JPH07505282A - キメラ受容体遺伝子およびこれを用いて形質転換した細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キメ−六　゛　−およびこれ　いて・　−したルバーＴ細胞、ナチュラルキラー （Ｎ　Ｋ）細胞等が適当である。形質転換リンパ球は治療学的処置方法に有用で ある。

て特異的分子を認識し、これと相互に作用することが知られている。このような ＣＤ３と会合する。ＣＤ３はリガンドによってＴＣＲの次の占有を細胞内で信号 する抗原特異的免疫応答を活性化することになる。ＴＣＰ／ＣＤ３複合体は免疫 ブチドと会合してＴ細胞表面に発現される。これらはＣＤ３複合体とゼータ鎖の Ｔ、δおよびεサブユニットである。ＣＤ３γ、δおよびεポリペプチドは３１ ｊＩ成員の免疫グロブリンスーパージエンファミリーによって符号化され、ヒト 染色体１１またはネズミ染色体９のクラスターに見いだされる。ゼータ鎖遺伝子 はマウスとヒトの両方において染色体１の他のＴＣＲおよびＣＤ３遺伝子から別 々に見いだされる。ネズミＴ細胞はゼータｍ−ＲＮＡ転写の代替スプライシング によって受容体会合ζ鎖を生成することができる。ＣＤ３鎖およびゼータサブユ ニットは可変性を示さず、抗原認識において直接必要とされない。

Ｔ細胞受容体の全成分は膜タンパク質であり、リーダーシーフェンス、外側に配 置されたＮ末端細胞外ドメイン、単一膜スパンドメイン、および細胞質テールか ら成る。α、β、Ｔおよびδ抗原結合ポリペプチドは糖タンパク質である。ゼー タ鎖は９個のアミノ酸のみの比較的短い外部ドメインおよび約１１０個のアミノ 酸の長い細胞質テールをもつ。大抵のＴ細胞受容体αβヘテロニ量体はジスルフ ィド結合によって共有結合しているが、多くのγδ受容体は互いに非共有結合に より会合している。ゼータ鎖は定量的にジスルフィド結合ζ−ηヘテロニ量体ま たはゼータ−ゼータホモ二量体を形成する。

免疫系の細胞の受容体の型の他の例はＦｃ受容体である。免疫系の細胞との抗体 −抗原複合体の相互作用は、抗体依存性細胞毒、マスト細胞脱顆粒反応、および 食作用のようなエフェクター作用から、制御リンパ球増殖および抗体分泌のよう な免疫モジュレータ−信号までの範囲の広い応答配列となる。これら全相互作用 は抗体または免疫複合体のＦｃドメインが造血細胞の特定の細胞表面受容体に結 合して開始される。抗体と免疫複合体によって引き起こされる細胞応答の相違は Ｆｃ受容体の構造上の不均質が原因であることは現在よく立証されている。

ＦｃＲ５は免疫グロブリンイソタイプに対する特異性によって明確にされる。

基づきローマ数字によって識別される。我々は現在３群のＦＣＴＲｓを確認し、 ＦｃｒＲＩ、ＦｃｒＲＩＬおよびＦ　ｃ　ｒ　Ｒ１１１と名付けている。２群の ＦＣｔＲは既に確認されており、これらはＦｃｔＲｌおよびＦｃεＲＴＩと呼ば れている。

群内で構造的に関連するが別個の遺伝子がＡ、Ｂ、Ｃによって表示される。最後 に、タンパク質サブユニットはギリシャ文字で例えばＦ　ｃ　ｒ　ＲＩＩＩＡα 、Ｆｃ７ＲＩＩＩＡｙで示される。

過去３年間でＩｇＧおよびＴｇＥＦｃ受容体（ＦｃｙＲＳＦｃｔＲ）に対してそ れらの分子クローニングによって不均質を確認することにかなりの前進があった 。これらの研究はＦｃ受容体が構造的に関連したりガント結合ドメインを共有す るが、恐らく細胞内信号化を仲介するであろうそれらのトランスメンプランおよ び細胞外ドメインにおいて異なる。従って、異なる細胞の特異的ＦＣｒＲｓは免 疫複合体と相互作用する際に異なる細胞応答を媒介する＊　ＦｃｒＲｓおよびＦ ｃｇＲＩの構造分析もこれらの若干の受容体の中で少なくとも１個の共通のサブ ユニットを示した。この共通のサブユニットはＴサブユニットであり、ＴＣＲ／ ＣＤ３のζまたはη鎖に似ており、Ｆ　ｃ　ｒ　Ｒ１１＋およびＦｃ上Ｒ１の信 号形質導入に含まれる。

ＩｇＧに対する低親和性受容体（Ｆ　ｃ　ｒ　ＲＩＩＩＡ）は、Ｔ鎖（Ｆ　ｃ　 ｒ　ＲＨｒＡ　ｒ）と会合したリガンド結合ＣＤ１６α（Ｆｃ７ＲＩＩＩＡｙ） ポリペプチドから成る。

ＣＤ１６ポリペプチドは多形核細胞において膜アンカー形態として、そしてＮＫ においてトランスメンプラン形ｇ（ＣＤ１６□）として出現する。ＦｃγＲＩＩ ＩＡはＮＫ細胞に対してトリガー分子として働り。

免疫細胞受容体の他の型はＩＬ−２受容体である。この受容体は３本の鎖、α鎖 （ｐ５５）　、ＩｔＡ　（ｐ７５）　オヨびｒｉＭカら成る。ＩＬ−２１，ｍよ ッテ刺激すると、リンパ球は増殖および活性化を受ける。

抗原特異的エフェクターリンパ球、例えば腫瘍特異的Ｔ細胞（Ｔｃ）は極めて珍 しく、各個特異的で、それらの認識スペクトルにおいて限定され、大抵の悪性腫 瘍に対して得ることが困難である。他方、抗体は容易に入手でき、さらに容易に 誘導され、さらに広いスペクトルを有し、各個特異的ではない、特定の抗体を癌 免疫療法に応用する主な問題は充実性腫瘍内の大きい範囲に達するために充分な 分量のモノクロナール抗体（ｍＡｂ）の無力にある。実際に、受身の抗腫瘍免疫 療法に対する免疫系の体液性または細胞質アームを補充するため多くの臨床上の 試みがなされたが期待を満たさなかった。抗腫瘍抗体を得ることはできたが、充 実性腫瘍が充分な分量の抗体（３）を得難いので、治療上の利用はそれだけ血液 関連腫瘍（１，２）に限られていた０選択された充実性腫瘍に有効であるが養子 免疫療法においてエフェクターリンパ球の使用は、他方では、（主にＮＫ細胞で あるリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）　（４）の場合におけるよう な）特異性の不足、または腫瘍侵入リンパ球（ＴＩＬｓ）を補充し大抵の悪性膿 瘍（５）についてこのような特異的Ｔ細胞を広げる際の困難性を欠点としてもつ 。

今なお、ＴＩＬｓが黒色腫および腎細胞癌中に得られること、それが選ばれた患 者に有効であること、および外来遺伝子がこれらの細胞（６）中で作用できるこ との観察は、これらの細胞に治療の可能性を示している。

最近開発された戦略（ヨーロッパ公告特許出願第０３４０７９３号、参照？−１ １）によれば、抗体の特異性の長所を、ホーミング、組織浸透、サイトヵイン生 成およびＴリンパ球の標的細胞破壊と組合わせて、生体外の遺伝子操作によって 、Ｔ細胞の抗腫瘍特異性の範囲を広げることができる。このアプローチでは、本 発明者らの実験室は、抗体分子の変化しゃすい領域ドメイン（Ｆ　ｖ）および抗 原結合ＴＣＲ１１Ｉ、すなわちα／βまたはγ／δ鎖の一定領域ドメインから成 るキメラＴ細胞受容体（ｃＴｃＲ）遺伝子をＴ細胞中に機能的に発現することに 成功した。この遺伝子対アプローチでは、ゲノム発現ベクターは、αまたはβＴ 　ＣＲ１１のＣＡＭ域遺伝子断片のいずれか１つに接合した抗−２，４，６−ト リニトロフェニル（ＴＮＰ）抗体（Ｓｐ６）の重い（ｖＩｌ）および軽い（Ｖｔ ）ｉｉｉのＶ領域ドメインに対してコードする再配列遺伝子断片を含んで構築さ れた。細胞障害性Ｔ細胞ハイブリドーマにトランスフエフシランした後、機能Ｔ ＣＨの発現を検出した。キメラＴＣＲはＳｐ６抗ＴＮＰ抗体のイディオトープを 示し、ハプテンＴＮＰへの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の非制限応答を Ｔ細胞に賦与した。トランスフェクタントはＴＮＰ挙動（ｂｅｅｒｉｎｇ）標的 細胞を特異的に殺し、それに応答して菌株と種のバリアを越えてインターロイキ ン−２（ＩＬ−２）を生成した。さらに、このようなトランスフェクタントは、 細胞処理と提示の必要性をバイパスして、固定化ＴＮＰ−タンパク質共役体に応 答した。キメラＴＣＲｓは抗体様特異性をもつＴ細胞を提供し、抗原に出会う際 に、ＭＢＣ非制限方法でＴ細胞の活性化、リンホカインの分泌および特異的標的 細胞溶菌に対して信号を有効に伝達することができた。さらに、ｃＴＣＲ挙動細 胞は固定化抗原によって刺激を受け、受容体仲介Ｔ細胞活性化が制限されず標的 細胞（８，９）のＭ）（Ｃ発現から独立することになる。新しい発現カセットは また再配列Ｖ。およびｖＬのｍＲＮＡとＰＣＲ増幅の逆転写に基づき開発され、 任意のｍＡｂ生成ハイブリドーマからｃＴＣＲ遺伝子を迅速に構築できるこれら の遺伝子の３゛および５゛共過配列（１２）に基づくプライマーを用いる。キメ ラＴＣＲアプローチの治療上の可能性を決めるため、我々は３ＢＣＩ３ネズミＢ リンパ腫細胞系の表面上ＴｇＭに特異的な抗イデイオタイプ抗体の結合部位から 成るｃＴｃＲ遺伝子を構築することに成功し機能的に発現させた。

ｃＴｃＲアプローチの広範囲の応用はプライマリ−Ｔ細胞中のｃＴＣＲ遺伝子の 十分な発現に依存する。それだけに、プロトプラスト融合法、リボフエクション または電気穿孔法を用いて、我々はＴ細胞ハイプリドーマ（８、・９）、または ヒ）Ｔ細胞腫瘍、例えばジャーカット中のｃＴＣＲを発現することに成功したが 、他と同様に、非形質転換ネズミＴ細胞系においては限られた一過性の発現のみ を達成した。レトロウルス性ベクターはヒトＴ細胞（１３，１４）においてトラ ンスジーン発現に有効であることが示され、これは２個の遺伝子が機能性ｃＴＣ Ｒ（Ｃαｖ、ｌ＋ＣβｖＬまたはＣαｖＬ＋Ｃβｖｏ）を発現するために導入さ れなければならないこと、２個の独立したレトロウィルス性ベクターを用いた単 一細胞の形質導入の有効性が非常に低いことが原因しているが、タンデム（１５ ）中の２個の遺伝子の形質導入を可能にする新しいベクターを試みなければなら なかった。

最近開発された別の戦略はＣＤ４、ＣＤ８、Ｉ　Ｌ−２受容体、またはＣＤ１６ のような受容体の細胞外リガンド結合ドメインをＴ／ζファミリイメンバー（２ ６−２８，３日）のいずれかひとつの細胞質テールに結合する方法を用いる。こ のような細胞外ドメインをリガンドまたは抗体によって架橋することはＴ細胞活 性化となることが示された。細胞障害性リンパ球に発現したキメラＣＤ４または ＣＤ１６−１７３分子は特異的細胞溶解を適当な標的細胞（２６，３８）に指示 することができる。　Ｐ　ＣＴ　Ｗ０９２／１５３２２では、適当に工作された 抗体分子の細胞外部位に結合したＴ細胞／　Ｆ　ｃ受容体ζ、εまたはＴ鎖の細 胞内部位からなるキメラの形成は免疫系細胞の標的！！識ポテンシャルが細胞外 抗体部位によって認識される抗原に特異的に再び指示するようにできるであろう ことを示唆している。しかし、特定例がこのよな活性化はＣＤ４受容体のような 受容体の細胞外部位がこのようなζ、εまたはＴ鎖に結合するとき可能であるこ とを示しているが、抗体の一部分がこのような鎖に結合するとき、リンパ球にお ける発現またはリンパ球における活性化を得ることができるという証拠を示して いない。

発朋■概！ 本発明によれば、可撓性リンカ−によってｖＩｌに結合したｖＬから成る特異的 抗体の一本ｔＪｊＦＶドメイン（ＳｃＦｖ）遺伝子を、短い細胞外およびリンパ 球活性化分子の全体のトランスメンプランおよび細胞質ドメインを符号化する遺 伝子断片を用いて、融合することによって、抗体認識部位およびリンパ球信号化 部位を１本の連続鎖に合わせるキメラ遺伝子が得られる。このようなキメラ５ｃ Ｆｖ−受容体（Ｃ−３ＣＦＶＲ）遺伝子をリンパ球にトランスフエフシランする 際に機能受容体として細胞に発現され、抗体型の特異性をもつ細胞を賦与する。

本発明は従って抗体型の特異性をもつリンパ球細胞を賦与するために適している キメラ遺伝子に関する０種々の型のリンパ球、例えばナチュラルキラー細胞、ヘ ルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、リンホカイン活性化細 胞、それらのサブタイプおよびキメラ受容体鎖を発現できるいずれかの他の細胞 型が適当である。

キメラ遺伝子は、特異的抗体の５ｃＦｖを符号化する第１の遺伝子断片、すなわ ち可撓性リンカ−によって結合した特異的抗体の重および軽１（それぞれｖＮお よびｖＬ）の可変領域を符号化するＤＮＡシークエンス、および部分的にまたは 全体的にトランスメンプランおよび細胞質を符号化するＤＮＡシークエンス、そ して任意に細胞外の、リンパ球受容体またはその１部に対応するリンパ球トリガ ー分子のドメインから成る第２の遺伝子断片からなる。

さらに本発明はキメラ遺伝子をもつ上記型のトランスフエフシラン細胞に適当な ベクターに間する。

さらに本発明は、このようなキメラ遺伝子がその発現を得るように導入された上 記型の細胞、およびまたこのような細胞を有効量含有する製薬予防および治療一 般的な用語では、本発明は本発明のキメラ遺伝子を含む発現ベクターを用いてト ランスフェクションしたリンパ球の発生方法に関する０次に示すように、細胞障 害性Ｔ細胞にトランスフェクションし、機能的に前記細胞内に発現させ、すなわ ち、ＭＭＣ非制限方法で予め定められた標的抗原に対してリンパ球の細胞性応答 を指示する発現ベクターから成るモデル系を構築した。

