JPH07504085A - バシラス・リヘニフォルミスｘ−アミラーゼのプロモーターの変異体由来のバシラス属細菌のプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １６、ハシラス属の菌株内でタンパク質を産生させる方法であって；請求の範囲 第９〜１２項のいずれか一つに記載のＤＮＡ構造体または請求の範囲第１３項に 記載のベクターで形質転換されたハシラス属菌株の宿主細胞を、前記タンパク質 を産生させる条件下で培養し、得られたタンパク質を培養物から回収することか らなる方法。

明細書 パンラス・リヘニフォルミスＸ−アミラーゼのプロモーターの変異体由来のハシ ラス属細菌のプロモーター発明の技術分野 本発明は、パンラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆ ｏｒｍｉｓ）のプロモーター、該プロモーターを含有するＤＮＡ構造体、該ＤＮ Ａ構造体で形質転換された宿主細胞、および該プロモーターによってハシラス属 の菌株中にタンパク質を産生させる方法に関する。

発明の背景 パンラス・リヘニフォルミスα−アミラーゼの遺伝子の各種プロモーターの配列 はすてに報告されている。すなわち、Ｍ、　５ｉｂａｋｏｖおよび１．Ｐａ１ｖ ａ、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１４５巻、５６７〜５７２頁、１９８ ４年には、プロモーター配列を含めてパンラス・リヘニフォルミスα−アミラー ゼ遺伝子の５′末端の単離と決定について報告されている。また、Ｔ、　Ｙｕｎ ｋ　ｔ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９８巻、１１４７〜１１５６頁、１９８ ５年は、プロモーター配列を含めてパンラス・リヘニフォルミスα−アミラーゼ 遺伝子の完全ヌクレオチド配列を示している。そしてＢ、　Ｍ、　Ｌａｏｉｄｅ ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１７１　（５）巻、２４３５〜２４４２頁、 １９８９年では、パンラス・リヘニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子の５′末端 付近の領域からの該遺伝子の異化代謝産物抑制（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ　ｒｅｐ ｒｅｓｓｉｏｎ）が考察され、この領域の配列が示されている。

発明の要約 驚くべきことには、本発明の発明者らは、すでに発表されているプロモーターの 配列と相同の新規のプロモーターが、あるタンパク質をコードする遺伝子がその プロモーターから転写されるとそのタンパク質の収量が劇的に増大することを見 出したのである。

したがって本発明は、下記のＤＮＡ配列またはこの配列の機能相同体に含有され ているバシラス属菌株のプロモーターに関する。

ωびり番号：ｌ） 上記配列中、Ｎ”−Ｎ＠がともにＡＴＧＴＴＴＣＡまたはＧＴＧＴＴＴＣＡを形 成しない場合を除いて、Ｎ’−Ｎ’は各々Ａ、　Ｔ、ＣまたはＧである。

すでに発表された配列では、Ｎ１はＴ　（Ｔ、　Ｙｕｕｋｉら、の前記文献）も しくはＣ（Ｂ、Ｍ、Ｌａｏｉｄｅらの上記文献）であり、一方Ｎ”−Ｎ’はＡＴ ＧＴＴＴＣＡ（Ｔ、　Ｙｕｕｋｉらの上記文献およびＢ、　Ｍ、　Ｌａｏｉｄｅ らの上記文献）またはＧＴＧＴＴＴＣＡ（Ｍ、　５ｔｂａｋｏｖの上記文献参照 ）である。いくつもの報告書で、Ｂ・リヘニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子を 含めてバシラス属菌株の異化代謝産物抑制が考察されている。すなわち、Ｂ、Ｍ 。

Ｌａｏｉｄｅらの上記文献ならびにＢ、　Ｍ、　Ｌａｏｉｄｅおよびり、１．Ｍ ｃＣｏｎｎｅｌｌ、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７１巻、２４４３〜２４５０頁、１９８９年には、プ ロモーターから下流でシグナル配列の切断部位から上流の１０８個のｂｐに対す る、Ｂ・ズブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）中のａｍｙＬの異化代謝産物抑制 の仲介に必須のシス配列の地図が示されている。これら文献の著者らは、この領 域に逆方向反復配列のＴＧＴＴＴＣＡＣ−２０ｂｐ−ＡＴＧＡＡＡＣＡを同定し ているが、この配列の左側の部分が欠失すると異化代謝産物抑制に影響すること なく、発現が消失するか変化することを報告している。またこれらの著者らは、 多数のＢ・ズブチリス異化代謝産物抑制遺伝子中の転写開始部位付近のａｍｙＬ 逆方向反復配列（５’　−Ａ／ＴＴＧＴＮＡ／Ｔ−３′）の左側の部分に相同の 配列を同定している。

Ｙ、ＭｉｗａおよびＹ、ＰｕＪｉｔａ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　 １８巻、７０４９〜７０５３頁では、Ｂ・ズブチリスのｇｎｔオペロンの異化代 謝産物抑制に関与するシス配列が１１個のｂｐの領域に限定されている。この１ １個のｂｐの領域内に８個のｂｐの配列ＡＴＴＧＡＡＡＧがある。上記の著者ら は、このｓｂｐの配列はバシラス属の菌株の異化代謝産物抑制に関与する共通配 列であろうと主張している。というのはこの配列が他の異化代謝産物抑制を示す バシラス属菌株の遺伝子に見出されたからである。興味深いことには、Ｂ・リヘ ニフォルミスα−アミラーゼの遺伝子内で、上記の共通配列は、Ｌａｏｉｄｅら が同定した逆方向反復配列の左側部にすぐに続いている。

Ｍ、　Ｊ、　Ｗｌ！１ｃｋｅｒｔおよびＧ、Ｈ，Ｃｈａｍｂｌｉｓｓ、　Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８７巻、６２３８〜６２４２頁には、ａｍｙＥ遺伝子由来のＢ・ズブチリス中の 異化代謝産物抑制オペレーター配列の部位特異的突然変異誘発について報告され ている。その著者らは、アミラーゼの過剰産生（ｈｙｐｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉ ｏｎ）および異化代謝産物抑制がともに同じ領域内の突然変異によって影響を受 け時には同じ突然変異によって影響を受けたことを観察している。またその著者 らは、Ｂ・ズブチリスα−アミラーゼの異化代謝産物抑制オペレーターが他のバ シラス属菌株アミラーゼ遺伝子の調節領域の配列および他の異化代謝産物で抑制 される遺伝子とかなりの相同性を共有していることを見出した。これらの著者が 同定した共通配列は、Ｂ・リヘニフォルミスα−アミラーゼ転写開始部位に対し て＋７０位〜＋６４位に位置している。

