JPH06502496A - 可撓性容器を用いて粒子を分離する装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 可撓性容器を用いて粒子を分離する装置及び方法疫選択法が存在する。これらの 多くの方法が、１９９０年４月２３日付出願の係属中の米国特許出願第０７１５ １３．５４３号の背景部分において詳細に説明されており、該米国特許出願はこ こに参考として掲示する。これらの方法として、例えば、遠心力を用いたクロス 分離、望まない細胞を殺すことによる分離、蛍光活性形細胞ソータを用いた分離 、物理的支持体上に固定化されたリガンドに細胞を直接的又は間接的に結合する ことによる分離、パニング技術を用いた分離、カラムイムノアブソープションに よる分離、及び磁気イムノビーズを用いた分離がある。これらの各方法に関連す る問題が、上記米国特許出願第０７１５１３．５４３号において詳細に論じられ ている。

これらの方法に対する１つの改良として、上記米国特許出願第０７１５１３．５ ４３号には、目標粒子と非目標粒子との混合物から、第１メンバに間接的に結合 した目標粒子を分離する装置及び方法が記載されている。この装置は、混合物を 導入すべきカラムと、該カラム内に配置される多孔質結合剤からなり且つ第１メ ンバに結合できる第２メンバを備えた床（ベッド）とを有しており、結合剤の間 隙は粒子が床を通って流れることを可能にするサイズを有し、結合された粒子を 多孔質結合剤から解放させるべ（多孔質結合剤を攪拌するための、カラム内に配 置された手段を更に有している。この米国特許出願第０７１５１３．５４３号に は多孔質材料を攪拌する種々の手段が記載されており、例えば磁気インペラ、磁 気ビーズ、錘（ウェイト）、磁気錘、ピペット、及び浮きフロートがある。結合 剤から目標細胞を分離する付加的技術として、化学的及び酵素的処理がある。

上記種々の攪拌技術は、インペラ又は磁気ビーズ等の攪拌装置を収容するための 比較的直径の大きなカラムを必要とする。従って、これらの技術は、ｌ７１６イ ンチａ勺１．６　ｍｍ）程の小径をもつカラムが望まれる少量の細胞の分離を行 う場合に（シヒずしも有効ではない。また、これらの各攪拌機構は付加的な部品 の製造を要し、コストの増大を招く。

を備えた可撓性容器（ｐｌｉａｂｌｅ　ｖｅｓｓｅｌ）を有しており、該容器の 少なくとも一部が可撓性を有しており、容器内に配置される結合剤の床を更に有 しており、結合剤は、この上に目標粒子が固定されるようにして目標粒子と結合 でき、床は、混合物が容器内に導入されるときに粒子が床を通って流れることを 可能にする充分なサイズの間隙を有しており、容器の可撓性部分は、適当な力が 加えられたときに結合剤の相対移動を生じさせることができ、該相対移動は、結 合ＩＰから目標粒子を除去するのに充分なものである。本発明の好ましい実施例 では、容器は、両端部にそれぞれ配置された別々の入口及び出口を有しているカ ラムの形状をなしているけれども、他の形状にすることもできる。

結合剤の種類に基づき、装置に、容器内に結合剤を保持するためのスクリーンを 更に設けることができる。更に、本発明の好ましい実施例によれば、目標粒子を 、親和力分離により分離される細胞のような生物学的粒子にすることができる。

本発明の関連する特徴の範囲内で、目標粒子と非目標粒子とを含有する混合物か ら目標粒子を分離するためのシステムが提供される。このシステムは、流体が流 入できる入口及び流体が流出できる出口を備えた可撓性容器を有しており、該容 器の少なくとも一部が可撓性を有しており、容器内に配置される結合剤の床を有 しており、結合剤は、この上に目標粒子が固定されるようにして目標粒子と結合 でき、床は、混合物が容器内に導入されるときに粒子が床を通って流れることを 可能にする充分なサイズの間隙を有しており、容器の可撓性部分は、適当な力が 加えられたときに結合剤の相対移動を生じさせることができ、該相対移動は、結 合剤から目標粒子を除去するのに充分なものであり、結合剤の相対移動を生じさ せるようにして可撓性部分を変形させる変形手段を更に有しており、目標粒子は 、容器の可撓性部分を変形させることにより結合剤から除去される。

上記装置及びシステムは、目標粒子と非目標粒子とを含有する混合物から目標粒 子を分離するものを説明したが、本発明の装置及びシステムは、目標粒子のみを 含有する溶液から目標粒子を分離するのにも使用できる。