本発明の遺伝学的に巧みに処理されたリンパ球細胞は新しい治療掌上の処理方法 に使用することができる０例えば患者から単離したＴ細胞またはＮＫ細胞は特異 的抗原に向けられた抗体の可変領域を含むキメラ遺伝子を符号化するＤＮＡを用 いてトランスフェクションすることができ、次に患者に戻して、このような細胞 によって発生した細胞性応答が引金となってＭＭＣ非制限方法で特異的抗原に向 かうようにする。他の具体例では、患者の末梢血球を本発明に従って遺伝学的に 巧みに処理し、次に患者に投与する。

自己ＭＨＣプラス抗原の相互認識によって加えられた制限のため、ＴＣＲ遺伝子 の移植による新しい特異性の獲得は交配された組合せに制限される。このような 操作は実際には異系交配固体群では不可能である。しかしながら、本発明はＴＣ Ｐ成分だけでなく他のリンパ球信号鎖、例えばＣＤ３のゼータ／イータ鎖、ＦＣ γＲとＦｃａＲのＴ鎖、ＩＬ−２Ｒのα、βおよびＴＭｌまたは任意の他のリン ホカイン受容体、ＣＤ１６α−鎖、Ｄ２、ＣＤ２Ｂ、その他を用いる抗体特異性 を我々に与えることができる。従って、キメラ遺伝子を抗原特異的ではないＮＫ 細胞に移植することはそれらに抗体特異性を賦与するであろう。

図ｍΩ説貝 図１はキメラ５ｃＦＶＲ発現ベクターの略図である。Ｒは任意の受容体鎖、例え ばＣＤ３のゼータサフ゛ユニット、ＦＣγＲ１１１のガンマおよびＣＤ１６αサ フ゛ユニツト、ＴＣＲのＣαおよびＣβ、ＩＬ−２受容体のβ鎖または任意の他 の鎖または、ここに記載されたものの一部を表す、Ａは可撓性リンカ−（ハンチ ボックス）によって連結した特異的抗体のＶ、とＶｔ（ＤｓｃＦｖを７１号化す る遺伝子断片の調製を示す、Ｂはカッパ軽鎖リーダー（Ｌ、）を含むｐＲ５Ｖ発 現ベクターを示し、Ｃに記載されたリンパ球から調製された受容体遺伝子および Ａの遺伝子断片を導入する。キメラ遺伝子の発現はラウス肉腫ウィルスの反末端 リピート（ＬＴＲ）プロモーターによって駆動される。

これらのプライマーはｖ、ｌとＶ、の共通配列に合うように設計された。関連し ＦｖＲγトランスフェクタント細胞）およびそれらの親（ＭＤ４５．２７Ｊハイ プリドーマ細胞）から作成した。

図６は５ｃＦｖＲを発現するトランスフェクタントを刺激して、ＴＮ　Ｐ　−Ａ 。

２０（パネルＡ）を用いて、または異なる濃度の可溶性ＴＮＰ−ＦｒＧ　（パネ ルＢ）を用いずまたは用いてプラスチインク固定化ＴＮＰ−ＦγＧで刺激した後 、１−２を作成することを示している。ＧＴＡｃ、２０は先に述べたＳｐ６二本 ＭｃＴＣＲ）ランスフェクタント（９）である、５ｃＦｖＲゼ一タ発現ＳＴＺは ａＣｔの刺激剤対エフェクター（Ｓ／Ｅ）細胞比にてＴＮＰ−Ａ、２０を用いて 相互培養した後、１ｍｌにつき約２００ユニツト（Ｕ）の［、−２を作成した。

トランスフエクタント対非修飾Ａ、２０またはＦγＧコントロールの応答は図に は示していないが、完全にネガティブであり、まさにＭＤ、４５およびＭＤ４５ ．２７Ｊ対ＴＮＰ抗原のバンクグラウンド応答に伯ていた。

図７は５ｃＦｖＲを発現するトランスフェクタントを用いてインキュベーション した後のＴＮＰ−Ａ、２０細胞の特異的５ＩＣｒ脱離を示す、エフェクター細胞 は殺害アッセイの前に８時間プラスチインク固定化ＴＮＰ−ＦｒＧを用いてイン キュベーションした。運動アッセイは、１０：１のエフェクタ一対標的（Ｅ／Ｔ ）にて行い（パネルＡ）；投与量応答は９時間アッセイで決定した（パネルＢ） 。同一の条件で同しエフェクター細胞を用いてインキュベーションしたコントロ ール非修飾Ａ、２０標的細胞は自然脱離（図には示していない）よりい’Ｃｒを 多くは脱離しなかった。

図８はキメラ５ｃＦｖＲ７／この表面発現を示す、Ｎ２９抗ＨＥＲ２ｍＡｂの可 変領域から成るｓ　ｃＦｖＲｒ　（Ｎ２９ｒ　１、Ｎ２９　ｒ　１５）または５ ｃＦｖＲζ（Ｎ２９ζＭ、１）キメラ遺伝子を用いてトランスフェクションした Ｔ細胞ハイブリドーマは、抗Ｎ２９イディオタイプ抗体またはコントロール血清 （破線）を用いて染色しＦＡＣ３によって分析した。

図９は洗剤可溶性５ｃＦｖＮ２９Ｒｒおよび５ｃＦｖＮ２９ＲこのＮｅｕ／ＨＥ Ｒ２抗原への結合を示す、細胞溶解物中のキメラ受容体の存在は１（ＥＲ２Ｘ被 覆ウェルおよび抗γ　（Ａ）または抗ζ（Ｂ）抗体を用いるＥＬＩＳＡによって 評価した。キメラトランス遺伝子を発現するハイブリドーマから誘導した機能分 子は固定化抗原に結合し、Ｔまたはぐポリペプチドのいずれかに特異的な抗原決 定基を発現することができた。

図１０はＨＥＲ２挙動刺激剤細胞（Ａ）または固定化ＨＥＲ２Ｘタンパク’ｉｊ 　（Ｂ）によるキメラ受容体発現細胞の抗原特異的活性を示す、キメラ５ｃＦｖ Ｎ２９Ｒｒ／ζ遺伝子を発現するＴ細胞ハイブリドーマは、異なる領域のＨＥＲ ２発現細胞またはプラスティック結合精製ＨＥＲ２／Ｎｅｕ受容体を用いて相互 培養した後に、！Ｌ−２生成について抗原特異的であるがＭ）（Ｃ非制限刺激を 受けた。使用した刺激剤細胞はヒト胸癌細胞系５ＫＢＲ３およびＭＤＡ４６Ｂ、 ヒト卵巣癌細胞系５ＫＯＶ３またはＨＥＲ２、ｃ−ｅｒｂＢ−２）ランスフエツ ト３Ｔ３−ＮＩＨ繊維芽細胞（エイ・ウルリソチ博士が親切に用意してくれた） であった、Ｎｅｕ／ＨＥＲ２タンパク質は５ＫＢＲ３，５ＫＯＶ３およびＨＥＲ ２にオーバー発現するが、Ｍ　Ｄ　Ａ　４６Ｂ細胞は検出できない表面受容器を もつ０図に示したように、トランスフェクションしない親細胞ＭＤ４５．２７Ｊ はＮｅｕ／ＨＥＲ２発現細胞を用いてインキュベーションした後、ＩＬ−２を何 も生成しなかった。ＢにおいてＣ黒い四角］−ＭＤ４５．２７Ｊ、トランスフェ クションしない細胞；０−Ｎ２９ｒｌ、トランスフエクタント発現５ｃＦｖＮ２ ９Ｒ１図１１はキメラ受容体発現細胞がＮｅｕ／ＨＥＲ２標的細胞を溶解するこ とを示す、トランスフェクションしないＣＴＬハイプリドーマおよび５ｃＦｖＮ ２９Ｒｒ（Ｎ８７）または胸（ＳＫＢＲ３）癌細胞系のいずれかのために、それ らの細胞融解ポテンシャルについて研究した。同じＦＡＴで親細胞によって脱離 された５１Ｃｒのパーセントを引算した。

図１２はキメラ受容体発現細胞がＨＥＲ２標的細胞を特異的に融解することを示 す、トランスフェクションしないＣＴＬハイブリドーマおよびｓ　ｃ　Ｆ　ｖＮ ２９Ｒγ発現（Ｎ２９ｒｌ）またはｓ　ｃ　Ｆ　ｖＮ２９Ｒζ発現（Ｎ２９ζ１ ８）トランスフェクシントは、Ｎ　ｅ　ｕ　／　ＨＥ　Ｒ２発現ＮＩＨ−３７３ ネズミ繊維芽細胞（黒い印）または買上特異的な溶菌は全エフェクタ一対標的（ Ｅ　：　Ｔ）の比でＮ２９ｒｌによって示された。トランスフェクションしない 繊維芽細胞と比較するとＨＥ　Ｒ’２の融解が弱いことが、Ｎ２９ζ１８につい て観察されたが、ＭＤ４５およびＭＤ４５．２７Ｊ、）ランスフエフシロンしな いハイプリドーマは何ら顕著な５１Ｃｒ脱離を引き起こさなかった。［Ｒい三角 〕、【白い二角３　、−Ｎ２９ｒ　１　［黒い丸印コ、−Ｎ２９ζ１８：［黒い 四角］、［白い四角］　−ＭＤ４５．２７Ｊ。

この構築は好ましくは図１のＡで示した方法で行われ、抗体形成細胞からＤＮＡ またはＲＮＡを単離する。ＣＤＮＡはｍＲＮＡから調製され、ＰＣＨによる抗体 軽および重可変領域（ＶＷおよびＶｔ）の増幅はＶＬ　５°　０（ｂａ　Ｉ）　 、ＶＬ３　（Ｓａｌｒ）、ＶＮ　５’　（Ｓａｌｌ）およびＶ、、−３”　（Ｂ ｉ　ｔＥＴＩ）特対して３８　ｃ　、　１３カンパ鎖からのリーダーシーフェン スをＬＴＲプロモーターから下流に導入した。Ｃでは、Ｔリンパ球からのＲＮＡ を単離し、調製したＣ　ＤＮＡから、ＴＣＲのα、β鎖、ＣＤ３のＴ、ζサブユ ニット、ＦＣｙＲＩＩＩのＣＤ１６α、またはＩＬ−２受容体（ここでは普通に Ｒと示した）を、各鎖についてプライマーの特定の組を用いて増幅することがで きる。プライマー全体はそれらの５゜末端でＸｂａ　Ｌ　Ｘｂａ　ＩまたはＢｓ ｔＥ１１部位の下流で数個の塩基を含む、３゛末端で、全ての受容体鎖は５ｎａ ＢＩ部位を含む。リーダーシーフェンスのｐＲ３Ｖ２ｎｅｏプラスミドへの導入 に続いて、受容体をｐＲｓＶｎｅｏＬにベクター獲得ｐＲ３ＶｎｅｏＬに−Ｒの ）（ｂａ　１部位に導入する。増幅ＶＬ　（Ｘ　Ｂ　ａ　ｌ−３ａｉｌで消化し た）およびＶＮ　（ＳＡ　Ｉ　Ｉ　Ｂ　ｓ　ｔ　Ｅｌｌで消化した）＄１域は３ 片連結反応においてｐＲ５ＶｎｅｏＬに−Ｒプラスミドを消化した）（ｂａｒ− ＢｓｔＥＴＩに導入される。得られたプラスミドｐＲ３Ｖｓ　ｃＦｖＲは完全な キメラ−末鎖受容体を含む０図１２−１８に記載した受容体（Ｒ）遺伝子断片は ヒ）ＴＣＲＣβである。

図１３はｐＲ５Ｖｎｅｏ−ｓｃＦｖＲからｐＢＪｌ−ｎｅｏベクターまでの５ｃ ＦｖＲ遺伝子の移動を示す、５ｃＦｖＲは５ｎａＢＩを用いてｐｒｒｓＶベクタ ーから切り出し、ｐＢＪ　１プラスミドのポリリンカーのＥｃｏＲＶ部位に導入 し、ＳＲαプロモーターからキメラ遺伝子の発現を駆使する。

図１４は：Ａ）抗ＪｇＥ　５ｃＦｖＣβキメラ遺伝子を発現するＴ細胞によるロ ゼツト形成の図式表現を示す。ヒツジ赤血球（Ｓ　ＲＢ　Ｃ）はＴＮＰで被覆し 次にＩｇＥクラスノ抗ＴＮＰで被覆した。ＩｇＥ−ＴＮＰ−３ＲＢＣ−複合体は 抗ｉｇＥ８４−１ｃ　ｍＡｂの５ｃＦｖから成る５ｃＦｖＲを用いてトラフ　ス フ　ｘ、クシジンしたＴＩＩ胞でインキュベートして、ロゼツト形成について顕 微鏡下で観察した。

Ｂ）ｓｃＦｖＲ）ランスフエクトＪＲＴ、７３．５細胞のロゼツト形成の結果、 親ＪＲＴ、７３．５細胞はネガティブコントロールとして、８４．１ｃはポジテ ィブコントロールとして使用した。結果はロゼツトを形成する細胞のパーセント で示した。

Ｃ）ｓｃＦｖＲを発現するトランスフエクタントのロゼツト形成の阻害、トラン スフェクタントはＩｇＥ、抗Ｆｃおよび抗ＭＹＣＳ　ｒ　ｇＧ　（ネガティブコ ントロールとして）を用い、次に５ＲＢＣ共役体を用いてインキュベートして数 えた。

Ｄ）ＪＳＢ、１５）ランスフエクタントのロゼツト形成、Ｅ）ｓｃＦｖＲ，ＭＤ 。

４５を発現するＭＤ、４５誘導トランスフエクタントのロゼツト形成をネガティ ブコントロールとして使用した。

図１５はＡ）ｓｃＦｖＣβキメラ遺伝子を発現するトランスフエクタントを篩分 けするために使用したＥＬＩＳＡの図式表現を示す（ＲはＣβである）、プレー トをＩｇＥで被覆し、トランスフェクタントの溶解物を添加し、次に抗ヒトα／ βＴＣＲ抗体を添加し、ヒツジ抗マウスパーオキシターゼで展開させた。Ｂ）Ｅ ＬＩＳＡ抗ヒト抗βＴＣＲ抗体中の５ｃＦｖＲを発現する若干のトランスフエク タントの結果。

図１６はＩ　Ｌ−２生成について固定化１ｇＢまたは抗ＣＤ３を用いたトランス フェクタントの刺激を示す、プレートを２．５μｇ／■１のＩｇＥまたは抗ＣＤ ３精製抗体を用いて被覆し、トランスフェクタント細胞を、２０−２４時間、ホ ルボール１２−ミリスチー目３−アセテート（ＰＭＡ）　（Ｌｏｎｇ／ｍｌ）の 存在でインキュベートした。上澄み液を収集し、ｒＬ−２生成は【Ｌ−２依存細 胞系ＣＴＬＬを用いて決定した。トランスフェクションしないＪＲＴ、７３．５ 細胞はネガティブコントロールとして使用し、異なる媒体に対するコントロール もＣＴＬＬアッセイに含まれていた。

図１７はＩｇＥポジティブＢ細胞を用いるＩＬ−２生成のための刺激を示す、Ｓ ＰＳＰＥ−７ｌ分泌型ハイブリドーマを１０分間Ｏ℃で０．２５％グルタルアル デヒドを用いて固定し、異なるエフェクター／刺激剤（Ｅ／Ｓ）比でトランスフ ェクタントと混合した。細胞を２０−２４時間インキュベートして、上澄み液を 収集し■Ｌ−２生成についてアッセイした。

