JPH06509866A - 呼吸系ウイルスに対する有効な抗体力価用の血漿試料をスクリーニングする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 呼吸系ウィルスに対する有効な抗体力価用の血漿試料をスクリーニングする方法 この発明は、呼吸系合胞体ウィルス、インフルエンザウィルス、パラインフルエ ンザウィルスおよびアデノウィルスなどの呼吸系ウィルスに対する高抗体力価の 血漿試料をスクリーニングすることに関する。より詳細には、この発明は、中和 検定法の使用を通じて、呼吸系ウィルスに対する抗体の有効量の血漿試料をスク リーニングすることに関する。

一般に、複数の個体より人手した血漿試料は特定の抗原に対する抗体としてスク リーンされる。その抗原に対しある種の抗体力価を有するこれらの試料は、特定 の抗原あるいは有機体もしくはこのような抗原を含むウィルスにより引き起こさ れる感染の治療のための免疫グロブリン調合剤を生産するためにプールされる。

抗体用血漿試料のスクリーニングは、適切な検定を使用して適切な抗体用血漿試 料それぞれを試験することにより実施される。採用される適切な検定には、競合 検定法、阻害検定法、免疫蛍光検定法、酵素結合免疫吸着検定法（エリザ）、サ ンドイッチ検定法および中和検定法がある。血漿試料それぞれの抗体力価を測定 するに際し、同じ検定がそれぞれの試料で行われる。望ましい抗体力価を有する これらの試料は、次いでプールされる免疫グロブリン調合剤を生産するために選 択される。

この発明の一つの局面に従って、呼吸系ウィルスにより引き。

起こされる感染の治療あるいは疫病予防のために、有効な抗体の血漿試料を個体 識別し、あるいはスクリーニングする方法が提供される。中和試験あるいは検定 を行うことでこの方法が開始される。中和検定法は、呼吸系ウィルスに対する抗 体を有する一つの血漿試料を呼吸系ウィルスと接触させることよりなる。これで 生じる血漿およびウィルスの混合体は、その後細胞個体群と接触される。試料内 に残存する非中和ウィルス（すなわち、抗体に拘束されず従って細胞を感染させ 得るウィルス）は、細胞を感染させたウィルスが一定の呼吸系ウィルスに適当な 期間で複製が行われた後に免疫検定法で測定される。適当な期間の後、細胞内の ウィルス抗原の量が測定される。細胞内にあるウィルス複製を予防する前もって 選択された最小量の抗体力価で、血漿試料は選択され、選択された試料が得られ る血漿は、次いで免疫グロブリンの生産のためにプールされる。

細胞内にあるウィルス抗原の量を測定するのに用いられる免疫検定法は、競合検 定法、阻害検定法、免疫蛍光検定法、サンドイッチ検定法、間接サンドイッチ検 定法などを含む、このような検定法は、従来の技術で一般的に知られている手法 に従って行われる。一般に、ウィルス抗原の量は、直接もしくは間接的に細胞内 に存在するウィルスに拘束されるトレーサーの量を決めることで、測定される。

トレーサーには、検出可能標識あるいはマーカーが含まれる。マーカーあるいは 標識は、例えば放射性同位元素などの放射性標識、蛍光染料、吸収染料、ケミル ミネセンス物質などの蛍光標識、スピン標識、ビオチン、色素原、染色微粒子あ るいは酵素標識などがその例である。酵素標識は、エリザ検定法で使用され、そ こでは、細胞内に存在するウィルス抗原の量が存在する拘束された酵素標識の量 で測定される。エリザ検定法が行われるに際し、基質を酵素と反応させて色を出 すために適切な基質が採用される。しかし、この発明の範囲は前記に記載された 特定の検定法に限定されないことは理解されるべきである。

望ましい実施例において、細胞内のウィルス抗原の量を測定するのに用いられる 免疫検定はエリザ検定法である。そのような検定において、方法の中和部分が実 施される細胞は、呼吸系ウィルスに対する抗体（すなわち抗ウイルス抗体）と接 触され、ウィルス−抗体複合体を形成する。この複合体は、次いで抗ウイルス抗 体に対する酵素結合抗体と接触され、ウィルス−抗ウイルス抗体酵素結合抗体と いう複合体を形成する。この複合体はその後酵素のための基質と接触される。細 胞内のウィルス量が次いで測定される。前もって選択された最小抗体力価で、も し細胞内にウィルスが伴在しなければ、血漿試料が得られる血漿は、呼吸系ウィ ルスの疫病予防および治療に使用される免疫グロブリンを提供するだめの血漿試 料のプール部分となるように選択することができる。

