JPH07505765A - 核酸の複製によるアッセイのリポーターの増幅 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の複製によるアッセイのリポータ−の増幅発明の分野 本発明は、被検体に応じて固定化された標的核酸配列を複製することによって増 幅を達成する、流体の中の被検体の増幅された検出の方法に関する。

１９６０年代および１９７０年代におけるイムノアッセイの導入は、正確かつ精 確な測定を可能とする被検体の数を増加させた。ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　 Ａ）および免疫ラジオメトリック（ＩＲＭＡ）アッセイは、被検体を測定するた めに抗体または競合抗原の放射性同位元素の標識化を利用する。次いで、酵素ま たは蛍光性標識に基づく検出系がアイソトープの検出系に対する別法として開発 された。Ｄ、Ｌ、Ｂａｔｅｓ。

Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５（７）、２０４（１９８ ７）は、酵素の増幅に基づく１つのこのような方法を記載している。この方法に おいて、二次酵素系を一次酵素標識にカップリングし、例えば、−次酵素を追加 の系、例えば、基質のサイクルまたは酵素のカスケードに触媒的に結合すること ができる。酵素の増幅は触媒的プロセスのカップリングから、直接の修飾による か、あるいはコントロールする酵素の生産物との相互作用により生ずる。

米国特許第４．６６８，６２１号は、感度を増強するために凝固のカスケードを 使用して増幅されたアッセイにおいて、酵素結合凝固アッセイ（ＥＬＩＣＡ）を 利用することを記載している。この方法は、可溶性フィブリノゲンおよび標識化 可溶化フィブリノゲンからのトロンビン活性化フィブリンの形成のための凝固物 の形成を伴う。固相に取り付けられた環境指示性（ｒｅｐｏｒｔａｂｌｅ）リガ ンドの増幅は、凝固因子接合体および引き続（凝固カスケード反応との組み合わ せた使用によってのみ得られる。

基質／コファクターのサイクリングは酵素仲介増幅の他の変法であり、そして− 次酵素の標識により発生したコファクターまたは基質のサイクリングに基づ匂− 次酵素の生産物は増幅サイクルの触媒のアクチベーターであり、これは比率が基 質の濃度に応答し、それゆえ酵素標識の濃度に応答する。基質サイクリング系の １例は米国特許第４，７４５，０５４号に記載されている。

Ｖａｒｙら、ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、３２−１１６９６　（１９８６）は、核 酸の検出に適する酵素増幅法を記載している。この方法は鎖置換アッセイであり 、そしてホスホリラーゼにより解放されつる基質標識として作用するポリヌクレ オチドの独特の能力を使用する。

の検出または定量を改良する方法を開示している。検出シグナルの増幅は、酵素 系に対して特異的な検出可能な標識化基質から成る接合体を活性化することによ って達成され、ここで前記接合体は被検体依存性酵素活性化系と反応して活性化 された接合体を形成し、これは接合体のためのレセプターが固定化されるときは いつでも堆積する。

ヌクレオチドのハイブリダイゼーションアッセイが、特定の核酸配列の検出手段 として開発された。米国特許第４．８８２，２６９号は増幅された核酸配列のハ イブリダイゼーションアッセイを記載しており、ここで標的核酸をポリマーのテ イルを有する相補的−次プローブと接触させる。このポリマーのテイルに結合で きる複数の第２シグナル発生プローブを添加して、標的核酸の増幅された検出を 達成する。この方法の変法はＰＣＴ出願国際公開第８９１０３８９１号および欧 州特許出願第２０４５１０号に記載されており、これらはアンブリファイア−ま たはマルチマーのオリゴヌクレオチドをターゲラテッド核酸セグメントに結合し た一本鎖核酸単位にハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーションアッ セイを記載している。シグナルの増幅は、シグナル発生核酸ベースをこれらのア ンブリファイア−およびマルチマーの鎖にハイブリダイゼーションすることによ って達成される。これらの開示のすべてにおいて、増幅はシグナル発生プローブ の取り付けのための追加の部位を固定化するメカニズムにより達成される。

対照的に、本発明はシグナルの増幅において基本的に異なる概念を利用する。被 検体に対する応じて、標的核酸配列を固定化し、そして核酸複製技術を使用して 複製する。シグナルの増強は、標的配列の複製物の発生および検出により達成さ れる。

米国特許第４，９９４，３６８号は、−次ポリヌクレオチド配列の複製したコピ ーを生成することによって、ポリヌクレオチドの被検体の検出を達成する核酸の ハイブリダイゼーションアッセイを開示している。

問題の標的配列をまず制限して遊離の３°　ＯＨ末端を準備し、次いで一本鎖の パターンのポリヌクレオチドの中の２またはそれ以上の鋳型配列の３°末端に位 置する相補的結合性配列にハイブリダイゼーションさせる。鎖延長を標的配列に ついて実施し、次いでこの延長生成物を断片に切断し、引き続いてこれらの断片 を一本鎖のパターンのヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせる。検出可能 な数のコピーが得られるまで、重合サイクルを反復する。同様な流れにおいて、 ＰＣＴ出願国際公開第９０１０３４５号は核酸の検出アッセイを記載しており、 ここでリポータ−分子は１）ターゲラテッド部位に対して相補的であるオリゴヌ クレオチドのプローブ配列；２）プライマーの延長を開始できるプライマー配列 、および３）プライマー配列に対して相補的である配列セグメントからなる付加 物である。付加物は被験核酸試料に最初に添加されるので、プライマーを不活性 とするヘアピン構造を取る。しかしながら、付加物を試料の中の標的配列にハイ ブリダイゼーションさせると、付加物は活性化されるようになり、そしてそのプ ライマー配列はプライマーの延長生成物を開始するために有効となる。これらの 技術の方法は出願人の方法とはかなり異なりかついっそう面倒なアプローチを使 用して、検出可能な核酸の多数のコピーを生成する点で異なる。また、これらの 方法はヌクレオチド配列の検出に限定されるが、出願人の方法は広い範囲の被検 体に適用可能である。

免疫学的アッセイのためのリポータ−としてＲＮＡの使用は文献に記載されてき ている。国際公開第８７１０６２７０号は、イムノアッセイによるか、あるいは 核酸プローブのハイブリダイゼーションによりバイオポリマーをアッセイするた めのリポータ−として、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより自触的に複製す ることができるＲＮＡの使用を教示している。

同様に、国際公開第９１／１７４４２号は、イムノアッセイにおいて検出可能な シグナルの増幅に使用できる種々のタンパク質／核酸ハイブリッドのプローブを 記載している。まず固体の支持体上に抗原性被検体を固定化し、−重鎖または二 本鎖の核酸鋳型に操作可能に接続された二本鎖ＲＮＡ　Ｔ７ポリメラーゼプロモ ーターを含んでなるタンパク質／核酸ハイブリッドのプローブを前記被検体に結 合し、結合しないプローブを除去し、ＲＮＡオリゴマーの多数のコピーを転写し 、そして転写体を検出および定量することからなる方法により、シグナルは増幅 される。

鋳型の複製は１０１〜１０’コピー／鋳型の程度である。

上の方法はイムノアッセイによる被検体の検出のレベルを増強するために有用で あるが、両者の方法はかなりの制限に悩まされる。例えば、両者の方法は核酸の 複製のためにＲＮＡ依存性ポリメラーゼの使用に頼り、これは他の増幅法、例え ば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはりガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）よりか なり低い増幅を与え、そして分子的に特定される生成物を生じない。ＰＣＲは、 例えば、１０’〜１０目コピー／明確な長さの標的程度の増幅を与えるであろう ことはこの分野においてよく知られている。

５ａｎｏら、５ｃｉｅｎｃｅ、２５８．１２０　（１９９２）は抗原検出系を記 載しており、ここで特定のＤＮＡ分子をリポータ−として使用する。ストレプト アビジン−プロティンＡキメラを使用して、マイクロタイタープレートのウェル 上に固定化された抗原−モツクローナル抗体複合体にビオチニル化ＤＮＡを取り 付けた。複合化ＤＮＡのセグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増 幅し、そしてＰＣＲ生成物をゲル電気泳動により分析した。この方法は、多数の 試薬の添加の必要性および広範な洗浄の要件により制限される。

発明の要約 出願人は、被検体依存性リポータ−系の検出可能な応答を増幅することによって 、被検体を検出する方法を開示する。標的核酸配列が被検体の存在に応じて固定 化された後、前記標的核酸配列の核酸の複製を使用して増幅は達成される。

本発明は、流体試料中の被検体の検出および定量の増幅された検出の方法である 。この方法はまず被検体を固定化して、出願人が「被検体依存性リポータ−系Ｊ 　（ＡＤＲＳ）と呼ぶものを形成する。このＡＤＲＳは、試料中の被検体の存在 に応答して固定化された標的核酸配列から構成されているであろう。次に、ＡＤ ＲＳの固定化された標的核酸配列を、標的配列を複製できる条件下に、核酸複製 組成物と接触させ、そして標的の複製を実施する。そして最後に、複製された標 的核酸配列を検出し、これにより被検体の存在を決定できる。

出願人の増幅された検出方法は、ある数の異なる方法で実施するように特別に設 計することができる。例えば、出願人はこの方法の４つの可能な変法を提示した （参照、第１図、第２図、第３図および第６図）。

出願人の方法の好ましい態様において、標的配列と異なる参照核酸配列をＡＤＲ Ｓとともに１または２以上の工程において含め、そしてその方法のアッセイ条件 下に標的配列と同時に複製する。これらの参照配列は、複製された標的配列と検 出可能に区別され、したがって各特定のアッセイ法のための内部対照として働く 配列を発生するように設計する。

第４図および第５図に示されている他の好ましい態様において、各被検体のため のリポータ−接合体の中に使用する標的核酸の「可変セグメント」の長さを変化 させることによって、１つの試料内のいくつかの被検体を検出するためにこの方 法を使用することができる。この方法において、試料のプライマーを１つの試料 内のすべての複製のために使用することができ、そして複製された核酸標的のサ イズの分離は１つの試料中の多数の被検体の便利な検出を可能とするであろう。

第６図に示されているなお他の態様において、この方法の便利な変法が開示され ており、ここでリガンドリポータ−接合体を使用して、捕捉試薬上の結合部位に ついて試料の被検体と競合させる。次いで、結合しないリガンドリポータ−接合 体上の標的セグメントを複製し、試料中の被検体の存在を示すことができる。

図面の簡単な説明 第１図は、被検体依存性リポータ−系の応答を増幅する「直接標的堆積法」を図 解する。

第２図は、被検体依存性リポータ−系の応答を増幅する「触媒標的堆積法」を図 解する。

第３図は、被検体依存性リポータ−系を増幅する「触媒間接標的堆積法」を図解 する。

第４図は、１より多い被検体／試料を検出するための「直接標的堆積法」の使用 を図解する。

第５図は、１より多い被検体／試料を検出するための「直接標的堆積法」におい て使用するためにデザインされた可変長さのリポータ−接合体を図解する。

第６図は、被検体依存性リポータ−系を増幅する「競合結合法」を図解する。

第７図は、本発明の「直接標的堆積法」アッセイにおいて複製された標的配列の 分離のために使用した電気泳動のアガロースゲルの写真である。

発明の詳細な記述 出願人は、被検体依存性リポータ−系の検出可能な応答を増幅することによって 、被検体を検出する高感度方法を開示する。この増幅は、被検体の存在に応答し て標的核酸配列の核酸の複製によって達成される。

本発明は、被検体依存性リポータ−複合体（ＡＤＲＣ）の応答を増幅する方法を 提供する。ＡＤＲＣは被検体に応答して形成され、そして結合した被検体を含有 する。ＡＤＲＣは標的核酸を直接固定化することができるか、あるいは他の試薬 と反応して、究極的にレセプター上に固定化された標的核酸配列を生ずる。生ず る生成物は核酸複製系であり、これは、適切な複製試薬を添加するとき、標的核 酸配列の多数のコピーを形成することができる。全体の固定化された複製系は、 出願人により、被検体依存性リポータ−系（ＡＤＲＳ）と呼ばれる。ＡＤＲＳか ら生ずる増幅された核酸配列のコピーは検出可能であり、被験流体中の被検体の 検出および測定のために有用な手段を提供する。

用語「被検体」は、本発明の方法により検出またはアッセイすべき物質を呼ぶ。

典型的な被検体は次のものを包含するが、これらに限定されない：タンパク質、 ペプチド、核酸セグメント、分子、細胞、微生物および断片およびそれらの生産 物、あるいは取り付は部位、結合構成員またはレセプター（例えば、抗体）を開 発することができる任意の物質。

用語「被検体依存性リポータ−系Ｊ　（ＡＤＲＳ）は、被検体の存在に応じて形 成される固定化された系を呼ぶ。この系は固定化された核酸標的配列を含有する であろう。引き続いて、この被検体はこの標的核酸配列の増幅されたコピーの検 出により検出または定量される。

用語「被検体依存性リポータ−複合体Ｊ　（ＡＤＲＣ）は、上の系の１つの成分 を呼ぶ。ＡＤＲＣは、固定化された被検体捕捉試薬、被検体、およびリポータ− 接合体を呼ぶ。

用語「固定化された捕捉試薬」は、適当な支持体への取り付けにより固定化され た被検体に結合できる物質、例えば、抗体、レセプター、レクチン、核酸または 結合性タンパク質を呼ぶ。また、ある場合において、固定化された捕捉試薬は、 単に、中間の物質の助けなしに被検体が結合できる固体の支持体マトリックスか ら構成することができる。

用語「リポータ−接合体」は、１）結合性対の１構成員、例えば、抗体、レクチ ン、レセプターまたは結合性タンパク質あるいは被検体に結合することができる 他の部分に結合した標的核酸配列からなる接合体（第１図におけるように）：あ るいは２）結合性対の１構成員、例えば、抗体、レクチン、レセプターまたは結 合性タンパク質に結合した酵素からなる接合体を呼ぶ（第２図および第３図にお けるように）。

用語「標的核酸配列」または「標的配列」または「標的」は、複製して複製され た核酸標的配列を発生するＡＤＲ３内の鋳型核酸を呼ぶ。

用語「核酸複製組成物」は、核酸の複製を実施するために必要な成分からなる組 成物を呼ぶ。複製はこの分野において知られているいくつかのスキームのいずれ によっても達成することができるものを意図しており、限定されるものでないが 、ここでこのようなスキームは次の：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：または りガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を包含する。ＰＣＲ法を選択する場合、複製組成物 は、例えば、ヌクレオシド三リン酸、適当な配列をもつ２つのプライマー、ＤＮ ＡまたはＲＮＡポリメラーゼおよびタンパク質を包含する。これらの試薬および 核酸の増幅におけるそれらの使用の手順を説明する詳細は、米国特許第４，６８ ３．２０２号（１９８７、Ｍｕｌｌｉｓら）および米国特許第４，６８３．１９ ５号（１９８６、Ｍｕｌｌｉｓら）（それらを引用ニヨッテ本明細書に組み入れ る）に記載されている。ＬＣＲ法を選択する場合、核酸複製組成物は、例えば、 熱安定性リガーゼ、例えば、Ｔ、ａｑｕａｔｉｃｕｓ　リガーゼ、２組の隣接す るオリゴヌクレオチド（ここで各組の１構成員は標的鎖の各々に対して相補的で ある）、Ｔｒｉｓ　ＨＣ１緩衝液、ＫＣＬ　ＥＤＴＡ、ＮＡＤ、ジチオスレイト ールおよびサケ精子ＤＮＡからなるであろう。例えば、Ｔａｂｏｒ、Ｓ　および Ｒｉｃ用によって本明細書に組み入れる。

用語「複製された標的配列」は、複製法において生成された標的核酸配列のコピ ーを呼ぶ。

用語「核酸複製基質」は、酵素により活性化可能な部分に、必要に応じてスペー サーを介して、接続された標的核酸配列からなる接合体を呼ぶ。

用語「活性化された核酸複製中間体」は、核酸複製基質とＡＤＲＣの酵素との反 応から得られた生成物を呼ぶ。

用語「堆積した核酸複製生成物」は、レセプター上への活性化された核酸複製中 間体の堆積から生ずる生成物を呼ぶ。

用語「堆積する」または「堆積」は、固定化されたレセプターへの有向の結合（ ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ）を意味する。コノような堆積は、例えば、 共有結合の形成、固体のマトリックスへの直接結合からか、あるいは特異的結合 性対の相互作用から生ずることがある。

用語「レセプター」は、共有結合の形成を通して、あるいは特異的結合性対の相 互作用を通して、ＡＤＲ３の活性化された接合体に結合する部位を意味する。例 えば、スキームＩＩおよびＩＩＩ　（第１図および第２図参照）において、工程 ２の活性化された接合体のためのレセプターは、ＡＤＲＣを固定化する同一支持 体上に位置することができる（示すように）か、あるいは工程２の活性化された 接合体のためのレセプターは異なる不溶性支持体上に位置することができる。

用語「結合性基質」は、結合性射程の第１構成員、必要に応じてスペーサー、お よび酵素により活性化可能な部分からなる接合体を呼ぶ。

用語「結合性対」は、免疫型結合性対のクラスの任意のもの、例えば、抗原／抗 体またはハブテン／抗ハブテン系：およびまた、非免疫型結合性対のクラスの任 意のもの、例えば、ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン：葉酸 ／葉酸結合性タンパク質：相補的核酸断片ニブロチインＡまたはＧ／免疫グロブ リン：および共有結合を形成する結合性対、例えば、スルフヒドリル反応性基、 例えば、マレイミドおよびハロアセチル誘導体、およびアミン反応性基、例えば 、イソトリオシアネート、スクシニミジルエステルおよびスルホニルハライドを 包含する。

用語「活性化された結合性中間体」は、結合性基質とＡＤＲＣの酵素との反応か ら得られた生成物を呼ぶ。

用語「堆積した結合性生成物」は、レセプター上に堆積した活性化された結合性 中間体を呼ぶ。

用語「核酸複製接合体」は、結合性射程の第２構成員、必要に応じてスペーサー 、および標的核酸配列からなる接合体を呼ぶ。

用語「核酸複製結合性対複合体」は、堆積した結合性生成物および核酸複製接合 体との間で形成した複合体を呼ぶ。

用語「複製対照」は、参照核酸配列および前記参照配列の核酸の複製を促進する ようにデザインされたプライマーの同種の組からなる混合物を呼ぶ。

用語「参照核酸配列」または「参照配列」は、標的核酸配列と異なる鋳型核酸を 呼ぶ。参照配列をＡＤＲ３内に組み込み、そしてさらに複製して定量を改良する アッセイ対照として働かせることができる。

用語「参照核酸接合体」は、参照核酸配列、必要に応じてスペーサー、および被 検体または被検体同等体からなる接合体を呼ぶ。

用語「シグナル発生核酸」は、酵素的手段またはエネルギー放射を介して検出可 能な部分で修飾または標識化された核酸を呼び；次のものを包含するが、これら に限定されない：蛍光性部分、放射性標識、または光放射性部分。

