JPH07502495A - 特定種のｌｆａ−３またはｃｄ２結合蛋白質を投与することによる同種移植または異種移植の寛容性を改善するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １ｌｆ定種のＩ，ＦＡ−３またはＣ　Ｉ）　２結合蛋白質を投与することによる 同種移植または異種移植の寛容性を改善するための方法 本出願は１９９１年１０月７日に出願し、現在係属中の出願番号第０７／７７２ ７０５号の一部継続出願である。

発明の技術的分野 本発明は、人間を含む削孔類において、移植した異種移植組織または同種移植組 織の寛容性をＩ．　Ｆ　Ａ　−　３またはＣ　Ｉ）　２結合蛋白質を投与するこ とにより改善する方法に関する。

発明の背景 同種移植組織とは同一種のうちの遺伝的に非同一な個体間で移植される組織をい う。このような、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、角膜、骨髄、肺および皮膚等の組織 の同種移植か種々の末期段階の病気の治療のために医療においてそのり゜Ｉノ果 を示し、かつ、受は入れられてきている。しかしながら、不幸にも、移植の要求 の増加は今日のドナーによる／Ｊ％給では間に合わず、また、人間のドナーの供 給を増加する努力ら、高まる人体組織の要望には間に合わないと予憇されている 。例えば、米国では、年間１４ＯＯＯ人の心臓同種移植の適格者の内の僅がに２ ０００人のみが心臓移植を受けているだけである（Ｒｏｓｅ。

「心臓移植の危険性」　（八ｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ，Ｓｕｒｇ，，４７．ｐ．６１ ５　（１９８９）））。

そこで、ドナー組織の他の供給源についての関心が高まりつつある。このような １』（給源としては、異種移植組織が一例として挙げられ、これはーの種がら他 の種への移植組織をいう。

たたし、これら同種移植および異種移植の両方の問題として、受容者によるドナ ーの移植組織の拒絶がある。

このような移植における拒絶は複雑でまだ完全には理解されていない免疫システ ムの一連の作用によるものと考えられている。一般的に、このような免疫応答に は以下の二つの面がある。１）細胞性応答．主に細胞障害性１゛細胞から成り、 該細胞は異種細胞またはウィルス感染細胞を攻撃して殺す。２）体液性応答：異 種高分子に対して特異的である抗体を分泌するプラズマ細胞に対するＢ細胞の活 性から成る。

また、当該移植拒絶は、リンパ球等の単核細胞の移植組織への累進的浸透（ｐｒ ｏｇｒｅｓｓｉｖｅ　ｉｎｆｉ　Ｉ　ｔ　ｒａｔ　ｉｏｎ）により、組織学的に 特徴付けられる。このような細胞の増加が生じると数日中に移植組織か破壊され る。それゆえ、増感処理されたＴリンパ球が当該拒絶過程の主な開始剤として用 いられている。

このＴリンパ球は標的′ｌ１象物および抗原提示細胞と相互作用して、当該免疫 応答において主たる役割を果たす。

例えば、当該Ｔリンパ球を媒介させて標的細胞を殺す処理け、最初に、細胞溶解 性Ｔ　ＩＪンパ球（エフェクター細胞）を移植内皮組織等の標的細胞に付着する 段階を含む多段階の処理である。また、ヘルパー１９２６球は移植組織内の抗原 提示細胞に付着することにより免疫応答の開始を補助する。

なお、このような１９２６球の標的対象物や抗原１是示ｌｌＴｌ胞との相互作用 は高度に特異的であり、当該Ｔリンパ球の表面上の多くの特異的な抗原受容体の −による標的り４象物または１１”Ｌｌ皇促示細胞の表面」二のＩＡ原の認識に 依存する。

このようｆ、Ｌ　１９２６球や他の細胞の受容体−抗原相互作用は、例えば、抗 原−受容体複合体ＣＤ３やＣＤ４、ＬＦＡ−１、ＣＤ８およびＣＤ２等の補助分 子等の種々のＴリンパ球表面蛋白質により容易化されている。さらに、当該相互 作用は標的対象物または抗原提示細胞の表面上で表現されるＬ　Ｆ　Ａ　−３、 ■ＣΔＭ−１およびＭＭＣ等の補助分子によっても影響を受ける。

上記Ｔ細胞活性についてのＣＤ２とＬ　ＦＡ−３との間の相互作用はまだ十分に 理解されていないが、最近の研究では、ＣＤ２（１９２６球の補助的（；１着性 分子）とＬＦＡ−３（標的細胞および抗原提示細胞の補助分子）との間には特異 的な相互作用があり、これによって、１９２６球が標的細胞や抗原提示細胞に（ １１着することが示唆されできている。このような細胞間付着は１９２６球の機 能的な応答の開始に関係があると考えられている（Ｄｕｓｔｉｎ他、「精製リン パ球機能を（ｆう抗原３はＣＤ２に結合し、かつ、′ｒリンパ球骨付着仲介する 」　（Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６５．Ｉ）ｐ、６７７−９２　（１９８７））、Ｓｐｒｉ ｎｇｃｒ他、「リンパ球機能を伴うＬＦＡ−１、ＣＤ２およびＬＦＡ−３分子： 免疫システムの細胞付着受容体Ｊ　（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎ。

１、　、５．　ｐｐ、　２２３−５２　（１９８７）　）　）　。　ま　ｔこ、 Ｌ　Ｆ　Ａ　−３／　ＣＤ　２相互作用は、抗原非依存および依存による抱合体 形成や赤血球を伴うＴリンパ球ロゼツト形成において、１′リンパ球と胸腺上皮 細胞との間の相互作用を仲介する（参照例：５ｅｃｄ他、「高速免疫選択手法に よる、ＣＤ２抗原、′ｒ！Ｉ′ｌｌ胞赤血球受容体の分子クローニングＪ　（Ｐ ｒｏｃ、ＮａＬ　Ｉ、Δｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８４．ｐｐ、３３６５−６９　（１９８７）））。

ＬＦＡ〜３は人間の赤血球等の種々の広範な細胞の表面上に見られ、種々の１９ ２６球の相互作用における役割をさらに明瞭にするへく、多大な研究の課題とな っている（参照例：Ｋｒｅｎｓｋｙ他、ｒ　Ｉ−Ｆ　Ａ　−１、Ｉ−ＦＡ−２お よびＬＦＡ−３の機能的意義、分布および構造ＣＴＬ−標的相互作用を伴う細胞 表面抗原Ｊ　（Ｊ、１ｍｍｕｎｏ　１．．１３１　（２）、ｐｐ、６１１−１６ （１９８３）、Ｓｈａｗ他、［人間細胞障害性ＴＩＩＴＩＩＩａクローンに用い られる二種類の抗原依存型付着経路Ｊ　（Ｎａｔｕｒｃ、３２３．　ｐｐ、２６ ２−６４　（１９８６）））。これまで、二種類のＬＦＡ−３の自然形態が同定 されており、ｔａ　Ｌ、　ＦＡ−３の一形態（「トランスメンプラノＬＦ△−３ 」）はトランスメンプラン疎水性ドメインによりＩｎｌ胞１漠内に連結する。さ らに、このＬ　ＦＡ−３の形態をコードするｃｌ）Ｎ△がクローン化されシーケ ンス化されている（参照例：Ｗａｌｌｎｅｒ他、「リンパ球機能を伴う抗原３（ ＬＦＡ−３）の主構造Ｊ　（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６６、ｐｐ、９２３−３ ２　（１９８７）））。また、当該１．、　Ｆ　Ａ　−３の他の−の形態はホス ファチンルイノンｌ−−ル（ｒｒ’Ｎ）含有の糖脂質との共有結合を介して細胞 膜に連結する。この後者の形態は「Ｐｌ連結Ｌ　ＦＡ−３」として示され、当該 Ｌ　ＦＡ−３の形態をコートするｃＤＮΔちまたクローン化されシーケンス化さ れている（Ｗａｌｌｎｅｒ他、ＰＣＴ特許出願Ｗ０９０１０２１８１）。

人間ＣＤ２（Ｔｌｌ）分子は９５％以上の胸腺リンパ球および事実上すべての末 梢１９２６球上に表現される５０ｋＤ表面糖蛋白質である。特異的なモノクロー ナル抗体を用いた生化学的分析により、ＣＤ２がＴリネージ持異性を有しており 、いくつかの異なるグリコリル化された形態における細胞表面上に存在すること が示唆されている（１−１ｏｗａｒｄ他、［Ｅ−ロゼツト形成をプロ・ツクする モノクローナル抗体により定まる人間Ｔリン／マ球の弁別マーカーＪ　（Ｊ、１ ｍｍｕｎｏ１．．１２６．１）ｐ、２１１７−２２　（１９８１）、１３ｒｏｗ ｎ（Ｉ！！　（Ｌｃｕｋｏｃｙｔｅ　′ｒｙｐｉｎｇ　Ｉｌｌ、ｅｄ、ＭｃＭｉ ｃｈａｅｌ、０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｃｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ、１１０ −１２　（１９８７）、５ａｙｒｅ他、ｒｌ’１ｌｃＤＮへの分子クローニング および表現は人間′「リンパ球」二の受容体類似構造を呈示するＪ（ｒ’ｒｏｃ 、Ｎａ　ｔ　１．　Δｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４．ｐｐ、２９４１−４５　 （１９８７）））。また、人間ＣＤ２遺伝子のシーケンスは既に報告されている （ＳｅｅｄおよびΔｒｕｆｆｏ、ｒ高速免疫選択手法によるＣＤ２抗原、Ｔｌｌ Ｔｌ胞赤１１＋１球受容体の分子クローニングＪ（１’ｒｏｃ、ＮａＬｌ、　Δ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４．ｐ＋）、３３６５−６９　（１９８７）、５ａ ｙｒｅ他、同上（１９８７）））。さらに、ＬＦＡ−３結合ドメインを有する可 溶ＣＤ２ポリペプチドが報告されている（ＰＣＴ特許公報〜Ｖ０９０１０８１８ ７）。

また、例えばＴＳ　２／１８、Ｔｌｌ、、Ｔ１１．、Ｔ１１、等のＣＤ２に対す るモノクローナル抗体や、例えばＴ　Ｓ　２　／　９　”ＦのＬＦＡ−３に対す るモノクローナル抗体もまた報告されている（参照例・Ｈｕ　ｇ　ｈ　ｅ　ｓ　 （小、「Ｔ細胞機能レギュレータとしての内皮網ＩＩＪ（１ｍｍｕｎｏ１．Ｒｅ ｖｉｅｗｓ、１１７．ｐｐ、８５−１０２　（１９９０））、Ｍｅｕｅｒ、ｒＴ 細胞活性の別経路：５０ｋｄＴ１１羊赤血球受容体蛋白質の場合の機能的役割Ｊ 　（Ｃｅ　Ｉ　１．３６．Ｉ）ｐ、８９７−９０６　（１９８４））、Ｓａｎｃ ｈｃＺ−Ｍａｄｒｉｄ他、「人間′１゛−リンパ球−媒介の細胞溶解を伴う三種 の異なる抗体：Ｌ　Ｆ　Ａ　−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ−３Ｊ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａ　ｔ　１．八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９．ｐｐ、７４８９−９３　（１ ９８２）））。

一方、移植拒絶を防雨するための免疫応答の抑制が、１ＴＩＩＩＩ性応答を非特 異的にブロックするプレドニゾン（ｐｒｃｄｎ　ｉ　５ｏｎｃ）、シクロスポリ ン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アザチオプリンあるいはシクロホスファミド 等の薬剤により行われている。また、移植組織に々１して反応するＴおよびＩ３ リンパ球をｒｌｔｌするために照ｑ、ｌ技法もｆｌｌ用されている。しかしなが ら、これらの技法による免疫抑制は抗原の＜、’ｉ　ｎ的寛容を生じることがで きないため、患者の偶発的感染を多大に引き起こすおそれかある。加えて、上述 した免疫抑制技法の長期使用により、他の不利益な副作用が生じる。例えば、長 期のシクロスポリン治療は腎臓毒、高血圧および悪性腫瘍の高い発生率を伴う。

細胞障害性Ｔリンパ球の媒介応答はシクロスポリンやプレドニゾンにより制？卸 できるが、体液性拒絶が発生するために免疫抑制療法か無効になる。なお、現在 、このような体液性拒絶に対する治療法は皆無である。

それゆえ、今日まで、異種移植または同種移植の寛容性を改善するに十分である と見なすことのできる方法や治療剤かなかった。したがって、移植組織の拒絶を 緩和するに有効な方法が１是供されてはいるか、このような従来の方法や治療剤 における不都合点を回避するための措置が依然として必要であった。

発明の＋［！Ｅ要 本発明は上述の問題の多くを解消するものである。すなわち、本発明は、まず第 一に、哺乳類における同種移植組織または異種移植組織の寛容性を改善するため の方法を提供する。本発明の方法は哺乳動物、好ましくは人間に対して移植組織 と、１．　ＶΔ−３またはＣ１）２結合蛋白質とを供与する段階から成る。なお 、本発明の方法は、好ましくは、心臓および？フ臓の異種移植および同種移植の 寛容性を改善するために用いられる。また、本発明の方法は移植寛容性の改善の ためのこれまでの治療方法よりも、偶発的感染のおそれ、腎臓毒、高血圧および 悪性ｌｌ１ｊ′Ｉ瘍の増加等の望ましからぬ副作用を回避する等の多くの点て優 れている。

図面の簡単な説明 第１図および２図は、抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体（Ｉｎ２）を注射した２ 頭のヒヒと非特異的イソタイプとしての対照モノクローナル抗体（ＭＯＰＣ２１ ）を注射した１頭のヒヒに対するＴ細胞依存型Ｂ細胞の活性アッセイの結果を示 している。ＥＬＩＳΔアッセイにおけるＯＤユニットによりにＩＭｌした免疫グ ロブリン生成をＸ軸に示す。また、抗Ｌ　ＦＡ−３モノクローナル抗体の初期注 ｇＪ後の日数をＸ軸に示す。

発明の詳細な説明 定義 ここで、ｒＬＦ八−３結合蛋白質ｊとは、ＬＦＡ−３に結合可能な１種以上のポ リペプチドから成る蛋白質をいう。Ｉｊお、このＬ　ＦＡ−３結合蛋白質には免 疫グロブリンＬｔｆｉ（ｌ　ｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）、免疫グロブリン１１鎖（ ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）およびそれらの抗体結合性フラグメントが含まれる。