少なくとも一つのグループは、配列Ｎ”　−Ｎ’（本願の命名法による）が異化 代謝産物抑制を行うのに必要なシス配列の必須部分を形成していると考えており 、もう一つのグループはすぐ隣接している配列を指摘している。Ｎ２〜Ｎ９が逆 方向反復配列の一部を形成していることは注目に値する。これらの配列を修飾す ると、ａｍｙＬプロモーターから得られる転写のレベルにより影響を与えるかも しれない。しかし、プロモーター配列の他の部分例えばＮ１における置換も、そ のプロモーターから得た転写レベルに影響するかもしれないということは無視で きない。

本願において、２機能的同族体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ） ″という用語は、上記配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するプロ モーター配列を意味するものとし、このプロモーター配列は、同様の条件下で、 Ｔ、Ｙｕｕｋｉらの前記文献またはＢ、　Ｌａｏｉｄｅらの上記文献に開示され たプロモーターより一層効率的に、そのプロモーター配列が先行している遺伝子 の転写を促進する。転写効率は、例えば、プロモーターからのｍＲＮＡの転写の 量を、例えばノーサンブロッティング法もしくはプライマー伸長法で直接測定す るか、またはプロモーターから発現された遺伝子産物の量を間接的に測定するこ とによってめられる。上記用語には、上記プロモーター配列の誘導体、例えば該 配列に一つ以上のヌクレオチドを挿入したもの、該配列のどちらかの末端への一 つ以上のヌクレオチドを付加したもの、および該配列のどちらかの末端もしくは 内部の一つ以上のヌクレオチドを欠失させたものを含めることとするが但しこの ような修飾が該配列のプロモーターとしての機能を損わないことが条件である。

上記配列のフラグメントは機能同族体の上記定義に含まれる。

発明の詳細な開示 本発明のプロモーターは、標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、米国、ニュー ヨーク州、コールドスプリングハーバ−１１９８９年参照）にしたがって、Ｔ、 Ｙｕｕｋｉらの前記文献もしくはＢ、　Ｌａｏｉｄｅらの前記文献から公知のプ ロモーター配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッドを形 成することによって、適切なバシラス・リヘニフオルミス菌株のゲノムから誘導 することができる。公知のプロモーター配列は、公知の方法にしたがって部位特 異的突然変異誘発を行わせることによって一つ以上の部位を修飾することができ る。また本発明のプロモーター配列は、確立された標準方法、例えばＳ、　Ｌ、 　ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ、　Ｈ。

Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　ＴｅＬｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２２巻、 １８５９〜１８６９頁、１９８１年に記載されているホスホアミダイト法（ｐｈ ｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ）またはＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭ口Ｏ Ｊ、、３巻、８０１〜８０５頁、１９８４年に記載されている方法によって合成 によって製造することもできる。

本発明の好ましいプロモーターの例は、Ｎ１がＣもしくはＴ；またＮ１がＡ、　 ＧもしくはＣ；特にＮ１がＣでＮ′がＡのプロモーターである。すなわちＮ”− Ｎ’は配列ＡＴＧＴＴＡＣＡを形成するのが好ましく、一方Ｎ１はＣが好ましい 。

上記プロモーター配列の適切なフラグメントの例は下記のＤＮＡ配列を有する。

可番号：２） 配列中、Ｎ’−Ｎ”は前記の意味を有する。

好ましい実施態様では、本発明のプロモーターはＢ・リヘニフオルミスの遺伝子 から誘導され、その遺伝子は特にバシラス・リヘニフォルミスα−アミラーゼの プロモーターの変異体である。

他の態様では、本発明は、上記のプロモーター配列によって先行された、注目の タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構造体に関する。注目の タンパク質としては酵素が有利であり、例えばα−アミラーゼ、シクロデキスト リングリコジルトランスフェラーゼたはプロテアーゼがある。ＤＮＡ構造体とし ては、シグナルペプチドをコードする配列を含有し、このＤＮＡ構造体で形質転 換された細胞を培養すると注目のタンパク質を培養培地に確実に分泌するものが 有利である。

本発明によれば、ＤＮＡ構造体は自己複製発現ベクター上に存在していてもよい 。このベクターはさらにそのベクターを宿主細胞中で複製することができるよう にするＤＮＡ配列を含有している。このような配列の例は、プラスミドのｐＵｃ １９（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ。

３３巻、　１０３〜１１９頁、１９８５年）、　ｐＡｃＹｃ１７７　（Ａ、Ｃ， Ｙ、ＣｈａｎｇおよびＳ、　Ｎ。

Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、ＢａＣ１ｅｒｉＯ１，、１３４巻、１１４１〜１１５６頁、 １９７８年）、　ｐＵＢｌｌＯ（Ｇｒｙｃｚａｎらの１９７８年の文献）または ｐｌＪ７０２　（Ｅ、Ｋａｔｚら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉ　ｃ−ｒｏｂｔｏｌ、 、　１２９巻、２７０３〜２７１４頁、１９８３年）の複製開始点である。また このベクターは、選択可能なマーカー、例えばアンピシリン、クロラムフェニコ ールもしくはテトラザイクリンに対する耐性のような抗生物質耐性を与える産物 を産生ずる遺伝子、またはＢ・ズブチリスもしくはＢ・リヘニフォルミス由来の ｄａｌ遺伝子（Ｂ、　Ｄｉｄｅｒｉ−ｃｈｓｅｎの１９８６年の文献）を含有し ていてもよい。注目のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよび 複製開始点を連結するために使用する方法は当該技術分野の当業者にとって公知 である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　： 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

米国、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバ−１１９８９年参照）。

あるいは、ＤＮＡ構造体は宿主細胞の染色体上に存在していてもよい。このこと は、ＤＮＡ構造体が宿主細胞内で安定に保持されているような場合に有利なこと が多い。ＤＮＡ構造体の宿主染色体への組込みは、従来の方法、例えば相同的組 換え法にしたがって実施することができる。プロモーター配列、注目のタンパク 質をコードするＤＮＡ配列および任意にシグナル配列は宿主細胞に別個に導入す ることができることには留意しなければならない。

別の態様では、本発明は、バシラス属の菌株内でタンパク質を製造させる方法で あって、本発明のＤＮＡ構造体またはベクターで形質転換されたバシラス属菌株 の宿主細胞を、前記タンパク質を産生させる条件下で培養し、得られたタンパク 質を培養物から回収することを含んでなる方法に関する。

上記の細胞を培養するのに使用する培地は、細菌を増殖させるのに適したいずれ の通常の培地でもよい。発現された遺伝子の産物は好ましくは培養物から回収さ れる。産物の回収は通常の方法で行われ、この方法は、細胞を遠心分離または濾 過によって培地から分離し、上澄み液または濾液のタンパク質成分を例えば硫酸 アンモニウムのような塩によって沈澱させ、次いで必要に応じて各種のクロマト グラフィーの方法例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ トグラフィーなどに付すことからなる方法である。

