JPH07505530A - コードされた組合わせ化学ライブラリー - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 コードされた組合わせ化学ライブラリー説明 技術分野 本発明は、生物構造の多様性を定義する化学構造の集積を含むコードされた化学 ライブラリーに関する。

背景 医薬及び農薬に適用する場合、広範囲な生物学的過程を効果的に調節することが できる新規な分子を見出すことがますますめられている。生物活性化学薬品を検 索する標準的方法は、天然物質のコレクション、例えば発酵ブイヨンもしくは植 物エキス又は合成分子のライブラリーを複雑度が簡単な結合反応から緻密な生理 的標品までにわたる分析を用いてスクリーンすることである。スクリーンはたい てい手がかりを与えるだけであり、更に経験的方法あるいは化学設計による改良 が必要である。時間がかかりかつ高価な方法であれば、標的分子の化学構造の詳 細な知識に基づく合理的な方法であってもまったく置き換えられることにはなら ない。即ち、“不合理な薬剤設計″と呼ばれる−大量の集団又は集積から正しい 分子を選択する方法−には、集積の作成及び選択方法の双方に引き続き改良が必 要とされている。

最近、手がかりを発見する化合物ライブラリーを提供するためにペプチド又はヌ クレオチドを用いるに当たりいくつかが開発された。モノクローナル抗体で認識 されたエピトープの決定を速める方法が最初に開発された。いまでは例えば合成 ペプチドの段階的検索の標準的連続方法は極めて精巧な方法を包含し、大量のべ ブチド配列が平行して合成されかつ蛍光又は他のリポーター基で標識された受容 体分子を用いてスクリーンされる。有効なペプチド配列は、配列中のアドレスか ら解読することができる。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３９９８−４００２　（１９８４）；　Ｍａｅｊ ｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ．，１４６：８３−９０（＋９９２）＋及び Ｆｏｄｏｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７５（１９９１）参照。

別の研究において、ｌａｍら．　Ｎａｔｕｒｅ．　３５４：８２−８４（１９９ １）には、各樹脂ビーズが約２０モルのべブチドを含むように樹脂ビーズ上で合 成されるベブチドの組合わせライブラリーが記載されている。このビーズは標識 受容体分子を用いてスクリーンされ、結合受容体を存するものが肉眼による検査 で検索し、物理的に取り出し、ペプチドが直接配列分析により同定される。理論 上、この方法は他の化学物質と用いることができるが、配列決定に感受性のある 方法が必要である。

組合わせペプチドライブラリーにおける同定の課題を解決する別の方法が、Ｈｏ ｕｇｈｔｅｎら、　Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８４−８６　（１９９０によって用 いられている。２０種の天然アミノ酸のへキサペプチドの場合、４００種の別個 のライブラリーが合成され、各々最初の２つのアミノ酸は一定であり残りの４位 置はすべての可能な組合わせで占められる。次いで活性ペプチドを用いてライブ ラリーを見出すために、結合又は他の活性の競合に基づく分析が用いられる。次 いで２０種の新しいライブラリーカ恰成され、３番目の位置の作動なアミノ酸を 決定するために分析され、活性へキサペプチドが定義されるまでこの方法でプロ セスが反復される。これは暗号辞書を検索するのに用いられる方法と似ており、 一連のふるい又はバケツを用いて構築することによりペプチドが解読され、これ により検索が対数になる。

最近極めて強力な生物学的方法であって、各ファージか個々のペプチドを有しか つそれを特定するＤＮＡ配列を含むようにペプチドライブラリーがバクテリオフ ァージの表面に存在する方法が記載された。ライブラリーはすべての組合わせが 生じるようにランダムオリゴヌクレオチドの集積を合成することにより作成され 、次いでファージベクターに挿入される。各々の配列が１つのファージでクロー ン化され、特定の標的に結合するものを見出すことにより適切なペプチドを選択 することができる。この方法で回収されたファージを増幅し、選択を繰り返すこ とができる。ペプチド配列は、ＤＮＡの配列を決定することにより解読される。

例えば、Ｃｗｉｒｌａら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 　８７：６３７８−６３８２　（＋９９０）＋　５ｃｏｔｔ轣B ５ｃｉｅｎｃｅ、　２４９：３８６−３９０　（１９９０）；及びＤｅｖｌｉｎ ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４９：４０４−４０６　（＋９X０）番 孔 ライブラリーカ恰成オリゴヌクレオチド自体であって、活性オリゴヌクレオチド 分子が受容体に結合することにより選択され、次いでポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）によって増幅される別の“遺伝的”方法が記載された。ＰＣＲは連続的に 強化することができ、次いでＰＣＲ産物から作成されたクローンのＤＮＡ配列を 決定することにより活性分子の構造か解読される。この集積はヌクレオチド及び 天然ピリミジン及びプリン塩基又は特定のワトソン・クリック対を保存する修飾 体に限定され、ポリメラーゼによりコピーされる。

遺伝的方法の主な利点はＤＮＡ配列のクローン化及び増輻能カにあり、連続的選 択により強化することができカリ活性分子の構造を解読する簡便な方法を与える 。しかしながら、遺伝的集積はヌクレオチド及び天然アミノ酸からなるペプチド に限定壊＼結合部位の全領域にある広範囲な化学集積が必要である。反対に、化 学的方法は無限の集積を与えることができるが連続的強化の能力がなく、選択さ れた活性分子の構造を発見するに当たり困難がある。

れた化学的及び遺伝的方法の双方の利点を組合わせる方法であって、各化学配列 が化学合成によりそれ自体構築された“遺伝的”垂れはしの付加により標識され て各化学構造を特定する“レトロ遺伝子”法を提供する方法を提供するものであ る。

概略は、２つの交互の平行組合わせ合成が合成される化学構造に化学的に結合さ れ、各場合においては、特定の化学単位の１種を構造に付加するとオリゴヌクレ オチド配列が付加され、その化学単位を“コード“するように、即ち化学単位構 造をアイデンティファイア−として機能するように定義される。プール及び分割 後このプロセスを繰り返すことによりライブラリーがつくられる。　−そのよう にして作製されたライブラリーから問題の前選択された生物学的分子に結合する か又は結合、活性化、化学的触媒等のような所望の活性を有するライブラリー中 の種類を同定することにより、活性分子が選択される。その後、活性分子の同一 性は遺伝的垂れはし、即ちアイデンティファイア−オリゴヌクレオチド配列を読 み取ることにより決定される。ｌ実施態様においては、レトロ遺伝前垂れはしの 増殖コピーはポリメラーゼ連鎖反応により得ることができる。

次いで適切な極性を有する増幅コピー鎖を用いてマツチング垂れはしによるハイ ブリッド形成によりサブセットのライブラリーを強化することかでき、次いでこ のプロセスがこのサブセットに繰り返される。即ち、増幅することができるヌク レオチド配列への結合を利用する精製プロセスにより連続的強化が得られる。

最後に、ＰＣＲ反応の生産物をクローン化及び配列決定することにより化学物質 の構造が解読される。

従って、本発明は化学多様性の強化源である三官能分子ライブラリーの使用によ る前選択結合又は触媒活性を存する化学構造を同定する新規な方法を提供するも のである。このライブラリーは前選択生物分子と相互作用する化学構造（構造モ チーフ）を同定するために用いられる。

即ち、ｌ実施態様においては、本発明は式Ａ−Ｂ−Ｃ（式中、Ａは化学部分てあ り、ＢはＡ及びＣに操作的に結合したリンカ−グチであり、Ｃは化学部分Ａの構 造を同定するヌクレオチド配列を含むアイデンティファイア−オリゴヌクレオチ ドである。）による三官能分子を企図するものである。

もう１つの実施態様においては、本発明は複数種の三官能分子を含むライブラリ ーを企図するものであり、これにより化学多様性の集積が形成される。

もう１つの実施態様は、結合又は触媒のような生物活性分子と前選択化学的又は 生化学的相互作用に関与する化学構造の同定方法であって、その化学構造が本発 明による三官能分子のライブラリーに存在する方法を企図するものである。本方 法は下記段階を含んでいる： ａ）三官能分子のライブラリーと生物学的に活性な分子とを溶液中で結合条件下 結合反応複合体を形成するのに十分な時間混合し：ｂ）段階（ａ）で形成された 複合体を単離し。

ｃ）ＩＩ離複合体中のポリマーアイデンティファイア−すりゴヌクレオチドのヌ クレオチド配列をめ、それにより前選択結合相互作用に関与した化学構造を同定 する。

本発明は、また下記段階を含む本発明によるライブラリーの調製方法を企図する ものである： ａ）末端Ａ′で化学前駆体単位及び末端Ｃ′でヌクレオチド前駆体Ｚ′との反応 に適応する式Ａ’−Ｂ−Ｃ’による末端Ａ′及びＣ′を存するリンカ−Ｂを供給 し； ｂ）化学前駆体単位Ｘ′を該リンカ−の末端Ａ′に付加するとともに前駆体単位 アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドＺ′を該リンカ−の末端Ｃ′に付加 して構造Ｘ、　−Ｂ−Ｚ、を有する三官能分子を含む組成物を形成することによ り合成を行い； Ｃ）組成物の１個以上のアリコートで段階（ｂ）を繰り返して三官能分子を含む 産物を含むアリコートを作製し： ｄ）段階（Ｃ）で作製した部分を組合わせて三官能分子の混合物を形成し、それ により該ライブラリーを形成する。

関連の実施態様においては、本発明は、（１）水溶液に分散できる種類である固 体支持体、（２）固体支持体に結合した第１結合単位、（３）第１結合単位に結 合した第２結合単位及び（４）第２結合単位に結合した三官能単位を含むオリゴ ペプチド／オリゴヌクレオチド複合体を合成する三官能固体支持体であって、三 官能単位がオリゴペプチド合成に使用できる第１脱離基及びオリゴヌクレオチド 合成に使用できる第２脱離基を有し、第１脱離基がＮ−ＦＭＯＣ又はその官能等 価基であり、第２脱離基がＯ−ＤＭＴ又はその官能等価基であり、第２結合単位 が濃アンモニア水にさらすことにより切断可能結合によって第１結合単位に結合 され、固体支持体、第１結合単位、第２結合単位、切断可能結合、第１及び第２ 脱離基のみの三官能単位の各々がＦＭＯＣ脱離基を用いるオリゴヌクレオチド合 成プロトコールで用いられる条件及びＯ−ＤＭＴ脱離基を用いるオリゴヌクレオ チド合成プロトコールで用いられる条件に実質的に化学的に反応しない該支持体 が記載される。

更に、（１）水溶液に分散できる種類の固体支持体、（２）固体支持体に結合し た第１結合単位、（３）第１結合単位に結合した第２結合単位、（４）第２結合 単位に結合した三官能単位、（５）三官能単位に結合したオリゴヌクレオチド及 び（６）三官能単位に結合したオリゴヌクレオチドを含むオリゴペプチド／オリ ゴヌクレオチドライブラリーの要素が企図される。

図面の簡単な説明 本開示の一部をなす図面において： 図１は、本発明の三官能分子から誘導されたＰＣＲ増幅産物の制限エンドヌクレ アーゼ切断（段階ｌ）、引き続きその切断ＰＣＲ産物へのビオチン添加（段階２ ）のスキームを示すものである。

図２は、実施例９に記載される方法による三官能分子を存するライブラリーの作 製方法を示すものである。

図３は、本発明を実施するのに作動であり実施例３Ｂに記載される“ｂｆ−ＣＰ Ｇ“と称される制御細孔ガラス（ＣＰＧ）支持体に基づく好ましい三官能リンカ ーー支持体分子の構造を示すものである。

コードされた組合わせ化学ライブラリーは、各々が異なる化学構造を定義しかつ ヌクレオチド配列が対応する化学構造を定義するユニークなアイデンティファイ ア−オリゴヌクレオチドを含む複数の三官能分子種を含む組成物である。

１、三官能分子 三官能分子は本発明のライブラリーの基本単位であり、ライブラリーの化学部分 を形成する一連の化学ビルディングブロックから構成されたポリマー要素及び化 学部分の構造を確認するコードを備えている。

即ち、三官能分子は式Ａ−Ｂ−Ｃ（式中、Ａは化学部分であり、ＢはＡ及びＣに 操作的に結合したリンカ−分子であり、Ｃは化学部分Ａの構造を同定するヌクレ オチド配列を含むアイデンティファイア−オリゴヌクレオチドである。）で表す ことができる。

ａ、化学ポリマー 本発明の三官能分子の化学部分は、上記式Ａ−Ｂ−ＣのＡで表され、式（Ｘ、） 。

（式中、ＸはポリマーＡの単一化学単位であり、ｎはポリマーＡのＸの位置アイ デンティファイア−である。）で表される線状の化学単位を含むポリマーである 。

ｎが１の場合、Ｘはリンカ−（Ｂ）に最も近い位置にあるように、ｎはｌ＋ｉ（ ｉは０−１０の整数である。）値を有する。

ａで定義されるポリマーの長さは変動することができるが、本明細書で更に述べ られる大きなアルファベットサイズがある場合には実施しやすいライブラリーサ イズ限界が生じる。典型的には、ａは４〜５０の整数である。

化学部分（ポリマーＡ）は種々のポリマー構造であり、本発明のライブラリーで 表されるべき化学多様性の種類の選択に左右される。ポリマーＡは、ポリマー形 に結合及び伸長することができるモノマー化学単位である。例えば、ポリマーＡ はポリペプチド、オリゴ糖、糖脂質、脂質、プロテオグリカン、糖ペプチド、ス ルホンアミド、核タンパク質、複合ペプチド（即ち、補欠分子族を有する）、遷 移状態類縁体のような酵素基質を含有するポリマー、曹［ＣＯＨ，］、ｖ　ｔｃ 。

Ｓｌ　、Ｗ　［ＣＯＯ］又は’！’　［ｐｏｔ　ＮＨ］のようなアミド結合置換 部分を有するポリペプチド類縁体ポリマー及び類似の生化学ポリマーとすること ができる。具体的には本明細書で記載されたポリペプチド系ライブラリーである 。

ライブラリーがペプチドポリマーを含む場合、化学単位Ｘは天然タンパク質の領 域を形成するように選択されるか又は非天然ポリペプチドであるか、天然Ｄ−ア ミノ酸を含むか又は非天然アミノ酸もしくは天竺及び非天然アミノ酸の混合物を 含むことができる。非天然混合物は、生物学的相互作用に関係する有効かつユニ ークな構造モチーフの同定を与える。

非天然アミノ酸としては、修飾アミノ酸及びＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸び立体 異性体及びアミド又はプソイドアミド結合を形成することができる他の化合物が 挙げられる。

本明細書に記載されるアミノ酸残基は、“Ｌ”異性体であることが好ましい。

“Ｈ″は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。“Ｏ Ｈ″は、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味する 。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２４３：３５５２−５９　（１９６９）及び３ ７　Ｃ，Ｆ、Ｒ−９１，８２２（ｂＸ２）で採用された標準ポリペプチド命名法 と一致したアミノ酸の略号を下記対応表に示す：対応表 Ｆ　Ｐｈｅ　フェニルアラニン Ｍ　Ｍｅｔ　メチオニン Ａ　Ａｌａ　アラニン Ｓ　Ｓｅｒ　セリン ［（Ｈｉｓ　ヒスチジン Ｑ　Ｇｌｎ　グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸 １１　Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　アスパラギン “アミノ酸残基′なる語は、対応表並びに修飾及び特異アミノ酸、例えば３７Ｃ １Ｆ、　Ｒ，９１，８２２（ｂＸ４）に挙げられたものを包含するように広く定 義され、参考として本明細書に引用される。

従って、化学部分Ａで定義されたポリマーは化学的多様性を高めるポリマーバッ クボーン修飾を含むことができる。例としてポリペプチド系をつくるに当たり、 次のバックボーン構造ニーＮＨＮ　（Ｒ）ＣＯ−１−ＮＨＢ　（Ｒ）ＣＯ−１− ＮＨＣ（ＲＲ’　”ｌ　Ｃ０−１−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ）ＣＯ−１−ＮＨＣＩ　Ｈ ，Ｃ０−１−ＮＨＣＨ２ＣＨＲＣＯ−１−ＮＨＣＨＲＣＨ！　Ｃｏ−及びラクタ ム構造のような種々の修飾か企図される。

更に、−ＣＯＣＨ，−１−ＣＯＳ−１−ＣＯＮＲ，−ＣＯＯ−１−Ｃ３ＮＨ−１ −ＣＨ，ＮＨ−１−ＣＨｆ　ＣＨ，−１−ＣＨ，Ｓ−１−ＣＨｔ　５ｏ−１ＣＨ ｆＳＯ＊　、　ＣＨ（ＣＨｆ）Ｓ−１−ＣＨ＝ＣＨ−５−ＮＨＣＯ−１−ＮＨＣ ＯＮＨ−１−ＣＯＮＨＯ−１Ｃ（＝ＣＨｆ　）ＣＨｔ−１−ＰＯ２−ＮＨ−１− ＰＯ，−ＣＨ２−１−ＰＯ，−ＣＨ，Ｎ＋及びＳｏ、ＮＨ−一のようなアミド結 合修飾が企図される。

ｂ、ポリマーアイデンティファイア−オリゴヌクレオチド本発明の三官能分子内 のアイデンティファイア−オリゴヌクレオチドは、上記式Ａ−Ｂ−ＣのＣで表さ れかつ式（Ｚ、）、Ｃ式中、Ｚは位置ｎの化学単位Ｘを同定するオリゴヌクレオ チドＣ内の単位アイデンティファイア−ヌクレオチド配列である。）で表された 配列を有するオリゴヌクレオチドである。ｎが１の場合、Ｚはリンカ−（Ｂ）に 最も近い位置にあるように、ｎは１＋ｉ　（ｉはθ〜ＩＯの整数である。）値を 存する。ａは前述のようにオリゴヌクレオチドの化学単位アイデンティファイア −数を意味する整数である。

例えば、三官能分子は下記式で表される。

Ｘ４　Ｘｓ　Ｘｓ　Ｘ、　Ｂ　Ｚ＋　Ｚ−Ｚｓ　Ｚ−この例においては、オリゴ ヌクレオチド２．．２いＺ、及びＺ、の配列は各々化学単位Ｘ１、Ｘ！、Ｘ、及 びＸ４の構造を同定する。即ち、アイデンティファイア−配列において位置ｎの 化学単位Ｘと位置ｎの単位アイデンティファイ−ｒ　−オリゴヌクレオチドＺと の間に対応がある。

