JPH06505275A

JPH06505275A - ヒト免疫不全ウイルスエンドヌクレアーゼ蛋白質由来ポリペプチド

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Publication number: JPH06505275A
Application number: JP50786292A
Authority: JP
Inventors: シオディー　フランセスカ
Original assignee: ジョンソン　アンド　ジョンソン
Priority date: 1991-03-15
Filing date: 1992-03-03
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2010-12-20
Also published as: FI934022A0; JPH07119235B2; CA2105664A1; AU1572592A; WO1992016219A1; DE69225473T2; ES2118131T3; US5229364A; EP0575522A4; US5401628A; EP0575522A1; AU671950B2; NO308855B1; NO933269L; DK0575522T3; EP0575522B1; CA2105664C; ATE166068T1; DE69225473D1; FI934022L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ＨＩＶ感染を顕示する抗ＨＩＶエンドヌクレアーゼ抗体の検出に役立つポリペプチドに関する。

背景ヒト免疫不全（ＨＩＶ）ゲノムによってコードされる抗原構造の同定は、ワクチンの開発および血清学試験のために必要である。いくつかの反応性の強い抗原部位が、ＨＩＶ−１およびＨｒＶ−２のｇａｇおよびｅｎｖがコードする蛋白質で同定された（８−１３）。トランスメンブラン蛋白質のＮＨｔ末端に位置する抗原配列（シーケンス）に由来するペプチドは、ＨＩＶの２つの聾に対する抗体の明確な分類を可能にしく１２Ｌ一方、２種の血清型間の交差反応性が、配列相同性を示すこれら領域に対して見出された（１２−１４）。しかしｇａｇおよびｅｎｖの交差反応領域に対する血清反応性はしばしば非常に低く、さらに、すべてのＨＩＶ−１抗体陽性血清が、交差反応性ペプチドを基にした血清学試験で調べたとき陽性を示すとはかぎらない。

レトロウィルスのライフサイクルの特色の１つは、プロウィルスＤＮＡの宿主染色体への挿入である。ウィルスゲノムのｐｏｌ遺伝子の３゛末端によりコードされる蛋白質は、エンドヌクレアーゼ活性を有することが示されたが（Ｉ）、これはＤＮＡ組み込みのために必要である。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）感染者の大半の血清は、血清学試験でエンドヌクレアーゼＰ３１と反応する（２−４）。

しかし、この蛋白のどの部分が抗体反応に対する標的となるのかは不明である。

発明の要約本発明は次の式のポリペプチドを含む：Ｘ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ− Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−８Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＬｅｒＡｌａ− Ｇｌ　ｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−２式中、ＢはＬｅｕまたはｌｉｅで、Ｘは１から２０個のアミノ酸残基またはアミノ末端基で、ＺはＩから２０個のアミノ酸残基またはカルボキシ末端基である。

本発明のポリペプチドまたは抗体（好ましくはユニットを構成するか）も含まれ、そのような組成物は、抗ＨＩＶエンドヌクレアーゼ抗体の検出に役立つ。

図面の簡単な説明図１は、選択されたＨＩＶ−１エンドヌクレアーゼペプチドに対するＨＩＶ感染および非感染者の血清の反応性を示す。３３検体のＨＩＶ−１抗体陽性血清（点付き四角）および１４のコントロール血清（白画角）を、ＨＩＶ−１エンドヌクレアーゼ蛋白質を表象するペプチド（６）を用いてＥＬＩＳＡて調へた。アミノ酸配列は、ＨＩＶ−１コンセンサス配列から得られ、図の下（横軸）に示しである。大文字はコンセンサスアミノ酸を示し、一方、小文字はより保存度の低いアミノ酸を示している。４９０ｎｍの吸収値は縦軸で示す。感染者の３血清はＣＤＣｌに（７）、１３血清はＣＤＣｌ　Ｉに、７血清はＣＤＣＩ　Ｉ　Ｉに、ｌＯ血清はＣＤＣＩＶに分類された。ＥｎｄＩＯにより表される領域より他の領域に対する反応性は非常に低かったので、図では選ばれた番号のペプチドの結果だけが示されている。

図２は、ＨＩＶ−１抗体陽性およびコントロール血清の１８グリシン（Ｇ）置換ペプチドのＥＮＤＩＯセットに対する反応性を示している。横線入り四角は、抗体陽性Ｉ３血清の平均光学密度を示す。垂直の線は検車偏差を表している。無傷のペプチドＥｎｄ　Ｉ　Ｏに対する平均反応性は、活性の１００％を示すために選ばわ、置換ペプチドに対する反応性は、これとの関係で表現されている。ＨＩＶしかし、免疫グロブリン結合の所望の機能的特性が当該ポリペプチドによって保持されるかぎり、“Ｄ型”異性体残基もまたいずれのし一アミノ酸残基にも置換できる。ＮＨ，は、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に存在する自由なアミノ基を指す。Ｃ０ＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。遊離ペプチドのアミノ末端ＮＨ，基およびカルボキシ末端Ｃ○ＯＨ基は、例によって式中に記載されていない。配列のアミノまたはカルボキシ末端のハイフンは、さらにアミノ酸残基配列または対応するＮＨ，もしくはＣ００Ｈ末端基が存在することを示している。標準的ポリペプチド命名法（Ｊ、　Ｂｉ。

対応表記号　アミノ酸Ｆ　Ｐｈｅ　フェニルアラニンＭ　Ｍｅｔ　メチオニンＡ　Ａｌａ　アラニンＳ　Ｓｅｒ　セリンＩ　Ｉｌｅ　イソロイシンＰ　Ｐｒｏ　プロリンＫ　Ｌｙｓ　リジンＨＨｉｓ　ヒスチジンＱ　Ｇｌｎ　グルタミンＥ　Ｇｌｕ　グルタミン酸Ｗ　Ｔｒｐ　トリプトファンＲＡｒｇ　アルギニンＤ　Ａｓｐ　アスパラギン酸Ｎ　Ａｓｎ　アスパラギンＣＣｙｓ　システィンすべてのアミノ酸残基配列は、その左から右への方向性がアミノ末端からカルボキシ末端への慣用的方向である式によって、本明細書中では示されているという点に留意されるべきである。

ポリペプチド：　これは、連続したアミノ酸残基のアルファアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸残基の直線状連続物である。

ペプチド：　ここで用いられているように、ポリペプチドとして互いに結合したアミノ酸残基が５０個未満の直線状連続体を指す。

蛋白質：　ペプチドとして互いに結合したアミノ酸残基が、５０個より多い直線状連続体を指す。

合成ペプチド：　ペプチド結合によって互いに連結された、化学的に製造されたアミノ酸残基の鎖を指すが、天然で得られる蛋白質およびそのフラグメントを含まない。

ヌクレオチド：　糖部分（ペントース）、燐酸（燐酸基）および窒素含有複素環基本体から成るＤＮＡまたはＲＮＡの単量体ユニット。この基本体は、グリコシドの炭素（ペントースの１′炭素）を介して糖部分に結合し、基本体と糖との連合体はヌクレオシドである。このヌクレオシドがペントースの３′　または５′ 位に結合した燐酸基を含むとき、ヌクレオチドと呼ばれる。機能的に連結されたヌクレオシド配列は、ここでは例によって“ヌクレオチド配列”と呼ばれ、その左から右への方向性が、５′末端から３′末端への慣用的方向である式で本明細書中では表されている。

Ｂ、ポリペプチド一具体例では、本発明は次の式によって表されるポリペプチドを含む：（Ｆｌ）　Ｘ、−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ− Ｐｈｅ−ＢＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ −Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｚ−Ｂは、ＬｅｕまたはＩＪｅのいずれかであるが、好ましくはＬｅｕである。ＸおよびＺは、それぞれアミノおよびカルボキシ末端基を表す。Ｘか存在するか否かは、その下付き文字ｎで示され、ｎはＯまたは１のいずれかで、ｎかＯのときＸは存在せず、ｎが１のときＸは存在する。同様に、ｍが０のときＺは存在せず、ｍが１のときＺは存在する。好ましくは、ｎ＝＝ｏでｍ＝１である。好ましくは、ｎ＝ｌでｍ＝０である。好ましくは、ｎ＝１でｍ＝１である。Ｘはアミノ末端ＮＨ１基でもよく、また、Ｘは１からおよそ２０個のアミノ酸残基績でもよいが、これはｎが１のときは存在するが、ｎが０のときは存在しない。Ｚはカルボキシ末端Ｃ００Ｈ基またはカルボキシ末端ＮＨ，基でもよい。また、Ｚは１からおよそ２０個のアミノ酸残基績でもよいが、これはｍが１のときは存在するが、ｍが００ときは存在しない。

Ｘは以下のアミノ酸残基配列の１つでもよい：（ａ）　ＮＨｔ−ＧＩＹ−ＴＹｒ −１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（ｂ）　ＮＨｔ−ＧＩＹ−ＴＹｒ−［１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−１１ｅ− Ｐｒ。