本発明を、添付図面を参照して以下の実施例でさらに説明する。

なお図面では下記の略語を使用する。

“ｐＢＲ３２２″はｐＢＲ３２２由来のＤＮＡを意味する。

“＋ｏｒｔ　ｐＵＢｆｌＯ″はｐＵＢｌｌｏのプラス複製開始点を意味する；“ ｒｅｐ″はｐＵＢｌｌｏのｒｅｐ遺伝子を意味する；“ｃａｔ″はｐｃ１９４の クロラムフェニコール耐性遺伝子を意味する；“ｃｇＬＡ”はテルモアネロバク タ−ＣＧＴアーゼの遺伝子を意味する；“ＰａｍｙＭ”はＢ・ステアロサーモフ ィラスのマルトゲニック（ｍａｌｔｏ−ｇｅｎｉｃ）アミラーゼ遺伝子（Ｄｉｄ ｅｒｉｃｈｓｅｎおよびＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎの１９８８年の文献）のプロ モーターを意味する； “ｂｌ＆″はｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子を意味する；“ｐＫＫ２３ ３−２　”はｐＫＫ２３３−２由来のＤＮＡを意味する；“ＰａｍｙＬ″はＢ・ リヘニフォルミスα−アミラーゼの遺伝子のプロモーターを意味する； ＰａｍｙＱ″はＢ・アミロリプファシェンスα−アミラーゼの遺伝子のプロモー ターを意味する； “ａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ”はＢ・リヘニフォルミスα−アミラーゼの遺伝子のシ グナルペプチドをコードする部分および成熟酵素をコードするテルモアネロバク タ−（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属菌株のＣＧＴアーゼ遺伝子の 部分を含有する融合遺伝子を意味する。

“ａｒｍ”はｐＨ１９４のエリスロマイシン耐性遺伝子を意味する；“ｏｒｉ　 ｐＨ１９４”はｐＨ１９４のプラス複製開始点とｒｅｐ遺伝子を含有する領域を 意味する；ならびに “’　ａｍｙＬ”はＢ・リヘニフォルミスα−アミラーゼの遺伝子の３′末端に またがるＤＮＡフラグメントを意味する。

図１はプラスミドｐＮｖ６０１の制限酵素地図である；図２はプラスミドｐＰＬ １８７Ｂの制限酵素地図である；図３はプラスミドｐＰＬ１４１９の制限酵素地 図である；図４はプラスミドｐＰＬ１４８９の制限酵素地図である；図５はプラ スミドｐＰＬ１５４０の制限酵素地図である；図６はプラスミドｐＤＮ３０００ の制限酵素地図である；図７はプラスミドｐＰＬ１７５９の制限酵素地図である ；図８はプラスミドｐＰＬ１８９２の制限酵素地図である；図９はプラスミドｐ ＰＬ１７９６の制限酵素地図である；図１０はプラスミドｐＢＢ３７の制限酵素 地図である；図１１はプラスミドｐＰＬ１３８５の制限酵素地図である；図１２ はプラスミドｐＰＬ１８９３の制限酵素地図である；図１３はプラスミドｐｓＪ １１１１の制限酵素地図である；図１４はプラスミドｐＤＮ３０６０の制限酵素 地図である；図１５はプラスミドｐｓＪ１２７７の制限酵素地図である；図１６ はプラスミドｐＳＪ９９４の制限酵素地図である：図１７はプラスミドｐｓＪ１ ２８３の制限酵素地図である；図１８はプラスミドｐｓＪ１３４２の制限酵素地 図である；図１９はプラスミドｐＳＪ１３５９の制限酵素地図である：図２０は プラスミドｐＰＬ１４８３の制限酵素地図である；図２１はプラスミドｐＰＬ１ ４８７の制限酵素地図である；図２２はプラスミドｐＳＪ９３２の制限酵素地図 である；図２３はプラスミドｐＳＪ９４８の制限酵素地図である；図２４はプラ スミドｐｓＪ９８０の制限酵素地図である；図２５はプラスミドｐｓＪ１３９１ の制限酵素地図である；図２６はプラスミドｐｓＪ１３９１に保持されている染 色体α−アミラーゼ遺伝子とａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ融合遺伝子の間の相同的組換 えによる交換を示す概略説明図である； 図２７は、ｃｇｔＡの成熟部分の５′末端間の生体内組換えを示す概略図である ；ならびに 図２８はプラスミドｐｓＪ１７５５の制限酵素地図である。

本発明を下記の実施例でさらに説明するが、本発明の適用範囲はこれらの実施例 によって限定されず請求の範囲によって限定されるものである。

実施例 一般的方法 上記プラスミド類を構築するのに使用した実験方法は、組換えＤＮＡ法の技術分 野の標準方法である（ＴｏＭａｎｉａｔｉｓら、ＭＯｌｅＣＬＩＩａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、米国、ニューヨーク州、 コールドスプリングハーバ−１１９８２年参照）。

制限エンドヌクレアーゼはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社およびＢ ｏｅｈｒｉ−ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社から購入しメーカーが推奨するよう にして使用した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ ｂｓ社から購入しメーカーが推奨するようにして使用した。

菌株からのベクターＤＮＡの調製はすべてＫｉｅｓｅｒの１９８４年の文献に記 載されている方法によって実施した。

大腸菌（Ｌ　並Ｕ）の形質転換： 大腸菌の細胞をコンピテント状態にし、Ｍａｎｄｅｌおよび旧ｇａの１９７０年 の文献に記載されているようにして形質転換した。

Ｂ・ズブチリスの形質転換： コンビテント細胞を調製し、Ｙａｓｂｉｎらの１９７５年の文献に記載されてい るようにして形質転換した。

Ｂ・リヘニフォルミスの形質転換： ＡｋａｍａｔＳｕの１９８４年の文献に記載されているようにして、ポリエチレ ングリコールによる原形質体形質転換法によって、プラスミドをＢ・リヘニフォ ルミスに導入した。

大腸菌、Ｂ・ズブチリスまたはＢ・リヘニフォルミスのＣＧＴアーゼ産生コロニ ーを、１％可溶性デンプンを補充したＬＢ寒天プレート上に形質転換体をプレー トすることによって同定した。３７℃もしくは３０℃で一夜インキユベートした 後、プレートをヨウ素の蒸気で染色して、デンプン上にＣＧＴアーゼの作用で生 成した加水分解領域を示した。