また、１種以上のポリペプチドから成るり、　ＦＡ−３結合蛋白質の成分ポリペ プチドは必要に応してジスルフィド結合していてもよく、また、共有的に架橋し ていてもよい。したがって、当該ＬＦＡ−３結合蛋白質はＩｇＡ、ＩｇＧ、Ｉｇ Ｅ、ＩｇＤ。

ＩｇＭの種（並びにこれらの亜種）の完全な免疫グロブリンを含み、該免疫グロ ブリンの■、鎖はに（ｋａｐｐａ）またはλ　（ｌａｍｂｄａ）種であってもよ い。さらに、このような結合蛋白質はまたｌ−７ＦＡ−３結合特異性を保持する 、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’　フラグメント、Ｆ（ａｂ’）＝フラ グメント、Ｆ　（Ｖ）フラグメント、１１鎖モノマーまたはダイマー、Ｌ鎖モノ マーまたはダイマー、１種のＩ−１ｔｒ（および１種のし鎖から成るダイマー等 の完全な免疫グロブリンの一部をも含む。

さらに、当該ｒＬＦ△−３ＬＦＡ白質」は、Ｌ　Ｆ　Ａ　−３に結合する、融合 体を含む可溶性ＣＤ２ポリペプチドおよびそれらの誘導体をも意味する。また、 ［可溶性ＣＤ２ポリペプチド」とは、細胞膜内においてそれ自体で連結すること のないＣＤ２ポリペプチドをいう。このような可溶性ポリペプチドには、例えば 、当該ポリペプチドを連結するに十分な膜拡張領域を有さないＣＤ２ポリペプチ ドや当該膜拡張領域が無機能となるように変形されたＣＤ２ポリペプチドが含ま れる。この可溶性ＣＤ２ポリペプチドは天然のＬ　Ｆ　Ａ　−３ポリペプチドに 結合し、（ａ）天然の削孔類ＣＤ２ＤＮＡシーケンス（例；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ ：５）、（ｂ）天然ＣＤ２ＤＮΔシーケンスへのＤＮＡシーケンス縮川、用るい は、（ｃ）’ｌ’。

以下の約２０°Ｃないし２７℃および１Ｍ塩化すトリウムと同等の条件下におい て」二紀ＤＮΔシーケンスの−と対合するＩ）　ＮΔクシ−ンスによりコード化 される。このような可溶性ＣＤ２ポリペプチドは周知であり、例えば、それらの いくつかは本明細書に参考文献として挙げたＰＣＴ　Ｗ０９０１０８１８７号に 記載されている。

さらに、当該ｒＣＤ２結合蛋白質」はＣＤ２に結合可能な１種以上のポリペプチ ドから成る。なお、該ＣＤ２結合蛋白質は免疫グロブリンＬ鎖、免疫グロブリン ＩＩ鎖およびこれらの抗原結合性フラグメントを含む。また、１種以上のポリペ プチドから成るＣＤ２結合蛋白質の成分ポリペプチドは必要に応じてジスルフィ ド結合していてもよく、また、共有的に架橋していてもよい。したがって、当該 ＣＤ２結合蛋白質はＩｇＡ・ＩｇＧ、ＩｇＥ・ＩｇＤ、ＩｇＭの種（！１しびに これらの亜種）の完全な免疫グロブリンを含み、該免疫グロブリンのし鎖はに（ ｋａｐｐａ）またはλ（ｌａｍｂｄａ）種であってもよい。

さらに、このような結合蛋白質はまたＣＤ２結合特異性を保持する、例えば、Ｆ ａｂフラグメント、ｔａｂ’　フラグメント、Ｆ　（ａ　ｂ’　）　２フラグメ ント、Ｆ（ｖ）フラグメント、ＨＳＧＩモノマーまたはダイマー、ＬＳＩモノマ ーまたはダイマー、１種の１１鎖および１種のＬ鎖から成るダイマー等の完全な 免疫グロブリンの一部をも含む。

さらに、当該ｒＣＤ２結合蛋白質」は、ＣＤ２に結合する、融合体を含む可溶性 ［、ＦＡ−３ポリペプチドおよびそれらの誘導体をもＣ味する。また、ここに定 義するように、ヱクＣＤ２結合蛋白質は可溶性ＬＦΔ−３ＦＡペプチドの融合体 およびＬＦＡ３ＴＩＰ　（以下に記載）等の免疫グロブリン領域を含む。また、 ［可溶性ＬＦΔ−３ＦＡペプチド」とは細胞膜内においてそれ自体で結合し得な いＬＦＡ−３ポリペプチドをいう。このような可溶性ポリペプチドには、例えば 、当該ポリペプチドを連結するに十分な膜拡張領域を有さないＬＦＡ−３ポリペ プチドや当該膜拡張領域が無機能となるように変形されたＬＦＡ−３ポリペブチ １−が含まれる。この可溶性ＬＦΔ−３ＦＡペプチドは天然のＣＤ２ポリペブチ １−に結合し、（，１１）天然の削孔類ＬＦΔ−３ＤＮＡシーケンス（例　ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ・１またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３）、（ｂ）天然ＬＦＦＡ３Ｄ ＮＡシーケンスへのＤＮＡシーケンス縮重、あるいは、（ｃ）Ｔ、以下の約２０ ℃ないし２７℃および１Ｍ塩化ナトリウムと同等の条件下において上記ＤＮＡシ ーケンスの−と混成するＤＮＡシーケンスによりコード化される。このような可 溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドは周知であり、例えば、それらのいくつかは本明細 書に参考文献として挙げた米国特許第４９５６２８１号に記載されている。

また、ここに記載の「人間化組換え抗体」とは、組換えＤＮＡ技法により生成さ れた抗体を言い、抗原結合に不要な人間の免疫グロブリンＬ鎖またはトＩ鎖のア ミノ酸の一部または全部が対応する人間以外の哺乳類の免疫グロブリンＬまｔこ はＦＩｓ貞で置き換えられている。

さらに、ここに記載の「キメラ組換え抗体」とは、組換えＤＮＡ技法により生成 された抗体を言い、免疫グロブリンＬ鎖、Ｈ鎖あるいはその両方のヒンジ領域お よび不変領域の一部または全部が他の免疫グロブリンＬ鎖またはＨ鎖からの対応 する領域に置き換えられている。

また、ここに記載の移植組織の「寛容性の改善」とは、移植１巨絶の１種以上の 一般的特性の程度を減するとか除去するという意味である。このような特性は移 植（外来）組織に対する免疫応答を明示するものであり、例えば、リンパ球等の 単核細胞の当該外来組織内への累進的浸透や、リンパ細胞障害抗体の生成、細胞 溶解、ネクローシス、脈管炎、出血および線ＩＵ症等を含む。他の観察容易な改 善された寛容性の呈示としては、非免疫１Ｉｌｌ制の受容体（対！′ｌｑ）に比 して、受容体における移植組織の生存期間が長いことである。

移植組織 本発明の方法は、人間を含む哺乳類において、同種移植組織または異種移植組織 の寛容性を改善する」二で有用である。なお、これらの方法は削孔動物体に移植 組織とＬ　ＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質とを投与する段階から成る。また、 このような移植は、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、ｊＴ４膜、冑髄、肺、皮膚および 血液を含む供給諒から得た組織の同種移植および異種移植を含む。さらに、″５ 該移植組織は上記組織の一部や血液の構成成分を含む。

好ましくは、本発明の方法は心臓の同種移植や異種移植、および腎臓の同種移植 や異種移植に用いられる。また、本発明の方法は哺乳類のいずれにも、好ましく は人間に、適用することができる。

なお、移植組織の選択においては、種々の因子を考慮する必要があり、これらの 因子には、例えば、遺伝的異種性を可能な限り最小にすること、Ａｌ３０血液型 の適合性、）ＩＬＡ適合性、ドナー組織の入手可能性、患者の免疫状態、および ドナー組織の大きさ等が含まれる。特に、心臓および腎臓の同種移植または異種 移植の場合、当該トナー組織は解剖学的に適合性を有しており、かつ、生理学的 に受容体における組織機能の要求を満足し得るものてなければならない。なお、 種々の移植に用いる外科的プロトコルが周知となっている。

理論により拘束されることを望まないが、本出願人は本発明の方法において使用 するＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質がＴ細胞活性を阻害するために、異種移 植または同種移植の寛容性を誘引するための予防および治療手段になると考えて いる。当該阻害作用は一般にＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質がＬＦＡ−３／ ＣＤ２相互作用を阻害する時に生じる。しかしながら、本発明に使用する特定の 、Ｌ　Ｆ　Ａ　−３およびＣＤ２結合蛋白質は当該ＬＦＡ−３／ＣＤ２相互作用 を阻害せずにＴ細胞活性を阻害してもよい。

すなわち、本発明の方法において用いる好ましいＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋 白質はＴ細胞活性を有効的に阻害するものである。

なお、本発明の特定ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質による方法の有用性は、 ＬＦＡ−３／ＣＤ２相互作用を阻害する能力やＴ細胞活性またはこれらの両方を 阻害する能力をアッセイすることにより容易に決定することが可能である。

さらに、このＬＦＡ−３／ＣＤ２相互作用を阻害する能力のアッセイは、例えば 、ＬＦＡ−３とＣＤ２の分子を表現する細胞上での当該ＬＦＡ−３とＣＤ２との 間の相互作用を阻害する事実上の阻害剤の能力の視覚評価（拡大処理下）を可能 にする簡単な細胞結合アッセイを用いることにより行うことができる。この場合 、ジュルカソト（Ｊｕｒｋａｔ）細胞がＣＤ２１基体として好ましく、羊の赤血 球または人間のＪＹ細胞がＬＦＡ−３”基体として好ましい。また、本発明にお いて有用な結合蛋白質の結合特性は、結合蛋白質を放射性ラベル処理（例：３６ ８または　＋２Ｊ）ｌ、、その後、当該ラベル化した結合蛋白質をＣＤ２”また はＬＦＡ＋細胞と適当に接触させる等の幾つかの既知の方法によりアッセイする ことができる。また、該結合特性は酵素によりラベル化した適当な二次的抗体を 用いてもアッセイすることか可能である。さらに、５ｅｅｄ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４．ｐｐ、３３６５−６９（１９８７） ）において記載されるようなロゼツト競合アッセイも使用することかできる。

また、Ｌ　ＦΔ−３およびＣＤ２結合蛋白質のＴ細胞活性を阻害する能力は従来 のＴ細胞活性アッセイのいずれかにより決定することができる。なお、これらは 、例えば、分裂促進因子（マイトゲン）に応じてＴ細胞の増殖や細胞質分泌を阻 害する結合蛋白質の能力や、他の細胞表面蛋白質に対してモノクローナル抗体を 活性化する能力（参照例：Ｍｏｉｎｇｅｏｎ他、ｒＣＤ２の構造的生物学Ｊ　（ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ、、１１１、ｐｐ、１１１−４４　（１９ ８９））を評価するアッセイを含む。

ＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質 本発明の方法においては多種類のＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質が有用であ り、それらには、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ組換え抗体、人間化 組換え抗体、可溶性ＬＦＡ−３およびＣＤ２ポリペプチド、ＬＦＡ−３およびＣ Ｄ２擬態化体、およびこれらの誘導体（例：他のポリペプチドとの融合体）また は部分切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形態が含まれる。

Ａ　抗体 本発明において有用なＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質は、モノクローナル抗 体、組換え抗体、キメラ組換え抗体、人間化組換え抗体、およびこれらの抗原結 合性部分を含む。好ましくは、当該抗体はモノクローナル抗体である。

なお、受入番号ＡＴＣＣＦ（Ｂ　１０６９３　（ＩＥ６）、ＡＴＣＣＨＢ　１０ ６９４　（ＨＣ−ＩＢＩＩ）　、ＡＴＣＣＨＢ　１０６９５　（７Ａ６）　、お よびＡＴＣＣＨＢ　１０６９６　（８８８）を有するハイブリドーマ（雑種細胞 ）の群から選択されたハイブリドーマ、あるいは、ＴＳ２／９として知られるモ ノクローナル抗体（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ他、［人間Ｔ−リンパ球−媒 介の細胞溶解を伴う三種の異なる抗体：ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２およびＬＦＡ− ３Ｊ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９．ｐｐ、７４８ ９−９３　（１９８２））により生成されるモノクローナル抗ＬＦΔ−３抗体を 用いることがより好ましい。　さらに、最も好ましくは、受入番号ＡＴＣＣＨＢ 　１０６９３　（ＩＥ６）を有するハイブリドーマにより生成されるモノクロー ナル抗ＬＦＡ−３抗体を用いることである。

また、抗ＣＤ２抗体のうち、好ましいモノクローナル抗体は、ＴＳ２／１８　（ Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒ　ｉｄ他、同上（１９８２））を含むＴ１１．エピト ープ抗体として知られるモノクローナル抗体を含む。

このようなモノクローナル抗体を生成する技法は周知であり、簡単に宮えば、不 死細胞系（一般に省髄腫細胞）が任意の抗原から成る標品（ｐｒｅｐａｒａｔ　 １ｏｎ）により免疫化（接種）した削孔動物体のリンパ球（一般に肺臓細胞）に 融合し、結果として生じるハイブリドーマの培養上澄み液を当該抗原に対する抗 体についてスクリーニングする（参照・Ｋｏｈｌｅｒ他、「所定特異性の融合細 胞分泌抗体の連続培養Ｊ　（Ｎａｔｕｒｅ、２５６、ｐｐ、４９５−９７　（１ ９７５）））。なお、本発明の目的に有用な免疫原はＬＦＡ−３表現またはＣＤ ２表現細胞、並びに、ＬＦＡ−３、ＣＤ２、またはこれらの逆受容体結合フラグ メント（例：　ＣＤ２に結合するＬＦＡ−３またはＬ　Ｆ　Ａ　−３フラグメン トに結合するＣＤ２フラグメント）を含む無細胞標品を含む。また、少なくとも 免疫グロブリンのヒンジ領域および不変領域に融合した可溶性ＬＦＡ−３ポリペ プチドから成る融合蛋白質等（例：以下に記載するＬＦＡ３Ｔ　Ｉ　Ｐ）の、Ｌ ＦＡ−３、ＣＤ２またはこれらの部分の誘導体も有用である。