前述のように、本発明はまた、目標粒子と非目標粒子とを含有する混合物から目 標粒子を分離する方法を提供する。本発明の方法は、上記装置に混合物を通す工 程と、容器から非目標粒子を除去する工程と、結合剤の相対移動を生じさせて目 標粒子を結合剤から除去すべく、容器の可撓性部分を変形させる工程と、容器か ら目標粒子を回収する工程とを有している。前述のように、使用される結合剤の 種類に基づき、本発明の方法には、結合剤を支持し且つ混合物が通過できるスク リーンを設けることにより、容器内の結合剤の位置を維持する工程を更に設ける ことができる。好ましい実施例においては、目標粒子は、親和力分離技術により 分離される細胞のような生物学的粒子である。

同様に、溶液から目標粒子を分離する他の方法も提供される。この方法は、目標 粒子を含有する溶液を上記装置に通して溶液を結合剤に接触させ、目標粒子を結 合剤に結合させる工程と、容器から溶液の非結合部分を除去する工程と、結合剤 の相対移動を生じさせて目標粒子を結合剤から除去すべく、容器の可撓性部分を 変形させる工程と、容器から目標粒子を回収する工程とを有している。

本発明の上記及び他の特徴は、添付図面に関連して述べる以下の詳細な説明によ り明らかになるであろう。

胚回に」本町り開方 前述のように、本発明は、目標粒子と非目標粒子との混合物から目標粒子を分離 する装置及び方法に関する。第１図は、本発明を代表する装置を備えた粒子分離 装置を示すものである。第１図を参照すると、装置１０は、可撓性容器（より詳 しくはカラム）１２と、目標粒子及び非目標粒子を含有する混合物を導入するた めの、可撓性カラムど連通している混合物注入器１４と、カラムをフラッシング するための洗浄液を収容している洗浄液注入器１６とを有している。以下に詳述 するように、本発明の好ましい実施例ではカラム全体が可撓性を有しているけれ ども、カラムの少なくとも一部は可撓性を有する必要がある。カラム内への混合 物及び洗浄液の導入を制御するための三方弁１８が設けられている。弁１８の下 には、混合物又は洗浄液のいずれかを、カラムの頂部を覆う針ポート２２を介し てカラム内に注入するためのシュラウド針２０が配置されている。

第２図に示すように、カラム１２は、該カラム１２内に配置された、結合剤２４ の床と、結合剤の下に配置された、カラム内での結合剤の位置を維持するための スクリーン２６とを有している。カラムは、混合物及び洗浄液を導入する人口２ ８と、出口３０とを有しており、該出口３０を通って混合物の成分がカラムから 流出する。別の構成として、カラムは、該カラム内に混合物を導入し且つ混合物 をカラムから取り出すための単一開口を有するものでもよい。

可撓性容器は多くの便利な形状に形成することができる。前述のように、本発明 の好ましい実施例によれば容器はカラムである。別の形状としてチューブ、ボト ル又はバッグがある。しかしながら、本発明はこれらの形状に限定されないこと を理解されたい。また、好ましい実施例では、容器全体が可撓性を有するもので あるが、カラムの少なくとも一部は可撓性を有する必要がある。本発明の好まの 排除を生じさせるような可撓性を有している。以下に詳述するように、可撓性部 分の目的は、ユーザが、結合剤の相対移動を生じさせるのに必要な力をカラムの 可撓性部分に反復付与できるようにすることにある。従って、例えばカラムは、 結合剤に隣接する壁の部分を除き、剛性材料で作ることができる。可撓性材料の 例として、可塑化ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタ ン、シリコーンゴム、ｐＶＤＣ（Ｓａｒａｎ　、登録商［４）　、　５ＣＬＡＩ ＲＧｂ表街標）、Ｓ−ｕｒｌｙｎ（Ｍａ標、包装フィルム）、Ｃ−ＦＬＥＸ　Ｃ ＪＨａＫ）　、ポリエステル、ゴム、幾つかのフルオロポリマー、又は例えばア ルミニウム又は銅フィルム等の金属フィルムがある。

結合剤２４は、目標粒子及び非目標粒子を含有する混合物がカラム内に導入され るときに目標粒子と結合し、非目標粒子は通過できるように設計されている。

従って、結合剤の床は、目標粒子と非目標粒子との混合物がカラム内に導入され るときに非目標粒子を通過させるのに充分なサイズの間隙すなわち空隙（ボア） を有するものでなくてはならない。使用される特定種類の結合剤は、分離すべき 目標粒子に基づいて定める。結合剤は、重力以外の力によっても目標粒子が結合 剤上で移動できなくなるように、目標粒子と成る程度結合するものでなくてはな らない。