（ｃ）　ＮＨｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ− １１ｅ（ｄ）　ＮＨｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−［１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（ｅ　）　ＮＨｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ｆ　）　ＮＨ，−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（ｇ）　ＮＨｔ−Ｇｌｙ−ＴＹｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ（ｈ）　ＮＨｓ−ＧＩＹ−ＴＹｒ−［１ｅ（ｉ　）　ＮＨｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（Ｄ　ＮＨｔ−ＧｌｙＺは以下のアミノ酸残基配列の１つでもよい：（ａ　）　Ｔｈｒｌ　Ｉｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｔ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ＣＯＯＨ（ｂ　）　Ｔｈｒ　ｌ　１ｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（；１ｙ−Ｓｅｔ− Ａｓｎ−ＣＯＯＨ（ｃ　）　Ｔｈｒ−［１ｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ −Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＣＯＯＨ（ｄ　）　Ｔｈｒ−［１ｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ（ｅ　）　Ｔｈｒ−［１ｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ（ｆ　）　Ｔｈｒ　Ｉ　１ｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ −ＣＯＯＨ（ｇ）　Ｔｈｒ−［１ｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ（ｈ）　Ｔｈｒ −１ｉｅ−Ｈｉｓ−ＣＯＯＨ（ｉ）　Ｔｈｒ−１１ｅ−ＣＯＯＨ（Ｄ　Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ別の具体例では、本発明のポリペプチドは次の式をもつ：（Ｆ　２）　ＮＨ２− （Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ −１１ｅＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ− Ｖａｌ−Ｌｙｓ　）　ｔ　−ＣＯＯＨ式中、ＢはＩｌｅまたはＬｅｕのいずれかで、好ましくはＬｅｕである。ｐの値は、そのホモブロックポリマーが０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液中で溶解できるような整数である。好ましくは、ｐの値は２からおよそ６である。

好ましいポリペプチドはアミノ酸残基およそ３０個未満であり、さらに免疫的に活性な配列を含み、細胞付着活性を示し、その配列は次の式によって表される：（Ｆ３）　Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−ＧＩＹ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−ＴＹｒ −Ｐｈｅ−ＬｅｕＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ− Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓより好ましくは、次の式のポリペプチドである：（Ｆ４）　Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−［１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇ１．ｕ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃ１ｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｔ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ本発明のポリペプチドの各々は、ＨＩＶエンドヌクレアーゼ（ｐ３１）に免疫学的に類似する活性を育するという特色をもつ。

好ましい具体例では、本発明のポリペプチドは、固形マトリックス（例えばアガロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ニトロセルロース、ポリエステル、ガラス、合成樹脂、ラテックス、長鎖多糖類なと）に機能的に連結される。好ましくは、本発明のポリペプチドは、例えばマイクロリットル容量のプレートウェルのような診断用デバイスを形成する固形マトリックスに機能的に連結される。

本発明のポリペプチドには、そのポリペプチドがＨＩＶエンドヌクレアーゼ蛋白質ｐ３１によって誘発される抗体と免疫的に結合することかできるポリペプチドであるかぎり、そのアミノ酸残基配列が本明細書で示されているポリペプチドのいずれの類似体、フラグメントまたは化学的誘導体も含まれる。したがって、本発明のポリペプチドは、種々の変更、置換、挿入、および欠失にも付すことができ、その場合、そのような変化はそれらを使用するについて特定の利点を提供する。”類似体”という用語は、ここで具体的に示された配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列をもつ一切のポリペプチドを指すが、その場合１つまたは１つより多い残基が、機能的に類似の残基で保存的に置換されている。保存的置換の例は、１個の非極性（疎水性）残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニン）の他との置換、１個の極性（親水性）残基の他との置換（例えばアルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間）、１個の塩基性残基（例えばリジン、アルギニン、またはヒスチジン）と他との置換、または酸性残基（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸）と他との置換を含む。

“保存的置換”という語句は、また、本来の残基の場所に化学的に誘導した残基を使用することを含むが、ただし、そのようなポリペプチドが必要な結合活性を発揮するということを条件とする。

“化学的誘導体”とは、機能的側鎖基の反応によって化学的に誘導された１つまたは１つより多い残基をもつ本発明のポリペプチドを指す。そのような誘導分子には、例えば、自由なアミノ基が誘導さね、アミンヒドロクロリド、ｐ−トルエンスルフォニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基をその中で形成するような分子が含まれる。自由なカルボキシル基は、塩、メチルおよびエチルエステル、またはエステルもしくはヒドラジドの他のタイプを形成するために誘導することができる。自由なヒドロキシル基は、０−アシルまたは０−アルキル誘導体を形成するために誘導することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成するために誘導することができる。化学誘導体に含まれるものは、また、１つまたは１つより多い天然に得られるアミノ酸の、２０個の標準アミノ酸の誘導体を含むようなペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンに置換でき、５−ヒドロキシリジンはリジンに置換でき、３−メチルヒスチジンはヒスチジンに置換でき、ホモセリンはセリンに置換でき、さらに、オルニチンはリジンに置換できる。本発明のポリペプチドは、１つまたは１つより多い付加および／または欠失をもつか、またはその配列がここに示されているポリペプチドに関連した残基をもついずれのポリペプチドも含むが、ただし必須の結合活性が維持されていることを条件とする。“フラグメント“という用語は、そのアミノ酸残基配列がここに示されているポリペプチドのそれより短いアミノ酸残基配列をもついずれの本発明のポリペプチドも指す。

本発明のポリペプチドは、メリーフィールドが最初に記載した固相合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　Ａａ　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｅ、、　８５：２１４９− ２１５４（１９６３））によって製造できる。他のポリペプチド合成技術は、例えば、ボダンスキーらの″ペプチド合成″　（Ｍ、　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　、　Ｊｏｈｎ　１Ｖｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、第２版（１９７６））の他に当該技術分野で既知の参考文献で見出すことができる。ポリペプチド合成技術の要約は、“固相ペプチド合成”　（Ｊ、　５ｔｕａｒｔ　＆　Ｊ、　Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ピアースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ、第３版、Ｎｅｕｒａｔｈら纒、１０４−２３７ページ、アカデミツクプレス、ニューヨーク、ニューヨーク（１９７６））で見出すことができる。そのような合成に使用できる適切な保護基は、上記のテキスト、並びに、“有機化学の保護基”　（Ｊ、　Ｆ、　Ｗ、　ＭｃＯｍｉｅ。

Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、プレナムプレス、ニューヨーク、ニューヨーク（１９７３））で見出すことかできる。

一般には、これらの合成法は、１つまたは１つより多いアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基の、成長ポリペプチド鎖への連続付加を含む。普通には、最初のアミノ酸残基のアミノまたはカルボキシル基のいずれかか、適切な、選択的に除去できる保護基で保護される。種々の、選択的に除去できる保護基か、反応性側鎖基を含むアミノ酸（例えばリジン）のために利用できる。

例として固相合成法を用いて、保護アミノ酸または誘導アミノ酸は、その非保護カルボキシルまたはアミノ基を介して内部支持固体に結合させられる。その後、アミノまたはカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、さらに、適切に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基をもつ、当該配列の次のアミノ酸を混合し、固体支持体にすでに結合している残基とアミド結合を形成するために適した条件下で反応させる。続いてこのアミンまたはカルボキシル基の保護基を、新しく付加されたアミノ酸残基から除去し、その後、次のアミノ酸（適切に保護されている）を付加していく。すべての所望のアミノ酸が適切な配列で連結された後、−切の残存末端基および側鎖基の保護基（および固体支持体）を連続的に、または同時に除去し、最終的なポリペプチドを提供する。

本発明のポリペプチドは、Ｃ−末端アミド基をもっことができる。以下で述べる理由のために、Ｃ−末端アミド（例えば式ｐ２のベプチ１つは、通常、対応するＣ−末端酸よりもわずかに高い純度で合成できる。Ｃ−末端酸をもつペプチドは、通常、ＨＦ９２．５％／アニソール７．５％中で１時間で切断される。これは、“ＳＮど型反応を含むが、ここでアニソールはスカベンジャーとして用いられる。このタイプの反応の間、除去される側鎖保護基は遊離ベンジル型カルボカチオンを生じ、これは、アニソールスカベンジャーの代わりにこのペプチドの他の領域（すなわち、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ残基）と反応できる。これらの反応は、“ＳＮ２”型反応か切断に用いられる場合は、これらの反応は避けることができる。これは、タムの“低／高切断”方法（ＴａＩｌｌ’ｓ″ｌｏｗ／ｈｉｇｈ　ｃｌｅａｖａｇｅ″ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ、　［ｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔ、　Ｒｅｓ、、　２１：５７−６５．１９８３）を用いて行われる。ベンズヒドリルアミン樹脂（これはＣ−末端アミドを生成する）を用いて、この反応はより穏和な“ＳＮ２“型反応によって側鎖保護基を切断するが、該反応は、ペプチドからカベンジャーへの保護基の１分子移転（反応性カルボカチオン中間体を経由して）を含み、一方、樹脂に結合したペプチドは残存する（この切断方法は、Ｃ−末端酸の製造に用いられる非常に不安定な樹脂には用いることができない。）スカベンジャー副産物は、その後洗い流し、ペプチドは標準的な“ＳＮＩ“ 方法を用いて樹脂から切断する。これは、殆どのペプチドについて通常少なくとも５％高い純度をもたらし、時には、より長しペプチドまたは“困難な″残基を含むペプチドについては成功と失敗の分かれ道となる。