用語「プライマー」は、標的化核酸の少なくとも１つの鎖の一部分に対して相補 的でありかつその目的が標的化配列の核酸の複製を保証および指令することであ る核酸配列を呼ぶ。プライマーは標的または参照配列の特定のセグメントに対し て相補的であるようにデザインされ、そして他のプライマーと組み合わせて使用 することができ、こうして「プライマーの組」または「プライマーの対」を形成 することができる。プライマーのサイズ、ベースの配列、相補性および標的の相 互作用についての要件は、本発明の詳細な説明のプライマーの節において論じら れる。

用語「プライマー」は、それ自体、一般にここにおいて核酸の複製プロセスを開 始する機能を有する配列結合性オリゴヌクレオチドを包含するために使用する： このような複製プロセスは、例えば、ＰＣＲＳＬＣＲまたは多数のオリゴヌクレ オチドのイニシエイターよりむしろ単一のものを使用する他の酵素反応を包含す ることができる。

節「複製された核酸配列」または「複製された配列」は、ＡＤＲＳアッセイのス キーム内で生成した核酸の複製生成物を呼び、そして複製された標的配列および 複製された参照配列の両者を包含するためにこの文脈内で使用される。

用語「リガンド」は、被検体特異的結合性対の１構成員、例えば、分子、タンパ ク質、ペプチド、核酸セグメント、治療剤、ポリペプチド、毒素、ヌクレオチド 、炭水化物、細胞、微生物、抗体、レクチン、レセプター、結合性タンパク質、 あるいは被検体と同一であるか、あるいは構造的に被検体に関係し、そして被検 体特異的結合性対の第２構成員に結合できる化学的因子を呼ぶ。リガンドは化学 的取り付けが可能となるように構造的に修飾することができる。

用語「リガンドリポータ−接合体」は、リガンドにカップリングした標的核酸配 列からなる接合体を呼ぶ。リガンドは標的の３゛末端、５゜末端あるいは３゛　 と５′末端との間の任意の位置において力１．プリングすることができる。さら に、リガンドは固定化された捕捉試薬上の被検体結合性部位について同一の被検 体と競争することができる。

用語「固定化された被検体複合体」は、被検体と固定化された捕捉試薬との間で 形成された複合体を呼ぶ。

本発明は、試料中の被検体の検出および定量のための増幅された検出方法を提供 する。この方法は、工程ｉ）において、被検体を固定化して［被検体依存性リポ ータ−系Ｊ　（ＡＤＲＳ）と呼ぶものを形成することからなる。ＡＤＲＳは、試 料中の被検体の存在に応じて固定化された、固定化標的核酸配列から構成される であろう。次に、工程ｉｉ）において、ＡＤＲＳの標的核酸配列を、標的配列を 複製できる条件下に、核酸複製組成物と接触させる。工程１ｉｉ）において、標 的配列は複製される。核酸の複製のためのいくつかの既知の方法の任意のものを 使用できる。添加する複製組成物は、標的配列の複製に必要な試薬から構成され る。そして最後に、工程ｉｖ）において、標的核酸配列を検出し、これにより被 検体の存在を決定することができる。複製された標的核酸配列は、ある数の現在 入手可能なリポータ−検出スキームの任意のものを使用して検出することができ る；このようなスキームの例は、大きさ弁別、リガンドの捕捉、放射線検出、発 光検出、蛍光の検出、またはそれらの任意の組み合わせであり、これらの検出ス キームの任意のものを酵素的に仲介できる場合を包含する。

本発明の増幅された検出方法は、ある数の異なる方法において実施するように特 別にデザインすることができる。例えば、出願人は、標的配列がＡＤＲ３内で究 極的に形成される方法において異なる、この方法の４つの可能な変法（参照、第 １図、第２図、第３図および第６図）を提供した。

多数の標的核酸試薬を異なる被検体の検出のためのアッセイ内で同時に使用する ことができるか、あるいはアッセイの対照を提供するために使用することができ る。本発明の方法の好ましい態様において、標的配列と異なる参照核酸配列を１ または２以上の工程においてＡＤＲ３内に含め、そしてその方法のアッセイ条件 下に標的配列と同時に複製することができる。これらの参照配列は、複製された 標的配列と検出可能に区別され、したがって各特定のアッセイ法のための内部の 対照の測度として働く配列を発生するようにデザインされるであろう。

他の好ましい態様において、各々が別々の被検体に対して特異的な、多数の標的 核酸試薬を同一アッセイの環境において一緒に使用して、多数の被検体の同時の 検出を促進することができる。

本発明の１つの態様は、「直接標的堆積法」と呼ばれ、第１図に示されている。

この態様の工程ａにおいて、被検体（Ａ）を含有する被験試料をまず固定化され た捕捉試薬（Ｂ）、例えば、抗体と接触させ、次いで標的核酸配列（Ｃ）からな るリポータ−接合体と接触させて被検体依存性リポータ−複合体（ＡＤＲＣ）（ Ｄ）を形成し、これから過剰の試薬を洗浄により除去する。工程すにおいて、Ａ ＤＲＣを核酸複製組成物と接触させ、そして複製を実施して複製された核酸（Ｅ ）を生成する。工程Ｃにおいて、複製された核酸を検出する。この態様において 、リポータ−接合体は標的核酸配列および、例えば、抗体または他の被検体結合 性試薬からなる接合体である。

当業者により容易に実施される、この方法の明らかな変法は適応であり、ここで 工程ａ後、溶液の中に遊離して止まる、過剰の非固定化リポータ−接合体を固定 化された捕捉試薬−被検体複合体から分離する。被検体試料の中に遊離で止まる 過剰の非固定化リポータ−接合体の量は、試料の中に最初に存在する被検体の量 に対して比例する。この非固定化リポータ−接合体は、結合した被検体複合体か らの分離後、次いで、例えば、溶液中で遊離である間に複製することができ、そ して複製された核酸を検出し、これにより試料中の被検体の存在を決定する。

本発明の他の態様は、「触媒標的堆積法」と呼ばれ、第２図に示されている。こ の態様の工程ａにおいて、被検体（Ａ）を含有する被験試料をまず固定化された 捕捉試薬（Ｂ）、例えば、抗体と接触させ、次いで標的核酸配列（Ｃ）と接触さ せて被検体依存性リポータ−複合体（Ｄ）を形成し、これから過剰の試薬を洗浄 により除去する。この態様において、リポータ−接合体（Ｃ）は核酸複製基質（ Ｆ）（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）上のある部分を活性化するこ とができる酵素およびある数の結合性対（例えば、抗体）から構成される。工程 すにおいて、工程ａにおいて形成したＡＤＲＣを核酸複製基質（Ｆ）（これは標 的核酸配列を含有する）と反応させて、活性化された核酸複製中間体（Ｇ）を形 成し、この中間体は活性化された核酸複製中間体のためのレセプターが固定化さ るときはいつでも堆積して、堆積した核酸複製生成物（Ｈ）を生成する。次いで 過剰の試薬を洗浄除去する。工程Ｃにおいて、堆積した核酸複製生成物を核酸複 製組成物と接触させて複製された標的配列の核酸（Ｅ）を生成する。工程ｄにお いて、複製された核酸を検出する。

本発明の他の態様は、「触媒間接標的堆積法」と呼ばれ、第３図に示されている 。この態様の工程ａにおいて、被検体（Ａ）を含有する被験試料をまず固定化さ れた捕捉試薬（Ｂ）（例えば、抗体）と接触させ、次いで標的核酸配列（Ｃ）と 接触させて被検体依存性リポータ−複合体（Ｄ）を形成し、これから過剰の試薬 を洗浄により除去する。この態様において、リポータ−接合体（Ｃ）は結合基質 （１）上のある部分を活性化することができる酵素（例えば、セイヨウワサビペ ルオキシダーゼ）から構成される。（Ｉ）、結合性基質は、この基質およびある 数の結合性対から構成された接合体である。工程すにおいて、ＡＤＲＣを結合性 基質（１）と反応させて、活性化された結合性中間体（Ｊ）を形成し、これは活 性化された結合性中間体のためのレセプターが固定化されるときはいつでも堆積 して、堆積した結合性対の複合体（Ｋ）を生成する。

次いで過剰の試薬を洗浄除去する。工程Ｃにおいて、堆積した核酸複製生成物を 核酸複製接合体（Ｌ）（これは標的核酸配列および結合性対の第２構成員を含有 する）と接触させて核酸複製結合性の対複合体（Ｍ）を生成する。次いで過剰の 試薬を洗浄除去する。工程ｄにおいて、核酸複製結合性対の複合体を核酸複製組 成物と接触させて、複製された標的配列の核酸（Ｅ）を生成する。工程ｅにおい て、複製された核酸を検出する。

本発明の他の態様は第１図の「直接標的堆積法」の変法であり、そして第４図に 示されている。この態様の目的は、単一の試料中のいくつかの異なる被検体を検 出する方法を提供することであり、そしてまた「多波検体法」と呼ぶすることが できる。

第４図において、工程ａにおいて、異なる被検体（ＡおよびＡ”）を含有する被 験試料をまず固定化された捕捉試薬（ＢおよびＢ’　）と接触させ、次いで各々 が標的核酸配列からなる標的核酸配列（ＣおよびＣ′）と接触させて被検体依存 性リポータ−複合体（ＤおよびＤ’　）を形成し、これから過剰の試薬を洗浄に より除去する。工程すにおいて、ＡＤＲＣを核酸複製組成物と接触させ、そして 複製を実施して複製された核酸（ＥおよびＥ’　）を生成する。工程Ｃにおいて 、複製された核酸を検出する。

この態様において、１より多いリポータ−接合体が存在し、各々は被検体特異的 抗体または標的核酸配列に連鎖した他の被検体結合性試薬からなる。リポータ− 接合体の各型のための標的核酸配列は、長さが他のリポータ−接合体の標的と異 なる、特定の長さを有する。こうして標的核酸配列の複製は異なる長さの増幅生 成物を与え、そして異なる被検体の存在は、大きさに基づ（増幅生成物の分析、 例えば、ゲル電気泳動により便利に検出することができる。特定の態様において 、長さが異なる標的核酸配列は、同一の５゛および３′プライマ一結合領域から なり、こうして同一プライマーを使用して試料の中に存在する種々の標的のすべ てを複製できるようにデザインする。試料の核酸中の多数の配列の検出に有用な 多波検体検出の他の好ましい態様（「多遺伝子アッセイ」）において、リポータ −接合体は、試料の中に存在することがある特定の核酸に対して相補的である他 の核酸配列にカップリングされた標的配列から構成される。相補的配列は試料の 核酸の中に存在する配列にハイブリダイゼーションし、これによりリポータ−接 合体を固定化する。次いで、リポータ−接合体の標的セグメントは複製され、特 異的試料の配列の存在を示す。

本発明の追加の態様は、「競合結合法」と呼ばれ、第６図に示されている。

第６図において、この態様の工程ａにおいて、被検体（Ａ）を含有する被験試料 をまず固定化された捕捉試薬（Ｂ）、例えば、抗体と接触させ、次いでリガンド に結合した標的核酸配列からなるリガンドリポータ−接合体（Ｑ）と接触させ、 ここでリガンドは固定化された捕捉試薬（Ｂ）上の結合部位について被検体（Ａ ）と競争することができる。この反応は固定化された被検体複合体（Ｎ）を形成 し、結合しないリガンドリポータ−接合体（Ｑ）を残す。次いで、リガンドリポ ータ−接合体（Ｑ）および固定化された被検体複合体（Ｎ）を洗浄により分離す る。

リガンドリポータ−接合体（Ｑ）を接触させる場合、核酸の複製が起こり、そし て被検体の存在が検出される。固定化された被検体複合体（Ｎ）を接触させる場 合、複製は起こらず、そして複製された核酸（Ｅ）は生成しない。この態様にお いて、リガンドリポータ−接合体は標的核酸配列および、例えば、捕捉試薬上の 結合部位について被検体を競争することができる他の結合性試薬からなる。

さらに、当業者は認識するように、上のいくつかの態様はアッセイを通じて別の 固定化点を使用して実施することができる。例えば、第６図において、リガンド リポータ−接合体を固定化し、そして捕捉試薬を溶液中で遊離させることができ る。

こうして、上の態様のすべてにおいて、標的核酸配列から複製された核酸の生成 を使用して被検体の検出を増幅する。

本発明の方法を使用して、広範な種類の被検体を検出することができる。一般に 、これらは次のものを包含するが、これらに限定されない：植物、動物、核酸セ グメント、分子、細胞、微生物およびそれらの断片および生産物、あるいはそれ らのための取り付は部位、結合構成員またはレセプター（例えば、抗体）を開発 することができる物質。病原体、ウィルスおよび細菌はとくに重要である。簡単 な物質は被験流体の中に溶解し、それから抽出するか、あるいはその中に懸濁す ることができる液体、気体または固体であることが考えられる。簡単な物質は医 学的、獣医学的、環境的、栄養的または工業的な意味をもつものである可能性が 最も強いであろう。限定を意図しないが、ヒト、動物、または微生物学的な源を 本発明の方法により試験することができることが考えられ、これらの源は体液、 例えば、尿、血液、血清、血漿、たん、糞便物質、肺吸引物質、滲出物；微生物 の培養流体；エアゾール；作物物質；土および地下水を包含する。

被検体に結合する固定化された捕捉試薬は、一般に、例えば、適当な支持体に取 り付けられた結合性タンパク質、レクチン、核酸または抗体から構成されるであ ろう。任意の既知の抗体は固定化された捕捉試薬の抗体として働くことができる 。さらに、特定の抗体を調製しそしてこの方法において使用できる。ある場合に おいて、被検体は直接工程との非特異的相互作用により、例えば、タンパク質と ポリスチレンとの間の相互作用により捕捉することができる。

ＡＤＲＣにおいて使用する適当な固定化支持体、レセプターの支持体および親和 性支持体（複製された核酸を捕捉するために）は、合成ポリマーの支持体、例え ば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリグリシジルメタクリレート、ポリスチ レン、置換ポリスチレン（例えば、アミン化またはカルボキシル化ポリスチレン ：ポリアクリルアミド：ボリアミド：ポリ塩化ビニル：など）ニガラスビーズ： アガロース；またはニトロセルロースなどを包含する。これらの物質はフィルム 、ウェル、ビーズ、粒子、ピン、栓または膜として使用することができる。ある いは、支持体は磁性および非磁性の粒子からなる。

これらの支持体は異なる固定化された試薬の調製に使用できる。例えば、アプロ ーチおよび試薬の形状に依存して、別々の固定化された支持体をＡＤＲＣの結合 のために、活性化された接合体レセプターの結合のために、あるいは検出工程の 間の核酸の複製生成物の捕捉のために調製することができる。あるいは、被検体 、レセプターおよび生成物の結合活動が他の結合機能と競合しないか、あるいは それを妨害しない［下に、被検体、接合体および生成物結合性試薬を同一支持体 に共固定化することができる。この方法において、ＡＤＲＣ，およびレセプター の支持体を調製し、そして別々の支持体として使用することができるか、あるい は結合性試薬を同一支持体上で組み合わせることができる。被検体結合性分子、 および試薬は当業者によく知られている技術を使用して固体の支持体上に固定化 することができる。Ｈ，Ｗｅｅｔａｌｌ、１ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍ ｅｓ、Ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ａｎｔｉｂ。

ｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、（１９７５）Ｍａｃｅｌｌ　Ｄｅｋｋｅ ｒ、Ｉｎｃ、　、二ｊ、−ヨーク。

典型的には、固定化された捕捉試薬は直径約３０μｍのグリシジルメタクリレー トのビーズおよび抗体、例えば、ヤギ抗つサギＩｇＧ抗体から構成することがで きる。試験のビーズおよび抗体を４℃においてインキュベーションし、次いで洗 浄して過剰の抗体を除去する。次いでビーズをウシ血清アルブミンで処理して未 反応のエポキシド基を結合し、そして緩衝液の中に再懸濁させる。

本発明の方法の実施において、２つの異なる型のリポータ−接合体が考えられる 。第１の型は抗体または被検体を認識する他の結合性構成員にカップリングした 標的核酸配列から成る。これらはタンパク質をアミノオリゴヌクレオチドに連鎖 する当業者に知られている方法の変法を使用して調製することができる。例えば 、これは酵素的ティリング方法を使用して達成することができ、ここでアミノ修 飾ｄＮＴＰを核酸の３゛末端上に付加する。Ａ、Ｋｕｍａｒ、Ａｎａｌｙｔ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、、１旦旦、３７６　（１９８８）。あるいは、アミン修飾塩基を 核酸塩基配列の中に合成的に導入することができる。Ｐ、Ｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉ ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１量、５２７５　（１９８７）、次いで、Ｕｒｄｅａ の方法において抗体を酵素と置換することによって、抗体をアミノ修飾核酸に核 酸に取り付けることができる。Ｍ、Ｓ、Ｕｒｄｅａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、、よ旦、４９３７　（１９８８）。

さらに詳しくは、核酸／抗体接合体の好ましい調製は、ヘテロ２官能性架橋剤を 堆積した核酸複製生成物オリゴヌクレオチド標的にカップリングし、引き続いて これをＴｓｅｎｇら、ＵＳＳＮＯ７／９４６２４７に記載されている化学を使用 して抗体にカンプリングすることを包含する。この分野における標準のプロトコ ールを越えたこの連鎖化学の主要な利点は、それが不都合な反応、例えば、ホモ ＤＮＡまたはホモ抗体ポリマーの発生を減少することである。

抗体へのオリゴヌクレオチドの化学的取り付けを促進するために、合成の間にシ アンエチルホスホルアミダイト化学を使用してオリゴヌクレオチドの５°末端に 第１７ミノ基を導入することによって、オリゴヌクレオチドをアミノ修飾する。

さらに、アミノ修飾されたオリゴヌクレオチドを、スルフヒドリル基を導入する ヘテロ２官能性試薬で修飾する。

試薬のＮ−スクシニミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）は、アミノ 修飾オリゴヌクレオチドにカップリングした第１アミン反応性基のＮ−ヒドロキ シルースクシンイミド（ＮＨ３）を使用してアセチル保護スルフヒドリル基を導 入するヘテロ２官能性架橋剤である。抗体を他のＮＨ３架橋剤のスクシニミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣ ｃ）で修飾する。ＳＭＣＣは抗体のペプチド内の第１アミン基（例えば、リジン 上のε−基）と反応して、マレイミド基（遊離のスルフヒドリル反応性基）を抗 体に導入する。マレイミド修飾抗体を５ＡＴＡ修飾抗体と混合する。５ＡＴＡ修 飾オリゴヌクレオチド上のアセチル保護スルフヒドリル基をヒドロキシルアミン の添加により活性化して、反応性の遊離スルフヒドリル基を生成する（ＵＳＳＮ ０７／９４６２４７）。遊離のスルフヒドリルを含有するオリゴヌクレオチドは 直ちにマレイミド修飾抗体と反応してＤＮＡ−抗体接合体を形成する。

