含有する組換 え体バクテリオファージを得、ひとコード配列を骨誘導因子を合成するひとセル ラインまたは組織を同定するプローブとして用いることができる。あるいは、う しコード配列は、このようなひとセルライン又は組織を同定するためのプローブ として用いられる。間車にいうと、ＲＮＡを選択した細胞又は組織源から抽出し 、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに移入す るか又はホルムアルデヒドき反応させ、直接ニトロセルロース上にスポットする 。

ニトロセルロースを次いでうしまたはひと軟骨および／又は骨誘導蛋白質のコー ド配列由来のプローブとハイブリダイゼーションする。ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ ）セルロースクロマトグラフィーにより選択し、ｃＤＮ＾を確立された技術によ り（ツールら、前出）ラムダｇｔｌｏにクローン化する。

当業者に周知の別の方法を用いて、本発明のひとおよび他の種の軟骨／骨量白質 を単離することが出来る。前記の方法を用いてうしまたはひと蛋白質をプローブ 源として用いることにより問題となる他の関連した蛋白質を単離してもよい。

このような他の蛋白質はなかでも骨折の修復、傷の治癒および組織修復に同様の 宵月性がある。

実施例６ 軟骨／骨量白質の発現 本発明のうし、ひとまたは他のは乳類の蛋白質を製造するために、常用的遺伝子 工学技術によりそれをコードする前記のように単離したＤＮＡを適当な発現ベク ターに移入し、は乳類細胞または他の好ましい真核生物又は原核生物宿主に導入 する。トランスフェクションの方法としては、エレクトロボーレーンヨン、Ｃａ ＰＯ４沈殿、プロトプラストフュージョン、マイクロ注入およびリボフエクンヨ ンがあげられる。宿主細胞を形質転換し、次いで安定な形質転換体を標準的免疫 学的生物学的または酵素検定により生成物の発現に関してスクリーニングする。

このＢＬＩＰ−８ポリペプチドををコードするＤＮＡおよびｍＲ）ＪＡを、サザ ンおよびノザンプロット法等の標準的方法により検出し、高発現セルラインをク ローン化するかまたは適当な選択性のレベルで再クローン化して、より相同性の 高い細胞集団を得る。

選択された形質転換宿主細胞を培養し、それにより発現した本発明のＢＭＰ−８ 蛋白質を回収し、単離し、精製する。標準的技術を用いて発現した蛋白質の特性 検定を行う。例えば、特性検定は、［３５Ｓｌメチオニンまたはンスティンでの パルス標識、ポリアクリルアミド電ヌ泳動による分析を包含する。組み換え発現 されたＢＭＰ−８蛋白質は、同時に生産され、元々天然で結合している蛋白質性 材料を含まず、例えば細胞メディアに見られる物質のような他の不純物も含まな い。

本発明の生物学的に活性な組換えひと蛋白質の好ましい発現システムは、安定に 形質転換されたは乳類細胞である。一時的な発現に関しては、選択されるセルラ インはＳＶ４０形質転換アフリカグリーンモンキーの腎臓ＣＯ５−１で、これは 典型的にはプラスミド中に１〜４日間で中程度の量の蛋白質を生産する。更に、 好ましいは乳類細胞はＣＩＯ細胞である。

当業界の熟練者であれば、本発明のＤＮＡ配列ならびに既知ベクター、例えばｐ ＣＤｒ岡山ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジーＪ　、２　：　 １６］〜１７０　（１９８２）およびｐＪＬ３、ｐＪＬ４　ｒボッら、ＥＭＢＯ ・ジャーナルＪ　、４　：　６４５〜６５３　（１９８５）を用いることにより は乳層発現ベクターの構築は可能である。これらのベクターの適当な宿主細胞へ の形質転換に一つ、本発明の蛋白質が発現され得る。当業界の熟練者であれば、 コード配列の側面に位置するは乳類調製配列を削除又はこれを細菌性配列と置き 換えることにより本発明の配列を操作し、細菌細胞による細菌内又は細菌性発現 用細菌性ベクターを構築することが可能である。例えば、フード配列は更に操作 （例、他の既知リンカ−または他の公知技術によるそこからの非コード配列の欠 失もしくは存在するヌクレオチドの改変による修飾）され得る。