図１８は抗■ｇＥ　５ｃＦｖＲを発現する細胞障害性ハイプリドーマによるＩｇ Ｅ生成の特異的阻害を示す、肺臓細胞を４日間２０μｇ／ｍｌのＬＰＳと１００ Ｕ／ｍｌのＩＬ−４で刺激した。４日目に細胞を洗浄し、５ｃＦｖを発現するＭ Ｄ、４５細胞障害性ハイブリドーマを添加し、ＩｇＥとＩｇＧ濃度を２４．４８ および７２時間後に測定した。８４．１ｃハイブリドーマ細胞をコントロールと してＭＤ、４５と同様に含ませた。

図１９はキメラ５ｃＦｖ−ＣＤ１６遺伝子の図式表現である。

図２０は５ｃＦｖｃＤ１６遺伝子を用いてトランスフェクションしたネズミ好塩 基性白血病（ＲＢ　Ｌ）細胞の表面染色を示す。免疫蛍光染色は抗Ｓｐ６イデイ オタイプｍＡｂ２０．５およびネガティブコントロールとして無関係のマウス抗 体を用いて行った。ＦＡＣ３染色パターンにおける右側へのシフトはキメラ受容 体発現細胞に依る。

図２１は５ｃＦｖＲｒまたは５ｃＦｖＲζキメラ遺伝子でトランスフェクション したＲＢＬｔｔｉＢ胞の表面染色を示す、免疫蛍光染色は抗Ｓｐ６イデイオタイ プｍＡｂ２０．５およびネガティブコントロールとして無関係のマウス抗体を用 いて行った。

図２２は５ＣＦＶＣＤ１６遺伝子を用いてトランスフェクションしたネズミ胸腺 腫Ｂ　Ｗ５１４７細胞の表面染色を示す。免疫蛍光染色は抗Ｓｐ６イデイオタイ プｍＡｂ２０．５およびネガティブコントロールとして無関係のマウス抗体を用 いて行った。

図２３はＴＮＰ［ｌｌ八、２０標的細胞によって５ｃＦｖｃＤ１６および通常の γ鎖を用いてコトランスフエクションしたＢ　Ｗ５１４７細胞の刺激を示す。Ｂ Ｗ−３ＣＦＶＣＤ１６クローン５（Ａ）またはクローン５０（Ｂ）は異なる標的 ：刺激比でＴＮＰ修飾照射Ａ、２０細胞を用いて相互培養した。上澄み液に生成 した！Ｌ−２は次の２４時間ＭＴＴアッセイによって測定された。

図２４は固定化ＴＮＰ−１−リγ−グロブリン（ＴＮＰ−ＦｒＧ）によって５ｃ ＦｖｃＤ］６および通常のγ鎖を用いてコトランスフェクションしたＢ　ｗ５１ ４７細胞の刺激を示す、異なる濃度のＴＮＰ−ＦｒＧを異なるＴＮＰ：　ＦｒＧ 比で使用してミクロ培養プレートのウェルを被覆した。ＩＬ−２はＢＷ　−ｓ　 ｃ　Ｆ　ｖ　ＣＤ１６クローン５　（Ａ）またはクローン５０（Ｂ）の２４時間 培養の上澄み液で測定した。それ自身によって固定化したＦｒＧを用いる細胞の いずれが１個のインキュベーシヨン（黒い四角）は細胞を刺激しなかった。親Ｂ Ｗ細胞は同じ条件下でＴＮＰ−ＦｒＧに応答してＩＬ−２を何も作らなかった（ 図には示していない）。

図２５は５ｃＦｖＩＬ２Ｒ遺伝子でトランスフェクションしたＲＢＬ細胞の表面 染色を示す、免疫蛍光染色は抗Ｓｐ６イデイオタイプｍＡｂ２０．５およびネガ ティブコントロールとして無関係のマウス抗体を用いて行った。

図２６は５ｃＦｖＲを用いてトランスフェクションしたＢＷ５１４７細胞が表面 キメラ受容体を発現することを示す＊　５ｐ６−ｓｃＦｖＲを用いてトランスフ ェクションしたＢ　Ｗ５１４７細胞は２０．５抗Ｓｐ６イデイオタイプ抗体の腹 水１：２００の希釈物またはコントロールとして同じ希釈率の抗ＭＯｖ１８腹水 と反応させ、次にＦｒＴＣ標識抗マウスＩｇによって反応させた。免疫蛍光はＦ ＡＣ３によって検出した。ＢＷ、５ｐ６−ＣＤ１６は５ｃＦｖｃＤ１６およびγ 鎖でコトランスフエクシッンした細胞である。５ｃＦｖｃＤ１６のみでトランス フェクションした細胞はトランスフェクションしないＢＷ細胞よりは染色しなか った。

図２７はＴＮＰ−Ａ、２０＄ｌ［ｌ胞を用いたｓ　ｃＦｖＲ−ＢＷ５１４７）ラ ンス７　ｓ、クタントの刺激を示す、異なるＢＷ−ｓｃＦｖＲ）ランスフェクタ ントは種々の分量のＴＮＰ−Ａ、２０細胞を用いて２４時間インキュベートした 。ＴＬ−２はＭＴＴ比色定量アッセイによって測定した。ＢＷＧはｓ　ｃＦｖＲ ｙ　）ランスフェクタントであり、ＢＷＺは５ｃＦｖＲζトランスフエクタント である。

図２８はｓ　ｃＦｖＲトランスフエフ）　Ｂ　Ｗ５１４７細胞が固定化ＴＮＰに 応答することを示す、異なるＢＷ−ｓｃＦｖＲトランスフェクタントは’ｒＮＰ 、、−ＦｒＧ被覆ウェルを用いて２４時間インキュベートした。ＩＬ−２はＭＴ Ｔ比色定量アフセイによって測定した。横座標はミクロ滴定プレートのウェルを 被覆するために使用したＴＮＰ−ＦｒＧの濃度を示す、ＢＷＧは５ｃＦｖＲγト ランスフエクタントでありＢＷＺは５ｃＦｖＲζトランスフエクタントである。

発皿凶詳槻バ説所 遺伝子ベアアプローチ（“Ｔボディ″アプローチ）を含む従来法の問題点を解決 するため、そしてその応用性を他の細胞および受容体分子に広げるため、新しい 代替の設計を本発明に従って開発した。バクテリア中に抗体一本１ＮＦＶドメイ ン（ｓｃＦｖ）　（１６，１７）を発現することは、ｃＴＣＲへの一本鎖アプロ ーチおよび証明された能力に依存する。このような５ｃＦｖドメインは、抗体の 重および軽可変（Ｖ、およびＬＬ）遺伝子断片を可撓性リンカ−と結合し、天然 ｆＰａｂ゛断片と同じ特異性と親和性を示すことを証明した。従ってｓ　ｃＦｖ のひとつの直接的応用はＴＣＰ一定ドメインのひとつに連結した５ｃＦｖから成 るキメラ分子を構築することである。

本発明によれば、キメラ分子は受容体サブユニットに連結した５ＣＦＶから成る ように構築され、５ｃＦｖからの信号を形質導入し、Ｔ細胞ならびに他のリンパ 球に抗体特異性を与える。

従って、本発明による新しい戦略は５ＣＦＶからの信号を形質導入し、Ｔ細胞な らびに他の免疫細胞に抗体特異性を与える助けとなる他の受容体分子を使用する ことができる。事実、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような免疫 細胞の受容体分子の経膜的細胞質ドメインから成るキメラ分子の抗体認識ユニッ トとして５ｃＦｖを発現することができる。このような受容体は天然には単一ま たは複数の鎖であることができ、必ずしも１ｇ遺伝子スーパーファミリーには属 しない。

このアプローチのための候補分子は、Ｔ細胞およびＮＫ活性化および／または増 殖の引金となる受容体のような、受容体複合体の主成分として信号形質導入に貢 献する受容体分子である。Ｔ細胞のトリガーの例はＴＣＲのサブユニ７）、例え ばＴＣＲのα、β、γまたはδ鎖、または信号形質導入に含まれるＣＤ３複合体 を構成するポリペプチドのいずれか、例えばＴ、δおよびεＣＤ３鎖である。

ＴＣＲ／ＣＤ３のポリペプチドの中で（Ｔ細胞の主要トリガー受容体複合体）、 特に有望なものはゼータおよびそのイータイソフオーム鎖であり、ホモまたはへ テロ−Ｓ−８一連結二置体のいずれかとして現れ、リガンドのＴＣＲ認識によっ て引金となる細胞活性化プログラムの少なくとも小部分で介在するために応答す ることができる。これらのポリペプチドは５ｃＦｖの連結に役立つことができる 非常に短い細胞外ドメインをもつ。

免疫細胞トリガー分子の追加の例はＩＬ−２受容体（Ｔ　Ｌ−２Ｒ）　ｐ５５　 （α）またはｐ７５（β）鎖のいずれかひとつであり、特にｐ７５サブユニット はＴ細胞およびＮＫ増殖を表示するために応答することができる。

さらに本発明に従って５ｃＦｖキメラを生成するための候補となる受容体分子は Ｆｃ受容体のサブユニット鎖を含む。

ＮＫ刺激受容体のグループにおいて、最も魅力のある候補はＩｇＧに対し低い親 和性の受容体、ＦＣγＲＩＨのＴおよびＣＤ１６αサブユニツトである＊Ｆｃｒ Ｒ１１＋の占有または架橋は（抗ＣＤ１６によってまたは免疫複合体によって） サイトカイン生成、表面分子の発現および細胞溶解活性のためのＮＫ細胞を活性 化すル（２０，２１）。ＮＫ細胞、マクロファージ、およびＢおよびＴ細胞にお いて、ＦＣｒＲＴＩＩはジスルフィド連結Ｔまたはゼータ鎖と会合したりガント 結合α鎖から成るヘテロオリゴマー複合体として現れる。　Ｐ　ｃ　ｒ　ＲＩＩ ＩＡ信号ガンマｔｍ　（２２）はまたＦｃεＲ１複合体の一部として役に立ち、 ホモ二量体として現れ、ＣＤ３ゼータ鎖に非常に偵でおり、実際に若干の細胞溶 解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＮＫ細胞においてそれと共にヘテロニ量体を形 成することができる（２３−３５）。

これらポリペプチドとＣＤ４　（２５）　、ＣＤ８　（２６）　、Ｉ　Ｌ−２受 容体鎖（２７）またはＣＤ１６細胞外ドメインとの間に最も最近調製されたキメ ラは、他のＴＣＲ／ＣＤ３成分がなくてもＴ細胞刺激を信号で知らせる際に活性 化されることを証明した。

上記の受容体分子に加えて、リンパ球アクセサリイおよびＣＤ２およびＣＤ２Ｂ のような接着分子があり、Ｔ細胞活性化に対して相互刺激信号を形質導入する。

これらの相互刺激受容体はまた本発明に従って使用することができる。

ここで特定して述べた特異的受容体積の他に、信号鎖Ｆｖキメラを５ｃＦｖドメ インと、例えば顆粒球、Ｂリンパ球、マスト細胞、マクロファージ等の開示され た分子に伯でいる機能をもつ任意の受容体またはコリセブター鎖を結合すること によって作成することができる。望ましい免疫細胞トリガー分子の顕著な特徴は 自主的に発現する能力（すなわち、−重鎖として）、得られたキメラが対応する 遺伝子を遺伝学的に導入した免疫細胞の表面に発現するように細胞外ドメインに 溶融する能力、および信号形質導入プログラムにおいて標的リガンドと出会うよ うに二次的な役割を演じる能力を含む。

５ｃＦｖドメインは、５ＣＦＶ部位がキメラを発現するとき細胞外であるような 免疫細胞トリガー分子に結合されなければならない、これはトリガー分子の細胞 質ドメインに向かい合ったトランスメンプラン部位の端部に対して、５ｃＦｖを 結合して、またはトリガー分子の内生的細胞外部位または他の起源からの部分の いずれであるスペーサーを用いることによって、達成される。本発明のキメラ分 子はＮＨＣ非制限抗体型特異性を発現する免疫細胞上に与える能力をもつ、従っ て、抗原結合および信号形質導入の性質の連続ポリペプチドを、免疫細胞上の標 的受容体として生成して利用することができる。生体内では、これらの遺伝学的 に巧みに処理したキメラ受容体を発現する細胞はそれらの標的に向い、それによ って他のエフェクター細胞を引きつけるように刺激され、そこで、それ自身によ って、標的細胞の特異的散逸を取りつぐだろう、好適例では、標的細胞は腫瘍細 胞であり、５ｃＦｖドメインはｕｉ細胞上に発現したエピトープに特異的な抗体 から誘導される。このような抗腫瘍細胞溶解がＩＬ−２の外来性供給から独立す ることができ、従って養子免疫治療に対して特異的で安全な手段を与えることが 期待される。

好適例では、免疫細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である０本発明の抗体５ｃＦｖＲ 設計は従ってＭＨＣ非制限方法で生体内においてリンパ球を新しい標的に向ける ことを含む。このようにして、Ｔ細胞は生体内で腫瘍細胞、または抗体を高める ことができるように選択する任意の他の標的に向けることができる。この点では 、５ｃＦｖＲ設計はｃＴｃＲＴｃ上りもを利である。ｃＴｃＲに対し必要な遺伝 子ペアの代わりに１個の遺伝子のみを発現し、これによって一層簡単な構築とト ランスフェクションを提供する必要がある。

“−末鎖ＦＶドメイン”の用語は、その全体の内容がここに参考のために組み込 まれる参照文献１６と１７に記載されたような従来の一本鎖抗体だけでなく、− 開鎖形態の抗体の結合ドメインを与える任意の構成、例えば超可変領域としても 知られている抗体の１またはそれ以上の相補性決定部位（ＣＤＲｓ）を含むこと ができるような構成を含むことを意味する。

受容体分子のトランスメンプランおよび細胞質部分を符号化する遺伝子は天然遺 伝子またはその天然アミノ酸シークエンス中のタンパク質を符号化するいずれか の遺伝子に正確に対応することができる。さらに、本発明は、変異体タンパク質 分子が実質的にアミノ酸シークエンスおよび／または３Ｄ構造において憤でおり 、天然タンパク質にＩＩ（ＩＩした生物活性を有するように、分子のアミノ酸構 造に対し一定の小さい改変を特徴とする■ｕｔｅｉｎｓを含む。

本発明の形質転換細胞は多くの病気の治療に使用することができる。このような 形質転換細胞を投与する最新の方法は、養子免疫治療または細胞移入治療を含む 、これらの方法は血液流に形質転換免疫系細胞を戻すことができる。ローゼンベ ルグ・ニス・エイ、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａ＋ｎｅｒｉｃａｎ　６２　（１９ ９０年５月）；ローゼンベルグら、Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　ｌ！ｎ　１ａｎｄ　Ｊｏｕ ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３２３（９）：　５７０　（１９９０）＠ 本発明の形質転換細胞は適当な製薬学的に許容できる賦形側との製薬組成物の形 態で投与することができる。このような組成物は、ヒトを含めて、本発明の形質 転換細胞の有益な効果を経験できるいずれかの動物に投与することができる。