第２の接合体の型は、抗体または結合性対の他の構成員にカップリングした酵素 からなる。また、これらはこの分野においてよく知られている方法を使用して調 製することができる。Ｄ、Ｇ、Ｗｉ　１１　ｉ　ａｍＳ％Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ、７９．２６１　（１９８４）。あるいは、酵素結合性接合体は、組 換えＤＮＡおよび遺伝子操作の技術を使用して発生させることができる。１．Ｐ ａ５ｔａｎおよびＤ　Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、５ｃｉｅｎｃｅ、λ５４，１１７ ３　（１９９１）、リポータ−接合体に適当な酵素は次のものを包含するが、こ れらに限定されない：ヒドラーゼ、リアーゼ、オキシド−リダクターゼ、トラン スフェラーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼ。他のものはペルオキシダーゼ、グ ルコースオキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグルコシダーゼで ある。特定の例は、アルカリ性ホスファターゼ、リパーゼ、ベーターガラクトシ ダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびブタ肝臓エステラーゼを包含す る。リポータ−接合体の選択は、本発明のどの態様を実施するかに依存する。

標的核酸・ 対数的核酸の複製技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはりガ ーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））は、特定の核酸配列のコピーを増幅するための高感度 手段を提供する。これらの方法は２つの非常に重要な可能性を与える。１つは復 製方法の特異性である。単一の配列からの情報を、核酸と高い濃度のタンパク質 との複雑な混合物を含有する試料の存在下に、特異的に複製することができる。

第２はこの方法により提供される高い感度である。〉１０６倍程鹿の標的ＤＮＡ の複製を温度サイクルの方法により達成することができる。現在、病原体を未知 の試料の混合中で配列のプローブにより検出することができるが、しかしながら 、感度はほぼわずかに１０３細胞／ｍｌに到達するにすぎない。標的ＤＮＡの対 数的配列の複製は、１〜５細胞／１００ｍ１程度に少ない検出を可能とする、現 在大きく拡張したプローブの試験感度を有する（Ａ。

Ｋ、Ｂｅｊら、Ａｐｐ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、５６．３０７ 　（１９９０）参照）。

前述したように、標的核酸を複製して標的配列の核酸の増幅されたコピーを生成 する。標的配列のデザインは重要である。なぜなら、複製は適当な１または２以 上のプライマーを必要とするからである。そしてまたな標的は検出の異なる手段 および反応条件の柔軟性を提供するからである。

詳しくは、標的核酸配列は２０〜５０００塩基の長さて変化することができる。

好ましくは、標的をＰＣＲ増幅のために使用する場合、それは３０〜１０００塩 基の範囲である。標的は２つの相補的核酸鎖の７λイブリッド二重らせんからな る二本鎖（ｄｓ）であることができるが、あるいは−重鎖（Ｓ　Ｓ）であること ができる。二本鎖の標的は対数的連鎖重合に参加するために相補的鎖の生成を必 要としない。いずれがの鎖または両者の鎮は、結合または検出のために使用する 修飾された塩基を有することができる。標的の１つの鎮のみを支持体に取り付け るとき、相補的鎖は溶液相中でプライマーと自由にアニーリングする。いったん 支持体の混合物から除去されると、鎖の複製は妨害されない。こうして二本鎖の 標的は固定化された標的のためにと（に有用である。なぜなら、加熱変性は複製 のために支持体から除去された一方の鎖を自由にするからである。

しかしながら、捕捉試薬を調製するとき、二本鎖標的の一本鎖をまた使用するこ とができる。例えば、下に示すように、標的の１つの鎖のみを第１増幅サイクル の間に使用する。次いでプライマー＃１のアニーリングおよび延長は、−重鎖標 的を二本鎖の複製物に変換することができる。引き続くサイクルと協調して作用 して、プライマー＃１および＃２は新しく合成された二本＃Ａ櫟的核酸の対数的 複製をもたらす。−重鎮標的は、１）ただ１つの饋をつくることが必要であるの で、安価であり、モして２）相補的鎖とのアニーリングを予め必要としないとい うことにおいて、いくつかの試薬の調製の利点を提供する。適当にデザインした ＳＳまたはｄｓ標的の増幅のために、い（っがのプライマーを使用することがで きる。

本発明の好ましい簡素化において、対数的複製は一本鎖標的または単一のプライ マーを使用して達成することができる。これは５ｓＩｉｉｌｌ的の１末端にプラ イマー結合配列を、そして標的配列の反対の末端にブライマ−結合部位の相補的 鎖を含有するように、標的配列をデザインすることによって達成することができ る。プライマーのアニーリングおよび延長は、同一のプライマー結合部位を含有 する相補的標的鎖の形成を生ずる。

この方法において、生ずるｄｓ標的の両者の（＋）および（−）鎖は標的二重ら せんの両末端に同一プライマー部位を含有し、そしてポリメラーゼおよび標的核 酸と組み合わせて使用する同一プライマーは両者の＋および一標的鎖の複製を促 進する。

単一プライマーのアプローチは、アッセイの複雑さの減少および再現性の増加の 利点を提供する。ただ１つのプライマーを調製しそして検出のために準備しなく てはならないので、簡素化が達成される。いっそう重要なことには、単一プライ マーは核酸の複製の生産性を増強することができる。なぜなら、各プライマーは 精確に同一の溶融温度（Ｔｍ）を有するからである。こうして、温度再循環の拘 束はいっそう容易にコントロールされる。さらに、プライマー−２量体の複製か ら生ずる非特異的核酸の形成の可能性は減少する。

好ましい態様において、標的核酸配列の塩基の組成および配列を変化させて異な るアンセイの要件を満足することができる。例えば、標的は複製の間に増幅され ない配列セグメント、あるいは標的配列の長さの変更に使用する可変領域を含有 するすることができる。例えば、標的核酸配列は５゛末端に抗体またはリガンド の取り付けのためのカンプリング連鎖、および３゛末端にプライマー結合部位、 およびそれらの間に挿入された可変領域を含有するようにデザインできることが 考えられる。可変領域は任意の長さまたは組成であることができ、標的増幅法の 要件によってのみ制限される。これは第５図に示されており、リポータ−接合体 の１例を提供し、ここで標的核酸が５′末端における化学的カップリング連鎖を 通して抗体に接合されている。標的オリゴヌクレオチドは複製プライマーの一方 に対して相補的な５量結合領域、および他方の複製プライマーを結合するための ３量部位を含有することができる。標的配列内に核酸塩基の可変領域が存在し、 この可変領域は長さまたは配列が可変であり、これにより大きさまたは他の因子 、例えば、結合する能力、または明確なシグナル（例えば、蛍光、放射線など） を生じる能力に基づいて複製した標的を検出する手段を提供することができる。

多波検体検出のための他のペプチドは第４図に示されており、ここで長さを変化 させる標的核酸を使用して種々の被検体を検出する。例えば、同一のプライマー 結合部位および同一配列を有するが、内部の標的領域のみが異なる１系列の核酸 標的を異なる結合性対にカップリングすることができ、これらの結合性対は異な る被検体（例えば、被検体特異的抗体、レクチン、レセプターなど）に結合する ことができる。次いでこれらのリポータ−接合体の各々の複製生成物はサイズに 基づいて容易に区別することができ、そして、例えば、ゲル電気泳動により都合 よく可視化することができる。「多遺伝子アッセイ」において、ここで検出すべ き被検体は試料の核酸内に含有されるＲＮＡまたはＤＮＡの特定の配列であり、 リポータ−接合体は試料の核酸の特定の部分に対して相補的である核酸配列にカ ップリングされた変化する鎖長の標的から構成されている。この方法において、 １つの試料内の多数の遺伝子または配列の部位を１つのアッセイにおいて都合よ くスクリーニングすることができる。

ただ１つの塩基により鎖長が変化する配列を減少することができる、核酸分離の 高い分解能は、多数の被検体を含有する多数の試料をスクリーニングすべきとき 、この方法を極めて魅力的とする。

さらに、検出可能なシグナルを発生することができる増幅された核酸の検出を促 進するように標的配列をデザインすることができる。例えば、標的配列は標識化 プライマーまたは標識化塩基（例えば、蛍光、放射線、光の放射）の組み込みを 提供して、対応して標識化されたシグナル発生核酸を生成することができる。鎖 内の、および相補的鎖の間の標識化塩基の型、数および位置はシグナルの検出を 促進するようにデザインする。

好ましい態様において、蛍光体の間のエネルギーの転移を可能とするか、あるい は近位に位置するカップリングされた酵素の間の酵素チャンネリングを可能とす るように、特異的に標識化した塩基を配列の中に配置することが望ましい。

詳しくは、励起蛍光体（Ｆｌ）と放射蛍光体（Ｆ２）との間の距離がらせん二重 らせんアセンブリー内で１２塩基（約５０オングストローム）以内にある場合、 適当に標識化された塩基の間のエネルギーの転移を遠う好ましい距離は５〜１２ 塩基である。これは、標識化塩基（ＦｌおよびＦ２）の一方がらせんの各回転に おいてシグナルの核酸の中に交互に組み込まれるように、標的およびプライマー の配列をデザインすることによって達成することができる。あるいは、標的また はプライマーの塩基配列は、ＦｌおよびＦ２がシグナルの核酸の反対の鎖の中に 組み込まれるようにデザインすることができる。標識化塩基の位置は、鎖のハイ ブリダイゼーションのとき、ＦｌおよびＦ２がく４０オングストロームの距離で 二重らせん内に位置するようにコントロールされる。こうして、シグナルの核酸 内で、鏡開および鎖内の両者の塩基は蛍光体をエネルギーの転移に適当な距離内 に位置決めすることができる。

エネルギーの転移に参加する蛍光体の要件は文献に詳しく記載されている。Ｌ、 Ｅ、Ｍｏｒｒ　１ｓｏｎ、Ａｎａ　１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１７迭、１０１　（ １９８８）。一般に、エネルギーの転移を達成するために、また、励起蛍光体（ Ｆｌ）の放射スペクトルが励起蛍光体（Ｆ２）の吸収または励起のスペクトルと オーバーラツプするように、励起塩基（Ｆｌ）および放射塩基（Ｆ２）の標識化 に使用する蛍光体の適当な組み合わせを選択することが重要である。例えば、次 の蛍光体の組み合わせは、エネルギーの転移のために普通に入手可能な適当な候 補を包含する・励起蛍光体（Ｆｌ）　放射蛍光体（Ｆ２）ピレンブチレート　β −フィコエリトリンフルオレセイン　テキサス・レッド ルシファー・イエロー　ローダミン ルシファー・イエロー　テキサス・レッドフルオレセイン　ローダミン フルオレスカミン　フルオレセイン 他の好ましい態様において、標的およびプライマーの配列は結合性対の第１構成 員（例えば、ジゴキシゲニン、ビオチン）で標識化した塩基を組み込むようにデ ザインすることができる。組み込まれた標識化塩基を使用して、生ずる核酸を固 定化するか、あるいはリポータ−（例えば、ストレプトアビジン−アルカリ性ホ スファターゼ、抗ジゴキンゲニンーアルカリ性ホスファターゼ）で標識化した結 合性対の第２構成員とそれらを複合化することができる。異なる塩基またはプラ イマー、結合性構成員（例えば、ビオチン）て標識化した１または２以上、およ び１または２以上のリポータ−で標識化した１または２以上の組み込みを可能と するように標的配列をデザインすることができることが考えられる。ビオチン標 識化塩基が鎖の一方の末端に主として組み込まれ、そしてリポータ−塩基が他方 の末端にまたは結合性構成員から多少の距離を置いて組み込まれるように、配列 をコントロールすることが望ましい。それにもかかわらず、３′末端における、 ならびに自己相補的配列とのＣおよびＧの連続的存在（３またはそれ以上）を回 避することが重要である。

例えば、標的遺伝子配列は次の配列を含有する：５Ｉ　ＡＴＧ　ＣＧＴ　ＡＧＣ へＧ口　７７丁　入ＣＣＧＣＡ　ＧＡＧ　入子ＣＡＴＧ　ＣＧＴ　入τＧ　ＴＡ ＣＣへτ　Ｇ二重　３−３Ｉ　了ＡＣＧＣＡ　丁ＣＧ　ＴＣＧ　入入入　丁ＧＧ 　ＣＧＴ　１ｊｃ　１入Ｇ　ＴＡＣＧＧＡ　ＴＡＣＡＴＧ　Ｇ丁入　ＣＧＡ　Ｓ 書５「　へ丁ヒ　Ｃ：入　にτ　ＧτＡ　入ＧＴ　Ｃ）１　λＧこ　τＧＴ　Ｔ ＴＣＣ丁Ｇ　３’　配列番号　、１３’Ｔ八ＧＧど　ＧＧＡ　Ｃ入〕　τＣ八　 Ｇ：入　丁ＣＳ　Ａ口へ　λ入ＧＧへｃ　ｓ’　配列番号　２核酸複製基質は、 標的核酸配列、必要に応じてスペーサー、および酵素により活性化可能な部分か ら構成される。標的核酸配列は前述のガイドラインに従い調製する。酵素により 活性化可能な部分は、固定化されり捕捉試薬の固体の支持体上のレセプターに結 合できる反応性中間体を形成する任意の部分であることができる。好ましい懸様 において、酵素反応性部分はチラミンである。核酸複製基質および核酸複製接合 体を含むリポータ−接合体は、接合体の２つの機能的要素を連鎖する分子のスペ ーサーセグメントを含有することができる。スペーサーの１つの目的は、標的ま たは結合性機能の１ｉ製セグメントを固相支持体の表面から延長することである 。有用なスペーサーはアフィニティクロマトグラフィー分野においてよく知られ ている。例えば、Ｈ，５ｃｈｏ。ｔ、Δ土±１ｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ａｐｈ、（１９８４）、ＭａｒｃｅＩＩ　Ｄｅｃｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、：、−Ｂ −りは、異なルスヘーサーおよびそれらの使用を記載している。有利には、スペ ーサーは約５０原子まで、好ましくは５〜３０原子の鎖を含む。組成において、 スペーサーは次の群の１または２以上を包含するが、これらに限定されない多官 能性セグメントであることができる：ペプチド、炭化水素、ポリアルコール、ポ リエーテル、ポリアミン、ポリイミンおよび炭水化物、例えば、−グリシルーグ リシルーグリシルーまたは他のオリゴペプチド、カルボニルジペプチド、および オメガアミノ−アルカン−カルボニル基、例えば、　ＮＨ（ＣＨ２）　２　Ｃｏ −、スペルミンまたはスペルミジン基、オメガ−アルカンジアミン基、例えば、 　ＮＨ（ＣＨ２）ｓ　ＮＨ−または−Ｎ　Ｈ−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ　Ｈ−。スペーサ ーセグメントは、また、ポリマー単位、例えば、多糖、ポリエチレンオキシド基 、グリセリル、ペンタエリスリトールなどの基から構成することができる。スペ ーサーセグメントは直接連鎖するか、あるいは２価のへテロ２官能性またはホモ ２官能性カプラー、例えば、５ＡＴＡ　（Ｎ−スクシニミジルＳ−アセチルチオ アセテート）、ＳＭＣＣ（スクシニジル４−（Ｎ−マレイミドエチル）シクロヘ キサン−１−カルボキシレート）、ｐ−フェニルジインチオシアネート、ジチオ ビススクシミジニルプロピオネート、１゜４−ブタンジオールジグリシジルエー テル、ジイソシアネート、カーポジイミド、グリオキサル、グルタルアルデヒド またはスルホスクンミジニル６−（４°　−アジド−２′ニトロフエニルアミノ ）−ヘキサノエートを通して連鎖することができる。

標的核酸配列の長さはプライマーの取り付は部位を越えて延長することがてきる 。こうして標的の延長した長さは別のスペーサーを提供し、こうして分子のスペ ーサーの長さを減少するか、あるいはその必要性を排除し、そしてまた多分標的 の複製の効率を増加することができる。例えば、標的取り付は部位に付加された 塩基は標的セグメントを固定化点から離れて延長するであろう。この方法におい て、スペーサーの長さは減少するか、あるいはある場合において排除することが できる。一般に、標的に５〜３０塩基の添加は固定化された標的の複製の効率を 増加するために十分であろう。分子のスペーサーの組成および長さは、ヌクレオ チド標的配列の増幅の間の干渉を防止するようにデザインされる。最近の発見は 、アミノリンクに隣接する標的配列がプライマーの取り付けおよび対数的連鎖反 応のためにアクセス可能であることを示す。（Ｓ、ＳｔａｍおよびＪ、Ｂｒｏｓ ｉｕｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　ｅ　ａ　ｒ　ｃ　ｈ、１９　１ ．３５０　（１９９１）。

いったん標的核酸配列がデザインされると、核酸複製基質は酵素標識化オリゴヌ クレオチドのプローブについて開発されたよく確立された手順を使用して調製す ることができる。参照、例えば、Ｇ、Ｈ，ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ、Ｍ、 Ｍ　、ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ、（１９８９）、ｐ、１３６−１４８．５ｔｏｃｋｔ ｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク。

さらに詳しくは、標的核酸配列の合成の間に、第１アミンを含有するスペーサー のアームで修飾された塩基を標的の５゛末端および／または３゛末端に導入する ことができる。５゛アミノ基を含有する塩基を導入するための試薬は商業的に入 手可能であり（Ｃ８−アミノへキシル−ＡＴＰおよびＮ６−アミノリンク　ＡＴ Ｐ、Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｏ）　、そして配列の中への導入を達成する方法はこの 分野において知られている。Ｎ−モノメトキシトリチル−Ｃ６−アミノ修飾シア ノエチルホスホルアミダイト試薬（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ　Ｉｎｃ、、４０３０　Ｆａｂｉａｎ　ＷａｙＳＰａｌｏ　Ａｌｔｏ、カリ７ ｔルニア州９４３０３）またはアミノリンク（Ａｍｉｎｏ　ｌ　ｉｎｋ’）２　 （Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、）は、標的オリゴヌクレオ チドの合成の間に５′末端の第１脂肪族アミンをオリゴヌクレオチドに導入する 容易な手段を提供する。カップリング反応の詳細な手順は、クロンチク（Ｃ１ｏ ｎｔｅｃｈ）社報Ｎｏ、ＰＢＯ２２７８９−１から、あるいはアプライド・バイ オシステムス・インコーホレーテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 、Ｉｎｃ、）、３９２型マニユアルから入手可能である。いったんアミノ修飾核 酸標的が調製されると、次いでそれをコハク酸無水物と反応させることができる ；これは側鎖の長さを延長しそして、また、標準の方法を使用して活性化してＮ −ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ３）中間体（１）を形成することができる末 端のカルボン酸を提供する。次いでこの中間体を、例えば、チラミンに化学的に カップリングして核酸複製基質（２）を形成することができる。

（１）ＮＨ３（Ｃ）、リンカー−５°標的３′（２）チラミン−（Ｃ）７リンカ ーー５゛欅的３゛一般的試薬は、また、内部の単一または多数のアミノ基を遺伝 子配列の中に導入するためにクルアケム（Ｃｒｕａｃｈｅｍ）（４６０Ｓｐｒｉ ｎｇ　ＰａｒｋＳＨｅｒｎｄｏｎ、バージニア州２２０７０）クロンチク・ラボ ラトリ−（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（４０３０Ｆａｂｉａｎ 　ＷａｙＳＰａｌｏ　Ａｌｔｏ、カリフォルニア州４４３０３）またはアプライ ド・バイオシステムス・インコーポレーテッド（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、カリ フォルニア州）から入手可能である。しかしながら、末端標識化オリゴマーは内 部的に標識化された核酸よりも、結合および反応のためにいっそアクセス可能で ある傾向がある。