本発明のポリペプチドは、少なくとも１５個のアミノ酸残基および５０個までのアミノ酸残基、好ましくは２０−３５個のアミノ酸残基のＨＴＶエンドヌクレアーゼ由来セグメントを含んでいる。このポリペプチドは、付加的配列にＮ−末端およびＣ−末端のいずれか、またはその両方で結合させることができ、この場合、付加的配列は、長さで１から１００個のアミノ酸である。そのような付加的アミノ酸配列、またはリンカ−配列は、エンドヌクレアーゼアミノ酸残基配列とは異種であり、検出可能な標識、固体支持体または担体に簡単に固定できる。本発明のペプチドとともに用いることかできる標識、固体支持体および担体は、下記に述べる。連結に用いられる典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システィン、リジン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸なとである。好ましい連結残基は、カルボキシ末端システィンおよびリジン、並びにアミノ末端チロシンである。

本発明のいずれのポリペプチドも（下記に述べるキメラポリペプチドを含む）、医薬的に許容できる塩の形で用いることができる。本発明のポリペプチドと塩を形成することかできる適切な酸は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、クエン酸、チオシアン酸、硫酸、燐酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマール酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸なとを含む。

本発明のペプチドと塩を形成することができる適切な塩基は、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）および有機塩基（例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど）および場合によって置換されたエタノールアミン（例えばエタノールアミン、ジェタノールアミンなど）を含む。

さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを、ｐＨ緩衝剤、湿潤剤、抗酸化剤、還元剤、水性媒体などのうち１つまたは１つより多いものと組み合わせて含む組成物をも含み、そのような組成物は、ここに記載されているように使用するための水溶液として、または、水溶液を作るために復元できる乾燥組成物（例えば粉末）として製剤化される。

Ｃ，キメラポリペプチド本発明のキメラポリペプチドは、次の式により限定される少なくとも１つのペプチドセグメントの存在によって明示される：Ｇ　１ｕ−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｎ−Ｇ　１ｕ−Ｔｈｒ−Ａ　ｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＢＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ式中、ＢはｌｉｅまたはＬｅｕのいずれか、好ましくはＬｅｕで、ペプチド結合を介してＨＩＶエンドヌクレアーゼとは異種のペプチドセグメントに機能的に連結されている。

本発明のキメラポリペプチドのＨＩＶエンドヌクレアーゼ由来セグメントは、ポリペプチド鎖内で連続しているが、または互いに隣接していてもよい。それらか隣接している場合、該セグメントは、典型的にはおよそ５個がら手頃にはおよそ５０個の残基まで、好ましくはおよそ１５からおよそ３ｏ残基を含むスペーサーセグメントを形成するアミノ酸残基によって分断されている。本発明のキメラポリペプチドは、複数の同一エンドヌクレアーゼセグメントを含むことができる。

本発明のキメラポリペプチド内に３つまたは３つより多いエンドヌクレアーゼセグメントが隣接する場合、スペーサーセグメントは同一でも異なっていてもよい。

本発明のキメラポリペプチドは、さらに、１つから手頃なところではおよそ５０個、例えばおよそ５またはおよそ１０、典型的にはおよそ１５またはおよそ３０個のヘッドおよび／またはテールセグメントを、それぞれそのアミノまたはカルボキシ末端に含むことができる。その場合、そのようなセグメントは該ポリペプチドの作成または使用において好都合である。例えば、テールセグメントは、本発明のキメラポリペプチドを固形マトリクスに結合させるための手段を提供し、その場合、細胞内で発現されている間、該ポリペプチドの分泌を促進させるために都合よくリーダーセグメントとして使用することができる。

Ｄ、ＤＮＡおよび組み換えＤＮＡ分子生命体では、蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、該蛋白質をコードする遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と遺伝的コードを介して直接関連をもつ。したがって、遺伝子は、アミノ酸残基の配列、すなわち遺伝子かコードする蛋白質またはポリペプチドを限定することができる。

遺伝的コードに重要でよく知られた特色は、その重複性である。すなわち、蛋白質を作るために用いられるアミノ酸の殆どについて、１つより多いヌクレオチドトリブレットコード（コドン）か特定のアミノ酸残基をコードまたは指定する。

したがって、多（の異なるヌクレオチド配列が特定の１個のアミノ酸残基配列をコードすることができる。そのようなヌクレオチド配列は機能的に同等であると考えられる。なぜならば、それらは、すべての生物において同じアミノ酸残基配列の産生をもたらすことができるからである。時には、プリンまたはビリミジンのメチル化変種を与えられたヌクし／オチド配列に取り込ませることができる。

しかし、そのようなメチル化は、いずれの場合でもコーディング関係に影響を与えない。

本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明のキメラポリペプチドの遺伝子コード（すなわち発現か可能）を限定するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはセグメントを含む。好ましいＤＮＡセグメントは、次の式によって表される配列に対応するヌクレオチド塩基配列を有する：（Ｆ　５　）ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ｍ　ＣＴｒ　ＴｒＡ　ＡＡＡ　ｍ　ＧＣＡ　ＧＧＡＡＧＡ　ＴＧＧ　ＣＣＡ　ＧＴＡ　ＡＡＡ本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、化学的手技、例えばマツチラッチらのフォスホトリエステル法（Ｍａｔｔｅｕｅｃｉら、Ｊ、　ＡＩＬＣｈｅｍ、　Ｓａｃ、、　１０３：３１８５（１９８１））によって容易に合成できる。もちろん、コード配列を化学的に合成することによって、所望されるいずれの修飾も、その天然のアミノ酸残基配列をコードするものについて適切な塩基を置換することによって簡単に行うことができる。しかしながら、上に示した塩基配列の一部または全てと同一な塩基配列か好ましい。

本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子は、よく知られた方法を用いて、上記の供託プラスミドの各々からの適切な制限フラグメントを機能的に連結（ライゲート）することによって調製することができる。この方法で製造された本発明のＤＮＡ分子は、典型的には粘着末端、すなわち該分子の二本鎖部分を越えて伸びる“突出′　（“オーバーハンギング″）一本鎖部分をもつ。本発明のＤＮＡ分子」−に粘着末端が存在することが好ましい。本発明によってまた意図されるものは、上記のＤＮＡ分子のリボ核酸同等物である。

本発明はさらに組み換えＤＮＡ分子をも含み、これは、複製および／または発現のために本発明のＤＮＡ分子（すなわち、本発明のポリペプチドまたは本発明のキメラポリペプチドをコードする遺伝子を規定するＤＮＡ分子）に機能的に連結されたベクターを含む。

本明細書中で用いられているように、“ベクター”という用語は、細胞中で自律的に複製できるＤＮＡ分子を指し、それに別のＤＮＡセグメントが機能的に連結さね、それによって連結されたセグメントの複製を引き起こす。本発明のＤＮＡセグメントによって伝達される遺伝子の発現を支持することができるベクターは、ここでは“発現ベクター”と呼ぶ。したがって、組み換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）は、天然には通常−緒に見出されることがない、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。

本発明のＤＮＡセグメントが機能的に連結されるベクターの選択は、当該技術分野でよく知られているように、所望される機能的特性（例えば蛋白質発現）および形質転換される宿主細胞に直接依存し、これらは、組み換えＤＮＡ分子構築の技術に固有の制限である。しかし、本発明で意図されるベクターは、それが機能的に連結されているＤＮＡセグメントに含まれている本発明のキメラポリペプチドの少なくとも複製、さらに好ましくは発現をも指令することができる。

好ましい具体例では、本発明で意図されるベクターには、原核細胞ｌ／ブリコン、すなわち原核宿主細胞（例えば細菌宿主細胞）内の組み換えＤＮＡ分子の染色体外自律的複製および維持を指令する能力をもつＤＮＡ配列が含まれる。そのようなレプリコンは当該技術分野ではよく知られている。さらに、原核細胞レプリコンを含むこれら具体例には、その発現によって、それで形質転換（トランスフオーム）されたｌＨ菌宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子か含まれる。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子である。

原核細胞レプリコンを含むこれらベクターは、それで形質転換された細菌宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ、　ｅｏｌｉ））内の本発明のキメラポリペプチド遺伝子の発現を指令することができる原核細胞プロモーターもまた含むことができる。

プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を許すＤＮＡ配列によって形成される発現制御エレメントである。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントの挿入のために便利なｆａＪ限部位を含むプラスミドベクターにおいて典型的には提供される。そのようなベクタープラスミドの典型例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（バイオラドラボラトリ−（８ｉｏｒａｃｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リッチモンド、カリ７ｔルニア）から市販）、並びにｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（ファルマシア（ビス力タウエー、ニューシャーシー）から市販）である。真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは哺乳類細胞と適合するものは、本発明の組み換えＤＮＡ分子を生成するためにまた用いることかできる。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野においてよく知られており、いくつかの販売元から利用可能である。典型的には、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位を含んで提供される。そのようなベクターの典型例は、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ’−１０（ファルマソア）、ｐＢＰＶ−１ｐＭＬ２ｄ　（インターナショナルバイオテクノロジー社）およびｐＴＤＴｌ　（ＡＴＣＣ１＃３１．２５５）である。

好ましい具体例では、本発明の組み換えＤＮＡ分子を構築するために用いられる真核細胞発現ベクターは、真核細胞で有効な選別マーカー、好ましくは薬剤耐性選別マーカーを含む。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性を生じる遺伝子、すなわちネオマイシンフォスホトランスフェラーゼ（ｎｅＯ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ、　Ｍａｔ、＾ｐｐ１．　Ｇｅｎｅｔ７．１：３２７−３４１（１９８２））。

本発明のｒＤＮＡを生成するためにレトロウィルス発現ベクターを使用することも考えられている。ここで用いられているように、“レトロウィルス発現ベクター′という用語は、レトロウィルスゲノムのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に由来するプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を指す。

好ましい具体例では、発現ベクターは、典型的にはレトロウィルス発現ベクターで、これは好ましくは、真核細胞内で増殖不能である。レトロウィルスベクターの構築および使用は、ソーブらによって記載されている（Ｓｏｒｇｅら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１、　Ｂｉｏｌ、、　４：１７３０−３７（１９８４））。

相補的な粘着末端を介してベクターにＤＮＡを機能的に連結させる種々の方法か開発された。例えば、相補的なホモポリマートラクトを、挿入されるべきＤＮＡセグメントおよびベクターＤＮＡに付加することかできる。続いて、挿入されるセグメントおよびベクターＤＮＡに付加された相補的ホモポリマートラクト間の水素結合によってベクターおよびＤＮＡセグメントをつなぐ。続いて、ベクターおよびＤＮＡセグメントを、相補的ホモポリマーテール間で水素結合によってつなぎ、組み換えＤＮＡ分子を生成する。

１つまたは１つより多い制限部位を含む合成リンカ−は、ＤＮＡセグメントをベクターにつなぐまた別の方法を提供する。前に述べたようにエンドヌクレアーゼ制限消化で生成したＤＮＡセグメントを、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエのバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理する。この酵素は、その３’　−５ ’　エキソヌクレアーゼ活性により突出３′側一本鎖末端を除去し、さらにそのポリメラーゼ活性で引っ込んだ３゛末端を補填する。したがって、これらの活性の組み合わせは、平滑端をもつＤＮＡセグメントを生じる。平滑端セグメントは、非常に過剰モルのリンカ−分子と、平滑端ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる酵素（例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ）の存在下でインキュベートされる。したがって、反応生成物は、その末端にポリマーリンカ−配列をもつＤＮＡセグメントである。続いて、これらのＤＮＡセグメントは適切な制限酵素で切断され、このＤＮＡセグメントに適合しえる末端をつくる酵素で切断した発現ベクターに連結される。

種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ−は、インターナショナルバイオテクノロジー社にューヘブン、ＣＮ）を含む多数の販売元から市販されている。

また本発明に含まれるものは、上記の組み換えＤＮＡ分子のＲＮＡ同等物である。

本発明は、また本発明の組み換えＤＮＡ分子、好ましくは本発明のキメラポリペプチドを発現することができるｒＤＮＡで形質転換された宿主細胞にも関する。

この宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。細菌細胞は、好ましい原核宿主細胞であるが、典型的には天場菌株、例えば大腸菌ＤＨ５株（ベセスダリサーチラボラトリーズ社（ベセスダ、メリーランド）から入手可能）である。好ましい真核宿主細胞は酵母および哺乳類の細胞を含むが、好ましくはを椎動物細胞、例えばマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽細胞株からの細胞である。好ましい真核宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能）およびＮＩＨスイスマウス胎児細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能）が含まれる。本発明の組み換えＤＮＡ分子による適切な細胞宿主の形質転換は、既知の方法で達成されるが、これは用いるベクターに完全に依存する。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えばコーＬンら（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、　ＩＪＳん６９：２１１０（１９７２））およびマニアーティスら（ｍｎｉａｔｉｓら、分子クローニング、実験室指針（険小ｆ旦稙Ｊ−５椎動物細胞の形質転換に関しては、例えば、ソーツら（Ｓｏｒｇｅら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ形質転換が完成した細胞、すなわち本発明の組み換えＤＮＡ分子を含む細胞は、既知の技術で同定できる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入の結果得られた細胞をクローニングし、単クローンコロニーを得ることができる。これらのコロニーの細胞を採集し溶解して、例えばサザーンら（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８−５０３（１９７５））またはベレフトら（Ｂｅｒｅｎ　ｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ、　、　３：２０ｇ（１９８５））によって記載された方法を用いて、それらのＤＮＡ内容物を調べることができる。ｒＤＮＡの存在を直接調べることに加え、形質転換が完全に行われたか否かは、ｒＤＮＡか本発明のキメラポリペプチドの発現指令することができる場合に、既知の免疫的方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターで完全に形質転換された細胞は、ＨＩＶエンドヌクレアーゼポリペプチドの抗原性を示す蛋白質を生成する。形質転換されていると思われる細胞サンプルを採集し、このペプチドセグメントに対して特異的な抗ポリペプチド抗体を用いて、ＨＩＶエンドヌクレアーゼ抗原性の存在について調べる。

したがって、形質転換された宿主細胞自体に加え、本発明はまた、栄養培地中のこれらの細胞の培養、好ましくは単クローン（コロニーとして同質）培養、または単クローン由来培養をも含む。好ましくは、この培養は、またＨＩＶエンドヌクレアーゼと免疫的に交差反応性を示す蛋白質を含む。

形質転換された宿主細胞の培養に育用な栄養培地は、当該技術分野において既知で、いくつかの市販光から入手できる。宿主細胞か哺乳類である具体例では、“ 血清非含有°培地を用いるのが好ましい。

Ｅ、接種別の具体例では、本発明のポリペプチド、好ましくは式Ｆ１に対応するペプチドは、接種物を作成するために医薬的に許容できる水性希′ｌｔ物ど；１．”「用いられる。これは、有効量で役、すするどき、ＨＩＶエンドヌクレアーゼと免疫的に反応する抗体を誘発させることができる。

“接種物“という用語は、本明細書では、本発明のポリペプチドを活性成分として含む、インテグリンベータサブユニットに対する抗体の生成のために使用される組成物を指すために用いられる。

抗体を誘発するためにポリペプチドが用いられる場合、当該ポリペプチドは単独で用いるか、または兵役体として（またはポリペプチドポリマーとして）担体に結合させることができることは理解されるところであるが、表現の容易さのために、本発明のポリペプチドの種々の具体例では、共通して“ポリペプチド”（その種々の文法的形態を含む）という用語で本明細書では呼」ζ既に記載したように、１つまたは１つより多い付加的アミノ酸残基が、該ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に付加して、担体へのポリペプチドの結合を補助することができる。ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に付加されたシスティン残基は、ＳＳ結合を介して共役体を形成するために特に育用であることが分かった。しかし、兵役体を調製するために当該技術分野で既知の方法もまた用いることができる。付加連結方法の例には、ミカエル付加反応生成物、ゲルタールアルデヒドなどのジアルデヒド（Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、。

１４７、３１８−３２６（１９８３））の使用、または担体にアミド結合を形成するために水溶性カルボジイミドを使用するようなカルボジイミド技術の使用が含まれる。活性化官能基を介する蛋白質共役またはカップリングについての論評のためには、例えば、オーラメアスら（Ａｕｒａｍｅａｓら、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　［ａｎｕｎｏｌ、、　８巻補充７：７−２３（＋９７８））を参照できる。

育用な担体は当該技術分野において既知で、一般には蛋白質それ自体である。

そのような担体の見本例は、キーホールリンベットのヘモシアニン（ＫＬＨ）、エデスチン、サイログロブリン、アルブミン（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ））　、赤血球細胞（例えばヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）　）、破傷風トキソイド、コレラトキソイドの他、ポリアミノ酸（例えばポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸））なとである。

担体の選択は、接種物の最終的な使用により左右され、本発明に特に関係がない基準を基にしている。例えば、接種される特定の動物に不利な反応を生じない担体が選択されるべきである。

本接種物は、有効な、免疫発生量の本発明のポリペプチドを、典型的には担体に結合させた共役物として含む。単位用量当たりの該ポリペプチドまたは蛋白質の有効量は、当該技術分野で知られているように、とりわけ接種される動物種、動物の体重、選択される接種方法に依存する。典型的には接種物は、単位接種（単位用量）当たり、およそＩＯマイクログラムからおよそ５００ミリグラム、好ましくはおよそ５０マイクａグラムからおよそ５０ミリグラムの濃度のポリペプチドまたは蛋白質を含む。