なお、免疫処理は標準的手法により行うことができる。

単位投与および接種方法は接種処理される哺乳動物の種類、免疫状態、体重等に 依存する。一般に、接種された哺乳動物から血液が採取され、適当なスクリーニ ングアッセイを用いて特別な抗体について各血液サンプルの血清が評価される。

例えば、それぞれの細胞表面上のＬＦＡ−３およびＣＤ２の存在から生じる羊赤 血球細胞によるジュルカット細胞のロゼツト形成を阻止するための免疫血清の能 力をインビトロにおけるＴ細胞活性の阻害能力、あるいは、当該両畦力をスクリ ーニングしながら試験することにより、有用な抗ＬＦＡ−３および抗ＣＤ２抗体 が同定できる。一般に、ハイブリドーマ細胞の生成に使用されるリンパ球は、接 種されて上記のスクリーニングアッセイを用いてその血清が所望の抗体の存在に ついて既に陽性であると判定された哺乳動物から単離される。

一般に、不死細胞系（例：骨髄腫細胞系）は同一種の哺乳動物からリンパ球細胞 として派生する。好ましい不死細胞系はマウス骨髄腫細胞系であり、当該細胞系 はヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地（ｒＨＡ Ｔ培地」）に対して感応性が高い。

一般に、ＨＡＴ感応性マウス骨髄腫細胞はポリエチレングリコール（ＰＥＧ３３ ５０）を用いてマウス胛臓細胞と融合する。その後、当該融合から生じるハイブ リドーマ細胞はＨＡＴ培地を用いて選別され、該培地は未融合および未生成状態 で融合した骨髄腫細胞を殺す（未融合肺臓細胞は形質転換していないために数日 後に死滅する）。その後、ハイブリドーマ培養上澄み液の、例えば、ＬＦＡ−３ やＣＤ２への結合能力、あるいは、ジュルヵット細胞の羊赤血球細胞に対する付 着の阻止能力についてのスクリーニングにより、所望の抗体を生成するハイブリ ドーマが検出される。また、有用なハイブリドーマの同定はＴ細胞活性の阻害能 力についてのスクリーニングによっても行うことができる。なお、モノクローナ ル性を確保するために限界希釈によるハイブリドーマ培養のサブクローニングが 一般に行われている。

さらに、抗ＬＦＡ−３および抗ＣＤ２モノクローナル抗体を生成するために、上 記スクリーニングアッセイにおいて陽性と判定されたハイブリドーマ細胞を、所 定の栄養培地において、当該ハイブリトーマ細胞が該モノクローナル抗体を当該 培養培地中に分泌するに十分な時間と条件下で培養する。このようなハイブリド ーマ細胞培養に適する組織培養技法および培養培地は周知である。

また、上記の如き細胞を除いたハイブリトーマ培養の上澄み液は収集することが でき、所望の抗体を必要に応して周知の方法によりさらに精製することも可能で ある。

また、当該所望の抗体はブリスタン［２，６，１０゜１４−テトラメチルペンタ デカン（アルドリッジケミカル社、ミルウォーキー、ライスコンシン）］注入し たマウスの腹膜腔内に当該ハイブリトーマ細胞を注射することによっても生成す ることができる。すなわち、該ハイブリドーマ細胞は当該腹膜腔内において増殖 し、腹水液内に溜まる抗体を分泌する。さらに、該抗体は注射器により当該腹膜 腔部から腹水液を取り出すことにより採取できる。

また、本発明において有用なＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質は、所望の抗体 の免疫グロブリンＬ鎖およびＩ（鎖をコードするＤＮＡにより形質転換した宿主 細胞、あるいは、これらのＬＦＡ−３またはＣＤ２結合部位により生成した組換 え抗体であってもよい。このような組換え抗体は周知の遺伝子工学的技法により 生成することかできる（参照例：本明細書において参考文献として記載の米国特 許第４８１６３９７号）。

例えば、該組換え抗体は、本発明において有用な抗体を生成するハイブリドーマ から所望の抗体の免疫グロブリンＬ鎖およびＨ鎖をコードするｃＤＮＡまたはゲ ノムＤＮＡをクローニングすることにより生成することができる。その後、これ らのポリペプチドをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは表現ベクタ内に挿 入され、ＤＮＡシーケンスの両方が一以上の転写および翻訳表現制御シーケンス に連結する。さらに、これらの表現ベクタおよび表現制御シーケンスから上記の 表現宿主細胞に対して適合性のあるものが選ばれる。ＤＮＡの両シーケンスは異 なる表現ベクタに挿入することもできるが、通常、同一の表現ベクタに挿入され る。

この場合、原核または真核宿主細胞が表現宿主として使用できる。なお、真核宿 主細胞は原核細胞に比して適切に折りたたまれかつ免疫学的に活性な抗体を組み 合わせ分泌しやすいので、当該真核宿主細胞を使用するの方が好ましい。しかし ながら、周知の方法により、不適切な折りたたみにより不活性となったいかなる 抗体も再生することが可能である（ＫｉｍおよびＢａ　Ｉ　ｄｗｉ　ｎ。

［小蛋白質の折りたたみ反応における特異的中間体および蛋白質の折りたたみ機 構ｊ　（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、、５１．　ｐＩ）、４５９−８９　（１９８２）））。また、該宿主 細胞はＬ鎖ダイマーまたはＨ鎖ダイマー等の本発明に有用な完全抗体の部分を生 成することか可能である。

さらに、上述の手法における種々の変形もまた本発明において有用となる。例え ば、抗ＬＦＡ−３または抗ＣＤ２抗体のＬ鎖またはＨ鎖のいずれか（両方ではな い）をコートするＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することも可能である。ま た、組換えＤＮＡ技法を、ＬＦＡ−３やＣＤ２の対受容体結合に不要なＬ鎖およ びＨ鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡの一部またはすべてを除去する ために使用することもできる。このようにして部分的に切除したＤＮＡ分子から 表現された分子は本発明の方法に有用である。加えて、二官能性抗体も生成する ことができ、この場合、１個のＨ鎖および１個のし鎖がＬＦＡ−３またはＣＤ２ に対して特異的であり、かつ、他のＨ鎖およびＬ鎖がＬＦＡ−３またはＣＤ２以 外の抗原若しくはＬＦＡ−３またはＣＤ２の他のエピトープに対して特異的であ る。

また、所望の免疫グロブリンＬ鎖およびＨ鎖をコードするＤＮＡから成る適当な 表現ベクタを用いて宿主細胞を形質転換することにより、キメラ組換え抗体を生 成することができる。この場合、当該り鎖および／またはＨ鎖のヒンジ領域およ び不変領域をコードするＤＮＡのすべてまたは一部が異なる種の免疫グロブリン Ｌ鎖またはＨ鎖の対応する領域からのＤＮＡにより置き換えられている。元の組 換え抗体が人間のものではなく、当該抗ＬＦＡ−３または抗ＣＤ２抗体が人間に 投与される場合、人間のシーケンスに対応する置き換えを行うことが好ましい。

例示的なキメラ組換え抗体としては、マウスの可変領域と人間のヒンジ領域およ び不変領域とを有するものが挙げられる（参照：米国特許第４８１６３９７号お よびＭｏｒｒｉｓｏｎ外、「キメラ人間抗体分子二人間不変領域ドメインを有す るマウス抗原結合ドメイン」（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ、Δｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、８１、ｐｐ、６８５１−５５　（１９８４）））。

また、人間化した組換え抗ＬＦＡ−３または抗ＣＤ２抗体は所望の非人間の免疫 グロブリンＬ鎖およびＨ鎖をコードするＤＮＡから成る適当な表現ベクタを用い て宿主細胞を形質転換することにより生成できる。この場合、抗原結合に関与し ないアミノ酸をコードするＤＮＡのすべてまたは一部が所望の人間の免疫グロブ リンＬ鎖およびＨ鎖からのＤＮＡにより置き換えられている（参照：Ｊｏｎｅｓ 他、「人間の抗体における補足的決定領域のマウスにおけるものによる置き換え Ｊ　（Ｎａｔｕｒｅ。

３２１、ｐｐ、５２２−２５　（１９８６）、および、欧州特許第０２３９４０ ０号））。

また、完全でない抗ＬＦＡ−３および抗ＣＤ２抗体もまた本発明において有用で ある。なお、このような抗体は上述の抗体のいずれかから誘導することができる 。例えば、上述の抗体から派生する抗原結合フラグメント並びに完全長モノマー 、ダイマーまたはトリマーポリペプチドがそれ自体で有用である。この種の有用 な結合蛋白質として、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’　フラグメント、Ｆ（ａｂ ’）＊フラグメント、Ｆ　（Ｖ）フラグメント、Ｈ鎖モノマーまたはダイマー、 Ｌ鎖モノマーまたはダイマー、１個のＨ鎖および１個のＬ鎖から成るダイマー等 が挙げられる。

当該抗体フラグメントは、例えば、ベプンンまたはパパイン等のプロテアーゼを 用いる完全抗体の開裂、および、当該開裂生成物の還元剤による処理等の化学的 方法によっても生成することができる。また、有用なフラグメントを部分切除し たＨ鎖および／またはＬ鎖の遺伝子により形質転換した宿主細胞を用いることに よって生成することもできる。これらのＨ鎖およびＬ鎖モノマーはジチオトレイ トール（ｄｉ　ｔｈｉｏｔｈｒｅｉ　ｔｏｌ）等の還元剤を用いて完全な抗体を 処理した後、当該鎖状体を分離するべく精製することにより得られる。また、該 Ｈ鎖およびＬ鎖モノマーは所望のＨ鎖またはＬ鎖のいずれか（両方ではない）を コードするＤＮＡを用いて形質変換した宿主細胞により生成することができる（ 参照：　Ｗ　ａ　ｒ　ｄ他、［大腸菌から分泌した単一の免疫グロブリン可変ド メインの範驕における結合活性Ｊ（Ｎａｔｕｒｅ、３４１．ｐｐ、５４４−４６ 　（１９８９）　、５ａ５ｔｒｙ他、［モノクローナルな接触抗体の発生のため の大腸菌における免疫学的な範晴におけるクローニング：Ｈ鎖可変領域特異性ｃ ＤＮＡライブラリの構造Ｊ　（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、８６゜ｐｐ、５７２８−３２　（１９８９）））。

Ｂ、可溶性ＣＤ２およびＬＦＡ−３ポリペプチド本発明の方法において有用なＬ ＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質は可溶性ＣＤ２およびＬＦＡ−３ポリペプチド を含む。このうち、可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドがより好ましい。

該可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドはＬＦＡ−３のトランスメンブラン形態、特に 、細胞外ドメイン（例：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＡＡ＋　ＡＡ＋ａ７）から誘 導することができる。このようなポリペプチドは本明細書の参考文献でもある米 国特許第４９５６２８１号および同時係属で共同譲渡されている米国特許出願０ ７／６６７９７１号および０７／７７０９６７号に記載されている。

好ましい可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドとしては、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のΔ Δ、−ＡＡ、、、ＳＥＱ　ＩＤＮ０＝２のＡＡ、−ＡＡ、。、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ＋２のＡ　Ａ　ｓ。−Ａ　Ａ　、、およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＡ　Ａ　 ２゜Ａ　Ａ　ｓ。から成るポリペプチドが含まれる。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２を コードするＤＮＡシーケンス（すなわちＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）から成るバク テリオファージが受入番号ＡＴＣＣ７５１０７においてアメリカンタイプ力ルチ ャーコレクンヨン（Ｒｏｃｋｖｉ　Ｉ　ｌｅ、Ｍａｒｙａｎｄ）に寄託されてい る。

該可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドはまたＰＣＴ特許出願ＷＯ９０１０２１８１号 に記載されるもの等のＬＦＡ−３のｌ’ｌ連結形態から誘導できる。なお、当該 ＰＩ連結ＬＦＡ−３をコードするＤＮＡシーケンス（すなわちＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：３）から成るベクターが受入番号ＡＴＣＣ６８７８８においてアメリカンタ イプカルチャーコレクシ−ａン（Ｒｏｃｋｖ　ｉ　ｌ　ｌ　ｅ、Ｍａ　ｒｙａｎ ｄ）に寄託されている。該ＬＦＡ−３のＰ１連結形態およびＬＦＡ−３のトラン スメンブラン形態はその細胞外ドメイン全体にわたって同一のアミノ酸シーケン スを有しているため、当該ＰＩ連結ＬＦＡ−３から派生する好ましい可溶性ＬＦ Ａ−３ポリペプチドはＬＦＡ−３のトランスメンブラン形態から派生するものと 同一である。

また、可溶性ＣＤ２ポリペプチドは完全長ｃＤ２、特に、その細胞外ドメイン（ 例：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のＡ　Ａ　＋　−Ａ　Ａ　＋ｓｓ　）から誘導する ことができる。このようなポリペプチドはＣＤ２の細胞外ドメインの全部および 一部分から構成できる。好適な可溶性ＣＤ２ポリペプチドが参考文献でもあるＰ ＣＴ　ＷＯ９０１０８１８７に記載されている。

本発明において有用な可溶性ポリペプチドの生成は当業界において知られる種々 の方法により行うことができる。例えば、当該ポリペプチドを完全なトランスメ ンブランＬＦＡ−３またはＣＤ２分子、若しくは、完全なＰＩ連結ＬＦＡ−３分 子から、エンドペプチダーゼと組み合わせた特定のエンドペプチダーゼ、エドマ ン分解、あるいはこれらの両方による蛋白質分解により得ることができる。この ような完全なＬＦＡ−３分子または完全なＣＤ２分子は従来の方法によりその天 然の形態から精製することができる。また、該完全なＬＦＡ−３またはＣＤ２は ｃＤＮＡを用いて既知の組換えＤＮＡ技法により生成することもできる（参照例 ：Ｗａｌｌｎｅｒ他の米国特許第４９５６２８１号、Ａｒｕｆｆｏおよび５ｅｅ ｄ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８４、ｐｐ、２９４１−４５　（１９８７））　、５ａｙｒｅ他（Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８４、ｐｐ、２９４１−４５　（１９８７）））。