以下に詳述するように、目標粒子と非目標粒子との混合物は、混合物注入器１４ からカラム内に導入される。結合剤は目標粒子と結合するので、非目標粒子が結 合剤を通過する間に目標粒子が結合剤に結合さ江従って目標粒子が非目標粒子か ら分離される。その後、目標粒子は、好ましくは結合剤の相対移動が生じるよう にカラムの可撓性部分を反復変形させることにより、結合剤から除去される。カ ラムの可撓性部分は、例えば人の手又は第１図に概略的に示すような機械的手段 ３２で可撓性部分を簡単に圧搾することにより種々の方法で変形される。

従って、このユニークな可撓性カラムのｆｆｌ’ｆｌこより、内部攪拌装置を要 せずして結合剤を攪拌できる。

目標粒子として、好ましくは（１，Ｉｔ＋ｎ＋Ｊ又上の直径をもつ有機、無機、 固体又は液体粒子がある。しかしながら、本発明の好ましい実施例によれば、目 標粒子の一グループとして、ウィルス、バクテリア、菌類、寄生虫及び細胞等の 生物学的粒子がある。細胞としては、数ある中で、内皮細胞、腫瘍細胞、膵島細 胞、マクロファージ吠食細胞）、単核細胞（単球）、ナチュラルキラー細胞、Ｂ リンパ球、■リンパ球、及び造血幹細胞等のヒト細胞のクラスがある。

目標細胞は、親和力分離法（結合剤が、目標細胞に希タリに結合するリガンド又 は抗体を使用している分離法）を含む多数の技術を用いて非目標細胞から分離で きることは明らかである。目標細胞は、これらを、前述のように少なくとも一部 が可撓性を有しているカラム（表面上に固定化された目標粒子に特別に結合する リガンドを備えた結合剤（好ましくは、無特定多孔質低結合剤）の床を収容して いる）に通すことにより「直接Ｊ方法で分離できる。別ヌ構成として、目標細胞 は、第１メンバに直接的又は間接的に結合され且つ表面上に固定化された第２メ ンバを備えた結合剤（無特定多孔質低結合剤のような結合剤）の床上に通される 。

第２メンバは、約１０’Ｍ−’以上の親和力で第１メンバに結合さね、従って、 目標細胞を結合剤比に間接的に固定化できる。種々の物質がリガンド又は抗体に 対する支持体として機能し、これらの物質として、数ある中で、多孔質中空繊維 （Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　Ｍａｓｓ、　 ）　、ビーズ（Ｐｏ１ｙｓｃ１ｅｎｃｅｓ、　Ｗａｒｒｉｎ■狽盾氏B Ｐａ、）、磁気ビード（Ｒｏｂｂｉｎｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｍｏｕｎｔ ａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆ、　）、メツシュ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉ ｎｓｏｎ、　１ｉｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆ、　）、スクリーン及 び中実繊維（Ｅｄｅ−１ｍａｎ等の米国特許第３．８４３．３２４号及びＫｕｒ ｏｄａ等の米国特許第４．４１６．７７７号）がある。結合剤がビーズ（例えば 、ビーズが出口のサイズより大きい場合）又は繊維（保持装置を用いることなく 繊維の位置を維持できるもの）からなるときにはスクリーン２６が不要であるこ とに留意されたい。

上記のように、第２メンバは、リガンド第１メンバを含むワンステップ法により 、目標細胞を結合剤に間接結合できるようにする。第２メンバは、多数の第１メ ンバ／第２メンバの結合対から選択でき、第２メンバとして、数ある中で、ビオ チン−アビジン、ビオチンーストレブタビジン、ビオシチンーストレプタビジン 、メトトレキセート−ジヒドロ葉酸レダクターゼ、５フルオロウラシル−チミジ ル酸シンターゼ、リボフラビン−リボフラビン結合チロティン（Ｂｅｃｕａｒ及 びトａ１ｍｅｒの著書「卵白のりボフラビン結合プロティンへのフラビン誘導体 の結合」（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｆｌａｖｉｎ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖ ｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒ盾狽■奄■ ｏｆ　Ｅｇｇ　Ｗｈｉｔｅ”）、Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５７　（ １０）：５６０７−１７．１９８２年、参句、抗体−プロチインＡ及び抗体−プ ロチインＧがある。上記結合対のいずれのメンバも第２メンバとして機能し、相 補メンバは第１メンバとして機能する。従って、いずれのメンバも結合剤に付着 し、相補メンバもリガンドに付着する。