本発明の接種物に付属する、“単位用量”という用語は、動物のための単位用量として適切な、物理的に明確に限定された単位を指し、各単位は、所望の希釈剤（すなわち担体または賦形剤）を含めて所望の免疫原的効果をもたらすように計算され予め定められた量の活性物質を含む。本発明の接種物の新規な単位用量の細目は、（ａ）活性物質の固有の特性および達成される特定の免疫学的効果並びに（ｂ）動物の免疫に使用するためにそのような活性物質を調合する場合の当該技術分野においてつきものの制限（これらは、本明細書に詳細に開示されている通りで、本発明の特徴である）によって決定され、さらにそれらに直接左右される。

接種物は、典型的には、乾燥固体ポリペプチド−共役物から、該ポリペプチド− 共役物を生理的に耐えられる（許容できる）希釈剤または賦形剤（例えば水、食塩水または燐酸緩衝食塩水）中に懸濁し、水性組成物を生成することによって製造できる。そのような希釈剤は、当該技術分野において既知で、例えば“レミントンの薬科学”　（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｅａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　１６版、マックパブリッシングカンパニー、イーストン、ペンシルバニア（１９８０）、１４６５−１４６７ページ）で論じられている。

接種物は、希釈剤の１部分としてアジュバントもまた含むことができる。フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）　、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）およびミョウバンは、当該技術分野において既知で、いくつかの販売元から本発明の抗体は、多クローンまたは単クローン性にかかわらず、ＨＩＶエンドヌクレアーゼおよび式Ｆ１のペプチドと免疫反応を生じる。この抗体は、式Ｆ４によって表されるペプチドとは免疫反応を起こさない。

“抗体”という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子）を指すために本明細書では用いられる。典型的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子および、パラトープを含む免疫グロブリン分子の部分（当該技術分野でＦａｂ、Ｆａｂ’　、Ｆ　（ａｂ’）ｔおよびＦ　（ｖ）として知られている部分を含む）である。

“抗体結合部位″とは、重鎖および軽鎖可変領域並びに特異的に抗原と結合する（免疫反応を起こす）高度可変領域を含む抗体の構造部分のことである。“免疫反応°という用語は、抗原決定基を含む分子と抗体結合部位を含む分子（例えば完全抗体分子またはその部分）との間の結合を意味する。

“抗原決定基”は、抗体結合部位によって免疫的に結合させられる抗原の実際の構造部分を指す。この用語はまた、“エピトープ′という用語と相互に用いられる。

１、多クローン抗体本発明の多クローン抗体は、本発明のポリペプチド、好ましくはアミノ酸残基配列において弐Ｆ１と対応するポリペプチドと免疫反応を起こす。本発明の多クローン抗体は、さらに、弐Ｆ４のアミノ酸残基配列をもつポリペプチドとは実質的に免疫反応を生じないとみなされる。

好ましい多クローン抗体は、ＨＩＶエンドヌクレアーゼと免疫反応を起こす能力を育するとみなされる。

本発明の多クローン抗体は、典型的には、本発明の接種物、好ましくは式Ｉに対応するペプチドを含む接種物で哺乳類を免疫し、それによって適切なポリベブチド免疫特異性をも一つ哺乳類の抗体分子を誘発１イ）ことによ−）で調製される５、続いＣ抗体分子・は当該哺乳類から集めらオ］、さｌ；）に、既知の技術、例スば固相に免疫ポリペプチドを用いたイムノ゛ｒノイニティーによって所望の程度に分離される。

そのようにして調、製された多クローン抗体は、特にＨＩＶ感染を同定するために本発明の診断方法およびシステムにおいて用いることができる。

２、単クローン抗体本発明の単クローン抗体は、弐Ｆｌによって表されるアミノ酸残基配列によって形成されるエピトープと免疫反応を生じるとみなされる。さらに好ましくは、本発明の単クローン抗体は、式Ｆ４によって表されるアミノ酸残基配列と対応するポリペプチドとは免疫反応を生じないとみなされる。

好ましい単クローン抗体は、またＨＩＶエンドヌクレアーゼと免疫反応を起こす能力を有するとみなされる。

“単クローン抗体″という語句は、特定の抗原と免疫反応を起こすことができる、ただ１種の抗体結合部位を含む抗体分子の集団を指す。したがって、単クローン抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応を起こす抗原に対して単一の結合親和性をもつ。単クローン抗体組成物は、したがって、複数の抗体結合部位をもつ抗体分子、各々は異なる抗原に対して免疫特異的、例えば二特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）単クローン抗体を含むかもしれない。

単クローン抗体は、典型的には、ただ１種の抗体分子を分泌（産生）するハイブリドーマと呼ばれる単一細胞クローンによって産生される抗体から成る。ハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞とミエローマまたは他の永続可能株細胞とを融合させることによってつくられる。そのような抗体は、最初コーラ−とミルシュタインによって記載された（Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５６：４９５−４９７（＋９７５））（この文献の内容は引用として含まれている）。

３、単クローン抗体の製造方法本発明は、弐Ｆ１のポリペプチドと免疫反応を起こすが、式Ｆ４のペプチドとは免疫反応を起こさない単クローン抗体の生成方法を含む。この方法は、次の工程を含む：（ａ）動物を、本発明のポリペプチド、好ましくは弐Ｆｌのペプチドで免疫する。これは９、典型的には免疫学的に在勤な員（すなわち免疫反応を生（２るために４−分なｊｌ）の免疫原を免疫学的に能力のある動物に投与する。−とによって達成される６、好ましくは、該哺乳類はげっ歯頚（例えばウサギ、ラットまたはマウス）である。続いてこの哺乳類か、免疫原と免疫反応を起こす抗体分子を分泌する細胞を産生ずるのに十分な期間、この哺乳類を維持する。

（ｂ）それから免疫された哺乳類から取り出した抗体産生細胞の浮遊液を１１１１Ｊ。

する。これは、典型的には該哺乳類の膵臓を取り出し、当該技術分野で既知の方法を用いて、個々の膵臓細胞を生理的に耐えつる培養液中で機械的に分離することによって実施される。

（Ｃ）抗体産生細胞浮遊液を形質転換（永続性）細胞株を生成することができる形質転換剤で処理する。形質転換剤および永続細胞株を製造するためのそれらの使用は、当該技術分野で既知であり、それらには、エプスタインバーウィルス、シミアンウィルス４０、ポリオーマウィルスなどのＤＮＡウィルス、モロニーネズミ白血病ウィルス、ラウス肉腫ウィルスなどのＲＮＡウィルス、ミエローマ細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３　、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４など）が含まれる。

好ましい具体例では、形質転換剤での処理は、適切な融合促進剤を用いて適切な細胞株由来マウスミエローマ細胞で浮遊膵臓細胞を融合させることによってハイブリドーマ産生をもたらす。好ましい比率は、ミエローマ細胞１個にっき膵臓細胞はおよそ５個である。全容量はおよそ膵臓細胞１０”個である。用いられる細胞株は、好ましくは、いわゆる″薬剤耐性”型で、それによって非融合ミエローマ細胞は選択培地中で生存することができず、一方、ハイブリッドは生存できる。最も普遍的な種類は、８−アザグアニン耐性細胞株で、これはヒボキサンチングアニンフすスホリボシルトランスフェラーゼ酵素を欠き、したがって、ＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地によって維持されない。また、用いられるミエローマ細胞株が、それ劇身いずれの抗体も産生じていない“非分泌“望あることも一般に望ましいが、分泌型も用いることができる。

ある場合には、しかしながら、分泌ミエローマ株が好ましい。好ましい融合促進剤は、平均分子量がおよそ１０００からおよそ４０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ１００Ｏなどのように市販されている）であるが、当該技術分野で既知の融合促進剤も用いることができる。

好ましくは、ペプチドＦ４とは反応しないものを識別するためにさらにスクリー抗体を回収する。適切な培養液および適切な培養期間は既知でもあり、また容易形成させ、これにより宿主マウスの血流および腹腔滲出物（腹水）中に高濃度（およそ５−２０ｍｇ／ｍ１）の所望抗体を生じるであろう。

これらの組成物の調製のために有用な培地は、当該技術分野で既知で、市販も（Ｄｕｌｂｅｃｃｏら、Ｖｉｒｏｌ、、　８：３９６（１９５９））で、４．５ｇ／ｌのグルコース、２０ｍｍのグルタミンおよび２０％のウシ胎児血清が補充されている。同系交配マウス株の典型例はＢａ１ｂ／ｃである。

本発明の単クローン抗体は、抗体が免疫反応を起こす本発明ののポリペプチドを固相中で用いる既知のイムノアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製することができる。

上記の方法で製造される単クローン抗体は、例えば、診断および治療のために用いることかできるが、この場合、ＨＩＶエンドヌクレアーゼ含有免疫反応生成物が生成されることが望ましい。