次いで修飾コード配列は、例えば谷口ら、「プロンーディングズ・オブ・ザ・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンノーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ ーブ・オブ・アメリカＪ　、７７　：　５２３０〜５２３３　（１９１！（１） に記載された方法を用いて既知細菌性ベクターに挿入され得る。次いで、この実 例的細菌性ベクターにより細菌宿主細胞を形質転換し、本発明の蛋白質を発現さ せ得る。細菌細胞における本発明の軟骨および／骨量白質の細胞外発現の実施法 については、例えばヨーロッパ特許出願ＥＰ＾１７７３４３を参照。

昆虫細胞で発現させる昆虫性ベクターの構築についても同様の操作が実施され得 る［例えば、公開されたヨーロッパ特許出願１５５４７６記載の方法を参照］。

酵母ベクターもまた、酵母細胞による本発明の因子の細胞内又は細胞外発現を目 的とする酵母調節配列を用いて構築されつる。［例えば、公開ＰＯ出願１０８６ １００６３９およびヨーロッパ特許出ｊ１［ＥＰ＾１２３２８９参照］。

は乳類細胞から高レベルの本発明蛋白質を製造する方法は、本発明の蛋白質をコ ードする異種遺伝子の多数のコピーを含む細胞の構築を含む。異種遺伝子は、増 幅可能なマーカー、例えばジヒドロ累酸還元酵素（ＤＩＩＦＲ）遺伝子（この場 合、カウフマンおよびノヤーブ、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・／くイオ ロジー」、１５９　：　６０１〜６２９（１９８２）の方法に従い、多量の遺伝 子コピーを含む細胞が、メトトレキセー）　（ＭＴＴ）の高濃縮液における伸長 に関して選択され得る）に結合され得る。この方法はいくつかの異なる細胞タイ プにより使用され得る。例えば、本発明の蛋白質に関するＤＮＡ配列を含むプラ スミドは、その発現を可能にする他のプラスミド配列およびＤｆｌＦＲ発現プラ スミドｐＡｄＡ２６ｓＶ（Ａ）３［カウフマンおよびシャープ、「モレキュラー ・アンド・セルラー・バイオロジーＪ　、２　：　１３０４　（１９ｇ２）　］ と効果的に組み合わされて、燐酸カルシウム共沈殿およびトランスフェクション 、エレクトロボーレージ言ンまたはブロトブラストフユーノヨンによりＤＩｌｒ ＦＲ−欠失Ｃ１１０細胞、ＤＤＫＸ−ＢＩＩ中に共に導入され得る。Ｄｆ［ＦＲ 発現形質転換体を、透析うし胎児血清を含むアルファ培地での成長に関して選択 し、続いて酊Ｘ高濃縮液（Ｑ、　０２．０．２．１０および５μＭ　ＭＴＸにお ける連続段階）　での成長による増幅に関して選択する〔カウフマンら、「モレ キュラー・アンド・セルラー・）くイオロジー」、５：１７５０　（１９８３） 　］。形質転換体をクローン化し、本発明の蛋白質を培地から回収し、単離し、 精製する。前記実施例３に記載したローゼンー修飾すンノ（スーレデイ・ラット 骨形成検定により生物学的活性蛋白質発現をモニターする。蛋白質発現は、ＭＴ ｌ性のレベルが高くなると、増加すべきである。同様の方法は、他の関連した蛋 白質にも使用され得る。

実施例７ 発現した軟骨／骨量白質の生物学的活性上記実施例６で得られた発現したＢ１１ Ｐ−８蛋白質の生物学的活性を測定するために、蛋白質をヘパリンセファロース カラムにおいて部分的に精製し、当業者に周知の標準的精製技術を用いて更に精 製する。例えば、培地から集めたボストトランスフエクンヨン調節培地上清を限 外ろ過により濃縮し、透析し、ヘパリンセファロースカラムにかける。

調製的ＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥ［レムリ、［不イチ＋　−Ｊ　、２２７　： 　６８０〜６８５　（１９７０）　］により更・こ精製が行われる。例えば、蛋 白質をゲルに適用する。回収率は、前記のようにしてヘパリン−セファ０−スで 精製した１−ｐｓＳ］メチオニン標１９ＢＭＰ蛋白質を添加することにより評価 することが出来る。蛋白質は、隣接レーンの銅染色により可視化される［リ−ら 、［アナリテイカル・バイオケミストリーＪ　、１６６：３０８〜３］２（１９ ８７）］。適当なバンドを切断し、抽出する。

