JPH07111888A - ハイブリドーマと、このハイブリドーマの産生するモ ノクローナル抗体、およびこのモノクローナル抗体が 認識するマウスリンパ球活性化抗原 - Google Patents
ハイブリドーマと、このハイブリドーマの産生するモ ノクローナル抗体、およびこのモノクローナル抗体が 認識するマウスリンパ球活性化抗原Info
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- JPH07111888A JPH07111888A JP5260218A JP26021893A JPH07111888A JP H07111888 A JPH07111888 A JP H07111888A JP 5260218 A JP5260218 A JP 5260218A JP 26021893 A JP26021893 A JP 26021893A JP H07111888 A JPH07111888 A JP H07111888A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 マウスの未熟胸腺細胞により免疫されたハム
スタ−の脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との融合細胞に由
来するハイブリド−マ、このハイブリド−マが産生する
モノクロ−ナル抗体、およびこのモノクロ−ナル抗体に
よって認識されるマウスリンパ球活性化抗原。 【効果】 未熟胸腺細胞を細かく機能的に分画化するこ
とが可能となり、免疫細胞の分化、活性化等の機構解明
への途が拓ける。
スタ−の脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との融合細胞に由
来するハイブリド−マ、このハイブリド−マが産生する
モノクロ−ナル抗体、およびこのモノクロ−ナル抗体に
よって認識されるマウスリンパ球活性化抗原。 【効果】 未熟胸腺細胞を細かく機能的に分画化するこ
とが可能となり、免疫細胞の分化、活性化等の機構解明
への途が拓ける。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】この発明は、ハイブリドーマと、
このハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体、お
よびこのモノクローナル抗体が認識するマウスリンパ球
活性化抗原に関するものである。この発明のモノクロー
ナル抗体および活性化抗原は、たとえば生体の免疫機構
に関する基礎研究分野や、免疫系疾患に関する医療分野
等において有用である。
このハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体、お
よびこのモノクローナル抗体が認識するマウスリンパ球
活性化抗原に関するものである。この発明のモノクロー
ナル抗体および活性化抗原は、たとえば生体の免疫機構
に関する基礎研究分野や、免疫系疾患に関する医療分野
等において有用である。
【0002】
【従来の技術とその課題】生体の免疫応答反応の発現・
調節に中心的役割を果たすT細胞は、胸腺においてT前
駆細胞より成熟T細胞へと分化することが知られてい
る。T前駆細胞は胸腺へと移行したのち急速に分裂・増
殖し、同時にT細胞レセプター(T cell receptor:以
下、TCRと略記する)遺伝子の再構成が生じ、その遺
伝子産物が細胞表面に発現される。T細胞が認識する抗
原のレパートリーは、TCR遺伝子がほとんど体細胞突
然変異を起こさないことから、大部分がこの胸腺での分
化過程で決定されると考えられる。
調節に中心的役割を果たすT細胞は、胸腺においてT前
駆細胞より成熟T細胞へと分化することが知られてい
る。T前駆細胞は胸腺へと移行したのち急速に分裂・増
殖し、同時にT細胞レセプター(T cell receptor:以
下、TCRと略記する)遺伝子の再構成が生じ、その遺
伝子産物が細胞表面に発現される。T細胞が認識する抗
原のレパートリーは、TCR遺伝子がほとんど体細胞突
然変異を起こさないことから、大部分がこの胸腺での分
化過程で決定されると考えられる。
【0003】このT細胞のレパートリー選択は、未熟胸
腺細胞中のCD4+ 8+ (doublepositive;以下、DP
と略記する)細胞の段階で起きることが知られている。
すなわち、DP細胞はTCR分子を介して間質系細胞の
主要組織適合遺伝子複合体を認識し、positiveに選択さ
れたり、またはnegativeに除去されたりする。このよう
にDP細胞は heterogeneousな細胞集団であるが、この
集団をさらに細かく機能的に分画化するマーカーは数少
ない。
腺細胞中のCD4+ 8+ (doublepositive;以下、DP
と略記する)細胞の段階で起きることが知られている。
すなわち、DP細胞はTCR分子を介して間質系細胞の
主要組織適合遺伝子複合体を認識し、positiveに選択さ
れたり、またはnegativeに除去されたりする。このよう
にDP細胞は heterogeneousな細胞集団であるが、この
集団をさらに細かく機能的に分画化するマーカーは数少
ない。
【0004】近年、CD69等のリンパ球を活性化した
際に発現する活性化抗原が、このDP細胞を機能的に分
