JPH07265097A - 鉄の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】高感度な鉄の定量法を提供する 【構成】水性媒体中、２価鉄イオンを含む試料と、還元
剤共存下、オキシダーゼ反応により生成させた過酸化水
素とを接触反応させ、対応する過酸化水素変化量をオキ
シダーゼ検出反応等、高感度な過酸化水素検出法により
定量することを特徴とする鉄の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素反応により発生さ
せた過酸化水素が還元剤共存下２価鉄イオンにより増幅
して消費されることを利用した極めて高感度な鉄の定量
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】微量鉄イオンの分析法としては、ビピリ
ジン、０−フェナントロリン、バソフェナントロリン、
トリピリジルトリアミン、チオグリコール酸、チロンな
どを用いる比色法がある。しかし、これらの方法は有機
溶媒抽出を利用したり、反応、発色の条件が温和ではな
いため、酵素反応のような、簡便かつ迅速な測定には不
適である。酵素反応を用いる鉄イオンの測定法として
は、アコニターゼが鉄イオンにより活性化されることを
利用した方法が報告されている（第３２回日本臨床化学
会年会要旨集ｐ５６ｂ）。

【０００３】２価鉄イオンが過酸化水素を還元すること
は周知のことであり、このことを利用して２価鉄イオン
を求めることができる。電気化学的に鉄を測定する方法
があり、鉄のクーロメトリーとして古くから知られてい
る。しかし、これらの方法では感度は悪く微量の鉄の分
析には適さない。これらの方法以外により、鉄を高感度
に検出する方法の発明が求められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】最終液中濃度としてｐ
ｐｔ（ｎｇ／ｍｌ）という微量の鉄イオンを検出するに
は、２価鉄イオンによる過酸化水素還元作用の増幅と対
応する微量の過酸化水素の変化量を高感度に検出する方
法が用いられなければならない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、水性媒体中、
酵素反応又は電気化学的方法により過酸化水素を発生さ
せ、還元剤の共存下発生させた過酸化水素と２価鉄とを
反応させ、過酸化水素の変化量を過酸化水素発色反応又
は電気化学的方法により検出することを特徴とするもの
である。本発明が対象とする鉄濃度は極めて微量である
ため、単に２価鉄により消費される過酸化水素量はわず
かであるため、電気化学的及び吸光光度法等では検出で
きず、微量鉄の測定方法としては無効である。本発明
は、２価鉄に微量の還元剤を共存させれば、協同作用的
に過酸化水素が消費され、高感度に鉄を定量できること
を見いだしたことにもとずく。

【０００６】ここに、水性媒体とは緩衝液、生理食塩水
等の水を含有する液を表し、緩衝液としてはトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液、リン酸緩
衝液、グッド緩衝液、バルビタール緩衝液等が代表的で
ある。鉄の還元剤としてはＦｅ^２＋−Ｆｅ^３＋系の酸化
還元電位の見掛け電位より低いものを用いる。アスコル
ビン酸、塩酸ヒドロキシルアミン、チオ硫酸ナトリウ
ム、チオグリコール酸、ヒドロキノン、硫酸ヒドラジン
などがある。特にヒドロキシルアミンとその塩、ヒドラ
ジンとその塩は、ペルオキシダーゼ反応を阻害せず、か
つ、過酸化水素の消費反応が遅いので、優れた還元剤で
ある。又、アスコルビン酸はアスコルビン酸オキシダー
ゼにより消費できるため、過酸化水素生成−発色反応の
前に大部分を消費することができる。なお、ヒドロキシ
ルアミンもヒドロキシルアミン脱水素酵素により消去で
きる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元体
（ＮＡＤＨ）とフェリシアンイオンからジアフォラーゼ
反応により生成したフェロシアンイオンを還元体として
用いることもできる。この場合は、フェロシアンイオン
の過酸化水素消費速度は遅い。