さらに当業者は本発明の５ｃＦｖ部分を作成するために使用される抗体は任意の 抗体であり、その特異性が免疫細胞に伝達されることが望ましいものであること を理解するだろう、このような抗体は、腫瘍細胞、ウィルス抗原を発現する細胞 、ある一定のＢ細胞およびＴ細胞を特異的に除去するための抗イデイオタイプま たは抗クロモタイプ抗体、または免疫グロブリン決定基の一定の到達に逆らう抗 体に対抗することができる。従って、例えば、抗体が一定部位のＩｇＥへの特性 に対して向かうならば、アレルギー等を緩和するためにＩｇＥ生成り細胞を除去 するために役立つことができる。可能な抗体のこのリストは限定するものではな く、当業者は本発明に従って受容体と組み合わせる際に重要な効用が存在する多 くの追加の抗体に気付くであろう。

本発明の遺伝子を当該分野で知られている任意の方法、例えば、リン酸カルシウ ムトランスフェクション、電気穿孔法、リボフエクション、レトロウィルスベク ターによる形質導入、レトロウィルスベクターまたはウィルスベクター等で免疫 細胞に導入することができる。

二番目には、５ｃＦｖＲ設計は唯一の鎖から成る信号分子の大きいスペクトルに 抗体特異性を与えるために使用することができる。三番目には５ｃＦｖは一本鎖 に■。とｖＬを共に維持し；従ってキメラと内因性鎖との混合ペアを作る際にも 、分子の抗原結合性が保持される。最後にガンマとゼータがＴＣＲ／ＣＤ３、Ｆ ｃγＲ１１１およびＦＣｉＲＩの信号鎖を構成するという事実は、他の造血細胞 、例えばＮＫ細胞、好塩基球、またはマスト細胞、Ｔ細胞を新しい目標に向ける ため、キメラ受容体を利用する可能性を広げる。

本発明のキメラ５ｃＦｖＲｒまたは以下に記載するその簡単な変更は、連続−末 鎖としての抗体の特異性、および細胞障害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞のエフェクタ ー機能またはヘルパーＴ細胞の調節機能の有効性を合わせて、標的免疫治療学に ついて重要な当然な発達を構成する。このアプローチは抗原認識ユニットとして ５ｃＦｖ、ＮＫ細胞およびＴ細胞の有力な細胞障害性応答、およびまたはＴ細胞 の能力を活用し、標的部位での活性化の際にリンホカインおよびサイトカイ、ン を分泌し、従って免疫系の他の武器を補充し、調節し、増幅することになる。

キメラ５ｃＦｖ受容体はリンパ球に次の機能を与える：任意の予め定められた抗 原に対する抗体型特異性；それらの標的への特異的“ホーミング；特異的認識： 活性化、および標的に出会う結果としてエフェクター機能の実行、および標的部 位での特異的な制御された増殖、抗原からのＦＶをリンパ球に賦与することは、 また可溶性ハブテンまたは抗イデイオタイプ抗体のＦａｂ’　を用いる前記機能 の制御された選択的ブロッキングのために役立つことができる。

このアプローチを用いる抗体特異性を賦与される候補の免疫細胞は、ＮＫ細胞、 リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）　、細胞障害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細 胞、および上記の種々のサブタイプである。これらの細胞はその真正な自然のま まの機能を実行することができ、さらに、遺伝子治療のために示された外来遺伝 子のキャリヤーとして役立つことができ、キメラ受容体はこの場合には細胞をそ の標的に向けるために役立つだろう、このアプローチはまた、抗イデイオタイプ 抗体のｌ”ｖから作られたキメラ受容体を発現するヘルパーＴ細胞を用いて、抗 イデイオタイプ予防接種に応用することができる。このような”デザイナ−リン パ球”はイディオタイプベアリングＢ細胞に影響し合い刺激して、抗原特異的抗 体を生成し、従って細胞障害性抗原を用いる能動免疫の必要性を回避する。

本発明をさらに次の限定されない実施例によって説明する。

実施例 実施例１：キメラ５ｃＦｖＲｒ／ζ　′　云　の１上発現この実施例では次の物 質と方法を用いた。

Ａ、縄脂糸友圭グ抗オ　ＭＤ、４５はＨ−２’にアロスペシフインクなりＡＬＢ ／Ｃマウスの細胞溶解Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）ハイブリドーマである（２９）　 、　ＭＤ４５．２７ＪはＭＤ、４５のＴＣＲα突然変異体である。Ａ、２０はＢ 　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ起源のＢリンパ腫である（ＡＴＣＣ＃ＴｌＢ２０Ｂ）、１ ０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を追加したダルベツコの修飾イーグル媒体（ＤＭＥ Ｍ）で細胞を項番した。Ｓｐ６、抗ＴＮＰｍＡｂ、および２０．５、抗Ｓｐ６イ デイオタイプｍＡｂは、シイ・ケーラーによって提供された（３０）　、抗ヒト ＦｃｔＲＴｒ鎖ポリクローナルおよびモノクローナル（４Ｄ８）　（３１）抗体 は、それぞれ、ジェイ・ビイ・キネトおよびジエイ・コーチャンによって提供さ れ、ネズミゼータ鎖へのウサギ抗体はエム・バニャシュによって提供された。

Ｂ、土Ａｉ遺伝子Ω構築　全部の＆１１換えＤＮＡ操作はサムブルーフら、（１ ９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌｓコールド・スプリング−ハーバ−、ニューヨーク・およびアウス ベルらｓ　（１９８７）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌｅｙ　＆　５ｏｎｓの最新 版に記載されているように行った。Ｓｐ５抗ＴＮＰ抗体の■、およびｖＬを符号 化する特異的遺伝子は、ｓ　ｃＦｖの末端でＸｂａ　ＩとＢｓｔＥＩＩ制御部位 を導入する免疫グロブリンｙ　ｊｄｌ域（３３）の５゛および３°共道アミノ酸 配列に従って設計されたオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ 増幅によってｃＴｃＲ（１２，３２）を調製するために記載されたゲノム構築物 から誘導した。５ｃＦＶを構築する際に、我々はコルチャーらによって記載され たリンカ−２１２に憤たリンカ−シーケンスを含むｖＬ−リンカー−ｖ、を使用 した（３４）　、従って、Ｖｔ−３°およびＶＴ＋　５’プライマーバリンカー の５゛および３゛部分から成るシーフェンスを含み、それぞれ、それらの３゛お よび５”末端で５ａｌｌを導入する。表１は異なる構築において使用されるオリ ゴヌクレオチドプライマーを記載する。実施例では、使用した特異的プライマー の数を参照させる。Ｘｂａｌおよび５ａｉｌ（Ｖｔ）および５ａｌｌおよびＢ　 ｓ　Ｌ　Ｅｌｌ　（ＶＭ）で精製ＰＣＲ生成物を消化した後、断片を、抗３１３ 　Ｃ、１３ｃＤＮＡ　ｃＴＣＲ遺伝子（１２）の発現のために用意された、５Ｃ １５カツパ軽鎖（ニス・レビイによって提供された）およびＴＣＲ−尾領域β鎖 （Ｃβ）のリーダーを含むｐＲ８ｖ２ｎｅＯヘース発現ベクターのＸｂａ　Ｉお よびＢｓｔＥ１１部位に連結した。このプラスミドのＣβを次に、ヒトｃＤＮＡ クローン（３５）から増幅したガンマ鎖またはジャーカットｃＤＮＡから増幅し たゼータ鎖のいずれかと、５′および３゛末端にＢｓｔＥＩＩおよびＸｈｏ　Ｉ を導入するプライマーを用いることによって置換した。最終の５ｃＦｖＲｒ発現 ベクターの概略図は図２に示される。キメラ５ｃＦｖＲγおよび５ｃＦｖＲこの 構築に使用するオリゴデオキシヌクレオチドのシーフェンスは図２に記号で表し ている。

Ｃ０±１ラノ」」認３１ノＡ」伝予辺発現２０μｓのｐＲ３ＶｓｃＦｖＲｙ／（ ＤＮＡの２０Ｘ１０’ＭＤ、４５またはＭＤ、２７Ｊハイブリドーマ細胞のトラ ンスフェクションは１．９ｋＶでｌ５ＣＯｉｉｔカ供給を用いる電気穿孔法によ って行った。トランスフエクタントを２ＩＩｇ／■１にてＧ４１８で選択した。

トランスフェクションした細胞の表面の５ｃＦｖＲｒ／この発現を、２０．５抗 Ｓｐ６イデイオタイプおよび蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウス Ｆａｂ’抗体を用いる免疫蛍光染色によって評価した。機能アンセイは！Ｌ−１ 生成アンセイおよび細胞毒性アッセイを含み、ＴＮＰ修飾Ａ、２０標的細胞に特 異的に反応するトランスフェクタントの能力は参考文献９に詳述されているよう に評価した。ＩＬ−２の分量はＩＬ−２−依存ＣＴＬ系およびメチルテトラゾリ ウム酸（ＭＴＴ）染色（３６）を用いて決定した。細胞毒性アンセイは５ＩＣｒ 脱Ｍ　（２９）によってモニターした。全部の決定は３回繰り返して行った。

Ｄ、′　欠および　プロット法　１０”個の細胞を含む洗浄ベレットを１％ジギ トニン、０．１２％トリトンｘ−ｔｏｏを１０１１ＭトリスＨＣｌ−食塩水緩衝 液ｐ　Ｈ７，４、この食塩水緩衝液は１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ＩｍＭフェニルメチ ルスルホニルフルオダイド（シグマ）、１０Ｊｇ　／ｗｓ　Ｉアプロチニンおよ びＩＯμｇ／−１０イペブチン（ベーリンガー・マンハイム、Ｇｍ　ｂ　Ｈ）を 含む、の１１に溶解させた。０℃で２０分、１２０００Ｘｇで１５分間遠心分Ｍ 後、上澄み液の等分した部分を抗体と共にインキュベーションし、次に第２の抗 体およびタンパク質Ｇ−セファローズ（ファーマンア）を用いて記載されている ように（３２）沈澱させた。あるいは、細胞溶解物を、１％ＮａＤｏｄＳＯａお よび１０ｎ＋Ｍヨードアセトアミド（非還元ゲルについて）または１５ｍＭジチ オトレイトール（還元ゲルについて）のいずれかの最終濃度まで試料緩衝液と混 合させた。洗浄した免疫性′ｔｉ物を同し条件下に試料緩衝液中に解離させた。

Ｓｐ６イデイオトープの分解を避けるため、試料を５−２０％ゲルグラジェント によるＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥの前に３０分間２０℃でインキュベーション した９分離したタンパク質をニトロセルロース紙にプロットして、抗Ｓｐ６、抗 ガンマまたは抗ゼータ抗体と、次にパーオキシターゼ標識抗イムノグロブリン抗 体によって反応させた。洗浄したプロットを製造業者の忠告に従って化学発光キ ット（ＥＣＬ、アムステルダム）を用いて現像し、フィルムに感光させた（コダ ７り、Ｘ−ＯＭＡＴ　ＡＲ）。

Ｅ、關　所定の抗体と信号ガンマまたはゼータ鎖の抗原結合部位を用いてキメラ 受容体を生成するため、両方の因子をひとつの連続分子に結合できる５ｃＦｖ設 計（１６，１７）を採用した。Ｓｐ６抗ＴＮＰｍＡｂ　（３７）のＶＬおよび■ 、を収容しているｐＲ３Ｖｓ　ＣＦＶＲＴ／ζ発現ベクター（図１．２）を巧み に処理する際に、我々はガンマ、ゼータまたは他の鎖と組み合わせて異なる抗体 からの５ｃＦｖｓを適応させるためのモジュール方式の発現カセットとして使用 できるエレメントを導入した。これは、異なるユニットのインフレーム連結反応 および他のベクターへの除去を可能にし、比較的ユニークな制限部位によって側 面を接するＶＬまたはｖＷｐｆｆ域のいずれかの５゛および３゛　シーフェンス の大部分に共通のシーフェンスから成るオリゴヌクレオチドプライマーを用いて 達成される（表Ｉ参照）、我々は、いろいろの−末鎖抗体およびそれらの断片の バクテリア中の　−発現に適していることが見出されている５“−ｖＬ−リンカ −〜ＶＭ−３°設計を用いることを選択したが（１７）　、逆の５”　−Ｖ、− リンカ−ＶＬ−３゛配列を同様に使用することができる（１６）　。

キメラ５ｃＦｖＲ７遺伝子を、ＭＤ、４５ネズミＣＴＬハイブリドーマ（トラン スフェクタントのＳＴＡシリーズ）または、表面ＴＣＲ／ＣＤ３複合体（ＳＴＢ シリーズ）を発現しないＭＤ４５．２７Ｊ　ＴＣＲα−突然変異体に導入すると 、抗Ｓされた。５ｃＦｖＲＴまたは５ｃＦｖＲζ分子の表面発現はＴＣＰ／ＣＤ ３複合体から独立していた；それはＭＤ４５．２７Ｊ　）ランスフェクションＳ ＴＢまたはＳＴＺ細胞におけるＣＤ３の表面発現を復活せず、そして、それらの 表面に５ｃＦＶＲγおよびＴＣＲ／ＣＤ３の両方を最初に発現したＳＴＡの若干 のサブクローンは、長くした培養期間に、５ｃＦｖＲＴ発現と機能のいずれも明 らかな効果がなくＴＣＰ／ＣＤ３発現を失った（図には示していない）。

胞溶解物のイムノプロット法分析は親細胞には現れなかった３６．５４−６２． ７４−８０および８５９０ｋＤａの見かけの分子量の４本のはっきりしたバンド を示した（図４）、還元条件下に、５ｃＦｖＲγの予期された３６ｋＤａＪｌＩ Ｎ体型に相当する１の種は明らかに分子の多量体の性質を示した。見かけの７５ ｋＤａ分子量をもつバンドはホモ二量体分子に相当し、９０ｋＤａ種の性質は知 られていない。最近報告された（３１）ものに類似する新しいガンマ会合ポリペ プチドを示しているかも知れない。この種は細胞溶解物のイムノプロットにのみ 検出され、表面ヨウ素化および免疫沈降後には現れず（図５Ｂ）、分子の細胞内 由来を示唆する。５４−６２ｋＤａの範囲でのバンドの出現はＳＴＢ　）ランス フェクタントにおいては一層明白だった。キメラ５ｃＦｖＲγ鎖および内生的ゼ ータおよび恐らくはＣＤ３複合体のイータ鎖との間にヘテロニ量体を示す。従っ て我々はＳＴＢ溶解物から作成した抗Ｓｐ６免疫沈降物を電気穿孔し、ゲルをブ ロア）し、それを抗Ｓｐ６、抗ガンマまたは抗マウスゼータ／イータ抗体（図５ Ａ＞で出現させた。抗イデイオタイプおよび抗ガンマ抗体は共にトランスフェク ション細胞からの４個のバンドを示した。しかし、抗ゼータ（これはマウスイー タ鎖と交差反応する）は６０ｋＤａ種のみを特異的に出現させた。抗Ｓｐ６また は抗ガンマ抗体（図５Ｂ）のいずれかを用いる表面ヨウ素化タンパク質の免疫沈 降は７５ｋＤａの主要種を非還元条件下に示す。これはキメラ鎖のホモ二量体で ある。