培地 ＢＰＸ：シャカイモデンブ：／　１００ｇ／ｊ’大麦粉　５０ｇ／Ｉ ＢＡＮ　５０００　ＳＫＢ　０．１　ｇ　／　／カゼイン酸ナトリウム　１０ｇ ／ｌ 大豆かす　２０ｇ／ｆ Ｎａ２ＨＰＯ，、１２Ｊ（，０９ｇ／ＩＰｌｕｒｏｎｉｃ　Ｏ，１ｇ　／　Ｉ ＬＢ寒天：　Ｂａｃｔｏ−トリプトン　１０ｇ／ＩＢａｃｔｏ酵母エキス　５ｇ ／Ｉ！ ＮａＣ１１０ｇ／１２ ＢａＣｔＯ−寒天　１５ｇ／Ｉ！ ＮａＯＨでｐＨ７，５に調節した。

テルモアネロバクタ−属の種の菌株ＡＴＣＣ５３６２７のＣＧＴアーゼの遺伝子 （以後ｃｇｔＡと呼ぶ）を保有する大腸菌プラスミドｐＮＶ６０１　（図１）の 構築は国際特許願公開第ＷＯ３９１０３４２１号に開示されている。このｃｇｔ Ａ遺伝子を含有するビー・サチリスのプラスミドｐＰＬ１８７８（図２）は国際 特許願公開第Ｗ０９１１０９１２９号に記載されている。このプラスミドは以下 のようにして構築した。

ｐＮＶ６０１を５ａｕ３Ａで部分的に消化し次いで再連結し、得られたプラスミ ドで大腸菌５Ｃ３Ｉ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国、カリフォルニア州、　 ＪａＪｏｌｌａから購入した凍結コンピテント細胞）を形質転換し、アンピシリ ン耐性（２００μｇ／ｍｌ）で選択した。一つのＣＧＴアーゼ陽性コロニーは、 ｐＰＬ１４１９（図３）を含有するＰＬ１４１９であった。プラスミドｐＰＬ１ ４１９を５ａｕ３Ａで部分的に消化し、次いでフラグメントをＢｇｌ　ＩＩで消 化したｐＰＬ１４８９（図４）に連結した。一つのＣＧＴアーゼ陽性でアンピシ リン耐性（２００ｕ　ｇ　／　ｍｌ）の大腸菌５Ｃ３Ｉ形質転換体はｐＰＬ１５ ４０（図５）を含有していた。ｐＫＫ２３３−２のＰｓｔＩ部位と旧ｎｄｎ［の 部位の間に合成りＮＡクリンカを挿入することによって、プラスミドｐＫＫ２３ ３−２　（Ｐｈａｒｍａ＋ｊａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入 した）からｐＰＬ１４８９を誘導した。このリンカ−はｐＤＮ３０００（図６； 国際特許願公開第９１１０９１２９号、［）ｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎらの１９９０ 年の文献）由来のＰｓｔＩ　−ＨｌｎｄＩ［ｒフラグメントであった。ｐＰＬ１ ５４０をＨａｅ　ＩＩとｓｐｈ　Ｉて消化し、得られたｃｇｔＡ遺伝子を含有す る２、　４ｋｂのフラグメントを、ＨａｅＩｒ＋Ｓｐｈ　ｒで消化したプラスミ ドｐＤＮ１３８０　（ＤｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎおよびＣｈｒｉｓｔｉａ−ｎｓｅ ｎの１９８８年の文献）に挿入した。ビー・サチリスＤＮ１８８５　（Ｄｉｄｅ ｒｉ−ｃｈｓｅｎらの１９９０年の文献）のＣＧＴアーゼ陽性でクロラムフェニ コール耐性（６μｇ／ｍｌ）の形質転換体はｐＰＬ１８７８を含有していた。

２、α−アミラーゼ／　ＣＧＴアーゼの融合遺伝子の構築バシラス・リヘニフォ ルミスα−アミラーゼ遺伝子のａｍｙＬをクローン化してプラスミドｐＤＮ１９ ８１を得る方法はＪｐｒｇｅｎｓｅｎらの１９９０年の文献に記載されている。

プラスミドｐＰＬ１７５９（図７）において、ｐＤＮ１９８１のＰｓｔ　Ｉ　− ＨｌｎｄＩ［［フラグメントを、Ｉ］ＤＮ３０００（図６）由来のＰｓｔ　ｌ− ＨｌｎｄＩｎのマルチリンカ−フラグメントで置換した。それはａｍｙＬプロモ ーターおよび大部分のシグナルペプチドをコードする配列を保持していた。

２．４ｋｂのＳａｌ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉフラグメント上にある、ｐＰＬ１８１７ から切取ったｃｇｔＡ遺伝子を、Ｓａｌ　Ｉ　＋　Ｎｏｔ　Ｉで消化したｐＰＬ １７５９に挿入し、得られたプラスミドでＤＮ１８８５を形質転換しカナマイシ ン耐性（１０Ｊｇ／ｍｌ）で選択して、プラスミドｐＰＬ１８９２（図８）を構 築した。

ｐＢ８３７（図１０；　Ｊｐｒｇｅｎｓｅｎ、　Ｐ、らの１９９１年の文献）由 来の０．５ｋｂのＳａｃ　Ｉ　−ＥｃｏＲＶ　７ラグメントを、Ｓａｃ　Ｉ　＋ 　Ｓｍａ　Ｉで消化した１）ＰＬ１３８５（図１１　ＨＤｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ らの１９９０年の文献）に挿入し、得られたプラスミドでＤＮ１８８５を形質転 換しクロラムフェニコール耐性（６μｇ／ｍｌ）で選択してプラスミドｐＰＬ１ ７９６（図９）を構築した。

２、４ｋｂのＢａｍＨＩ　−Ｎｏｔ　Ｉフラグメント上にある、　ｐＰＬ１８７ ８から切取ったＣＧＴアーゼ遺伝子を、ＢａｍＨＩ　＋　Ｎｏｔ　Ｉで消化した ｐＰＬ１７９６に挿入し、得られたプラスミドでＤＮ１８８５を形質転換しクロ ラムフェニコール耐性（６μｇ／ｍｌ）で選択することによって、プラスミドｐ ＰＬ１８９３（図１２）を構築した。

同じプラスミドに含有され、かつ相同領域を共有する二つのＤＮＡ配列を、生体 内で相同領域間の組換えによってともに融合することができる（図２７参照）生 体内での遺伝子工学的方法（Ｊｐｒｇｅｎｓｅｎらの１９９０年の文献）を、ａ ｍｙＬ遺伝子とｃｇｔＡ遺伝子の融合体を構築するのに用いた。この場合、Ｃｇ ｔＡシグナルペプチドをコードする配列はａｍｙＬ遺伝子のシグナルペプチドを コードする配列で正確に置換されていた。