画するうえで重要なマーカーとなり得ることが明らかに
なってきた。しかしながら、そのような活性化抗原を同
定し、かつ分離・抽出するための手段は従来知られてお
らず、またリンパ球活性化抗原それ自体の特性も解明さ
れていないのが現状である。
際に発現する活性化抗原が、このDP細胞を機能的に分
画するうえで重要なマーカーとなり得ることが明らかに
なってきた。しかしながら、そのような活性化抗原を同
定し、かつ分離・抽出するための手段は従来知られてお
らず、またリンパ球活性化抗原それ自体の特性も解明さ
れていないのが現状である。
【0005】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、マウスのリンパ球活性化抗原を特異
的に認識するモノクローナル抗体と、この抗体を産生す
るハイブリドーマを提供することを目的としている。ま
たこの発明は、上記モノクローナル抗体が認識するリン
パ球活性化抗原を、その特性を明らかにすることによっ
て、産業上の利用に共することを目的としてもいる。
されたものであり、マウスのリンパ球活性化抗原を特異
的に認識するモノクローナル抗体と、この抗体を産生す
るハイブリドーマを提供することを目的としている。ま
たこの発明は、上記モノクローナル抗体が認識するリン
パ球活性化抗原を、その特性を明らかにすることによっ
て、産業上の利用に共することを目的としてもいる。
【0006】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、マウスの未熟胸腺細胞により免
疫されたハムスターの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との
融合細胞に由来するハイブリドーマを提供する。またこ
の発明は、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナ
ル抗体を提供する。
を解決するものとして、マウスの未熟胸腺細胞により免
疫されたハムスターの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との
融合細胞に由来するハイブリドーマを提供する。またこ
の発明は、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナ
ル抗体を提供する。
【0007】さらにこの発明は、マウス未熟胸腺細胞の
約80%において発現する分子量約12kDaのGPI
アンカー蛋白質であって、上記モノクローナル抗体によ
って認識されることを特徴とするマウスリンパ球活性化
抗原をも提供する。以下、この発明の構成について詳し
く説明する。 (1)ハイブリドーマの作出 この発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マの作出方法は、公知の方法(Nature, 256,p49
5,1975)等に従って、たとえば次のとおりに行な
うことができる。 1)動物の感作 マウスの胸腺細胞を抗原として使用し、これを完全フロ
インドまたは不完全フロインドのアジュバントと混和
し、1週間から数か月の間隔でハムスターに1〜4回程
度注射し、動物を感作する。 2)細胞融合 免疫された動物から摘出した脾臓細胞とマウス骨髄腫細
胞とを常法により融合させ、融合細胞を得る。マウス骨
髄腫細胞としてはSP2/0−Ag14等を用いること
ができる。細胞融合を行う方法はいくつか知られている
が、例えばポリエチレングリコール(以下PEGと記載
することがある)を使用する方法、電気融合による方法
等を用いることができる。この発明においては、これら
いずれの方法でも融合細胞を得ることができる。 3)融合細胞の選択 前記の方法により得た融合細胞の培養上清を用いて胸腺
細胞を染色し、流動細胞計測装置(フローサイトメトリ
ー)を用いてこれを解析し、胸腺細胞の細胞表面抗原を
認識する抗体のなかで既知の抗原とは異なる染色パター
ンを示すものを選択する。さらに、多くの既知の活性化
抗原が無刺激の抹消T細胞には発現していないことを考
慮し、上記抗体のなかで胸腺細胞は染色し、末梢T細胞
は染色しない抗体産生株を選別した。 4)クローニング 前記で選択した特異抗体産生細胞を、一つのクローンか
ら由来した均一な細胞集団とするため、公知の限外希釈
法等を用いて、クローニング操作を行い、目的とするモ
ノクローナル抗体を安定に産生する細胞株、いわゆるハ
イブリドーマを得る。
約80%において発現する分子量約12kDaのGPI
アンカー蛋白質であって、上記モノクローナル抗体によ
って認識されることを特徴とするマウスリンパ球活性化
抗原をも提供する。以下、この発明の構成について詳し
く説明する。 (1)ハイブリドーマの作出 この発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マの作出方法は、公知の方法(Nature, 256,p49
5,1975)等に従って、たとえば次のとおりに行な
うことができる。 1)動物の感作 マウスの胸腺細胞を抗原として使用し、これを完全フロ
インドまたは不完全フロインドのアジュバントと混和
し、1週間から数か月の間隔でハムスターに1〜4回程
度注射し、動物を感作する。 2)細胞融合 免疫された動物から摘出した脾臓細胞とマウス骨髄腫細