Ｇ、ハイブリドーマおよび製造方法本発明のハイブリドーマは、本発明の単クローン抗体を産生する能力を有するとみなされるものである。

所望の免疫特異性を有する、すなわち特定の蛋白質、特定蛋白質上の識別可能なエピトープおよび／またはポリペプチドと免疫反応を起こす能力を存する抗体分子を産生ずる（分泌する）ハイブリドーマを製造する方法は、当該技術分野で既知である。特に利用できるものは、ナイマンら（Ｎｉｍｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０：４９４９−４９５３０９８３））およびガルファーら（Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、。

７３：３−４６（１９８１））によって記載されたハイブリドーマ技術である。

これらの内容は、本明細書に参考文献として含まれている。

Ｈ，アッセ一方法当業者は、種々の非均質および均質方法、競合または非競合性免疫アッセー（ここで利用されてもいる）が存在することは理解しえよ九例えば、有用な固相アッセーは、実施例２で具体的に考察されるＥＬ４ＳＡの他に、酵素増幅免疫アッセー法（ＥＭＩＴ）および蛍光免疫アッセー（ＦＩＡ）を含む。しかし、本発明のポリペプチドと抗体との反応により付与されるシグナルを生じる一切の方法が含まれる。これらアッセー法の各々は、単一または二重抗体技術を採用することかでき、その場合は、免疫反応を示すための表示手段が用いられ、それによってアッセーされるべき抗体と本発明のポリペプチドとの結合が示される。典型的な手技はＳ　″酵素免疫アツセー”　（Ｍａｇｇｉｏ、　Ｅｎｘｙｌ！１ｅ［ｍｎｏａｓｓａｙ、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ。

クリーブランド、オハイオ（１９８１））および“蛍光抗体法”　（ＧｏｌｄｎＩａｎ、　ＦｌｕｏｒｅｓｅｅｎｔＡｎｔｉｂｏｄｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、アカデミツクプレス、ニューヨーク、ニューヨーク（１９８０））でみいだされる。

管腔液サンプルが本アッセー法において用いられる。好ましくは体液サンプルは、既知量の血液または血液由来生成物（例えば血清または血漿）として提供されるが、尿、唾液、膣分泌物または脳を髄液（ＣＳＦ）もまた使用できる。

ここに含まれるアッセ一方法の１つは、管腔液サンプル中の抗ＨＩＶエンドヌクレアーゼ抗体の存在、好ましくはその量を決定する。この方法は以下の工程を含む・（ａ）管腔液サンプルを本発明のポリペプチドと混合し、免疫反応混合物をつくる。ポリペプチドは、好ましくは、免疫反応混合物が液相および固相の両方をもつように固体支持体に機能的に結合されている。

（ｂ）該免疫反応混合物をしばらく、典型的には予め定めた時間、生物学的アッセー条件下で維持し、固相にポリペプチド含有免疫反応生成物を十分に生成させる。非均質アッセ一様式では、維持時間後、反応物は通常、典型的には洗浄して固相を保持することによって分離される。

生物学的アッセー条件とは、本発明の免疫化学試薬およびアツセーされるべき抗原の活性を保持できるような条件である。このような条件には、およそ４°Ｃからおよそ４５℃の間の温度、およそ５からおよそ９の間のｐＨ１さらに、蒸留水のイオン強度からおよそ１モルの塩化ナトリウムのそれの間のイオン強度が含まれる。そのような条件の最適化方法は当該技術分野で既知である。

（ｅ）工程（ｂ）で形成された免疫反応生成物の存在、好ましくはその量、さらにそれによって、抗ＨＩＶエンドヌクレアーゼ抗体の管腔液サンプル中の存在またはその量を続いて決定する。

上記方法の好ましい具体例では、免疫反応生成物の量は、以下の（ｉ）−１ｉｉ＋）によって工程（Ｃ）にしたがい決定される。

（ｉ）ポリペプチド含有免疫反応生成物に結合することができる標識された特異的結合試薬を混合し、標識反応混合物をつくる；（ｉ　ｉ）標識された特異的結合試薬がポリペプチド含有免疫反応生成物に結合し、標識複合体を形成するために十分な時間、生物学的アッセー条件下で該標識反応混合物を維持する；（ｉｉｉ）形成された一切の標識複合体の存在または量をめ、それによって、抗ＨＩＶエンドヌクレアーゼ抗体含有免疫反応生成物の存在または量を検出する。

特に好ましい具体例では、標識された特異的結合試薬は、標識抗ＩｇＧである。

また別の具体例では、管腔液サンプルは、標識または非標識である本発明のポリペプチドで免疫反応を起こさせる。典型的には、非標識ポリペプチドは、固体マトリクスに結合させる。抗ＨＩＶエンドヌクレアーゼ抗体の一方の腕は、固相ポリペプチドに結合し、当該抗体のもう一方の腕は、標識ポリペプチドに結合し、それによって固相標識免疫反応生成物を形成するであろ九標識および非標識ポリペプチドとの免疫反応は、実質的に同時に、すなわち同一混合物中でまたは連続的に実施できる。

別の具体例では、本発明のポリペプチドと本発明の抗ポリペプチド抗体および管腔液サンプルとで免疫反応を起こさせる。好ましくは、該ポリペプチドは、固体支持体に固定さ札抗ポリペプチド抗体は標識される。また別に、抗ポリペプチド抗体は固体支持体に固定さね、ポリペプチドが標識される。いずれの場合にも、標識固相免疫反応生成物が形成され〜それが抗ＨＩＶエンドヌクレアーゼ抗体の存在および／または量を表示する。

好ましくは、固相支持体の表面の非特異的蛋白質結合部位はブロックされる。

したがって、固相結合ポリペプチドは、吸着または他の既知の結合手段によって固体マトリクスに結合される。その後、蛋白質水溶液（この蛋白質水溶液は、該アッセーとの干渉物、例えばウシ、ウマまたは他の血清アルブミン（これらはまたＨＩＶエンドヌクレアーゼに関する夾雑物を含まない）を含まない）は固相と混合さね、ポリペプチド食前固体支持体の表面で、単クローン抗体分子か占領していない表面の蛋白質結合部位で混合された蛋白質に吸着される。

典型的な蛋白質水溶液は、ｐＨ７，１−７，５のＰＢＳ中に、およそ３からおよそ１０重量％のウシ血清アルブミンを含む。この蛋白質水溶液一固体支持体混合物は、典型的には、３７°Ｃで少なくとも１時間維持され、その後、生じた固相から未結合蛋白質は洗浄除去される。

管腔液サンプルは、すでに述べたように血漿または血清でもよい。サンブノしは、好ましくはおよそ１１０からおよそ１　：５０００に、より好ましくはおよそｌ・ＩＯに希釈される。

１、診断システム本発明はまた、前述のアッセ一方法を実施するときに用いることができる診断システム、典型的にはキット形式のシステムを含む。当該システｌ、は、別包装の免疫化学試薬として本発明のポリペプチドを少なくとも１ア・ソセーに十分な量で含む。包装試薬の使用指示書もまた、例によって含まれる。

１具体例では、キット形式の診断システムは、固体支持体、例えば本発明のポリペプチドを少なくとも１つのアツセーを実施するために十分な量で結合させたマイクロタイタープレート（機能的に該固体支持体に結合されている）を含む支持固体を含む。

好ましい具体例では、上記の診断システムは、別包装の試薬として第二の抗体、表示抗体をさらに含むか、この抗体は、ヒトＩｇＧと免疫反応を生じる抗体分子を含んでいる。該システムは、競合ＥＬＩＳＡ様式で使用する本発明の抗ポリペプチド抗体を、別包製試薬としてさらに含んでいる。

好ましくは、標識か酵素の場合、診断システムは、１つまたは１より多い下記のものをさらに含んでいる：（ｉ）既知の濃度の過酸化水素供給源；　（ｉ　１）ＯＰＤのような可視化用酸化的染色前駆体；（ｉｉｉ）着色反応を止める停止剤溶液、例えば４Ｎ硫酸：（ｉｖ）アッセーに使用する１種または１種より多い緩衝液（乾燥または液体形）：　（ｖ）標準リファレンスカーブ調製用物質。

本明細書で用いられているように、“包装”という用語は、固体マトリクスまたは物質、例えばガラス、プラスチック、紙、金属箔なと固定範囲内に本発明のポリペプチド、多クローン抗体または単クローン抗体を保持できるものを指す。

したがって、例えば包装は、ミリグラム量の意図されたポリペプチドを入れるために用いられるガラス製バイアルでもよ（、また、マイクログラム量の意図されたポリペプチドが機能的に固定された（すなわち抗体が免疫学的に結合できるように結合されている）マイクロタイターウェルでもよい。

“使用指示書”は、例によって、試薬の濃度、または少なくとも１つのアツセ一方法のパラメーター（例えば混合されるべき試薬およびサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の維持時間、温度、緩衝液条件など）を説明する重要な記載を含んでいる。

好ましい具体例では、本発明の診断システムは、さらに本発明のポリペプチドまたは抗体分子を含む複合体形成をシグナル化することができる標識または表示手段もまた含んでいる。

ここで用いられている“複合体′という言葉は、特異的結合反応、例えば抗体／抗原またはレセプター／リガンド反応の生成物を指す。典型的な複合体は、免疫反応生成物である。