単位アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドの長さは、ライブラリーの複雑 度、独自に同定されるべき異種化学単位数並びにハイブリッド形成及びポリメラ ーゼ連鎖反応忠実度のようなオリゴヌクレオチドの一意性の要求に関する他の検 討に基づいて変動させることができる。典型的な長さは約２〜約ＩＯヌクレオチ ドであるが、より長いものから単位アイデンティファイア−を除外することはな にもない。

アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）及びシチジン（Ｃ）が単 位アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドに介在するデオキシヌクレオチド の典型的選択を表す限りにおいては、Ａ、Ｇ、Ｔ及びＣは単位アイデンティファ イア−オリゴヌクレオチドの配列を“はっきり説明するまために用いられる代表 的な“アルファベットを形成する。他のヌクレオチド又はヌクレオチド類縁体は 、ワトソン・クリック対の形成能を有しかつＰＣＲ反応においてＤＮＡポリメラ ーゼで複製される限り、上記４種のヌクレオチドの他にあるいは代わりに用いる ことができる。しかしながら、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｔ及びＣが好ましい。

アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドのコード設計の場合、オリゴヌクレ オチド配列の重要な部分が偶然にさもなければライブラリーの三官能分子の操作 中に別の関係のない組合わせに生じないようにコード表示を選択すること力泌要 である。

例えば、Ｚがトリヌクレオチドであり、その配列がユニークな化学単位Ｘを定義 するライブラリーを検討する。本発明の方法は化学単位のアルファベットのすべ ての組合わせ及び順列を与えるので、２種類の異なった単位アイデンティファイ ア−オリゴヌクレオチド配列がフレームシフトだけで異なり従ってフレームが明 確でない限りハイブリッド形成又は配列決定で容易に区別できる密接に関連した 配列を有することが可能である。

単位アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドの誤解読の他の原因が生じるこ とがある。例えば、ＤＮＡハイブリッド形成におけるミスマツチ、アイデンティ ファイア−オリゴヌクレオチドを増幅又は配列決定するプライマー伸長反応での 転写エラー及び類似エラーが三官能分子の操作で生じる。

本発明は、アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドを読み取る際にエラーの 可能性を減少する、例えば単位アイデンティファイア−ヌクレオチド配列間の類 似性を低下させるように単位アイデンティファイア−ヌクレオチド配列のより長 いヌクレオチドを使用する種々の手段を企図するものである。典型的な長さは、 化学単位のアルファベットのサイズに左右される。

フレームシフト又は突然変異による解読エラーを取り除くのに有効な代表的な系 は、遺伝コードに対する理論代替コードとして開発されたコードでありカリ無コ ンマ遺伝コードとして知られている。Ｃｒ１ｃｋら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ４３：４１６−４２１　（＋９５７）。

化学単位かアミノ酸である場合、便利な単位アイデンティファイア−ヌクレオチ ド配列はトリブレットコドンを用いた周知の遺伝コード又は上記Ｃｒ１ｃｋらに 記載されている無コンマコードの使用である。本発明は、遺伝コードのトリブレ ットコドンと天然アミノ酸との間に与えられた翻訳によって限定される必要がな く、他の対応系を対応させることができる。

典型的な及び例示の単位アイデンティファイア−ヌクレオチドは、実施例におい て記載される無コンマコードに基づきかつ相補的ハイブリッド形成を確実にする 長さを示すために化学単位当たり６ヌクレオチド（ヘキサヌクレオチド）の長さ を有する。

アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドは、効果的なハイブリッド形成の場 合型れはしくコード）領域に少なくとも１５ヌクレオチドを有することが好まし い。更に、ライブラリーの複雑度の検討、化学単位のアルファベットのサイズ及 び化学部分のポリマーの長さがすべて本明細書で更に詳細に述べられるアイデン ティファイア−すりゴヌクレオチドの長さに寄与している。

好ましい実施例においては、アイデンティファイア−すりゴヌクレオチドＣは式 ｐ１−　（Ｚ、）、−Ｐ２　（ｐ＋及びＰ２はポリマーアイデンティファイア− オリゴヌクレオチドを増幅するために適応されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）プライマー結合部位を与えるヌクレオチド配列である。）で表されるヌクレオ チド配列を有する。ＰＣＲプライマー結合部位の要求は通常当該技術において周 知であるが、ポリマーアイデンティファイア−オリゴヌクレオチド配列を含むＰ ＣＲ増幅産物（ＰＣＲ増幅二重らせんＤＮＡフラグメント）を形成させるように 設計される。

アイデンティファイア−オリゴヌクレオチド配列（Ｚ、’）、に隣接する２つの ＰＣＲプライマー結合部位、ＰＩ及びＰ２が存在すると、ＰＣＲを用いて三官能 分子から誘導されたＰＣＲ増幅二重らせんＤＮＡフラグメントを作製する手段を となる。この設計は、三官能分子内の化学部分の構造を決定するアイデンティフ ァイア−コードの解読方法においてクローン化及び配列決定する目的に対して特 定の三官能分子上に存在する垂れはし配列を増幅させるのに有効である。

ヌクレオチドＰＩ及びＰ２の一方又は双方がアイデンティファイア−オリゴヌク レオチド配列からＰＣＲプライマー結合部位を除去する手段を含むように設計さ れる三官能分子であることが更に好ましい。配列が次のハイブリッド形成反応に 寄与しないように、フランキングＰＩ及びＰ２配列の除去が好ましい。ＰＣＲ増 幅産物からＰＣＲプライマー結合部位を除去する好ましい手段は、ＰＣＲ増幅二 重らせんＤＮＡフラグメント内の制限エンドヌクレアーゼ部位の形にある。

制限エンドヌクレアーゼは当該技術において周知であり、二重らせんＤＮＡの特 定の長さを認識しかつ配列特異的方法でＤＮＡを切断する酵素である。

好ましくは制限エンドヌクレアーゼ部位は、特定の制限エンドヌクレアーゼに対 する三官能分子を処理する際に除去されるＰＩ及びＰ２の量を最大にするために ＰＣＲプライマー結合部位に相対する（Ｚ、）、に近く位置しなければならない 。更に好ましくはＰｌ及びＰ２は各々得られたＰＣＲ増幅二重らせんＤＮＡの制 限エンドアフレアーゼ部位を形成するように適応し、制限エンドヌクレアーゼで 切断される場合、２つの制限部位は非オーバーラツプ付着末端を形成して次の操 作を容易にする。

切断した場合衣の操作を容易にするビオチニル化ヌクＩノオ千ド（例えばビオチ ニルデオキシＵＴＰ）の取込みのような末端特異的修飾に適応したオーバーラツ プ末端を得る制限部位か特に好ましい。

アイデンティファイア−オリゴヌクレオチド内の上記好ましい実施態様は、図１ に示される特定の実施態様に纏められる。

図１においては、実施例に記載されているアイデンティファイア−オリゴヌクレ オチドから誘導されるＰＣＲ増輻増重二重んＤＮＡが示されている。（Ｚ、）配 列はコード配列として角括弧に示され、その二重らせんの相補鎖はアンチコード 鎖として角括弧に示されている。Ｐｌ及びＰ２配列は、５′から角括弧まである Ｐｌ配列で区切られた５ｔｙｘ制限工ンドヌクレアーゼ部位及び３′から角括弧 まであるＰ２配列で区切られたＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を用いて詳 細に示されている。

段階ｌは、ＰＣＲ増幅２重らせんＤＮＡを酵素５ｔｙｉ及びＡｐａＩで切断して 付着末端を有する修飾アイデンティファイア−配列を形成することを示すもので ある。段階２は５ｔｙｉ部位のアンチコード鎖を特異的にビオチニル化し、それ によりビオチニル化ＵＴＰの取込みがＢで示されている。

図１において段階Ｉ後非オーバーラッピング付着末端が存在すると、制限消化Ｐ ＣＲ増幅フラグメントを適切なベクター、例えば配列決定ベクターに特異的及び 方向性クローン化することができる。更に、得られた突出部分かＤＮＡポリメラ ーシーレノウフラグメントを用いるｄＣＴＰ及びビオチニルｄＵＴＰ　（ＢＴＰ ）による挿入反応の基質であることから、５ｔｙＩはＰＩの中に設計された。他 の制限部位、Ａｐａｌは上記ビオチニル化の基質とならないように選択されたの で、アンチコード鎖のみをビオチニル化することかできる。

ビオチニル化されると、二重らせんフラグメントは固定化アビジンに結合するこ とができ、二重らせんを変性してアイデンティファイア−ヌクレオチド配列を含 むコード配列を遊離することができ、それにより更に本明細書に記載される関連 のコーディング鎖の選択にハイブリッド形成試薬として有効な精製アンチコード 鎖を得ることができる。

Ｃ，リンカ−分子 本発明の三官能分子のリンカ−分子は上記式Ａ−Ｂ−ＣのＢで表され、化学部分 をアイデンティファイア−オリゴヌクレオチドに操作的に結合する機能を行う分 子とすることができる。

リンカ−分子は固体支持体に結合する手段を有し、それにより固体相における三 官能分子の合成を容易にすることか好ましい。更に、固体支持体に結合すると、 本明細書に記載される三官能分子のライブラリーを用いるスクリーニング法を実 施するに当たりある種特徴を与える。支持体に結合する手段が可逆的である、即 ちリンカ−を固体支持体から分離することができるリンカ−分子が特に好ましい 。

リンカ−分子は構造及び長さを変動させ、少なくとも２つの特徴：　（１）化学 部分Ａへの操作的結合及び（２）アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドへ の操作的結合を与えることができる。化学結合の種類はまちまちであるので、結 合の種類か本発明の必須の特徴とみなされないようにＡ及びＣへの操作的指定結 合を行うために種々の化学が用いられる。ＡとＣの間の長さとしてのリンカ−の サイズは広く変動させることができるが、本発明の目的のために指定した結合機 能を与えるのに十分な長さを超える必要はない。即ち、少なくとも１個から約２ ０個の原子の鎖長か好ましい。

固体支持体に結合する可逆的手段の好ましい付加手段を含む好ましいリンカ−分 子は、実施例３に記載されている。即ち、三官能分子は合成後固体支持体から除 去できる。別の実施態様においては、三官能分子をその部分を遊離するために時 間が経つにつれて徐々に切断される能力を有する。

種々の化学又は酵素選択的切断機能性を、本発明に有効なリンカー−支持体分子 に組込むことができる。例えば、４−ヒドロキシメチルフェノキン酢酸部分は酸 切断可能リンカ−を与える。２−　［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシロキシ） メチル１安息香酸部分はフッ化物切断可能部分を与える。２−ヒドロキシメチル 安息香酸部分のリン酸塩は、アルカリ性ホスファターゼ処理を組合わせ、次いで 緩和なアルカリ処理により切断可能な部位を与える。即ち、上記で挙げたちの以 外の選択的に切断可能なリンカ−の取込みも本発明の一部とみなされる。

化学合成用固体支持体は一般的には周知である。オリゴヌクレオチド及びポリペ プチド合成において用いられるＧｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（Ｈｅｒｎｄｏｎ、 ＶＡ）、ＢａｃｈｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐ Ａ）、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、 　bＰＧ　ｌ＋ｃ、。

（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、Ｎ、Ｉ）及びＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉ　ｔｙ、　ＣＡ）のような多くの販売元から入手できる合成 樹脂及び制御細孔ガラス（ＣＰＧ）が特に好ましい。実施例２に記載されるよう にテフロン及びＣＰＧ支持体か最も好ましい。

関連実施態様においては、本発明は化学部分としてポリペプチドを存する本発明 の三官能分子（即ち、オリゴペプチド／オリゴヌクレオチド複合体）を作製する のに特に適した好ましい三官能固体支持体を記載するものである。

オリゴペプチド／オリゴヌクレオチド複合体を合成する好ましい三官能固体支持 体は、固体支持体、第１ｖ：自単位、第２結合単位及び三官能単位を含んでいる 。

この文において゛三官能単位”は、本発明の三官能分子と混同されるへきでなく 、代わりに２つの（ニ）反応機能性を与える、１つがペプチドを結合しもう１つ かオリゴヌクレオチドを結合する三官能固体支持体に存在するその化学部分を意 味する。具体的な三官能単位は、アミンヘキサノールリンカーに続くセリン分枝 モノマーとして図３に示されている。

本明細書で用いられる固体支持体は、上記のように水溶液中に分散できる種類の ものである。好ましい固体支持体は、ペプチド及びオリゴヌクレオチド合成に使 用できる種類の制御細孔ガラス、例えばＳｉｇｍａで販売されているアミノプロ ピル−ＣＰＧである。固体支持体は第１結合単位にしっかりと結合される。好ま しい第１結合単位としては、アミド結合によってアミノプロピル−ＣＰＧに結合 されたサルコシンリンカ−及びサルコシンリンカ−に結合されたサクシニルリン カ−が挙げられる。また、第２結合単位は第４結合単位に結合される。好ましい 第２結合単位はアミノヘキサノール基である。第１及び第２結合単位のカップリ ングに好ましい結合はアルキルエステルである。アルキルエステルは濃アンモニ ア水と反応すると容易に加水分解又は切断される。

三官能単位は、オリゴペプチド合成に使用できる第１脱離基及びオリゴヌクレオ チド合成に使用できる第２脱離基を有する。好ましい二官能単単位は、Ｌ−セリ ン残基である。Ｌ−セリン残基としては、アミノ末端、カルボキシル末端及びヒ ドロキシル末端が挙げられる。セリン残基は、そのカルボキシル末端で第２結合 単位に結合される。好ましい実施態様においては、セリン残基のカルボキシル末 端がアミド結合によってアミンヘキサノールリンカ−に結合される。セリン残基 は、そのアミノ末端で第１脱離基に、そのヒドロキシル末端で第２脱離基に結合 される。好ましい第１脱離基は、Ｎ−ＦＭＯＣ［Ｎ−（９−フルオレニルメトキ シカルボニル１又はその官能等価基である。好ましい第２脱離基は、Ｏ−ＤＭＴ （０−ジメトキシトリチル）又はその官能等価基である。

固体支持体、第１結合単位、第２結合単位、その間の切断可能な結合及び該第１ 及び第２脱離基のみの三官能単位は、ＦＭＯＣ脱離基を用いた慣用のオリゴヌク レオチド合成プロトコールで用いられる条件下ｆＢｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｔｈｅ 　ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆＰｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｓｐｒｉｎ ｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８４）；及びＢｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｐｒ１ｎｃｉ ｐｌｅ刀@ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１ ９８４）ｌ及びＯ−ＤＭＴ脱離基及びホスホルアミダイトドナーを用いた慣用の オリゴヌクレオチド合成プロトコールで用いられる条件下で各々実質的に化学的 非反応性である。

別の実施態様においては、三官能固体支持体は第３結合単位も含まれる。第３結 合単位は三官能単位と第１脱離基との間にあり結合される。この実施態様の好ま しい方法においては、第３結合単位は感光性であり、即ち紫外線に露光すること により切断できる。第３結合単位には、アミド結合によって三官能セリン残基の アミノ末端に結合した及びエステル結合によってＦＭＯＣ遮断アミノ酸に結合し た３−ニトロ−４−ブロモメチルベンゾエート基が含められる。

２、ライブラリ一 本発明のライブラリーは、本発明による複数の種類の三官能分子を含む化学多様 性の集積である。ライブラリーにおける複数の種類は各々か異なった化学部分を 有する化学多様性群を定義するものである。即ち、ライブラリーはペプチド、脂 質、オリゴ糖又は他の種類の前記化学ポリマー群を定義することができる。

ライブラリーにおける異なる種類の数はライブラリーの複雑度を表し、化学部分 のポリマーの長さ及び化学ｍ位ポリマーをつくるために用いることかできる化学 単位アルファにツトのサイズで定義される。ライブラリーにおいて“複数の種類 ′なる句に４よって言及される異なる種類の数は、弐〜ｆｍ、即ちＶのａ乗（指 数ａ）で定義される。■は、了ルファベツトサイズ、即ち化学部分に使用するの に有効な異なった化学単位Ｘの数を表す。“ａ”はＶに対する指数であり、ポリ マー八を形成する化学単位Ｘの数、即ちポリマーへの長さを表す。

例えば、ポリマーＡが６個のアミノ酸の長さを有するペプチドでありかつ用いら れるアミノ酸か２０個の天然アミノ酸である三官能分子の場合、アルファベラ（ Ｖ）は２０でありポリマーの長さくａ）は６であり、ライブラリーサイズは２０ ６又は６４００万である。この具体的なライブラリーは、対応するユニークなア イデンティファイア−すりゴヌクレオチドに操作的に結合した６４００万の異な る六量体ポリペプチドを供給する。

ライブラリーの複雑度はライブラリーの他の種類に相対して三官能分子の具体的 な種類の量を決定することから、ライブラリーにおいて有効な最大複雑度に対し て理論上限界がある。もう１つの限界は、ライブラリーに存在する実際の支持体 分子又はビーズの数によって定義されたライブラリーサイズである。従って、ラ イブラリーがどのくらいの大きさく複雑さ）でなればならないかを検討すること は有効である。このサイズの限界は、本発明のスクリーニング法の後ポリマーア イデンティファイア−すりゴヌクレすチドの存在を検出する感受性のレベルによ って示される。検出感受性は、分析されるべき受容体分子と三官能分子との間の 結合又は触媒活性の閾値で示される。

例えば結合閾値が１０−１Ｍ（マイクロモル）である場合には、１ミリリツトル （ｍｌ）容量において各々の種類少なくとも１ナノモルでなければならない。こ の閾値において、１０４の複雑度を有するライブラリーは各々の種類ｌＯマイク ロモルを含むことができる。ライブラリー複雑度と結合閾値との間の逆数関係か ら、より複雑なライブラリーは結合閾値がより低い場合に可能である。

ライブラリー内の個々の三官能分子の種類の相対量は約０．２〜約ｌＯ当量に変 動させることができ、１当量はライブラリー内の種類の平均量を示す。各々の種 類がほぼ等モル量でライブラリーに存在することが好ましい。

好ましい実施態様においては、ライブラリーはライブラリーのすべての種類に所 定のアルファベットと化学単位の前選択数がある一定のライブラリーの数学的組 合わせに基づいて可能な化学多様性の完全な集積を含んでいる。即ち完全な集積 は、所定のアルファベットと化学長さを有する本発明のライブラリーに見出され る可能な化学多様性すべての原因を与えるものである。