胞とを常法により融合させ、融合細胞を得る。マウス骨
髄腫細胞としてはSP2/0−Ag14等を用いること
ができる。細胞融合を行う方法はいくつか知られている
が、例えばポリエチレングリコール(以下PEGと記載
することがある)を使用する方法、電気融合による方法
等を用いることができる。この発明においては、これら
いずれの方法でも融合細胞を得ることができる。 3)融合細胞の選択 前記の方法により得た融合細胞の培養上清を用いて胸腺
細胞を染色し、流動細胞計測装置(フローサイトメトリ
ー)を用いてこれを解析し、胸腺細胞の細胞表面抗原を
認識する抗体のなかで既知の抗原とは異なる染色パター
ンを示すものを選択する。さらに、多くの既知の活性化
抗原が無刺激の抹消T細胞には発現していないことを考
慮し、上記抗体のなかで胸腺細胞は染色し、末梢T細胞
は染色しない抗体産生株を選別した。 4)クローニング 前記で選択した特異抗体産生細胞を、一つのクローンか
ら由来した均一な細胞集団とするため、公知の限外希釈
法等を用いて、クローニング操作を行い、目的とするモ
ノクローナル抗体を安定に産生する細胞株、いわゆるハ
イブリドーマを得る。
【0008】以上のようにして得られたハイブリドーマ
は、従来未知のマウスリンパ球活性化抗原を特異的に認
識するモノクローナル抗体を産生するという機能的特徴
を有している。その代表的な例として、ハムスターの脾
臓細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合して得たハイブリ
ドーマを、ハイブリドーマPRST1と命名し、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、FE
RM P−13893なる受託番号を得た。
は、従来未知のマウスリンパ球活性化抗原を特異的に認
識するモノクローナル抗体を産生するという機能的特徴
を有している。その代表的な例として、ハムスターの脾
臓細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合して得たハイブリ
ドーマを、ハイブリドーマPRST1と命名し、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、FE
RM P−13893なる受託番号を得た。
【0009】このハイブリドーマPRST1は、次の性
質を有している。 a)由 来:アルメニアンハムスター脾臓細胞とマウ
ス骨髄腫細胞SP2/0−Ag14との融合細胞である
ハイブリドーマ b)形 態:非紡錘形であり、ほぼ球形を呈する c)継代培養:可能 d)機能的特徴:マウスリンパ球活性化抗原を特異的に
認識するモノクローナル抗体を産生する e)細胞増殖性:付着および浮遊の双方において良好 f)保存条件:液体窒素中で−80℃以下で保存する g)血清要求性:通常10%牛胎児血清添加培地で培養
する (2)抗体の取得 この発明の抗体は、前記ハイブリドーマを培養した培養
上清から、または動物にこのハイブリドーマを接種し、
生体内培養することによって得られた生体滲出液から通
常の蛋白精製に用いられる生化学的手法により精製する
ことができる。
質を有している。 a)由 来:アルメニアンハムスター脾臓細胞とマウ
ス骨髄腫細胞SP2/0−Ag14との融合細胞である
ハイブリドーマ b)形 態:非紡錘形であり、ほぼ球形を呈する c)継代培養:可能 d)機能的特徴:マウスリンパ球活性化抗原を特異的に
認識するモノクローナル抗体を産生する e)細胞増殖性:付着および浮遊の双方において良好 f)保存条件:液体窒素中で−80℃以下で保存する g)血清要求性:通常10%牛胎児血清添加培地で培養
する (2)抗体の取得 この発明の抗体は、前記ハイブリドーマを培養した培養
上清から、または動物にこのハイブリドーマを接種し、
生体内培養することによって得られた生体滲出液から通
常の蛋白精製に用いられる生化学的手法により精製する
ことができる。
【0010】この発明の抗体は、このようにして得られ
たいくつかのモノクローナル抗体のうち、後述するマウ
スリンパ球活性化抗原に対して特異的に反応することが
確認されたハムスター由来の抗体であることを特徴とし
ている。以上のようにして得られたこの発明のモノクロ
ーナル抗体によって認識される抗原は、次に示す機能
的、物理的性質を有している。
たいくつかのモノクローナル抗体のうち、後述するマウ
スリンパ球活性化抗原に対して特異的に反応することが
確認されたハムスター由来の抗体であることを特徴とし
ている。以上のようにして得られたこの発明のモノクロ
ーナル抗体によって認識される抗原は、次に示す機能
的、物理的性質を有している。
【0011】 上記のモノクローナル抗体が認識する
抗原は、マウスDP細胞の約80%にその発現が認めら
れるが、より成熟したCD4+ 8- またはCD4- 8+
(single positive,SP)細胞においては発現が急速に
減少し、末梢のT細胞においてはその発現が認められな
くなる。 末梢のT細胞においても、これをin vitroにてCo
nA等により刺激するとその発現が認められるようにな
ることから、この抗原はマウスリンパ球の活性化抗原で
ある。
抗原は、マウスDP細胞の約80%にその発現が認めら