目標細胞と非目標細胞とを含有する混合物を、結合剤を含有するカラム内に導入 した後、上記のように、非目標細胞は結合剤を通過し、同時に目標細胞は結合剤 に結合される。結合剤から目標細胞を除去するには、結合剤の相対移動を生じさ せるのに必要とされる程度の内方への圧力を加えることにより、カラムの可撓性 部分を反復変形させるのが好ましい。変形度合いは、親和剤が視認できるほど移 動されるまで徐々に増大させる。次に、攪拌レベルを微調節する。例えば小さな 力を用いて、特に強くは結合していない粒子を除去し、その後、より大きな力を 加えて、最も強く結合した粒子を除去する。最後に、目標細胞を結合剤から除去 した後、洗浄液注入器１Ｇからの洗浄液により、目標細胞をカラムから洗い出す 。

前述のように、このようにして結合剤を攪拌することにより、ピペッティングに よる攪拌に比べて細胞生存度が顕著に向上することが見出されている。また、カ ラムにはいかなる内部攪拌装置も不要であるので、カラムの直径を比較的小さく でき（＋／１６インチ（約１．６１ｍ＋）　）　、これは、少量の目標細胞を分 離するときに有効である。

以上、本発明の特に好ましい実施例を、目標細胞に特に結合するリガンド又は抗 体に関連して説明したが、本発明は、非目標粒子から細胞のような目標粒子を分 離するのに、このような高親和力をもつ結合剤の使用に限定されるものではない ことを理解すべきである。それどころか、生物学的又は非生物学的な目標粒子を 充分に結合する作用をもつあらゆる結合剤を使用できる。また、本発明の装置及 び方法は、溶液から目標粒子を分離するのに使用することもできる。例えば、水 溶液中の脂質小胞を捕捉し、水溶液かｅＭＴｆｌ貢小胞を分離する結合剤として 疎水性クロマトグラフィー樹脂を使用できる。その後、カラムの可撓性部分を圧 搾して樹脂を相対移動させることにより、脂質小胞を順回）ら除去できる。次に 、洗浄液注入器Ｉ６からの洗浄液をカラムを通してフラッシングさせ、脂質ｔＪ ４泡をカラムから排出することにより、脂質小胞を溶離することができる。

以下の例は、例示として開示するものであり、制限的なものではない。

例 Ａ、バフィーコート（転層）細胞の調製骨髄の試料に２４０ｇの遠心力を１５分 間かける。血漿を除去し、バフィーコート細胞を吸引し且つ再度２４０ｇの遠心 力を１５分間かけて、残留赤血球を除去する。２８０ｇの遠心力を１０分間かけ ることにより、バフィーコート細胞をＰＢＳで二度洗浄する。次に、ＰＢＳ中の ｌＸｌ０’白血球個数／ｍｌプラス１％ＢＳＡの最終濃度になるように細胞を再 懸濁させる。

Ｂ、抗体によるバフィーコート細胞の保温（インキュベーション）バフィーコー ト細胞の懸濁液を、室温で５分間、２０μｇ／ｍｌビオチニレーテッドアンチＣ Ｄ−３４抗体（Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｂｆｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｗａｔｅｒｂｅａｃ ｈ　Ｃａｍｂｒｊｄｇｅ、υ、ン）と共に保温する。次に、２８０ｇの遠心力を １０分間かけることにより、抗体−細胞の混合物を、ＰＢＳプラスＩ％ＢＳＡで 二度洗浄する。次に、ＰＢＳ中のｌ×１０８白血球個数／ｍｌプラス５％ＢＳＡ の濃度で細胞を再懸濁させる。

Ｃ，ポリアクリルアミドゲルのカルボキシル化■７グラムのドライバイオゲルＰ −６０αｍｌ　（５０−１００メツシユ（ウェット）、粗いビーズ）　ＣＢＴＯ ＲＡＤ、カタログ番号１５０．１６３０、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃ−ａｌｉｆ、 ）が、１０．５ＭのＮａ、ＣＯ，の１．５Ｌに添加される。ＮａＯＨて）肋＜１ ０．５に調節さね−ビーズに損傷を与えることがないように約２０〜３０分間、 ミキサ（ＲＺＲＩ、　Ｃａｒ−ｆａｎｎ、　Ｗｉａｒｔｏｎ、　０ｎｔａｒｉｏ 、　Ｃａｎａｄａ）で注意深く攪拌する。次に、６０℃の水浴中に混合物が置か れる。混合物の温度が６０℃に到達した後、混合物は、時折攪拌することにより 更に２時間（６０℃で）保温される。次に、混合物を水浴から取り出して水浴中 に置き、混合物の温度を室温まで低下させる。