得られた溶液の適量を２ｈｇのラットマトリックスと混合し、次いでインビボ骨 および／又は軟骨形成活性に関してローイン修飾サンバスーレディ検定により検 定する。モツクトランスフエクンヨン上清分画を対照として使用する。特定量の 本発明のひと蛋白質が加えられたラットマトリックスを含有するインブラントを ７日後にラットから除去し、組ｍ評価を行う。各インブラントからの代表的部分 を新規前無機質の存在に対してボン・コツプおよび酸性フーンンにより染色し、 軟骨特異的マトリックス形成の存在に対してトルイジンブルーにより染色する。

その部分内に存在する細胞のタイプおよびこれらの細胞が表現型を示す程度を評 価し、実施例３に記載したように採点する。

以上、本発明の好ましい実施態様について詳細に記載した。その実施に際し、こ れらの記載事項を考慮して多くの修正および変更が行われることは当業界の熟練 者であれば容易に想到し得るはずである。それらの修正および変更も後記請求の 範囲内に包含されるものと考えられる。

配列表 （１）一般的情報 （１）出願人　ヒユーイック、ロドニー・エムワング、ジャック・エイチ （■）発明の名称　骨および軟骨誘導蛋白質（迅）配列数　１３ （ｉｖ）通信のあて名 （Ａ）名宛先−ジエネテイツクス・インステイテユート・インコーホレイテッド 、リーガル・アフエアーズ（Ｂ）町名番地　ケンブリッジバーク・ドライブ　８ ７番（Ｃ）不老　ケンブリッジ （Ｄ）州名　マサチューセッツ （Ｅ）国名：　アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号・　０２１４０ （ｖ）コンピューター読取り形式 （Ａ）媒体の型・　フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣ コンパチブル＜ｃ＞オペレイティング・システム・　ＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−ＤＯ ３（Ｄ）ソフトウェア：　パテントイン・リリース　＃１．０、バージョン　１ １．２５ （ｖｉ）現在の出願データ （Ａ）出願番号：ＵＳ （Ｂ）出願日・　１９９１年５月１５日（Ｃ）分類・ （罎）委任／代理人情報 （Ａ）名前、　カピノス、エレン・ジエイ（Ｂ）登録番号：　３２．２４５ （Ｃ）件名／事件簿：　（ｄ５１８２Ｘ−ＰＣＴ（ｉｘ）遠隔通信情報 （Ａ）電話：　６１７−８７６−ＩＩ７０（Ｂ）ファクシミリ−６１７−８７６ −５８５１（２）配列番号ＩＪ二関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ・　２３アミノ酸残基 （Ｂ）型・　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　１本鎖 （Ｄ）トポロジｍ：　未詳 （ｉｉ）配列の種類　ペプチド （茄）ハイポセティカル　否 （ｆｆ）アンチセンス・　否 （ｖｊ）起源 （Ｆ）組織の種層、　骨 （ｘｉ）配列：　配列番号Ｉ Ａｒｇ　１（１ｇ　にｌｕ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｎ　５ｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ 　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　ＸＡｖ　入Ｓｐ　Ｔｒ■ ｌ　５　１０　ユ５ （２）配列番号２に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝　１８アミノ酸残基 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　１本鎖 （Ｄ）トポロジー　未詳 （ｎ）配列の種類　ペプチド （ｔｔｉ）ハイボセティカル　否 （汁）アンチセンス：　否 （Ｖ）フラグメント型：　中間部 （ｖｉ）起源 （Ａ）生物名：　ボス・タウルス （Ｆ）組織の種類：　骨 （Ｘｌ）配列、　配列番号２ Ｌａｕ社ｑ （２）配列番号３に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝　７７ミノ＃を残基 （Ｂ）塁、　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー、　未詳 （ｉｊ）配列の種類・　ペプチド （蜘）ハイポセティカル・　否 （ｉｔ）アンチセンス：　否 （η）起源 （Ａ）生物名：　ボス・タウルス （Ｆ）組織のｆ票：　骨 （ｘｉ）配列：　配列番号３ （２）配列番号４に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ・　２３アミノ酸残基 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　１本鎖 （Ｄ）トポロジー・　未詳 （■）配列の種類、　ペプチド （ｉｆｉ）ハイポセティカル　否 （■）アンチセンス、　否 （ｖｊ）起源 （Ａ）！物名　ボス・タウルス （Ｆ）　紐１瞠の種類　骨 （刀）配列　配列番号４ （２）配列番号５に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　８０塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）＃の数　２本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｆ）配列の種類　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｆ）ハイポセティカル　否 （ｔｖ）アンチセンス　否 （ｖＩ）起源 （Ａ）生物名、　ポスータウルス （′Ｆ１１）直接の起源 （Ｂ）クローン名　ａｃｃ３０ （咄）ゲノム内での位置 （Ｃ）単位　塩基対 （江）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号　ＣＤ５（Ｂ）位置：　２５．．