れるが、より成熟したCD4+ 8- またはCD4- 8+
(single positive,SP)細胞においては発現が急速に
減少し、末梢のT細胞においてはその発現が認められな
くなる。 末梢のT細胞においても、これをin vitroにてCo
nA等により刺激するとその発現が認められるようにな
ることから、この抗原はマウスリンパ球の活性化抗原で
ある。
【0012】 マウスB細胞をLPSで刺激するとそ
の発現が増強することから、この抗原はマウスB細胞で
も発現する。 細胞をPI−specific phospholipase C(PI−
PLC)処理すると細胞表面発現量が顕著に減少するこ
とから、この抗原はGPIアンカー蛋白質である。
の発現が増強することから、この抗原はマウスB細胞で
も発現する。 細胞をPI−specific phospholipase C(PI−
PLC)処理すると細胞表面発現量が顕著に減少するこ
とから、この抗原はGPIアンカー蛋白質である。
【0013】 可溶化したハイブリドーマを用いた免
疫沈降法により定量したこの抗原の分子量は、還元条件
下で約12kDaである。 この発明のモノクローナル抗体によって認識され、かつ
以上の特性を有することが確認されたこの発明のリンパ
球活性化抗原は、DP細胞を機能的に分画化するための
良好なマーカーとなり得る。そして、その結果得られる
多くの知見は、免疫細胞の分化および活性化に関する理
解を増大させるとともに、将来的には白血病等の新たな
分類診断方法の確立に大きく寄与するものと考えられ
る。
疫沈降法により定量したこの抗原の分子量は、還元条件
下で約12kDaである。 この発明のモノクローナル抗体によって認識され、かつ
以上の特性を有することが確認されたこの発明のリンパ
球活性化抗原は、DP細胞を機能的に分画化するための
良好なマーカーとなり得る。そして、その結果得られる
多くの知見は、免疫細胞の分化および活性化に関する理
解を増大させるとともに、将来的には白血病等の新たな
分類診断方法の確立に大きく寄与するものと考えられ
る。
【0014】次に実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に限
定されるものではない。
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に限
定されるものではない。
【0015】
実施例1(ハイブリドーマの作出) (1)動物の免疫 1mlのリン酸緩衝液に浮遊させたマウス胸腺細胞5×
107 個を6週齢のハムスターの腹腔に投与した。追加
免疫は充分に高い抗体価が認められるまで2〜3週間毎
に行った。 (2)細胞融合 高抗体価が認められたハムスターの脾臓を摘出した。マ
ウス骨髄腫細胞SP2/0−Ag14と前記ハムスター
脾蔵細胞とを細胞数比で1:2の割合でPEG1500
を用いて融合した。この融合細胞を培地に懸濁し、96
穴プレートの各ウエルに分注し、37℃、5%CO2 下
で7日間培養した。 (3)スクリーニングおよびクローニング 前記ハイブリドーマの増殖を終了した各ウエルの培養上
清を一部採取し、各々を用いて胸腺細胞を染色し、流動
細胞計測装置によりこれらを解析し、胸腺細胞の細胞表
面抗原を認識する抗体のなかで既知の抗原とは異なる染
色パターンを示すものを選択し、これを指標として目的
とするハイブリドーマをスクリーニングした。次に、上
記の抗体のなかで、胸腺細胞は染色し、末梢T細胞は染
色しない抗体を選別し、その抗体産生株のウエルについ
て限界希釈法によりスクリーニングを行なった。
107 個を6週齢のハムスターの腹腔に投与した。追加
免疫は充分に高い抗体価が認められるまで2〜3週間毎
に行った。 (2)細胞融合 高抗体価が認められたハムスターの脾臓を摘出した。マ
ウス骨髄腫細胞SP2/0−Ag14と前記ハムスター
脾蔵細胞とを細胞数比で1:2の割合でPEG1500
を用いて融合した。この融合細胞を培地に懸濁し、96
穴プレートの各ウエルに分注し、37℃、5%CO2 下
で7日間培養した。 (3)スクリーニングおよびクローニング 前記ハイブリドーマの増殖を終了した各ウエルの培養上
清を一部採取し、各々を用いて胸腺細胞を染色し、流動
細胞計測装置によりこれらを解析し、胸腺細胞の細胞表
面抗原を認識する抗体のなかで既知の抗原とは異なる染
色パターンを示すものを選択し、これを指標として目的
とするハイブリドーマをスクリーニングした。次に、上
記の抗体のなかで、胸腺細胞は染色し、末梢T細胞は染
色しない抗体を選別し、その抗体産生株のウエルについ
て限界希釈法によりスクリーニングを行なった。
【0016】このようにして、この発明のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマPRST1を作出し
た。 実施例2(モノクローナル抗体の取得) 実施例1で得たハイブリドーマPRST1を、培養し、
その培養上清よりproteinAセファロースカラムを用いて
モノクローナル抗体PRST1を精製した。 実施例3(マウスリンパ球活性化抗原の単離) 実施例2で得たモノクローナル抗体PRST1を用い、
マウスリンパ球活性化抗原を単離した。
ル抗体を産生するハイブリドーマPRST1を作出し
た。 実施例2(モノクローナル抗体の取得) 実施例1で得たハイブリドーマPRST1を、培養し、