【０００７】過酸化水素生成反応としては、電気化学的
な方法もあるが基質と酸素により過酸化水素を生成する
オキシダーゼ酵素反応が最も適している。この場合、直
接過酸化水素を生成しないが、最終的にオキシダーゼ酵
素反応に結びつけられるすべての酵素反応が含まれる。
オキシダーゼ酵素反応のうち、生体試料等に含まれる物
質を基質とし、よく用いられる方法としては、グルコー
スオキシダーゼ法、コレステロールオキシダーゼ法、ガ
ラクトースオキシダーゼ法、グリセロールオキシダーゼ
法、尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）法などがある。一
般には用いられないがアミノ酸オキシダーゼ法、アミン
オキシダーゼ法、アルデヒドオキシダーゼ法、グルタミ
ンオキシダーゼ法、グリコールオキシダーゼ法、ジヒド
ロオロット酸オキシダーゼ法、ピルビン酸オキシダーゼ
法、ヘキソースオキシダーゼ法、モノアミンオキシダー
ゼ法、ラトステロールオキシダーゼ法、リジンオキシダ
ーゼ法、シュウ酸オキシダーゼ法、ヒドロキシ酸オキシ
ダーゼ法等がある。

【０００８】生体試料中には存在しないか、微量であっ
て、かつ基質、酵素共に長期安定であるものとしては、
コリンオキシダーゼ法、グリセロール−３−リン酸オキ
シダーゼ法、キサンチンオキシダーゼ法がある。

【０００９】基質があらかじめ試料中に存在する場合に
ついては、基質をあらかじめ他の酵素反応により消去し
別のものに変化させてから、上述の過酸化水素生成反応
を行うか、基質を多量に存在させ、試料に含まれる基質
の増加による影響をなくするか等の方法がある。これら
の方法は、酵素的分析法では確立されており、よく利用
されている。上述した過酸化水素生成を行う酵素反応は
Ｃｕ^２＋によって阻害されるものがあるが、うまい具合
に微量のＦｅ^２＋によっては阻害されない。

【００１０】生成した過酸化水素を高感度に検出するに
は、電気化学的な方法［鈴木周一編、イオン電極と酵素
電極、ｐ８６〜１０６、講談社サイエンティフィック］
の他にオキシダーゼ検出反応（カタラーゼ共役系、ペル
オキシダーゼ共役系）、化学発光法等がある。カタラー
ゼ共役系はＨａｎｔｚｓｃｈ反応を利用する方法、４−
アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２，４
−トリアゾール又は３−メチル−２−ベンゾチアゾリン
ヒドラジンを用いる方法がある。ペルオキシダーゼ共役
系は、多くの高感度発色試薬が開発されており、それら
は［”臨床化学実践マニュアル”，検査と技術増刊号，
１９９３年，２１巻，ｐ２３，医学書院］に一覧表とし
て記載されている。それらの発色試薬のモル吸光係数は
１×１０^４〜８×１０^４であり、最小のモル吸光係数を
有する４−アミノアンチピリン（モル吸光係数１×１０
^４）試薬であっても５ｐｐｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）の鉄を
十分な感度で測定できる。大きなモル吸光係数を有する
Ｎ−スルフォプロピルアミンでは、ｐｐｔ（ｐｇ／ｍ
ｌ）の鉄が十分測定可能である。このような大きなモル
吸光係数を有する発色試薬と還元剤共存下化Ｆｅ^２＋に
よる過酸化水素消費反応を組み合わせることにより、微
量の鉄を定量することが可能である。以上のようなトリ
ンダー発色試薬の他に、酸化還元発色試薬も用いること
ができるが、Ｆｅ^３＋をＦｅ^２＋に還元する還元剤の影
響をうけるので、鉄還元剤をあらかじめ消去した後用い
ることができる。この試薬については同仁化学研究所カ
タログＤＯＪＩＮ１７，ｐ１０に記載されている。感度
的に劣るが、よう素イオン又はフェリシアンイオンと過
酸化水素との反応を用いることもできる。以上のような
分光学的方法の他に、過酸化水素電極法、ペルオキシダ
ーゼ固定化酵素電極法が高感度検出法として用いること
ができる。

【００１１】過酸化水素がＦｅ^２＋により消費されその
変化量を精度良く検出するには、過酸化水素量が検出反
応にとって適切量でなければならない。本発明では過酸
化水素をオキシダーゼ酵素反応により発生させる方法を
採用している。これによれば、過酸化水素の生成量を、
補酵素、基質量等を制御することによりいかようにでも
調節可能であること、過酸化水素生成速度も酵素量、補
酵素量、活性化剤の量等を制御することにより調節可能
であるという優れた利点を有している。