ここで用いられているように、“ｍａ”および“表示手段”は、複合体の存在を示す、検出可能なシグナルの生成に直接または間接的に関係する単一原子および分子を指す。いずれの標識または表示手段も、発現蛋白質、ポリペプチド、または本発明の抗体もしくは単クローン抗体組成物の一部分である抗体分子に結合させ、もしくは取り込ませることができるが、また別々に用いることもできる。

さらに、これら原子もしくは分子は。単独でもまたは添加試薬との共役物としても用いることができる。そのような標識は、臨床診断化学においてそれ自体よく知られているが、それらが新規な蛋白質、方法および／またはシステムとして用いられる場合に限って、本発明の一部分を構成する。

標識手段は、化学的に抗体または抗原にそれらを変成させることなく結合し、青用な免疫蛍光トレーサーである蛍光クロム（色素剤）を形成する蛍光標識剤でもよい。適切な蛍光標識剤は、蛍光クロム、例えばフルオリセインイソシアネー）（ＦＩＣ）、フルオリセインイソチオシアネート（Ｆ　ＩＴＣ）、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルフォニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）　、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルフオニルクロリド（ＲＢ２００ＳＣ）などである。免疫蛍光分析技術は、デル力の“免疫蛍光分析”　（ＤｅＬＵｃａ、“Ｉａｎｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ”、　”手段としての抗体“、（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｓ　ａ　Ｔｏｏｌ”）、　Ｉｍｒｃｈａｌｏｎｉｓ！Ｉ、ジヲンウイリー＆サンズ社、１８９−２３１ページ（１９８２））で見出すことができるが、本明細書に参考文献として含まれている。

好ましい具体例では、表示団は酵Ｉｇ（例えばホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）　、グルコースオキシダーゼなどである。第一の表示団がＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼのような酵素である場合、１／セプター／リガンド複合体が（免疫反応物）が形成された事実を可視化する付加試薬が必要になる。ＨＲＰのためのそのような付加試薬は、過酸化水素および酸化色素剤前駆体（例えばジアミノベンジジン）を含む。グルコースオキシダーゼについて有用な付加試薬は、　２．　２’　−アジノージ（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ− スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。

放射性元素もまた有用な標識剤で、本明１では実例として用いられている。

典型的な放射性標識剤は、ガンマ線を放射する放射性元素である。それ自体ガンマ線を放射する元素、例えば＋１４）、ｌｔＪ、１１８１．ＢＪＳｌｌ（：ｒは、ガンマ線放射性元素表示群に属する種類の代表である。特に好ましいものは＋ａｓＩである。

有用な標識手段の別のグループは、”０％　”Ｆ％　”ＯおよびＮ”で、これらはそれ自体陽電子を放射する。そのように放射される陽電子は、動物の体に存在する電子に遭遇するとガンマ線を放射する。また有用なものは、”’　Ｉｎまたは２Ｈのようなベータ線を放出するものである。

標識物質の連結、すなわちポリペプチドおよび蛋白質の標識は、当該技術分野で既知である。例えば、ハイブリドーマによって産生される抗体分子は、培養液中の成分として与えられた放射性同位体含有アミノ酸の代謝的取り込みによって標識できる。例えば、ガルファーらの文献（Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈ、εｎｚｙｍｏ１．．７３：３−４６（１９８１））を参照できる。活性化官能基を介する蛋白質の共役またはカプリングの技術は特に利用できる。例えば、オーラメアスらの文献ＣＡｕｒａｒｒ１ｆＡ５ら、５ｃａｎｄ、　Ｊ。

きる。“特異的結合剤”とは、本発明の試薬物質またはそのような物質を含む複合体と結合する分子であるが、しかし、それ自体は本発明のポリペプチドまたは抗体分子組成物ではない。典型的な特異的結合剤は、第二の抗体分子、補体蛋白質もしくはそのフラグメント、スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ぶどう球菌）蛋白質Ａなどである。好ましくは、この特異的結合剤は、該試薬物質が複合体の一部どして存在するとき、該試薬物質と結合する。

好ましい具体例では、特異的結合剤は標識される。しかし、、診断システムが標識されていない特異的結合剤を含む場合、該結合剤は、典型的には増幅手段または試薬として用いられる。これらの具体例では、標識特異的結合剤は、増幅手段が試薬物質含有複合体と結合するとき、該増幅手段と特異的に結合することができる。

本発明の診断キラ）・は、管腔液サンプル（例えば血液、血清または血漿）中のアポＥの量を検出するために“ＥＬＩＳＡ“様式で用いることができる。“ＥＬ、ＩＳＡ″とは、固相に結合した抗体または抗原および酵素／抗原または酵素／抗体共役物を、サンプル中に存在する抗原量を検出および定量するために用いる酵素結合免疫吸着アッセーを指す。ＥＬＩＳＡ技術の記載は、“基礎および臨床免疫学”（Ｄ、　Ｐ、　５ｉｔｅｓら、Ｂａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１版、第２２章、Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＬｏｓＡ１ｔｏｓ出版、カリフォルニア（１９８２））並びに米国特許第３６５４０９０号、３８５０７５２号および４０１６０４３号に見出される。これらは、すべて本ＦＩＡＩＩＢ書に参考文献として含まれている。

試薬は、典型的には、水性媒体から吸着によって固体マトリクスに固定されるが、当該技術分野で既知の、蛋白質およびポリペプチドに応用できる他の固定態様も用いることができる。

したがって、好ましい具体例では、本発明のポリペプチドまたは抗ポリペプチド抗体分子は、固体マトリクスに固定ざ１本発明の診断システムの包装を含む固体支持体を形成することができる。

有用な固体マトリクスは、それに固定された試薬を含む固体支持体を調製するために当該技術分野において既知である。そのような物質は水に不溶性で、ファルマシアファインケミカルズ（ビス力タウエー、ニューシャーシー）から商標５ＥＰＨＡＤＥＸとして市販されている架橋デキストラン；アガロース：直径およそ１ミクロンからおよそ５ミリメートルのポリスチレンビーズ（アボットラボラトリーズ（ノースジカゴ、イリノイ）から市販）；塩化ポリビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンをヘースにした織物、例えばシート状、小片状、へら状のもの二または管、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェル、例えばポリスチレンもしくはポリビニルクロリドでつくられたものを含む。

本明細書に記載されたしずれの診断システムの試薬物質、標識特異結合剤または増幅試薬は、溶液（例えば液体懸濁物として、または実質的に乾燥粉末（例えば凍結乾燥形で）として）で提供することができる。表示手段が酵素の場合、該酵素の基質は、またシステムの別包装として提供することができる。例えば前記のマイクロタイタープレートのような固体支持体および１つまたは１つより多い緩衝液もまた、この診断アッセーシステムに別包製成分として含むことができる。

診断システムに関連してここで考察した包装材は、診断システムにおいて通常用いられるようなものである。そのような材料には、ガラスおよびプラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）瓶、バイアル、プラスチックおよび薄層プラスチック封筒などが含まれる。

！換型以下の実施例は説明のためで、本発明を制限するためではない。

１、ペプチド合成ＨＩＶ−１エンドヌクレアーゼ蛋白質の抗原部位の発生および位置の決定のために、全エンドヌクレアーゼ配列をカバーする２８本の線状ペプチドを調製した。

これらのペプチドのＥＬＩＳＡでの反応性を、ＨＩＶ感染が証明された個々人のヒト血清を用いて調べた。該配列は、ＨＩＶ−１ｐｏｌコンセンサス配列（６）に由来し、各ペプチドは、１０個のオーバーラツプ配列をもつ２０個のアミノ酸残基から成る。ペプチドＥｎｄｌ（該蛋白質のアミノ末端を表す）は、ＨＩＶ− １コンセンサスｐｏｌ配列の５７４位でロイシンで始まる。ペプチドＥｎｄ２８（該シリーズの末端）は、この蛋白質のＣ０ＯＨ末端をカバーし、８０９位でアスパラギン酸残基で終わる。

血清学的アッセーで用いられるペプチドは、ホーテンら（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｐｒｏｃ、多槽装置で固相用に切断した。このペプチドはＨＰＬＣで８０−８５％の均質性を示したので、したがってさらに精製せずに使用した。

２、血清学的アッセーペプチドＥＬＩＳＡは以下のように実施した。マイクロタイタープレートウェル（Ｌｉｎｂｒｏ、フロー、スコツトランド）は、０．０１Ｍ炭酸緩衝液に懸濁したペプチド（１Ｈｇ／ウェル）で室温で１晩被覆した。その後、プレートウェルを５％ウシ血清アルブミンでブロックした。ウェル当たり１００μ】の試薬を用いた。