他の好ましい態様において、標的核酸の配列はリガンドを組み込むようにデザイ ン可能であると考えられる。ここにおいて使用するとき、用語リガンドは被検体 に構造的に関係するりガント、および被検体の結合をまねるリガンドの両者を包 含するが、ただしリガンドはレセプター結合部位について被検体と競争すること ができることを条件とする。こうして、リガンド−標的接合体は結合性対の第１ 構成員として機能することができ、そして結合性対の第２構成員（例えば、抗体 ）への被検体の結合と競合する、被検体の結合特性をまねることができる。本発 明の目的に対して、３０００より小さい分子量のりガントは好ましいが、１５０ ０より小さい分子量をもつリガンドは最も好ましい。

組み込まれたリガンドの位置的向きおよび数の変動性は標的のデザインに対して 柔軟性を与え、アッセイの感度を増加し、そして捕捉試薬との接合体の相互作用 を最適化する。リガンドを二重らせんの標的核酸の一方または双方の鎖の中に組 み込むことができることが考えられる位置的に、リガンドは標的の５゛　または ３°末端に組み込むか、あるいは核酸配列内の内部の塩基上に組み込むことがで き、ここで末端における組み込みは一般に好ましい。欅的当たり任意の数のりガ ントを組み込むことができることが考えられるが、この目的がアッセイの最大の 感度を達成することにある場合、比較的小さい数のりガントが好ましく、ここで １〜２の範囲は最も好ましい。最大速度の接合体の捕捉を望む場合、標的当たり 大きい数のりガントが好ましい。

核酸配列の中ヘリガントを組み込む方法は、化学的または酵素的手段によるか、 あるいはりガント標識化塩基を標的配列の中に直接組み込むことによって達成す ることができる。化学的組み込みは、前述したように、チラミン複製基質の合成 のために使用するものに類似する化学を利用する。典型的には、第１アミンを含 有するスペーサーアームで修飾された塩基を標的の５゛末端または３°末端に導 入することができ、これはさらにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ３）中間 体に修飾することができ、この中間体は引き続いてリガンドに化学的にカップリ ングするこ之ができる。

好ましいアプローチにおいて、ポリメラーゼ連鎖反応の間にリガンド標識化塩基 またはプライマーを使用して、リガンド組み込み配列を調製する。リガンドの標 識化は１または２以上のリガンドで修飾されたプライマーを組み込むか、あるい はリガンド標識化ｄＮＴＰを使用することによって達成できることが考えられる 。リガンド標識化プライマーは、標準のオリゴヌクレオチドシアノエチルホスホ ルアミダイト化学を使用して、プライマーの合成の間に選択した塩基をリガンド 修飾ホスホルアミダイト塩基と置換することによって調製できる。あるいは、連 鎖可能な分子スペーサーを含有する修飾された塩基を使用してプライマーを調製 する場合、リガンドはプライマーの合成後にスペーサーに化学的連鎖することが できる。他の方法において、増幅手順の間に標的核酸配列の中に組み込むことが できるリガンド標識化ｄＮＴＰまたはアミノ修飾ｄＮＴＰを使用する。

化学的または酵素的手段と反対にＰＣＨにより、リガンド組み込み核酸配列の合 成すると、い（つかの利点が得られる。例えば、化学的合成において固有の配列 の失敗のために、１００塩基より長い標的はいっそう容易に構成される。さらに 、標識化プライマーを使用する場合、プライマー中のリガンドの適当な配置によ り標的配列の一方または双方の鎖内のりガントの位置決めおよび数の両者をコン トロールすることができる。

対照的に、標識化ｄＮＴＰの使用は多価リガンドリポータ−接合体の調製を促進 するが、リガンドの数および標識化のパターンの正確なコントロールは信頼性に 劣る。なぜなら、ｄＮＴＰ−リガンドの組み込みはｄＮＴＰと修飾されたｄＮＴ Ｐ類似体との間のポリメラーゼの弁別および標的核酸配列中の特定の塩基の存在 の頻度の両者に依存するからである。

標的核酸配列および複製接合体の調製に関する前述の説明は、本発明の参照核酸 配列および参照複製接合体の調製およびデザインに等しく適用可能であることを 理解すべきである。

結合性基質は、結合性射程の第１構成員、必要に応じてスペーサー、および酵素 により活性化可能な部分から構成される。前記スペーサーおよび部分は、核酸複 製基質について説明したものと同一である。本発明の実施における使用に適当な 特定の結合性対の構成員は、免疫型または非免疫型であることができる。免疫特 異的結合性対の例は、抗原／抗体系またはハブテン／抗ハプテン系である。結合 性対の抗体の構成員は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれら の免疫反応性断片であるかどうかにかかわらず、当業者に知られている普通の方 法により生成することができる。用語免疫反応性抗体断片または免疫反応性断片 は、抗体の結合領域を含有する断片を呼ぶ。このような断片はＦａｂ型断片であ ることができ、これらの断片はＦｃ部分を欠如する断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａ ｂ’　およびＦ（ａｂ’）ｚ断片として定義されるか、あるいは完全な抗体の重 鎮成分を接続するジサルファイド結合の還元的切断により得られる「半分子」断 片であることができる。特定の結合性対の抗原構成員が免疫原性でない場合、例 えば、ハプテンである場合、それはキャリヤータンパク質に共有結合させてそれ を免疫原性とすることができる。

非免疫性結合性対は、２つの成分が互いに対して自然の親和性を共有するが、抗 体ではない系を包含する。非免疫性結合性対の例は、ビオチン−アビジンまたは ビオチン−ストレプトアビジン、脂肪酸−葉酸塩結合性タンパク質、相補的プロ ーブ核酸、プロティンＡ、Ｇ、および免疫グロブリンなどである。また、互いと の共有結合を形成する非免疫性結合性対が包含される。共有結合の結合性対の例 は、スルフヒドリル反応性基、例えば、マレイミドおよびハロアセチル誘導体お よびアミン反応性基、例えば、イソチオシアネート、スクシンイミジルエステル およびスルホニルハライドなどを包含する。好ましい態様において、結合性基質 の例は、Ｎ−ヒドロキソスクシンイミドリンカ−分子を介してチラミンにカップ リングされたビオチンの接合体であろう。結合性基質はよ（知られている方法を 使用して合成することができる、Ｍ、　Ｎ、Ｂｏｂｒｏｗら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５．２７９、　（１９８９）。

核酸複製接合体は、結合性射程の第２構成員、必要に応じてスペーサー、および 標的核酸配列から構成される。標的核酸配列およびスペーサ−をデザインし、そ して前述の原理に従い調製する。結合性射程の第２構成員は、結合性基質の中に 使用した結合性射程の第１構成員に対して相補的であるように選択する。前述し たように、好ましい態様において、結合性基質はビオチン、スペーサーおよびチ ラミンから構成された接合体である。こうして、核酸復製接合体中に使用した結 合性射程の第２構成員の選択はアビジンまたはストレプトアビジンであり、こう して結合性基質は結合性射程の第２構成員としてアビジンまたはストレプトアビ ジンからなるであろう。核酸複製接合体はよ（確立された手順を使用して調製す ることができる。参照、例えば、Ｇ、Ｈ，ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋＳＭ、 Ｍ、、ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ、（１９８９）　、ｐ、１３６−１４８．５ｔｏｃｋ ｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク。さらに詳しくは、標的核酸配列の合成の間 に、第１アミンを含有するスペーサーのアームで修飾された塩基を５′末端また は３°末端に導入することができる。５′アミノ基を含有する塩基を導入するた めの試薬は商業的に入手可能である［アミノリンク（Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ″’） 　２　（Ａｐｐ　１ｉｅｄ　Ｂｉｏｃｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、、８００　Ｌｉｎ ｃｏＩｎＣｅｎｔｅｒ　Ｄｒｉｖｅ、カリフォルニア州９４４０４］、アミノリ ンク（Ａｍｉｎｏ　ｌ　１ｎｋＰ）２は、オリゴマーの合成における最後の工程 として添加される。次いで、２官能性エステルにより側鎖の長さを延長しかつ末 端のカルボン酸を提供することによって、アミノ修飾核酸標的を活性化し、次い でこれを標準の方法を使用して活性化してＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ ３）中間体（１）を形成することができる末端のカルボン酸を提供する。次いて この中間体をアビジンで化学的にカップリングして核酸複製接合体（３）：＋ｌ ｌ　ＮＨ５（Ｃ＋ｎ　１ｉｎｋｅｒ−５’　ＸＸＸＸ’ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ ＸＸＸＸｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ　３’！３１　Ａｖｉｃ！ｉｎ　−（Ｃ１ｒｈ 　１ｉｎｋｅｆ−ｓ’ｘｘｘ’ｘｘｘｍｍ瀉ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ 　３市一般的試薬は、また、内部の単一または多数のアミノ基を標的核酸配列の 中に導入するためにクルアヶムＣＣｒｕａｃｋｒｅｍ）およびクロンチク（Ｃ１ ｏｎｔｅｃｈ）から入手可能である。しかしながら、末端標識化オリゴマーは内 部的に標識化された核酸よりも、結合および反応のためにいっそアクセス可能で ある傾向がある。

プライマー： 現在の実施において、標的核酸配列の複製は「プライマーの」オリゴヌクレオチ ドを必要とし、このオリゴヌクレオチドは、ここにおいて使用するとき、標的配 列にアニーリングして標的の複製を促進するすべてのオリゴヌクレオチドを呼ぶ 。

標的の複製をポリメラーゼ連鎖反応により実施するとき、２つの特定のプライマ ーを使用する。各プライマーは標的の２つの相補的鎖の一方に特異的にハイブリ ダイゼーションする（あるいは標的が一本鎖（Ｓ　Ｓ）である場合、プライマー の一方は合成後第２鎖に対して特異的である）。

標的の複製は、（−）センス標的鎖に対して相補的であるプライマー（プライマ ー＃２）の５′末端が、（＋）センス鎖特定のプライマー（＃１）の５°→３° 末端である（十）センス鏑の領域に相当することを必要とする。さらに、プライ マーはプライマー−２量体を形成するために十分な相補性をもつ領域を含有すべ きではない。これらの拘束内で、プライマーの合計の長さは標的より短い〜標的 より長い範囲であることができる。一般に、長さが１０〜３ｏ塩基であるプライ マーは最も好ましく〜−−−−−−５’プライマー＃１ ＋センスｓ’　−−３＋ −センス３’　−ＹＹＹ！ＹＹＹＹＹＹＹ””””””’−５’プライマー１２ 　５’　−−−−−−−−−−−＞プライマーは、また、標的の中に相補性をも たない（５′オーバーハングまたは５″の不一致）配列をそれらの５′末端に含 有することができる。

＜−−−−−−−−一−−５電プライマ一番１＋　センス　５’　−ＸＸＸ　℃ ０ズＸＸＸＸＸＸＸ−３’５″　−−−−−−−−−−−＞　プライマー１２− 　セン７、　３’　−ＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹ −５’（ｘ、ｙは相補性塩基を表す。） この５°オーバーハングまたは５°不一致）を使用して、プライマー上に機能化 された塩基（例えば、シグナル発生性または結合性構成員〜誘導された塩基）を 組み込むことができるか、あるいは余分の配列の添加により複製された核酸生成 物の長さを延長することができる。これらの添加は生ずる核酸の捕捉および／ま たはシグナルの検出に有用である。

プライマーにおいて、標的に対して相補的な３′セグメントを種々の異なる５゛ セグメントに接合することができる。こうして、異なるシグナル発生性テイルに 連鎖した固定したハイブリダイゼーション領域をもつ１系列のプライマーを作る ことができる。発生したシグナルは使用した１または２以上のポリメラーゼの５ °領域に依存し、そして問題の検出方法に対して調整することができる。それゆ え、単一の標的配列を変化する５゛オーバーハングまたは不一致を含有する異な るプライマーとともに使用して、ある数の異なる配列特異的応答を発生すること ができる。

典型的には、ＰＣＲ型増幅技術において、プライマーは異なる配列を有し、そし て互いに対して相補的ではない。所望の試験条件に依存して、プライマーの配列 は標的核酸の効率よくカリ正確な複製を提供するようにデザインすべきである。

いくつかの簡単なルールはプライマーの選択およびデザインにおいて有用である 。典型的には、プライマーは１０〜３５塩基対の長さであり、５０〜６０％のＧ ＋Ｃ組成を有すべきである。

所定のプライマー対について計算したＴｍは釣り合うべきである。この目的に、 ＡまたはＴについて２℃およびＧまたはＣについて４℃を一緒に加えてオリゴヌ クレオチドのＴｍを推定することができる。（ＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ 、ｒ遺伝疾患の診断における特異的ハイブリＡｐｐｒｏａｃｈ、に、Ｅ、Ｄａｖ ｉｓ編、（１９８６）ｐ、３３−５Ｑ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、 バージニア州）。選択した条件に依存して、５５℃〜８０℃のＴｍは適当である 。Ｔｍに加えて、プライマーの３°末端における相補性は重要な考慮である。一 般に、プライマーの対の相補性は、ことに３°末端において回避すべきである。

また、プライマーの３′末端におけるＣおよびＧの連続的存在（３またはそれ以 上）ならびに自己相補的配列を回避すべきである。また、複製環境におけるプラ イマー分子の濃度を考慮すべきである。０．０１〜０゜１量Ｍのプライマー濃度 は一般に適当であり、約０．０５〜１．　０量Ｍの濃度は最適である。

リカーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を標的二本鎖核酸の複製のために使用するとき、２ 組の標的特異的プライマーが要求されるであろう。１組のプライマーの構成員は 標的の所定の鏡上に見いだされる隣接する配列に対して相補的であるが、第２組 の構成員は反対の鏡上に見いだされる隣接する配列に対して相補的である。この 方法において、１組の隣接するプライマーは各標的鎖に対して特異的である。複 製プロセスの間に、組換え遺伝子を加熱して２つの標的の鎖を変性する。次いで 、２つのプライマーの組を構成する４つの相補的オリゴヌクレオチドのプライマ ーをそれらの溶融温度付近において分離した標的鎖にハイブリダイゼーションさ せた。熱安定性リガーゼは各標的鏡上の隣接するプライマーに共有結合する。標 的に対して完全に相補的である隣接するプライマーのみは一緒に結合するであろ う。この方法において、結合の第１段階からの生成物は結合の次のラウンドのた めの標的となる。こうして生成物は標的の変性、プライマーのハイブリダイゼー ションおよび結合の工程の連続するサイクルとともに指数的に増加する。

プライマーの間の非相補性についての要件、プライマーのサイズ、塩基の組成お よび溶融温度の要件は、ＰＣＲ複製について前述したものに類似すう傾向がある 。一般に、ＬＣＲ複製のためのプライマーは、各々が樟的核酸上のその特定の結 合部位に優先的に結合するように、十分に長くあるべきである。結合の特異性を 保証するために、反応はオリゴヌクレオチドのプライマーの溶融温度（Ｔｍ）付 近において実施することができる。より高い温度において、接合における単一塩 基の不一致が形成することがある。これは不完全ならせんを生ずるばがりでなく 、かつまた不一致のオリゴヌクレオチドの７ゾブリダイゼーシヨンを不安定化す る。

ＰＣＲまたはＬＣＲ型の両者の複製において、プライマーは１または２以上のリ ポータ−で標識化された塩基を含有するか、あるいは特定の結合性対の１構成員 で標識化することができる。例えば、ビオチンおよびフルオレセイン残基をＣＥ ホスホルアミダイト合成の間にプライマーの中に組み込むことができる（ＮＥＮ 　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄｕ　Ｐ。

ｎｔＳＢｏｓ　ｔｎ、？サチュセッッ州：か、あるいはＣ１ｏｎｔｅｃｈ）。増 幅の間のプライマーの組み込みは、また、ビオチンおよびフルオレセインを含有 する核酸生成物を生ずるであろう。この方法において、複製プロセスの間のプラ イマーの組み込みは、複製された核酸の中にリポータ−および親和性標識を組み 込む好ましい手段として使用できる。

アッセイの条件： 本発明の被検体依存性リポータ−系を実施するとき、いくつかの工程が要求され る。第１に、被検体依存性リポータ−複合体（ＡＤＲＣ）が形成する。これはよ く知られているイムノアッセイの試薬および技術を使用して実施される。試薬は 、順次、競合的、サンドイッチ、および免疫測定のイムノアッセイのために適合 させることができる。Ｈａｒｌ。

ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ、（１９８８）　、ｐｐ、５５５−６１２、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、：＋−ルド・スプリング・ ハーバ−、ニューヨーク。

いったんＡＤＲＣ複合体が形成したなら、遊離の試薬を除去する。これは重要な 工程である。なぜなら、遊離の試薬および非特異的に結合したリポータ−は複製 プロセスに寄与することがあるからである。非特異的結合の減少を促進するため に、ＡＤＲＣの解離を引き起こさないストリンジェントな洗浄条件、例えば、核 酸のハイブリダイゼーション試験において使用する条件を使用できる。なぜなら 、標的の複製および読出しは核酸化学に基づくからである。例えば、加熱、ｐＨ の変化、または（および）ホルムアミド、洗浄剤および塩類の添加を使用して洗 浄工程の効率を増加することができる。ストリンジェント過ぎる条件は、ＡＤＲ Ｃの解離またはイムノアッセイのリポータ−の破壊に導くことがある。

ストリンジェントな洗浄条件に対する耐性は、被検体の性質、使用する結合性構 成員および特定のリポータ−とともに変化するであろう。したがって、ストリン ジェントな条件は各アッセイのために実験的に最適化しなくてはならない。しか しながら、非特異的結合を減少するための洗浄において、多少のＡＤＲＣが損失 される場合、これは温度再循環工程の数の増加により実現される追加の標的の複 製により補償することができる。

ＡＤＲＣがストリンジェントな洗浄条件に対して感受性である場合、触媒化リポ ータ−アッセイ（第２図）を使用することができる。この適合において、ＡＤＲ Ｃと基質との反応は標的核酸と支持体との間の共有結合を生ずる。カンブリング 後、固体の支持体を洗浄して共有結合した標的核酸複合体を残す。詳しくは、チ ラミン標的基質をＨＲＰ酵素リポータ−とともに使用して標的を支持体に共有結 合させることができる。

この方法において、酵素の増幅を達成することができ、そしてストリンジェント な洗浄条件は標的の複製の前に使用することができる。

次の工程において、標的核酸配列を複製する。ＰＣＲを使用する複製法である場 合、標的配列を核酸複製組成物（１００μｍ）と混合し、ここでこの核酸複製組 成物は２つのプライマー（ＬＯＯｐｍｏｌ／プライマー）、熱安定性ＤＮＡポリ メラーゼ、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２単位）、要求されるヌクレオ チド（ｄＮＴＰ２００μＭ／塩基）（これらはシグナルを発生する核酸またはリ ガンドを含有する核酸であることができる）、ツイーン２０洗浄剤（０，０５％ ）、２０ｍＭＴＲＩ　Ｓ／ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，３）　、ＭｇＣ＋２　（１， ５ｍＭ）　、ＫＣｌ　（２５ｍＭ）　、および核酸配列不含ゼラチン（１０μｇ ／ｍｌ）からなる。