実施例２　：　！ＩｉＦ六　として５ｃＦｖＲｒ／このキメラ５ＣＦＶＲＴまた は５ｃＦｖＲζが活性受容体分子として機能することができるかどうか試験する ため、我々は抗原特異的刺激を受けるようにトランスフエクンヨンハイブリドー マの能力を研究した。ＭＤ、４５Ｔ細胞ハイプリドーマはそのＴＣＲによって引 金となりＴＬ−２、ＴＬ−３またはＧＭ−Ｃ３Ｆを生成することができる。特に Ｈ−２１標的細胞（２９）を認識し応答するが、そのＭＤ４５．２７Ｊ突然変異 体はα鎖がないため、そのＴＣＰによって刺激されない。キメラ５ｐ６−ｓｃＦ ｖＲｒを導入する際に、これらの細胞の両方は特異的に引金となり、ＴＮＰ修飾 刺激細胞（図６Ａ＞またはプラスチック固定化ＴＮＰ−）リガンマグロブリン（ ＴＮＰ−ＦＩＧ）　（図６Ｂ）でインキュベーション後にＩＬ−２を生成する。

非修飾Ａ、２０細胞またはＦＩＧは、ＴＮＰに対する応答の特異性を示すトラン スフエクタントを活性化しなかった。固定化抗原を用いた種々のトランスフェク タントの刺激は異なる度合の反応性となる。ＳＴＡは首尾一貫した方法でプラス チック結合ＴＮＰ−ＦｒＧに対応したが、ＳＴＢおよびＳＴＺ　（それぞれ、５ ｃＦｖＲｒおよび５ｃＦｖＲζでトランスフェクションした）はそれらの能力を 失い固定化抗原で刺激を受けたがヘプテン修飾細胞では受けなかった。

このような挙動はこれらの細胞について追加の相互依存的な信号が必要なことを 示唆している。さらにＴＮＰ−ＦｒＧプラスホルボール１２−ミリステート１３ アセテート（ＰＭＡ）またはＣａ”イオノホアのいずれかとの相互刺激はＩＬ− ２生ンスフエクタントの活性化もまた可溶性ＴＮＦ−ＦγＧによって抑えられた 。抗原の同一濃度は、−木鎖と二本鎖ＦｖがＴＮＰに対し同じ相対親和力を示す ＳＴＡおよびＧＴＡｅ、２０（図６Ｂ）の５０％抑制（ＩＣｓ。）を引き起こす ために必要だった。

最後に、我々はキメラ受容体を５ＩＣｒ標識細胞でインキュベーションして、特 異的標的細胞溶解を介在する能力を試験した０図７に示されるように、５９６− ｓｃＦｖＲｒまたは一５ｃＦｖＲζでトランスフェクションした細胞のみが縁壁 関連型でＴＮＰ修飾標的細胞を溶解できた。この細胞溶解活性は可溶性ＴＮＰ− ＦγＧがブロックしたのでＴＮＰに特異的であり（図には示していない）、非修 飾して発現できることを示す。キメラ５ｃＦｖＲｒ／ζは抗体型特異性をＴ細胞 に（図５および６））、ガンマおよびゼータ鎖がＴ細胞の自律活性化ができるこ とを強く示唆している。まだ、５ｃＦｖＲｒと内因性ゼータおよびイータ鎖との 間のへテロニ量体が低い水準にあるので（図３および４）、信号プロセスにおけ る残りのゼータ鎖（またはイータ鎖）による若干の貢献の可能性は除外すること ができない。それにもかかわらず、現在は明らかに、ＴＣＰ鎖がこのプロセスに 加わっていないことを示しており、従ってＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−２受容体、ま たはガンマ／ゼータファミリイメンバーのいずれかひとつの細胞質テイルに結合 したＣＤ１６の細胞外ドメインによる抗体架橋はＴ細胞活性化に由来する最近の 観察を立証し補っている（２６−２８）　、　ｓ　ｃＦｖＲｒ／こと同様に、細 胞障害性リンパ球に発現させるキメラＣＤ４またはＣＤ１６−ガンマ／ゼータ分 子は特異的細胞溶解を適当な標的細胞に向けることができた（２６．３８）、最 近ガンマ／ゼータ鎖の活性の原因になることが挙げられた細胞内１８残基モチー フ内の突然変異の分析は、カルシウム反応性を媒介する能力は細胞溶解を支持す る能力から分けられることができることを示した（３Ｂ）　、これは、５ｃＦｖ および遺伝学的に修飾されたゼータまたはガンマ鎖から成るキメラ鎖を使用して 特異性を支配するだけでなくリンパ球の選択された反応性を指図することができ る新しい可能性を広げた。　、抗原の固定化は５ｃＦｖＲｒ／ζによる十分な刺 激のために必要であり、可溶性多重結合リガンド（例えばＴＮＰ−タンパク質） は引き金とはならないが、むしろ細胞またはプラスチック結合ＴＮＰにより受容 体媒介活性化を抑える（図５Ｂ）という発見は、隣接するガンマまたはゼータ鎖 の単なる保合または一様な架橋が（ＩＬ−２脱離によって証明されるように）Ｔ 細胞活性化に終わらないことを示している。十分にＴ細胞が引き金となるための りガント固定化の依存はまたｃＴｃＲ媒介信号についても報告されており（８， ９）、これの基礎となる機構はまだ不明である。ハイプリドーマトランスフェク ション細胞を用いると、固定化抗原に対するまたは種々の起源のＴＮＰ修飾刺激 細胞に対する応答能力が異なる種々の変異体が得られた。これらの変異体は表面 受容体を発現しＴＣＰをバイパスする刺激に応答するので（例えばＰＭＡ＋Ｃａ パイオノホアを用いて）、最適のサイトカイン脱離に必要な相互刺激信号に導く 経路に沿った成分のひとつに、それらが不足していることが推論された（３９） 　、むしろ、ＰＭＡまたはイオノマイシンのいずれかを固定化抗原に添加すると これらのクローンの大部分の応答性が増加したという事実は、この仮定を強く支 持する。

実施例３；　キメラ−１１Ｆｖ　会　を　いるＮｅｕ／ＨＥＲ２へのｒ　リンパ 　の　・ 悪性細胞の形質転換表現型または生長に必須の細胞表面分子は抗癌免疫治療に対 して魅力のある標的である。Ｎｅｕ／ＨＥＲ２、ヒト腺癌結合生長因子受容体に 特異的な抗体は腫瘍抑制能をもつことが示された。まだ、充実腫瘍への抗体の不 充分な接近能力がそれらの臨床用途を限定している。腺癌にエフェクターリンパ 球を向けるため、我々は抗Ｎｅｕ／ＨＥＲ２抗体の抗原結合ドメイン、およびＴ 細胞受容体／ＣＤ３およびイムノグロブリンＦｃ受容体複合体のＴまたはζ信号 形質導入サブユニットを組み込む一本鎖受容体遺伝子をＴ細胞中に構築し機能的 に発現させた。細胞障害性Ｔ細胞ハイプリドーマ中の抗Ｎｅｕ／ＨＥＲ２キメラ 遺伝子の表面発現はそれらに、Ｎｅｕ／ＨＥＲ２をオーバー発現する細胞のイン ターロイキン−２生成および溶解のためのそれらの活性化を可能にする特異的Ｎ ｅｕ／ＨＥＲ２認識を賦与した。これらのキメラ遺伝子は癌の免疫治療のために 使用することができる。

細胞溶解リンパ球が腫瘍細胞を再目標にするためのキメラ受容体アプローチの可 能性を確立するため、我々は抗Ｎｅｕ／ＨＥＲ２抗体を用いた。Ｎｅｕ／ＨＥＲ ２（またｃ−ｅｒｂＢ−２とも呼ばれる）は、オーバー発現するいくつかのヒト 腺癌の悪性腫瘍に影響を与える成長因子受容体を符号化する癌原遺伝子生成物で ある。Ｎｅｕ／ＨＥＲ２タンパク質の細胞外部位に特異的なモノクローナル抗体 （ｍＡｂｓ）のパネルから（４１）　、我々は、ヌードマウスのＨＥＲ２／Ｎｅ ｕトランスフェクション繊維芽細胞の腫瘍形成成長を有意に抑え、種々の培養胸 細胞系の表現型分化を誘導するｍＡｂＮ２９を選択した（４２）　、この実施例 では、我々は、キメラ受容体のりガント結合ドメインとして抗Ｎ　ｅ　ｕ　／　 ＨＥ　Ｒ２特異性を備えるＴ細胞が、標的細胞を運ぶＮｅｕ／ＨＥＲ２に特異的 に応答することを示す。

この実施例では、次の物質と方法を使用した。

Ａ、縦置ζｉｄ　ＭＤ４５、ネズミアロスペシフィソクＣＴＬハイブリドーマ（ ２９）およびＭＤ４５．２７Ｊ、ＴＣＲα鎖を欠くその突然変異体は、キメラ遺 伝子のための受容体として役立った。使用した刺激体と標的細胞はヒト胸癌細胞 系５ＫＢＲ３およびＭ　Ｄ　Ａ４６Ｂ、ヒト卵巣癌細胞系５ＫＯＶ３、またはＨ ＥＲ２、ｃ−ｅｒｂＢ−２トランスフェクション３Ｔ３−ＮＩＨ繊維芽細胞（エ イ・ウルリノチ博士によって快く提供された）であった。細胞を１０％ＦＣ３を 含有するＤＭＥＭで培養した。Ｎ２９はモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体（４１） であり、登録番号ＣＮＣＭｌ−１２６２で１９９２年８　月１９日に、フランス 国パリ、インスチチュート・パスツールのザコレクシオン・ナシオール・ド・タ ルチュール・ド・ミクロオーガニズムに寄託されている。抗Ｎ２９イディオタイ プ抗血清はウサギを精製したＮ２９タンパク質で免疫にして免疫血清を正常マウ スＩｇ−アガロースカラムに吸着させて調製した。ウサギ抗ＣＤ３ζおよび抗Ｆ ＣｔＲＩｒ抗体はジェイ・ビイ・キネソｉ・博士が快く提供してくれた。

Ｂ、キメ−゛　二　の　とトランスフェクションキメラ５ｃＦｖＮ２９Ｒｒまた はｓ　ｃ　Ｆ　ｖ　Ｎ２９Ｒζ遺伝子は、Ｎ２９抗ＨＥＲ２ｍＡｂを生成するハ イブリドーマから調製されたｃＤＮＡ、および抗ＴＮＰ　ｒｃＦｖＲについて実 施例１で記載したようなγまたはζ遺伝子のいずれかからＰＣＲによって増幅し た、−木鎖ＦＶＤＮＡから（■、−リンカーー■□配列で）構築した０ＭＤ４５ またはＭ　Ｄ４５．２７　Ｊハイブリドーマは、キメラ遺伝子を収容しているｐ Ｒ３Ｖ２ｎｅｏ発現ベクターのＤＮＡ２０μｇを用いて電気穿孔法でトランスフ ェクションして、（９）に詳述されているように２ｍｇ／ｍｌの０４１８　（Ｇ 　ｒ　ＢＣＯ）の存在で２−３週間成長させて選択した。トランスフェクション 細胞は、コントロール血清または抗Ｎ２９イディオタイプ抗崩清（ウサギを精製 Ｎ２９タンパク質で免疫にして免疫血清を正常マウスＩｇ−アガロースカラムに 吸着して調製した）のいずれかを用いて染色した。血清のｌ：２００希釈物を用 いて４℃でインキュベーションした後、細胞を洗浄し、追加の１時間４℃で、蛍 光イソチオシアネート標識ヒツジ抗ウサギ抗体（ジャクソン・ラボラトリーズ、 ウェスト・グローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて処理した。各細胞の免疫蛍光をＦ ＡＣ３ＣＡＮを用いて測定した（ベクトン・ジ、キソン）。

Ｃ１可澄性受容体■挟聞　細胞溶解物は、５Ｘ１０’個の細胞のベレットに、１ ００μｌの溶菌緩衝液を添加してトランスフェクシントから調製した。緩衝液は 、ｌＯＩＩＩＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（シ グマ）、ｌＯμｇ／１ｌＩｌのアプロチニンおよび１０Ｍｇ　／　ｍ　ｌのロイ ペプチン（ベーリンガー・マンハイム、ＧｍｂＨ）を含有する１％トリトンＸ１ ００の０．１５Ｍ　ＮａＣ＋−１０ｍＭトリスＨＣＩ　ｐ　Ｈ７，４緩衝液から 成る。０℃で３０分、そして遠心分離後、細胞核を含まない上澄み液を精製ＨＥ Ｒ２Ｘタンパク質５μｇ／ウェルを用いて予め被覆したマイクロタイタープレー トのウェルに添加した。ＨＥＲ２Ｘはエイ・ウルリツチ博士によって快く提供さ れたＣＨＯ細胞によって生成したＮｅｕ／ＨＥＲ２の組換え細胞外ドメインであ る。４℃で２−４時間インキュベーション後、プレートを洗浄し１μｇ／ｍｌの 抗ヒトζまたはγ抗体を用いてインキュベーションした。

洗浄し、セイヨウワサビパーオキシターゼ標識抗Ｔｇ抗体（ジャクソン・ラボラ トリーズ）を添加後、パーオキシターゼ基質を添加し結合度をＣＤ４．。を読み 取刺激体細胞（３Ｘ１０’／ウエル）を９６ウエルのマイクロ培養プレートで少 なくとも６時間付着する迄培養した。精製ＨＥＲ２Ｘを用いてトランスフエクタ ントを刺激するため、マイクロ培養プレートのウェルをＨＥＲ２Ｘタンパク質を 用いて指示濃度で少なくとも３時間２２℃で被覆し、次に２回媒体を用いて洗浄 した。

次にトランスフェクションクローンとそれらの親ハイブリドーマを、１０％ウシ 胎児血清と１０−’Ｍの２−β−メルカプトエタノールを用いて補足したＤＭＥ Ｍに添加（１０’／２００＃　ｌ／　ウｘ、ル）　シタ。培養２０−２４時間後 、生成したＩＬ−２（７１分量を、上述のように（９）ＭＴＴ比色分析によって ＩＬ−２従１ｃＴＬ−Ｌ細胞系の増殖により評価した。細胞毒性活性を測定する ため、トランスフエクタントとそれらの親ハイブリドーマを、５ＩＣｒ標識・標 的細胞を用いて種々のエフェクタ一対標的比で１６時間インキュベーションした 。Ｓ′Ｃｒ脱離アッセイは上述のように行った（１６）。