ライブラリーは、三官能分子の各種類がＰＩ又はＰ　２　Ｐ　Ｃ’Ｒプライマー 結合部位に対して同じヌクレオチド配列を含む三官能分子から構成されることが 特に好ましい。この設計によるライブラリーは、本発明の方法を実施する場合、 ライブラリーに存在するアイデンティファイア−オリゴヌクレオチド（コード配 列）の種類を増幅するために単−ＰＣＲプライマー対を用いることができること から特に好ましい。

関連の実施態様においては、本発明はライブラリー要素、即ち本発明の三官能分 子を企図するものである。好ましいライブラリー要素は、前記オリゴペプチド／ オリゴヌクレオチド複合体である。

即ち、１実施態様においてオリゴペプチド／オリゴヌクレオチド複合体のライブ ラリーの要素は、固体支持体、第１結合単位、第２結合単位、三官能単位、オリ ゴペプチド及びオリゴヌクレオチドを含んでいる。固体支持体は水溶液に分散で きる種類のものである。第１結合単位は、固体支持体に結合される。第２結合単 位は、第１結合単位に結合される。三官能単位は、第２結合単位に結合される。

オリゴペプチド及びオリゴヌクレオチドは三官能単位に結合される。

別の実施態様においては、ライブラリー要素は第１結合単位を第２結合単位に結 合するための切断可能な結合を包含する。切断可能な結合は濃アンモニア水にさ らすことにより切断可能な種類のものである。

別の実施態様においては、ライブラリー要素には三官能単位をオリゴペプチドに 結合するための切断可能な結合を包含する。切断可能な結合は、紫外線にさらす ことにより切断可能な種類、例えばアミド結合によって三官能セリン残基のアミ ノ末端に結合した及びエステル結合によってＦＭＯＣ遮断アミノ酸に結合した３ −ニトロ−４−ブロモメチルベンゾエート基とすることができる。

ライブラリー要素は、固体支持体及び第１及び／又は第２結合単位なしで作成す ることもできる。この場合、ライブラリー要素は三官能単位、該三官能単位に結 合したオリゴペプチド及び該三官能単位に結合したオリゴヌクレオチドを含んで いる。これと別の実施態様には、三官能単位をオリゴペプチドに結合するための 切断可能な結合を包含する。切断可能な結合は、上記で示したように感光性、即 ち紫外線にさらすことにより切断可能な種類のものである。

Ｂ、ライブラリーの作製方法 本発明のライブラリーを形成する複数の三官能分子の作製方法は、多数の異なる 種類の効率のよい合成に関して種々の課題を解決するものである。

本合成法においては、まず化学単位Ｘを付加し、次にオリゴヌクレオチド配列を リンカ−分子に付加する連続段階には、化学単位Ｘを付加し、次に対応する化学 単位を定義する（コードする）単位アイデンティファイア−ヌクレオチド配列Ｚ を付加する交互の平行合成手順が必要である。ライブラリーは、本明細書に記載 される反応産物をプール及び分裂した後この交互の平行プロセスを反復すること によりつくられる。

コードされたライブラリーを作成する唯一の制約は、ヌクレオチド又はオリゴヌ クレオチド配列を加えることに比べて化学単位を加える２つの交互合成手順の間 に適合しつる化学がなければならないことである。

合成適合性の課題は、交互ポリマーが合成される適合しうる保護基の正しい選択 及び１つの成長ポリマーを選択的に脱保護するとともに他の成長ポリマーはブロ ックされたままである方法の正しい選択、例えば一時的な保護基又は特定の脱保 護化学によって除去できる保護基の使用によって解決される。適合しうる適切な 保護化学は本明細書に記載され、更に適切な化学は５ｙｎｏｐｓｙｓ、　Ｉｎｃ 、がら入手できるしＧｒｅｅｎｅら、　”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ 　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ’、２ｎｄ　Ｅｄ、　、　iｏｈ ｎ Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　（１９９１）に記載されている化学保護記載データ ベースにも記載されている。

複数の三官能分子を有するライブラリーの合成は、下記段階を含んでいる。

（１）第１化学単位Ｘ、を操作的に結合しかつ単位アイデンティファイア−ヌク レオチドＺ、を定義する第１ヌクレオチド配列を操作的に結合しその配列が化学 単位Ｘ１の構造をコードする（定義する）適切な手段を有するリンカ−分子を供 給する。リンカ−は固体支持体に結合する手段を有することが好ましく、それだ けで合成が固体相で進行する。

即ち、供給されたリンカ−分子は構造Ａ’−Ｂ−Ｃ’を有し、Ａ′は前駆体（Ｘ ′）の化学単位Ｘを操作的に結合する反応に適応させた末端を表し、Ｃ′は前駆 体（Ｚ′）のヌクレオチド又はポリマーアイデンティファイア−オリゴヌクレオ チドＺを操作的に結合する反応に適応させた末端を表す。末端Ａ′及びＣ′は、 一方の末端の操作的結合反応中他方の末端が反応から保護されるように各々の遮 断基で保護される。

（２）次いでリンカ−分子を合成の第１サイクルに供して一方の末端のビルディ ングブロックを加える。末端Ａ′に最初に化学単位Ｘを付加するか又は末端Ｃ′ に最初にアイデンティファイア−オリゴヌクレオチドＺを付加するように決めら れる限り合成の順序は通常重要でない。第１サイクルは、ビルディングブロック が付加されるべきリンカ−の末端を脱保護し次いでビルディングブロックを末端 に付加する段階を含んでいる。典型的には、付加したビルディングブロックはそ の遊離末端、即ちその種類の次のビルディングブロックの付加に関与する末端に 遮断基を含んでいる。次いでリンカ−分子を合成の第２サイクルに供してもう一 方（第２）末端のビルディングブロックを付加する。第２サイクルは、ビルディ ングブロックが付加されるリンカ−の第２末端を脱保護し次いでビルディングブ ロックを末端に付加する段階を含んでいる。また、付加したビルディングブロッ クは典型的にはその遊離末端で遮断される。

アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドＺの末端Ｃ′への付加が行われ、完 全な単位アイデンティファイア−ヌクレオチド配列Ｚを形成するヌクレオチドに よるヌクレオチド又はＺが前合成され、オリゴヌクレオチドＺがブロックとして 末端Ｃ′に付加される。オリゴヌクレオチドの合成が当該技術において周知であ る限り、三官能分子を合成する際に操作の数を減少させることからオリゴヌクレ オチドの前合成及びブロックの成長ヌクレオチドポリマーへの付加か好ましい。

化学単位Ｘ又は単位アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドＺは、適切な末 端において成長ポリマーへの前駆体操作的結合を容易にする反応化学と適合しつ る脱離基を含むことを示すために前駆体（Ｘ’又はＺ’）と呼ばれる。

段階（２）から得られた産物は構造Ａ’−Ｘ、−Ｂ−Ｚ、−Ｃ’を有する三官能 分子であり、Ｘ、及びＺ、を成長ポリマーに加えるために上記第１及び第２サイ クルを反復しやすい。

（３）三官能分子産物Ａ’−Ｘ、−Ｂ−Ｚ、−Ｃ’か形成された後、産物のアリ コートか作られ、芥子りコートで段階（２）のサイクルが繰り返されるか、異な る種類のＸ（及びその対応するＺ）を各々異なるアリコートに加えることを除く 。

各アリコートの反応産物は、構造Ａ’−Ｘ、−Ｘ、−Ｂ−Ｚ、−Ｚｔ−Ｃ’を有 する。

（４）各々が産物Ａ’　Ｌ−Ｘ、　Ｂ　Ｚ＋　Ｚｓ　Ｃ’を含有するアリコート を合わせて（プールして）異なる三官能分子の混合物を形成し、混合物をアリコ ートに分けた。芥子りコートで再び段階（２）のサイクルが繰り返され、異なっ たＸ及びＺビルディングプロ・ツクを芥子りコートに加えて三官能分子産物Ａ′ ＸＩ　Ｘｔ　Ｘｔ　Ｂ　Ｚｌ　ＺＩ　Ｚｌ　Ｃ’を形成する。

−組の次のビルディングブロックのプール、分割及び付加方法が所望のポリマー の長さに基づいて位、（ｆｎ＝４．５．６６１８等で繰り返すことができる。サ イクルが繰り返されポリマーの長さが成長するので、得られたライブラリーの複 雑度も増大する。各サイクルの場合、ポリマーの長さａが１つだけ増え、従って ライブラリー複雑度は式ｖａに従って指数的に増大する。好ましい実施態様にお いては、サイクルは約１−１０回繰り返される。

関連実施態様においては、段階（１）で得られたリンカ−かまずアリコートに分 けられ、段階（２）のサイクルが芥子りコートで行われ、異なるＸ及び対応する Ｚをリンカ−に各々の異なる了りコートにおいて付加する。次いでアリコートを 前のようにプールし、段階（２）のサイクルを１以上のアリコートで繰り返すこ とができる。

即ち、（１）リンカ−又はプールをアリコートに分け、（ｉｉ）　Ｘ及びＺをリ ンカ−基質に別々のアリコートで平行付加し、（ｉｉｉ）アリコートをプールす る段階をサイクルして（繰り返して）化学単位及びその対応する単位アイデンテ ィファイア−オリゴヌクレオチドを連続して付加し、各々がリンカ−を介して対 応するアイデンティファイア−オリゴヌクレオチドに操作的に結合した異なる化 学ポリマーを有する多数の三官能分子を含むライブラリーを形成することができ る。

好ましい実施態様においては、本発明のライブラリーを形成する方法はＰＣＲプ ライマー結合部位Ｐｉ及びＰ２をライブラリーの三官能分子の各々に付加する段 階を包含する。

この方法は上記と実質的同様であるが、Ｘ及びＺを加える段階（２）のサイクル の前に段階（１）で得られたリンカ−分子に一連のヌクレオチド又は前合成Ｐ１ オリゴヌクレオチドを加えることを包含する。ライブラリーのすべての部分が同 じＰｉ配列を含んでいることから、リンカ−をアリコートに分けかつそのアリコ ートをＸ、及びＺ、を加える段階（２）のサイクルに供する前にリンカ−分子Ａ ’−Ｂ−Ｃ’のＣ′末端にＰｌを加える。得られた産物は、式Ａ’　−Ｂ−ＰＩ −Ｃ′を有する。

その後、前のように産物を分割しサイクルすると、産物Ａ’　−（Ｘ、）、−Ｂ −ＰＩ−（Ｚ、）、−Ｃ’　（ａは長さ“ａ″のポリマーの存在を示す。）の標 品を生じる。

次に、産物Ａ’　−（Ｘ、）、−Ｂ−Ｐｌ−（Ｚ、”ｌ　、−Ｃ’を含有するプ ール混合物に一連のヌクレオチド又は前合成オリゴヌクレオチドＰ２を末端Ｃ′ で付加して産物Ａ’　−（Ｘイ）、−Ｂ−Ｐｌ−（Ｚ、）、−Ｐ２−Ｃ’を形成 する。

即ちライブラリーのすべての部分が、ライブラリーの三官能分子の種類の存在に 無関係に普遍的ＰＣＲ反応を行うことができる共通配列Ｐ１及び共通配列Ｐ２を 含んでいる。

関連実施態様においては、本発明のライブラリーの作製方法は本明細書に記載さ れるようにｂｆ−ＣＰＧ固体支持体を使用する。

１、ポリペプチドライブラリー 好ましい１実施態様においては、本発明は、三官能分子がポリマーＡのポリペプ チドを有するライブラリー及びライブラリーの作製方法を企図する。

この実施態様においては、アミノ酸及びオリゴヌクレオチドを成長ポリマーに連 続して加えることに適合しうる化学は、カルボキシからアミノ末端の向きに、ま たアミノからカルボキシ末端の向きにアミノ酸ポリマーの合成を開発した。化学 は、３′から５′の向きに、また５′から３′の向きにオリゴヌクレオチドの合 成も開発した。更に、これらの合成の各々においてはアミノ酸側鎖（Ｒ基）があ る種アミノ酸残基を保護し、合成又は脱保護段階の１つでＲ基が反応性末端とな ることが好ましい。

各種の化学は、次に詳細に記載される。

合成の場合、数種のアミノ酸の反応性側鎖を保護しなければならない。下記表１ は、保護基を含有することが好ましいＲ基を有する天然アミノ酸を示すものであ る。任意の適合しうる保護（遮断）基が用いられ、特定の保護基に本発明か限定 されるべきではない。表１には好ましい保護基も示される。

表１ アミノ酸　保護基 アルギニン　Ｎ−ＭＴｒ’、　Ｎ−ＰＭＣ７ヒスチジン　Ｎ　π−Ｂｕｍ’、　 Ｓ四”、　ＦＭＯＣ，ＤＮＰシスティン　５−Ｔｒｔ”、　Ａｃｍ”、５−ｔ− ブチルトリプロファン　Ｎ’−ＣＨｏ、なし チロシン　０−ＴＢＳ’ アスパラギン酸　０−ＴＳＥ’、　ＤＪＩＩＢ”グルタミン酸　０−ＴＳＥ’、 　ＤＭＢセリン　０−ＴＢＳ’ トレオニン　０−ＴＢＳ’ リシン　Ｎ−Ｂｚ”、　ＴＦＡ”、　ＴＥＯＣ’フェニルアラニ：７　なし メチオニン　なし アラニン　なし プロリン　なし ’　ＭＴｒはＮ１−４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル である。

’　Ｂｕｍはｔｅｒｔ−ブトキシメチルである。

’　Ｔｒｔはトリフェニルメチルである。

’　ＴＢＳはｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリルエステルである。

’　ＴＳ［Ｅはトリメチルシリルエチルエステルである。

”　Ｂｚはベンジルである。

’　ＰＭＣはＮ、−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロモン−６−スルホニ ルである。

”　ＴＦＡはトリフルオロアセチルである。

’　ＴＥＯＣはβ−（トリメチルシリル）エトキシカルボニルである。

”ＳＥＭはβ−（トリメチルシリル）ニドキシメチルである。

”Ａｃｍはアセトアミドメチルである。

”ＤＭＢはジメトキシベンジルである。

保護前駆体として三官能分子に付加するのに適切な保護アミノ酸は、Ｂａｃｈｅ ｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ、（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ）、 Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂｓ（ＣＡ）及びＮｏｖａ　Ｂｉｏモ■■■ （ＣＡ）のような多くの販売業者から入手することができる。更に、保護アミノ 酸の調製はとにか〈実施例】に記載されている。

ａ、ポリペプチド合成 リンカ−基質上のポリペプチドのカルボキシからアミノ末端の向きの合成の場合 、必要に応じて便宜上保護及び脱保護することができる遊離アミノ末端が必要で ある。好ましいアミノ末端保護基はフルオレニルメトキシカルボニル基（ＦＭＱ Ｃ）である。

ＦＭＯＣ保護アミノ末端は、ポリペプチド合成に周知のジメチルホルムアミド（ ＤＭＦ）中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン又はジクロロメタン（ＤＣＭ）中１．８ −ジアザトリジクロ１５．４．０１ウンデセ−７−エンを用いて脱保護される。

アミノ酸中位は、ＦＭＯＣ保護アミノ末端及びペンタフルオロフェニルエステル （Ｏｐｆｐ）で保護されたカルボキシル末端を有する保護アミノ酸の形で又はＢ ＯＰ、ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ叉は好ましくはｐｙＢｏｐと共に用いて遊離酸を活性 化すること（−よりイ；ｊ加される。、ＢＯＰはベンゾトリアゾール−１−イル オキシトリス（ジノζ千ルアミハーホスホニウムヘキサフルオロホスフエ−１・ （カスドロ試薬）である。ＨＢＴＬＴは、２−　（ＩＨ−ベンゾトリアゾール− １−イル’）　−１，１，３，３−デトラメチル内ロニ内ムヘキサフルオロポス フェートである。ＴＢＴＵは、２−（ＩＴ（−ベンゾトリアゾール−１−イル） 　−１，１，３，、３−テトラメチルウロニウムデトラフルオロボＬ＝−）−で ある。ｐｙＢｏｐは、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス［ジメチル了 ミ、ノホスボニうムへギサフルオロホスフェート１である。付加反応（こは、ペ プチド合成に周知であるように保護アミノ酸、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ） 及びヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）が必要である。得られた産物 はＦＭＯＣ保護アミノ末端を有する付加アミノ酸残基を含み、その後前のように 保護アミノ酸が脱保護付加される。

す゛ツカー基質上ポリペプチドのアミノからカルボキシ末端の向きの合成の場合 、必要に応じて便宜−ヒ保護及び脱保護することかできる遊離カルボキシ末端か 必要である。好ましいカルボキシ末端保護／活性化基は前記０ｐｆｐである。リ ンカートのカルボキシ末端は、遊離アミノ末端を存するリンカ−とＨＯＢＴ中ス クタスクシンアミドロトン触媒とを反応させることにより作製される。その後、 ジシクロへギシル力ルポジイミド（ＤＣＣ）及びエタノール中ペンタフルオロフ ェノールど反応させて遊離カルボキシ末端に０ｐｆｐエステルを形成することに より、木端を修飾することができる。０ｐｆｐエステルは保護リンカ−末端であ り、前記のようにＦＭＯＣ−１Ｏｐｆｐ−保護アミノ酸による付加反応に有効で あるか、アミノ酸は逆方向でリンカ−に付加する。得られた産物は０ｐｆｐ保護 末端を有する付加アミノ酸残基を含存し、その後保護アミノ酸による付加を繰り 返すことオリゴヌクレオチドは、周知であるように種々の化学により合成するこ とができる。非常に良い再検討は”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔ ｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ”。

ｅｄ、　Ｍ、Ｊ、　Ｇａ１ｔ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ（１９８ ４）である。好ましいオリゴヌクレオチド合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ　［ｎｃ、　（ＡＢＩ；　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）から入 手できるような種々の自動ＤＮＡ合成機械により行われる。更にオリゴヌクレオ チド合成及びリンカ−基質上オリゴヌクレオチドの３′から５′の向きの合成の 場合、必要に応じて便宜上保護及び脱保護することができる遊離ヒドロキシ末端 が必要である。好ましいヒドロキシ末端保護基は、ジメトキシトリチルエーテル （ＤＭＴ）である。オリゴヌクレオチド合成に周知であるようにジクロロメタン （ＤＣＭ）中３％ジクロロ酢酸で処理して遊離ヒドロキシ末端を形成することに より、ＤＭＴ保護末端がまず脱保護される。