ビーズを蒸留水又は脱イオン水で数回洗浄し、その後、真空に連結された粗いガ ラスフィルタを用いてＰＢＳで数回洗浄する。カルボキシル化されたゲルは、４ ℃でＰＢＳ中に貯蔵され、殺菌し又は防腐剤を用いて貯蔵すれば１年間は安定状 態に保たれる。

Ｄ、カルボキシル化されたバイオゲルを共役するアビジン先ず、真空に連結され た粗いガラスフィルタで濾過することにより、測定した量のカルボキシル化され たバイオゲルからＰＢＳを除去する。次に、ゲルを蒸留水又は脱イオン水中で１ ５〜３０分間平衡させる。水中での平衡により、ゲルの体積は萌に測定した大き さの約４倍に膨張する。ゲルは、ゲル１ｍｌ　（ＰＢＳ中で最初に測定したもの ）につき１０ｍ１の蒸留水又は脱イオン水中で再懸濁される。

最初に測定したゲル１ｍｌにつき、３０■のｌ−エチル−３−（３−ジメチルア ミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ−ＨＣＩ）　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、、カタログ番号６７７５０　、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｏ、） が添加される。ｐＨは、ＨＣＩの点滴添加により迅速に５．５に調節される。ｐ Ｈを５．５に維持するための注意がなされる。すなわち、ｐＨが５．０以下又は ６．０以上になるとバイオゲルの活性が大幅に低下する。混合物は５分間攪拌さ れる。

アビジン（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　ＩＩｌｃ、　Ｐａ １ｌｂｒｏｏｋ、　Ｃａ１ｉｆ、）が、ｌＯ〜１００■／ｍｌの濃度で脱イオン 水に溶解される。混合物は１．５時間攪拌される。

次に、２Ｍのグリシンを添加し、混合物中に０．２Ｍのグリシンの最終濃度を与 えて更に１時間攪拌する。

ゲルは、粗いガラスフィルタ及び真空を用いて数倍容のＰＢＳで洗浄され、４℃ で１％の安息香酸と共に貯蔵される。ゲルは、約１年間安定している。

Ｅ、カラムの調製 に９／１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫ１３　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａ＊ａｙ、　Ｎ、　Ｊ、　）が、端キヤツプ内の ８０ミクロンナイロンメツシュに組み付けられる。端キャップにはチューブが嵌 合され且つぜん動ポンプ（Ｃｏｌｅ　Ｐａｒｍｅｒ、　Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＩｌ 、）を介して収集チューブに螺着される。ＰＢＳのカラムには、上記のように調 製されたアビジン被覆バイオゲルが添加され且つ４ｃｒｄ）深さに沈澱される。

ピペットで攪拌することにより、ゲル床中の気泡が除去される。カラム内のゲル が洗浄され且つＰＢＳプラス５％ＢＳＡで平衡にされる。カルボキシル化された Ｐ−３０ゲルの１　ｃｒｒＪｌｉＪｒ＜充填された上記に９／１５カラムを除き 、該に９／１５カラムから前置カラムが作られ、各前置カラムの底からのチュー ブが、直ぐ下のアビジンバイオゲル充填形カラムの頂部内に導入される。各カラ ム内の液体レベルが、ゲルのレベルまで引き下げられる。

第２図に示すような可撓性容器は、医用ＰＶＣフィルムから製造さね−ＰＶＣ端 キャップ内には８０ミクロンのスクリーンが設けられている。端キャップにはチ ューブが連結され且つぜん動ポンプ（Ｃｏｌｅ　Ｐａｒｍｅｒ、　Ｃｈｉｃａｇ ｏ、　ＩＩｌ、）を介して収集チューブに螺着される。ＰＢＳのカラムには、上 記のように調製されたアビジン被覆バイオゲルが添加され且つＪａｎの深さに沈 澱される。容器の壁を圧搾することにより、ゲル床中の気泡が除去される。容器 内のゲルが洗浄され且つＰＢＳプラス５％ＢＳＡで平衡にされる。上記カルボキ シル化されたゲルをを備えたに９カラムから前置カラムが作られ〜前置カラムの 出口チューブが、容器の頂部のスパイクポート内に導入される。