５７ ０：Ｉ）配列　配列番号５ ＴＡＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡ　ＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴ　ＡＧλ　８（２） 配列番号６に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、　１１アミノ酸残基 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　！ｆｉｌｌ状 （■）配列のｆ類二　プロティン （ｘｉ）配列Ｉコ　配列番号６ （２）配列番号７に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ・　１９９塩基対 （Ｂ）型・　核酸 （Ｃ）鎖の数：　２本鎖 （Ｄ）トポロジー、１１ｉ鎖状 （ｎ）配列の種類ご　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイボセティカル　否 （ｖｉ）起源 （Ａ）生物名：　ボス・タウルス （ｖｉ）直接の起源 （Ａ）ライブラリー名、　うしゲノム （Ｂ）クローン名、　ラムダ　９８００−１０（ｖｉ）ゲノム内での位置 （Ｃ）単位：　塩基対 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号・　エキソン（Ｂ）位置：　３０．．１９９ （ｉｚ）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号・　イントロン（Ｂ）位置：　１．．２９ （鎗）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号・　ＣＤ５（Ｂ）位置　３０．．１７９ Ｃ力）配列：　配列番号７ ＣＡＧ　１９９ （２）配列番号８に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：　４９アミノ酸残基 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、　直鎖状 （ｉｉ）配列の種ｇＩ＝　プロティン （刀）配列：　配列番号８ Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓ＠ｒλｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｎ　Ｌｅｕ　） ｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　５（１１：　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｇｎ（２）配列番号９に 関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：　１７２塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鏑の数＝　２本鎖 （Ｄ）トポロジーＩ　ＩＩＩ状 （１ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（茄）ハイポセティカル：　否 （舊）起源 （Ａ）生物名、　ボス・タウルス （軸）ＩＩ接の起源 （Ａ）ライブラリー名二　うしゲノム （Ｂ）クローン名　ラムダ　９８００−ＩＱ（ｖｊ）ゲノム内での位置 （Ｃ）単位　塩基対 （Ｌｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号：　エキソン（Ｂ）位置：　５１．．１６１ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号　イントロン（Ｂ）位置、　１５０ （α）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号　イントロン（Ｂ）位置　１６２．．１７２ （匡）配列の特徴 （、Ａ）名称／特徴を表わす記号：　ＣＤ５（Ｂ）位置：　５１．．１６１ （刀）配列：　配列番号９ （２）配列番号１０に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （、Ａ）長さ−３７アミノ酸残基 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｊ）配列の種類　プロティン （ｘｌ）配列・　配列番号１０ （２）配列番号１１に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：　１１９塩基対 （Ｂ）型、　核酸 （Ｃ）Ｍの数＝　２本鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｉｆ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｎｉ）ハイポセティカル：　否 （ｎ）起源 （Ａ）生物名・　ボス・タウルス （ｖｉ）直接の起源 （Ａ）ライブラリー名：　うしゲノム （Ｂ）クローン名：　ラムダ　９８００−１０（輯）ゲノム内での位置 （Ｃ）ｊ１１位　塩基対 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号：　エキソン（Ｂ）位置：　２０．．９９ （江）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表わす記号、　イントロン（２）配列番号１３に関する情報 ｋｓｐ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｈｉｓ　ＧＩＹＡｒｇ　Ｇｌｎ　Ｖ ａｌ　ＣＹｓ　ｋｒｑ　ｋｒｑ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕｌ　５　１０　１５ Ｔｙｒ　ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｉ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　 Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　工１ｅ　Ｊｕａ　Ｐｒ。