この目的のために、下記のオリゴヌクレオチドリンカーを合成して、５ａｌｌで 消化したｐＵｃ１９　（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎらの１９８５年の文献）に 連結し、得られたプラスミドで大腸菌ＳＪ　２　（Ｄｉｄｅｒｉｃｂｓｅｎらの １９９０年の文献）を形質転換し、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）で選 択しｐｓＪｌｌｌｌ（図１３）を得た。

ａｍｙＬシグナルペプチドのコーディング領域の３′末端５ａｌｌ　Ｂｃｌ工　 Ｐｓｔ工 ＣｇｔＡ成熟タンパク質のコーディング領域の５′末端Ｘｂａ工　Ｓａｌ工 ＧＣＡＣＣＣ；ＧＡＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧ　−３’ＣＧＴＧ ＧＣＣＴＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴ　−５’　ωび１洛 号：３）ｐｃ１９４（ＨｏｒｉｎｏｕｃｈｉおよびＷｅｉｓｂｌｕｍの１９８２ 年の文献）由来のクロラムフェニコール耐性の遺伝子ｃａｔを、１．　ｌｋｂの ＢａｍＨＩ　−Ｂｇｌ　Ｉｎフラグメントとして、ｐＤＮ３０６０（図Ｉ４；国 際特許出願公開第ＷＯ９１１０９１２９号）から切取り、Ｂｃｌ　Ｉで消化した ｐｓＪｌｌｌｌに挿入し、得られたプラスミドで大腸菌ＳＪ　６　（Ｄｉｄｅｒ ｉｃｈｓｅｎらの１９９０年の文献）を形質転換し、アンピシリン（２００μｇ ／ｍｌ）とクロラムフェニコール（６μｇ／ｍｌ）の耐性で選択してｐＳＪ１２ ７７（図１５）を得た。

ｐＰＬｌ、８９３由来の０．６ｋｂのＮｏｔ　Ｉ　−Ｎｅｏ　ｎフラグメントを ｐＰＬ１８９２由来の５．４ｋｂのＮＯｔ　Ｉ　−Ｎｃｏ　ｎフラグメントに連 結し、得られたプラスミドでＤＮＩ８８５を形質転換し、カナマイシン耐性（１ ０μｇ／ｍｌ）で選択することによってｐＳＪ９９４　（図１６）を構築した。

ｐｓＪＩ２７７由来の１．　ｌｋｂの５ａｌｌフラグメントをＳａｌ　Ｉで消化 したｐＳＪ９９４に連結し、得られたプラスミドでＤＮ１８８５を形質転換し、 カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）とクロラムフェニコール耐性（６μｇ／ｍ １）で選択することによってｐｓＪ１２８３（図１７）を構築した。

ｐｓＪ　１２８３から１．　ＩｋｂのＰｓｔＩフラグメントを欠失させ、得られ たプラスミドでＤＮ１８８５を形質転換させ、カナマイシン耐性（１０μｇ／ｍ ｌ）で選択してｐｓＪ１３４２（図１８）を構築した。

ｐｓＪ１３４２からの実際の生体内組換えによって、ｐｓＪ１３５９（図１９） を構築した。ＣＧＴアーゼ遺伝子の成熟部分の出発部と、ｐｓＪ１３４２上のＰ ｓｔｌとＳａ、ＩＩ間に延びる合成オリゴヌクレオチドの部分との間には相同性 がある。このプラスミドがこれらの２つの相同領域間の組換えを受けるとＸｂａ Ｉ　、Ｓａｌ　ＩおよびＢａｍＨＩに対するユニーク部位が欠失する。

宿主菌株ＤＮ１８８５から製造したｐｓＪ１３４２の１バツチをＢａｍ）ＩＩ、 　ＸｂａＩおよび５ａｌＩで完全消化し、その消化したプラスミドで、ＤＮ１８ ８５のコンピテント細胞を直接（すなわち連結を行わずに）形質転換し、カナマ イシン耐性（１０μｇ／ｍりで選択した。この方法によって組換プラスミドは強 く強化される。というのは線形化されたプラスミドモノマーは、ビー・サチリス のコンピテント細胞を形質転換できるからである（Ｍｏｔｔｅｓらの１９７９年 の文献）。組換えられたプラスミドは制限酵素によって開裂されることなく、し たがってビー・サチリスのコンピテント細胞を充分形質転換することができるモ ノマーおよびオリゴマーの形態の混合物として存在する。このようにして得られ た一つの形質転換体はｐｓＪ１３５９を含有していた。このプラスミドは、ｐＵ Ｂｌｌｏ（ＬａｃｅｙとＣｈｏｐｒａの１９７４年の文献、Ｇｒｙｃｚａｎらの １９７８年の文献、ＭＣＫｅｎＺｉｅらの１９８６年の文献）の複製開始点、ｐ ＵＢｌｌｏのＲｅｐタンパク質の遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ならびにテ ルモアネロバクタ−属の種の菌株ＡＴＣＣ５３６２７由来のＣＧＴアーゼの成熟 部分をコードするＤＮＡに完全に融合された、Ｂ・リヘニフォルミスのアミラー ゼ（ａｍｙＬ）プロモーターおよびシグナルペプチドのコーディング領域を含有 している。

３、染色体組込みベクターの構築 ｐＵＢ１］、０のカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）を含有する１、　４ｋｂの ＢａｍＨｎフラグメントをプラスミドｐＤＮ２９０４　（国際特許出願公開第Ｗ ０９］、１０９１２９号）から切取り、Ｂｇｌ　ＩＩで消化したｐＤＮ３０００ （図６）に連結し、得られたプラスミドで大腸菌５Ｃ３Ｉを形質転換してアンピ シリン耐性（１００μｇ／ｍｌ）で選択して、かような一つの形質転換体からｐ ＰＬｌ、４８３（図２０）を回収した。

次にこのプラスミドを、復製に対して温度感受性のノくシラス属細菌のベクター であるプラスミドｐＥ１９４（ＨｏｒｉｎｏｕｃｈｉおよびＷｅｉｓｂｌｕｍの １９８２年の文献ｂ）と結合させた。ｐＰＬ１４８３をＡｃｃ　Ｉで消化し、ｐ Ｅ１９４をＣ１ａ　Ｉで消化し、得られた二つの線状化プラスミドを混合して連 結し、生成したプラスミドでＢ・ズブチリスＤＮ１８８５を形質転換し３０℃に てカナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）で選択した。得られた形質転換体の一つ はｐＰＬ１４８７（図２１）を含有していた。