Ｆ、カラムの作動 上記のように処理された５ＸＩＯ’［の骨髄細胞は、前置カラム内のカルボキシ ル化されたゲルの頂部上に静かに積層され、約１ｍｌ、／ｍ１ｎＪｕ下の流量で アビジン被覆されたバイオゲルカラム内に重力により流入できる。細胞混合物は 、１ｍｌ／ｌｌｌ１ｎの流量でアビジン被覆されたバイオゲルカラムを通してポ ンプにより圧送される。

細胞溶液が通された後、前置カラムが、１〜２ｍｌのＰＢＳプラス５％ＢＳＡで 洗浄される。最後の細胞溶液がアビジン被覆ゲルに流入したならば、２ｍｌのＰ ＢＳプラス５％ＢＳＡを当該カラムに静かに添加し、床を通して残留セルを洗浄 する。

最後のＰＢＳプラス５％ＢＳＡレベルが床に流入する前に、ＰＢＳが溶液の頂部 上に静かに積層され、界面を形成する。床は、粘着細胞が回収される前に、添加 する８ｍｌのＰＢＳで洗浄される。粘着細胞は、ＰＢＳを約３ｍｌ／ｍｌｎでカ ラムを通して流すと同時に、ピペットを介してゲルを攪拌することによりゲルか ら解放される。

Ｇ、可撓性容器の作動 上記のように処理された５０億個の骨髄細胞は、前置カラム内のゲル上に積層さ れ且つ３．５　ｍｌ／ｍｉｎの流量で可撓性容器１２図）を通してポンプで圧送 される。

前置カラムは５ｍｌのＰＢＳプラス５％ＢＳＡで洗浄され、次に、可撓性容器が １５０ｍ１のＰＢＳで洗浄され、非粘着細胞が除去される。容器へのＰＢＳの流 入を止めることにより粘着細胞を容器から除去し、次に、容器の壁を手で圧搾し て容器内のゲルを１２回排除する。容器へのＰＢＳの流入を再開して、解放され た細胞を容器から洗い出す。

Ｈ０結果 に９カラム及びピペット攪拌により８９％の精製ＣＤ３４ポジテイブ細胞が得善 された攪拌によるものであり、改善された収量は流量等の作動条件を異ならせた ことによるとも考えられる。

少量の細胞試料の分離 Ａ、細胞の精製 １５分間かけられ、残留赤血球が除去される。バフィーコート細胞が、１０”個 数／ｍｌの濃度でＰＢＳプラス０．１％Ｈ３Ａ中に再懸濁され且つビオチニレー テ・ソドアンチＩａ抗体（１μｇ／ｍｌ）と共に室温で５分間保温された（［免 疫選択法（１−ｓｕ＋ｎｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）　Ｊの適用において説明されて いる）。

Ｂ、ゲル及び分離容器の調製 例１の項目Ｃ，Ｄにおいて説明したようにしてカルボキシル化され且つアビジン 被覆ゲルを精製する。可撓性容器は、第１図に示すように、ＰｖＣチューブと、 医用浸出液成分とで構成される。アビジン被覆ゲルを収容しているチュー１１１ 図の参照番号１２）は、３．５ｍｌ内径を有している。直径が小さいため、細胞 を除去すべくゲルを攪拌する錘又は磁石を入れる空間がなく、ピペットの先端を 入れる空間もない。また、細胞を除去すべくゲルを攪拌するときに頻繁に発生す る気泡により、チューブのボアが完全に閉塞されるであろう。可撓性容器は、上 記１ｆｌｌ　Ｉで説明したように使用すべく調製された。

第１図に示すような第２の可撓性容器が、ＰｖＣチューブと、浸出液セット成分 （ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ｓｅｔ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）とにより製造される。容 器は、ＰＢＳ中で４ＣＩ１１の深さになるまでアビジン被覆バイオゲルで充填さ れ、且つぜん動ポンプを介して出口チューブが螺着される。ゲルはＰＢＳプラス ５％ＢＳＡで平衡にさ托チューブからは予め空気を除去しておく。洗浄リザーバ には１０ｍ１のＰＢＳ力９す漏される。試料リザーバ内にはカルボキシル化され たゲル（１）２　ｍｌ）が沈澱さ札装置カラムが形成される。