一般に、複製試薬の組成中の過剰のＭｇ←は非特異的増幅を生ずることができる が、不十分のＭｇ＋＋は収率を減少するであろう。デオキシヌクレオチドトリホ スファターゼ（ｄＮＴＰ）はＭｇ０と結合し、そして結合の量はｄＮＴＰ濃度に 依存することは知られている。すべての４塩基（ｄＮＴＰ）を含有する反応組成 物において、これはもとの１．５ｍＭ　Ｍｇ”の約０．７ｍＭの最終の遊離Ｍｇ ”＋を残す。ｄＮＴＰ濃度が有意に変化する場合、ＭｇＣ１□の補償的変化が必 要であることがある。

本発明を使用できる応用の多様性のために、核酸複製試薬組成物の濃度および試 薬の組成の調節を必要とすることがある。複製環境を最適化しかつ調節するため の実際のガイドラインは、Ｒ，に、５ａｉｋｉおよびＧｅ１ｆａｎｄ、Ｄ、Ｈ， 、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８９）　、ｐｐ、７−２２．５ｔｏｃｋ ｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、＝！−ヨークの中に見いだすことができる。

反応混合物を鉱油で覆って蒸発を防ぐ。次いで標的核酸を変性して二重らせんの 核酸配列鎖を分離する。一般に、これは高温（９０〜９５°Ｃ）において実施す る：しかしながら、完全な変性を達成するために、より長い初期時間が必要であ ることがある。標的核酸の鋳型へのオリゴヌクレオチドのプライマーのアニーリ ングは、通常、温度を３７〜６０℃に３０〜６０秒間低下することによって達成 される。次いで、プライマーのポリメラーゼ延長は、シグナル発生生成物の長さ に依存して、７２℃において１０〜６０秒間平衡化することによって達成される 。変性、プライマーのアニーリングおよびプライマー延長の工程を順次に反復的 に実施して、シグナル発生生成物の鎖数を増幅する。典型的には、温度のサイク ルは複製の所望の程度に依存して１０〜４０回実施する。次いで、この反応をＥ ＤＴＡ　（１０ｍＭ）の添加および４℃への冷却により停止する。

一般に、ＬＣＲが使用する複製プロトコールである場合、ＡＤＲＣの標的配列を ２組の隣接するオリゴヌクレオチド（各々４０ｆｍｏｌ）と混合する：各組は相 補的標的核酸鎖の１つに対して相補的であろう１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩 衝液ｐＨ７，６，１００ｍＭ　ＫＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮＡＤ、 １０ｍＭ　ジチオスレイトール、４μｇ　サケ精子ＤＮＡおよび１５ニック閉鎖 単位の熱安定性リガーゼ、例えば、Ｔ、ａｑｕａｔｉｃｓリガーゼを含有する１ ０μｌの緩衝液中において（ＴａｂｏｒＳＳ　およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｄ 、Ｃ，（１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２．１ ０７４−１０７８）。

次いで、反応混合物を蒸発から、例えば、１滴の鉱油でカバーすることによって 保護し、次いで９４℃に加熱して櫟的鎖の分離を保証する。

標的へのオリゴヌクレオチドのプライマーのアニーリングは、通常、温度を３７ 〜６０°低下することによって達成する。プライマーの溶融温度に近い最適な温 度を通常選択するが、プライマーの長さおよび特定のプライマーの組成に依存し て決定することができる。溶融およびプライマーのアニーリングのサイクルを１ ０〜３０回反復する。次いで、反応を４℃に冷却して反応を停止させる。

次の工程は増幅された核酸の検出または可視化を含む。これは次の手段を包含す るいくつかの手段により達成することができる＝　（ａ）挿入色素を使用して二 重らせん核酸の直接検出；　（ｂ）核酸の中に組み込まれたリガンド、アイソト ープまたはリポータ−の間接的または直接の検出；　（Ｃ）増幅された核酸への リポータ−プローブのハイブリダイゼーション：または（ｄ）複製生成物のサイ ズの増加に基づく反応環境から−の複製された生成物の分離後の複製された生成 物の直接検出。

詳しくは、反応混合物中の増幅された核酸を挿入色素の添加により検出すること ができる。とくに、核酸の二重らせん鎖に挿入したとき、色素の検出特性を変化 する、エチジウム、フェナジン、フロコマイリン、フェッチアシンおよびキノリ ン型の色素である。一般的概観およびそれ以上の情報は、Ｂｅｒｍａｎら、Ａｎ ｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉｏｅｎｇ、、λす、８７　（１９８１）にお いて得ることができる。例えば、好ましい色素は臭化エチジウムであり、これは 核酸の挿入のとき、短い波の紫外線（２５９ｎｍ）で反応混合物を励起すること によって検出できる。

核酸の複製の間の修飾された遊離塩基または修飾されたプライマーの組み込みは 、リガンド、アイソトープ、またはリポータ−で修飾された塩基を導入する手段 を提供する。リガーゼ型の複製を使用する場合、修飾された塩基をもつオリゴヌ クレオチドを使用して標的配列を複製できる。これらの技術はいくつかの検出の 方法を提供する。例えば、ビオチニル化またはリガンド修飾された塩基の組み込 みは、増幅された核酸生成物を溶液から固体の支持体上に単離し、そして組み込 まれなかった塩基を廃棄する手段を提供する。次いで、アビジン−シグナル−発 生接合体の添加は検出を促進する。増幅された配列は、また、シグナル発生標識 化塩基を含有することができる。これらは固相の支持体上で直接検出することが できる。あるいは、固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを含有する 磁性ビーズ上のビオチニル化ＤＮＡ断片の収集および検出の方法は、Ｊ、Ｗａｈ ｌｂｅｒｇら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｐｒ。

ｂｅｓ、４　２８５　（１９９０）に記載されている。

他の別法において、増幅されたセグメントの配列は、エネルギーの転移のために シグナル核酸内に蛍光性塩基を位置決めするか、あるいは１または２以上のアビ ジン標識化酵素の結合が酵素のチャンネリングを生ずるように、ビオチニル化塩 基を位置決めするようにデザインすることができる。これらのアプローチを使用 して、組み込まれなかった塩基からの分離を必要としないで、増幅された標的を 検出することができる。

分子のモデル化および最近の報告、Ｒ，Ａ、Ｃａｒｄｕｌｌｏら、旦工ｏｃ、Ｎ ａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５．８７９０　（１９８８）に従い 、エネルギーの転移は１２塩基程度に多く離れた距離で達成することができる。

しかしながら、最適な距離ｈａ５〜１２塩基のどこかに存在ように思われる。１ 蛍光体塩基／らせん回転において、これはエネルギーの転移のために適当な近位 でドナーおよびアクセプター蛍光体を位置決めする。

被検体の定量。

被検体依存性リポータ−系（ＡＤＲ３）の応答は、試料の中に存在する被検体の 量、およびまた配列増幅の効率に依存する。試料中の被検体の濃度は固定した反 応条件下の実験的に関係するアッセイの応答および既知の被検体の濃度により標 準曲線から補間することができるが、配列の複製の効率を予測しかつコントロー ルすることは手順および反応の変動のために困難である。さらに、増幅は高度に 感受性である。それゆえ、誤った陰性の試験の表示を同定することができる場合 、被検体の不存在はいっそう信頼性をもって決定し、そしてアッセイの有用な範 囲を拡張することができる。

少なくとも２つの型の内部の対照を使用して、配列の複製の効率の変化を補償し 、そして誤った陰性の試験の応答を同定する手段を提供することができることが 考えられる。出願人はこれらを「増幅、または複製の対照」、および「捕捉対照 」と呼ぶ。「増幅対照」は、「参照配列」と呼ぶ核酸配列（詳しくは、標的配列 の核酸と異なる配列）およびその対応する１または２以上の同種のプライマーを 呼ぶ。使用において、参照配列および同種のプライマーは核酸の複製の試薬組成 物の中にを含めることができ、そして反応条件が配列の増幅のために許容性であ ることを証明する働きをする。試験の間に、増幅対照はシグナルを生ずるが、標 的配列はシグナルを発生せず、標的配列の増幅の欠如は増幅のために非許容性の 試験条件の結果でありえず、そして結果は検出可能なレベルより低い被検体濃度 を示す。

増幅対照は、また、被検体定量のための内部対照として働くことができる。この 適用のために、参照配列は検出すべき被検体濃度に近似する既知の濃度において 添加する。複製反応の間に、参照配列は理論的には標的配列と同一の効率で増幅 されるであろう。参照配列および標的配列からのシグナルの応答の比を測定する ことによって、被検体の濃度を決定することができる。このアプローチにおいて 、ある範囲の既知の被検体濃度および固定した濃度の参照配列を含有する試料中 の標的配列および参照配列から生ずる応答の比を測定することによって、標準曲 線を決定する。この方法において、核酸複製の効率の変動を補償することができ る。こうして、アッセイの応答はいっそう正確に被検体濃度に関係づけることが できる。

参照配列は分子量において増幅配列に類似するが、複製された標的配列の核酸か ら検出可能に区別可能である別々のかつ明確な「複製された参照核酸」を生成す ることができな（てはならない。これは特有の塩基を含有するように標的配列お よび参照配列をデザインすることによって達成できる。この方法において複製の 間に、リガンド、リポータ−、アイソトープまたは反応性基で標識化された特有 の塩基またはプライマーを、それぞれ、参照配列の核酸および標的配列の核酸の 両者の核酸生成物の中に組み込むことができる。こうして、生ずる核酸は別々の リポータ−で標識化されるか、あるいはハイブリダイゼーション反応または特定 のリガンド結合性対の相補的構成員との結合を介して検出のために単離すること ができる。

「捕捉対照」は被検体参照配列接合体（適切には各態様のために適合される一下 を参照）および１または２以上の同種のプライマーからなる。

捕捉対照配列接合体はアッセイの被検体捕捉工程の間に含められ、そして同種の プライマーの対は核酸複製組成物の中に含められる。この配置において、捕捉対 照の複製が検出てきないことは捕捉の欠如または増幅のために非許容性の条件か ら生ずるであろう。捕捉および増幅の対照のために異なる配列を使用することに よって、両者の対照を各反応チャンバーの中に含め、失敗した捕捉および失敗し た複製の反応条件の間の弁別を可能とすることができる。配列特異的、弁別的に 検出可能なシグナルを発生するように、これらの増幅部位の各々（標的配列、増 幅対照および捕捉対照）をデザインできるという理由でのみ、これらの対照を含 めることが可能である。

これらの複製反応の各々が完結に進行するように、ｄＮＴＰおよびプライマーの レベルを調節すべきである。標的および同種のプライマーは、増幅効率を生ずる 同様なＴｍ、鎖長さおよび他の特性を有すべきである。

実施例 以下の実施例は本発明の鍵となる態様を具体的に説明するためのものであり、い ずれかの態様に限定するものと解釈されるべきではない。

試薬類の調製 レポーターまたはプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを、標準的なシ アノエチル（ＣＥ）ホスホアミダイトカップリング化学を使用して、自動化ＤＮ Ａオリゴヌクレオチド合成機（Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ　（商標）、デュポン社：　 Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　Ｃｏ、　、ウィルミントン、プラウエア州、およびモデル３９ ２、アブライドバイオシステムズ社、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、 　Ｉｎｃ、　、フォスター市、カリフォルニア州）中の調節多孔質ガラス（ＣＰ Ｇ）支持体上で調ＱＷおよびＨｏｌ　１ａｅｎｄｅｒ、ブレニム出版社：Ｐ１ｅ ｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、ニューヨーク）アミノ−修飾ホスホ アミダイト試薬＾＋ｎｉ口ｏｌｉｎｋ　２　（商標）をカリフォルニア州、フォ スター市のアブライドバイオシステムズ社から入手する。オリゴヌクレオチドを ［α３２Ｐ］コルジセピン５°−トリフオスフェートで放射−標識し、レンチレ ーションカウンティング用のシンチレーション流体（Ｂｉｏｆｉｕｏｒ　（商標 ））をＮＥＮプロダクツ、マサチューセッツ州ボストンのデュポン社から入手し 、ならびにシンチレーションカウンティングをベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）モ デルＬＳ　３８０１（ベックマンインストゥルメンツ社：Ｂｅｃｋａ＋ａｎ　Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、、バロアルト、カリフォルニア州）シンチレー ションカウンターを使用して行う。デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ をプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｉｎｃ、　、マジソン、ウィスコンシン州） から入手し、Ｐｏｌｙ−ｔｅｒｇｅｎｔ　５ＬＦ−１３をオリン社（Ｏｌｉｎ　 Ｃｏｒｐスタンフォード、コネチカット州）から入手する。オートラジオグラフ ィー用のＫｏｄａｋ　Ｘｏｍａｔ　（商標）ＡＲ２Ｘ−線フィルムをイーストマ ンコダック社（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ、　、ロチニスター、ニュー ヨーク州）から入手する。

試薬５ＡＴＡ　（Ｎ−ザクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート）およびＳ ＭＣＣ（サクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１− カルボキンレート）をピアス（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）か ら入手する。

ＳＡＴ＾およびＳＭＣＣカップリング化学品はＴｓｅｎｇらによる共に本出願人 に譲渡された米国特許第０７／９４６２４７号に記載されている。レポーター抗 体は、レポーター接合体（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　（アフイ コピュア、＾ｆｆ１ｎｉＰｕｒｅ　ヤギ抗−ウサギＩｇＧ　Ｈ＋Ｌ）中で使用さ れ、ジャクソンイムノリサーチラボ社０ａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａ ｒｃｈ　Ｌａｂｓ、、　Ｉｎｃ、、　：製品番号１１１−００５−０４５）から 入手する。抗体反応成分はオリゴヌクレオチド成分から、Ｚｏｒｂａｘ２５０ゲ ル排除カラム（Ｇｅｌ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｏｌｕｍｎ　：　９．４ｘ２５ ０ｍｍ、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐｌ＋７．０、および１ｍｌ／ｍｌ のカラム流速）（マンクモッドアナリティカル社：　ＭａｃＭｏｄ　Ａｎａｌｙ ｔｉｃａｌ　Ｉｎｃ、　、シャデスフォード、ペンシルベニア州）をウォーター ズ（Ｗａｔｅｒｓ）６００Ｅシステムコントローラーおよびウォーターズ９９１ フォトダイオードアレイ検出器に連結して使用する高圧液体クロマトグラフィー により分離する。注入は、ウォーターズ７００サテライトＷＩＳＰ　（自動注入 システム）を使用して行った。固定化した捕捉物として機能するグリシジルメタ クリレートの試験ビーズ（オキシラン　アクリル酸ビーズ）をシグマ（Ｓｉｇｍ ａ　：製品番号Ｎｏ、　０−９７５４．シグマ化学社：セントルイス、モンタナ 州）から購入する。以下の実施例で使用するデンシトメーターは、Ｄｅｎｓｊｇ ｒａｐｈ　１００　（商標）（グラフィクテクノロジー社：　Ｇｒａｐｈｉｃ　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、　、チェリー　ヒル、ニューシャーシー州）ま たはモデルＲＤ１０７ＲＱｕａｎｔａ　Ｌｏｇデンシトメーター（マクヘス社： ＭａｃＢｅｔｈ　Ｃａｒｐ、　、ニューボウ、ニューヨーク州）のいずれかであ った。

基本的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手順は、５ａｉｋｉ、　Ｒ，Ｓ、５ ｃｈａｒｆ、　Ｆ。

Ｆａｌｏｏｎａ、　Ｋ、Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｇ、Ｈｏｒｎ、　Ｈ＾、　Ｅｒ１ｉｃ ｈおよびＮ、Ａｍｈｅｉｍ、　１９８５に記載されている。５ｃｉｅｎｃｅ　２ ３０：１３５０および増幅反応は、パーキンエルマーシータスＧｅｎｅＡｍｐ（ 商標＋Ｎ８０１−００５：Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）キット、パ ーキンエルマーシータス９６００ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＰＣＲシステム温度循 環器（バーキンエルマーシータス、ノーウオーク、コネチカット州）を使用して 行う。本発明で使用するＰＣＲ法は、短い（＜１５０塩基）単一鎖ＤＮＡ標的配 列を増幅するために改変された。以下に与える実施例のすべてにおいて、＾ＤＲ Ｓアッセイはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）複製技術を使用して実行されるが 、リガーゼ連鎖反応、等温または自動触媒法を含む核酸の複製に適する任意の方 法が使用できることが理解されるべきである。

オリゴヌクレオチド調製・ 限定を意図せず、かつ説明のためだけに、複製に使用する配列およびプライマー は以下の配列で合成できた。

単一プライマー増幅用の標的配列： ５１　入７Ｇ　ＣＧＴ　ＡＧＣＡＣ口　７７丁　ＡＣＣＧＣＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣ Ａ１Ｇ　ＣＣＴ　ＡＴＧ　ＴＡ：　ＣＡＴ　ＧＣＴ　３’３’　ＴＡＣＧＣＡ　 ＴＣＧ　ＴＣＧ　入ＡＡ　ＴＧＧ　ＣＧＴ　ＣＴＣＴＡＧ　ＴＡＣＧＧＡ　ＴＡ ＣＡＴＧ　ＧＴＡ　ＣＧＡ　５’Ｓ’　ＡＴＣＣＴＡ　ＣＣＴ　Ｇ’ｒＡ　ＡＧ Ｔ　入ＡＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＡＣＧ　ＣＡＴ　３’　配列番号　：３３＋　Ｔ ＡＧ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＴＣＡ　ＴＴＴ　ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＴＧＣＧＴ Ａ　５’　配列番号：４単一プライマー増幅用の樟的／プライマー結合部位：５ ′　八τＧ　ＣＧＴ　ＡＧＣＡＧＣ７７丁　ＡＣＣＧＣＡ　ＧＡＧ　Ａ１ＣＡ１ Ｇ　ＣＣＴ　ＡＴＧ　ＴＡＣＣＡＴ　ＧＣＴ　３’３、、Ｑ−ｅ：Ｌユ１−　− 　＆　Ｇ　ＣＧＴ　ＣＴＣＴＡＧ　ＴＡＣＧＧＡ　丁ｋＣＡＴＧ　ＧＴＡ　ＣＧ Ａ　５’５’ＡτＧ　Ｃ３丁　八ＧＣＡＧＣ１丁Ｔ　ＡＣ３’　Ｐｒｉｍｅｒ　 １　配列番号＝５５’　ＡＴＣＣＴＡ　ＣＣＴ　ＣＴＡ　Ａ：二Ｊｎ」：　″　 ｕ　３’　配列番号：３３′　丁＾Ｇ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＴＣＡ　丁丁 丁　ＣＧＡ　ＣＧＡ　丁ｃｃｃτへ　５Ｉ　配列番号　４二重プライマー増幅用 の標的配列 ５’　ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＡＧＣＡＧＣ丁丁丁　ＡＣＣＧＣＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣＡ ＴＧ　ＣＣＴ　ＡＴＧ　ＴＡＣＣＡＴ　ＧＣＴ　３’３’　ＴＡＣ（、Ｃ＾　丁 ＣＧ　ＴＣＧ　入へＡ　ＴＧＧ　Ｃ０丁　ｃＴｃ　ＴＡＧ　丁＾ｃ　Ｇｃλ　７ 八ＣＡＴＣＧＴＡ　ＣＧＡ　Ｓ’Ｓ’　ＡＴＣＣＴＡ　ＣＣＴ　ＣＴＡ　ＡＧＴ 　ＣＡＴ　ＡＧＣ丁Ｇτ　Ｔｉｃ　ＣＴＧ　３’　配列番号、１３’ＴＡＧＧ八 丁　ＧＧＡ　ＣＡＴ　丁ＣＡＧ丁＾　丁ＣＧ　ＡＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＣ５’　配 列番号、２プライマー１ ５’　ＡＴＧ　Ｃ０丁　ＡＧＣＡＧＣＴＴＴ　ＡＣ３’　配列番号・：５プライ マー２ ３’　ＣＡＧ　ＴＡＡＣＧＡ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＡＣ５’　配列ｌｔ号−６二重 プライマー増幅用の標的配列／プライマー結合部位：５’　ＡＴＧ　ＣＧＴ　Ａ ＧＣＡＧＣ丁Ｔ？　ＡＣ３’プライマー　１　配列番号ツ多くの他の塩基配列お よび鎖長も本明細書中で考察されたガイドライン内で使用できる。