呼吸系ウィルスは、呼吸系合胞体ウィルス、インフルエンザウィルス、パライン フルエンザウィルスあるいはアデノウィルスである。

ある特定の望ましい実施例において、この発明は、呼吸系合胞体ウィルスすなわ ちＲ３Ｖにより引き起こされる感染の疫病予防およびもしくは治療のための有効 量の抗体に用いられる血漿試料のスクリーニングに特に適用することができる。

ある実施例では、個体から得られた血漿試料がマイクロタイター平板のそれぞれ に付価される。次いで呼吸系合胞体ウィルス（ロング菌株）の用量が各ウェルに 加えられ、血清およびウィルスの混合体は保温される。

保温の後、ＨＥｐ−２細胞の個体群が血漿およびウィルスの各試料に加えられ、 加Ｍ炭酸ガス恒温器で５日間保温される。

平板は、その後ウェルの内容物を吸引することで固定され、リン酸塩緩衝食塩水 およびトウイーン２０でウェルが洗滌され、その後アセトン・ＰＢＳ溶液が追加 される。この後平板は１５分間保温され、内容物が吸引され、平板は空気乾燥さ れる。

ウシ抗Ｒ３Ｖ血清などのＲ３Ｖに対する抗体を含有する血清の１種が次いで各ウ ェルに加えられる。

次いでウェルは１時間保温されてリン酸塩緩衝食塩水およびトウイーン２０で洗 滌され、抗Ｒ３Ｖ抗体に対して酵素共役免疫グロブリンと接触される。そのよう な免疫グロブリンの１例はペルオキシダーゼ共役ヤギ抗体ウシＩｇＧ（免疫グロ ブリンＧ）である。次いでウェルは１時間保温され、その後ウェルの内容物は吸 引され、また洗滌され、ある基質が加えられる。ペルオキシダーゼ共役免疫グロ ブリンが使用される場合、適切な基質はＯ−フェニレンジアミンジヒドロクロラ イドおよび過酸化水素である。４９２ｎｍにおける各ウェルの吸引度が解読され る。次いで吸引度は、細胞内のＲＳ　Ｖがあらかじめ定められたレベルと同等あ るいはそれ以下の量で存在するかどうかを測定するために使用される。非感染細 胞を有する１５対照ウエルのグループの平均値上で３標準偏差以上あるいはそれ と同等の吸引度の表示度数は、ウィルス複製の証拠であると見なされる。細胞内 のＲ８■があらかじめ定められたレベルと同量もしくはそれ以下で存在している これら試料に対応する血漿試料は次いでプールされ、ｎ　ｓ　ｖの疫病予防およ びもしくは治療に用いられる免疫グロブリン調合剤を形づくる。このような検定 は更にアンダーソン他ｒＪ、Ｃ１ｉｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｊ第２２巻、第５ 号、１０５０−１０５２頁（１９８５年１２月号）で記述されている。

この発明の方法が、呼吸系・ウィルスの予防およびもしくは治療のための抗体有 効量を有する血漿試料のための精度の高い試験管検定法を提供することを出願人 は発見した。このような血漿試料は、次いでプールされ、呼吸系ウィルスの治療 およびもしくは予防に有効な免疫グロブリン調合剤を提供する。

出願布はまた、この発明の方法を通じて呼吸系ウィルスに対する高抗体力価の血 漿試料をスクリーニングし、それに続いて０９吸系ウイルスの予防もしくは治療 用として免疫グロブリンを作るために高抗体力価を有する血清試料をプールする ことによって、他の検定法でスクリーンされた血清試料から提供された免疫グロ ブリンに比較して、呼吸系ウィルスのより改良された予防あるいはより改善され た治療を提供することができる免疫グロブリンを得ることができる。この発明に よる方法が他の検定法に対する１つの改良であるが、その他の検定法には、直接 エリザ法（例えば抗体としてウィルス感染細胞溶菌液あるいはウィルス蛋白質を 使用する直接エリザ法）、例えばウィルス蛋白質の拘束部位への試験血清に含有 される抗体と競合する抗体（単クローン性抗体など）を使用する検定法などのよ うな競合検定法（もし望ましければ、そのような競合検定法はエリザフォーマッ トで行うことができる）、および溶菌斑低減フォーマットの中和検定法がある。