遊離ヒドロキシ末端に３′から５′の向きに付加する前駆体としてのヌクレオチ ドには、ヌク【ノオチドの３′末端にジイソプロピルホスホルアミダイトを有す るホスホルアミダイト部分が必要である。更に、ホスホルアミダイトの酸素はシ アノエチル基（ＣＮＥ）で保護さね、５′末端はＤＭＴエーテルで保護される。

５’　ＤＮＴ−１３’　−ＣＮＥ−保護ヌクレオシドホスホルアミダイトの遊離 ヒドロキシルへの付加には、オリゴヌクレオチド合成に周知であるように、アセ トニトリル中テトラゾールが必要であり、次いで（ヨウ素）酸化及び酢酸無水物 による未反応ヒドロキシルのキャップ形成が行われる。得られた産物は、ＤＭＴ 保護５′末端を有する付加ヌクレオチド残基を含有し、その後前記のように保護 ヌクレオチドを脱保護及び付加することができる。

リンカ−上オリゴヌクレオチドの５′から３′の向きの合成の場合、前記のよう にリンカ−上に遊離ヒドロキシ末端が必要である。しかしながら、付加されるべ き保護ヌクレオチドはその５′及び３′末端に逆の保護化学を有し反対の向きの 付加を容易にする。

遊離３′ヒドロキシル及び５’ＤＭＴエーテルを有するヌクレオチドはまずイミ ダゾール中ＴＢＳ−ＣＩと反応させることにより３′ヒドロキシ末端で保護され て３′末端にＴＢＳエステルを形成する。次いで、ＤＭＴ−保護５′末端が前記 のようにＤＣＭ中ＤＣＡで脱保護されて遊離５′ヒドロギシ末端を形成する。

試薬（Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルアミ力（シアノエチル）ホスホンアミシックク ロリドをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中５′脱保護ヌクレオチドと反応させて ５′末端にアミノジイソプロピル−１ＣＮＥ−保護ホスホルアミダイト基を形成 する。

その後、３’　ＴＢＳエステルをＤＣＭ中テトラブチルアンモニウムフルオリド （ＴＢＡＦ）で除去してホスホルアミダイト−保護５′末端及び遊離３′ヒドロ キシ末端を有するヌクレオチドを形成する。塩基中ＤＭＴ−ＣＩとの反応は、Ｄ ＭＴエーテル保護基を３′ヒドロキシ末端に付加する。

次いで３’　ＤＭＴ−１５’　ＣＮＥ−保護ホスホルアミダイト化ヌクレオチド の遊離ヒドロキシ末端を有するリンカ−基質への付加は、オリゴヌクレオチド合 成に周知であるように前記テトラゾール接触反応を用いて進行する。得られた産 物はＤＭＴ−保護３′末端を有する付加ヌクレオチド残基を含有し、その後保護 ヌクレオチドを前記のようにＤＣＭ中ＤＣＡで脱保護及び付加することができる 。

上記は、ポリペプチド（Ｘ）、を両方の向きで有しかつポリマーアイデンティフ ァイア−オリゴヌクレオチド（Ｚ）、を両方の向きで有する本二官能分子を合成 することができることを示すものである。具体的には、３′末端を介してリンカ −に結合したオリゴヌクレオチドを有しかつカルボキシ末端を介してリンカ−に 結合したペプチドを有する三官能分子のライブラリーを形成する詳細に記載され る合成である。

好ましいｌ実施態様においては、付加後付加アミノ酸が遊離アミノ末端を存する 、即ちポリマーがカルボキシからアミノ末端の向きに構築されるように、合成順 序がリンカ−のポリペプチドを配向させる。この合成の具体的化学は実施例に記 載されている。

単一ヌクレオチドよりオリゴヌクレオチドの成長ポリマーアイデンティファイア −ヌクレオチド配列への付加は別の実施態様であり、ライブラリーの急速かつ調 節構築を与えることから好ましい。前述の合成は単一ヌクレオチド塩基単位を含 んでいるが、オリゴヌクレオチドが付加されるべき場合同様の保護基及び付加化 学があてはまる。

５’　ＣＮＥ保護及び３’ＤＭＴ保護末端を有するが又は３’　ＣＮＥ保護及び ５′Ｄ　Ｍ　Ｔ’ｆｆｌ護末端を有するオリゴヌクレオチドの合成は、一般に利 用できカリ本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド合成法を用いて容易に調製 することができる。

三官能分子又は分子ライブラリーの合成後、末端及びアミノ酸側鎖の保護基が除 去される。末端か相対的に不安定であることから、機能性、特に側鎖機能性を保 存するように脱保護順序が選ばれることが好ましい。

ポリペプチドライブラリーの好ましい本実施態様においては、実施例２−３に記 載されているテフロン支持体及び５’　ＢＣＭ３を用いる場合下記順序の脱保護 が好ましい： ｌ）テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）処理してＴＢＳ及び７Ｍ Ｓエチルエーテルを除去する： ２）ＭＴｒ、Ｂｕｍ、ＰＭＣ及びＴｒｔ基を除去するのに十分なトリフルオロ酢 酸（ＴＦＡ）で簡単に５分処理し、次いでトリエチルアミンで５分間中和する： ３）アンモニア水処理してＢｚ及びＣＮＥ基を除去する：及び４）過ヨウ素酸酸 化を用いて固体支持体から三官能分子を切断する。

また、下記順序の脱保護が光活性的に切断可能なリンカ一部分のあり又はなしの 実施例３に記載されているＣＰＧリンカ−について用いられる：１）ＴＢＡＦ処 理してＴＢＳ及び７ＭＳエチルエーテルを除去する：及び２）アンモニア水処理 してＢｚ及びＣＮＥ基を除去する。

示されるように、ライブラリーを合成した後及び保護基が除去された後、三官能 分子か固体支持体から切断さ札遊離したこ官能分子を固体支持体から分離して複 数の三官能分子を含む溶液を形成する。また、固相中複数の三官能分子の形でラ イブラリーが維持される。

実施例において天然アミノ酸が用いられるが、本発明はそのように限定されるべ きでない。可能なアミノ酸残基のアルファベットは、アミノ酸を定義する基礎化 学、即ちカルボキシル及びアミノ末端を満足させる分子を包含するように拡大さ せることができる。重合の際にアミド結合が形成される。即ち、可能なアミノ酸 には医薬的に活性な分子のようなし一アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、天然アミノ酸、 非天然アミノ酸及びその誘導体が含められる。

更に、末端を慣用的なアミノ酸構造に結合するポリペプチドバックボーンを限定 する根拠はない。アミノ酸及びカルボン酸部分は、側鎖基が本明細書に記載され るように適切に保護される限り、側鎖置換基を存するバックボーン上にある。

チアゾール−アラニン又はプリン−アラニンのような特異複素環のようなヘテロ 原子を存する本発明で用いることができる前に記載のないアミノ酸も開発される 。

慣用的及び特異アミノ酸の双方の構造を開発及び使用すると、本発明のライブラ リーの化学部分の多様性が大きくなる。そのようなライブラリーは、重要なコア 化学構造の新規な組合わせの本発明のスクリーン方法により探索することができ る。

典型的なバックボーンは、（ＣＨ２）、（ｎは１〜少なくとも６である。）のア ルキル鎖とすることができる。更に、アルファベットはα、β又はγアミノ酸の ような種々のバックボーン構造を有するアミノ酸を含むことができる。アルファ ベットは、バックボーン内の炭素原子数及びその配置を変動させることかできる アミノ酸も含むことができる。

Ｃ０化学構造の同定方法 本発明のライブラリ・−は、化学構造の同定を容易にする遺伝的垂れはしに各化 学部分を結合するように化学多様性の集積を与える。

本スクリーニング方法により、一度に１種合成するかあるいは予め相互作用を知 ることを必要とせずに異種化学単位の組合わせ結合によってランダムに形成され た構造の集積を抜き取るどにより、生物活性分子との相互作用又は化学触媒事象 を結合する際に関与する最適化化学構造を同定することができる。

従って、本発明はまた化学構造と生物活性分子との間に前選択結合又は触媒相互 作用に関与する化学構造の同定方法を企図するものである。同定されるべき化学 構造は本発明のライブラリ一部分の１種で表され、本方法は下記段階を含むもの である二 （１）本発明によるライブラリーを前選択生物活性分子と結合条件下（即ち、結 合反応混合物）生物活性分子がライブラリーに存在する本発明の少なくとも１種 の三官能分子と相互作用するのに十分な時間混合する。

（２）次いで結合反応複合体をライブラリー混合物から単離して単離複合体を形 成する。

（３）単離結合反応複合体に存在するポリマーアイデンティファイア−オリゴヌ クレオチドのヌクレオチド配列を決定する。ヌクレオチド配列は結合反応に関与 する化学構造を定義するコードを示すので、配列が生物活性分子との結合反応に 関与する化学構造を同定するを決定する。

触媒が同定されるべき活性かある場合、反応体を同定して触媒事象の存在を示す ことができ、ライブラリーの原因固体支持体が候補的触媒分子として選択される 。

前選択結合相互作用又は触媒反応を示す典型的な生物活性分子は、抗原に対する 抗体、オリゴ糖に対するレクチン、リガンドに対するレセプター、基質に対する 酵素及び分子相互作用の類似の媒体のようなもう１つの分子に選択的に結合及び ／又は反応する種々の分子のいずれかとすることができ、プロテアーゼのような 触媒分子とすることができる。従って、前選択結合相互作用はライブラリ一部分 が結合されるべき生物活性分子の選択により定義される。同様に、前選択触媒活 性はライブラリ一部分が触媒的に活性な物質を選択することにより定義される。

結合反応は具体例として述べられるが、その手順を触媒ポリマーを検出するため に使用するのに容易に適応することができることは理解される。

１、結合反応混合物 本発明のライブラリーと生物活性分子との混合物は、不拘−又は均一混合物の形 態とすることができる。即ち、ライブラリ一部分は液相に存在する生物活性分子 と共に固相とすることかできる。また、生物活性分子は液相に存在するライブラ リ一部分と共に固相とすることができる。また更に、ライブラリ一部分と生物活 性分子の双方か液相とすることもできる。

結合条件は、生物活性分子の既知の自然結合機能と適合しうる条件である。適合 しつる条件は生物活性分子の生物活性を維持するバッファー、ｐＨ及び温度条件 であり、それにより前選択結合相互作用に関与する分子の能力を維持する。典型 的には、条件としては通常問題の生物活性分子と結合されるｐＨ及びイオン強度 を有する生理的水溶液がある。

例えば、結合相互作用が抗体分子を結合することができるライブラリーの一部を 同定する場合、好ましい結合条件は免疫原又は既知の免疫反応抗原と免疫反応す る抗体に適した条件である。レセプター分子の場合、結合条件はレセプター−リ ガンド相互作用の測定と適合しうるちのである。

混合物が結合反応複合体を形成するのに十分な時間は、典型的には相互作用と適 合しつる条件下生物活性分子が通常の結合パートナ−と相互作用するのに要した 時間である。その分子に基づいて時間を変動させることができるが、混合時間は 典型的に少なくとも数分、通常数時間より長くないが、より長い混合時間を用い て結合反応複合体が形成することを除外することはなにもない。

結合反応複合体は、生物活性分子と本発明の三官能分子との間の相互作用の安定 な産物である。この産物は、複合体が著しく解離されることになることなく複合 体がライブラリーの残りの部分から単離することができる十分な時間にわたって 相互作用が維持される点で安定な産物を意味する。

２、三官能分子の結合反応混合物からの単離結合反応複合体は複合体に選択的な 分離手段により結合反応混合物から単離され、それにより生物活性分子に結合し たその種類の三官能分子を単離する。生物活性分子の状態により、種々の分離手 段がある。

例えば、生物活性分子は固相試薬として、少なくとも固体支持体に付着した混合 物で得ることができるので、液相から容易に分離することができ、それにより大 部分の種類の三官能分子を除去することができる。固相の結合反応混合物からの 分離には、固相から結合親和性の低い三官能分子をすすぐために固体支持体の洗 浄が任意に伴われる。

また、均一液状結合反応混合液の場合、生物活性分子に特異的な二次結合手段を 使用して分子を結合するとともに結合反応混合液からその分離を得ることができ る。

例えば、生物活性分子に免疫特異的な固定化抗体は結合反応複合体か形成された 後結合反応混合液に対して固相付着抗体として得ることができる。固定化抗体は 、結合反応混合液に存在する生物活性分子と免疫反応して抗体−生物活性分子免 疫反応複合体を形成する。その後、同相を結合反応混合液から分離することによ り免疫反応複合体、従って任意の結合反応複合体が混合液から分離されて単離三 官能分子を形成する。

を容易にする。具体的な結合手段は次の高親和対：ビオチンーアビジン、プロテ ィン−Ｆｃレセプター、フェリチン−磁気ビーズ等の１種である。即ち、生物活 性分子をビオチン、プロティンＡ、フェリチン及び類似の結合手段に操作的に結 合（複合）し、固相中対応する結合パートナ−１例えば固相アビジン、固相Ｆｃ レセプター、固相磁気ビーズ等を使用することにより結合反応複合体が単離され る。

タンパク質性分子を操作的に結合するために固体支持体を使用することは、一般 的に当該技術において周知である。有効な固体支持体基質は当該技術において周 知であり、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｉｓｃａｔ ａｗａｙ、　ＮＪ）製の商品名５ＥＰＨＡＤＥＸのような架橋デキストラン：直 径約１ミクロンから約５ミリメートルのアガロース、ボロシリケート、ポリスチ レン又はラテックスビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリル アミド、ニトロセルロース又はナイロン系ウェブ、例えばシート、ストリップ、 パドル、プレートマイクロタイタープレートウェル及び類似の不溶性基質が挙げ られる。

３、アイデンティファイア−配列の決定単離した三官能分子に存在するアイデン ティファイア−オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定して触媒反応の前 選択結合相互作用に関与する化学部分の種類を同定する。

慣用のＤＮＡ配列決定法はこの決定に容易に利用できかつ有効であるが、単離し た三官能分子の量及び質には配列決定反応の前に追加の操作が必要である。

量が少ない場合には、アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドに存在するプ ライマーＰＩ及びＰ２に対するＰＣＲプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）によってアイデンティファイア−オリゴヌクレオチドの量を増加させ ることが好ましい。

更に、単離した二宮能分子の質は、複数種の三官能分子が同様の生物活性分子結 合能によって同時単離されるようなものである。１種以上の三官能分子が単離さ れる場合、単離した異なる種類をアイデンティファイア−オリゴヌクレオチドの 配列決定する前に分離しなければならない。

即ちｌ実施態様においては、単離三官能分子の異なるアイデンティファイア−オ リゴヌクレオチドはＤＮＡ配列決定法により配列を決定する前に別個の配列決定 用ベクターにクローン化される。これは、典型的には本明細書で記載されるＰＣ Ｒにより異なるアイデンティファイア−すりゴヌクレオチドのすべてを増幅し、 次いで図１に示されているように増幅産物のユニークな制限エンドヌクレアーゼ 部位を用いて増幅フラグメントを配列決定用ベクターに方向的にクローン化する ことにより行われる。その増幅フラグメントのクローン化及び配列決定は、当該 技術において既知の多くの分子生物学的方法によって行うことができる通常の手 順である。

また、単離した三官能分子の集団から誘導されたＰＣＲ増幅産物をハイブリ・ノ ド゛形成ブ１１−ブとして用いて単離した三官能分子の質を選択的に強化するこ とかできる。例えば、図１に示されるようにビオチニル化で修飾される／’ｔイ ブリ・ソド形成プローブを用いて、ハイブリッド形成によりライブラリ一部分を 単離して上記ハイブリッド形成ブロー・ブに対してハイブリッド形成する配列を 存する三官能分子のみ含有する強化ライブラリーを形成することができる。異な った結合条件、例えばより高い厳密な結合条件下第２スクリーン反応において、 生物活性分子と最も強く結合する三官能分子の種類を単離することかできる。

即ち、化７多様性をスクリーンする強化ライブラリーを形成するためにライブラ リーを操作することができる。

４、ポリメラーゼ連鎖反応 本発明の方法の一部として単離した複合体中のアイデンティファイア−オリゴヌ クし・オチドのヌクしノオチド配列を決定する場合、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）の使用は好ましい実施態様である。

本発明において使用する場合、アイデンティファイア−すりゴヌクレオチドはｍ ＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡのセンス鎖のようなポリヌクレオチドコーディン グ鎖を含んでいる。分析されるべき遺伝物質は二本ＭＤＮＡの形である場合には 、まず典型的には溶融により一本鎖に変性される。対の各部分か前選択ヌクレオ チド配列を有するＰＣＲプライマー対で試料を処理（接触）することにより、核 酸をＰＣＲ反応に供する。ＰＣＲプライマー対は、長さが少なくとも約１０ヌク レオチドであることが好ましく、長さが少なくとも約２０ヌクレオチドであるこ とが更に好ましいアイデンティファイア−ヌクレオチドのヌクレオチド配列上の ＰＣＲプライマー結合部位に対してハイブリッド形成することによりプライマー 伸長反応を開始することができる。ＰＣＲプライマー対の第１プライマーは、核 酸の非ニーディシング又はアンチセンス鎖、即ちコーディング鎖に相補的な鎖に 対してハイブリッド形成することから、本明細書ではしばしば“アンチセンスプ ライマー”と呼ばれる。ＰＣＲプライマー対の第２プライマーは、核酸のコーデ ィング又はセンス鎖に対してハイブリッド形成することから、“センスプライマ ー”と呼ばれる。

ＰＣＲ反応は、ＰＣＲプライマー対、好ましくはその所定量と試料の核酸、好ま しくはその所定量とをＰＣＲバッファー中で混合してＰＣＲ反応混合液を形成す ることにより行われる。混合液をＰＣＲ反応産物の形成に十分な典型的には予め 決定された多数のサイクルに熱循環し、それにより単離された複合体中のアイデ ンティファイア−すりゴヌクレオチドを分析されるべき試料を強化する。

ＰＣＲは、典型的には熱循環、即ち低限が約３０度摂氏（３０°Ｃ）から約５５ °Ｃまでであり上限が約９０〜約１００℃である温度範囲内でＰＣＲ反応混合液 の温度を繰り返し上昇及び降下することにより行われる。上昇及び降下は連続的 であるが、ポリヌクレオチド合成、変性及びハイブリッド形成を容易にする各温 度における相対温度の安定性の時間によって相的である。

複数の第１プライマー及び／又は複数の第２プライマーを各増幅において用いる ことができ、例えば第１プライマーの１種を多数の異なる第２プライマーと対に なっていくつかの異なるプライマー対を形成することかできる。また、個々の第 １及び第２プライマー対を用いることができる。いずれの場合にも第１及び第２ プライマーの同種又は異種組合わせを用いた増幅の増幅産物は突然変異を分析す るために混合することができる。