その培養上清よりproteinAセファロースカラムを用いて
モノクローナル抗体PRST1を精製した。 実施例3(マウスリンパ球活性化抗原の単離) 実施例2で得たモノクローナル抗体PRST1を用い、
マウスリンパ球活性化抗原を単離した。
【0017】すなわち、モノクローナル抗体PRST1
が結合したセファロースービーズを作成し、これを用い
て、リンパ球活性化抗原を発現するT細胞ハイブリドー
マより抗原を免疫沈降した。電気泳動にて解析したとこ
ろ、この抗原蛋白質は還元条件下で12kDaの分子量
を示した。
が結合したセファロースービーズを作成し、これを用い
て、リンパ球活性化抗原を発現するT細胞ハイブリドー
マより抗原を免疫沈降した。電気泳動にて解析したとこ
ろ、この抗原蛋白質は還元条件下で12kDaの分子量
を示した。
【0018】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
りマウスリンパ球活性化抗原と、この抗原を特異的に認
識するモノクローナル抗体、およびこのモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマが提供される。これによ
り、未熟胸腺細胞を細かく機能的に分画化することが可
能となり、免疫細胞の分化、活性化等の機構解明への途
が拓ける。
りマウスリンパ球活性化抗原と、この抗原を特異的に認
識するモノクローナル抗体、およびこのモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマが提供される。これによ
り、未熟胸腺細胞を細かく機能的に分画化することが可
能となり、免疫細胞の分化、活性化等の機構解明への途
が拓ける。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 15/02 C12P 21/08 9161−4B //(C12P 21/08 C12R 1:91) (54)【発明の名称】 ハイブリドーマと、このハイブリドーマの産生するモ ノクローナル抗 体、およびこのモノクローナル抗体が 認識するマウスリンパ球活性化 抗原
Claims (4)
- 【請求項1】 マウスの未熟胸腺細胞により免疫された
ハムスターの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との融合細胞
に由来するハイブリドーマ。 - 【請求項2】 ハイブリドーマ株がFERM P−13
893である請求項1のハイブリドーマ。 - 【請求項3】 請求項1または2のハイブリドーマが産
生するモノクローナル抗体。 - 【請求項4】 マウス未熟胸腺細胞の約80%において
発現する分子量約12kDaのGPIアンカー蛋白質で
あって、請求項3のモノクローナル抗体によって認識さ
れることを特徴とするマウスリンパ球活性化抗原。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5260218A JP3053513B2 (ja) | 1993-10-18 | 1993-10-18 | ハイブリドーマと、このハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体、およびこのモノクローナル抗体が認識するマウスリンパ球活性化抗原 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5260218A JP3053513B2 (ja) | 1993-10-18 | 1993-10-18 | ハイブリドーマと、このハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体、およびこのモノクローナル抗体が認識するマウスリンパ球活性化抗原 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07111888A true JPH07111888A (ja) | 1995-05-02 |
| JP3053513B2 JP3053513B2 (ja) | 2000-06-19 |
Family
ID=17344994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5260218A Expired - Fee Related JP3053513B2 (ja) | 1993-10-18 | 1993-10-18 | ハイブリドーマと、このハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体、およびこのモノクローナル抗体が認識するマウスリンパ球活性化抗原 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3053513B2 (ja) |
-
1993
- 1993-10-18 JP JP5260218A patent/JP3053513B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3053513B2 (ja) | 2000-06-19 |
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