この発明は下記の実施例に関連して記述される。しかしこの発明の範囲はそれに 限定されるものではない。

実施例１ 微小中和検定法 この実施例のために、標準高力価ＩｇＧ調合剤がアンダーソン他の微小中和検定 法によって最高力価面ｗ１１００単位の内５単位から予備的実験で産出された。

これら５個の血漿試料はプールされ、また１％ＩｇＧ調合剤がプール試料から作 られた。このＩｇＧ調合剤は次いでＲ３Ｖに対する抗体力価のために種々様々な 希釈液でテストされた。この標＄Ｉ　ｇ　Ｇ調合剤の終点力価は、ウィルス複製 を完全に阻害する標準調合剤の内最高の希釈液である。ウィルス複製は、非感染 細胞のバックグラウンド光学濃度上の３標準偏差以上もしくは同等の光学濃度で あると定義される。このＩｇＧ調合剤の終点力価は１：６．０００であると測定 された。標準ＩｇＧ調合剤は、従って６，０００微小中和単位の抗体濃度である と指定された６下記の血漿試料が同じく下記に記述される微小中和検定法で採用 された。

１、前記記載の高力価ＩｇＧ（１％）調合剤が標準液として選択された。コノ調 合剤はｌ／ｌ、０００．］／２，０００゜１／４，０００．ｌ／６，０００．お よびｌ／８，０００（７）希釈液にされ、それぞれＲ３Ｖ抗体６，３，１．５． １および０．７５微小中和単位／　ｍ　ｌを含んでいた。希釈試料はアンダーソ ン他の微小中和検定法を受け、微小中和単位／　ｍ　ｌに対応する光学濃度の標 準曲線が得られた。標準液がウィルス複製を妨げた最高の希釈度は典型的に１／ ６，０００　（１微小中和量位／ｍｌ）であった。

２、下記の対照血漿試料： （ａ）約１，０００微小中和単位／ｍｌを含むサントスｏ６９静脈内免疫グロブ リン（ＩｇＧ）１％溶液。

（ｂ）約２，０００微小中和単位／ｍｌを含む最初の臨床ロットであるＲ３Ｖ静 脈内免疫グロブリン（正の制御ｉｔ）の１％溶液。

（Ｃ）ウィルス成長が阻害されない場合に観察される最大光学濃度を与える対照 ウィルス。

（ｄ）ウィルス成長がウィルス中和抗体により完全に阻害される場合に期待され る光学濃度を与える対照細飽。

対照（ａ）および（ｂ）はｌ／２，０００の希釈液である。

３、それぞれ１／２，０００の希釈液である２３個の未知の血漿試料 血漿試料の希釈の前に、各試料は５６℃で３０分間加熱不活性化される。次いで 各試料は、前記記載の通り最小必須培地（ＭＥＭ）にウシ胎児血清２％、グルタ ミン１％および抗生物質１％を加えて希釈される。各試料７５μｌは、９６ウエ ル・マイクロタイター平板のウェルに３通りづつ加えられる。約１００ＴＣＩ　 Ｄｓｏ（半組織培養感染量）になるように最小必須培地に希釈された呼吸系合胞 体ウィルス（ロング菌株）２５μｌが、細胞対照ウェルを除（すべてのウェルに 加えられる０次いで平板は室温で２時間保温される。

この保温の後、ＨＥｐ−２細胞の懸濁液１００ｕｌ　（２ｘ１０’細胞／　ｍ　 ｌ　）が各ウェルに加えられる。平板はその後サランラップ■で包装され、炭酸 ガス恒温器で３７℃、５日間保温される。次いで平板はリン酸塩緩衝食塩水（Ｐ ＢＳ）およびトウイーン２０で３回洗滌され、アセトン８０％、ＰＢ３２０％の ７５ｕｌが各ウェルに加えられる。平板はその後４℃で１５分間保温され、次い で各ウェルは吸引される。平板は次いで約３０分間空気乾燥される。