核酸複製組成物ユポリメラーゼ型増幅において、標的配列を増幅するために有用 な複製組成物は、複製緩衝液（２５ｍＭ　ＫＣＩ、２０ｍＭ　ＴＲｌ５ハイドロ クロライド（ｐＨ９−１３）、１．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、０，０５％Ｔｗｅｅｎ 　２０、およびＯ，１ｍｇ／ｍｌのオートクレーブ処理ゼラチン［ｗｔ／ｖｏｌ ］）、２００ｍＭの各ｄＮＴＰｓ、１．ｈＭの各プライマー、２．５ＵのＴａｑ 　ＤＮ＾ポリメラーゼを含む、２重−蒸留水により作成されたジエチルピロカー ボネート含有溶液（ｏ、１％ｗｔ／ｖｏｌ）を含んで成ることができる。標識デ オキシヌクレオチドトリホスフェートを使用する核酸複製が行われるとき、上記 の複製組成物は、ひとつ以上のデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴ Ｐｓ）が、標識塩基と置換されるように変更することができる。ビオチン化ｄＵ ＴＰ（ｂｉｏ−ｄＵＴＰ）　Ｃｘ　ンソバイオケム：　Ｅｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、ニューヨーク、ニューヨーク州）およびフルオロセイン標識ｄＣＴＰ（Ｆ− ｄＣＴＰ）　（ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナポリス、イン ディア州）をベセスダリサーチラボラトリー社（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ａｒ ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　：メリーランド州）から得るこ とができ、それぞれｄＴＴＰおよびｄＣＴＰと、標識対非標識塩基の比が１・３ のモル比で置換できる。一般的に効率的なハイブリダイゼーションを維持するた めには、２０−３０％の標識塩基の取り込みが好ましい、Ｖ、　Ｔ、　Ｃｈａｎ らＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１３８０８３（１９８５）。

核酸増幅二標的および参照配列の複製は、ＤＮＡ温度循環器およびＧｅｎｅ　Ａ ｍｐキットを使用して天然Ｔａｑポリメラーゼ（バーキンーエルマシークス社、 ノーウオーク、コネチカット）を使用して行うことができる。

増幅については、５０から１００μｌの上記複製組成物を、固定化された標的配 列を含むＡＤＲＣ試験ウェルに添加する。複製組成物を支持体との接触が確実と なるように撹拌し、次に７５μｍの鉱物油（ＢＨＤパラフィン油）を上塗りする 。核酸配列を次に９４℃で１−３分間変性させる。全体で２５−４０の温度循環 を以下の条件で行う９４°Ｃで０．５−１分間の変性、３７−６０℃で０．５− ］分分間プライマのアニーリング、７２°Ｃで１−２分間ＤＮＡの伸長。

Ｎ−ヒドロキシサクンンイミドー活性化標的核酸の調製：５゛活性化スペーサー アームの調製は、標的配列中のチミジン塩基を、Ｊ、　Ｒｕｔｈらにより、Ｆｅ ｄ、　Ｐｒｏｃ、　、　４４（５）、　１６２２（１９８５）に記載されたよう に、活性化エステルを末端化するＣ１２スペーサーアームで置換されたｃ５チミ ジン類似体に代えて、行うことができる。Ｃ５アミノ−修飾チミジン類似体は、 従来のホスホアミダイト活性化化学品を使用してオリゴヌクレオチド配列中に合 成的に取り込んで（アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニ ア州、モデル３９２ＯＮＡ合成機）、次にＤＳＳ（ジサクンンイミジルスベリン 酸塩゛ピアス、ロックフォールド、イリノイ州）で誘導化して（Ｒｕｔｈらによ り記載されたように（１９８５））、活性化Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドＣＮ Ｈ３）エステルを形成する。

抗体／核酸レポーター接合体の調製：ＮＨＳオリゴヌクレオチド溶液（０，５μ １ｏｌｅ等量）をＬＭ　ＮａＦＩＣ０３緩衝液、ｐＨ９，０中で０．２５μｍｏ ｌｅのヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｆａｂ断片断片的異的体（ＩＣＮ）とカップリン グできる。反応混合物を次に室温で２時間、暗室中でインキュベーションする。

抗体レポーター接合体を遊離の核酸および抗体と、ポリアクリルアミドゲル電気 泳動（４−７％）で、非−変性条件下（ＴＢＥ緩衝液）で精製する。接合体を接 合体バンドを切り取ることにより回収し、リン酸緩衝生理食塩溶液（ｐＨ７，４ ）を含有するストッパー付エコノーカラム（ｓｔｏｐｐｅｒｅｄ　ｅｃｏｎｏ− ｃｏｌｕｍ　：バイオラッド：　ＢｉｏＲａｄ）に、Ｇ、　Ｈ，Ｋｅｌｌｅｒお よび１ｌａｎｋｓ、　Ｍ、　Ｍ、　ＤＮＡプローブ、（１９８９）第１２９−１ ４２頁、ストンクトン出版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）に 記載されているように入れる。接合体を次に予め洗浄したセントリコン１０（Ｃ ｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０　：アミコン：　Ａｍ１ｃｏｎ）微少濃縮器を使用する 遠心によって濃縮する。

ポリスチレンビーズ（約１−４ｕの微小球ビーズ、ポリサイエンス社・Ｐｏ１ｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ、　、　ウェーリントン、ペンシルベニア州）を、 ０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９，６中のヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｆｃ断片持異的） 抗体（シグマ化学社、セントルイス、モンタナ州）で被覆し、固体相抗体支持体 を調製する。４℃で一昼夜インキュベーションした後、抗体溶液を遠心および吸 引によって除去する。ビーズを上記炭酸緩１ｒ　１ｆｆｌに溶解した２％ウシ血 清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。次にビーズを０，０５％Ｔｖｅｅｎを 含むｌ　ＱｍＭのリン酸緩衝生理食塩溶液（ｐＨ７，４）　（ＰＢＳＴ）で３回 すすぐことにより過剰な遊離試薬を洗いだし、次に再度ＰＢＳＴに懸濁する。マ ウスＩｇＧ（■ＩｇＧ）の希釈物を、１％ＢＳ＾を含有するＰＢＳＴ溶液中（Ｂ ＳＡ−ＰＢＳＴ）に希釈することにより作成する。マウスＩｇＧ溶液のアリコー トを微小球ビーズを含有する試験管に加え、濃度範囲が０．０．００１．０，０ １．０．１．１．０、から１０ｎｇ／■ＩｇＧ（試験管）のマウスＩｇＧを作成 する。すでに記載された０、０１μｇ／１Ｉｌｌの抗体／標的レポーター結合体 を含有する溶液（５μｍ）を次に加え、アッセイ混合物を１時間インキュベーシ ョンする。過剰な試薬を次に、ＰＢＳＴ洗浄液を３回交換して微小ビーズを洗浄 することにより除去する。

標的の複製は、１００μｍの核酸複製組成物を試験微小球ビーズに加えることに より行われる。試験溶液は支持体との接触を確実にするために混合され、次に５ ０μｌの鉱物油（ＢＤＩＩパラフィン油）を上層する。標的配列を次に９４℃で １−３分間変性させる。反応混合物をＤＮＡ温度循環器（パーキン　エルマーシ ータス社、ノーワーク、コネチカット）を使用して、製造元の指示に従い温度を 循環させる。

標的配列−増幅ウェル中の試験応答の測定は、ビオチン化ｄＡＴＰおよびフルオ ロセイン標識ｄＣＴＰを記載されたように含むように改変した上記配列増幅組成 物との平衡に従い行うことができた。

増幅したシグナルー発生核酸の検出のために、各ウェル中の増幅反応流体を取り 出し、以下のようにストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープレートウ ェルに移す　ポリスチレンマイクロストリップ（ＮＵＮＣ）を０．１Ｍ炭酸緩衝 液、ｐＨ９，６中に調製したストレプトアビジン（シグマ、セントルイス、モン タナ州）溶液で満たす。室温（ＲＴ）で−昼夜インキュベーションした後、溶液 を除去し、ストリップを上記炭酸緩衝液に溶解した２％のウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ）溶液でブロックする。ストリップの過剰な遊離試薬を、ＰＢＳＴ洗浄液 で３回すすいで洗い落とすことができる。試験流体を次にアビジン被覆ウェル中 で３０分間インキュベーションし、次に非結合の遊離標的を洗い落とす。ウェル を次にｌ　ＱｍＭのリン酸緩衝生理食塩溶液、ｐＨ７，４（ＰＢＳ）で満たし、 各ウェル中の蛍光を測定する。

この実施例のアンセイ応答は、抗体レポーター結合体が試験ウェルの表面に結合 することにより生じるものである。レポーター結合体上に含まれる標的配列は、 ビオチン化塩基およびすでに記載した蛍光で標識された塩基を含有する複製組成 物を使用して複製する。配列複製中のこれら塩基の取り込みにより、ビオチン化 および蛍光塩基の両方を含有する核酸の形成を生じる。検出のために、核酸はア ビジン固体−相支持体上での捕捉によって単離され、次にシグナル核酸蛍光を測 定することにより検出できる。アッセイの強さは試料中のマウスＩｇＧ被検物の 濃度に比例して上昇する。

実施例２ 間接的標的付着法を使用するマウスＩｇＧアッセイでの増幅被検体の検出チラミ ン核酸基質の調製： ＮＨ３標的オリゴヌクレオチド溶液（Ｑ、　５１１ｍｏｌｅ等量）を、２．５ｗ ＋１のジメチルホルムアミド中の０．５μｍｏｌｅのチラミン（水から再結晶さ せたもの、アルドリッチ：＾１ｄｒｉｃｈ、ミルウオーキ、ウィスコンシン州） に、１．ｋｌの１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム、ｐｌ＋７．５を加えること により、力、ツブリングさせることができ、次に５０℃で３時間加熱する。この 溶液を次に乾燥するまでロータリーエバポレーターで濃縮し、水からの再結晶に より精製するか、またはパーキンエルマーの高性能液体クロマトグラフィーの逆 相カラムを使用して精製する。

ストレプトアビジン核酸接合体の調製・ＮＨＳオリゴヌクレオチド溶液（０，５ ＋＋ｍｏｌｅ等量）を、ＩＭ　Ｎａｌ’１ＣＯ３緩衝液、ｐｌ＋９．０中の０． ２５＋ｎｍｌのストレプトアビジン（シグマ）と力・ツブリングさることができ た。この反応混合物を室温で２時間、暗室でインキュベーションする。接合体は 遊離の配列およびアビジンから、Ｍ、　Ｓ、　Ｕｒｅｄａ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ使 用するポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製できる。

ポリスチレン微小球ビーズ（約１−４μ）を、０．１１４炭酸緩衝液、ｐＨ９， ６中のヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｆｃ断片持異的）抗体で被覆する。室温で一昼夜 インキユベーションした後、抗体溶液を遠心および吸引によって除去する。

微小ビーズを上記炭酸緩衝液で溶解した２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブ ロックする。次にビーズをＰＢＳＴで３回すすぐことにより過剰な遊離試薬を洗 い出す。マウスＴｇＧ抗原の希釈を、１％ＢＳ＾含有ＰＢＳＴ　（ＢＳＡ−ＰＢ ＳＴ）中に実施例１に記載されたように調製し、次にビーズを含む２組の試験管 に加える。ビーズを３７°Ｃで１時間インキュベーションし、次にＰＢＳＴて洗 浄する。ヤギ抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ　（ベーリンガー　７２７％イム）を製 造元の指示どおりに希釈し、３７℃で１時間インキュベーションする。

次に過剰な試薬をＰＢＳＴで３回洗浄および吸引することにより除去する。

ジメチルスルホキサイド中のビオチン−チラミン接合体の保存溶液（ｌａ＋ｇ／ ｍｌ）を、上記に記載したように調製する。使用直前１こ、保存溶液を０．０１ ％のｌｌ２０２を含有する０、　１１１のホウ酸緩衝液、ｐＨ８，５で希釈して １０μｇ／ｍｌのビオチン−チラミン含有基質溶液を調製する。基質溶液を試験 ビーズの両方の組に加え、室温で１５分間インキュベーションする。未反応基質 を次に除去し、試験ビーズを３７℃のＰＢＳＴで洗浄する。

検出感度を比較するために、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（シ グマ社：セントルイス、モンタナ州）を製造元の指示に従い希釈し、試験ビーズ の１組に参照対照として加える。標的核酸の複製のために、ＰＢＳＴ中のストレ プトアビジン−標的配列結合体（１１１ｇ／ｍｌ）を第二組のビーズに添加する 。両組の試験ビーズを次に室温で３０分間インキュベーションし、次に未反応結 合体を除去するためにＰＢＳＴで３回洗浄する。

参照対照ウェルでの応答の測定は、次に１０ａ＋Ｍのジェタノールアミン（ｐＨ ９，５）　、０．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ緩衝液中のｐ−ニトロフェニルリン酸塩溶 液を、両方の組の試験ビーズに加えることにより行う。３７℃で１５分間後、発 色反応を５ｈｌのＯ，ＩＭ　ＥＤＴＡで停止し、光学密度を４０５止のマイクロ タイタープレートリーダー（モレキュラーデバイス社：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐ、　。

カリフォルニア州）で読んだ。

標的核酸増幅ウェルの試験応答の測定は、始めに上記実施例１に記載した複製組 成物で第二組のビーズを平衡化することにより行う。試験混合物はビーズ支持体 との接触を確実にするために撹拌され、７５μｍの鉱物油（ＢＤＨパラフィン油 ）を上塗りする。標的配列を９５℃で１から３分間変性させる。反応混合物を３ ０回、ＤＮＡ温度循環器を製造元の指示に従い使用して温度的に循環させる。増 幅した標的核酸を検出するために、ｌｌ１１の１００＋ｎｌエチジウムブ０フイ ト保存溶液（０，５ｍｇ／ｍｌ：４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩基、２＋ｎＭ酢酸、０． ２ｍｌ！　ＥＤＴＡを含むＴｒｉｓ酢酸ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８，１中）を、反 応上澄みに加える。この溶液を２５４ｎｍの短波長で励起して、蛍光を測定する 。

この実施例のアッセイ応答は、ビオチン／チラミンレポーターの試験ビーズ表面 へのＡＤＲＣ−ＨＲＰ触媒的付着、引き続きストレプトアビジン　シグナル−発 生配列標的の付着により生じるものである。標的を次に実施例１に記載した複製 組成物を使用して増幅し、生成する核酸生成物を染料相互反応で検出する。アッ セイの強さは試料中のマウスＩｇＧ濃度に比例し、非−増幅ＡＤＲＣ−ＡＰレポ ーターを使用して検出しつるｍＩｇＧよりも低い濃度を検出できた。

実施例３ 触媒的直接標的付着法を使用するマウスＩｇＧアッセイにおける増幅被検物の検 出　ポリスチレン微小球（約１−ｈ）を、０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９，６中の ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｆｃ断片持異的）抗体で被覆する。室温（ＲＴ）で−昼 夜インキュベーションした後、抗体溶液を除去し、ストリップを上記炭酸緩衝液 に溶解した２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。

次にビーズを０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩溶液 （ＰＢＳＴ）、ｐＨ７，４で３回すすぐことにより過剰な遊離試薬を洗い出す。

１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴ　（ＢＳＡ−ＰＢＳＴ）溶液に溶解したマウスＩｇＧ　 （ｍＩｇＧ）の抗原の希釈を、実施例１に記載されたようにビーズに加える。ビ ーズを３７℃で１時間インキュベーションし、次にＰＢＳＴで３回洗浄し、ヤギ 抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰで実施例２に記載したように処理する。

レポーターの触媒的付着用に、ジメチルスルホキサイド中のチラミン−遺伝子標 的基質の保存溶液（Ｉｍｇ／ｍｌ）を調製する。使用直前に、保存溶液を００１ ％のＨ２０□を含有する０、ＩＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ８，５で希釈してチラミ ン−配列標的基質溶液（１０μｇ／ｍｌ）を調製する。基質溶液を試験ビーズに 加え、室温で３０分間インキュベーションする。反応混合物を次に除去し、試験 ウェルを３７℃のＰＢＳＴで洗浄する。

配列増幅ウェルでの試験応答の測定は、試験ビーズの各組を、上記実施例１に記 載されたようにビオチン化およびフルオロセイン標識ヌクレオチドを含有するよ うに変更した上記配列複製組成物の平衡に従い行う。

試験溶液は支持体との接触を確実にするために混合され、次に７５μｌの鉱物油 （ＢＤＨパラフィン油）を上塗りする。標的配列を９５°Ｃで１から３分間変性 させ、次に反応混合物を３０回、ＤＮＡ温度循環器を製造元の指示に従い使用し て温度的に循環させる。

増幅したシグナル−発生核酸を検出するために、試験ビーズウェル中の各組の複 製反応流体を取り出して、以下のようにストレプトアビジンを被覆したマイクロ タイタープレート中に移す・ポリスチレンＥＩ＾マイクロタイタープレートウェ ルを、０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐｔｌ！］、　６で調製したストレプトアビジン（ シグマ）溶液で満たす。室温（ＲＴ）で−昼夜インキュベーションした後、スト レプトアビジン溶液を各ウェルから除去し、マイクロタイターウェルを上記炭酸 緩衝液に溶解した２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。ウェル の過剰な遊離試薬を、０．０５％の７ｖ６ｅｎ　２０を含む１０ｍＭリン酸生理 食塩水、ｐｉ（７，４（１’ＢＳτ）で３回すすいで洗い落とす。一旦上記試験 流体を調製したら、アビジン−被覆ウェル中に移し、３０分間インキュベーショ ンし、次に非結合の遊離標的複製試薬を洗い落とす。ウェルを次にＰＢＳ緩衝液 で満たし、各ウェル中の蛍光を測定する。