【００１２】次に、生体試料のように鉄が蛋白（トラン
スフェリン、アルブミン等）と結合している場合、キレ
ート剤を用いて鉄を蛋白から遊離する。このような試料
に対し本発明ではキレート剤を用いる方法を重要な構成
要件としている。というのは、鉄を分子構成要素（補欠
因子）とする酵素を用いる鉄の定量方法では、そのよう
なキレート剤を加えると失活し反応が進行しなくなる
が、本発明で用いるオキシダーゼ検出反応では鉄を補酵
素としていないので失活しないため、キレート剤を共存
させることができる。キレート剤を共役させることによ
り、従来、鉄を蛋白から遊離するために必要な操作であ
るｐＨを酸性にしたり、除蛋白するという過程が不要と
なり、測定操作の大幅な簡略化、測定系の自由な組み合
わせが可能となる。さらに、重要な点は、本発明のオキ
シダーゼ検出反応といったオキシドレダクターゼ反応
が、２価鉄キレートを共存させても遊離の２価鉄イオン
と同様に進行することを見いだした点にある。この現象
を利用すれば、オキシダーゼ反応以外のオキシレダクタ
ーゼ反応によって血清中の鉄の定量が可能となる。その
ような酵素反応としてはフェロオキシダーゼＩ、フェロ
オキシダーゼＩＩ、リポアミドレダクターゼがある。
又、２価鉄イオンが阻害するオキシドレダクターゼも同
様にキレート剤共存下、阻害法によって鉄の定量が可能
であり、これにはコリンデヒドロゲナーゼなどがある。

【００１３】鉄キレート剤としては、エチレンジアミン
四酢酸、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ジエチレンジアミン五酢
酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、トリエチレン
テトラミン六酢酸、ジアミノプロパノール四酢酸、ヒド
ロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジアミノプロパ
ン四酢酸等が安定度定数が大きく好ましい。ニトロ三酢
酸、ジヒドロキシエチルグリシン、イミノ三酢酸、ヒド
ロキシエチルイミノ二酢酸、エチレンジアミン二プロピ
オン酸などは安定度はやや小さいが用いることができ
る。このようなキレート試薬のみならず、水溶性の鉄結
合試薬、例えばバソフェナントリンスルホン酸ナトリウ
ム、フェロンなども用いることができる。

【００１４】以下に本発明の実施態様の骨子を説明す
る。本発明の実施態様は過酸化水素生成過程と検出過程
の２過程より構成される。試料としては、上水、廃水、
生体試料（血液、血清、血しょう、尿、ヘモグロビンな
ど）、食品など広範囲を対象とすることができる。まず
水性媒体に還元剤０．０１〜１ｍｇ／ｍｌを加え、次に
鉄を含む試料を加え、０〜５分間８〜５０℃でインキュ
ベートし（アスコルビン酸、塩酸ヒドロキシルアミンの
場合は瞬時に還元されるので、インキュベートは不要で
ある）３価鉄を２価鉄に還元する。２価鉄のみの場合は
還元剤は後に加えてもよい。オキシダーゼ反応により過
酸化水素を生成する方法を用いる場合は、オキシダーゼ
かその基質をこのときの水性媒体に共存させてもよい。
例えば、塩化コリン等を０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ加えて
おく。又、発色反応の基質を加えておいてもよい。例え
ば、４−アミノアンチピリン等を０．０５〜１ｍｇ／ｍ
ｌを加えておく。次に残りの基質、オキシダーゼ反応の
酵素及び発色反応の酵素を含む水性媒体を上述の液に加
え、生じる吸光度変化量を求め、鉄の量を求める。オキ
シダーゼ酵素としては０．２〜２０Ｕ／ｍｌ、発色反応
としてペルオキシダーゼを０．１〜２０Ｕ／ｍｌを用い
る。この酵素量は還元剤の種類に依存し、塩酸ヒドロキ
シルアミン、硫酸ヒドラジンなどの場合は少量でよい。
残りの基質としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフ
ェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン０．１〜
２ｍｇ／ｍｌを加える。この過酸化水素生成、発色反応
は酵素反応として適切な条件であるｐＨ６〜７．５、温
度８〜５０℃で行う。

【００１５】水性媒体のｐＨとしては、２価鉄が酸素に
より３価鉄に酸化されるのを防ぐため、３価鉄から２価
鉄への還元は酸性とするのがよい。この場合、弱い緩衝
作用の水性媒体とし（水のみでもよい）、次の反応過程
における強い緩衝液により、反応に適切なｐＨとなるよ
うにする。過酸化水素生成及び検出過程を酵素反応で行
う場合は緩衝液のｐＨは５〜８とし、特にｐＨ６．０〜
７．５が望ましい。