ａｍｙＬ遺伝子の３′末端のフラグメントを、プラスミドｐＤＮ１５２８Ｊｐｒ ｇｅｎｓｅｎ、　Ｓ、らの１９９１年の文献）から、０．７ｋｂのＳａｌ　Ｉ　 −ＨｌｎｄＩ［フラグメントとして切取り、Ｓａｌ　Ｉ　＋ＨｉｎｄＩＩＩで消 化したｐＵｃ１９に連結し、生成したプラスミドでイー・コリＳＪ２を形質転換 し、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）で選択した。このようにして得た形 質転換体の一つはｐＳＪ９３２　（図２２）を含有していた。

Ｂｇｌ　ｍリンカ−を旧ｎｄＩＩで消化したＩ）ＳＪ９３２に挿入し、得られた プラスミドでＳＪ２を形質転換し、もう一度アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍ １）で選択することによってプラスミドｐＳＪ９４８　（図２３）を得た。

ｐＰＬ１４８７の５．　ｌｋｂの旧ｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｈｉｎｄｌｎで 消化したｐＳＪ９４８に連結し、得られたプラスミドでＢ・ズブチリスＤＮ１８ ８５を形質転換し、３０℃にてカナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）で選択する ことによって、ｐｓＪ９８０　（図２４）を構築した。

最後に、ｐｓＪ１３５９の４．　ＯｋｂのＢｇＩＩ［フラグメントを、ｐｓＪ９ ８０の５．６ｋｂのＢｇｌ　ｎフラグメントに連結し、得られたプラスミドでＤ Ｎ１８８５を形質転換し、３０℃にてカナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）で選 択することによってｐｓＪ１３９１（図２５）を構築した。このプラスミドは、 複製に対して温度感受性でカナマイシンとエリスロマイシンに対する耐性を与え るベクター上に、Ｂ・リヘニフオルミスα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）由来 のプロモーターと上流領域（約０．４ｋｂ）　、α−アミラーゼ／　ＣＧＴアー ゼ融合遺伝子（ａｍｙＬ−ｃｇｔＡ）　、およびα−アミラーゼ遺伝子の３′領 域（’　ａｍｙＬ）由来の約０．７ｋｂを含有している。

Ｂ・リヘニフォルミスのα−アミラーゼ産生菌株を、原形質体形質転換法（Ａｋ ａｍａｔｓｕの１９８４年の文献）によって、ｐｓＪ１３９１で形質転換した。

−回再生させたところカナマイシン耐性のコロニーが単離し、α−アミラーゼと ＣＧＴアーゼの両方を産生ずることが見出された。これら二つの酵素が産生じて いることは次のようにして容易に認めることができる。すなわち振盪フラスコ中 のＢＰＸ培地（国際特許出願公開第Ｗ０９１１０９１２９号）による培養物から 得た培養上澄み液中のタンパク質を等電点電気泳動ゲル法（たとえばＰｈａｒｍ ａｃｉａ　ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍを用いる）で分離し、次いで１％の可溶性デ ンプンを含有するアガロースゲルを上にのせ次にヨウ素蒸気で染色することによ って認めることができる。ＣＧＴアーゼの活性はＰＩ４．５において検出し、α −アミラーゼの活性はＰＩ３において検出した。

この形質転換体をそのプラスミドの内容について分析したところ、入ってくるプ ラスミドと染色体との間の組換えが起こったことが分かった。すなわち、二重組 換えによって、染色体のα−アミラーゼ（ａｍｙＬ）遺伝子とプラスミドがもっ ているａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ融合遺伝子との交換がなされた結果、単離されたプ ラスミドはａｍｙＬ遺伝子を保有しくこのプラスミドで形質転換されたＢ・ズブ チリスＤＮ１８８５はα−アミラーゼを産生じた）、一方ａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ 融合遺伝子は染色体上に存在していた（図２６）。

ＴＹ培地（国際特許出願公開節Ｗ０９１１０９１２９号）中カナマイシンなしで 菌株を増殖させることによって、自発的にそのプラスミドを失った菌株を単離し た（ＳＪ１５９９．　ＳＪ］、６０３〜１６０７）。

Ｂ・リヘニフォルミスの元の形質転換体について、組換えを促進するため、染色 体への組込みと続いてプラスミドの切取りを確実に行う実験を実施した。元の形 質転換体を、ＩＯμｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天（国際特許出願 公開節Ｗ０９１１０９１２９号）上に５０℃でプレートし、個々のコロニーを５ ０℃で数回、再画線を行い、次いで各々をカナマイシンなしで３０℃にて一夜連 続してＴＹ培養物中で増殖させて、プラスミドを切除させた。元の５０℃での各 コロニー由来のＫａｎａｓ単離物をＢＰＸ振盪フラスコ中でインキュベートし、 次いでα−アミラーゼまたはＣＧＴアーゼの産生を上記の等電点電気泳動ゲル法 で分析して測定した。分析されたこれらのプラスミドなしの菌株はすべてＣＧＴ アーゼまたはα−アミラーゼを産生じた。ＣＧＴアーゼを産生する単離物は例え ば５Ｊ１５６１〜１５６２．１５８０〜１５８３．１５８６〜１５９１および１ ５９５である。

５Ｊ１６０８と命名した一つの菌株は他の菌株よりも大量のＣＧＴアーゼを産生 するようであった。

菌株５Ｊ１５６１．１５６２．１５９９．１６０６および１６０８をサザンプロ ット分析に付して、これらの菌株は染色体のａｍｙＬ遺伝子がａｍｙＬ　−Ｃｇ ｔＡ遺伝子で置換されていることを確認した。

以下の試験結果は、ＢＰＸ入り振盪フラスコ中で６日間３７℃でインキュベート して生成したＣＧＴアーゼの活性を定量することによって得た（いくつもの実験 で得た結果である。菌株の各グループ内の変動の主原因は異なるバッチの振盪フ ラスコを使用したことである）。

５Ｊ１６０８　２００〜２７５ ５、プロモーターの分析 我々は、ａｍｙＬ　−ｃｇｔＡ遺伝子を含有する菌株５Ｊ１６０８およびその外 の菌株のＣＧＴアーゼの産生量の大きな差が、ＣＧＴアーゼの発現に関与してい るａｍｙＬプロモーターの差が原因であるのか否かを試験した。

Ｂ・リヘニフォルミスの宿主菌株のａｍｙＬプロモーターの配列を配列番号＝４ に示す。

ＣＧＴアーゼを産生する多数のＢ・リヘニフォルミス菌株由来のプロモーター領 域をＰＣＲ法（Ｓａｉｋｉらの１９８８年の文献）によって染色体ＤＮＡから増 幅した。この場合、２０４〜２３３位の読取り下流（ｒｅａｄｉｎｇｄｏｗｎｓ ｔｒｅａｍ）からａｍｙＬプロモーターまでに相当する一つのオリゴヌクレオチ ドおよび成熟ＣＧＴアーゼをコードするＤＮＡの５′末端と読取り上流（ｒｅａ ｄｉｎｇ　ｕｐｓｔｒｅａｍ）に相当するもう一つのオリゴヌクレオチドをプラ イマーとして用いた。この第二のオリゴヌクレオチドの配列は５　’　−ＣＣＴ ＧＴＴＧＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧ−３’　（配列番号：５）であった。