Ｅ、猜果　ヒトＴまたはζ鎖のいずれかに融合したＮ２９の一本鎖Ｆｖについて コないそのＴＣＲα突然変異体ＭＤ４５．２７Ｊをトランスフェクションするた めに使用した。ハイブリドーマ細胞のキメラ鎖の表面発現はＮ２９抗Ｎ　ｅ　ｕ 　／　ＨＥ　Ｒ２ｍＡｂに特異的な抗イデイオタイプ抗体を用いて検出した（図 ８）。抗原結合および信号形質導入部分から成る融合タンパク質の結合性は、Ｎ ｅｕ／ＨＥＲ２の組換え細胞外ドメイン（ＨＥＲ２Ｘを示す）および抗Ｔおよび ζ抗体を使用する、受容体特異的酵素連結イムノソルベントアッセ（ＥＬｒＳＡ ）によって確かめた。

図９に示すように、ＨＥＲ２Ｘへの特異的結合は、トランスフェクションしたが 非トランスフェクシヲン親細胞ではない全体の細胞溶解物に認められた。３個の トランスフェクタント、５ｃＦｖＲγキメラ遺伝子を用いてトランスフェクショ ンしたＭＤ４５．２７Ｊから共に誘導された、Ｎ２９ｙｌおよびＮ２９ｒ１５、 そして５ｃＦｖＲζキメラ遺伝子を用いてトランスフェクションしたＭＤ４５細 胞の誘導体、Ｎ２９ζＭ、Ｉを、！Ｒ能研究のために選択した。

−末鎖キメラ受容体はＴ細胞活性のための特異的信号を形質転換することが見出 された。５ｃＦｖＲ発現細胞とヒト癌細胞のインキュベーションは、それらの表 面でＮｅｕ／ＨＥＲ２を発現し、ＩＬ−２の生成によって測定されるように顕著 な活性化をもたらした（図１０ａ）、この活性化は、５ＣＦＶＲによって媒介さ れ、Ｎｅｕ／ＨＥＲ２−特異的であった、その理由は、ＭＤＡ−ＭＢ４６８ヒト 胸癌細胞のように、Ｎ　ｅ　ｕ　／　ＨＥ　Ｒ２をオーバー発現しない細胞は、 高レベルの■Ｌ−２の生成を刺激しないが、胸痛５ＫＢＲ−３細胞、卵巣癌５Ｋ ＯＶ−３細胞およびｅ　ｒ　ｂＢ−２）ランスフェクションネズミ繊維芽細胞系 のように、大量のＮｅｕ／ＨＥＲ２を示す細胞は、ハイブリドーマを刺激して高 レベルのＩＬ−２を生成するからである。可溶性の精製ＨＥＲ２Ｘは胸痛細胞に よって部分的に活性化を妨げた。しかし、固定化の際に、強いＴ細胞活性化物質 として役立つが、トランスフェクション細胞に対してのみである（図１０Ｂ）、 固定化抗原へのＴ細胞応答は一般に細胞標的へのものよりも弱い。多分、Ｔ細胞 相互作用中にアクセサリイおよび接着分子によって与えられる相互刺激信号は細 胞内相互作用を増幅することができるのだろう。

最後に、特異的標的細胞殺害を媒介するトランスフェクション細胞の能力は、” Ｃｒ脱離アッセイによって決定した。種々のＮｅｕ／ＨＥＲ２発現細胞を標的と して試験するときＣ図１１）、我々はＨＥＲ２細胞系、Ｎｅｕ／ＨＥＲ２をオー バー発現するＮＩＨ−３７３繊維芽細胞は、十分な標的として役立つことができ ることを見出した。５ｃＦｖＲ７発現Ｔ細胞ハイブリドーマ（Ｎ２９ｒｌ）を用 いてインキュベーション後（図１２）、特異的溶菌の実質的なレベルが得られた 。５ＣＦＶＲζ発現ハイブリドーマ（Ｎ２９ζ１８）は、トランスフェクション していないハイブリドーマと比較するとき、限界の特異的Ｓ＋　Ｃｒ脱離信号の みを与えた。

細胞溶解効果は、トランスフェクションしていないＮ［Ｈ−３Ｔ３繊維芽細胞が 殺害を受けないので、Ｎｅｕ／ＨＥＲ２−特異的であった。同様に、親ＭＤ４５ ．２７Ｊ細胞は有意の％’Ｃｒ脱離を何も引き起こさなかった。我々が試験した 幾つかの候補ヒト腫瘍系からの高水準の自発的５１Ｃｒ脱離は、再生できる方法 で殺害効力を測定することを我々に許さなかった。にもかかわらず、全実験にお いて、トランスフェクション細胞は、親ハイブリドーマよりも、ヒト原藻（例え ば５ＫＢＲ−３胸およびＮ８７胃癌細胞系、図１１）からのかなり高い特異的５ ＩＣｒ脱離を誘導した。

この研究は、抗腫瘍抗体の一本鎖１”ｖを用いるキメラ受容体を発現するＴ細胞 が腫瘍細胞に再び向けられることを示している。単離し固定した形態または細胞 状態のいずれかで腫瘍抗原に５ｃＦｖＲを結合することは、十分にＴ細胞活性化 の引き金となり、標的細胞溶菌を媒介した。これらの結果は抗ＴＮＰ　５ｃＦｖ Ｒｒ／ζを用いる前の実施例を広げた。これらの場合すべてにおいて、活性化Ｔ 細胞またはＴ細胞系を使用した。

実施例４：　Ｉ　Ｅ　をもつ５ｃＦｖＲの　２アレルギー疾患は周囲のアレルゲ ンによる刺激でＩｇＢの合成が高まることを特徴とする。ＩｇＥの生成は抗原特 異的ヘルパーおよびサプレッサーＴ細胞によって調節される。活性化のあとのＴ リンパ球は、Ｂ細胞を誘導しＩｇＢを生成する。分泌したＩｇＥは優位にマスト 細胞および好塩基球の高親和性Ｆｃε受容体（ＦｃｔＲＩ）に結合する。アレル ゲンに出会うと、ｐｃｇＲＩ結合ＩｇＥは架橋し、ヒスタミンのような顆粒会合 予備形成薬理学的媒介物のエキソサイト−シスを刺激する。従ってＩｇＢ生成細 胞の除去はＩｇＢ生成を終わらせるのでアレルギー反応の開始を妨げる。この実 施例では、我々は、ＩｇＢ生成細胞およびそれらのＢ細胞前駆物質が表面ＴｇＥ を発現し、抗１ｇＢ抗体のＦｖから作られたキメラ−末鎖子細胞受容体（ｓｃＦ ｖＲ）遺伝子を用いる“Ｔ体”戦略を用いることによって、我々は特異的にＩｇ Ｂ生成をブロックできるという事実を利用する０本実施例は、抗マウスＩｇＥ抗 体を用いるインヴイトロ系におけるこのアプローチの可能性を示す。

この実施例では次の物質と方法を用いた。

Ａ、■　Ｅ　ν５ＣＦｖＲ′　−の　とトーンスフエフシラン選択された抗体は ８４゜ＩＣ、ネズミＣε３のエピトープに特異的なラットｍＡ　ｂである（４３ ）　、　８４．Ｉｃ　ｍＡ　ｂを使用する利点は、それがｉ！ＴｇＢと反応し、 マスト細胞結合ＴｇＥとは反応しないことであり、従ってＩｇＥのＦｃεＲ１結 合部位に密接に関連したエピトープを認識することが論証された。ＴＣＲαまた はβ鎖（ＣαまたはＣｒ）の一定領域に連結した連続一本ＭＦｖにおける８４． １ｃｍＡｂＶＬおよび■。を符号化するキメラ遺伝子の構築のための基本的戦略 は、抗ＴＮＰｓｃＦｖＲγ／ζキメラ遺伝子の調製について記載したものに偵て おり、図１および２に概略図で示される。ｍＲＮＡは、８４．１ｃハイプリドー マからオリゴ（ｄＴ）　セルｔ）−ス上で選択した。一本ｔｉｃＤＮＡはＭ−Ｍ ＬＶ−逆転写酵素（Ｂ　ＲＬ）を用いる３’Ｃｗおよび３゛Ｃ，重プライマーを 用いて合成した。我々はＳｐ６抗ＴＮＰｓ　ｃＦｖ　（４４）について上記した ものに似たマウス共通オリゴヌクレオチドブライマーを用いるＰＣＲによってｖ ８とｖｌを増幅した。、ｖｗ−３゛　プライマーとＶＨ５°プライマー（表１の ５および６）は、それぞれ、３°および５°末端に５ａ１１部位を導入するリン カ−の５゛　と３゛部位からなるシーフェンスを含んでいた。精製ＰＣＲ生成物 を）（ｂａ　ｌおよびＳａ　Ｉ　Ｉ　（Ｖｘ）およびＸｂａ　ｌおよびＢ　ｓ　 ｔ　Ｒ４１（ＶＨ）を用いて消化した後、断片を連結し、ｐＲ３ＶＬｇｃαまた はＣβ発現カセットのＸｂａ　ＩおよびＢｓｔＥ１１部位に導入した。これらの 発現力セントを、二本鎖キメラＴＣＲ（ｃＴｃＲ）遺伝子（４５，９，３２）を 発現するように初めから設計し、Ｒ３Ｖ　ＬＴＲに対しおよびヒトＴＣＲのＣα またはＣｒの下流に、３８ｃ、１３に軽鎖３゛のリーダーを、ｐ　ＲＳ　Ｖｇｎ ｅＯにクローン化して構築した。ＣαとＣｒは、Ｃαについて表Ｉからプライマ ー９および１２、ＣｒについてＩＩおよびＩ３を用いて、ヒ）ＴＣＰクローンか らＰＣＲ増幅した。我々は先ニ（４６）　、ＳＲαプロモーター　（４７）はＲ ３Ｖ　ＬＴＲよりも良くＴ細胞中の転写を駆動することを見出したので、ここで は抗１ｇＥｓｃＦｖＲ発現のためにそれを採用した。このために、我々はｐＢＪ ｌｎｅｏプラスミド（４７）を使用した。我々は完全５ｃＦｖをｐＲ３ＶｓｃＦ ｖｃβ／ｃαベクターから５ｎａＢ１部位で切り出し、それをｐＢＪ１ｎｅｏベ クターのＥＣＯＲ■に導入した。図１３はＳＲαの基礎ベクターの構築を示す（ ｐＢＪ−ｓｃ８４．β）。

８４．１ｃ基礎５ＣＦｖ・Ｃβキメラ遺伝子を、ネズミＭＤ４５ハイブリドーマ （２９）またはヒトジャーカントＴ細胞白血病βＴＣＲネガティブＪＲＴ３．５ 突然変異体（４８）のいずれかに、それぞれ導入した。を気泳動によりトランス フェクションを行い、トランスフェクタントを２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在で （９）に記載されているように選択した。５ｃＦＶＲでＪＲＴ、Ｔ３．５誘導し たトランスフエクタントをＪＳＢで表し、ＭＤ、４ｓトランスフエクタントはＪ ＳＭＢで表す。

Ｂ、　Ｔ　の’＝Ｉ　Ｅ　５ｃＦｖＲのキメラ遺伝子の結合性、表面受容体に対 して符号化する能力を決定するため、そして受容体の分子的性質を研究するため 、我々はまず、Ｃβ基礎キメラ遺伝子を、ＴＣＲβ鎮を欠いているヒト白血病ジ ャーカット細胞突然変異体ＪＲ７３，５にトランスフェクションした。抗８４． １ｃイディオタイプ抗体の不在で、我々は、抗ＣＤ３抗体を用いて、免疫蛍光に よって表面ＣＤ３の再現のために得られたトランスフエクタントをスクリーニン グして、キメラ５ｃＦｖＣβ鎖が内因性ＴＣＲα鎖と会合しＴＣＲ／ＣＤ３複合 体をもたらすであろうことを期待した。平行実験において、我々は■９Ｃαまた はＶＬＣｃｘｃＴＣＲ鎖とのトランスフェクションに次いでＣＤ３をＪＲＴ３． ５細胞の表面に持ち出すことができたが、我々は５ｃＦｖＣβ遺伝子を受け取る トランスフェクタントのｃＤ３特異的染色を何も示すことができなかった（デー ターは示されていない）、従って我々はトランスフェクシント中のキメラ５ｃＦ ｖ遺伝子の表面発現を、抗ＴＮＰ　ＩｇＥ　５ＰＥ−７で被覆したトリニトロフ ェニル化ヒツジ赤血球（ＴＮＰ−５ＲＢＣ）を用いるロゼント形成によってモニ ターした（４９）　、図１４はロゼフトを描写するこのような実験を示しており 、それらがＩｇＢに特異的であり、ＩｇＢを添加することによって抑えられる（ そしてコントロールＩｇＧ抗体では抑えられない、図１４ｃ）ことを示している 。キメラ受容体が同し複合体中に抗原結合部分とＴＣＰ決定基の両方を含むこと は、トランスフェクタントから作成した溶解物を分析することによって示された 。ＩｇＥ被覆被覆ウェル−のような細胞を含まない溶解物のインキュベーション は、抗ＴＣＲ−β特異的ｍＡｂｓおよびパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体 を添加することにより、特異的結合を与えた（図１５）。

Ｃ１機能光発現　キメラ表面受容体を発現するトランスフエクタントは、培養ウ ェルのプラスチックに被覆して固定化するか、またはＩｇＢ生成ハイブリドーマ の表面タンパク質として、ＩｇＥを用いて刺激した後に、ＩＬ−２生成のための 特異的活性化を受ける能力について試験した０図１６はトランスフェクション細 胞をプラスチック結合１ｇＢ（または抗ＣＤ３）によって刺激した実験を示す。

５ｃＦｖＣβの導入によって生成したジャーカット誘導トランスフェクシントは 特異的にＩＬ−２を生成したことが明かである。我々がトランスフエクタントを ＳＰＥハイブリドーマ細胞で刺激することを試みたとき、我々はこれらのハイブ リドーマによって分泌した可溶性ＴｇＥが刺激をブロックする（正確には３８Ｃ ，１３系のように）ことを見出した。従って我々はＴｇＥ生成ハイブリドーマ細 胞を固定したが、事実、図１７に明らかなように、このような細胞は強い刺激物 質として働いた。

次に我々は細胞障害性ＭＤ４５Ｔ細胞ハイプリドーマを用いて、５ｃＦｖＣβが 準備を整えてＩｇＥ生成細胞を除去するため（それらの表面にＩｇＢを発現する ことが知られている）細胞障害性細胞に引き金を引くことができるかどうかチェ ックした。生体内の状態に偵せるため、標的細胞として我々はネズミ肺臓リンパ 球を用い、リボ多Ｗ（Ｌｐｓ）およびＩＬ−４の存在でそれらを培養することに よりＩｇＥを生成させた。ＬＰＳ＋ＩＬ−４はＢ細胞中で１ｇクラススイッチお よび特にトリガー１ｇＥおよびＩｇＧ、形成（５０）を誘発することが知られて いる０図１８に記載されている実験において、我々は抗１ｇＥｓｃｐｖＣβを発 現するＭＤ４５）ランスフェクタントをネズミリンパ球とコインキュベーション して、ＬＰＳ＋ＩＬ−４を添加し、ＩｇＥとＩｇＧ蓄積の両方を、これらの培養 物の上澄み液にモニターした。図に示すように、ＩｇＢ分泌はｓ　ｃＦｖｃβＴ 細胞を含む培養物中に完全に破棄された（ａｂｒｏｇａ　ｔｅｄ）。ＩｇＧ生成 の効果を認めることができないので、効果は非常に特異的であった。ＩｇＥ生成 の抑制は、再指示の５ｃＦｖｃβ挙動ＣＴＬハイプリドーマによってＩｇＥ生成 細胞を除去するためであるようだ、このような効果の原因となるコントロール８ ４．１ｃＢ細胞ハイブリドーマの無能力は、培養媒体中のＩｇＢ蓄積の不足が８ ４．１ｃ抗１ｇＢ抗体によるＩｇＢの受動的な吸収のためでないことを示してい る。このセントの実験は明らかに、キメラ５ｃＦｖ−ＴＣＲを備えた細胞障害性 Ｔ細胞が特異的にそれらの標的細胞を除去することができることを示している。