【００１６】文献によるとアスコルビン酸は６ｍｇ／ｄ
ｌの割合で加えるのが望ましいとあり、３価鉄を還元
後、オキシダーゼ反応を行う。アスコルビン酸はアスコ
ルビン酸オキシダーゼを発色反応系に加えることによ
り、アスコルビン酸が消去されると同時に発色がおき
る。この場合、微量に残存するアスコルビン酸は還元剤
として２価鉄と協同効果を発揮する。

【００１７】オキシダーセ反応は、一定量の過酸化水素
を生成させた後、検出過程を行う場合と、両方を同時に
行う場合とがある。前者は試料中に共存する過酸化水素
消費物質が多量に存在していても、正確に鉄が測定でき
るという画期的な利点を有する。すなわち、試料中に例
えばアスコルビン酸、尿酸、ビリルビンなどの還元性物
質が多量に存在していても、鉄の還元剤を加えないで一
連の反応を行えば鉄は反応に関与しないためそのブラン
クのみが定量される。次に、鉄の還元剤を加えて一連の
反応を行い、両者を差し引けば鉄の定量ができる。この
方法は、血清、血しょうのようにアスコルビン酸などが
共存していても酵素作用により鉄は３価として存在する
試料に対して極めて有用である。

【００１８】生体試料については、オキシダーゼ反応に
おける基質が試料中に含まれている場合はその消去反応
を行う必要がある。例えばグルコースオキシダーゼを用
いる場合は、グルコースオキシダーゼをもって、内因性
のグルコースを消去するか、ヘキソキナーゼをもって消
去する。ヘキソキナーゼを用いる場合は、オキシダーゼ
反応と競合するため、マグネシウムキレート剤等の阻害
剤を加えて失活させる必要がある。本発明における鉄キ
レート剤の多くはマグネシウムキレートともなるので、
キレート剤の利用は極めて優れた方法といえる。

【００１９】鉄を蛋白から分離させるキレート剤はオキ
シダーゼ反応と共存させてもよいし、次のオキシダーゼ
検出反応時に共役させてもよい。後者の場合は、鉄をあ
らかじめトランスフェリン、アルブミン等から分離させ
ておいてもよい。この目的には、液のｐＨを２〜４とす
る。

【００２０】他の方法及び、他の酵素法で困難であった
血清の鉄結合能も本発明によれば簡単に測定できる。そ
の原理を以下に示す。まず、上述した方法に従い、鉄キ
レート剤を共存させて、血清鉄を定量する。次に、血清
に鉄イオンを過剰量加えて、鉄キレート剤を共存させな
いで鉄を定量する。この場合、蛋白は鉄により飽和し、
その分は反応しないので、遊離の鉄イオンのみが測定さ
れる。加えた鉄量から血清鉄及び遊離の鉄量を差し引け
ば鉄結合能が求められる。

【００２１】本発明では強い還元剤であるアスコルビン
酸等を用いた場合、銅の影響を若干うける。銅について
は試料中の銅と同量の硝酸銅を求めて加えるとよい。も
しくは、バソクプロインなど、銅と特異的に沈澱物を生
じる試薬を加える。尿酸、ビリルビンの還元性物質はそ
れぞれ尿酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼによ
り消去後発色反応を行う。この場合、消去反応で生成し
た過酸化水素は鉄の還元剤によって消失し、発色反応に
影響しない。