各菌株由来の増幅ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切取り、次いでジデ オキシ法（Ｓａｎｇｅｒらの１９７７年の文献）の配列決定プライマーとして、 ＰＣＲ増幅に使ったのと同じオリゴヌクレオチドを用いて配列を直接決定した。

配列分析の結果から、プロモーター領域内の二つの点変異の一方もしくは両方が 、観察されたＣＧＴアーゼの産生量の大きな差の原因であることが分かる。

菌株５Ｊ１５９９と１６０３〜１６０６はすべて低収量であるが配列番号＝４に 示すプロモーター配列をもっている。しかし、高収量菌株の５Ｊ１６０Ｂは配列 番号二６に示すプロモーター配列を含有している。

上記の差は、５５３位において５Ｊ１６０８がＴの代わりにＣを含有している場 合、および５９３位において５Ｊ１６０８がＴの代わりにＡを含有している場合 に起こる。

ｐｓＪ１３５９とｐｓＪ１３９１上に存在するａｍｙＬプロモーターの配列は、 上記のＰＣＲ増幅法と配列決定法を用いて決定した。その結果、両方のプラスミ ドが配列番号：ｌに示すプロモーター配列すなわち５Ｊ１６０８のプロモーター 配列と同一の配列を含有していることが分かった。

６、Ｂ・リヘニフォルミスα−アミラーゼの遺伝子ａｍｙＬの発現に対するプロ モーターの作用の分析 ｐＤＮ１９８１　（実施例２参照）由来の３．３ｋｂのロｇｌＩＩ−旧ｎｄＩ［ ｒフラグメントを、ｐｓＪ１３９１（図２５）由来の４．９ｋｂのＢｇｌ　ＩＩ −旧ｎｄＩ［［フラグメントに連結し、得られたプラスミドでＮ１８８５を形質 転換し、３０℃でカナマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）で選択することによって ｐｓＪ１７５５（図２８）を構築した。このプラスミドは、ＳＥＱ　ＩＤ６に示 すプロモーター配列（このプロモーターは高収率ＣＧＴアーゼ菌株５ＪＩ６０８ に見出される）を有する前ａｍｙＬ遺伝子と、複製について温度感受性でかつカ ナマイシンとエリスロマイシンに対する耐性を与えるベクター上に含有している 。

５Ｊ１６０８が誘導されたα−アミラーゼ産生Ｂ・リヘニフオルミス菌株は、ア ルカリ性プロテアーゼ遺伝子中に挿入されその結果この遺伝子を中断してこの菌 株をアルカリプロテアーゼ陰性にするクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有し ていた。誘導体の菌株５Ｊ１７０７は、クロラムフェニコール耐性遺伝子が約１ ５０ｂｐ欠失しその菌株がアルカリプロテアーゼ陰性になっていることを除いて ５Ｊ１６０８と同一である。

プラスミドｐｓＪ１７５５を、原形質体形質転換法で菌株５Ｊ１７０７中に導入 し、次いで実施例４に記載されているようにして組込み／切取りを行うことによ って、ａｍｙＬ−ｃｇｔＡ融合遺伝子のａｍｙＬ遺伝子による置換が達成された 。

配列番号＝６で示すプロモーター配列のａｍｙＬ遺伝子より先行している形質転 換菌株５Ｊ１７０７からのα−アミラーゼの収量を、５Ｊ１６０８が誘導された 菌株で配列番号＝４で示すプロモーター配列がａｍｙＬ遺伝子より先行している 菌株からの収量と比較した。

ＢＰＸ入り振盪フラスコ培養物を６日間３７℃でインキュベートして下記の試験 結果を得た。

プロモーターの配列　アミラーゼ、任意単位配列番号；４１ 配列番号：６　１０５ これらの試験結果から、α−アミラーゼの収量は配列番号＝６に示すプロモータ ー配列を用いると大きく増大することは明らかである。

引用文献 Ａｋａｍａｔｚｕ、　Ｔ、、　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ、　Ｊ、　（１９８４）、　 Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐｒｏ−ｔｏｐｌａｓｔ　ｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　［ｔａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　ａｎｄ 　ｉｔｓ　ａｐｐｌｆｃａｔｉｏｎｔｏ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｆｕｓｉｏｎ 　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、。

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Ｇｅｎｅｔ、、１７４．　２８１−２８６゜Ｌａｃｅｙ、　Ｒ，、Ｃｈｏｐｒａ 、　１．（１９７４）、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ａ　ｍｕｌ Ｌｉｒｅｓｉ−ｓｔａｎｔ　５ｔｒａｉｎ　ｏｆ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ　ａｕｒｅｕｓ、　Ｊ、Ｍｅｄ、Ｍｆｃｒｏｂｉｏｌ、、　７゜２８５＝２９ ７゜ ＭｃＫｅｎｚｉｅ、　Ｔ、、　Ｈｏ５ｈｉｎｏ、　Ｔ、、　Ｔａｎａｋａ、　Ｔ 、、　５ｕｅｏｋａ、　Ｎ、（１９８６）、　Ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐＵＢｌｌｏ：　Ｓｏｍｅ　５ａｌｉｅｎｔ　ｆｅａｔ ｕｒｅｓ　ｉｎ　ｒｅｌａ−ｔｉｏｎ　ｔｏ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ 　ｉｔｓ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　１５．９３−１０３゜Ｓ ａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、、　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ ，（１９７７）、　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ−ｔｅ ｒｍｉｎａｔｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉＬｏｒｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７４゜５４６３−５４６７゜ ５ａｊｋｉ、　Ｒ，に、、　ＧｅＪｆａｎｄ、　Ｄ、Ｈ，、５ｔｏｆｆｅｌ、　 Ｓ、、　５ｃｈａｒｆ、　Ｓ、Ｊ、、　Ｈｉｇｕ−ｃｈｉ、　Ｒ，、Ｈｏｒｎ、 　Ｇ、Ｔ、、　Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、、　Ｂｒ１ｉｃｈ、　Ｈ，Ａ、（１９ ８８）、　Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｍｐｌｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＤ ＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．４８７−４９１゜Ｇ ｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、、　Ｃｏｎｔｅｎｔｅ、　Ｓ、、　Ｄｕｂｎａｕ、　Ｄ、 （１９７８）、　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ　５ｔａｐ　ｙｌｏｃ ｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　１ｎｔｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　 ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ−ｔｉｏｎ　１ｎｔｏ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕＭｉｌｒ ｓ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１３４．３１８−３２９゜Ｙａｎｒｓｈ− Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、（１ ９８５）、　ＩｍｐｒｏｖｅｄＭ１３　ｐｈａｇｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔ ｏｒｓ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ：　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑ ｕｅ−ｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍ１３　ｍｐ１８　ａ、ｎｄ　ｐＵｃ１９　ｖ ｅｃｔｏｒｓ、　Ｇｅｎｅ　３３．１０３−１１９゜Ｙａｓｂｉｎ、　Ｒ，Ｅ、 、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｇ、Ａ、、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｆ、Ｅ、（１９７５）、 　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１２１、　２９６−３０４゜ 配列表 （１，）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称＋　Ｎｏｖａ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／５（Ｂ）ストリート：　Ｎｏｖ ｏ　Ａ１１ｅ（Ｃ）市：　Ｂａｇｓｖａｅｒｄ （Ｅ）国：デンマーク （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　２８８０（Ｇ）電話：　＋４５４４４４８８８ ８（Ｈ）テレファックス：　＋４５４４４９３２５６（１）テレックス：　３７ ３０４ （ｉｉ）発明の名称：バシラス属菌株のプロモーター（迅）配列の数二〇 （ｉｖ　）コンピューターが読取り可能な形態：（Ａ）媒体の種類：フロッピー ディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブルＣＣ）オペレーテ ィングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔ ｅｎｔ　Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０゜Ｖｅｒｓｉｏｎ　８１．２５　（Ｅ ＰＯ）（２）配列番号：１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二６１６個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｉｉ）分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ　）起源： （Ａ）生物：パンラス・リヘニフォルミス（ｘｉ）配列の表示：配列番号：工 （２）配列番号：２の情報： （ｊ）配列の特徴： （Ａ）長さ２１８６個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の種類：　Ｉ）ＮＡ（ゲノム）（ｖｉ　）起源。