この実施例のアッセイ応答は、チラミン−配列標的レポーターの試験ビーズ表面 への＾ＤＲＣ−１１ＲＰ触媒的付着により生じるものである。固定化された標的 核酸を次にビオチン化塩基および発蛍光団標識塩基を含有する配列復製組成物を 使用して増幅する。配列増幅中に生じるこれら塩基の取り込みは、ビオチンおよ び蛍光−標識塩基の両方を含有する核酸を生成する。検出のために、アビンン固 定−相支持体上の捕獲により核酸を単離し、次に核酸蛍光を測定することにより 検出する。蛍光の強さ；ま試料中のマウスＩｇＧ濃度に比例する。

標的または参照配列、およびプライマー配列を、ビオチン、同位体または（およ び）蛍光−標識塩基またはプライマーを取り込むことができるように設計できる 。この方法では、配列複製工程で核酸を生産し、捕捉および検出のための手段を 提供できる。例えば、標的配列または参照配列のいずれかが以下の塩基で調製で きた：参照核酸／プライマー結合部位・ ５°　ＡＴＧ　ＣＧＴ　ＡＧＣＡＧＣ７７丁　ＡＣＣＧＣＡ　にＡに　ＡＴＧ　 ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＡＴＧ　ＴＡＣＣＡＴ　ＣＣＴ　３・３’　”　’　”　−Ｃ ＧＴ　ＣＴＣＴＡＧ　ＴＡＣＣＧＡ　丁ＡＣＡＴＧ　ＧＴＡ　ＣＧＡ　５’５’ 　ＡＴＧ　ＣＧＴ　ＡＧＣＡＧＣＴＴＴ　ＡＣ３’　フライマー１　配列番号＝ ５５′　へ丁ｃｃ丁へ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＡＴＡ　ＧＴＡ　ＧへＡ　ＡＣＡ　Ｇ ＣＴ　ＧＡＣ３’　配列番号、７３’　ＴＡＧ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＴＡ Ｔ　ＣＡＴ　Ｃ？τ丁ＧＴ　ＣＧＡ　ＣＴＣ５’　配列番号”Ｂプライマー１（ 捕捉）： ５１　ビオチノー＾τＧ　ＣＧＴ　ＡＧＣＡＧＣ丁丁丁ＡＣ３’　配列番号：５ プライマー５（レポーター） ３’　ＡＴ　ＣＡＴ　ＣＴＴτＧＴ　ＣＧＡ　ＣＴＧ−発螢光団　（ｒｌｕｌ　 ５’　配列番号１３標的配列／プライマー結合部位。

５Ｉ　八ＴＧ　ＣＧＴ　ＡＧ：　ＡＧＣ：　ＴＴＴ　Ａｃｅ　ＧＣＡ’　ＧＡＧ 　Ａ＋ｘｃ　ＡＴＧ　ＣＣＴ　八ツＧ　丁入ｃｃへτ　Ｇｃ噤@３′ ３１　ユムニー二二Ｊ−二工工Ｌ　−ＣＧＴ　ＣＴＣ’ＸｋＧ　丁Ａｃ　ＧＧＡ 　ＴＡＣＡＴＧ　ＧＴＡ　ＣＧ）Ｉ　Ｓ。

あるいは発蛍光団間の効率的なエネルギー転移のため；こ、蛍光−標識塩基の位 置が適当な空間的配列になるよう１こ、配′９１］を設計することもできる。

ポリスチレン微小球ビーズ（約１−４μ直径）を、０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐｉ４ ９６中のヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｆｃ断片持異的）抗体（ＩＣＮ）で被覆する。

室温で一昼夜インキユベージョンした後、ＩｇＧ溶液を除去し、ビーズを上８己 炭酸緩衝液に溶解した２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプロ・ツクする。

次にビーズを１０ｍＭ　ＰＢＳＴで３回すすぐことにより過ｌ！Ｉｊな遊離試薬 を洗（１だす。計算のために、既知の濃度のマウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）を含有す る一連の濃度の試料から、アッセイ応答を測定すること（こより、標準曲線をイ 乍成する。標準溶液を調製するために、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ溶液（ ＢＳＡ−ＰＢＳＴ）にｍＩｇＧを溶解することによりｍＩｇＧの希釈物を作成す る。各標準（ま等量の試験ビーズに加えられる。このよう４こマウスＩｇＧ濃度 を０．０．００１．００１．０．１．１０、からＬｏｎｇ／ｍＩｇＧ（試験管） で含む試料力（調製できる。未知濃度のｍＩｇＧを含有する試験試料も別個のビ ーズの組（＝添加される。

試験および標準ビーズの両方を含む試験管を１０μｌ（０，１μｇ／ｍｌ）の上 言己抗−ＩＩＩｇＧ抗ＩｇＧ的レポーター結合体と共にインキュベーションスル 。過剰な試薬を次に、ＰＢＳＴで洗浄することにより除去する。

抗体標的レポーター結合体および参照配列の両方に関する標的核酸の増幅は、試 験ウェルに１００ａｌの複製組成物（これは適当な配列およびプライマー濃度で 複製対照も含む）を加える。試験溶液を支持体との接触を確実にするために混合 し、次に５０μｌの鉱物油（ＢＤＨパラフィン油）を上層する。標的および参照 配列を９４°Ｃで１から３分間変性させ、次に実施例１に記載されたように反応 混合物を３０回、ＤＮＡ温度循環器を製造元の指示に従い使用して温度的に循環 させる。

この実施例では標的および参照配列の両方に対する捕獲プライマー＃１は同一で あり、プライマー鎖の５°末端にビオチン化ｄＵＴＰを含有するように調製され る。ふたつの異なる標的に対するレポーターブライマー（＃２）は、異なる配列 を含んで成り、ひとつは標的核酸に特異的であり、ひとつは参照核酸に特異的で ある。各プライマー配列は、アンチセンス鎖およびその標的に相補的である。レ ポーターブライマーおよび参照プライマーの両方が、自動化ＤＮＡ合成機での合 成中にアミノ−修飾ホスフォアミダイド試薬で、それらの５゛末端をアミノ−修 飾されることができる。アミノ−修飾レポーターブライマーは、フルオロセイン ＮＨＳエステルと反応でき、プライマーの５°末端をフルオロセインで標識する 。アミノ−修飾参照プライマーを、ローダミン発蛍光団Ｎｌｌ５エステルで同じ 化学を使用して標識できる。

増幅した核酸を検出するために、各試験ウェル中の増幅反応流体を取り出して、 以下のように予めストレプトアビジン被覆したマイクロタイタープレート中に移 す、ポリスチレンＥＩＡマイクロタイターストリップ（ＮＵＮＣ）を、０．１Ｍ 炭酸緩衝液、ｐｉ（（］、　６で調製したストレプトアビジン（シグマ、セント ルイス、モンタナ州）溶液で満たす。室温で一昼夜インキユベーションした後、 ストレプトアビジン溶液を除去し、ストリップを上記炭酸緩衝液に溶解した２％ のウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）でブロックする。ストリップの過剰な遊離試薬 を、０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含む１０ｍＭリン酸生理食塩水、ｐＨ１， ４（ＰＢＳＴ）で３回すすいで洗い落とす。上記核酸複製から生成した試験流体 をストレプトアビジン被覆ウェル中で６０分間インキュベーションし、次に非結 合の遊離シグナル核酸生成物および試薬を洗い落とす。各ウェル中のローダミン およびフルオロセイン蛍光を、標準試料および試験試料の両方について測定し、 標準試料および試験試料中のフルオロセイン蛍光に対するローダミンの比を、コ ンピューター処理する。試験試料中のフルオロセインの反応は、標準試料で測定 された平均ローダミン対フルオロセイン応答に基づき補正される。正確なローダ ミン反応は、＋ｉＩｇＧ標準ウェルで測定されたフルオロセイン反応の介在によ りｍＩｇＧ濃度を決定するために使用されるだろう。試験試料中のフルオロセイ ン強度は、試料中のマウスＩｇＧ被検物の濃度に比例して増核酸レポーター（標 的）として使用する７５塩基のオリゴヌクレオチドを、５゛末端でアミノ−修飾 を施し、すなわち第一アミン基をオリゴヌクレオチド標的の５゛末端に導入した 。第一アミン基は後にＮＨ３−へテロ三官能性化学に使用され、ＤＮＡ標的を試 験抗体（Ａｂ）にカップリングする。

アミノ−修飾は、ＣＥホスフォアミダイト化学を使用して、標的を自動化ＤＮＡ 合成機で合成する間に達成される（Ｓ＋ｎ１ｔｈル」、　、　Ｓ、Ｆｕｎｇ、　 Ｍ、　Ｗ、　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびり、　Ｅ、Ｈｏｏｄ（１９８５）Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３：２３９９−２４１２　：　５ｐｒ ｏａｔ、@Ｂ。

３、　、　Ｂ、　Ｂｅｉ　ｊｅｒおよびＰ、　Ｒｉｄｅｒ（１９８７）Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃｆｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：６１８１−６１９６j。

＾ｍ１ｎｏｌｉｎｋ　２　（商標）（アブライドバイオシステムズ）、アミノ− 修飾化ホスフォアミダイト試薬はオリゴヌクレオチド合成の最後のホスフォアミ ダイトカップリングサイクル中に取り込まれた。

以下の標的プライマー配列は、結合体レポーター中の標的配列として使用するた めに設計、および合成した。

二重プライマー結合体レポーター系の標的配列（７５ｍｅｒ）　：５’Ｘ−ＧＧ ＣＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＡＡＣＡＣＴ　ＧＧＣＴＧＧ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　Ｇ ＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣＴＴＧ　ＴＴＣＣＣＣＴfＴ 、、ＣＣＴ　ＡＧＴ　ＡＴＴ　ＧＥＴ　７丁Ｃ丁ＧＧ　ＧＴＴ　５０丁　３′　 配列番号　・：９（Ｘ＝＾ｍ１ｎｏｌｉｎｋ　２　（商標）　アミノ−修飾剤） プライマー３　（７５ｍｅｒのための３°プライマー）　（１７ｍｅｒ）配列： ５’ＡＣＣＡＡＣＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣＡＡ　３’　配列番号：１０プライマ ー３　（７５ｍｅｒのための３゛プライマー）のプライマー結合部位を以下に表 す ５’Ｘ−ＧＧＣＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＡＡＣＡＣＴ　ＧＧＣＴＧＧ　ＴＣＴ 　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣＴＴＧ　ＴＴＣＣＣＣＴbＴ 、、ｃｃＴＡＧＴ−＋ｆ′　〒　−３響　配列番号：９３’ＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡ Ｇ　Ａｃｅ　ＣＭ　ＣＣＡ”　配列番Ｍ：１０下線を引いた配列はプライマー３ または３゛プライマ一結合部位に相補的な配列である。

プライマー伸長（複製）から生成した二重鎖７５ｍｅｒレポーター生成物を以下 に表す： ｓ’ｘ−ｃｃｃ　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＡＡＣＡＣＴ　ＧＧＣＴＧＧ　丁Ｃ Ｔ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣＴＴＧ　ＴＴＣＣＣＣHＧＴ ３’　ＣＣＧ　丁ＣＣＴＴＣＴ（＋ｒ　ＴＴＧ　ＴＧＡ　ＣＣＧ　ＡＣＣＡＧＡ 　ＣＡＣＣＡＣＧＡｃ　ＡＣＧ　ＡＡＣＡＡＧ　ＧＧＧ　ＡbＡ 、、ＣＣＴ　ＡＣＴ　−・　リ　配列番号＝９、、ＧＧ＾丁Ｃ入丁入子　ＣＡＡ 　ＡｊｔＧ　ＡＣＣＣＡＡ　ＣＣＡ　５’　配列番号：１１プライマー４　（７ ５ｍｅｒの５゛プライマー）　（１６ｍｅｒ）プライマー結合部位を以下に表す ： ５’Ｘ−ＧＧＣＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＡＡＣＡＣＴ　ＧＧＣＴＧＧ　ＴＣＴ 　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣＴＴＣＴ’ＴＣＣＣＣＴfＴ ３’　＃Ｐ’　−’　”ＧＡ　ＣＣＧ　ＡＣＣＡＧＡ　ＣＡＣＣＡＣＧＡＧ　Ａ ＣＧ　ＡＡＣＡＡＧ　ＧＧＧ　ＡＣＡ５’　ＧＧＣＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ触Ｃ 入３１　配列番号＝１２ｃｃτ　ＡＧＴ　ＡＴＴ　０７丁　ＴＴＣＴＧＧ　ＧＥ Ｔ　ＧＧＴ　Ｊ’　配列番号：９、ＧＧ八へＣＡＴ話ＣＡＡ　ＡＡＣＩ　ＡＣＣ Ｃ晶ｃｃ＾５１　配列番号・１１下線を引いた配列はプライマー４または“５″ プライマー結合部位”に相補的な配列である。

完全長生成物および不完全配列について、粗標的およびブライマーオリゴヌクレ オチドを、８％ポリアクリルアミド／８．３Ｍ尿素ゲル（変性）電気泳動（Ｓａ ｎｇｅｒ、　Ｆおよび＾、　Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、　１９７８．　ＦＥＢＳ　Ｌ ｅｔｔ、　８７　：ｌ０７）および標準的オートラジオグラフィーで分析した。

ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用してオ リゴヌクレオチドの３末端を［α３２Ｐ］コルジセピン５°　トリホスフェイト で放射標識（５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）　した。これは１１００ｎのオリゴヌク レオチドをｌｏｏｍＭのコルジセピン、ｐＨ６，８，１ｍＭ　ＣｏＣ１□、０． １ｍＭ　ＤＴ７．１００μｇ／ｎ１ＢｓＡおよび１０単位のＴｄＴを含有する１ ０μｌの反応溶液に加えることにより行った。反応は３７℃で３０分間インキュ ベーションした。標識オリゴヌクレオチドの２９１のアリコートを、６μｌの添 加溶液（９０％ホルムアミド、０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０ ５％キシレンシアツールＦＦ）に加え、混合、加熱しく９０℃で１分間）、そし て８％ポリアクリルアミド／８．３Ｍ尿素ゲル（４０ｘ３０ＸＯ，０４ｃｍ）　 （１ｘＴＥＡ緩衝液中：　８．９ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ホウ酸、ｐＨ８，２，２＋＋ Ｍ　ＥＤＴＡ）に添加した。電気泳動は、５５ワツト（または１．３５Ｗ／ｃｍ ）をゲルに負荷し、２．５時間、またはブロモフェノールブルーがゲルの底に移 動するまで行った。

ゲルをワットマン３ＭＭ紙（Ｗｈａｔｍａｎ　：ワットマンインターナショナル 社ニメイドストン、英国）に移して、モデル５８３ゲル乾燥器（バイオラットラ ボラトリーズ：　ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リッチモンド、カ リフォルニア州）で８０℃、１時間乾燥した。乾燥したゲルおよびＸ−線フイル ム（コダックＸｏｍａｔ　（商標）＾Ｒ２）を、増感スクリーン（デュポンＣｒ ｏｎｅｘ（商標）Ｌｉｇｈｔｉｎｇ　Ｐｌｕｓ　（商標）　デュポン社、ウィル ミントン、プラウエア州）を含むＸ−線カセットに設置し、フィルムを適当な時 間露光し、オートラジオグラフィー画像を得た。

レポーター結合体の合成ニ レポーター結合体を合成するために使用した戦略の合理性は、本明細書に概説さ れたものと同じである。方法には初めにスルフヒドリル基を、５ＡＴＡ試薬を使 用して７５塩基のアミノ−修飾オリゴヌクレオチドにカップリングさせ、次いで マレイミド基をＳＭＣＣ試薬を使用してヤギ抗体に添加し、最後に７５塩基のＳ ＡＴ八−修飾オリゴヌクレオチドをマレイミド−修飾ヤギ抗体に連結した。

ブリング ７５塩基、アミノ−修飾オリゴヌクレオチド（１，４＋ｎｇ：６０ｎｍｏｌｅｓ ）を、１００Ｉｌ！Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，０，１３，３ｍｇの ＳＡＴ＾（Ｎ−サクンンイミジルＳ−アセチルチルアセテート）５０％ジメチル ホルムアミド（ＤＭＦ）を含有する６６７μｍの反応混合物に加えた。５ＡＴＡ 試薬は２ｈｇを５０ｈｌのＤＭＦに溶解して調製した。反応混合物を２５℃で３ ０分間おいて、次に直ぐに５ｅｐｈａｄｅｘ　（商標）　Ｇ−２５（ファルマシ ア　エルケービー；　Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ　ＬＫＢ、ウプサラ、スウェーデン ）カラム（ｌＸ２０ｃｒＡ）に添加し、室温で、１００ｍＭのリン酸ナトリウム 緩衝液、ｐＨ６，５、流速価１７分で溶出した。分画を２８０ｎｍの吸収でモニ ターしくファルマシア　エルケービー、＃２１３８１Ｊｖｉｃｏｒｄ　Ｓモニタ ー）、ファルマシアモデルＦｒａｃ１００フラクションコレクターで回収した。

５ＡＴＡ−修飾オリゴヌクレオチドを含有する初めのピーク画分を（１゜０ｍ１ ）をプールし、アミコンのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　（商標）３濃縮器（アミコンダ ブリューアールブレイス社：　Ａｍ１ｃｏｎ、　Ｗ、　Ｒ，Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃ ｏ、　、デンバース。

マサチューセッツ州）を使用して１．　Ｏｗｌに濃縮した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ 　（商標）３ｓを５Ｍ２４　ｏ−ター（デュポン　ソーパル：　Ｄｕ　Ｐｏｎｔ 　５ｏｒｖａｌｌ、ニュータウン、コネチカット州）に置いて、Ｄｕ　Ｐｏｎｔ 　５ｏｒｖａｌｌ　（商標）　ＲＣ５Ｂ冷却超遠心機で、７５００回転（ｒｐｍ ニア５（ｌＯＸｇ）で、２０℃で４５分間、遠心した。試料をプールし、別のＣ ｅｎｔｒｉｃｏｎ　（商標）　３ｓに入れ、同じ遠心手順を使用して４５分間遠 心した。５ＡＴＡ−修飾オリゴヌクレオチド濃縮物（〜１．０ｍ１）を製造元（ アミコン）の指示に従い回収し、暗室中２０℃で、最終的なりＮＡ−＾ｂカップ リング法に必要となるまで保存した。