ＥＬＩＳＡ実施中の異なる工程間では５回洗浄（蒸留水中の０，９％ＮａＣｌおよび０．００５％トウィーン２０）を実施した。陽性血清およびコントロールはｒ／１００に希釈し、３７℃で１時間プレート中でインキュベートした。ペルオキシダーゼ共役抗ヒトＩｇＧｙｆａ免疫グロブｌル（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、　テンマーク）　ノ１／２０００希釈を加えた（１時間、３７℃）。基質として、１．　２フエニレンジアミンジヒドロクロリドを用いた。１０分間反応させ、その後ｓＭＨｔｓＯ４で反応を停止させた。プレートはタイターチック（Ｔｊ　ｔｅｒｔｅｋ）分光光度計で４９０ｎｍで判定した。光度計の読みが陰性ヒト血清の平均光学密度＋３標準偏差（ＳＤ）の値を示すとき陽性と判定した。ペプチドＥｎｄＩＯの平均光学密度＋３倍のＳＤは０．８であった。

各ペプチドは、ＨＩＶ−１惑染および陰性コントール血清とともにＥＬＩＳＡシステムで別々に用いた。１４種の抗体陰性コントロール血清はいずれもこのペプチドと反応しなかった。ＨＩＶ感染の異なる臨床段階から選ばれた（７）３３種のＨＩＶ−１抗体陽性血清はすべて、２８種のペプチドの１つ、ＥｎｄｌＯと強く反応した（ｒｆｌＩ）。感染血清との反応性は、非常に高希釈（＋／Ｉ　００００）でも観察された。ＥｎｄＩＯのアミノ酸配列は、ＥＴＧＱＥＴＡＹＦＬＬＫＬＡＧＲＱＰＶＫである。ペプチドの他の部分の反応性は、感染者またはＨＩＶ−１抗体陰性者から得られた血清の反応と区別できなかった。結果として、いくつかの選択されたペプチドのＥＬＩＳＡの結果だけが図〕に示されている。ペプチドＥｎｄ　１０を表すアミノ酸配列は、エンドヌクレアーゼ蛋白質の中央部分に位置しく６５５位で開始）、別々のＨＩＶ−１分離物間で高度に保存されている（表Ｉ）。

ＨＩｖ−１コンセンサス　ＥＴＧＱＥＴＡＹＦ？ＬＫＬＡＧＲＷＰＶＫＨＩＶ− ２ＲＯＤ　５ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の配列をもつ百株で保存されているアミノ酸を示している。？は、下に示す残基で表示したような置換を示している。

ＨＩＶ−２のゲノム（表１）およびサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）の対応する領域もまた非常に保存的である。ＨＩＶ−１配列とＨＩＶ−２分離物の比較は、５５％ホモロジーを示している。いくつかのアミノ酸ストレッチは、しかしながら、異なる血清型間で完全に保存されている。この観察のゆえに、ＨＩＶ−１ペプチドＥｎｄ１０を、ＨＩＶ−２感染者から得た３０種の血清で調べた。驚いたことには、すべてのＨＩＶ−２血清は、該ペプチドと強く反応し、反応の強さは、ＨＩＶ−１血清のそれに匹敵したく結果は示さず）。

エンドヌクレアーゼ領域のペプチドはすべてのＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２血清と反応するという我々の発見は、重要な診断的示唆となるかもしれない。ＥｎｄＩＯペプチドに基づく血清学的テストは、個々の蛋白質またはその部分の同定は、免疫的診断に有効な方法であることを証明するかもしれない。

３、置換実験ペプチドｅｎｄ９およびＥｎｄｌｌで得られた陰性結果は、両アミノ酸残基配列、ＥＴＧＱＥＴＡＹＦＬおよびＬＫＬＡＧＲＷＰＶＫ４分は、ＨＩＶ抗体との反応を許容するために存在する必要があることを示している。ペプチドＥｎｄＩＯのアミノ酸の相対的役割を決定するために、グリシンをもつ異なるＥｎｄｌＯ残基の配列置換をもつ一連のペプチドを調製し、ＥＬＩＳＡに使用した。無傷のペプチドＥｎｄ１０と比較して、光学密度（４９０ｎｍ）値の７０％以上の減少を示す置換は、抗体結合と関係があるとみなした。１３種のＨＩＶ−１抗体陽性血清をこの実験では用いた。このペプチドの中央部分の４個のアミノ酸（フェニルアラニン（ＨＩＶ−１ｐｏｌコンセンサス配列の６６３位のアミノ酸）、ロイシン（６６４位および６６６位）、およびトリプトファン（６７０位））のいずれかの置換は、光学密度の重大な減少をもたらした（図２）。４個の重要なアミノ酸の各々は、１つまたは１つより多い重要でない残基が間に入っているので、結果は、ＨＩＶのエンドヌクレアーゼ蛋白質に不連続な固有のエピトープが存在することを示唆している。

引用文献１、Ｇｒａｎｄｇｅｎｅｔｔら、（１９７ｇ）ＶｉｒｏＬｏｇｙ、８９：１１９ −１３２゜２、Ｌｉ１１ｅｈｏｊら、（１９８８Ｍ、　Ｖｉｒｏｌ、、６２：８＋　３０５３−３０５８゜３、Ｓｔｅｉｍｅｒら、（１９８６）Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、５８（１）：９−１６゜４、Ａ１１ａｎら、（１９８７）Ｂｌｏｏｄ、６９（１）　：３３１−３３３゜５、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、（１９８５）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２：５１３１−５１３５゜６、Ｍｅｙｅｒｓら、（１９９０）Ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｒｏｖｉｒ　ｓ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ　、１９９０゜７、疾病コントロールセンター（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）、　（１９８６）ＪＡＭＡ　ＪｕｌＹ　４．２５６（１）：２０−２５゜３、Ｗａｎｇら、（１９８６）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３：６１５９−６１６３゜９、Ｐａ１ｋｅｒら、（１９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４：２４７９−２４８３゜１０、Ｐａ１ｋｅｒら、（１９８８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５：１９３２−１９３６゜１１、Ｎｏｒｒｂｙら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ、３２９：２４８−２５０゜１２、　Ｎｏｒｒｂｙら、（印刷中）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）タイプ２およびタイプ１のエンベロープ蛋白質の線状抗原部位の比較。

１３、　Ｂｒｏｌｉｄｅｎら、（印刷中）、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２感染の検出およびそれらの識別用特異的合成ペプチド。

１４、　Ｇｏｕｄｓｍｉｔら、（１９８９）Ｊ、　ＡＩＤＳ、２：２９７−３０２゜１５、　Ｋｙｔｅら、（１９８２）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１５７：１０５−１３２゜＋６．　Ｃｈｏｕら、（１９７８）Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、４７：４５−１４８゜１７、Ｋｏｐｃｈｉｃｋら、（１９８１）Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、３７：２７４−２８３゜１８、　Ｐａｎｅｔｒ　ら、（１９７５）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　７２：２５３５−２５３９゜１９、　Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ　ら、（１９８４）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１ニア８８５−７８８９゜２０、　Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ　ら、（１９８４）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８１：６４６１−６４６５゜２１、Ｔｕ　ら、（１９８３）Ｊ、Ａｍ、　Ｃｈｅｍ−Ｓｏｃ、、１０５：６４４２−６４４５゜２２、ＨＯｕｇｈｔｅｎ　ら、（１９８６）［ｎｔ、Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、　２７＋６７５−６８３゜本発明はこれまで特定の好ましい具体例として記載し、さらにそれに関して例証してきたが、当業者ならば、種々の修飾、変更、省略および置換が、本発明の範囲から逸脱することなく容易に為されえることを理解しえよう。したがって、本発明は以下の請求の範囲によって専ら制限されるであろう。

ε 国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５６９　Ｈ９０１５−２Ｊ／／　Ｃ０７Ｋ　９９：００Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．次の式のポリペプチド：Ｘ【配列があります】Ｂ【配列があります】Ｚ。（式中、ＢはＬｅｕまたはＩｌｅで、Ｘは１から２０個のアミノ酸残基の鎖またはアミノ末端基で、Ｚは１から２０個のアミノ酸残基の鎖またはカルボキシ末端基である。）
２．Ｘが次の式で表される、請求の範囲第１項のポリペプチド：ＮＨ２【配列があります】。
３．Ｚが次の式で表される、請求の範囲第１項のポリベプチド：【配列があります】ＣＯＯＨ。
４．固形マトリクスに結合させた、請求の範囲第１項のポリペプチド。
５．該固形マトリクスがコラーゲンを含む、請求の範囲第４項のポリペプチド。
６．該固形マトリクスがニトロセルロースまたはポリエステルを含む、請求の範囲第４項のポリペプチド。
７．該固形マトリクスがガラス、合成樹脂または長鎖多糖類である、請求の範囲第４項のポリペプチド。
８．該固形マトリクスが合成樹脂繊維である、請求の範囲第４項のポリペプチド。
９．次の式をもつポリペプチド：ＮＨ１−〔【配列があります】〕ｐ−ＣＯＯＨ。（式中、ｐは、該ポリペプチドが０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液中で溶解可能であるような数値の整数である。）。
１０．ｐが２から６の間の数値である、請求の範囲第９項のポリペプチド。
１１．次の式のポリペプチド：ＮＨ２【配列があります】ＣＯＯＨ。