（Ａ）生物・パンラス・リヘニフォルミス（ｘｉ）配列の表示、配列番号、２ Ａ；υσ℃　１８６ （２）配列番号：３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６６個の塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉ）分子の種類：　ｃＤＮＡ （νＩ）起源； （Ａ）生物：合成 （ｘｉ）配列の表示　配列番号：３： ＴＣＣＡｒ　ＡＣ口ｘＴりα丁ｗｃｃｗ工石α石ＣＡαｒ−ＱンスＣＴｎフ５て Ｔ　６０ＣＤｒｈＫＪ　６６ （２）配列番号　４の情報。

（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、６１６個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数・−水路 （Ｄ）トポロジー：線状 （１ｉ）分子の種類・ＤＮＡ　（ゲノム）（ｖｉ　）起源： （Ａ）生物　パンラス・リヘニフォルミス（ｘｉ）配列の表示：配列番号＝４： （２）配列番号：５の情報： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ７２０個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の種類：　ｃＤＮＡ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物二合成 （ｘｉ）配列の表示、配列番号、５： ご頭１品Ｔｆｆｌｎα剪　２０ （２）配列番号：６の情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝６１６個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数、−水路 （Ｄ）トポロジー、線状 （ｉｉ）分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ　）　起１Ｍ　’パンラス・リ ヘニフォルミス（ｘｉ）配列の表示：配列番号：６： ！　ＡＧＡＡＴＣ６１６ Ｆｉｇ、　４ Ｆｉｇ、　５ 沫 Ｆｉｇ、　６ Ｆｉｇ、　７ Ｆｉｇ、　８ ｏ８ Ｆｉｇ、　１０ Ｆｉｇ、１１ Ｆｉｇ、　１２ Ｆｉｇ、　２０ Ｆｉｇ、　２１ Ｆｉｇ、　２４ Ｆｉｇ、　２５ Ｆｉｇ、　２８ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年５月１３日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記ＤＮＡの配列： 【配列があります （配列番号：１） （配列中、Ｎ２−Ｎ９が一緒になって配列【配列があります】または【配列があ ります】を形成しない場合を除いて、Ｎ１−Ｎ９は各々Ａ，Ｔ，ＣまたはＧであ る）または上記配列の機能的同族体に含有されているバシラス属菌株のプロモー ター。 ２．Ｎ１がＣまたはＴである請求の範囲第１項記載のプロモータ３．Ｎ７がＡ， ＧまたはＣである請求の範囲第１項記載のプロモーター。 ４．Ｎ１がＣでＮ７がＡである請求の範囲第１項記載のプロモーター。 ５．Ｎ２−Ｎ９が一緒になって配列【配列があります】を形成する請求の範囲第 １項記載のプロモーター。 Ｇ．Ｎ１がＣである請求の範囲第５項記載のプロモーター。 ７．下記配列： 【配列があります】 （配列番号：２） （配列中、Ｎ１−Ｎ９は上記の意味を有する）に含有されている請求の範囲第１ 項記載のプロモーター。 ８．バシラス・リヘニフォルミスの遺伝子から誘導され、特にバシラス・リヘニ フォルミスα−アミラーゼのプロモーターの変異体である請求の範囲第１〜７項 のいずれか一つに記載のプロモーター。 ９．請求の範囲第１〜８項のいずれか一つに記載のプロモーター配列が先行して いる注目のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構造体。 １０．注目のタンパク質が、α−アミラーゼ、シクロデキストリングリニユシル トランスフェラーゼまたはプロテアーゼのような酵素である請求の範囲第９項記 載のＤＮＡ構造体。 １１．さらに、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する請求の範囲 第９項または１０項に記載のＤＮＡ構造体。 １２．シグナルペプチドが、Ｂ・リヘニフォルミスα−アミラーゼのシグナルペ プチドである請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ構造体。 １３．請求の範囲第９〜１２項のいずれか一つに記載のＤＮＡ構造体を含有する 組換え発現ベクター。 １４．請求の範囲第９〜１２項のいずれか一つに記載のＤＮＡ構造体、または請 求の範囲第１３項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 １５．バシラス属の菌株、特にバシラス・リヘニフォルミス、バシラス・レンタ ス、バシラス・ブレビス、バシラス・ステアロサーモフィラス、バシラス・アル カロフィラス、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・コアギュランス 、バシラス・スリンジエンシスまたはバシラス・サチリスの菌株である請求の範 囲第１４項記載の宿主細胞。 １６．バシラス属の菌株内でタンパク質を産生させる方法であって；請求の範囲 第９〜１２項のいずれか一つに記載のＤＮＡ構造体または請求の範囲第１３項に 記載のベクターで形質転換されたバシラス属菌株の宿主細胞を、前記タンパク質 を産生させる条件下で培養し、得られたタンパク質を培養物から回収することか らなる方法。