好ましくは、当該本発明に有用な可溶性ポリペプチドは直接に生成されて、完全 なＬＦＡ−３分子や完全なＣＤ２分子を出発原料として得る必要性がないことで ある。

このことは従来の化学的合成技法や周知の組換えＤＮＡ技法により行うことがで き、この場合、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡシーケンスのみが形質転 換した宿主に表現される。例えば、所望の可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドまたは 可溶性ＣＤ２ポリペプチドをコードするＤＮＡシーケンスはオリゴヌクレオチド シンセサイザを用いる化学的手段により合成することができる。このようなオリ ゴヌクレオチドは所望の可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドや可溶性ＣＤ２ポリペプ チドのアミノ酸シーケンスに基づいて設計される。さらに、該所望のポリペプチ ドに対する特定のＤＮＡシーケンスのコード化は、特定の制限エンドヌクレアー ゼフラグメントの単離や所望領域のＰＣＲ合成によって、完全長ＤＮＡシーケン スから誘導することができる。

また、これらの可溶性ＬＦＡ−３およびＣＤ２ポリペプチドは形質転換した宿主 細胞の発酵や培養により単離でき、さらに、種々の従来法のいずれかによって精 製することが可能である。当業者においては、最も好適である単離法および精製 法を選択することが可能である。

組換えＤＮＡ技法は２０個以上のアミノ酸シーケンスを有する有用な可溶性ＣＤ ２ポリペプチドや可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドを生成する好ましい方法である が、２０個のアミノ酸よりも少ないシーケンスから成る短いＣＤ２またはＬＦＡ −３ポリペプチドは従来の化学的合成技法により生成されることが好ましい。こ のように合成技法で生成する本発明に有用なポリペプチドは極めて収率が高く容 易に精製できる点で有利である。

Ｃ，ＬＦＡ−３およびＣＤ２擬態物質 本発明の方法において有用なＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質には、当該ＬＦ Ａ−３およびＣＤ２の擬態物質も含まれる。このような物質はペプチド、半ペプ チド化合物または非ペプチド化合物であり、ＣＤ２　（ＬＦＡ−３擬態物質）や ＬＦＡ−３（ＣＤ２擬態物質）に結合して、ＣＤ２／ＬＦＡ−３相互作用、Ｔ細 胞活性あるいはこれらの両方を阻害する。

このような擬態物質は複数のペプチド（例：　５−２０個のアミノ酸長）、半ペ プチド化合物、非ペプチド化合物または有機化合物を合成した後、ＣＤ２／ＬＦ Ａ−３相互作用の阻害能力またはＴ細胞活性の阻害能力あるいはこれらの両方に ついて当該化合物をスクリーニングすることにより生成することができる（参照 ：米国特゛許第４８３３０９２号、５ｃｏｔｔおよびＳｍ１ｔｈ、「エピトープ ライブラリを用いたペプチドリガンドのサーチ」（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９．ｐ ｐ、３８６−９０　（１９９０）　、Ｄｅｖｌ　ｉｎ他、「ランダムペプチドラ イブラリ：特定蛋白結合分子の供給源Ｊ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、ｐｐ、４ ０４−０７　（１９９０）））　。

Ｄ　派生的ＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質本発明の方法において有用なもの としては上述のＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質の融合体や混成体を含む派生 形態も含まれ、当該ＬＦＡ−３やＣＤ２結合蛋白質のいずれも１種以上の同一ま たは異なるＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質、薬剤あるいはこれらの両方に機 能的に連結する（化学的結合あるいは遺伝的融合等による）このような派生結合 蛋白質の１種は、２種以上のＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質（同一種または 異なる種類のもの）の架橋により生成される。この場合に適する架橋剤としては 、ヘテロニ官能性の、適当なスペーサにより分離した２種の異なる反応基を有す るもの（例：ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ル）や、ホモニ官能性のもの（例：スペリン酸ジスクシンイミジル）が含まれる 。また、連結剤としてはピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ｌ１ｌｉｎ。

ｉｓ）により販売されるものが使用できる。

さらに、当該架橋処理においては、ＰＩ連結ＬＦＡ−３やそのフラグメントにお けるＰｌ連結信号シーケンスを利用することかできる。特に、該Ｐ■連結信号シ ーケンス（例：ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：４のＡ　Ａ　＋ｓ２Ａ　Ａ　ｔ＋２）をコ ードするＤＮＡは所望のポリペプチド、好ましくは可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチ ドをコードするＤＮＡの下流で連結する。もしもこのような構成が適当な真核細 胞において表現されれば、当該細胞はＰＩ連結信号シーケンスを認識してＰＩを ポリペプチドに共有的に連結する。而して、該ＰＩの疎水性によりポリペプチド のミセル凝集体が形成される。

また、１種以上の薬剤に連結したＬＦＡ−３およびＣＤ２結合蛋白質（例：融合 または混成蛋白質）もまた有用である。この場合、有用な薬剤としては、ＬＦＡ −３やＣＤ２以外のポリペプチドに対して特異的な抗体等の生物学的に活性なペ プチド、ポリペプチドおよび蛋白質か挙げられる。また、その他の有用な薬剤と しては、例えば、シクロスポリンＡ１ブレドニソン、ＦＫ５０６、メトトレキセ ート、ステロイドおよびレチノイド等の免疫抑制剤が挙げられる。

また、好ましい派生的結合蛋白質としては、組換え技法により生成されたポリペ プチドがあり、この場合、可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチド、可溶性ＣＤ２ポリペ プチドまたはペプチジルＣＤ２やペプチジルＬＦＡ−３擬態物質が免疫グロブリ ンＨ鎖のヒンジ領域の全部または一部および免疫グロブリンＨ鎖の不変領域の全 部または一部に融合している。このような融合蛋白質により血清の半減期が比較 的延長できかつ結合蛋白質の三量化が容易となると考えられる。

このような融合蛋白質を生成するための好ましいポリペプチドは可溶性ＬＦＡ− ３ポリペプチドであり、ｓＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ　：　２ノＡＡ＋　ＡＡｓｓ、Ｓ ＥＱ　ＩＤＮ　Ｏ＋　２　ノＡ　Ａ　１Ａ　Ａ　自ｏ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ のＡ　Ａ　ｓｏ　Ａ　Ａ　ａｓオヨヒＳ　Ｅ　Ｑ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ｏ：　２０）Ａ 　Ａ　＊。

−ＡＡ、。から成る群より選択した可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドが最も好まし い。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２をｒ−ｔ’するＤＮＡシー’ｒンス（すなわちＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：１）から成るバクテリオファージがアメリカンタイプカルチャーコ レクション（Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　Ｉｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に受入番号ＡＴＣＣ ７５１０７で寄託されている。

この種の最も好ましい融合蛋白質は、成熟したＬＦＡ−３の９２個のアミノ酸か ら成るアミノ末端、内部鎖状ジスルフィド結合に関与すると考えられる２個のシ スティン残基を含む人間１　ｇＧ　、ヒンジ領域の１０個のアミノ酸から成るＣ 末端、および人間１ｇＧ、Ｈ鎖の不変ドメインのＣＨ２およびＣ８３領域（例： ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　：　８）を含む。以下、このような融合蛋白質を［ＬＦＡ３ ＴＩＰＪと称する。典型的なＬＦＡ３Ｔ　Ｉ　ＰをコードするプラスミドｐｓＡ Ｂ１５２がアメリカンタイプ力ルチャーコレクンヨ：／　（Ｒｏｃｋｖｉ　！　 Ｉｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に受入番号ＡＴＣＣ６８７２０で寄託されている。ま た、当該ｐｓＡＢ１５２の挿入のＤＮＡシーケンスはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアで ある。

本発明の方法において用いるＬＦＡ３Ｔ　Ｉ　Ｐを生成する方法の一例が同時係 属の共同譲渡された米国特許出願第０７　／　７７０９６７　号１：記載すｈ　 ７−イ”ｊ　一般Ｌ：、ｐＳＡＢ１５２により形質転換したＣ０８７細胞の細胞 を除いた培養液はスパイラルカートリッジシステムＡＭＩＣＯＮ　５ＩＹ３０　 （ＡＭＩＣＯＮ、Ｄａｎｖｅｒｓ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて濃縮され、プロティンＡセファ０−ス４ Ｂ　（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のクロマトグラフィ にがけられる。その後、結合した蛋白質は溶出され、スーパーロース（Ｓｕｐｅ ｒｏｓｅ）−１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅ ｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）のゲル濾過クロマトグラフィにかけられる。

このスーパーロース−１２のフラクションは最少量の混入蛋白質のＬＦＡ３ＴＩ Ｐを含む。このことはゲル分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンプロット （Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析により決定できる（参照例：Ｔｏｗｂｉｎ他 、（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４．ｐｐ、４３５０−５４　（１９７９））、抗体（Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ＋、ｐｐ、４７４−５１０　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８８）））。

当該フラクションは集められ、ＹＭ３０セントリコン（Ｃｅｎ　ｔ　ｒ　ｉ　ｃ ｏｎ）（ＡＭＩ　Ｃ０Ｎ）において濃縮される。該ＬＦＡ３ＴＩＰはうさぎ抗Ｌ ＦＡ−３ポリクローナル抗血清を用いてウェスタンプロット上で検出された後、 山羊の抗うさぎＩｇＧでラベル化される。このＣＯ３７細胞の精製されたＬＦＡ ３ＴＩＰはジスルフィド結合により連結した２種のモノマーＬＦＡ−３−１ｇ融 合蛋白質の二量体であった。

本発明による薬剤組成物および方法 本発明による方法は削孔類動物に移植組織と１種以上の派生体を含むＬＦＡ−３ またはＣＤ２結合蛋白質を投与することにより同種移植組織または異種移植組織 の寛容性を改善する。このＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質は薬剤組成物の一 部として投与することもできる。

すなわち、有用な薬剤組成物は派生体を含む１種以上のＬＦＡ−３またはＣＤ２ から成り、一般に、薬理的に許容可能なキャリヤ内に収容されている。なお、［ 薬理的に許容可能なキャリヤ」とは投与体である患者においてアレルギー反応や 不都合な作用を生じないキャリヤを意味する。

この場合、薬理的に許容可能な好適キャリヤとして、例えば、水、生理食塩水、 リン酸塩バッファー処理した生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタ ノール等の１種以上並びにこれらの混合物が挙げられる。さらに、該薬理的許容 可能なキャリヤは保存性やＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質の効果を高める湿 潤剤または乳化剤、防腐剤またはバッファー等の少量の補助物質により構成され ていてもよい。

このような本発明に有用なＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質や組成物は上述の 如く定義した同種移植または異種移植に対する寛容性を改善し得る量という意味 において「効果的な量」で投与されることが好ましい。

なお、当業者においては、当該効果的な量のＬＦＡ−３やＣＤ２結合蛋白質が、 とりわけ、投与スケジュール、単位投薬量、該ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白 質が他の治療剤との組み合わせで投与されるか否か、患者の免疫状態および健康 状態、投与された特定のＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質の治療的並びに予防 的活性、および、その血清の半減期に依存することは明らかである。

さらに、上記薬剤組成物は一般的な免疫抑制剤と共に使用することも可能である 。これらは、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、および、メチルプレド ニソロン　アセテート（Ｄｅｐｏ−Ｍｅｄ　ｒｏ　Ｉ）　、メチルプレドニソロ ン　ナトリウム　スクシネート（Ｓｏｌｕｍｅｄｅ　ｒｏ　ｌ）等のステロイド 、および治療を受ける哺乳動物における免疫応答を抑制するに効果的な量で投与 されたプレドニソンを含む。例えば、シクロスポリンは手術の前日から初めて手 術後２−２５　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ　７日で投与することができ、また、アザチ オプリンは５〇−２００ｍｇ７日で、ツルメゾロール（Ｓｏｌｕｍｅｄｅｒｏｔ ）は移植時および手術後最初の日において静脈内に１２５ｍｇで、プレドニソン は手術後二日目から初めて１　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ　７日で、さらに、デポ−メ トロール（Ｄｅｐｏ−Ｍｅｄｒｏりは手術後二日目から初めて０゜８ｍｇ／ｋｇ ／日で投与することができる。なお、これらの投薬量は当然ながら当業者に周知 の因子により変更可能である。一般に、ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質と共 に使用する場合は、これらの免疫抑制剤の効果的濃度を可能な限り低くすること が望ましい。

さらに、上記薬剤組成物は他の治療剤または予防剤がら構成されていてもよい。

また、これらのＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質やその他の活性薬剤は単一の 複合分子の形態であってもよい。なお、当該２種の化合物の複合化は当業界にお いて周知の標準的架橋技法によって行える。また、単一分子は組換え融合蛋白質 の形態をも採りえる。

これらの付加的な免疫抑制剤、治療剤または予防剤は単一の投薬形態において該 ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質と共に投薬することができ、また、該ＬＦＡ −３やＣＤ２結合蛋白質とは別にがっこれと同時期に複合的投薬形態において投 薬することもでき、さらに、これらの成分を別々にかつ連続的に投与する複合的 投薬形態ににおいて有利である。

また、上記の薬剤組成物やＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質は種々の形態を採 り得る。例えば、錠剤、丸薬、粉、溶液、分散液や懸濁液、リポゾーム、座薬、 注射可能および注入可能溶液等の固体、半固体および液体の投薬形態が挙げられ る。なお、好ましい形態は意図された投薬状態および治療方法に依存する。ただ し、注射可能または注入可能な溶液が一般的に好ましい。

一般に、該ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質は治療用の殺菌した生理食塩水溶 液において懸濁する。また、上記薬剤組成物はその活性成分の放出を制御し、ま た、受容体におけるそれらの存在期間を延長するように形成することができる。

このための好適な薬剤放出システムが数多く知られており、例えば、ヒドロゲル 、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リボゾーム、マイクロエマ ルジョン、微小球等の態様が挙げられる。

本発明によれば、移植組織と特定のＬＦＡ−３結合蛋白質とを受容する哺乳動物 体に対して、体重１ｋｇ当たり約０．０１ないし約１０　ｍ　ｇ　ｓより好まし くは約０゜工ないし約５ｍｇ、最も好ましくは約０．１ないし約２ｍｇのＬＦＡ −３結合蛋白質が投薬される。

また、移植組織と特定のＣＤ２結合蛋白質とを受容する哺乳動物体に対しては、 体重１ｋｇ当たり約０．ｏｌないし約１０　ｍ　ｇ　、より好ましくは約０．０ １ないし約２ｍｇ、最も好ましくは約０．０１ないし約１ｍｇのＣＤ２結合蛋白 質が投薬される。

該ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質または組成物は、投薬者の判断において、 同種移植または異種移植組織の拒絶のおそれがなくなるまで１日当たり約１回投 薬される。また、該ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質または組成物の投薬期間 は該哺乳動物体における移植組織の許容性に依存する。当該拒絶の一般的な臨床 的兆候は移植された特定組織により変化する。しかしながら、発熱、異和感、組 織機能障害等が当該拒絶の典型的臨床兆候として挙げられる。さらに、該組織機 能障害の兆候は移植された組織に依存するが、当業者において周知でありかつ認 識されている指標により特徴付けられる。

治療の経過は、リンパ球の浸透度を決定するための切開的心筋バイオプシーや経 皮的内心筋バイオプシー等のバイオプシー、リンパ球細胞障害抗体生成の程度を 決定するための血液アッセイまたは混合リンパ球反応等の種々の方法により計測 することができる（参照例：Ｋｒｅｎｓｋｙ他、（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．．１ ３１．ｐｉ）。

６１１−１６　（１９８３）　、Ｂｒａｄｌｅｙ、細胞免疫学において選択され た方法における「混合リンパ球応答」（Ｍｉ　ｓｈｅ　ｌ　ａｎｄ　Ｓｈｉ　ｉ ｇｉ、ｅｄｓ、）。

ｐｐ、１６２−６４　（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、、Ｓａｎ　 Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　１９８０））。腎臓移植の場合、バイオプシーは単核細胞 の浸透度および増殖度、動脈内皮および移植組織における媒体のネタローシスの 程度を決定するために行われる（Ｃｏｓｉｍｉ他、Ｊ、Ｔｍｍｕｎｏｌ、、１４ ４．ｐｐ、４６０４−１２　（１９９０））。

本発明の方法は、同種移植組織の場合の好ましい実施態様において、移植前に三 日間連続して一日当たり１回、また、移植後に一日から土日にわたり連続して一 日当たり１回ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質を投与することから成る。より 好ましくは、該ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質を移植前に三日間連続して一 日当たり１回、また、移植後に三日間連続して一日当たり１回投与する。

また、本発明の方法は、異種移植組織の場合の好ましい実施態様において、移植 前に、ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質を該異種移植供給源からの組織と同時 期に投与することから成る。ここでの［同時期に（ｃｏｎ−ｔｅｍｐｏｒａｎｅ ｏｕｓ　Ｉｙ）Ｊとは、異種移植供給源（移植組織以外）からの組織とＬＦＡ− ３またはＣＤ２結合蛋白質との投与については、当該結合蛋白質が有効な免疫応 答を阻害するに効果の有るレベルで該異種移植供給源からの組織に結合するに足 る時間内にこれらの投与が十分に行われることを意味する。好ましくは、当該結 合蛋白質が飽和レベルで該異種移植供給源からの組織に結合する。本発明の好ま しい実施態様においては、一方の投与が他方の投与の約Ｏないし６時間以内に行 われる。さらに、最も好ましくは、該異種移植供給源からの組織とＬＦＡ−３ま たはＣＤ２結合蛋白質とが互いに約０ないし１時間以内に投与される。この場合 、どちらを先に投与してもよい。しかしながら、当該結合蛋白質を異種移植供給 源からの組織に先立って投与する方が好ましい。

また、本発明の他の実施例においては、当該同時期投与の後、移植前にＬＦＡ− ３またはＣＤ２結合蛋白質の投与が行われる。

より好ましくは、該Ｌ　Ｆ　Ａ’−３またはＣＤ２結合蛋白質を該異種移植の前 に三日間続けて一日に１回投与し、その後、−日に１回該異種移植供給源からの 組織と同時期に投与し、さらにその後、−日ないし土日間続けて一日に１回投与 する。もしも該異種移植供給源の種と受容体の種とが極めて不一致であれば、上 述のスケジュールに従って、ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質を三日間続けて 一日に１回当該異種移植供給源からの組織と同時期に投与することが必要になる 。好ましい実施態様においては、上述のスケジュールに従って、該結合蛋白質を 当該同時期投与の後および当該移植の前に５日ないし１０日間続けて一日に１回 投与する。また、最も好ましくは、当該ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質と異 種移植供給源からの組織との同時期投与を同時に行う。

理論に拘束されるわけではないが、出願人は異種移植供給源からの組織を、当該 組織に対して特異的に反応する活性化した細胞の集団の増加を阻害するべく、哺 乳動物体にＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質と同時期に投与した。而して、該 ＬＦＡ−３またはＣＤ２の同時期投与は上記特定の異種移植供給源からの細胞に より運ばれる抗原の特定の部分的集合に対して寛容性を誘引する。

したがって、該異種移植供給源からのいがなる組織も適応可能であるが、特に、 当該異種移植供給源からの血液細胞が好ましいことが理解できる。このような組 織は免疫応答を誘引するに足る量で投与する必要がある。なお、当該異種移植供 給源からの組織の投与の好ましい方法としては静脈注射が挙げられる。特に、約 １×１０６ないし約１×１０＠個の全血液細胞の投与が当該異種移植供給源から の組織として最も好ましい効果を示す。しがしながら、これよりも低いあるいは 高い投薬量や他の投与スケジュールも適用可能である。

該ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質またはその薬剤組成物は静脈、筋肉内、皮 下、関節内、粗膜内、骨膜、経口、局所的または吸入等を介して投与できる。通 常、静脈内または筋肉内投与が好ましいが、ＬＦＡ−３を表現する体内における 細胞が広範囲であるため、移植領域におけるより局所的な投与がより望ましい場 合がある。

本発明の方法の好ましい実施態様においては、哺乳動物体への移植前に、移植組 織の一面に効果的な量のＬＦＡ−３やＣＤ２結合蛋白質が注がれる。最も好まし くは、当該哺乳動物体への移植前に移植組織の一面に、該移植組織上のＣＤ２ま たはＬＦＡ−３部位を飽和するに足るＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質を注ぐ 。

本発明をさらによく理解するために、以下の実験例を説明する。なお、これらの 実験例は例示のためであり、本発明の範囲をこれに限るものではない。

実験例 実験例１ 抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体ＩＥ６およびモノクローナル抗体ＭＯＰＣ２１ の精製 ＩＥ６ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣＨＢ　１０６９３）を４０リツトルの攪拌 ガラス容器（Ｂｅｌｌｃｏ。

＃１９６５３６０００）中で、２％ウシ胎児血清、１５０μｇ／ｍｌのストレプ トマイシンおよび５０μｇ　／　ｍｌのゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯＬｉｆｅ　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ） の存在下、ＲＰＭ１１６４０培地中において、３７℃で７−１０日間培養した。

この細胞を除いた培養液を１００リツトルのカーボイ（ＮＡＬＧＥＮＥ）中に入 れた。その後、アジ化ナトリウムを加えて当該懸濁液の最終濃度を０．０２％に した。室温で、５μフイルタカートリツジ（Ｐｏｌｙｇａｒｄ、＃ＣＮ５００１ ＥＯ６，Ｍｉ　Ｉ　Ｉ　１ｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔ ｔｓ）により細胞破片を除いた後、０゜３μフイルタカートリツジ（Ｐｏｌｙｇ ａｒｄ、＃ＣＮ０３０１ＥＯ６，Ｍｉ　ｌ　Ｉ　１ｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）により処理した。その後、４℃で、７Ｍ３ｏ　Ｓ １０スパイラルフイルタカートリツジ（ＡＭＩＣＯＮ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓ ｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）により、上澄み液を５０ないし１００倍に濃縮した。こ の５０リツトルの細胞を除いた培養液からの濃縮液を２倍量の平衡バッファー（ ３Ｍグリシン、１．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８，９）で希釈し、４℃で一晩、 重力により、９０ｍ１のプロティンＡセファロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−３ｅ ｐｈａｒｏｓｅ：５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ 、Ｎｅｗ　Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）を通した。

使用カラムを平衡バッファーで洗浄し、１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３ ，０）により結合蛋白質を溶出した。この溶出フラクションを１／１ｏフラクシ ヨン容積（７）ＬＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，８）中ニ集メタ。次いで、当該フ ラクションのＡ２８０読取部分を取り出し、当該溶出蛋白質を含むフラクション を集めて−７０”Ｃで保存した。このようにしてプロティンＡ精製ＩＥ６を全部 で約２００リツトルの細胞を除いた培養液から作成した。この種々の収集物を、 ２リツトルのアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）攪拌セル中でＹＭ３０フィルタ（ＡＭＩ ＣＯＮ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて溶解し、組み 合わせ、約１０ｍｇ／ｍｌ蛋白質に濃縮した。その後、この濃縮物を５分割して それぞれ１００ｍ１の部分に分けて、各分割部分を、室温で、リン酸塩バッファ ー処理した生理食塩水中に展開した１リツトルのスーパーロース（Ｓｕｐｅｒｏ ｓｅ）−５ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）中に通した。次いで、ＩＥ６を含むピークフラクション を集めて一７０℃で保存した。

このようにしてすべての材料を処理した後、収集物を溶かし、組み合わせ、リン 酸塩バッファー処理した生理食塩水により２−３ｍｇ／ｍｌ蛋白質に調節した。

その後、最終的に得られた材料を１５ｍ１の部分に分けて一７０℃で使用するま で保存した。

ＭＯＰＣ２１をシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した腹水から精 製した。すなわち、該腹水を、３Ｍグリシン、１．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８ ，９の「プロティンムロ−ディングバッファー（Ｐｒｏｔａｉｎ　Ａ　ｌｏａｄ ｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）Ｊ中に希釈し、室温で２５ｍ１のプロティンＡセフ　７ 　ロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、Ｎｅ ｗ　Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）に通した。次いで、該カラムを２８０ｎｍにおける光 学濃度が基線レベルに戻るまで上記ローディングバッファーにより洗浄した。そ の後、結合したＩｇＧを５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３，０）により室温で溶 出し、５０倍容積のリン酸塩バッファー処理した生理食塩水に対して４℃で一晩 透析した。透析後、該ＭＯＰＣ２１を室温でリン酸塩バッファー処理した生理食 塩水中に展開した１リツトルのスーパーロース−６ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）中に通した。次いで、 該ＭＯＰＣ２１をふくむピークフラクションを集め、リン酸塩バッファー処理し た生理食塩水により２ｍｇ／ｍｌ蛋白質の最終濃度に調節し、各３０ｍｇに分割 した後、−７０℃で使用時まで保存した。このようにして得たすべての作成物に は、市販のキット式クロモゲンＬＡＬ　（Ｗｈ　ｉ　ｔ　ｔ　ａｋｅｒ　Ｍ、Ａ 、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に より、１０ユニット／ｍｌ以下のエンドトキシンが含まれていることが分かった 。以下、特に記載のない限り、すべての精製処理は室温下で行った。

実験例２ 抗ＬＦＡ−３抗体モノクローナル抗体ＩＥ６の投与のリンパ球機能に関する効果 Ａ、投与およびサンプリングのプロトコル２頭の異系交配の成育したヒヒＡおよ びＢ（Ｐａｐｉｏ　ａｎｕｂｉｓ）に５日間続けて１日に１回、ボータカテーテ ル（ｐｏｒｔａｃａｔｈｅｔｅｒ）により精製した抗ＬＦＡ−３モノクローナル 抗体ＩＥ６を１．４５ｍｇ／ｋｇで静脈投与した。ヒヒＡの体重は１２ｋｇであ り、ヒヒＢの体重は９．５ｋｇであった。また、対照として、他の成育したヒヒ Ｃ（体重９．４ｋｇ）に同量の非特異的なアイソタイプのマウスモノクローナル 抗体ＭＯＰＣ２１（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、Ｓｔ、Ｌｏｕ ｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を投与した。最初の抗体投与の前にそれぞれのヒヒか ら１回または２回血液を採取し、その後、５日間続けて毎日、各役場の４時間後 に血液採取を行った。さらに、最初の投与の日を１日目として、８日目、１１日 目および１４日目に血液を採取した。なお、他に記載しない限り、当該投与およ びサンプリグのプロトコルを本実験例において記載するすべてのアッセイにおい て用いた。

Ｂ　抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体ＩＥ６についての毒物学的検討 当該抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体の一般的な毒性およびヒヒの身体的条件に 関する潜在的効果、血液学、および、血液化学について評価した。なお、当該検 討を通して、各ヒヒの一般的な身体的条件は不変であった。

また、顕著かつ急激な副作用は見られなかった。さらに、血液学的および血液化 学的にも概ね正常であった。特に、Ｎａ”、Ｃｌ−１Ｋ”、クレアチン、血尿窒 素、および肝臓酵素ΔＳＴおよびＡＬＴのレベルはすべて正常な限界値内であっ た。加えて、血液細胞の数、すなわち、ヘマトクリット値、白血球細胞、リンパ 球、単核細胞、セグメント化した好中球および好酸球等は概ね正常な範囲であっ た。しかしながら、ヒヒＢは５日月以降においてセグメント化した好中球の実質 的な減少か見られた。

Ｃ０抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体ＩＥ６および対照ＭＯＰＣ２１の血清レベ ル 抗体投与の４時間後に採取した血液から血清を作成した。さらに、ＩｇＧを投与 したヒヒ（ヒヒＡおよびＢ）の場合は、２４時間の間隔で、抗体投与の直前およ び１日目ないし５日目に血清を採取した。また、８日目、１１日目および１４日 目にも血清を採取した。次いで、当該ＭＯＰＣ２１およびＩｇＧの血清レベルを 山羊の抗マウスＩｇＧ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍ ａｌｖｅｒｎ、Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）を塗布したマイクロタイタープレー トを使用するＥＬＩＳＡを用いたマウスＩｇＧレベルの計測により決定した。

なお、これらのＥＬ　Ｉ　ＳＡは実験例１において述べたように精製したＭＯＰ Ｃ２１およびＩｇＧを用いて標準化した。また、ＬＦＡ−３に結合可能なＩｇＧ （すなわち「活性ＪＩＥ６）の血清レベルをＬＦＡ−３のＡＡ、−ＡＡ＋ａ４か ら成る可溶性のＬＦＡ−３ポリペプチドを塗布したマイクロタイタープレートを 使用するＥＬ　Ｉ　ＳＡによって計測した（参照：米国特許第４９５６２８１号 ）。このＥＬＩＳＡもまた実験例１において述べたように精製したＩｇＧにより 標準化した。而して、上述のすべてのＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＩｇＧまた はＭＯＰＣ２１のマイクロタイタープレートへの結合が、アルカリ性フォスファ ターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎ。

ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）によりラベル 化した第２の山羊−抗、ウニ抗体を用いて検出できた。次いで、このように結合 した免疫グロブリンをサーモマックス（Ｔ　ｈ　ｅ　ｒｍｏｍａ　ｘ　：Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ、Ｐａ１ｏ　Ａｆｔｏ、Ｃａｔ　ｉ　ｆｏｒｎｉａ ）を用いてアルカリ性フォスファターゼ基板ｐＮＰＰの比色変換において着色生 成物とすることにより定量した。この場合、ＥＬＩＳＡ読取機の波長は４０５ｎ ｍであった（データ示さず）。

この結果、ＩＦ５およびＭＯＰＣ２１の血清レベルは４日目および５日目の間（ 約４０−８０μｇ　／　ｍ　Ｉ抗体）で最高となり、８日目および１１日目の間 で投与前のレベルに戻った。なお、ＩＦ５の投与後２４時間の血清レベルは、１ 日目ないし５日目に採取した血清の投与後４時間のレベルの５０％および８０％ の間で一貫して減少した。これに比して、ＭＯＰＣ２ルベルは２４時間後に１０ ％および２０％の間で減少したのみであった。また、活性ＩＥ６の割合は４０％ および７０％の間で変化した。さらに、該ＩＥ６の血清レベルはヒヒＡに比して ヒヒＢの方か高く　（体重９．５ｋｇ対１２ｋｇ）、これは異なる組織空間分布 によるものと考えられる。

さらに、処理したヒヒの血清における抗ＩＥ６抗体のタイター値をＥＬＩＳＡに より決定した。すなわち、精製したＩＦ５をマイクロタイタープレートに結合し 、各血液の血清を増加希釈においてアッセイした。（データ示さす）。

この結果、ＩＦ５を投与した両方のヒヒＡおよびＢにおいて、抗ＩＥ６抗体を早 くて１１日目の投与後に検出した。また、抗ＭＯＰＣ２１抗体のタイター値を抗 マウスＩｇＧを塗布したアッセイプレートを用いて検出し、当該抗ＩＥ６と同一 の反応速度であることが分かった。

（データ示さず）。

Ｄ、インビトロでのＴ細胞の活性化アッセイＩＥ６投与のインビトロにおけるＴ 細胞活性化についての効果を決定するために、末梢血液リンパ球を上述の抗体投 与したヒヒから単離して、Ｔ細胞依存型Ｂ細胞活性化およびフィトヘマグルチニ ンに応じたＴ細胞増殖あるいは抗ＣＤ２モノクローナル抗体の活性化についてア ッセイした。なお、これらのアッセイの各々について、該末梢血液リンパ球をＦ 　ｉ　ｃｏ　Ｉ　Ｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｔｓｃａｔａｗ ａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）上で当該製造者の示すプロトコルに従って単離した 。さらに、該末梢血液リンパ球を各アッセイに先立って室温で１０％ウシ胎児血 清を含有する組織培養地中で一晩保存した。

１、Ｔ細胞依存型Ｂ細胞活性化アッセイＴ細胞依存型Ｂ細胞の免疫グロブリン分 泌に対する活性化は抗ＬＦＡ−３抗体により阻止することができる（ＭＯＰＣ２ １を対照として使用）。

末梢血液単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ濃度培養地（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）上で当該製造者の教示に従って全血から精製した。付着 マクロファージを当該単核細胞のプラスチック皿上での３７℃４５分のインキュ ベーションにより除去した。また、非付着のリンパ球を生理的に適合性のある培 養地（ＲＰＭ１６４０．ＧＩＢＣＯＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａ １ｔｈｅｒｂｕ　ｒｇ、Ｍａ　ｒｙ　Ｉ　ａｎｄ）において洗浄した。コノもの はファクスタ（ＦＡＣ９ｔａｒ、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｃｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）上のＦＡ Ｃ８分析により最小のマクロファージを含むことがわかった。なお、当該検出に は、マクロファージ／単核細胞の細胞表面抗原に特異的な蛍光ラベル化処理した 抗体を用いた。その後、当該細胞を９６−ウェル丸底プレート（２ｍＭグルタミ ン、５　Ｘ　１０−’Ｍβ−メルカプトエタノールおよび非必須アミノ酸を加え たＲＰＭ１１６４０（ＧＩＢＣＯＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。

Ｇａｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ））において培養した。

この培養においては、Ｔ細胞がＢ細胞を活性化して免疫グロブリンを分泌させる 。この培養地中に分泌された免疫グロブリンを当該培養の開始後７日目および１ ２日目に培養地をサンプリングすることにより計測した。次いで、ＥＬＩＳＡを 用いてヒヒの免疫グロブリンについて当該サンプルの上澄み液（無細胞）を分析 した。この場合、アッセイプレートには山羊の抗人間免疫グロブリン（Ｊａｃｋ ｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ。

Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）が塗布されており、当該グロブリ ンもまたヒヒの免疫グロブリンを認識するが、ウシ胎児血清中に存在する免疫グ ロブリンやマウスの免疫グロブリンには結合しない。その後、当該山羊の抗人間 免疫グロブリンを塗布したプレートに結合した培養、上澄み液からの免疫グロブ リンを第２の山羊の抗人間免疫グロブリン試薬を用いて検出した。なお、該試薬 には、酵素であるアルカリ性フォスファターゼが結合している（Ｊａｃｋｓｏｎ 　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ ）。次いで、当該結合した免疫グロブリンをアルカリ性フォスファターゼ基板ｐ ＮＰＰ　（パラ−ニトロフェニルフォスファターゼ）による比色変換において着 色生成物とすることにより定量した。なお、当該基板変換はサーモ７−７クス（ Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ、Ｐａ１ｏ　Δｌｔｏ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）ＥＬＩＳＡ読取機により波長４０５ｎｍにおいて計測し た。

これらの実験結果を第１図および２図に示す。第１図は０日目から１−５日、８ 日、１１日および１４日にいたるヒヒＢ　（ＩＦ５）のリンパ球について行った アッセイのためのＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイから得た４０５ｎｍにおける相対吸収 ユニットを示している。第２図は０日目がら１−５日、８日および１１日にいた るヒヒＡ（ＩＥ６）およびＣ（ＭＯＰＣ２１）のリンパ球について行ったアッセ イのためのＥＬＩＳＡアッセイから得た４０５ｎｍにおける相対吸収ユニットを 示している。

この結果、ヒヒＢの場合は、Ｔ細胞依存型Ｂ細胞の１ｇ生成がＩＥ６投与の第２ ８目に減少し、１１日目まで０日目の値の約３５％に維持した（第１図）。

また、ヒヒＡの場合は、１−１１日目の１ｇ生成が投与前のレベルよりも高かっ た。これは、ヒヒＢの場合に比して、ヒヒＡの場合は到達したＩＥ６血清レベル が低いためと思われる。ここで、工ないし４日目に検出した１ｇ生成レベルを基 本値とすれば、５日目のＩｇ分泌の阻害は４０％であり、さらに、１１日目の阻 害は２０％となる（第２図）。

また、ヒヒＣの場合は、ＭＯＰＣ２１の投与後、末梢血液リンパ球が１ｇ生成の レベルを０日目のレベルに比して２日目から１１日目の間で増大している。

２、Ｔ細胞増殖アッセイ Ｔ細胞増殖アッセイにおいては、本発明者は抗ＣＤ２モノクローナル抗体若しく はフィトヘマグルチニン（ｒＰＨＡＪ　）を活性化してヒヒＡ、ＢおよびＣから ０日目、１−５日目、８日目、１１日目および１４日目に単離したＴ細胞を増殖 する能力を測定した。すなわち、ウェル当たりｌＸｌｏＢ個の末梢血液リンパ球 を（１）腹水液の１：９００希釈において抗ＣＤ２モノクローナル抗体Ｔ１１． およびＴ１１ｓと共に、（２）培養地のみにおいて、または（３）ＰＨＡ　（Ｓ 　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ 。

Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、３日間培養した。３日後、当 該細胞を１μＣｉ／ウエルの３ＨｄＴにより１８時間ラベル化して採取した。（ データ示さず）。

この結果、ヒヒＢから得た末梢血液リンパ球は該抗ＣＤ２モノクローナル抗体の 活性化に応じて”Ｈｄ　Ｔの取込量の増加を全く示さず、また、０日目から１４ 日目において培養地における増殖活性も極めて低かった。

一方、ヒヒＡから得た末梢血液リンパ球は該抗ＣＤ２モノクローナル抗体とＰＨ Ａとに反応を示した。すなわち、４日月以降、これらの物質に応じた増殖が約９ 倍阻害され、少なくとも１４日目まで低い増殖率が維持された。

また、ＭＯＰＣ２１の対照であるヒヒＣから得た末梢血液リンパ球はすべての条 件下においてすべての試験時間に極めて低い増殖活性を示した。

なお、ヒヒＣのＴ細胞増殖並びにヒヒＡ、ＢおよびＣの０日目の結果の再現性が 得られないため、これらのデータの有意差については明確でない。

実験例３ ＬＦＡ３ＴＩＰ投与のリンパ球機能に関する効果Ａ、投与およびサンプリングの プロトコル２頭の異系交配の成育したヒヒ（４，６ｋｇおよび７゜４ｋｇ）（Ｐ ａｐｉｏ　ａｎｕｂｉｓ）に５日間続けて１日に１回、ポータカテーテル（ｐｏ ｒｔａｃａｔｈｅｔｅｒ）により精製した抗ＬＦＡ３ＴＩＰ　（Ｂｉｏｇｅｎ、 Ｉｎｃ、、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を３　ｍ　ｇ　 ／　ｋ　ｇで静脈投与した。最初の抗体投与の前にそれぞれのヒヒから１回ずつ 血液を採取し、その後、５日間続けて毎日、各投与の４時間後に血液採取を行っ た。さらに、最初の投与の日を１日目として、８日目、１０日目、１５日目およ び２２日目に血液を採取した。なお、他に特に記載しない限り、当該投与および サンプリグのプロトコルを本実験例において記載するすへてのアッセイにおいて 用いた。

Ｂ、抗ＬＦＡ３ＴＩＰについての毒物学的検討当該抗ＬＦＡ３ＴＩＰの一般的な 毒性およびヒヒの身体的条件に関する潜在効果、血液学、および、血液化学的影 響について評価した。なお、当該検討を通して、各ヒヒの一般的な身体的条件は 不変であった。また、顕著かつ急激な副作用は見られなかった。さらに、血液学 的および血液化学的にも概ね正常であった。特に、Ｎａ”、Ｃｌ−１Ｋ’、クレ アチン、血尿窒素、および肝臓酵素ＡＳＴおよびＡＬＴのレベルはすべて正常な 限界値内であった。加えて、血液細胞の数、すなわち、ヘマトクリット値、白血 球細胞、リンパ球、単核細胞、セグメント化した好中球および好酸球等は概ね正 常な範囲であった。

また、ＣＤ４／ＣＤ８表現細胞の比率も正常な範囲内であった。

また、最後の投与後１０日目のＬ　ＦΔ３ＴＩＰのプラズマレベルは当該最後の 投与の直後のＬＦΔ３ＴＩＰのレベルの約３２％であり、マウスのモノクローナ ル抗体において一般に見られる半減期よりもはるかに長いことがわかった。

また、ＣＤ４およびＣＤ８表現細胞の蛍光ラベリングにより、約１０％のＣＤ４ ”細胞および約９０％のＣＤ８４細胞が最後の投与から１０日後において依然と してＬＦＡ３Ｔ　Ｉ　Ｐにより被覆されていることがわかった。

実験例４ ヒヒの心臓の同種移植モデル Δ　ＩＥ６処理 同種移植拒絶反応についての抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体ＩＥ６の効果を評 価するために、ヒヒの心臓をΔＢＯ型の異系交配のヒヒ（Ｐａｐｉｏ　ａｎｕｂ ｉｓ）の首の非機能部位にヘテロトビツクに移植する例示的な心臓の同種移植モ デルを採用した。この場合のプロトコルは、同種移植と異種移植との違いを除い て、Ｍｌ　ｃｈｌ　ｅ　ｒ　（ｔｈの［霊長類のヘテロトビツクな心臓異種移植 のための技法Ｊ　（Ｊ、Ｍｅｄ、Ｐｒ　ｉｍａ　ｔｏ　１．．１４゜ｐｐ、３５ ７−６２　（１９８５）に記載されるものと実質的に同一である。

而して、」二連の如く作成した精製ＩＥ６を１頭の成育したヒヒ（体重３２ｋｇ ）に５　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇの投薬量で１日目に開始して、移植前２日間続けて 投与した。３日目に、心臓のヘテロトビツクな同種移植を３ｋｇの若いヒヒから 得た心臓を用いて行った。当該移植の日に５ｍｇ／ｋｇのＩＦ５の１回の投薬を 行い、その後、１０日間続けて１日に１回この投与を行った。また、血液サンプ ルを当該投与に先立って移植の２日前に採取した。さらに、該血液サンプルを移 植と同時に、また、それから５日目、１０日目、１６日目、１９日目および２１ 日目に行った。次いで、ＩＦ５の全血清レベルおよび該ｌｌＩｎ清における活性 なＩＦ５の比率、すなわち、Ｉ−ＦＡ−３に結合可能なＩＦ５のパーセントのア ッセイを実験例２Ｃに述べたように行った。当該ヒヒには一般的な免疫抑制物質 がなんら投与されていない。

その後、移植部を毎日触診し、心臓の鼓動を触診および目視によりｉｖ価してモ ニターした。さらに、心電図を週に１回取った。また、経皮内心筋バイオプシー を移植後１６日目に行った。この結果、上述の血液サンプルについての血液化学 的評価および細胞計数結果は正常な限界値の範囲内であった。

また、当該モデルシステムにおける未処理の対照の心臓同種移植は非免疫抑制の ヒヒにおいて移植後平均９±３日（ｎ＝５）で拒絶反応を示した（Ｒｏｓｅ他、 ［心臓の異種移植Ｊ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｉｎ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ 　Ｄｉｓｅａｓｅ、３３．ｐｐ、１０５−１７　（１９９０））。なお、当該拒 絶は、当該モデルシステムの目的に対応して、心臓の膨張および硬化、および心 電図の評価による鼓動の停止として定義する。

さらに、心筋内のリンパ球の累進的浸透、リンパ球陣害抗体の生成、および、ド ナーの末梢血液リンパ球に対する反応をモニターした。その結果、免疫抑制治療 なしに９日以上当該システムにおいて移植組織が生存したことはその寛容性レベ ルが向上したことを示す。