ＰＣＲ反応は、任意の適切な方法を用いて行われる。通常、緩衝化した水溶液、 即ちＰＣＲバッファー、好ましくはｐＨ７−９、最も好ましくは約８で起こる。

好ましくはプライマーのモル過剰量が鋳望鎖を含むバッファーに混合される。ブ ロセスの効率を改良するためには多量のモル過剰量が好ましい。

ＰＣＲバッファーは、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ポリヌクレ オチド合成基質）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ並びに典型的には 熱安定性のポリメラーゼをすべてプライマー伸長（ポリヌクレオチド合成）反応 に十分な量で含存する。得られた溶液（ＰＣＲ混合液）を約９０−１００°Ｃま で約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間加熱する。この加熱時間の後、この溶 液をブライマーハイブリッド形成に好ましい５４℃まで冷却する。合成反応は、 室温からポリメラーゼ（誘導剤）がもはや効率よく機能しない温度まで生じる。

即ち、例えばＤＮＡポリメラーゼが誘導剤として用いられる場合には、温度は通 常約４０℃より高くない。熱循環は、ＰＣＲ産物の所望量が作製されるまで繰り 返される。具体的なＰＣＲバッファーは次のものを含んでいる：バッファー１０ ０ミクロリットル（μｌ）当たり５０閥ＫＣ１；　ｐＨ８，３のｌＯ繭トリス− ＨＣ１；　１．５ｍＭＭｇ　Ｃ１ｔ＋０．００１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ゼラチン、 ２００ｔｔＭ　ｄＡＴＰ　；２００μＭｄＴＴＰ；２００μＭｄＣＴＰ、２００ μＭｄＧＴＰ；及び２．５単位サーマスアグアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｇｕ ａ　ｔ　１ｃｕｓ）　（Ｔａｇ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■（米国特許第４． ８８９．８１８号）。

誘導剤は、酵素のようなプライマー伸長産物の合成を行うために機能する任意の 化合物又は系である。この目的のために適切な酵素としては、例えばＥ、コリＤ ＮＡポリメラーゼＩ％Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメント、 Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の有効なりＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素及び各核 酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成する適切な方法においてヌクレオチド の組合わせを容易にする熱安定酵素のような他の酵素が挙げられる。通常、合成 は各プライマーの３′端で開始し、鋳型鎖に沿って５′の方向に合成が終結する まで進行し、異なる長さの分子を作製する。しかしながら、上記と同じプロセス を用いて５′端で合成を開始し−Ｆ記の方向に進行する誘導剤がある。

誘導剤はまた、酵素のようなＲＮΔプライマー伸長産物の合成を行うために機能 する任意の化合物又は系である。好ましい実施態様においては、誘導剤はＤＮＡ 依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメ ラーゼ又は５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼである。これらのポリメラーゼは相補的Ｒ ＮＡポリヌクレオチドを作製する。ＲＮＡポリメラーゼの高代謝回転速度が、Ｃ ｈａｍｂｅｒｌ　ｉｎら、　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　ｅｄ、Ｐ、　Ｂｏｙｅ ｒ、ｐｐ、　８７−１０８．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ唐刀A　Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ　（１９８２）に記載されているように出発ポリヌクレオチドを増幅す る。転写に基づく増幅系は、Ｇｉｎｇｅｒａｓら、　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ 、　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 、ｐｐ、　２４５−２５２．　Ｉｎｎ１ｓら、　ｅｄｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、Ｓａｎ　cｉｅｇｏ。

ＣＡ　（１９９０）に記載されている。

誘導剤がＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、従ってリボヌクレオチドトリ ホスフェートを取込む場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰＳＧＴＰ及びＵＴＰの十分な量 がプライマー伸長反応混合液に混合さね、得られた溶液は上記のように処理され る。

新たに合成された鎖及びその相補的核酸鎖はプロセスの次の段階で用いることが できる二本鎖分子を形成する。

ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４．６８３．１９２号、同第４．６８３．２０２号 、同第ら、ｅｄｓ、、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、 　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　（１９９０）のような少なくともいくつかのテキスト に詳細に記載されている。

プライマー伸長によって合成されるべきプライマー、プローブ及び核酸フラグメ ント又はセグメントに関して、本明細書で用いられる２ポリヌクレオチド“なる 語は、２個以上、好ましくは３個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌク レオチドを含む分子として定義される。その正確なサイズは多くの要因に左右さ ね、また最後の使用条件に左右される。

本明細書で用いられる“プライマー”なる語は、核酸制限消化物から精製された か合成的に作製されたポリヌクレオチドを意味し、核酸鎖に相補的なプライマー 伸長産物の合成が誘導される条件下、即ちヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼ、 逆転写酵素等の重合用剤の存在下及び適切な温度とｐＨに置かれた場合に核酸合 成の開始点として作用することできる。プライマーは最大効率の場合−重鎖か好 ましいが、二本鎖の形でもよい。二本鎖の場合には、プライマーは伸長産物を調 製するために用いる前にそれを相補鎖から分離するようにまず処理される。プラ イマーはポリデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、 重合用剤の存在下に伸長産物の合成を開始するのに十分に長くなければならない 。

プライマーの正確な長さは、温度及びプライマー源のような多くの要因に左右さ れる。例えば、標的配列の複雑度により、ポリヌクレオチドブライマーは典型的 には１５〜２５個以上のヌクレオチドを含むがそれより少ないヌクレすチドを含 むこともできる。短いプライマー分子には通常鋳型と十分に安定な／％イブリッ ドを形成するために低い温度が必要である。

々の鎖に“実質的（ご相補的であるように選択される。これは、プライマーが各 々の鋳型鎖とランダムにでなくハイブリッド形成するのに十分に相補的でなけれ ばならないことを意味する。従って、ブうイマ・−配列は鋳型の正確な配列を反 映してもしなくてもよい。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントはプライ マーの５′端に結合することができ、プライマー配列の残りは鎖に実質的に相補 的である。そのような非相補的フラグメントは典型的にはエンドヌクレアーゼ制 限部位をコードする。また、プライマー配列が非ランダムにハイブリツド形成す るために合成又は増幅されるへき鎖の配列と十分な相補性を育し、それによりポ リヌクレオチド合成条件下に伸長産物を形成するのであれば、非相補的塩基又は 長い配列をプライマーに散在させることができる。

本発明のプライマーは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーシーロモーター配列又Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ（１９８９）参照。

ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを用いる場合、 プライマーは増幅されるべきポリヌクレオチド鎖に対してハイブリッド形成され 、のような誘導剤を用いて終わる。出発ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレ オチドとＤＮＡポリヌクレオチドの作製を交互にすることにより増幅される。

プライマーは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの鋳型配列又は複製開始部位を 含むこともできる。典型的なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼには、Ｌｉｚａｒ ｄｉら、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１１９７−１２０２　（１９８８ ）に記載されているＱＢレプリカーゼかある。ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ、鋳型 配列又は複製開始部位を含む少数の鋳型ＲＮＡ鎖から多数のＲＮＡ鎖を作製する 。こわらのポリメラーゼは、典型的にはＫｒａｍｅ　ｒら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉｏｌ、、　８９ニア１９−７３６（１９７４）に記載されているように鋳型鎖 を１００万倍増幅する。

ポリヌクレオチドブライマーは、例えばホスホトリエステル又はホスホジエス（ １９７９）参照。

単離複合体のアイデンティファイア−オリゴヌクレオチドの核酸試料がＰＣＲ増 幅によって強化されるべきである場合には、２つのプライマー、即ちＰＣＲプラ イマー対を増幅されるべき核酸の各コーディング鎖に用いなければならない。

第１プライマーは非コーディング（アンチセンス又はマイナス又は相補）鎖の一 部になり、プラス又はコーディング鏡上のヌクレオチド配列に対してｔｚｄブ１ ルソド形成する。第２プライマーは、コーディング（センス又はプラス〉鎖の一 部になり、マイナス又は非コーディング鎖上のヌクレオチド配列に対して）１イ ブリ・ソド形成する。第４及び第２プライマーの一方又は双方は、本明細書に記 載されるエンドヌクレアーゼ認識部位を定義するヌクレオチド配列を含むことが できる。

この部位は増幅されるポリマーアイデンティファイア−オリゴヌクレオチドの異 型である。

ｌ実施態様においては、本発明はプライマーの３′末端に位置する開始領域を有 するプライマーを形成する１組のポリヌクレオチドを利用する。開始領域は、典 型的には３′端（３′末端）１５〜３０ヌクレオチド塩基である。各プライマー の３′末端開始部分は、核酸の合成を触媒する、即ちプライマー伸長反応をその ３′末端から開始するプライマーとして作用することができる。プライマーの一 方又は双方は、更に５′末端（５′端）非開始部分、即ち好ましい鋳型に対する ハイブリッド形成に関与しない領域を含むことができる。

５、核酸配列分析 核酸配列分析は、ヌクレオチド配列を決定する周知の手順であり、本発明のアイ デンティファイア−オリゴヌクレオチド又はＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列 を決定するために本方法に適用される。核酸配列分析は、（ａ）プローブ鎖及び その相補的標的のハイブリッド形成又は変性に基づく物理化学的手法及び（ｂ） エンドヌクレアーゼ、リガーゼ及びポリメラーゼとの酵素反応の組合わせによっ て行われる。

核酸ハイブリッド形成を用いる分析において、本発明の方法のＤＮＡ二重らせん の存在の検出は種々の手段により行われる。

ＤＮＡ二重らせんの存在を検出する１方法においては、ＤＮＡ二重らせんでハイ ブリッド形成するオリゴヌクレオチドには検出できる二重らせんを与える標識又 は指示基を包含する。典型的には、そのような標識としては放射性原子、化学的 修飾ヌクレオチド塩基等が挙げられる。

オリゴヌクレオチドを標識、即ち指示手段又は基に操作的に結合し、標識鋳型に おける特定のヌクレオチド配列の存在を検出するために使用することができる。

オリゴヌクレオチドプローブ（標識オリゴヌクレオチド）の一部に操作的に結合 した又は存在した放射性元素は、ＤＮＡ二重らせんの検出を容易にする有効な手 段となる。典型的な放射性元素は、β線放射を生じるものである。β線を放射す る元素、例えばＨ，＋４Ｃ，”Ｐ及び３″Ｓはβ線放射発生放射性元素標識の種 類を表す。放射性ポリヌクレオチドプローブは、ＤＮＡキナーゼを用いる放射性 標識ヌクレオチドの核酸への酵素取込みにより典型的に調製される。

別の放射性標識オリゴヌクレオチドは、金属錯体形成剤、ビオチン含存基、蛍光 化合物等を含むように化学的に修飾されるオリゴヌクレオチドである。

有効な金属錯体形成剤はランタニド及び芳香族βジケトンによって形成されたラ ンタニドキレートであり、該ランタニドは蛍光ランタニド複合体を形成されるよ うにＥＤＴＡ類縁体のようなキレート形成化合物を介して核酸又はオリゴヌクレ オチドに結合される。米国特許第４．３７４．１２０号、同第４．５６９．７９ ０号及び公開欧州特許出願第０１３９６７５号及び国際出願第８７１０２７０８ 号参照。

ポリヌクレオチドを標識するビオチン又はアクリジンエステル標識オリゴヌクレ オチド及びその使用か記載されている。米国特許第４．７０７．４０４号、公開 欧州特許出願第０２１２９５１号及び欧州特許第００８７６３６号参照。有効な 蛍光マーカー化合物としては、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、 ＮＢＤ等が挙げられる。

ＤＮＡ二重らせんに存在する標識オリゴヌクレオチドは二重らせん自体を標識し 、従って分析されるべき試料に存在する他の核酸より区別できる。二重らせんの 標識の存在、それにより二重らせんの存在の検出は、典型的にはＤＮＡ二重らせ んに対してハイブリッド形成されない標識オリゴヌクレオチドプローブからＤＮ Ａ二重らせんを分離することを含んでいる。

非ハイブリッド形成標識オリゴヌクレオチドプローブのような一末鎖オリゴヌク レオチドをＤＮＡ二重らせんから分離する技術は周知であり、典型的には二本鎖 核酸から１本鎖をそれらの化学的性質に基づいて分離することを含んでいる。

更にたいてい分離技術は、非ハイブリッドプローブを不溶性基質に結合するＤＮ Ａ二重らせんから典型的には洗浄により分離する不均一ハイブリッド形成方式の 使用を含んでいる。具体的にはサザンプロット法であり、基質はニトロセルロー スシートであり標識は＊ｔＰである。５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉｏｌｌ、９８：５０３　（＋９７５）。

オリゴヌクレオチドは、また典型的には５′末端で又はその近傍で固体基質、即 ち前記不溶性水性固体支持体に結合されることが有利である。

“結合”ヌクレオチドを５′又は３′端のオリゴヌクレオチド部分に加え、その 部分を固体支持体に操作的に結合するために結合オリゴヌクレオチドを使用する ことも可能である。

ヌクレオチドハイブリッド形成分析においては、鋳型上の所定の配列に対して相 補性を有するオリゴヌクレオチドが鋳型に存在する相補的核酸配列に対してハイ ブリッド形成するのに十分な時間のハイブリッド形成条件下企図された方法でハ イブリッド形成反応混合液を維持してハイブリッド形成産物、即ちオリゴヌクレ オチド及び標的核酸を含有する複合体を形成する。

維持時間に関して用いられる“ハイブリッド形成条件”なる語及びその文法上の 相当語は、混合液中反応体と付随試薬の濃度の関係において、ハイブリッド形成 反応混合液を１種以上のすりゴヌクレオチドが標的配列とアニールするのに十分 な時間、温度及びｐＨ条件に供して核酸二重らせんを形成することを示すもので ある。ハイブリッド形成を行うために必要とされるそのような時間、温度及びｐ Ｈ条件は、当該技術において周知のように、ハイブリッド形成されるべきオリゴ ヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドと標的との間の相補性の程度、オリゴ ヌクレオチドのグアニン及びシトシン含量、所望のハイブリッド形成の厳密性及 びハイブリッド形成速度論に影響するハイブリッド形成反応混合液中の塩又は追 加試薬の存在に左右される。一定のハイブリッド形成反応混合液のハイブリッド 形成条件を最適化する方法は、当該技術において周知である。

典型的なハイブリッド形成条件は、ｐＨ値４〜９に緩衝化した溶液の使用を包含 し、４〜３７°Ｃ１好ましくは約１２〜約３０°Ｃ，−更に好ましくは約２２° Ｃの温度で０，５秒〜２４時間、好ましくは２分（ｍｉｎ）〜１時間行われる。

具体的には実施例４に記載される条件である。

ハイブリッド形成は、周知のように均−又は不均一方式で行うことができる。

均一ハイブリッド形成反応は、溶液中で完全に生じ、ハイブリッド形成（標的） されるべきオリゴヌクレオチドと核酸配列の双方か溶液中可溶形態で存在する。

不均一反応は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドプローブ又は標的核酸が 結合される反応媒体に不溶な基質の使用を含んでいる。

標的配列を含む核酸か二本［１（ｄｓ）形態である場合、ハ・イブリッド形成反 応を行う前に加熱又はアルカリ処理のようにまずｄｓＤＮＡを変性することが好 ましい。ｄｓＤＮＡの変性は、ハイブリッド形成されるべきすりゴヌクレオチド と混合する前に行われるか又はｄｓＤＮＡとオリゴヌクレオチドどの混合した後 に行うことかできる。

ハイブリッド形成反応混合物に存在するオリゴヌクレオチドの有効量は通常周知 であり、典型的にはハイブリッド形成されるべきオリゴヌクレオチドと鋳型との 間のモル比率によって表される。好ましい比率は、標的配列とオリゴヌクレオチ ドの等モル量を含むハイブリッド形成反応混合物である。周知のように、等モル 濃度からの偏差は、低効率であるがハイブリッド反応産物を生じる。即ち、ｌ成 分が他の成分に相対して１００倍モル過剰はどにあることができる比率であるが 、５０倍モル未満、好ましくは１０倍未満、更に好ましくは２倍過剰量が本発明 を実施するに当たり好ましい。

害廊他 下記実施例は、本発明を具体的に説明するものであるが、限定するものではない 。

１、保護アミノ酸の調製 三官能分子の合成には、保護アミノ酸が必要である。アミノ酸のアミノ末端はフ ルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）で保護され、カルボキシ末端はペン タフルオロフェニルエステル（Ｏｐ　ｆ　ｐ）で保護される。アミノ酸リシン、 システィン、チロシン、セリン、トレオニン、アルギニン、ヒスチジン、トリプ トファン、アスパラギン酸及びグルタミン酸には、その側鎖（Ｒ基）保護の追加 が必要である。

はとんどのＦＭＯＣ及び○ｐｆｐ保護アミノ酸は市販されており、Ｂａｅｈｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ、（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ）か ら入手した。本明細書で用いられるその構造に対する用語は、グリシン（Ｇｌｙ ）の場合法の例＋ＦＭＯＣ−Ｇ１ｙ−Ｏｐｆｐで示され、ＦＭＯＣ及び０ｐｆｐ はアミノ及びカルボキシ末端保護基である。側鎖保護の場合、次の保護アミノ酸 はＢａｃｈｅｍから入手できる：アルギニンの側鎖アミノ末端に置換基Ｎ’−４ −メトキシ−２，３，６−ドリメチルベンゼンスルホニルアルギニン（ＭＴｒ） を有するＦＭＯＣ−Ａｒｇ　（ＭＴｒ）−Ｏｐｆｐ；ヒスチジン内の複素環反応 性窒素に置換基Ｎπ−ｔｅｒｔ−ブトキシメチルヒスチジン（Ｂｕｍ）を有する ＦＭＯＣ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｕｍ）−Ｏｐｆｐ　；システィンの側鎖イ才つに置換 基ｓ−トリフェニルメチルシスティンを有するＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｔｒ　ｔ）− ０ｐｆｐ　；　トリプトファンの複素環基のアミノ基にホルミル基を有するＦＭ ＯＣ−Ｔ　ｒ　ｐ　（Ｎ−Ｆ　ｏ　ｒ）　−Ｏｐ　ｆ　ｐ　；及びリシン側鎖の 遊離アミノ基にベンジル基を有するＦＭＯＣ−Ｌｙｓ　（Ｎ−Ｂｚ）−Ｏｐｆ　 ｐ：括弧内の構造は反応性側鎖の保護基を示す。