正常キラー（ＮＫ）細胞におけるキメラ受容体アプローチのための最も魅力的候 補のひとつは、ｒＭと会合したリガンド結合ＣＤ１６αポリペプチドから成るＩ ｇＧ　（ＦｃｙＲＨＩＡ）のための低親和力受容体である（５１．５２）　、　 Ｆ　ｃ　ｒ　Ｒ１１１による（抗ＣＤ１６または免疫複合体のいずれかによる） ＮＫ細胞の連鎖反応のきっかけは、サイトカイン生成、表面分子の発現および細 胞溶解活性を含む（５３，２１）　、　ＣＤ１６ポリペプチドは多形核細胞にお ける膜アンカー形態としておよびＮＫにおけるトランスメンプラン形態（ＣＤ１ ６□）として現れる。ＦｃγＲ１１ｌ会合Ｔ鎖はまたホモ二量体として現れるＲ ｃａＲＩ複合体の一部として働き、ＣＤ３ζ鎖に非常に偵でおり、若干のＣＴＬ およびＮＫ細胞においてそれと共にヘテロニ量体を形成することができる（５２ ．２１．２８．２３−２５）　、ζおよびηのようにＴおよびＣＤ４の間のキメ ラはＣＴＬに向けてＨＩ　Ｖ　ｇ　ｐ１２０　（２６）を発現する細胞を認識し 殺害する。Ｔ２Ｃまたはηと共にＣＤ８（２７）またはＴａｃ（２Ｂ）の細胞外 ドメインのいずれかの間の同様のキメラ受容体が最近、信号プロセスに貢献する これらの分子の領域をマツプする研究において報告された。

５ｃＦｖの形態で特異的抗体の結合ドメインがＣＤ３ζ（また４４を参照）、Ｔ ＣＲＣβおよびＦＣεＲ１／Ｆ・ＣγＲＩＩＴγ　（４４）の認識ユニットとし て働くことができることを、先の実施例に示した０本実施例では、我々は５ｃＦ ｖおよび抗ＴＮＰから成るキメラ受容体およびＦｃｒＲＩＩＩのＣＤ１６αポリ ペプチドを、構築し機能的に発現させた。

この例では、次の物質と方法を使用した。

Ａ、キメラ５ｃＦｖ−ＣＤ１６αのｉｉｄと　層５ｃＦｖ−ＣＤ１６α設計のた めに、我々は前に作成したＳｐ６抗ＴＮＰの５ｃＦＶを使用した。全体の細胞質 およびトランスメンプラン、およびＣＤ１６α（図１９参照）の中間の細胞外領 域（ＧＩｙ２０６まで）を、表■のプライマー１８および１９を用いて、ヒトＣ Ｄ１６αＤＮＡクローン（５４）からＰＣＲ増幅した。切り詰めたＣＤ１６　Ｄ ＮＡをｒＤＮＡの代わりに前記ｐＲ５ＶｎｅｏｓｃＦｖＲｙヘクターに挿入した 。

Ｂ　キメラ５ｃＦｖ−ＣＤ１６αの Ａ、ヱヌ］長ミ銀失を発現　ＦｃｒＲＩＩＩはＣＤ１６およびＴ鎖から成るヘテ ロニ量体複合体として出現するので、キメラ５ｃＦｖｃＤ１６遺伝子の発現をチ ェックするため、我々はそれを、機能ＦｃｇＲＩ（５６）を発現するマスト細胞 であるラット好塩基性白血病（ＲＢＬ）細胞にトランスフェクションした。これ らの細胞はＦＣεＲ１の一部として過剰のＴ鎖を生成し、我々に受容体トリガー 脱顆粒反応アッセイとして便利な機能を提供する。キメラｓ　ｃ　Ｆ　ｖ−ＣＤ １６α並びに５ＣＦＶＲＴおよび５ｃＦｖＲζ遺伝子の電気穿孔およびＧ４１Ｂ における選択に次いで、抗Ｓｐ６イデイオタイプ抗体によって表面染色すること ができるＲＢｌ−クローンが得られた。図２０はＲＢＬをトランスフェクション した５ｃＦｖｃＤ１６のＦＡＣ３分析のパターンを示し、図２１は５ｃＦｖＲ７ および５ｃＦｖＲζトランスフエクタントの染色を示す。ＴＮＰ−タンパク質共 役体を５ｃＦｖＲγおよび５ｃＦｖＲζ発現ＲＢＬ）ランスフエクタントに添加 する際に、多価抗原による隣接受容体の架橋は上澄み液へのβヘキソースアミニ ダーゼの特異的脱離によって測定されるように脱顆粒反応の引金となった（表Ｉ ＋）。

表旦 キメ−５ｃＦｖＲｒおよび５ｃＦｖＲζ゛　−でトランスフェクションしたＲＢ Ｌ　の　・　亡　・ −−１ｇＥ＋ＤＮＰ−ＢＳＡ　２２ ｓｃＦｖＲｒ　ＩｇＥ　３ ｓ　ｃＦｖＲ７Ｔ　ｇＥ＋ＤＮＰ＝ＢｓＡ　３１ｓｃＦｖＲｒ　ＴＮＰ−ＢＳＡ 　５０ ｓｃＦｖＲζ　ＩｇＥ　３ ＳｃＦｖＲζ　Ｉ　ｇＥ＋ＤＮＰ−ＢＳＡ　３８ＳＣＦｖＲζ　ＴＮＰ−ＢＳＡ 　３２ ＲＢＬ親細胞および抗ＴＮＰキメラ５ｃＦｖＲｒまたは５ｃＦｖＲζ鎖を発現す るトランスフエクタントは、細胞のＩｇＥ賦与脱顆粒反応を評価するために、そ の抗原ＤＮＰ−ＢＳＡを用いてまたは用いずにＳＰＥ抗ＤＮＰＩｇＥで刺激され た。他方、ＴＮＰ−ＢＳＡはキメラ受容体により特異的刺激を誘発するために働 いた。脱顆粒反応は、前述のように脱顆粒反応に次いで細胞上澄み液に放出され たβ−ヘキソースアミニダーゼの酵素活性を測定して研究した（４３）　。

Ｂ、　ＢＷ５１４７　の　Ｂ　Ｗ５１４７はネズミ胸腺腫であり、γまたはζ鎖 のいずれかを転写しないので表面ＴＣＲ／ＣＤ３を発現しない０期待されるよう に、キメラｓ　ｃＦｖＣＤ１６ＤＮＡを用いてＢ　Ｗ５１４７細胞をトランスフ ェクションすると、検出できる表面受容体は何も生成せず、さらに細胞外受容体 を溶解物のイムノブロッティングによって検出することができた（図には示して いない）。

キメラ５ｃＦｖｃＤ１６および正常γＤＮＡをＢ　Ｗ５１４７細胞に一緒に電気 穿孔すると、免疫蛍光染色およびＦＡＣ３分析（図２２）によって現れたように 、有意に高レベルのＳｐ６イデイオタイプをトランスフェクタントの表面に検出 できた。トランスフェクタントは特異的刺激に反応し、ＴＮＰ修ｆｉＡ、２０細 胞または固定化ＴＮＰトリＴ−グロブリン（ＴＮＰ−ＦｒＧ）　（図２３．２４ ）を用いて刺激した後ＩＬ−２を生成した。

最後に、我々はキメラ５ｃＦｖＹＬ２Ｒ遺伝子（Ｓｐ６の５ｃＦＶおよびＩＬ− ２受容体のβ鎖から作られた）を、ＲＢＬ細胞の表面にトランスフェクションに 次いで発現させることができるかどうかチェックした。　５ｐ６−ＩＬ−２−Ｒ キメラ遺伝子はＳｐ６のｓ　ｃＦｖを含むＤＮＡを、ヒ１−ＴＬ−２受容体のβ 鎖の細胞質およびトランスメンプラン領域（カルボキシ３１２アミノ酸）を含む ＰＣＲ増幅ＤＮＡから（表■のプライマー２０および２３を用いる）クローニン グした９３６ｂｐＤＮＡ断片に結合して調製した０図２５は１個のこのようなＲ ＢＬ）ランスフエクタントを抗Ｓｐ６イデイオタイプ抗体で染色する免疫蛍光の 結果を示す。これらの結果は明らかにキメラ５ｃＦｖｌＬ２Ｒを表面タンバグ質 として発現させることができることを示している。

実施例６　：　ＢＷ５１４７　にお番るキメーー１′°Ｌ立受蔓生Ｑ発現Ｂ　Ｗ ５１４７　における　２ ＢＷ５１４７　（ＢＷ）はネズミ胸腺腫細胞系であり、ＴＣＲまたはＦｃγＲ１ 合体を発現させず（ζ鎖転写（５７）における欠陥のため）、従って異なるキメ ラ５ｃＦｖ受容体の発現を研究するため便利な細胞系として役立つ、ＢＷ細胞は 内生的ζまたはγ鎖を生成しないので、トランスフェクションに次いで、キメラ 受容体が外因性トランスジーンのホモ二量体からのみ成るであろう（ｓｃＦｖＲ ｒまたはｓ　ｃＦｖＲこの場合において）ことが期待される。また、それはキメ ラ５ｃＦｖｃＤ１６をＴまたはζ鎖から独立して発現させることができるかどう か研究するシステムを提供する。

ζ、γまたはＣＤ１６鎖のいずれかひとつに結合したＳｐ６抗ＴＮＰ　ｍＡｂの ５ｃＦｖから成るキメラ遺伝子は電気穿孔によってＢＷ細胞に導入され、Ｇ−４ １８の存在で生長した選択されたトランスフェクシントを、２０．５抗Ｓｐ６イ デイオタイプｍＡｂを用いてＳｐ６イデイオトーブの表面発現について分析した 。平行して、ＢＷ細胞のグループを５ｃＦｖｃＤ１６＋ｒ鎖ＤＮＡの混合物とコ トランスフェクションした。ＦＡＣ３によって分析した染色の免疫蛍光パターン は図２６に描かれている０図に示されるように、ＢＷ、５ｐ６−γとＢＷ、５ｐ ６−ζトランスフェクシント（それぞれ、５ｃＦｖＲｒまたは５ｃＦｖＲこのい ずれかを受け取った）は、抗Ｓｐ６イデイオタイプ抗体で特異的に染色すること ができ、従ってそれらの表面にキメラ受容体鎖の中位のレベルを発現する。ＣＤ ３発現について研究するとき、特異的抗ＣＤ３　ｍＡｂを用いると、我々は、そ れらのキメラ遺伝子がＣＤ３複合体から独立して細胞表面に発現されることを示 す、ｓｃｌ”ｖＲｒまたは５ｃＦｖＲζトランスフエクタント（図には示してい ない）のいずれかの表面染色を認めることができない、５ｃＦｖｃＤ１６単独で 電気穿孔したトランスフェクタントは表面受容体を発現しなかった（図には示し ていない）、シかし、５ｃＦｖｃＤ１６およびγ鎖ＤＮＡのコトランスフェクシ ョンは図２６に示したＢＷ、５ｐ６−ＣＤ１６のような、キメラ受容体を発現さ せるトランスフェクタントを生成した。これらの結果は明らかに、ＣＤｌ６キメ ラ鎖がそれ自身については充分でなく、表面発現のためにγ鎖を必要とすること を証明している。

ＢＷ細胞においてキメラ受容体が作用するかどうか研究するために、我々はＴＮ Ｐ修飾Ａ、２０細胞（図２７）または固定化ＴＮＰ−ＦγＧ（図２８）で刺激し た後ＩＬ−２生成のための刺激を受けるように、トランスフェクタントの能力を 試験した。ＢＷ細胞はＴＮＰ標識抗原でインキュベーションした後に何もＩＬ− ２を生成しないが、−末鎖受容体発現トランスフェクシントは細胞または固相抗 原のいずれかで刺激した後、ＩＬ−２を生成した。

これらの研究は共に機能受容体としてキメラ鎖の適当な発現を示すと解釈すると 、それらは一端で抗体タイプの特異性をもつリカンドと、他端でＴ細胞刺激のた めの信号と結合する。ここでは我々は非ＴＣＲ発現Ｔ細胞におけるキメラ−末鎖 受容体の発現を示したが、それらの信号Ｆｃｒ受容体においてＴおよびＣＤ１６ を使用する正常キラー細胞が同様に挙動することを期待することは妥当である。

ここに引用した参考文献はすべて、刊行された雑誌論説またはアブストラクトを 含めて、米国または外国特許出願に対応し、発行された米国または外国特許、ま たはいずれかの他の参考文献は、全てのデータ、表、図、および引用例に示され た本文を含めて、完全にここに参照符によって組み込まれる。さらに、ここに引 用した参考文献中に引用された参考文献の全体の内容もまた完全に参照符によっ て組み込まれる。

既知の方法の工程、従来法の工程、既知の方法または従来法についての参照は、 本発明の見方、記載または具体化を関連技術において開示、教示または示唆する ことを何ら容認するものではない。

特定の具体例の前記記述は、当業者の範囲の知識を適用して（ここに引用した参 考文献の内容を含めて）、他の者が、過度の実験なしで、本発明の一般概念から 離れることなく、このような特定の具体例を種々の応用のために容易に変更しお よび／または採用することができるように、本発明の一般的本質を完全に明らか にするだろう。従って、このような採用および変更は、ここに示された教示およ びガイダンスに基づき、開示した具体例の同価値の意義と範囲内にある。ここに ある語法または術語が記述のためのものであり、制限のためのものではなく、本 明細書の術語と語法はここに示された教示およびガイダンスに照らして熟練者に よって、当業者の１人の知識と組み合わせて、解釈されるべきであると理解され るべきである。