各ウェルの試料はその後エリザ検定法を受ける。ＰＢＳ／ゼラチン０．５％／ト ウイーン２０，０．１５％および正常ウシ血清２％で１　：　ｌ、０ＯＯＰＢＳ で希釈されたウシ抗Ｒ３Ｖ血清（ノースカロライナ州、リサーチトライアングル バーク。

ウエルカムダイアグノスティクス社）７５ｕｌが各ウェルに加えられる。平板は 次いで温室で３７℃で１時間保温され、その後４回ＰＢＳおよびトウイーン２０ で洗滌される。ＰＢＳ／ゼラチン０．５％／トウィーン２０．０．１５％および 正常ヤギ血清２％で１／１０，０００で希釈されたペルオキシダーゼ共役ヤギ抗 ウシＩｇＧ（メリーランド州、ゲイザーズバーグ、カークガードアンドベリーラ ボラトリーズ社）７５ｕｌが各ウェルに加えられ、平板は温室で３７℃、１時間 保温される。

各ウェルは次いでＰＢＳ／トウイーン２０で６回洗滌され、更に結晶性３．３’ 　、５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質の溶液１２５ｕｌが各ウ ェルに加えられた。平板は次いで室温で約１５分間保温される。４５０ｎｍでの 各ウェル吸光度がその後測定され、各３通の試料の平均吸光度が算出され、各血 漿試料内の抗Ｒ３Ｖ抗体の量が測定され、それから細胞内のウィルス抗原および 血漿試料の抗体力価が測定される。

スクリーニング手順 もし血漿試料が少くともｌ：３，０００のＲ３Ｖに対する抗体力価を有する（す なわちｌ／２，０００の試料希釈液は標準ＩｇＧ曲線で１．５微小中和単位と同 等もしくはそれ以下の光字濃度をもつ）場合には、血漿が更に対応するドナーよ り採取される。ドナーが供与する都度、ドナーが少くとも１：３，０００のＲ３ Ｖ抗体力価を持ち続けているかどうかを確認するために、血漿は前記記載の微小 中和検定法の手続きにより試験される。ドナーの力価がｌ：３，０００以下に落 ちていれば、追加の血漿は採取されない。

少くとも１　：３，０００のＲ３Ｖ抗体力価を有する血漿試料は、次いでその試 料が受容可能なドナーより受け入れたものであることを確かめ、その後約１５０ から約１，２００リツターよりなるプールに貯蔵される。プールされた血漿は、 次いで免疫血清グロブリンを提供するように従来の方法で分画される。

しかし、この発明は前記記載の特定の実施例に限定されるものでないことは理解 されるべきである。この発明は後述の請求の範囲に特に記述され、その範囲内に とどまるもの以上に実施することが可能である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．呼吸系ウイルスにより引き起こされる感染の治療あるいは疫病予防のための 有効な抗体力価をもつ血漿試料を識別する一つの方法であって、 前記呼吸系ウイルスに対する抗体をもつ血漿試料を呼吸系ウイルスに接触させ、 血漿およびウイルスの混合体を個体群の細胞に接触させ、 その混合体に残存する非中和ウイルスが細胞内で複製を行えるように定められた 期間混合体を保温し、免疫検定により細胞内のウイルス抗原の量を精密に測定し 、また、 あらかじめ選択された最小抗体力価で前記細胞内でのウイルス複製を妨げる血漿 試料を選択する、ことよりなる方法。
2. ２．前記細胞内の前記呼吸系ウイルス抗原の量を測定することが、 前記試料を前記呼吸系ウイルスに対する抗体と接触させ、 前記試料を前記呼吸系ウイルスに対する前記抗体に対する酵素結合抗体と接触さ せ、 前記試料を前記酵素のための基質と接触させ、前記基質と反応した酵素の量を測 定することにより前記試料に残存する前記呼吸系ウイルスの量を測定する、こと よりなる請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記呼吸系ウイルスが呼吸系合胞体ウイルスである請求の範囲第１項記載の 方法。
4. ４．前記呼吸系ウイルスがインフルエンザウイルスである請求の範囲第１項記載 の方法。
5. ５．前記呼吸系ウイルスがパラインフルエンザウイルスである請求の範囲第１項 記載の方法。
6. ６．前記呼吸系ウイルスがアデノウイルスである請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．請求の範囲第１項に従って識別される血漿試料から調合される一つの超免疫 血清グロブリン。