チロシンの側鎖ヒドロキシにｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）エステ ルを有するＦＭＯＣ−Ｔｙｒ　（ＯＴＢＳ）−０ｐｆｐは、過剰量のギ酸とＦＭ ＯＣ−Ｔｙｒ　（ｔｅｒｔ−ブチル）　−０ｐ　ｆ　ｐ　（Ｂａｃｈｅｍ）と反 応させて保護ヒドロキシ基からｔｅｒｔ−ブチル基を除去してＦＭＯＣ−Ｔｙｒ −Ｏｐｆｐを形成することにより調製される。その後、１当量のＦＭＯＣ−Ｔｙ ｒ−Ｏｐｆｐを１．２当量のＴＢＳ−ＣＩ及び１．５当量のイミダゾールとＤＣ Ｍ中不活性雰囲気下室温で１２時間反応させてＦＭＯＣ−Ｔｙｒ　（ＯＴＢＳ） −０ｐｆｐを形成する。

ＦＭＯＣ−３ｅｔ　（ＯＴＢＳ）−Ｏｐｆ　ｐは、同様に反応にＦＭＯＣ−３ｅ ｔ（ｔｅｒｔ−ブチル）　−０ｐ　ｆ　ｐ　（Ｂａｅｈｅｎ＋）を用いて調製さ れる。ＦＭＯＣ−Ｔｈｒ（ＯＴＢＳ）−Ｏｐｆｐもまた、ＦＭＯＣ−Ｔｈｒ　（ ｔｅｒｔ−ブチル）−０ｐｆｐ（ｈｃｈｅ＋＋＋）を用いてこの方法で調製され る。

アスパラギン酸の側鎖カルボキシル基にトリメチルシリルエチルエステル（ＴＭ ＳＥ）を有するＦＭＯＣ−Ａｓ　ｐ（ＴＭＳＥ）−Ｏｐｆ　ｐは、まず１当量の ＦＭＯＣ−Ａｓ　ｐ−０−ｔｅｒｔブチル（Ｂａｃｈｅｍ）と１．５当量の２− トリメチルシリルエタノール及び１．５当量のジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ ）とを酢酸エチル中不活性雰囲気下室温で１２時間反応させてＦＭＯＣ−Ａｓｐ 　（ＯＴＭＳＥ）−０−ｔｅｒｔ−ブチルを形成することにより調製される。そ の後、ＴＭＳＥエステルを過剰量のギ酸と室温で１４時間反応させてｔｅｒｔ− ブチル部分を加水分解するとともにＦＭＯＣ−Ａｓｐ　（ＯＴＭＳＥ）−ＣＯＯ Ｈの形の遊離カルボキシル末端を形成する。ギ酸を蒸発し、１当量の残りのアミ ノ酸を１．１当量のペンタフルオロフェノール（ｐ　ｆ　ｐ　：　Ｂａｅｈｅｍ ）及び１．１当量のＤＣＣと不活性雰囲気下室温１２時間混合して産物ＦＭＯＣ −Ａｓｐ　（ＴＭＳＥ）−Ｏｐｆ　ｐを形成する。、二の産物は、ヘキサン中ｌ Ｏ％（Ｖ／Ｖ）酢酸エチルを用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより未反応 ｐｆｐ、ＤＣＣ及び前駆体アミノ酸から単離される。

グルタミン酸の側鎖カルボキシル基にＴＭＳＥエステルを存するＦＭＯＣ−Ｇｌ ｕ　（ＴＭＳＥ）−Ｏｐｆｐは、アスパラギン酸前駆体の代わりにＦＭＯＣ−Ｇ 　ｌ　ｕ−０−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂａｃｈｅｍ）を用いる以外はＦＭＯＣ−１ ＴＭＳＥ及びｐｔｐ保護アスパラギン酸を調製する上記のように調製してＦＭＯ Ｃ−Ｇ１　ｕ　（ＴＭＳＥ）　・−０ｐｆｐを形成する。

Ｎａ−（５’−０−ジメトキシトリチル−２’、３’−ジアセチルｌ−アデニル イル）−テフロン支持体を示す固体支持体をＧｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（Ｈｅ ｒｎｄｏｎ、　ＶＡ）から入手した。固体支持体は、プリン塩基の６−アミノ基 による固体支持体結合、リボース環の５′位にジメトキシトリチルエーテル（Ｄ ＭＴ）及びリボース環の２′及び３′位に酢酸エステルを有する修飾アデニンヌ クレオシドを有するテフロン樹脂である。この固体支持体をジクロロメタン中５ 容量の３％（Ｖ／Ｖ）ジクロロ酢酸（ＤＣＭ中３％ＤＣＡ）と混合し、不活性雰 囲気下室温で１０分間維持し、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を除去して 遊１１５’ヒドロキシルを形成した。

得られｈ脱保護固体支持体をＤＣＭで３回洗浄して過剰の反応しないＤＣＡを除 去した。脱保護洗浄テフロン固体支持体はリンカ−にカップリングすることがで きる。

１当量の脱保護洗浄固体支持体（実施例２で調製した）を２０当量の（１−ジメ トキシトリチルオキシ−３−フルオレニルメトキシカルボニルアミノブロバン− ２イル）−（２−シアノエチル）　−（Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホル アミダイトを示し５′分技修飾因子Ｃ３（又は５　’　ＢＭＣ３；Ｇｌｅｎ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈから入手）と呼ばれるリンカ−及び２０当量のテトラゾール（ア セトニトリル中０．４５Ｍ、　Ｇｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）と混合し、不活性 雰囲気下室温で０６５〜１時間攪拌しながらかきまぜた。次いで混合液を過剰量 のアセトニトリルで洗浄して反応しない試薬を除去した。洗浄固相物質が残り、 ２当量のテトラヒドロフラン／水、９：ｌ中ヨウ素（Ｇｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈから入手）と不活性雰囲気下で混合し、室温で１０分間維持して酸化固体支持 体結合リンカ−を形成した。

次いで１当量の酸化固体支持体結合リンカ−を２０当量のアセトニトリル／酢酸 無水物、８８：１２（キャップ形成試薬：Ｇｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）と室温 でｌＯ分間混合して固体支持体上に存在する反応しない遊離ヒドロキシルにキャ ップを形成しかつキャップテフロン固体支持体結合リンカ−を形成した。

ｂ、制御細孔ガラス（ＣＰ　Ｇ’）支持体本発明で用いられる制御細孔ガラス（ ＰＣ（１；）及びリンカ−が特に好ましい。

具体的なＣＰＧ支持体の完全な構造は図３に示されており、（１）リンカ−をＣ ＰＧ支持体に結合するサルコシンリンカ一部分、（２）固体支持体からポリベブ 升ドーリン力−−オリゴヌクレオチド複合体（Ａ−Ｂ−Ｃ）を遊離するアンモニ ア水で切断できるスクシニルアミノヘキサノールリンカ−及び（３）固体支持体 からオリゴヌクレオチドを遊離する光不安定切断部位を存するセリン分枝モノマ ーを包含する。合成は下記のように段階的に行われる。

Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミドヘギサン〜１−オール（１）をまず調製してアミノヘキサ ノールリンカ一部分を形成した。それを目的として、６−アミノ−１−ヘキサノ ール（０，７５ｇ、６．４ミリモル）を飽和水性Ｎａ２　Ｃ０５（１０ｍ１）に 溶解し、氷で冷却した。ＴＨＦ　（２５ｍｌ、新たに蒸留）中９−フルオレニル メチルクロロホーメート（Ｆｍｏｃ−Ｃ１，１，８３ｇ、　７．１ミリモル）を 激しく攪拌しながら徐々に加えた。この溶液を１０％（Ｗ／Ｖ）クエン酸で油性 にし、酢酸エチルで抽出し、セライト５４５でろ過した後、相を分離した。有機 相を乾燥（Ｎａ、５Ｏ４）で乾燥し、ろ過し、蒸発して粗生成物（２，１５ｇ） を得た。酢酸エチル／ヘキサン（１００ｍｌ、８／２、Ｖ／Ｖ）で再結晶して純 粋な生成物を得てアルコールｌを生成した。アルコールｌの収量は１．６　ｇで あった。

Ｎ−Ｆｍｏｅ−アミドヘキサン−１−イルスクシネート（２）を調製してスクシ ニルアミノヘキサノールリンカ一部分を形成した。アルコールｌ（７５８ｍｇ１ ２．２ミリモル）を無水ピリジン（５ｍｌ）に溶解し、減圧下で蒸発乾固した。

蒸発した油状物を無水ピリジン（３ｍｌ）に再び溶解し、コハク酸無水物（２２ ９■、２．３ミリモル）、４−ジメチル７ミノビリジン（ＤＭＡＰｌ　３７０μ ｍ　１２７８■、０．１ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥ Ａ、３７０μｍ１２７８■、２，２ミリモル）を不活性雰囲気（Ａｒ）下撹拌し ながら加えた。この反応混合液を一晩攪拌し、蒸発乾固し、ジクロロメタン（１ ００ｍｌ）に再び溶解し、希釈水性塩酸（ＩＭ、５０ｍ１）で抽出した。有機相 を乾燥（Ｎａｇ　５ｏ−）Ｌ、ろ過し、蒸発して粗生成物を化合物２を示す油状 物として得、これを２−プロパツールで再結晶することができた。化合物２の収 量は７３５■（白色結晶として）であり、融点（Ｍｐ、）６７−６８°Ｃ（補正 ない；及び質量分析（ＭＳＸＥ　Ｉ、　ｍ／ｅ）４４０　（Ｃ＊５ＨｔｓＯｄＨ の計算値４４ｏ）を有した。

０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−セリン（３）を調 製してＦＭＯＣ及びＯ−ＤＭＴ末端を含むセリン分枝リンカ一部分を形成した。

Ｆｍｏｃ−Ｌ−セリン（４，０４ｇ、１２．２ミリモル）を無水ピリジン（１０ ｍｌ）に溶解し、減圧下で蒸発乾固した。この工程を２回繰り返した。蒸発した 油状物を無水ピリジン（１２ｍｌ）に再び溶解し、４．４′−ジメトキシトリチ ルオキシｐ（４，２０ｇ、１２．４ミリモル）を不活性雰囲気（Ａｒ）下室温で 攪拌しながら加えた。反応混合液を一晩攪拌し、蒸発乾固し、クロロホルム（４ ｘ２５＋ｎｌ）に再び溶解し、飽和水性ＮａＨＣＯａ（５０ｍｌ）で抽出した。

水相をクロロホルム（２５−ｍｌ）で１回逆抽出し、合わせた有機相をＮａｇ　 ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発して粗生成物を茶色がかった油状物として得た。

油状物をクロロホルム／酢酸エチルに溶解し、ヘキサンと１回摩砕し、次いで移 動相としてＣＨＣｌ５／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ、９４１５／１を用いてシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（１５０ｍｌシリカ）で精製した。両分をｔｉｃで 分析し、適切な画分をプールし、蒸発して化合物３を示す白色泡状物を得た。化 合物３の収量は４．２９　ｇであり、ＭＳ　（Ｅ　Ｌ　ｍ／ｅ）は６３０　（Ｃ ｓｓＨｔｓＮＯ１＋Ｈの計算値６３０）であった。

制御細孔ガラス（ＣＰＧ）を上記の調製リンカ−に結合するために活性化した。

それを目的として、ＣＰ　Ｇ　（Ｓｉｇｍａ　Ｇ５０１９、アミノプロピル−Ｃ ＰＧ、４．９７ｇ）をジクロロメタン中トリクロロ酢酸（３％、２０ｍ１）に懸 濁し、シェーカーで４時間攪拌した。ＣＰＧをろ過で単離し、ジクロロメタン（ ２０ｍｌ）で３回、クロロホルム中ＤｒＰＥＡ（１０％、２０ｍ１）で３回及び ジエチルエーテルで３回洗浄して活性化ＣＰＧを形成した。活性化ＣＰＧを減圧 下で乾燥した。

次いで図３に示されている要素をすべて含む三官能ＣＰＧ　［ｂｆ−ＣＰＧ、Ｃ ＰＧ−３ａｒ−ｓｕｅ−ａｈｏ−３ｅｒ　（０−ＤＭＴＸＮ−Ｆｍｏｃ）］を調 製した。

ｉ、活性化ＣＰＧ　（２，０ｇ、ローディ：／グ８３μモル／ｇ）をフィルター 漏斗（２５ｍｌ）に入れた。Ｆｍｏｃ−３ａｒ　（３１３，５ｍｇ、ミリモル） をＤＭＦ（２，８ｍ１）に溶解し、ＤＭＦ　（２，８ｍ１）中ｐｙＢｏｐ　（５ ２５，９＋ｎｇ、ミリモル）と混合し、合わせた活性化アミノ酸混合液をＣＰＧ に加えた。ＤＩＰＥＡ　（１ｍｌ）を反応混合液に加え、ＣＰＧを室温で１時間 振盪した。クロロホルム（５ｍｌ）を加え、振盪をもう３時間続けた。Ｓａｒ機 能性ＣＰＧをろ過で回収し、ＤＭＦ（２Ｘ）、ジクロロメタン（２×）、ジエチ ルエーテル（２×）で洗浄し、減圧下で乾燥した。最大ローディングを得るため に、この工程を繰り返してローディング７７μモル／ｇを有するＣＰＧ−Ｓａｒ を得た。残存する最終遊離アミノ基に酢酸無水物／ＤＭＡＰでキャップ形成し、 次いで減圧下で多く洗浄及び乾燥してＳａｒ機能性ＣＰＧを形成した。

ｉｉ、ｓａｒ機能性ＣＰＧ　（２，０ｇ）をＤＭＦ　（２／８．２×５分）中ビ ペリジンテ処理し、化合物２　（４５０ｍｇ）　、ｐｙＢＯＰ　（５７５ｍｇ） 及びＤＩＰＥＡ（１０００μｌ）をＤＭＦ　（２Ｘ２．８ｍ１）中で反応させた 。得られたＳａｒ−ｓｕｃ−ａｈｏ−Ｆｍｏｃ機能性ＣＰＧをろ過で回収し、Ｄ ＭＦ　（２Ｘ）　、ジクロロメタン（２ＸＬジエチノは一チル（２×）で洗浄し 、減圧下で乾燥した。

山、Ｓａｒ−ｓｕｃ−ａｈｏ−Ｆｍｏｃ機能性ＣＰＧをＤＭＦ　（２／８．２× １０分）中ピペリジンで処理し、化合物３　（７６４ｍｇ）　、ｐｙＢＯＰ　（ ５３６ｍｇ）及びＤＩＰＥＡ　（１０００μｌ　）とＤＭＦ　（２Ｘ２．８ｍ１ ）と反応させて三官能ＣＰＧ支持体又は”ｂ　ｆ−ＣＰＣ；″を形成した。ロー ディングは、３０２ｎｍのＦｍ０Ｃ／ピペリジン付加物吸収から判断して６１． ７μモル／ｇであることが決定された。

更に実施態様においては、上記ｂｆ−ＣＰＧは複合体からポリペプチドを除去す るための光不安定切断部位を付加することにより更に機能化される。

それを目的として、３−ニトロ−４−ブロモメチル安息香酸をα−ブロモ−ｐ− トルイル酸（４−ブロモメチル安息香酸；　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｍｉ　Ｉｗａｕｌｋｅｅ、　Ｗｌ製）を用いてＲｉｃｈら、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃ ｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、９７：１５７５−１５７９（＋９７５jに 記載されているように調製する。３−ニトロ−４−ブロモメチル安息香酸部分を まずＤＭＦ中ピ中口ペリジン理（２／８．２×５分）してＮ末端官能を脱保護す ることにより上記ｂｆ−ＣＰＧ支持体に付加し、次いで十分に洗浄し、ｐｙＢ。

Ｐで活性化される３−ニトロ−４−ブロモメチル安息香酸と反応させて図３に示 される構造を有する光切断できるｂｆ−ＣＰＧを形成する。カップリング反応の 完了はＦＭＯＣ脱保護及びカップリング反応の各々の後、ポジティブ及びネガテ ィブカイゼル試験によりモニターされる。

アミノ酸残基％／７−（７）光切断で！るｂｆ−ＣＰＧ　（０−ＮＢ−ｂｆ−Ｃ ＰＧとも呼ばれる）へのカップリングは、上記Ｒｉｃｈら及びＢａｒａｎｙら、 　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｔｎ。

Ｓｏｃ、　、　１０７：４９３６−４９４２　（＋９８５）に記載されているエ ステル化手順により行われる。

得られたｂｆ−ＣＰＧリンカ−／支持体分子は下記の本発明の関係において新規 でかつ有効な特徴を有する。

（１）リンカ−／支持体分子はＦｍｏｃペプチド合成条件に安定でありカリ切断 の際固体ＣＰＧ支持体を含まないペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を遊離す るサルコシン／スクシニル部分のアンモニア水感受性切断部位を有し、それによ り化学ライブラリーの可溶相形態を作製することができる。可溶相化学ライブラ リーは、ＰＣＲ反応における使用及び溶液相結合相互作用においてペプチド相互 作用を測定するのに特に適している。

（２）Ｌ−セリン分枝モノマーがあるので、ペプチド−オリゴヌクレオチド複合 体は異性体的に純粋である。

（３）光不安定リンカー／支持体分子（０−ＮＢ−ｂｆ−ＣＰＧ）Ｉｔ、約３５ ０ｎｍの光に感受性でありかつ切断の際可溶性ペプチドを遊離する図３に矢印で 示された光感受性（ｈｖ）切断部位を有する。切断は、上記Ｂａｒａｎｙらに記 載されているようなレイオネットＲＰＲ原子炉を用いて照射時間及び強度により 調節することができる。

実施例３で調製したキャップ形成テフロン固体支持体結合リンカ−を３％ＤＣＡ とＤＣＭ中不活性雰囲気下室温で１０分間混合してＤＭＴ保護基をリンカ−から 除去し遊離ヒドロキシル基を形成した。次いで脱保護リンカ−／支持体をＤＣＭ で３回洗浄した。脱保護リンカ−／支持体は、ヌクレオチドを付加することが１ 当量の脱保護リンカ−／支持体を約２０当量の所望のブロックヌクレオチドホス ホルアミダイト及び２０当量のテトラゾール（アセトニトリル中０．４５Ｍ）と 混合して結合ヌクレオチド／リンカ−／支持体（結合ヌクレオチド複合体）を形 成した。次いで結合ヌクレオチド複合体を過剰量のアセトニトリルで洗浄して反 応しない試薬を除去した。ブロックヌクレオチドホスホルアミダイトすべてをＧ ｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手し、ＤＭＴ保護ブロック５′ヒドロキシル、 ンアノエチルエステル（ＣＮＥ）及び３′ホスホルアミダイトのジイソプロピル アミン基を含む。更に、アデニン及びシトシン誘導体は塩基の遊離窒素上にベン ゾイル基を含有し、グアノシン誘導体はプリン塩基の２−アミノ基上にイソブチ ル基を含む。