参照文部 １）　Ｌｏｗｄｅｒ、　Ｊ、Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　５ｕｒｖ、 ４　：　３５９−３７５　（１９８５）２）　Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｔ、Ａ、、５ ｃｉｅｎｃｅ　２５２：　１６５７−１６６２　（１９９１）３）　Ｊａｉｎ、 Ｒ，に、、Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、旦１：　６４−６６　（１ ９８９）４）　Ｍｕｌｅ、　Ｊ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２ ５：　１４８７−１４８９　（１９８４）Ｓ）　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、Ａ 、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３鉦１３１８４３２１　（１９８６） ６）　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、Ａ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　０ｎｃｏ１．　 １０：　１８０−１９９　（１９９２）？）　Ｋｕｗａｎａ＋　Ｙ、ｅｔ　ａｌ 、＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ５ｔ　１４９：　９６０ −９６８　（１９ＢH） ８）　Ｇｒｏｓｓ、　Ｇ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｐｒｏ ｃ、　２１：　１２７−１３０　（１９８９）９）　Ｇｒｏｓｓ、　Ｇ、　ｅｔ 　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃｉｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：　 １００２４１００２Ｂ　（P９８９） １０）　Ｂｅｃｋｅｒ、　Ｍル、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１５８：　９１ １−９２１　（１９８９）１１）　Ｇｏｖｅｒｍａｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｃｅｌ＋　６０：　９２９−９３９　（１９９０）１２）　Ｇｒｏｓｓ＋　Ｇ 、、　Ｐｈ、Ｄ、　ｔｈｅｓｉｓ　（Ｗｅｉｚｍａｎｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　 ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｒｅｈ純■盾煤B ｌ５ｒａｅｌ） １３）　Ｃｕ１ｖｅｒ、に、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ　８８：　３１５５３１５９　（P９８Ｂ） １４）にａｓｉｄ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ｕｓＡ　８７：　４７３−４７７　（１９９O） １５）　Ａｄａｍ、Ｍ、Ａ、ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６５：　４９８ ５−４９９０　（１９９１）１６）　Ｈｕｓｔｏｎ、　Ｊ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：　５Ｂ７ ９５８８S　（１９８８） １７）　Ｂｉｒｄ、　Ｒ，Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４訂４２ ３−４２６　（１９８Ｂ）１８）　Ｗｅｉｓｓｍａｎ、＾、　ｅｔ　ａｌ、、　 ＥＭＢＯＪ、８　：　３６５１−３６５６　（１９８９）１９）　Ｂａｕｅｒ、 　Ａ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌ ＩＳＡ　８８：　３８４２−３８４．U　（１９９１） ２０）　Ｕｎｋｅｌｅｓｓ、Ｊ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｔｍｍ ｕｎｏｌ、　６：　２５１−２８１　（１９８Ｂ）２１）　Ｒａｖｅｔｃｈ、　 Ｊ、Ｖ、　ａｎｄ　Ｋｉｎｅｔ、　Ｊ、−Ｐ、、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、９　：　４５７−S９２　（１９９１） ２２）　ＷｉｒＬｈｍｕｌｌｅｒ、　Ｕ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ｌ！ｘｐ、 　Ｍｅｄ、１７屓１３８１−１３９０　（１９９２）２３）　０ｒｌｏｆｆ、　 Ｄ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）３４７：　１８９ −１９１　（１９９０）　。

２４）　Ｌａｎ１ｅｒ、Ｌ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉ−ｗｕｎｏｌ、皿　１５ ７１−１５７６　（１９９１）２５）　Ｖｉｖｉｅｒ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７：　４２６３−４２７０　（１９９１）２６） 　Ｒｏｍｅｏ、　Ｃ，ａｎｄ　５ｅｅｄ、　Ｂ、、　Ｃｅｌ＋　６４：　１０３ ７−１０４６　（１９９１）２７）　ｒｒｖｉｎｇ、　Ｂ、Ａ、　ａｎｄ　Ｗｅ ｉｓｓ、　Ａ、、　Ｃｅ１ｌ　６４：　８９１−９０１　（１９９１）２８）　 Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｋｌａｕｓｎｅｒ、　Ｒ，Ｄ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬhＳＡ　８８： ２９）　Ｋａｕｆｍａｎｎ＋　Ｙ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　７８：　２５０２−２５０６３０）　Ｒｕ５ｃｏｎｉ 、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｇ、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３ １虹３３０−３３４　（１９８５）３１）　５ｃｈｏｎｅｉｃｈ、Ｊ、ｅｔ　ａ ｌ、、Ｊ、Ｉ＋１Ｉｌｕｎｏ１．　臘　２１８１−２１８５　（１９９２）３２ ）　Ｅｓｈｈａｒ、　Ｚ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐ ｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　Ｔｕｍｏｒ　Ｉｍａ＋ｕｎｏｌｏ■凵A　ｅｄ。

Ｇ、　Ｇａｌｌａｇｈｅｒ　（ＩＲＬ、　０ｘｆｏｒｄ）　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ　 （１９９２）３３）　Ｋａｂａｔ、　Ｅ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｅｑｕｅｎ ｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ＴｓｗｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｍｐｏ ｒｔａｎｃｅ　（Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｉｌｔ＋ｓ＋ａｎ 　５ｅｒｖｉｃｅｓ、　Ｗａｓｈｒｎｇｔｏｎ、　c、Ｃ，） ４ｔｈ　ｅｄ、（１９８７） ３４）　Ｃｏ１ｃｈｅｒ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎａｔ、　Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｉｎ５ｔ、８２：　１１９１−１１９７　（１９９０j ３５）　Ｋｕｓｔｅｒ、　ｆｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、　２６虹６４４８−６４５２　（２９９０）３６）　Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｔ、 、　Ｊ、Ｔｍｗｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　６５：　５５−６３　（１９８３） ３７）　Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、６　：　５１１−５１９　（１９７６）３Ｂ）　Ｒｏｍｅｏ、　 Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　６８：　８８９−８９７　（１９９２）３９） 　Ｗｅａｖｅｒ、Ｃ，Ｔ、ａｎｄ　Ｕｎａｎｕｅ、Ｅ、Ｒ，、Ｔｍｍｕｎｏｌ、 Ｔｏｄａｙ　１１：　４９−５３　（１９９０）４０）　Ｅｓｈｈａｒ、Ｚ、ａ ｎｄ　Ｇｒｏｓｓ、Ｇ、、Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　６２．　（Ｓｕｐｐｌ、Ｘ ）＋　２７−２９４１）　５ｔａｎｃｏｖｓｋｉ、　１．　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、　８８：　８６X １−８６９５ ４２）　Ｂａｃｕｓ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　５２ ：　２５８０−２５８９　（１９９２）４３）　Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｍ、Ｓ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９：　１９１５　（１９８９ ）４４）　Ｅｓｈｈａｒ、　Ｚ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　９０：　７２０　（１９９３j ４５）　Ｇｒｏｓｓ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｉ！５ｈｈａｒ、　Ｚ、、　ＰＡＳＥＢ 　虹３３７０　（１９９２）４６）　Ｙａｂｌｏｎｓｋｉ、ｏ、ｌ　’Ｔｒａｎ ｓｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏ ｆ　丁　モ■撃■ ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｇｅｎｅｓ’、　Ｍ、Ｓｃ、　Ｔｈｅｓｉｓ　ｐｒｅｓｅｎ ｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｆｅｉｎｂｅｒｇ　Ｇｒａｄｕａｔ■ Ｓｃｈｏｏｌ＋　Ｔｈｅ　Ｗｅｉｚｓ＋ａｎｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　５ ｃｉｅｎｃｅ、　Ｒｅｈｏｖｏｔ、ｌ５ｒａｅｌ　（１９８V） ４７）　Ｌｉｎ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４虹６７７　（ １９９０）４Ｂ）　Ｗｅｉｓｓ、　Ａ、　ａｎｄ　５ｔｏｂｏ、　Ｊ、、　Ｊ、 　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６叶１２８４　（１９８４）４９）　Ｅｓｈｈａｒ、 　Ｚ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、匙７７５　（１９８０）５０ ）　５ｎａｐｐｅｒ、Ｃ，ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｓｍｕｎｏｌ、１４１王　４８ ９　（１９８８）５２）＾ｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｐ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８７：　２２７４　（１９９０j ５３）　Ｃａ５ｓａｔｅｌｌａ、　Ｍ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、 門ｅｄ、　１６吐５４Ｂ　（１９８９）５４）　Ｒａｖｅｔｃｈ、　Ｊ、Ｖ、　 ａｎｄ　Ｐｅｒｕｓｓｉａ、　Ｂ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１７０：　４ ８１　（１９８９）５５）　ＬｕｓＬｇａｒｔｅｎ＋　Ｊ、　ａｎｄ　Ｅｓｈｈ ａｒ、　ｚ、Ｉ　ｉｎ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎＦＩＧ、１ ９！　−９ｄＳ　−’！Ｉ　ε０つ−■ＦＩＧ、４Ａ　ＦＩＧ、４Ｂ ＭＤ　２７ＪＳＴＡ　ＳＴＢ　ＭＤ　２７Ｊ田ＡＳＴＢＦＩＧ、４ＣＦＩＧ、４ Ｄ 抗−９ｐ６　抗−γ ＦＩＧ、５Ａ Ｓ゛旧２７Ｊ　ＳＴＢ　２７Ｊ　ＳＴＢ　２７Ｊ　ＭＷＦＩＧ、５Ｂ 抗−５ｐｅ　抗−Ｙ　抗−３ｐ６　抗−ＹＳＴＢ　２７Ｊ　ＳＴＢ　２７Ｊ　Ｓ ＴＢ　２７Ｊ　ＳＴＢ　２７Ｊ非還元　還元 ＦＩＧ、６Ａ Ｓ／Ｅ比 ＦＩＧ、６Ｂ ＴＮＰ−Ｆ７Ｇ　（ｌＪｑ／ｍ１） ＦＩＧ、７Ａ Ｅ／Ｔ比 ＦＩＧ、７８ 時間（ｈｒ） １國ｍ−ｕｍ　騙唯榊−バ計 ０禰餠Ｕ＋差計　暮砲叱ｔｌ　１＝１ｉ　［１４ＦＩＧ、１１ ％　５１　Ｃｒ脱離 ＥＡＴ比 ＦＩＧ、１３ ＳｎｏＢＩ　ｐＲ５Ｖ２Ｎｅｏ−ｓｃＦｖＲ，５ｎｏＢＩロゼツト形成の図式表 示 ＦＩＧ、１４Ｂ 細胞 ＦＩＧ、１４Ｃ ロゼツト％ ＦＩＧ、１４Ｄ 細胞 ロゼツト％ ＦｔＧ、１５Ｂ Ｏ，Ｄ、　＋６２０１ 特表千７−５０５２８２　（１７） Ｅ／−５比 ＦＩＧ、１９ ｓｃＦｖ−５ｌ）６　ＣＤ　１６ ００ｂｐ ＦＩＧ、１８Ａ 時間 ＦＩＧ、１８Ｂ ＩｇＥ分泌 時間 ＦＩＧ、２１Ａ　ＦＩＧ、２１Ｂ ＦＩＧ、２２Ａ　ＦＩＧ、２２Ｂ ＴＬ−２（Ｕ／ｍ、ｌ） 標的＝エフェクター比 ＦＩＧ、２４Ａ ＩＬ−２［ＬＪ／ｍ１） ＴＮＰ−Ｆ７Ｇ　（ｕｑ／ｍ１） ＦＩＧ、２４Ｂ ＩＬ−２（Ｌｌ／ｍ１ｌ ＴＮＰ−ＦｙＧ　（ｕｑ／ｍｌ） −一〇−８ｗ５１４７ 一−−−−８ＷＧ−７８ 一一轟−ＢＷＧ−２４６ 一ローー８ＷＺ−２，３ 一バーー　８ＷＺ−２１，１１ ＦＩＧ、２８ ＋８Ｗ５１４７ 一個−二−−日ＷＧ−７，８ −１−８ＷＧ−２４．６ −ロー８ＷＺ　−２，３ 一１色−Ｂ　ＷＺ　−２１、ｊ　１ 平成６年９月１９日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．特異的抗体の一本鎖Ｆｖドメイン（ＳｃＦｖ）を符号化する第１の遺伝子断 片、および免疫細胞トリガー分子のトランスメンブランおよび細胞質ドメインを なくとも符号化する第２の遺伝子断片から成り、免疫細胞にトランスフェクシヨ ンする際に、抗体認識部位および免疫細胞トリガー部分を一本の連続鎖に発現さ せるキメラ遺伝子。
2. ２．第２の遺伝子断片がさらに部分的にまたは全体的に免疫細胞トリガー分子の 細胞外ドメインを含む請求項１によるキメラ遺伝子。
3. ３．第１の遺伝子断片が腫瘍細胞に対して抗体のｓｃＦｖドメインを符号化する 請求項１または２によるキメラ遺伝子。
4. ４．第１の遺伝子断片がウイルス感染細胞に対して抗体のＳｃＦｖドメインを符 号化する請求項１または２によるキメラ遺伝子。
5. ５．ウイルスがＨＩＶである請求項４によるキメラ遺伝。
6. ６．第２の遺伝子断片が白血球受容体鎖を符号化する請求項１ないし５のいずれ か１項によるキメラ遺伝子。
7. ７．遺伝子がＴ細胞受容体の鎖を符号化する請求項６によるキメラ遺伝子。
8. ８．Ｔ細胞受容体のサブユニットを符号化する請求項７によるキメラ遺伝子。
9. ９．抗原特異的Ｔ細胞受容体のα、β、γまたはδ鎖を符号化する遺伝子断片か ら成る請求項８によるキメラ遺伝子。
10. １０．第２の遺伝子断片はＴＣＲ／ＣＤ３複合体のポリペプチドを符号化する請 求項１または２によるキメラ遺伝子。
11. １１．ゼータまたはイータイソフォーム鎖を符号化する請求項１０によるキメラ 遺伝子。
12. １２．第２の遺伝子断片がＦｃ受容体またはＩＬ−２受容体のサブユニットを符 号化する請求項１または２によるキメラ遺伝子。
13. １３．第２の遺伝子断片がＩｇＥおよびＩｇＧ結合Ｆｃ受容体の共通サブユニッ トを符号化する請求項１２によるキメラ遺伝子。
14. １４．前記サブユニットがガンマ鎖である請求項１３によるキメラ遺伝子。
15. １５．ＦｃｒＲＩＩＩまたはＦｃｒＲＩＩのＣＤ１６α鎖についてコードする遺 伝子断片から成る請求項１４によるキメラ遺伝子。
16. １６．ＩＬ−２受容体のαまたはβサブユニットについてコードする遺伝子断片 から成る請求項１２によるキメラ遺伝子。
17. １７．請求項１ないし１６のいずれか１項によるキメラ遺伝子を含む発現ベクタ ー。
18. １８．請求項１７による発現ベクターを用いて形質転換した抗体特異性を賦与し た免疫細胞。
19. １９．請求項１ないし１６のいずれか１項によるキメラ遺伝子を含む抗体特異性 を賦与した免疫細胞。
20. ２０．正常キラー細胞、リンホカイン活性化細胞、細胞障害性Ｔ細胞、ヘルパー Ｔ細胞およびそのサブタイプから成る群から選択された請求項１８または１９に よる免疫細胞。
21. ２１．患者のリンパ球細胞を、第１の遺伝子断片が腫瘍細胞に対して向けられた 抗体のｓｃＦｖドメインを符号化する請求項１によるキメラ遺伝子から成る発現 ベクターで形質転換し、転換され従って活性化された細胞を患者に投与したとき に前記細胞が腫瘍細胞の標的になり従って腫瘍の退行を引き起こさせるようにし て成る患者の腫瘍の治療方法。
22. ２２．患者の末梢血球を形質転換する請求項２１による方法。