Ｃ８分離容器の作動 上記項目Ａで調製された１５００万個のバフィーコート細胞の末梢血ｍφ〈試料 リザーバ内に添加される。細胞は０．１　ｍｌ／＋ｍｉｎの流量で装置を通して ポンプにより圧送され、リザーバは０．２ｍｌのＰＢＳプラス１％ＨＳＡで洗浄 される。試料リザーバから最後の洗浄液をポンプで圧送する前に、三方弁を回転 して試料リザーバからの流入を停止させ、洗浄液リザーバからのＰＢＳが装置を 通って流れることができるようにし、無特定細胞を除去する。容器が洗浄された 後、解放された細胞を収集チューブ内に洗い出すべくＰＢＳ溶液を流し続けなが ら、アビジン被覆ゲルを保有°しているチューブを手で１２回圧搾して粘着細胞 を除去する。

Ｄ、結果 ３００万個のＩａポジティブ細胞が結合さね−且つＦＡＣＳ分析により判定され た８９％の純度で装置から回収された。これは、最初の血液試料中のＩａポジテ ィブ細胞の７０％の収量であることを示している。トリバンブルーにより判定し た生存度は、分離操作により変化していなかった。

逸脱することなく種々の変更をなし得ることは理解されよう。従って、本発明は 、請求の範囲の記載以外には制限されるものではない。

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．流体が流入できる入口及び流体ガ流出できる出口を備えた容器を有しており 、該容器の少なくとも一部が可撓性を有しており、前記容器内に配置される結合 剤の床を更に有しており、前記結合剤は、この上に前記目標粒子が固定化される ようにして前記目標粒子と結合でき、前記床は、混合物が前記容器内に導入され るときに粒子が床を通って流れることを可能にする充分なサイズの間隙を有して おり、前記容器の可撓性部分は、適当な力が加えられたときに結合剤の相対移動 を生じさせることができ、該相対移動は、結合剤から目標粒子を除去するのに充 分なものであることを特徴とする目標粒子と非目標粒子とを含有する混合物から 目標粒子を分離する装置。
2. ２．前記入口及び出口が、前記容器の単一開口であることを特徴とする請求の範 囲第１項に記載の装置
3. ３．前記容器の全体が可撓性を有していることを特徴とする請求の範囲第１項に 記載の装置。
4. ４．前記容器内で前記結合剤を保持する手段を更に有していることを特徴とする 請求の範囲第１項に記載の装置。
5. ５．前記結合剤が多孔質であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置 。
6. ６．前記目標粒子が生物学的粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項に記 載の装置。
7. ７．前記目標粒子が親和力分離により前記混合物から分離されることを特徴とす る請求の範囲第６項に記載の装置。
8. ８．前記可撓性部分に３０ポンド（約１３．６ｋｇ）以下の力を加えたときに、 前記可撓性部分を破裂させることなく前記結合剤の１０％以上が排除されること を特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
9. ９．流体が流入できる入口及び流体が流出できる出口を備えた容器を有しており 、該容器の少なくとも一部が可撓性を有しており、前記容器内に配置される結合 剤の床を有しており、前記結合剤は、この上に前記目標粒子が固定化されるよう にして前記目標粒子と結合でき、前記床は、混合物が前記容器内に導入されると きに粒子が床を通って流れることを可能にする充分なサイズの間隙を有しており 、前記容器の可撓性部分は、適当な力が加えられたときに撓合剤の相対移動を生 じさせることができ、該相対移動は、結合剤から目標粒子を除去するのに充分な ものであり、前記結合剤の相対移動を生じさせるようにして前記可撓性部分を変 形させる変形手段を更に有しており、前記容器の可撓性部分を変形させることに より、前記目標粒子が前記結合剤から除去されることを特徴とする目標粒子と非 目標粒子とを含有する混合物から目標粒子を分離するシステム。
10. １０．前記入口及び出口が、前記容器の単一開口であることを特徴とする請求の 範囲第９項に記載のシステム。
11. １１．前記容器の全体が可撓性を有していることを特徴とする請求の範囲第９項 に記載のシステム。
12. １２．前記容器内で前記結合剤を保持する手段を更に有していることを特徴とす る請求の範囲第９項に記載のシステム。
13. １３．前記結合剤が多孔質であることを特徴とする請求の範囲第９項に記載のシ ステム。
14. １４．前記目標粒子が生物学的粒子であることを特徴とする請求の範囲第９項に 記載のシステム。
15. １５．前記目標粒子が親和力分離こより前記混合物から分離されることを特徴と する請求の範囲第９項に記載のシステム。