【００２２】

【実施例】

【実施例１】 グルコースオキシダーゼとアスコルビン酸を用いる方法 （１）鉄検量線用標準液の調製 硫酸第二鉄（和光純薬工業製）を蒸留水で希釈し、塩酸
を一滴加えた後定容し１、２．５、５、１０μｇ／ｍｌ
の鉄（ＩＩＩ）検量用標準液を調製した。ただし、別に
原子吸光光度法により、和光純薬工業製鉄標準液を対照
として濃度を測定し補正係数を求めた。 （２）鉄の定量 試験管に鉄検量用標準液０．１０ｍｌをとり、４−アミ
ノアンチピリン０．１ｍｇ／ｍｌ、アスコルビン酸０．
０８ｍｇ／ｍｌ、及びグルコースオキシダーゼ（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、和光純薬工業製）３０
Ｕ／ｍｌを含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１．０ｍ
ｌを加え３７℃で５分間インキュベートする。次に、Ｎ
−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシ
ニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）０．６ｍｇ／ｍｌ、
グルコース０．０５ｍｇ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ（西
洋わさび由来、和光純薬工業製）１０Ｕ／ｍｌ、アスコ
ルビン酸オキシダーゼ（キューリ由来、和光純薬工業
製）１０Ｕ／ｍｌを含む１００ｍＭグッド緩衝液（ＨＥ
ＰＥＳ、ｐＨ６．８）２．０ｍｌをあらかじめ３７℃に
インキュベートしたものを上述の溶液に加え、吸光度変
化を分光光度計（日立製ＵＶ３４００）で測定した。得
られた検量線を図１に示す。本法では試料中にグルコー
スが少量含まれていてもグルコースオキシダーゼにより
分解されて過酸化水素となり、これはさらにアスコルビ
ン酸により還元されて呈色には影響しない。しかし、グ
ルコースが相当量になるとアスコルビン酸が不足し、誤
差となる。又、試料にアスコルビン酸が多量に含まれて
いる場合も発色反応に影響する。アスコルビン酸オキシ
ダーゼは多い程高精度な結果が得られる。

【００２３】

【実施例２】 コリンオキシダーゼとアスコルビン酸を用いる方法 （１）鉄検量線用標準液の調製 実施例１と同じようにして、１２５、２５０、３７５、
４７５μｇ／ｄｌを調製した。 （２）鉄の定量 試験管に鉄検量線用標準液０．０８０ｍｌをとり、これ
に４−アミノアンチピリン０．１ｍｇ／ｍｌ、塩化コリ
ン０．４ｍｇ／ｍｌ、アスコルビン酸０．１２ｍｇ／ｍ
ｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ２）１．０ｍｌを加
え３７℃で５分間インキュベートする。次に、ＥＭＳＥ
０．６ｍｇ／ｄｌ、ペルオキシダーゼ（西洋わさび由
来、オリエンタル酵母製）１０Ｕ／ｍｌ、コリンオキシ
ダーゼ（アルカリゲネス由来、和光純薬工業製）６Ｕ／
ｍｌ、アスコルビン酸オキシダーゼ８キュウリ由来、和
光純薬工業製）３Ｕ／ｍｌを含む２００ｍＭグッド緩衝
液（ｐＨ７．０、２５℃）を３７℃にインキュベートし
たもの２ｍｌを上述の溶液に加え、１分後及び３分後の
吸光度を分光光度計（日立製ＵＶ３４００）で測定し、
両方の吸光度差を計算した。得られた検量線を図２に示
す。本法では、ｐＨ２の溶液と試料を混合し、３７℃で
５分間インキュベートすることにより、コロイド状の水
酸化鉄、コロイド状の酸化鉄をも分解し、定量できる。
本法はエンドポイント法であるが、塩化コリンを数倍量
とすることにより速度法が可能である。終点法か速度法
かは塩化コリンと、コリンオキシダーゼ量に依存する。
アスコルビン酸が多量に加えてあるのは、０．５分後の
吸光度を空試験値とするためである。にごりのない試料
については、アスコルビン酸は少量でよい。

【００２４】

【実施例３】 グリセロール−３−リン酸オキシダーゼと塩酸ヒドロキ
シルアミンを用いる方法 （１）鉄検量線用標準液の調製 試薬特級硫酸第一鉄（和光純薬工業製）を蒸留水で定容
し、１２５、２５０、３７５μｇ／ｄｌの鉄（ＩＩ）検
量線用標準液を調製した。 （２）鉄の定量 試験管に鉄検量線用標準液０．０３０ｍｌをとり、これ
に４−アミノアンチピリン０．３ｍｇ／ｍｌ、塩酸ヒド
ロキシアミン０．１５ｍｇ／ｍｌ、グリセロール−３−
リン酸１．５ｍｇ／ｍｌを含む水溶液（ｐＨ２．５、２
５℃）１．０ｍｌを加え３７℃にインキュベートする。
次に、ＥＭＳＥ０．３ｍｇ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ
（西洋わさび由来、和光純薬工業製）０．４Ｕ／ｍｌ、
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（マイクロオー
ガニズム由来、ＥＣ１．１．３．２１、ベーリンガーマ
ンハイム製）１．５Ｕ／ｍｌ、エチレンジアミン四酢酸
ナトリウム５ｍｇ／ｍｌを含む２００ｍＭグッド緩衝液
（ｐＨ７．５、２５℃）２．０ｍｌをあらかじめ３７℃
にインキュベートしたものを、上述の溶液に加え、生じ
る吸光度変化（０．２から０．７分の０．５分間）を分
光光度計（日立製ＵＶ３４００）で測定した。検量線を
図３に示す。次に血清０．０３０ｍＬをとり、同様にし
て測定した結果、測定値は９５ｍｇ／ｄｌであった。こ
の血清をバソフェナンスロリン吸光光度法で測定した結
果は９２ｍｇ／ｍｌであり、極めてよく一致した。