ＩＥ６処理したヒヒにおいては、移植した同種異系の心臓が当該移植後２３日に おいて依然として鼓動していた。したがって、該Ｉ　Ｅ　６は心臓の同種移植に おいて目覚ましい寛容性の改善をもたらす。

Ｂ、ＬＦＡ３ＴＩＰ処理 実験例４Δにおいて述べたものと実質的同一の手順により、心臓同種移植の拒絶 反応についてのＬＦＡ３ＴＩＰの効果を評価した。すなわち、精製したＬＦＡ３ Ｔ１、Ｐ（同上）を１頭の成育したヒヒに移植前に２日続けて１「１当たり３　 ｍ　ｇ／　ｋ　ｇの）徒薬量で１桑与した。３日目に、心臓のヘテロトビツクな 同種移植を若いヒヒから得た心臓を用いてｉ〒っだ。なお、当該移植の日に３　 ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇのり、　Ｆ　Ａ　３　Ｔ　Ｉ　Ｐを１回段薬し、その後、９ 日間続けて１［１に１回この役りを行った。

その後の血液サンプルの採取および分析、および同種移植の１１絶反応の評価を 実験例４Δと実質的同一に行っｔこ。

この結果、該Ｌ　ＦＡ３１１Ｐで処理したヒしにおける移植組織の生存間開は未 処理のしヒにおいて生存した移植組織に１シシて延長し、該Ｌ　ＦＡ３　’「ｌ 　１’による移植組織の寛容性が向上することがわかった。

寄託 本発明において有用なマウスのハイプリドーマ細胞および抗体は１９９１年３月 ５日にブグベスト条約に基づきアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏ ｃｋｖｉ　ｌ　Ｉｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）に寄託された培養体により例 示され１以下の如く同定される。

指定名　ΔＴＣＣ受人番号 Ｉ　Ｅ　６　ＨＢ　１０３９３ Ｉ　Ｃ−Ｉ　Ｂ　１１　１１　Ｂ１０６９４７Δ６　１［Ｂ　１０６９５ ８８８　Ｈｒｌ　１０６９６ ブラスミトｐｓΔＢ１５２により形質転換した大腸菌（Ｅ、ｃｏ　ｌ　１）ＪＡ ２２１は１９９１年１０月１日にブダペスト条約に基づきアメリカンタイプカル チャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　Ｉｅ、Ｍａｒｙ　１ａｎｄ。

ＵＳＡ）に寄託され、以下の如く同定される。

指定名　ＡＴＣＣ受入番号 ｐｓＡＢ１５２　６８７２０ トランスメンブランＬＦＡ−３をコードするプラスミドのキャリヤであるバクテ リオファージは１９８７年５月２８日にブダペスト条約に基づきインビトロイン ターナショナル（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ。

ｎａｌ、Ｉｎｃ、、Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）に寄託さ れた。その後、当該寄託は１９９１年６月２０日にアメリカンタイプカルチャー コレクションに移され、以下の如（同定される。

指定名　ＡＴＣＣ受入番号 λＨＴ１６［λｇｔｌｏ／ＬＦΔ−３］　７５１０７ＰＩ連結ＬＦＡ−３をコー ドするプラスミドにより形質転換した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）は１９８８年７月 ２２日にブダペスト条約に基づきインビトロインターナショナル（Ｉｎ　Ｖｉｔ ｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、、Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ、Ｍａｒｙ ｌａｎｄ。

ＵＳＡ）に寄託された。その後、当該寄託は１９９１年６月２０日にアメリカン タイブカルチャーコレクンヨンに移され、以下の如く同定される。

、指定名　ＡＴＣＣ受入番号 ｐ２４　６８７８８ シーケンス 以下は、シーケンスリストにおいて述べたシーケンスの概要である。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ二１　トランスメンブランＬＦＡ−３のＤＮＡシーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２　）ランスメンブランＬＦＡ−３のアミノ酸シーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３　ＰＩ連結ＬＦＡ−３のＤＮＡシーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４　ｐｉ連結ＬＦＡ−３のアミノ酸シーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５　ＣＤ２のＤＮＡシーケンスＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６　 ＣＤ２のアミノ酸シーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア　ＬＦＡ３ＴＩＰのＤＮＡシ上述の如く本発明の数多く の実施態様を説明したが、これらの基本的実施態様は変更可能であり、したがっ て、本発明の手法を利用する他の実施態様を当該変更によって提供することも可 能である。それゆえ、本発明の範囲は本明細書における上記の記載とこれに添付 した請求の範囲とにおいて定めることのできるすべての変更態様および変形例を 含むと解されるべきである。すなわち、本発明は、例示の目的で上述した当該特 定の実施態様によって制限されるものではない。

シーケンスリスト （１）一般情報 （１）出願人：ＷＡＬＬＮＥＲ，Ｂａｒｂａｒａ　Ｐ。

ＢＥＮＪＡＭＩＮ、Ｃｈｒ　ｉ　ｓ　ｔｏｐｈｅｒＤ。

（ｎ）発明の名称：　ＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質の投与による同種移植 または異種移植の寛容性を改善するための方法 （ＩＩＩ）シーケンス数：８　′ （ＩＶ）通信アドレス （Ａ）アドレス：Ｃ＼ｏＦＩＳＨ＆　ＮＥＡＶ（Ｂ）ストリート＋８７５　Ｔｈ １ｒｄ　Ａｖｅ（Ｅ）国：Ｕ、　ｓ、　Ａ。

（Ｆ）ＺＩＰ：１００２２ （Ｖ）コンピュータ読取可能形態 （Ａ）媒体種：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ　ｐｃ　コンパチブル （Ｃ）オペレーティング　システム：　ＰＣ−Ｄ。

Ｓ／ＭＳ−ＤＯ８ （Ｄ）７７トウエア：Ｐａｔｅｎｔ　Ｉｎ　ＲｅＩｅａｓｅ＃１．０゜ Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５ （ｌ現在の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （■）これまでの出願データ （Ａ）出願番号：ＵＳ　０７／７７２，７０５（Ｂ）出願日：１９９１年１０月 ７日 （■）代理人（ＡＴＴＯＲＮＥＹ／ＡＧＥＮＴ）情報（Ａ）氏名：Ｈａｌｅｙ　 Ｊｒ、、Ｊａｍｅｓ（Ｂ）登録番号：２７，７９４ （Ｃ）リファレンス／事件整理番号：Ｂ１６２ＣＰ （ＩＸ）通信情報 （Δ）電話：　（２１２）７１５−０６００（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の情 報 （Ｉ）　シーケンス特性 （Ａ）長さ一７５３塩基対 ＣＢ）種類：核酸 （Ｃ）構成ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　ＣＤ５ （Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：１．．７５０（ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：　１ ．．８４（ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：８５ ．．７５０（ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：１９ ．７５０（Ｄ）他の情報：／ｎｏｔｅ−”Ｈｕｍａｎ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａ ｎｅ　ＬＦＡ−３”（ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒ　ｅ （Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：６４６．　、７１４（Ｄ）他の情報：／ｎｏｔｅ−” 　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ” （ＸＩ）シーケンス配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ の情報 （Ｉ）シーケンス特性 （Ａ）長さ一２５０アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線形 （ＩＩ）分子の種類：蛋白質 （ＸＩ）シーケンス配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２にｌｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａ Ｊｎ　Ｓ・ｒ　ＧＬｕ　Ｆｈｓ　Ａｒｇ　＾Ｌａ　Ｐｈ＠　５ａｒ　Ｓ＠ｔ　Ｆ ）ｌ＠　Ｌｙｓ　ＡＪＩ’ｌ　`ｒｇ ＶａＬ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　ＡＪＰ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　５＊ｒ　ＧＬ７　Ｓ＠ｔ　 Ｌａｕ　Ｔｈｒ　工１・　τγ１：　Ａｍ６　ＬＪｕ　τｈ■ ５＠ｒ　５ｅｒＡｓｐ　ＧＬｕ　ｋｓｐ　ＣＬｕ　Ｔｙｒ　ＧＬｕ　Ｍ＠ｅ　Ｃ １ｕ　５＠τＰｒｏ　Ａｓｎ　Ｉｌ＊　Ｔｈｒ　ＡｌｐＣｙｓ　Ｐｒｏ　Ｍｓｅ 　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ｋｓｎ　Ｓ＠ｔ、Ｔｈｒ　５ａｒ 　Ｘｉｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｓ　Ｌｙｅ１３５　１ム０　１４５ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３の情報 （１）シーケンス特性 （Ａ）長さニア２３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）構成ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　ＣＤ５ （Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ＋１．．７２０（ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：１． ．８４ （ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：８５ ．．７２０（ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕ（Ｂ）　ＬＯＣＡＴＩＯＮ　二 　１　、　、７２０（Ｄ）他の情報：／ｎｏｔｅ−”Ｈｕｍａｎ　ＰＩ−ｌｉｎ ｋｅｄ　ＬＦＡ−３” （ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：５６ ８．．７２０（Ｄ）他の情報：　／　ｎ　ｏ　ｔ　ｅ−ＳｉｇｎａｌＳｅＯＬｌ ｅｎＣｅ　ｆｏｒ　ＰＩ−１ｉｎｋａｇｅ”（ＸＩ）シーケンス配列：ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：３τλＡ　７２コ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４（７）情’Ｍ（Ｉ）シーケンス特性 （Ａ）長さ＝２４０アミノ酸 ＣＢ）種類二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線形 （ＩＩ）分子の種類：蛋白質 （ＸＩ）　シーケンス配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４Ｍ喧ｅ　Ｖａｌ　ＡＬａ　 Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ａｓｐ　入Ｌａ　ＣＬｙ　ＡｒＢ　ＡＬａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　 ＶａＬ　Ｌａｕ　Ｓｕｒ　ＶａｌＶａＬ　Ｃｙｓ　Ｌ＠ｕ　Ｌａｕ　ＨＬｓ　Ｃ ｙｓ　ｎ＠　にｌｙ　Ｐｈ＠　Ｉｌ＠　Ｓ＠ｔ　Ｃｙｓ　Ｆｈｍ　Ｓｉｒ　Ｇｉ ｎ　Ｇｌｎ−１０−５Ｌ １２・　Ｔｙｒ　に１７　Ｖｌａｌ　ＶａＬ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ｋｓｎ　Ｖａｔ 　Ｔｈｒ　ｈａ　ＨＬｓ　ＶａＬ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　ｋｓｎνａｌ　Ｐｒｏ　Ｌ ＠ｕ　Ｌｙｅ　Ｇｌｕ　Ｖｎｌ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｌｙｍ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌ ｙｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｅ　Ｖａｔ　ＡｌａＶａＬτｙｒ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ 　Ｖａｌ　Ｓａｒ　ＧＬｙ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　ＩＩｓ　Ｔｙｒ　Ｊｕｎ ムｕ　ＴｈｒＬＪＬＩ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａ１１ｌ　ＬＪＬＩ　Ｔｈｒ　ｋｓｎ 　ＣＬｙ　Ｓａｔ　Ｘ１ｍ　Ｇｌｕ　ＶａＬ　ＧＬｎ　Ｃｙｓ　Ｍａｔ　hｌ＠ １０５　１１０　１１コ Ｐｒｏ　ＧＬｕ　ＨＬｓτｙｒ　ｋｓｎ　５＠ｒ　８１４　ｋｒｇ　ＣＬｙ　Ｌ Ｊｕ　ＺＬｓ　Ｍａｅτｙｒ　５ｓｒ　Ｔｒｐ　ＡｊＰＣｙｓ　Ｐｒｏ　Ｍａｃ 　ＧＬｕ　にｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ｋｍＩ′ｌＳ＠ｔ　Ｔｈｒ　５ｓ ｒ　ＺＬｓ　Ｔｙｒ　Ｆｈｓ　Ｌｙ■ １３５　１４０　１ａ５ Ｌａｕ　Ｐｈ＠Ｊｕｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｔ　５ａｒ　１１＠　Ｉｔ−レ＋ ｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｘ１ｍ　Ｐｒｏ　５ｅｔ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：５の情報 （Ｉ）シーケンス特性 （Ａ）長さ：１０５６塩基対 ＣＢ）種類；核酸 （Ｃ）構成ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー；線形 （ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　ＣＤ５ （Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：　１．．１０５３（ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ　：　 １．．７２（ＩＸ）特徴 （Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　ｍａ　ｔ　ｐ　ｅ　ｐ　ｔ　ｉ　ｄ（Ｂ）ＬＯ ＣＡＴＩＯＮニア３．．１０５３（ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：　１ ．．１０５３（Ｄ）他の情報：／ｎｏｔｅ−”Ｈｕｍａｎ　ＣＤ２” （ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：６２ ８．、　７０２（Ｄ）他の情報：／ｎｏｔｅ−”　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ 　ｄｏｍａｉｎ” （ＸＩ）シーケンス配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５τＡＡ　１０５６ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：６の情報 （Ｉ）シーケンス特性 （Ａ）長さ：３５１アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線形 （ｒＩ）分子の種類：蛋白質 （ＸＩ）　シーケンス特性：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６Ｍ＠ｃ　Ｓａｒ　Ｐｈ＠　 Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　ＶａＬ　ＡＬａ　Ｓｓｒ　Ｐ’ｈ＊　Ｌａｕ 　Ｌａｕ　ＩＬｓ　ｈａ　Ａｎｎ−２４，２０・１５　−１０ τｈｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　ＡＬＡ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　ＩＬｓ　 Ａｓｎ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｐ　ＩＬｅ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　ｈａｌｏ　１５　２０ Ｌｙｓ　Ｌｙｇ　Ｌｙｓ　１１＊＾ｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｈｓ　Ａｒｇ　ＬｙＩＧｌ ｕ　Ｌｙｍ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　（Ｌｕ４５　Ｓｏ　５５ Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　ＬｙｊＬａｕ　Ｐｈａ　Ｌｙｅ　ＡＪｎ　Ｃ Ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｌｙｍ　Ｚｌａ　Ｌｙｅ　ＨＬｓＬａｕ　Ｌｙｊ　Ｔｈ ｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　ＣＬｎ　Ａｓｐ　Ｉｌ・　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ＶａＬ　Ｓａ ｒ　Ｘ１ｍ、Ｔｙｒ　Ａｓｐ　τｈｒＬｙｓ　Ｇａｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ 　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌ・ｐｈ・Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｉｔｓ　（ ｉｎ　Ｃ１ｕ＾ｒｇ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　１１ｓ　Ｓａ ｒ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｃｙ露ＩＬａ　ＡｓＴＩＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ１０５　 １１０　１１５　１２Ｏ Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｍｅｔ　ＡｓｒＸＧＬｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　 ！’τｏ　（ＬｕムｕＡｊｎムＵτｙｒ　Ｇ１ｎ１２５　Ｌ３０　１３５ ＾ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙ窟ＨＬｓ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　５＠ｒ　Ｇｌｎ　Ａ ｒｇ　Ｖａｔ　ＩＬｅ　Ｔｈｒ　ＨＬｓ　Ｌｙ篇τ印＾ｓｐ　Ｚｌｅ　Ｔｙｒ　 Ｌａｕ　工ｉｅ　Ｉ’ｈａ　Ｇｌｙ　ＩＬｗ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　にｌｙ　Ｇｌｙ 　Ｓｉｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｈｏ■ Ｖａｌ　Ｐｈ＠Ｖａｌ＾ｌａ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｐｈ＠τｙｒ　Ｚ１自 Ｔｈｒ　Ｌｙｍ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｍ　（：１ｎ＾ｒｇ　Ｓａｒ　Ａｘｚ　 Ａｘｚ　ｋｓｎ　ＡＪＰ　Ｃ１ｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ＡｒＢ　 ＡＬａ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ｖａ１２２０２２５２コＯ Ａｒｇ　Ｓａｒ　（ｉｎ　ＡＬＡ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　ＨＬｓ　Ａｒ＜　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　Ｈｌｓ　ＡｒＢ　ＶａＬＧｉｎ　ＨＬｇ　に ｉｎ　Ｉ’ｒｏ　にｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｉ’ｒｏ　ＡＬＡ　Ｐｒｏ 　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　（ｉｎ　Ｖ≠P Ｈａｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｍ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　 Ａｒｇ　Ｐｒｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｐｒｃ＋　Ｌｙ■ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアの情報 （１）シーケンス特性 （Ａ）長さ：１０５０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）構成ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ＩＩＩ）ヒポセティカル（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：否（ＮＯ） （ＴＶ）アンチセンス（ＡＮＴＩ−３ＥＮＳＥ）：否（ＮＯ） （ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　ＣＤ５ （Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：１．．１０４１（ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：１． ．８４ （ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：８５ ．．１０４１（ＩＸ）特徴 （Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：１．．１０４１（Ｄ）他の情報：／ｎｏ　ｔ　ｅ　− ’　ＬＦＡ３Ｔ　Ｉ　Ｐ”（ＩＸ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：３６ ０．．３６１（Ｄ）他の情報：／ｎ□　ｔ　ｅ　−’　ＬＦＡ−３／ＩｇＧ　ｆ ｕｓｉｏｎ　ｐｏｉｎｔ” （ＸＩ）　シーケンス特性：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：８（７）情報（Ｉ）シーケンス特性 （Ａ）長さ：３４７アミノ酸 （Ｂ）種類；アミノ酸 （Ｃ）トポロジー二線形 （ｎ）分子の種類：蛋白質 （ＸＩ）シーケンス配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８Ｍ５ｅ　ＶａＩＡＬＩＩ　Ｇ Ｌｙ　Ｓａｒ　Ａｊｐ　ｈＬａ　にＧｌｙ　Ａｒｇ　ＡＬａ　ＬＪＩＪ　Ｇｌｙ 　Ｖａｔ　Ｌａｕ　Ｓａｔ　Ｖ≠■ −２８−２５・２ｏ　・１５ Ｇｌｕムｕ　ＧＬｕ　ｋｓｎ　Ｓａｔ　ＣＬｕ　Ｐｈｓ　Ａｒ４　Ａｉｍ　Ｐｈ ｅ　Ｓｉｒ　Ｓｉｒ　Ｆｈａ　Ｌｙｓ　Ｊｕｎ　Ａｒｇ４０　ｋ５　５０ Ｓ＠ｔ　Ｓａｔ　Ａｌｐ　Ｇｌｕ　ｋｓｐ　Ｃ１ｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　 Ｇｌｕ　Ｓａｔ　ＮＯＡｌｎ　Ｘ１＠　Ｔｈｅ　＾１ｐ７０　７５　、　８０ Ｔｈｒ　Ｍａｅ　Ｌｙｓ　Ｆｈａ　Ａ＠Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｙ 寥Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　Ｔｈｅ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