16. １６．前記可撓性部分に３０ポンド（約１３．６ｋｇ）以下の力を加えたときに 、前記可撓性部分を破裂させることなく前記結合剤の１０％以上が排除されるこ とを特徴とする請求の範囲第９項に記載のシステム。
17. １７．目標粒子と非目標粒子とを含有する混合物から目標粒子を分離する方法に おいて、 前記混合物と、容器内に配置された結合剤の床とを接触させる工程を有しており 、前記容器の少なくとも一部が可撓性を有しており、前記結合剤は、この上に前 記目標粒子が固定化されるようにして前記目標粒子と結合でき、前記床は、混合 物が前記容器内に導入されるときに粒子が床を通って流れることを可能にする充 分なサイズの間隙を有しており、前記容器の可撓性部分は、適当な力が加えられ たときに結合剤の相対移動を生じさせることができ、該相対移動は、結合剤から 目標粒子を除去するのに充分なものであり、前記容器から前記非目標粒子を除去 する工程と、前記結合剤の相対移動を生じさせて前記目標粒子を前記結合剤から 除去すべく、前記容器の可撓性部分に力を加えて該可撓性部分を変形させる工程 と、前記容器から前記目標粒子を回収する工程とを更に有していることを特徴と する目標粒子と非目標粒子とを含有する混合物から目標粒子を分離する方法。
18. １８．前記除去工程が、前記容器内に洗浄液を導入して、容器から非目標粒子を 洗い出すことであることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の方法。
19. １９．前記回収工程が、前記容器内に洗浄液を導入して、容器から目標粒子を洗 い出すことであることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の方法。
20. ２０．前記容器内での前記結合剤の位置が、前記結合剤を支持し且つ前記混合物 が通過できるスクリーンにより維持されることを特徴とする請求の範囲第１７項 に記載の方法。
21. ２１．前記目標粒子が生物学的粒子であることを特徴とする請求の範囲第１７項 に記載の方法。
22. ２２．前記目標粒子が親和力分離により前記混合物から分離されることを特徴と する請求の範囲第２１項に記載の方法。
23. ２３．前記可撓性部分に３０ポンド（約１３．６ｋｇ）以下の力を加えたときに 、前記可撓性部分を破裂させることなく前記結合剤の１０％以上が排除されるこ とを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の装置。
24. ２４．流体が流入できる入口及び流体が流出できる出口を備えた容器を有してお り、該容器の少なくとも一部が可撓性を有しており、前記容器内に配置される結 合剤の床を更に有しており、前記結合剤は、この上に前記目標粒子が固定化され るようにして前記目標粒子と結合でき、前記床は、混合物が前記容器内に導入さ れるときに粒子が床を通って流れることを可能にする充分なサイズの間隙を有し ており、前記容器の可撓性部分は、適当な力が加えられたときに結合剤の相対移 動を生じさせることができ、該相対移動は、結合剤から目標粒子を除去するのに 充分なものであることを特徴とする溶液から目標粒子を分離する装置。
25. ２５．溶液から目標粒子を分離する方法において、前記目標粒子を含有する前記 溶液と、容器内に配置された結合剤とを接触させる工程を有しており、前記容器 の少なくとも一部が可撓性を有しており、前記結合剤は、この上に前記目標粒子 が固定化されるようにして前記目標粒子と結合でき、前記床は、混合物が前記容 器内に導入されるときに粒子が床を通って流れることを可能にする充分なサイズ の間隙を有しており、前記容器の可撓性部分は、適当な力が加えられたときに結 合剤の相対移動を生じさせることができ、該相対移動は、前記目標粒子が前記結 合剤に結合されるように、該結合剤から目標粒子を除去するのに充分なものであ り、前記容器から前記溶液を除去する工程と、記結合剤の相対移動を生じさせて 前記目標粒子を前記結合剤から除去すべく、前記容器に力を加えて該容器を変形 させる工程と、前記容器から前記目標粒子を回収する工程とを更に有しているこ とを特徴とする容器から目標粒子を分離する方法。
26. ２６．流体が流入できる入口及び流体が流出できる出口を備えた容器を有してお り、該容器の少なくとも一部が可撓性を有しており、前記容器内に配置される多 孔質結合剤の床を更に有しており、前記結合剤は、この上に前記目標粒子が固定 化されるようにして前記目標粒子と結合でき、前記多孔質結合剤の空隙のサイズ は、混合物が前記容器内に導入されるときに粒子が床を通って流れることを可能 にする充分な大きさであり、前記容器の可撓性部分は、適当な力が加えられたと きに結合剤の相対移動を生じさせることができ、該相対移動は、結合剤から目標 粒子を除去するのに充分なものであることを特徴とする目標粒子と非目標粒子と を含有する混合物から目標粒子を分離する装置。