次いで１当量の結合ヌクレオチド複合体を上記実施例３のように酸化のためにテ トラヒドロフラン／水、９：１中２当量のヨウ素と混合して結合ヌクレオチド複 合体を酸化した。

その後、１当量の酸化ヌクレオチド複合体を上記実施例３のように２０当量のキ ャップ形成試薬と混合して反応しない遊離ヒドロキシルにキャップ形成しキャッ プ固相結合ヌクレオチド複合体を形成した。

Ｃ，ヌクレオチドの三官能ＣＰＧへのカップリングヌクレオチド残基を三官能Ｃ ＰＧ支持体へ付加するカップリング化学の証明として、ｂｌ−ＣＰＧ、、ｈのオ リゴデオキシリボヌクレオチドを合成及び結合した。

そ第１を目的として、オリゴヌクレオチドを１μモル規模の標準合成サイクル並 びに市販の試薬及びホスホルアミダイトを用いてＡＢＩ３９４ＤＮＡシンセサイ ザーにより合成した。使用した固体支持体は、ＡＢＩシンセサイザー用市販の中 空合成カラムに入れたｂｆ−ＣＰＧ（２０■、１μモル）とした。反復収率は、 脱トリチル化を集めアセトニトリル中ｐ−）ルエンスルポン酸ｌ水和物（０，１ Ｍ）に希釈し４９８ｎｍの吸収を測定することから判断した９８．９％を算出し た。

オリゴヌクレオチドを濃アンモニア水によって支持体から遊離した（２４時間を 超えて振盪する）。オリゴヌクレオチドを市販のＯＰＣカートリッジを用いて単 離し、ＨＰ　Ｌ　Ｃ及びＰＡＧＥを分析した（”Ｐ−ｇ−ＡＴＰ及びＴ４キナー ゼで放射能標識した）。

１当量のギャップデフロン固相結合ヌクレオチド複合体を１当量の１，８．ジア ザビシクロ［５，４，０１ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ；Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、製。

Ｍｉ　１ｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌ）とＤＣＭ中不活性雰囲気下室温で１０分間混合 してヌクレオチド複合体のリンカ−からフルオロメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ ）保護基を除去（脱保護）した。次いで脱保護ヌクレオチド複合体を過剰量のＤ ＣＭで洗浄して反応しないＤＢＵを除去し遊離アミノ基を有する脱保護ヌクレオ チドを形成した。

ｂ、アミノ酸の付加 １当量の実施例５Ａの脱保護ヌクレオチドをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中 ２０当量の保護アミノ酸と２０当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯ Ｂｔ）と不活性雰囲気上室温で０．５〜１時間混合した。この反応条件は、アミ ノ酸のカルボキシ末端をそのペンタフルオロフェニルを介してヌクレオチド複合 体の遊離ナミノ基に結合してヌクレオチド／アミノ酸複合体（複合体）を形成す る。次いでこの複合体を過剰量のＤＣＭで洗浄して反応しないＨＯＢｔ及び前駆 体アミノ酸を除去した。保護アミノ酸は、アミノ及びカルボキシ末端にＦＭＯＣ 及び０ｐｆｐ、場合によっては、上記側鎖上の保護基を有する実施例１で記載さ れたものの１種である。

Ｃ，アミノ酸の三官能ＣＰＧへのカップリングアミノ酸残基を三官能ＣＰＧ支持 体へ付加するカップリング化学の証明として、ペプチド、Ｈ−ＨＰＱＦＶＳ−ａ ｈｏを合成し、そのペプチドをｂｆ−ＣＰＧに結合した。それを目的として、ｂ ｆ−ＣＰＧ（４２８■、２６μモル）を装置の攪拌装置に接続したフィルター漏 斗に入れた。使用した試薬は、ｏ−ｐ　ｆｐｘステル（Ｖａｌ及びＨｉｓ　［Ｆ ｍｏｃ］の場合）あるいはｐｙｓｏｐで活性化した遊離酸（Ｐｈｅ、Ｇｉｎ及び Ｐｒｏの場合）として市販のＦｍｏｃアミノ酸誘導体とした。カップリングは、 慣用の一層学を用いる自動ペプチドシンセサイザー−で行った。Ｆｍｏｃ脱保護 及びカップリング段階の各々の後、カップリング反応の成功をポジティブ及びネ ガティブヵイゼル試験によりモニターした。

ペプチドを脱保護し、ｔ、ＤＭＦ中ピ中口ペリジン／８．２×５分）ｉｉ、濃ア ンモニア水（２４時間振盪）で処理することによりｂｆ−ＣＰＧの一部から遊離 した。逆相ＨＰＬＣによりペプチドを１本の主ピークとして分析した。ＭＳ（イ オンスプレー、ｍ／ｅ）８１３　（Ｃ＊５ＨａａＮ＋＊Ｏｓ＋Ｈの計算値８１３ ）。

６、複合体の延長 複合体は、ヌクレオチドとアミノ酸付加の交互サイクルにより長くすることがで きる。複合体が所望のアミノ酸ポリマーどオリゴヌクレオチドポリマーをもつま で、次の交互サイクルが繰り返される。

ａ、ヌクレオチドの付加 付加ヌクレオチドを結合するために、末端ヌクレオチド上の５’　−ＯＨをテフ ロンリンカ−／支持体の脱保護の前記実施例４Ａに記載されるプロトコールに従 ってＤＣＡで脱保護する。その後、保護ヌクレオチドが実施例４Ｂのように付加 付加アミノ酸を結合するために、複合体に付加した最後のアミノ酸のアミノ−Ｆ ＭＯＣ末端を前記実施例５ＡのようにＤＢＵで脱保護する。その後、保護アミノ 酸が実施例５Ｂに記載されるように付加される。

別のヌクレオチド及びアミノ酸を付加する上記段階１及び２のサイクルは、複合 体が所望の長さ及び構造のポリマーを有するまで繰り返すことができる。

Ｃ，ポリペプチド−オリゴヌクレオチドＣＰＧ複合体の構築三官能ＣＰＧ支持体 上にペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を調製するカップリング化学の証明と して、ｂｆ−ＣＰＧ上にオリゴデオキシリボヌクレオチドＡＴＣＡＣＣＡＣＡ　 ＣＴＡ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＣＣＣＴＡＴ　ＴＣＴ　ＴＡＧ”）を１μモル規模の 標準合成サイクル及び市販の試薬及びホスホルアミダイトを用いるＡＢｒ３９４ ＤＮＡシンセサイザーにより標準合成化学に従って合成した。固体支持体は、Ａ ＢＩシンセサイザーの市販の中空合成カラムに入れた上記実施例　で作製したＦ ｍｏｃ−（Ｆｍｏｃ）ＨＰＱＦＶＳ　（ＤＭＴ）−ａｈｏ−ＣＰＧ　（２０ｖ、 ｇ、１μモル）とした。

反復収量は、脱トリチル化を集め、アセトニトリル中ｐ−トルエンスルホン酸１ 水和物で希釈し、４９８ｎｍの吸収を測定することから測定した各々９７．９％ （２４量体）及び９８．３％（４５量体）を算出した。

上記４５量体オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーの部位を示す２つの隣接 １５量体領域及び無コンマコドンＦのＣＴＡ、ＨのＡＴＣ，ＰのＡＣＣ，ＱのＡ ＣＡ及びＶのＧＣＧを（任意に）用いるペプチドのコード配列である中間１５量 体を有する。

ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体は、濃アンモニア水（２４時間を超える振 盪）により支持体から遊離した。ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を市販の ｏｐｃカートリッジを用いて単離し、ＨＰＬＣ及びＰＡＧＥ　（”Ｐ−ｇ−ＡＴ Ｐ及びＴ４キナーゼで放射能標識した）により分析した。

’４５量体配列。２つの隣接！５量体はＰＣＲプライマーであり、中間１５量体 は無コンマコドンＦのＣＴＡ、ＨのＡＴＣ，ＰのＡＣＣ、ＱのＡＣＡ及びＶのＧ ＣＧを（任意に）用いるペプチドのコード配列である。

ｄ、ｂｆ−ＣＰＧ支持体上ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体ライブラリーの 合成 実施例３Ｂに記載される三官能（ｂｆ）ＣＰＧ支持体を用いて、ペプチド−オリ ゴヌクレオチド複合体ライブラリーを下記段階に記載されるように構築する。

段階１．固体支持体、ｂｆ−ＣＰＧをＡＢ　Ｉ　３９４　ＤＮＡシンセサイザー （Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、Ｐｏ５ｔｅｒ　Ｃ１ｔ ｙ、　ＣＡ）に使用する市販の中空合成カラムに入れる。３′オリゴヌクレオチ ドプライマー配列（配列番号　）を合成し、次いで標準合成サイクル及び市販の 試薬及びホスホルアミダイトを用いる製造業者の標準手順に従ってｂｆ−ＣＰＧ に化学的に結合する。

段階２１段階２後の支持体は、合成されるべきポリペプチドのライブラリー位置 １に付加されるべき異なるモノマーアミノ酸数を表す多数のアリコートに分けら れる。各Ｆｍｏｃアミノ酸残基モノマー（１）は、モノマー上の保護と一致した プロトコールに従って結合される。典型的なプロトコールにおいては、ｂｆ−Ｃ ＰＧを攪拌装置に接続したフィルター漏斗に入れる。使用される試薬は、０−ｐ ｆｐエステルあるいはｐｙｓｏｐで活性化された遊離酸として市販のＦｍｏｃア ミノ酸誘導体である。機能性ｂｆ−ＣＰＧをＤＭＦ中ピペリジン（２／８．２× ５分）で処理し、上詰のように活性化したモノマーと反応させる。カップリング 反応の成功は、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング各段階後ポジティブ及びネガテ ィブカイゼル試験でモニターする。同様に、脱保護Ｆｍｏｃ／ピペリジン複合体 の３０２ｎｍにおける吸収は、カップリング反応がうまく進行する指標として作 用する。モノマー（１）−機能性ｂｆ−ＣＰＧをろ過により回収し、ＤＭＦ　（ ２×）、ジクロロメタン（２×）、ジエチルエーテル（２×）で洗浄し、減圧下 で乾燥してモノマー（１）−複合ｂｆ−ＣＰＧを形成する。

段階３．適切なモノマー（１）の単位アイデンティファイア−であるオリゴヌク レオチドは、異なるモノマー（１）−機能性ｂｆ−ＣＰＧの各々をＤＮＡシンセ サイザー用市販の別々の中空合成カラムに入れる；とによりモノマー（１）−機 能性ｂｆ−ＣＰＧの各々に結合される。モノマー（１）−機能性ｂｆ−ＣＰＧ上 に存在するモノマー（１）の種類に対応するオリゴヌクレオチドコード配列［例 えば、オリゴ（１）を示す無コンマトリヌクレオチド単位１を標準合成サイクル 並びに市販の試薬及びホスホルアミダイトを用いる前記ＤＮＡシンセサイザーに よる３逐次合成サイクルによってモノマー（１）−機能性ｂｆ−ＣＰＧに化学的 に結合してモノマー（１）、オリゴ（１）−ｂｆ−ＣＰＧ複合体を形成する。

段階４．異なるモノマー（１）−機能性ｂｆ−ＣＰＧをプールし、混合し、ライ ブラリーの位置２に付加されるべき異種アミノ酸残基モノマーの数を示す多数の アリコートに分けられる。モノマー（２）は、モノマー（１）の段階２に記載さ れるようにＣＰＧに結合される。

段階５．適切なモノマー（２）の単位アイデンティファイアーであるオリゴヌク レオチド配列は、異なるモノマー（１）−機能性ｂｆ−ＣＰＧの各々をＤＮＡシ ンセサイザー用市販の別々の中空合成カラムに入れることによりモノマー（１） −機能性ｂｆ−ＣＰＧの各々イニ結合される。

これらの段階、段＃４−５は、適切な数のモノマー及び対応する単位アイデンテ ィファイア−オリゴヌクレオチドが取込まれるまで繰り返される。

段階６１合わせた固体支持体をＤＮＡシンセサイザー用市販の中空合成カラムに 入れる。５′オリゴヌクレオチドプライマー配列は、上記のように標準合成サイ クル並びに市販の試薬及びホスホルアミダイトを用いてモノマー（ｎ）−モノマ ー（１）−機能性ｂｆ−ＣＰＧに化学的に結合される。最後のＤＭＴ基は、精製 段階で親和性垂れはしとして用いられるべきオリゴヌクレオチド−ペプチド複合 体に結合されたままである。

段階７６組合わせペプチド−オリゴヌクレオチドライブラリーを脱保護し、まず ＴＢＡＦで適切な時間、次に濃アンモニア水（２４時間を超えて振盪）で処理す ることにより支持体から遊離する。ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を単離 し、市販のｏＰＣカートリッジを用いて精製した。

７、保護基の除去 １種以上の三官能分子の完全な合成後、保護基を末端ヌクレオチド、末端アミノ 酸及び保護アミノ酸の側鎖から除去する。

ａ、ヌクレオチド保護基の除去 オリゴヌクレオチドポリマーの最後のヌクレオチドの５’　−ＯＨ上のＤＭＴ保 護基を、上記実施例４Ａのプロトゴールに従ってＤＣＡで除去する。

ｂ、アミノ酸保護基の除去 アミノ酸ポリマーの最後のアミノ酸のアミノ末端上のＦＭＯＣ保護基を、上記実 施例５Ａに記載されるようにＤＢＵで除去する。

Ｃ，アミノ酸側鎖保護基の除去 アミノ酸側鎖保護基を除去する条件は下記のように具体的な保護基に基づく：ｉ 、ＴＢＳ及びＴＳＥエステル基の除去１単位の複合体を約２０当量のテトラブチ ルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）とＤＣＭ中で混合し、不活性雰囲気下室 温で一晩維持して千ロジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン及びトレオ ニンの側鎖を保護するＴＢＳ又はＴＭＳＥエーテルを除去する。

ｉｉ、Ｂｚ基の除去 複合体を過剰量のアンモニア水で混合し、不活性雰囲気下６０°Ｃで一晩維持し てリシンの側鎖アミノ基を保護するベンジル（Ｂｚ）基を除去する。

ｉｉｉ、ＭＴｒ、Ｂｕｍ及びＴｐｍ基の除去複合体を２０〜５０％ＴＦＡと混合 し、不活性雰囲気下室温で約５分間維持してアルギニン、ヒスチジン又はシステ ィンを各々保護するＭＴｒ、Ｂｕｍ又はＴｐｍ基を除去する。その後、複合体を トリエタノールアミン及びＣＨＣｌ、で中和する。

複合体をｐＨ＋２の水性バッファ・−と混合し、不活性雰囲気上室温で約５分間 維持してトリプトファンの反応性２−アミノ基を保護するホルミル基を除去する 。

保護基をテフロン支持体上の複合体から除去した後、複合体をアセトニトリル／ 水（１：　４　ｖ／ｖ）中１００８ヨウ素酸ナトリウム、１００−リン酸ナトリ ウムバアファー、ｐＨ７，２の切断溶液と混合することにより三官能分子を固体 支持体から除去する。混合液は、遮光して室温で攪拌しながら維持される。４時 間攪拌した後、液相を除去し、固体支持体を過剰量の水及びメタノールで洗浄す る。

次いで洗浄液を除去し、ｌｕモルの固体支持体を５０ｕｌのｎ−プロピルアミン 、１００ｕｌのアセトニトリル及び４００ｕｌの水と混合し、５５℃で３時間維 持する。その後、液相を回収し、減圧下で蒸発乾固し、乾燥生成物をアセトニト リル／水に溶解する。溶解した生成物をＥＭ　ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｌ　Ｏ０ ＲＰ−１８ｍ　５０−カラム（４Ｘ２５）ＨＰＬＣカラムによる逆相ＨＰＬＣを 用いて精製する。移動相Ａは９５％０．ＩＴＥＡＡバッファー（ｐＨ７，０）及 び５％アセトニトリルであり、移動相Ｂは５％ＴＥＡＡバッファー（ｐＨ７，０ ）及び９５％アセトニトリルである。勾配は、流速１ｍｌ／分で１００％Ａ５分 間、１００％Ａ〜５０％５０分間である。均一画分を集めて純粋な三官能分子溶 液を得る。

この溶液を精製物質のバッファーを変える必要がある場合、この溶液を透析する 。

ｂ、ｂｆ−ＣＰＧ支持体の切断 ｂｆ−ＣＰＧ支持体に結合したペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を２つの異 なる位置で切断することができる。

図３に示されるように、アンモニア水反応はサルコシン−スクシニルリンカ一部 分を切断し、それによりペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を固体支持体から 遊離し、液相複合体を形成する。

図３に示されるように、約３５０ｎｍの光による照射はセリン分枝モノマー部分 に存在する光反応性部位を切断し、それによりポリペプチドを固体支持体から遊 離する。

双方の場合ともに、固体支持体は遊離した可溶性物質からろ過により容易に分離 されて切断反応に基づき単離可溶性複合体又はポリペプチドを形成する。

９、三官能分子のライブラリーの調製 実施例１−８の合成手順を用いて、三官能分子の作製方法が詳述される。分子の ライブラリーを形成するために、操作を更に必要とする。まず、分割し、異なる 単位を各アリコートに加え、そのアリコートをプールして実質的にライブラリー をつくる。第２に、場合によってはＰＣＲプライマー結合部位と単位アイデンテ ィファイア−オリゴヌクレオチドをヌクレオチドでヌクレオチドを付加するより 前合成したブロックとして付加することができる。

ａ、保護オリゴヌクレオチドの合成 この手順を用いて、表２に示されるヌクレオチド配列を有するが、オリゴヌクレ オチドの５′末端にＤＭＴを有するとともにオリゴヌクレオチド３′末端にＣＮ Ｅエステル及びアミノジイソプロピルホスホルアミデートを有するＰＣＲプライ マー結合結合部位オリゴヌクレオチド及１Ｐ２を合成した。同様に、１単位当た り６ヌクレオチドを育しかつ上記ブロック末端を有するグリシン（Ｇ１　ｙ）及 びメチオニン（Ｍｅｔ）の単位アイデンティファイア−オリゴヌクレオチドを合 成した。単位アイデンティファイア−オリゴヌクレオチド配列を表２に示す。