８５　９０　９５　１ｏ。

Ｃｙｍ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＩＪｕ　Ｌａｕ　にＧｌｙ　ＧＬｙ 　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｆｈｓ　ＰｒB Ｃｙｍ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｔ　ＡＪｐ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　ＨＬｓ　ＣＬｕ　 ＡＪｉｌ　Ｐｒｃ＋　ＣＬｕ　ＶａＩ　Ｌ７ｍ　Ｐｈａ　１高■ １３５　Ｌ４０　１４５ τｒｐ　Ｔｙｒ　ＶａＬ　ｋｓｐ　にＧｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＶａＬ　ＨＬｍ 　＾１１　Ａｌｍ　Ｌｙｓ　Ｔｈｅ　Ｌｙｍ　Ｐｒｏ　ｋｒ■ Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　ＬＪｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　 Ｇｌｕτｙｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｍ　Ｌｙｅ　ＶａＬ　５ｓｒＡＪｎ　Ｌｙｓ　Ａｌ ａ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒ６　！１＊　にＬｕ　ＬｙＩ　Ｔｈｅ　１１ ＠　Ｓｓｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＬｙＭＧ：１ｙ　（Ｌｒ＋　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　に Ｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｖａｔ丁’ｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓ ｉｒ　Ａｒｇ　ｋ唐■ Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ｈｓｎ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　 Ｔｈｅ　Ｃｙｓ　ＬＪｕ　ＶａＬ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　１’ｈ■ 丁ｙｒ　Ｐｒ６　Ｓａｒ　Ａｊｐ　１１＠　Ａｌｍ　Ｖｍｌ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　 Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ａｊｎ　にＧｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　にＬ■ ＾ｓｎ　Ａｌｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　 Ｌａｕ　Ａｊｐ　５ｓｒ　ＡＪｐ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　ＦｈａＰｈ−ムｕ　Ｔｙｒ 　５ａｒ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｔｈｒν１１＾ｓｐ　Ｌｙｓ　５ｓｒ＾ｒｇτｒｐ 　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ＾ｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｈ＠　５＠ｒ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　 Ｖａｌ　Ｍ＠ｔ　Ｈｌｍ　（ｌｕ　Ａｌｍ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ａａｎ　Ｈｌｓ　 ＴｙｒＦＩＧ、Ｉ Ｔ細胞依存性Ｂ細胞の活性アッセイ 日数 ＦＩＧ、２ ヒヒｃ　（ＭＯＰＣ２１）　およびＡ　（ＩＥ６）日数 補正書の翻訳文提出書 （特許法１８４条の８） 平成６年　４１１７０

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．人間を含む哺乳動物に移植組織とＬＦＡ−３またはＣＤ２結合蛋白質を投与 する段階から成ることを特徴とする移植した同種移植組織または異種移植組織の 寛容性を改善するための方法。
2. ２．前記結合蛋白質がＴ細胞の活性を阻害することを特徴とする請求項１に記載 の方法。
3. ３．特定のＬＦＡ−３結合蛋白質を投与することを特徴とする請求項１に記載の 方法。
4. ４．前記ＬＦＡ−３結合蛋白質が可溶性のＣＤ２ポリペプチドであることを特徴 とする請求項３に記載の方法。
5. ５．前記ＬＦＡ−３結合蛋白質がモノクローナルな抗しＦＡ−３抗体であること を特徴とする請求項３に記載の方法。
6. ６．前記モノクローナル抗ＬＦＡ−３抗体が受入番号ＡＴＣＣＨＢ１０６９３（ １Ｅ６）、ＡＴＣＣＨＢ１０６９４（ＨＣ−１Ｂ１１）、ＡＴＣＣＨＢ１０６９ ５（７Ａ６）、ＡＴＣＣＨＢ１０６９６（８Ｂ８）を有するハイブリドーマから 選択されるハイブリドーマにより生成されるか、あるいは、モノクローナル抗体 ＴＳ２／９であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. ７．前記モノクローナル抗ＬＦＡ−３抗体が受入番号ＡＴＣＣＨＢ．１０６９３ （１Ｅ６）を有するハイプリドーマにより生成されることを特徴とする請求項６ に記載の方法。
8. ８．特定のＣＤ２結合蛋白質を投与することを特徴とする請求項１に記載の方法 。
9. ９．前記ＣＤ２結合蛋白質がモノクローナルな抗ＣＤ２抗体であることを特徴と する請求項８に記載の方法。
10. １０．前記ＣＤ２結合蛋白質が可溶性のＬＦＡ−３ポリペプチドであることを特 徴とする請求項８に記載の方法。
11. １１．前記可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：２のＡＡ１−ＡＡ ９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のＡＡ１−ＡＡ■０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のＡＡ５０ −ＡＡ６５およびＳＥＱＩＤＮＯ：２のＡＡ２０−ＡＡ■０から成るポリペプチ ドの群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記ＬＦＡ−３ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：２のＡＡ１−ＡＡ９２で あることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記結合蛋白質が人間化した組換え抗体であることを特徴とする請求項１ に記載の方法。
14. １４．前記結合蛋白質がキメラ組換え抗体であることを特徴とする請求項１に記 載の方法。
15. １５．前記結合蛋白質がＦａｂフラグメント、Ｆａｂ′フラグメント、Ｆ（ａｂ ′）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメントおよび抗しＦＡ−３または抗ＣＤ２ モノクローナル抗体の完全な免疫グロブリンＨ鎖から選択されることを特徴とす る請求項５または９に記載の方法。
16. １６．前記結合蛋白質が完全長の免疫グロブリンＨ鎖のモノマーおよびダイマー から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. １７．前記移植組織が異種移植組織であることを特徴とする請求項１に記載の方 法。
18. １８．前記移植組織が心臓または賢臓の異種移植組織であることを特徴とする請 求項１７に記載の方法。
19. １９．前記移植組織が同種移植組織であることを特徴とする請求項１に記載の方 法。
20. ２０．前記移植組織が心臓または腎臓の同種移植組織であることを特徴とする請 求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記哺乳動物が人間であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
22. ２２．前記移植組織が前記哺乳動物に移植される前に効果量の前記結合蛋白質で 散布されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
23. ２３．前記結合蛋白質が体重１ｋｇ当たり約０．０１および約１０ｍｇの間の投 薬量で投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
24. ２４．前記ＬＦＡ−３結合蛋白質が体重１ｋｇ当たり約０．１および約５ｍｇの 間の投薬量で投与されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
25. ２５．前記ＬＦＡ−３結合蛋白質が体重１ｋｇ当たり約０．１および約２ｍｇの 間の投薬量で投与されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. ２６．前記ＣＤ２結合蛋白質が体重１ｋｇ当たり約０．０１および約２ｍｇの間 の投薬量で投与されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
27. ２７．前記ＣＤ２結合蛋白質が体重１ｋｇ当たり約０．０１および約１ｍｇの間 の投薬量で投与されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
28. ２８．前記結合蛋白質を前記移植の前に２日間続けて１日に１回投与し、当該移 植後に１日ないし１０日間続けて１日に１回投与することを特徴とする請求項１ ９に記載の方法。
29. ２９．前記結合蛋白質を前記移植の前に２日間続けて１日に１回投与し、当該移 植後に２日間続けて１日に１回投与することを特徴とする請求項２８に記載の方 法。
30. ３０．前記結合蛋白質が前記移植の前に前記異種移植の供給源からの組織と同時 期に投与されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
31. ３１．前記同時期投与の後に、前記結合蛋白質の前記移植前の投与が行われるこ とを特徴とする請求項３０に記載の方法。
32. ３２．前記結合蛋白質を前記移植の前に２日間続けて１日に１回投与し、その後 、１日の間１日に１回、次いで、１日ないし１０日間続けて１日に１回、前記異 種移植供給源からの組織と同時期に投与することを特徴とする請求項１７に記載 の方法。
33. ３３．前記結合蛋白質を前記移植の前に２日間続けて１日に１回投与し、その後 、１日の間１日に１回、次いで、５日ないし１０日間続けて１日に１回、前記異 種移植供給源からの組織と同時期に投与することを特徴とする請求項３２に記載 の方法。
34. ３４．前記結合蛋白質および前記異種移植供給源からの組織の同時期投与が同時 であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
35. ３５．前記異種移植供給源からの組織が血液であることを特徴とする請求項３０ または３２に記載の方法。
36. ３６．前記血液蛋白質が静脈内、筋肉内、皮下、関節内、包膜内、骨膜、経口、 局所または吸入を介して投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
37. ３７．前記結合蛋白質が静脈内または筋肉内に投与されることを特徴とするする 請求項３６に記載の方法。
38. ３８．前記結合蛋白質が効果量の免疫抑制剤と共に投与されることを特徴とする 請求項１に記載の方法。
39. ３９．前記免疫抑制剤がシクロスポリンであることを特徴とする請求項３８に記 載の方法。
40. ４０．前記免疫抑制剤がプレドニソンであることを特徴とする請求項３８に記載 の方法。
41. ４１．前記免疫抑制剤がプレドニソンおよびシクロスポリンであることを特徴と する請求項３８に記載の方法。
42. ４２．前記結合蛋白質がＬＦＡ−３結合蛋白質、ＣＤ２結合蛋白質および薬剤か ら成る群から選択される１種以上の物質に連結することを特徴とする請求項１に 記載の方法。
43. ４３．前記結合蛋白質が人間の免疫グロブリンＨ鎖のヒンジ領域および不変領域 またはそれらの一部分に連結した可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドであることを特 徴とする請求項４２に記載の方法。
44. ４４．前記可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：２のＡＡ１−ＡＡ ９２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のＡＡ１−ＡＡ８０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のＡＡ５０ −ＡＡ６５およびＳＥＱＩＤＮＯ：２のＡＡ２０−ＡＡ■０から成る群から選択 されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
45. ４５．前記可溶性ＬＦＡ−３ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：２のＡＡ１−ＡＡ ９２であることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
46. ４６．前記結合蛋白質がＳＥＱＩＤＮＯ：８のＡＡ１−ＡＡ３１９から成ること を特徴とする請求項４５に記載の方法。