【００２５】

【実施例４】 硫酸ヒドラジンを用いた場合 （１）鉄検量線用標準液の調製 実施例３と同じであるが、濃度系列を２．４、６．０、
１２、２５μｇ／ｍｌとした。 （２）鉄の定量 試験管に鉄検量線用標準液０．１０ｍｌをとり、これに
４−アミノアンチピリン０．２ｍｇ／ｍｌ、塩化コリン
０．６ｍｇ／ｍｌ、硫酸ヒドラジン飽和水（２０℃）
０．０４ｍｌ／ｍｌを含む水溶液（ｐＨ２．５、２５
℃）２．０ｍｌを加え２５℃で５分間インキュベートす
る。次に、ＥＭＳＥ１ｍｇ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ
（西洋わさび由来、和光純薬工業製）０．５Ｕ／ｍｌ、
コリンオキシダーゼ（アルカリゲネス由来、和光純薬工
業製）１．１Ｕ／ｍｌを含む２００ｍＭグッド（ＨＥＰ
ＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０、２５℃）を２５℃にインキ
ュベートしたもの１ｍｌを、上述の溶液に加え、０．５
分後から２．５分後の吸光度を分光光度計（日立製ＵＶ
３４００）で測定し、両方の吸光度差を計算した。得ら
れた検量線を図４に示す。

【００２６】

【発明の効果】本発明の効果は次のとおりである。本発
明では酵素反応を利用しているので、温和な反応条件で
簡便かつ短時間に鉄の測定が可能である。又、酵素反応
により、適量の過酸化水素を検出と同一の溶液中で発生
させることが可能であり、反応中鉄濃度としてｐｐｔ
（ｎｇ／ｍｌ〜ｐｇ／ｍｌ）という極めて高い感度が得
られる。又、試料中濃度としては図３から吸光度変化
０．００１を与える数ｐｐｂ（数μｇ／ｄｌ）が検出可
能である。本発明で用いる酵素は鉄を補酵素としないの
で、鉄キレート剤を共存させることが可能であり、鉄を
補酵素とする方法に比較して温和、簡便な過程にて鉄を
定量できる。この特徴を生かし、他の方法、他の酵素法
では困難であった血清における鉄結合能をも簡単に測定
できる。定電位クーロメトリーにより、２価鉄を３価鉄
に酸化して鉄を定量する方法において、還元剤を共存さ
せることにより、本発明の増幅効果により高感度定量が
可能となる。本発明の原理は、銅、マンガンなど微量の
酸化還元金属の定量に応用できる。

【００２７】

【図面の簡単な説明】

【図１】グルコースオキシダーゼを用いたときの鉄の検
量線

【図２】コリンオキシダーゼを用いたときの鉄の検量線

【図３】グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用い
たときの鉄の検量線

【図４】硫酸ヒドラジンを用いたときの鉄の検量線

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 還元剤の共存下に２価鉄から３価鉄への
   酸化を行わせそれに対応する変化量を定量する鉄の分析
   法
2. 【請求項２】 過酸化水素を発生させ、還元剤の共存
   下、過酸化水素による２価鉄から３価鉄への酸化を行わ
   せ、対応する過酸化水素量の変化量を定量する請求項１
   に記載する鉄の分析法
3. 【請求項３】 過酸化水素発生法がオキシダーゼ酵素反
   応であり、過酸化水素定量方法がオキシダーゼ検出反応
   である請求項２に記載する鉄の分析法
4. 【請求項４】 鉄キレート剤を共存させる請求項２及び
   請求項３に記載する鉄の分析法
5. 【請求項５】 トランスフェリン、アルブミン、グロブ
   リン等の鉄結合タンパクから、鉄を水性キレート剤を用
   いて遊離させオキシドレゼクターゼ酵素反応を行う鉄の
   定量方法