表２ 呼称　オリゴヌクレオチド配列 ＰＩ　５’　−ＧＧＧＣＣＣＴＡＴｒＣＴｒＡＧ−３’Ｐ２　５’　−ＡＧＣＴ ＡＣＴＴＣＣＣＡＡＧＧ−３’Ｚ１’　５’　−ＣＴＣＡＴＧ−３’ Ｚ“”　５’　−ＡＣＧＧＴＡ−３’ 化学単位がアミノ酸であり、アルファベットサイズがグリシン及びメチオニンか ら構成される２であり、単位アイデンティファイア−ヌクレオチド配列が長さ６ ヌクレオチドであり、化学ポリマーの長さが３アミノ酸である始原量ライブラリ ーの合成を記載する。プロセスのスキームを図２に示す。

実施例２で調製された固体支持体を実施例３に記載されるリンカ−に結合する。

便宜上、固体支持体結合リンカ−分子はＬＩＮＫと呼ばれる。その後、保護オリ ゴヌクレオチドＰＩが実施例４の単一保護ヌクレオチドに記載されるＬＩＮＫＩ ニー結合されて構造Ｐｌ−ＬＩＮＫを形成する。

段階１において、Ｐｌ−ＬＩＮＫは２アリコートに分けられる。第１アリコート は実施例５に記載されるアミノ酸残基グリシンの連続カップリング、次いで実施 例４に記載される保護オリゴヌクレオチドＺ′１′のカップリングに供して構造 ＣＴＣＡＴＧ−Ｐｌ−ＬＩＮＫ−ｇｌｙを形成する。第２アリコートを同様にア ミノ酸メチオニン及びオリゴヌクレオチド２１′を付加するために結合して構造 ＡＣＧＧＴＡ−Ｐｌ−ＬＩＮＫ−ｎｅｔを形成する。次いで２つのアリコートを プールしで２種の三官能分子の混合物を形成する。

段階２において、段階ｌのプールを２アリコートに分ける。第１アリコートを前 のように連続カップリングに供し、グリシン及びオリゴヌクレオチドＺ″′を付 加して下記構造を形成する。

ＣＴＣＡＴＧＣＴｆｌｌ：ＡＴＧ−Ｐｌ−ＬＩＮＫ−ｇｌｙ、　ｇｌｙ及ヒＣＴ ＣＡＴＧＡＣＧＧＴＡ−ＰＩ−ＬＩＮＫ−原ｊ−ｇｌ）’。

第２了りコートを前のように連続カップリングに供し、メチオニン及びオリゴヌ クレオチドＺ”°゛を付加して下記構造を形成する：ＡＣＧＧＴＡＣＴＣＡＴＧ −円−ＬＩＮＫ−ｇｌ　ｙ、　ｍｅｔ及びＡＣＧＧＴＡＡＣＧＧＴＡ−Ｐｌ−Ｌ ＩＮＫ−呪ｔ、制ｔ０次いで２つのアリコートをプールして４種の三官能分子の 混合物を形成する。

段階３において、段階２のプールを２アリコートに分ける。第１アリコートを前 のように連続カップリングに供し、グリシン及びオリゴヌクレオチドＺｔｌｙを 付加する。その後、保護オリゴヌクレオチドＰ２を実施例４の単一保護ヌクレオ チドに記載されるプール中の成長三官能分子に結合して下記構造を形成する：Ｐ ２ＣＴＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧ円−ＬＩＮＫ−ｇｌｙ、　ｇｌＹ、　 ｇｌ）’　。

Ｐ２ＣＴＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＧＴＡＰＩ−ＬＩＮＫ−ｎｅｔ、　ｇｌｙ 、　ｇｌｙ　。

Ｐ２ＣＴＣＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＴＣＡＴＧＰＩ　−ＬＩＮＫ−ｇｌｙ、　ｍｅ ｔ、　ｇｌｙ及びＰ２ＣＴＣＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＣＧＧＴＡＰＩ−ＬＩＮＫ− ｍｅｔ、　ｍｅｔ、　ｇｌｙ。

第２アリコートを前のように連続カップリングに供し、メチオニン及びオリゴヌ クレオチドＺ“°“を付加する。その後、保護オリゴヌクレオチドＰ２を実施例 ４の単一保護ヌクレオチドに記載されるプール中の成長三官能分子に結合して下 記構造を形成する： Ｐ２ＡＣＧＧＴＡＣＴＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧＰｌ−ＬＩＮＫ−ｇｌｙ、　ｇｌｙ 、　ｍｅｔ　。

Ｐ２ＡＣＧＧＴＡＣＴＣＡＴＧＡＣＧＧＴＡＰ１−ＬＩＮＫ−ｍｅｔ、　ｇｌｙ 、　ｍｅｔ、Ｐ２ＡＣＧＧＴＡＡＣＧＧＴＡＣＴＣＡＴＧ円−ＬＩＮＫ−ｇｌｙ 、　ｍｅｔ、　ｍｅｔ　、及びＰ２ＡＣＧＧＴＡＡＣＧＧＴＡＡＣＧＧＴＡＰ１ −ＬＩＮＫ−ｍｅｔ、ｍｅｔ、ｎｅｔ。

次いで２つのアリコートをプールして８種の三官能分子の混合液を形成する。

得られた８種の三官能分子のプールは、本発明の方法に従って作製した小さなラ イブラリーを表す。アルファベットサイズを増やすことにより１段階当たりのア リコート数が増加される。

特定の実施態様及び実施例を含む前記明細書は、本発明を具体的に説明するもの であり、限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の真意及び範囲を 逸脱することなく他の多くの変更及び修正を行うことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式Ａ−Ｂ−Ｃで表される二官能分子（式中、Ａは化学部分であり、ＢはＡに 操作的に結合したリンカー分子であり、Ｃは化学部分Ａの構造を同定するヌクレ オチド配列を含むアイデンティファイアーオリゴヌクレオチドである。）２．Ａ が式（Ｘ■）■（式中、ＸはポリマーＡの単一化学単位である。）で表される線 状の化学単位を含むポリマーであり；アイデンティファイアーオリゴヌクレオチ ドＣが式（Ｚ■）■（式中、Ｚは位置ｎの化学単位を同定するオリゴヌクレオチ ドＣの単位アイデンティファイアーヌクレオチド配列である。）で表され；ｎが １＋ｉ（ｉは０〜１０の整数である。）値を有するポリマーＡのＸ及びオリゴヌ クレオチドＣのＺの双方の位置アイデンティファイアーであるので、ｎが１の場 合、Ｘ又はＺはリンカーの最も近くに位置し、ａが４〜５０の整数である請求項 １記載の二官能分子。 ３．該単位アイデンティファイアーヌクレオチド配列Ｚが２〜８ヌクレオチドの 長さを有する請求項２記載の二官能分子。 ４．該化学部分Ａがオリゴ糖、ポリペプチド、糖脂質、脂質、プロテオグリカン 、糖ペプチド又はオリゴヌクレオチドである請求項１記載の二官能分子。 ５．該ポリマーＡがポリペプチドであり、Ｘが該ポリペプチドのアミノ酸残基で あり、単位アイデンティファイアーヌクレオチド配列ＺがポリペプチドＡの位置 ｎのアミノ酸残基を同定するヘキサヌクレオチド配列である請求項２記載の二官 能分子。 ６．該アミノ酸残基が天然、修飾及び非天然アミノ酸からなる群より選ばれる請 求項５記載の二官能分子。 ７．該アイデンティファイアーオリゴヌクレオチドＣが式Ｐ１−（Ｚ■）■−Ｐ ２（式中、Ｐ１及びＰ２はポリマーアイデンティファイアーオリゴヌクレオチド を増幅するために適応されたＰＣＲプライマー結合部位を示すヌクレオチド配列 である。）で表されるヌクレオチド配列を有する請求項２記載の二官能分子。 ８．該Ｐ１及びＰ２が各々ＰＣＲ増幅二重らせんＤＮＡフラグメントに存在する 場合制限エンドヌクレアーゼ部位を定義する配列を含む請求項７記載の二官能分 子。 ９．該制限部位がＰＣＲプライマー結合部位に相対して（Ｚ■）■の近くに位置 する請求項８記載の二官能分子。 １０．該制限エンドヌクレアーゼ部位が制限エンドヌクレアーゼ切断の際に非オ ーバーラップ付着末端を形成する請求項９記載の二官能分子。 １１．複数種の請求項１記載の二官能分子を含むライブラリー。 １２．該複数種が式Ｖ■（式中、ＶはＸの可能な化学単位のアルファベットを形 成する異なる化学単位数を表し、ａはＶに対する指数でありポリマーＡを形成す るＸの化学単位数を表す。）で定義される請求項１１記載のライブラリー。 １３．Ｘが天然アミノ酸であり、Ｖが２０である請求項１２記載のライブラリー 。 １４．ポリマーＡを形成する化学単位数（ａ）が３〜８である請求項１２記載の ライブラリー。 １５．Ｘがアミノ酸であり、ａが６である請求項１２記載のライブラリー。 １６．Ｘがアミノ酸であり、該単位アイデンティファイアーヌクレオチド配列Ｚ が３〜６ヌクレオチドの長さを有する請求項１２記載のライブラリー。 １７．該複数の該二官能分子種の各々が０．２〜１０．０モル当量で存在する請 求項１１記載のライブラリー。 １８．該二官能分子種の各々の該アイデンティファイアーオリゴヌクレオチドＣ が式Ｐ１−（Ｚ■）■−Ｐ２（式中、Ｐ１及びＰ２はアイデンティファイアーオ リゴヌクレオチドを増幅するために適応したＰＣＲプライマー結合部位を示すヌ クレオチド配列であり、Ｐ１及びＰ２のヌクレオチド配列はライブラリーの二官 能分子種すべてが共有する。）で表されるヌクレオチド配列を有する請求項１２ 記載のライブラリー。 １９．生物活性分子との前選択結合相互作用に関与する化学構造の同定方法であ って、該化学構造が請求項１１記載の二官能分子のライブラリーに存在する方法 であって、 ａ）該二官能分子ライブラリーを生物活性分子と溶液中で結合条件下結合反応複 合体を形成するのに十分な時間混合し；ｂ）段階（ａ）で形成した複合体を単離 し；ｃ）単離した複合体のアイデンティファイアーオリゴヌクレオチドのヌクレ オチド配列を決定し、それにより前選択結合相互作用に関与する化学構造を同定 する： 段階を含む方法。 ２０．該生物活性分子が該固体支持体に付着される請求項１９記載の方法。 ２１．該生物活性分子が結合分子を結合することができる結合手段に操作的に結 合される請求項１９記載の方法。 ２２．該結合手段がビオチン、プロテインＡ及び磁気ビーズからなる群より選ば れる請求項２１記載の方法。 ２３．該決定が、 ｉ）単離したアイデンティファイアーオリゴヌクレオチド配列からポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物を形成し；ｉｉ）ＰＣＲ増幅産物の配列を決定し、 それによりアイデンティファイアーオリゴヌクレオチドの配列を決定する： 段階を含む請求項１９記載の方法。 ２４．請求項１１記載の複数の二官能分子を含むライブラリーの調製方法であっ て、ａ）末端Ａ′で化学前駆体単位Ｘ′と及び末端Ｃ′でヌクレオチド前駆体Ｚ ′と反応するのに適応する式Ａ′−Ｂ−Ｃ′で表される末端Ａ′及びＣ′を有す るリンカー分子Ｂを供給し； ｂ）化学前駆体単位Ｘ′を該リンカーの末端Ａ′に付加しかつ前駆体単位アイデ ンティファイアーオリゴヌクレオチドＺ′を該リンカーの末端Ｃ′に付加して構 造Ｘ■−Ｂ−Ｚ■を有する二官能分子を含む組成物を形成することにより合成を 行い； ｃ）組成物の１つ以上のアリコートで段階（ｂ）を繰り返して二官能分子を含む 産物を含むアリコートを作製し； ｄ）段階（ｃ）で作製したアリコートを合わせて二官能分子の混合物を形成し、 それにより該ライブラリーを形成する：段階を含む方法。 ２５．該段階（ｃ）及び（ｄ）を段階（ｄ）の混合物で繰り返して更に化学単位 Ｘ及び対応するアイデンティファイアーオリゴヌクレオチドＺを混合物の二官能 分子に付加する請求項２４記載の方法。 ２６．該段階（ｃ）及び（ｄ）の反復を混合物で１〜６回繰り返し、それにより ａが３〜１０であるような該二官能分子のポリマーＡを形成する請求項２５記載 の方法。 ２７．該リンカー分子がｂｆ−ＣＰＧ又はｏ−ＮＢ−ｂｆ−ＣＰＧからなる群よ り選ばれた二官能固体支持体である請求項１９記載の方法。 ２８．該リンカー分子がｂｆ−ＣＰＧ又はｏ−ＮＢ−ｂｆ−ＣＰＧからなる群よ り選ばれた二官能固体支持体である請求項２４記載の方法。 ２９．オリゴペプチド／オリゴヌクレオチド複合体を合成するための二官能固体 支持体であって、 水溶液に分散できる種類のものである固体支持体、該支持体に結合した第１結合 単位、 該第１結合単位に結合した第２結合単位、及び該第２結合単位に結合した二官能 単位、を含み、 該二官能単位がオリゴペプチド合成に使用できる第１脱離基及びオリゴヌクレオ チド合成に使用できる第２脱離基を有し、該第１脱離基がＮ−ＦＭＯＣ又はその 機能等価基であり、該第２脱離基がＯ−ＤＭＴ又はその機能等価基であり、該第 ２結合単位が濃アンモニア水にさらすことにより切断できる結合によって該第１ 結合単位に結合され、 該固体支持体、該第１結合単位、該第２結合単位、該切断できる結合及び該二官 能単位、該第１及び第２脱離基のみの各々がＦＭＯＣ脱離基を用いるオリゴペプ チド合成プロトコールによって用いられる条件及びＯ−ＤＭＴ脱離基を用いるオ リゴヌクレオチド合成プロトコールによって用いられる条件に実質的に化学的に 反応しない： 二官能固体支持体。 ３０．該固体支持体が制御細孔ガラスである請求項２９記載の二官能固体支持体 。 ３１．該第１及び第２結合単位間の該結合がアルキルエステルである請求項２９ 記載の二官能固体支持体。 ３２．該二官能単位がアミノ端、カルボキシル端及びヒドロキシル端を有するセ リン残基であり、該セリンがそのカルボキシル端で該第２結合単位に結合され、 そのアミノ端で該第１脱離基に結合され、そのヒドロキシル端で該第２脱離基に 結合される請求項２９記載の二官能固体支持体。 ３３．該固体支持体が制御細孔ガラスであり、該第１及び第２結合単位間の該結 合がアルキルエステルであり、該二官能単位がアミノ端、カルボキシル端及びヒ ドロキシル端を有するセリン残基であり、該セリンがそのカルボキシル端で該第 ２結合単位に結合され、そのアミノ端で該第１脱離基に結合され、そのヒドロキ シル端で該第２脱離基に結合される請求項２９記載の二官能固体支持体。 ３４．該固体支持体がアミノプロピル−ＣＰＧであり、該第１結合単位がアミド 結合によってアミノプロピル−ＣＰＧに結合したサルコシンリンカー及びサルコ シンリンカーに結合したスクシニルリンカーを含み、第２結合単位がアルキルエ ステルによって該スクシニルリンカーに結合したアミノヘキサノール基を含み、 該二官能単位がＬ−セリン残基を含み、セリンのアミノ端がアミド結合によって 該アミノヘキサノールリンカーに結合され、該セリンのカルボキシル端がＦＭＯ Ｃ脱離基に結合され、該セリンのヒドロキシル端がＯ−ＤＭＴ脱離基に結合され る： 請求項３３記載の二官能固体支持体。 ３５．該二官能単位と該第１脱離基との間にはさまれ結合した第３結合単位を更 に含み、 該第３結合単位が紫外線にさらすことにより切断できる：請求項２９記載の二官 能固体支持体。 ３６．該第３結合単位がアミド結合によって該セリンのアミノ端に結合しかつエ ステル結合によってＦＭＯＣブロックアミノ酸に結合した３−ニトロ−４−Ｏ− エチルベンゾエート基を含む請求項３５記載の二官能固体支持体。 ３７．該固体支持体がアミノプロピル−ＣＰＧであり、該第１結合単位がアミド 結合によってアミノプロピル−ＣＰＧに結合したサルコシンリンカー及びサルコ シンリンカーに結合したスクシニルリンカーを含み、第２結合単位がアルキルエ ステルによって該スクシニルリンカーに結合したアミノヘキサノール基を含み、 該二官能単位がＬ−セリン残基を含み、セリンのアミノ端がアミド結合によって 該アミノヘキサノールリンカーに結合され、該セリンのカルボキシル端がＦＭＯ Ｃ脱離基に結合され、該セリンのヒドロキシル端がＯ−ＤＭＴ脱離基に結合され る： 請求項３６記載の二官能固体支持体。 ３８．水溶液に分散できる種類のものである固体支持体、該固体支持体に結合し た第１結合単位、第１結合単位に結合した第２結合単位、該第２結合単位に結合 した二官能単位、該二官能単位に結合したオリゴペプチド、及び該二官能単位に 結合したオリゴヌクレオチド、を含むオリゴペプチド／オリゴヌクレオチド複合 体ライブラリーの要素。 ３９．該第１結合単位を該第２結合単位に結合するための切断可能結合を更に含 み、該切断可能結合が濃アンモニア水にさらすことにより切断できる請求項３８ 記載のオリゴペプチド／オリゴヌクレオチド複合体ライブラリーの要素。 ４０．該二官能単位を該オリゴペプチドに結合するための切断可能結合を更に含 み、該切断可能結合が紫外線にさらすことにより切断できる請求項３９記載のオ リゴペプチド／オリゴヌクレオチド複合体ライブラリーの要素。 ４１．二官能単位、 該二官能単位に結合したオリゴペプチド、及び該二官能単位に結合したオリゴヌ クレオチド：を含むオリゴペプチド／オリゴヌクレオチド複合体ライブラリーの 要素。 ４２．該二官能単位を該オリゴペプチドに結合するための切断可能結合を含み、 該切断可能結合が紫外線にさらすことにより切断できる請求項４１記載のオリゴ ペプチド／オリゴヌクレオチド複合体ライブラリーの要素。