２０　２５　コ０ Ｇｉｎ　ＧＩＹ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　ｊｕａ　’ｒｙｒ　Ｔｙｒ　ｃｙｓ　Ｇｌｕ 　にｌｙ　Ｇｌｕ　ＣＹｓ　Ｓｅｒ　Ｐｈｉ　Ｐｒｏ　Ｌａ■ 人ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｍ＠ｔ　Ａｓｎ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　 Ａｌａ　工ｍｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ｓａｒ　ＬＣｕ　Ｖａ１Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｉ ４ｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｊｕａ　ｃ ｙｓ　ａｙｓ　Ａｈａ　ｐｒｏ　笥ｒ６５　７０　フ５　８０ Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　 Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　入ｓｎ　Ｖａ１工１ｅ　Ｌａｕ　Ａ ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　入ｓｎ　Ｍａｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　入ｒｇ入１ ａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓｌｏｏ　１０５　１１０ Ｆｉｇ　１ ５２　標準 、、ＰＣＴ／（Ｉｓ　９１１０３３８Ｂ国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１３１００　 ８６１９−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　ＺＮＡ　Ｃ８２１４−４Ｂ／／Ｃ０７Ｋ　７１０６　Ｚ 　８３１８−４Ｈ７１０８７５３７−４Ｈ ７／ＬＯ７５３７−４Ｈ （Ｃｌ３Ｆ　２１１０２ ＣＩ２Ｒ１：９１） ＣＯ７Ｋ　９９：００ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、Ｓ、Ｅ）、ＣＡ 、ＪＰ Ｉ （７２）発明者　ウォング、ジャック・エイチアメリカ合衆国０２１７３　マサ チューセッツ、レキシントン、ローウェル・ストリート５２２番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記配列 ａ）【配列があります】 （配列番号１） ｂ）【配列があります】 （配列番号２） ｃ）【配列があります】 （配列番号３） ｄ）【配列があります】 （配列番号４）および ｅ）ａ）−ｄ）の配列に相同的な配列 の少なくとも１種を含み、ａ）−ｄ）を特徴とする蛋白質の相同体をコード化す る精製ＢＭＰ−８蛋白質。 ２．さらに軟骨および／または骨形成誘導能を特徴とする、請求項１記載の蛋白 質。 ３．下記配列 ａ） 【配列があります】 （配列番号７） ｂ）【配列があります】 （配列番号９）および ｃ）【配列があります】 （配列番号１１） の少なくとも１種を含む、ＢＭＰ−８蛋白質をコード化するＤＮＡ配列。 ４．ＡＴＣＣ番号７５０１０のＤＮＡによりコード化されるアミノ酸配列を特徴 とする精製蛋白質。 ５．ＢＭＰ−８をコード化するＡＴＣＣ番号７５０１０のＤＮＡ配列。 ６．（ａ）その発現制御配列と機能可能に結合している請求項３記載のＤＮＡ配 列を有するベクターにより形質転換された細胞を培養し、（ｂ）軟骨および／ま たは骨形成誘導能を特徴とする蛋白質を上記培養媒質から採取し、分離し、精製 する段階により製造される精製蛋白質。 ７．（ａ）その発現制御配列と機能可能に結合しておりＢＭＰ−８をコード化す るＡＴＣＣ番号７５０１０のＤＮＡ配列を含むベクターにより形質転換された細 胞を培養し、 （ｂ）軟骨および／または骨形成誘導能を特徴とするＢＭＰ−８蛋白質を上記培 養媒質から採取し、分離し、精製する段階により製造される精製蛋白質。 ８．請求項３記載のＤＮＡで形質転換された宿主細胞。 ９．請求項５記載のＤＮＡで形質転換された宿主細胞。 ｌ０．（ａ）その発現制御配列と機能可能に結合している請求項３記載のＤＮＡ 配列を有するベクターにより形質転換された細胞を培養し、（ｂ）軟骨および／ または骨形成誘導能を特徴とする蛋白質を上記培養媒質から採取し、分離し、精 製する段階を含む、ＢＭＰ−８蛋白質の製造法。 １１．（ａ）その発現制御配列と機能可能に結合している請求項５記載のＤＮＡ 配列を有するベクターにより形質転換された細胞を培養し、（ｂ）軟骨および／ または骨形成誘導能を特徴とする蛋白質を上記培養媒質から採取し、分離し、精 製する段階を含む、精製ＢＭＰ−８蛋白質の製造法。 １２．医薬として許容される媒質と混合して有効量のＢＭＰ−８蛋白質を含む、 医薬組成物。 １３．医薬として許容される媒質中に有効量のＢＭＰ−８蛋白質を含む、骨およ び／または軟骨形成用医薬製剤。 １４．さらに、組成物を支持し骨および／または軟骨形成表面を提供するマトリ ックスを含む、請求項１３記載の組成物。 １５．マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、ポリ乳酸および燐 酸３カルシウムから選ばれた材料を含む、請求項１４記載の組成物。 １６．医薬として許容される媒質中に有効量のＢＭＰ−８蛋白質を含む、創傷治 癒および組織修復用医薬組成物。