ヤギ抗体へのマレイミド基のカップリング。

レポーター接合体（アフィニピュア・Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ　ヤギ抗−ウサギＩ ｇＧ、　Ｆｌ＋Ｌ、ｌ、　５ｍｇ／ｍｌ）に使用するレポーター抗体３ｍｇを、 １００ｍＭの１ノン酸ナトＩ功ム緩衝液、ｐＨ７，０，２ｍｇのＳＭＣＣ，１， ５％のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含有する２７ｍ１の反応混合物に加え た。ＳＭＣＣは５ｍｇを８４μｍのＤＭＦ（６０ｍｇ／ｍｌ）に溶解することに より調製した。反応は７５塩基のアミノ−修飾オリゴヌクレオチドが５ＡＴＡ試 薬と反応した後、７５分に開始した。反応混合物を２５℃で３０分間反応を進め 、次に直ぐに５ｅｐｈａｄｅｘ　（商標）　Ｇ−２５カラム（ＩＸ２０ｃｍ）に 添加し、室温で、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ）１６゜５、流速１ ｍｌ／分で溶出した。分画を２８０ｎｍの吸収でモニターし、フ７／レマンアモ デルＦｒａｃ１００フラクションコレクターで回収した。ＳＭＣＣ−修１！吊（ マレイミド−修飾）ヤギ抗体を含有する初めのピーク画分を（１，０ｍ１）を１ 本の試験管にプール（４から６ｍ１）　した。反応生成物を５ＡＴＡ−修ＩＪ第 １ノゴヌクレオチドに直ぐにカンプリングする用意力くできた。

立ユ腟至丘１触準≦史氏彰駐昼視力値り凶丸プＩＪ：ユｓｙ： プールしたマレイミド−修飾ヤギ抗体分画（５ｍｌ）を１５ｍ１のＦａｌｃｏｎ 　（商標）　２０５９試験管（ベクトン　アンド　デ・ソキンソン　社：　Ｂｅ ｃｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、　、リンカーンパー ク、ニューシャーシー州）１こ加えた。

濃縮した７５塩基の５ＡＴＡ−修飾オリゴヌクレオチド（〜１．０ｍ１）を同じ 反応試験管に加え、マレイミド−修飾ヤギ抗体とよ（混合した。力・ンプ―ノン グ反応は７５μｍの１Ｍヒドロキシルアミン（ＨＡ）　（ピアス、口・ツクフォ ード、イリノイ州）　、ｐｌ＋７．０．５０ｍＭ　ＥＤＴＡを加え、よく混合す ること１こより開始した。反応物を、ＹＭ５フィルター（アミコン）を装備した アミコンモデル３ミニセル（八ｍ１ｃｏｎ　Ｍｏｄｅｌ　３　ＭｉｎｉＣｅｌｌ 　：　６ｍｌの撹拌セル）濃縮器に移した。ミニセルをへ１功ム源に繋ぎ、６０ ｐｓｉに調整して、磁気撹拌機上に置いた。主要成分（修飾−＾ｂｓ、修飾−オ リゴヌクレオチドおよび新に形成されたＤＮＡ−＾ｂ接合物）をアルミホイルで 覆い、室温で濃縮しながら反応を進めた。反応容量を約１．Ｑｍｌに減少させた （６０分）。反応物をミニセルから取り出し、ライ−トン２２４８１２、アンバ ー４．０ｍｌバイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ、ミルヒキイレ、ニューシャーシー州） に移して、室温でＬａｂＱｕａｋｅ　（商標）（ラボインダストリー社：　Ｌａ ｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、バークレー、カリフォルニア州）でインキ ュベーションし、全反応時間が２時間になるまで回転した。反応を１０μｍの１ ０ｍＭ　Ｎ−エチルマレイミド（ＤＭＦ中）を添加することにより終了した。

修飾オリゴヌクレオチド成分からオリゴヌクレオチド−抗体接合体の単離ニ ア５塩基−オリゴヌクレオチドーヤギー抗体接合体（レポーター接合体またはオ リゴヌクレオチド−抗体接合体）および抗体反応成分を、オリゴヌクレオチド成 分から高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離した。これはＺｏｒ ｂａｘ　２５０ゲル排除カラム（９，４Ｘ２５０ｍｍ、　０．２Ｍリン酸ナトリ ウム緩衝液、ｐ）＋７．０、および１ｍｌ／ｍｌのカラム流速）をウォーターズ ６００Ｅシステムコントローラーおよびウォーターズ９９１フォトダイオードア レイ検出器に連結して行われた。注入は（２００μｍ）を、ウォーターズ７００ サテライトＷＩＳＰ　（自動注入システム）を使用して行った。初のピーク分画 （０，５ｍ１）は、オリゴヌクレオチド−抗体結合体およびマレイミド修飾−抗 体反応成分を生じた。

この分画をさらにオリゴヌクレオチド−抗体接合体について、ゲル電気泳動およ び標準的オートラジオグラフィーにより分析した。結合体一連結オリゴヌクレオ チドを３゛末端で、ＴｄＴを使用して［α３２Ｐ］コルジセビン５゛−トリホス フェイト（５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で放射標識した。これは２１１１のＨＰｌ 、Ｃ−単離分画を、１００ｍＭのカコジル酸塩、　ｐＨ６，８、ｌｎｍ　ＣｏＣ ｌ２．０．１ｍＭＤＴＴ１０ｈｇ／ｍ１Ｂｓ＾、１０単位（７）ＴｄＴおよびｌ ｌ１ｃｊノ［α３２Ｐ］コルシセヒン５−トリホスフェイトを含有する１０μｍ の反応溶液に加えることにより達成された。反応物を３７℃で３０分間インキュ ベーションした。試料を次に標準的なドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｌａｅｍｍｌｉ、　ＵＫ、　１９７０　 Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５）および標準的ＤＮＡ変性（尿素）ポリ アクリルアミドゲル（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆおよび＾、　Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、　 １９７８．　ＦＥＢＳＬｅｔｔ、　８７：１０７）で分析した。

標識生成物のアリコート４μｍを、１２μｌのタンパク質ゲル添加緩衝液（６２ ，５ｍＭ　ＴｒｉｓＳｐＨ６，８，２％ＳＤＳ、　１０％グリセロール、０．０ １％ブロモフェノールブルー）に加えた。試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲ ルに添加した（８％ポリアクリルアミド分離ゲル（１５Ｘ１５Ｘ０．０７５ｃｍ ）　、３７５ｍＭ　ＴｒｉｓＳｐＨ８，８，０，５％ＳＤＳ　：　４％ポリアク リルアミド濃縮ゲル、０．１２Ｍ　ＴｒｉｓＳｐＨ６，８，１％ＳＤＳ　、レム リー泳動緩衝液中、０．２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１９２ｍＭグリシン、０ １％５ＤＳＳｐＨ８，３）　、電気泳動は１００Ｖ（６，７Ｖ／ｃｍ）で開始し 、試料が濃縮ゲル中を移動した後に２２５Ｖ（１５Ｖ／ｃｍ）に増加した。電気 泳動は染料の先端が約１３−１４ｃｍに移動するまで続けた。

２μｌの第二アリコートを、ｈｌの添加溶液（９０％ホルムアミド、０．０５％ ブロモフェノールブルー、および０．０５％キシレンシアツールＦＦ）に加え、 混合し、そして８％ポリアクリルアミド／８．３％尿素ゲル（４０Ｘ３０ＸＯ， ０４ｃ＋ｎ）（ＩＸＴＢＥ＆ｌ衝液中：　３．９ｍ１ｌ　Ｔｒｉｓ−ホウ酸、ｐ Ｈ８，２，２ｍＭ　ＥＤＴ＾）に添加した。

ゲル電気泳動は、５５ワツト（または１．３５Ｗ／ｃｍ）をゲルに負荷し、ブロ モフェノールブルーがゲルの底に移動するまで行った。

オートラジオグラフィーについては、５ＤＳ−タンパク質ゲルおよびＤＮＡ変性 ＰＡＧＥゲルの両方をワットマン３ＭＭ紙に移し、バイオラッドモデル５８３ゲ ル乾燥器で８０°Ｃ１１時間乾燥した。乾燥したゲルおよびＸ−線フィルム（コ ダック　Ｘｏｍａｔ　（商標）＾Ｒ２））を、増感スクリーン（デュポンＣｒｏ ｎｅｘ　（商標）　Ｌｉｇｈｔｉｎｇ　Ｐｌｕｓ　（商標））を含むＸ−線カセ ットに設置し、フィルムを適当な時間露光して、オートラジオグラフィー画像を 得た。

ＨＰＬＣ分画の分光高度的走査、および上記オートラジオグラフィー法から得た データは、どのＨＰＬＣ分画が７５塩基５ＡＴＡ−修飾オリゴヌクレオチド前駆 体を含まずオリゴヌクレオチド−抗体接合体を含有するのかを決定するために使 用した。ピーク分画をプールし、４℃で保存した。

固定化捕捉ビーズ（試験ビーズ）は、１００ｍｇのグリシジルメタアクリレート ビーズ（オキソシン　アクリル酸ビーズ）を、５０ｈｌの捕捉抗体溶液、ヤギ抗 −ラビットＩｇＧ抗体（０，５ｍｇ）　（アフィニピュア　ヤギ抗−ウサギＩｇ Ｇ、　Ｈ＋Ｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ　：　ＰＢＳ緩衝液中）に加えて調製した。試 験ビーズを４℃で回転させながら２０時間インキュベーションした。過剰なりギ 抗体を遠心および吸引により除去した。試験ビーズを次にウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ）で前処理して、未反応のエポキシド基を不活性化した。

試験ビーズを１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中　１０ｍＭリン酸緩衝生理食 塩溶液、ｐＨ７，４）と共に、室温で２時間インキュベーションした。試験ビー ズを水で洗浄し、ＢＳＡを除去し、次に４ＸＰＢＳ緩衝液で洗浄し、そして最終 的に０゜０２％のアジドを含有する１、　０ｍＭのＰＢＳ緩衝液中（０，１ｍｇ ／１ｌＬ）に再懸濁した。

固定化捕捉試薬の免疫−反応性および免疫アッセイ法：試験ビーズの免疫−反応 性をふたつの複製について、０．５ｍｇの試験ビーズヲ５００μｍの“エッペン ドルフ”試験管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　（登録商標）・プリンクマンインストウ ルメント社：　Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、　、　：ウ エストベリー、ニュヨーク州）中の２５ｈｌのＴｒｉｓ試料緩衝液（ＴＳＢ）　 （５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、７５ｍＭ　塩化ナトリウム、０，１％ｐｏｌｙ− ｔｅｒｇｅｎｔ　５ＬＦ−１８，０，１％ＢＳ＾、および００２％アジド）に加 えることにより、アッセイする。試験抗原を受容する試験管をアッセイするため に、ウサギＩｇＧ　（精製したウサギＩｇＧ）　、２０μｌの保存溶液（１００ μｇ／ｍｌ）を加え、溶液を室温で３０分間インキュベーションした。対照アッ セイ試験管（抗原を加えない試験ビーズ）に、２０μｍのＴＳＢ緩衝液を加え、 溶液を室温で３０分間インキュベーションした。試験ビーズは遠心によりペレッ ト化し、上澄みを吸引により除去した。各試験を３ＸＴＳＢ緩衝液で洗浄した。

各試験を次に、室温で５ｈｌのヤギ抗−Ｒ−ＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結 合体（シグマ、製品番号＾−８０２５）保存溶液と共に、２５０＋＋１の最終容 量で１時間インキュベーションした。結合体試薬を遠心および吸引により除去し て、次に各試験を４ＸＴＳＢ緩衝液で洗浄した。次にＢＣＩＰ　（ブロモクロロ インドイル　ホスフェートシグマ、製品番号７１０−３）試薬（２０μｍ）を各 試験管に加えて、室温で３０分間インキュベーションした。試験中の発色（青− 緑）を記録し、免疫活性の程度を測定した。

オリゴヌクレオチド−抗体接合体（ヤギ抗−Ｒ−ＩｇＧに接合した７５塩基標的 オリゴヌクレオチド）を３°末端で、ＴｄＴを使用して［α３２Ｐ］コルジセピ ン５°−トリホスフェート（５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で放射標識した。これは １０μｌのプールしたオリゴヌクレオチド−抗体接合体のｎｐｔｃピーク分画を 、１００ｍＭ（７）カコジル酸塩、　ｐｌ＋６．８．１ｍｍ　ＣｏＣ１４，０， １μＭ　ＤＴＴ、　１０ｈｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、３０単位のＴｄＴおよび２０μＣ ｉの［α３２Ｐ］コルジセピン５°−トリホスフェイトを含有する２ｈｌの反応 溶液に加えることにより達成された。反応は３７℃で３０分間インキュベージジ ンした。１０マイクロリツトルの標識オリゴヌクレオチド−抗体結合体を５０μ ｍの“コールド“接合体に添加した。５ｐ１から０．００５μｍのオリゴヌクレ オチド−抗体結合体の連続的希釈物を、免疫−反応性についてアッセイした。試 験される各希釈物について、ふたつの複製物を０．５ｍｇの試験ビーズを５０ｈ ｌの“エッペンドルフ“チューブ中の２５０μｌのＴＳＢ緩衝液に加えることに より用意した。試験抗原を受容する試験管をアッセイするために、ウサギエｇＧ （精製されたウサギエｇＧ：シグマ、Ｎ−５００６）　、２ｈｌの保存溶液（１ ０ｈｇ／ｍｌ）を加え、溶液を室温で３０分間インキュベーションした。ふたつ の対照アッセイ試験を（添加抗原無しの試験ビーズ）、各接合体希釈物について 作成した。各対照試験に、２ｈｌのＴＳＢ緩衝液を加え、溶液を室温で３０分間 インキュベーションした。

試験ビーズは遠心によりペレット化され、上澄みを吸引により除去した。

各試験を３ＸＴＳＢＩ！衝液で洗浄した。次に各試験を、２５ｈｌのＴＳＢ緩衝 液および［α３２ｐ］標識オリゴヌクレオチド−抗体結合体の適当な希釈物中で 、室温で１時間インキュベーションした。未反応の標識レポーター結合体試薬を 、遠心および吸引で除去し、次に各試験を４ＸＴＳＢＩｌ衝液で洗浄した。各試 験管のアッセイ試験ビーズ、またはアッセイ対照ビーズをｌｈｌのＴＳＢ緩衝液 に再懸濁し、１０ｍ１のシンチレーション流体（Ｂｉｏｆｌｕｏｒ（［ｊ［）　 ）を含有するシンチレーションバイアルに移した。各試験の放射標識の量をベッ クマン　モデルＬＳ３８０１シンチレーションカウンター（ベックマン）で計数 した。各希釈物のシグナルの量および非特異的標識をグラフ化した。これらのデ ータを、バックグラウンドからは非特異的反応性が区別できない、７５塩基オリ ゴヌクレオチド−ヤギ＾ｂ接合体の希釈物を測定するために使用した。レポータ ー接合体のこの希釈物およびこの希釈物のすぐ下の希釈物を以下の免疫アッセイ に使用した。

レポーター接合体を使用する用量一応答免疫アッセイ：被検体保存溶液の連続希 釈から作られたアリコート、ウサギＩｇＧ（１００μｇ／＋１）　（ジグｖ、　 Ｎｌ−５００６）　、ｌｕｇ、　ｌｎｇ、およびｌｐｇを、２５ｈｌのＴＳＢ中 に０゜５ｍｇの試験ビーズを含有する５００μｍの試験管に加えた。２５０μｍ のＴＳＢ緩衝液、０、５１１ｇの試験ビーズを含み、およびウサギＩｇＧは含ま ない対照アッセイも存在した。アッセイ溶液を室温で（抗原捕捉工程）３０分間 インキュベーションした。試験ビーズを遠心によりベレット化し、および上澄み を吸引により除去した。各試験を３ＸＴＳＢ緩衝液で洗浄し、次に室温で０．０ ２μｌのオリゴヌクレオチド−抗体結合体を含有する２５ｈｌ等量希釈のＴＳＢ 緩衝液と３０分間インキュベーションした。上澄みを遠心および吸引により除去 した。試験ビーズを４ＸＴＳＢ緩衝液、次に１×水で洗浄した。ビーズを５０μ ｌの水に再懸濁した。

レポーター抗体（ヤギ抗−ウサギＩｇＧ　：ジャクソン　イムノリサーチラボ） に接合した７５塩基オリゴヌクレオチド樟的配列の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）を使用して行った。この方法にはさらにふたっの別個のプライマー の添加が必要であった。第一の添加は開始サイクル前に成され：３°プライマー が５′プライマーよりも１ｏＸ過剰で加えられた。第二のプライマーの添加は、 １５サイクル目の複製後に成され、両方のプライマーが同じ濃度で加えられた。

増幅反応は、上記の試薬および以下の条件で行われた。各試験試料について、最 終反応容量５０μｍ（１゜ｆｆｌＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，３，５０ｍＭ　 ＫＣＩ、１．５ｍＭ　ｍｇｅｔ、、０．００１％　ゼラチン、１゜ｈＭ　ｄＡＴ Ｐ、　１１００ＩＩ　ｄＣＴＰ、　１００μＭ　ｄＧＴＰ、　１００ｇＭ　ｄＴ ＴＰおよび０．２５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する）が調製された 。開始反応については、２゜５１１１の３゛ブライ７　（４０ｎＭ　保存溶液） および２．５μｍの５°プライマー（４０ｎＭ　保存溶液）が、２５ａｌの蒸留 水を含有するＭｉｃｒｏＡ＋ａｐ　（商標）反応試験管（パーキン　エルマーー シークス）に加えられた。水に再懸濁した５マイクロリツトルの試験ビーズをプ ライマーに加え、試験管を９５°Ｃで５分間おいた。ラムダプライマーおよびＤ ＮＡ、“キット”対照を、ＰＣＲ試薬対照（製造元が薦めるプライマーおよびラ ムダＤＮＡに関する反応濃度）用に、さらに試料として実験に加えた。マスター 　リアクションミックス（ｍａｓｔｅｒ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍ１ｘ）をパーキ ン　エルマー−シークスキット試薬およびＴａｑＤＮ＾ポリメラーゼ（＾ｍｐｌ ｉｔａｑ　（商標）：パーキン　エルマーーシータス）を使用して（［ｎ＋１］ 　ｘ１５μｍ、ｎは試験試料の数である）を使用して調製し、７２℃に加熱した 。マスター　リアクション　ミックスを各試験管に小分け（１５μｌ）　Ｌ、混 合そして７２℃で停止している温度循環ブロックに移した。すべての試料を温度 循環器に移した後、それらを９０℃で１５秒間の１５サイクル（変性条件）、そ して次に４２℃で１０秒間（プライマーアニーリング条件）に供した。標的配列 が短いので（７５塩基）、さらに重合化する必要は無かった。重合は、変性のた めに室温から９０°Ｃに上昇する間に行われた（〈１°（：：／５ｅｃ）。２０ サイクルの後、２．５μｍの３゜プライマー（４００ｎＭ保存溶液）および２． ５μｌの５′ブライ７　（４００ｎＭ保存溶液）を加えるために、反応物を７２ ℃に維持した。上記に記載されたものと同じ循環サイクルを使用して、反応物を さらに１５サイクルの循環に供した。反応を４５秒間で６５℃にし、次に４℃に し、さらなる分析のために維持した。

増幅生成物の分析 増幅生成物は初めにサブマリン電気泳動で分析した。７５塩基標的（ヤギ＾ｂに 接合したレポーターオリゴヌクレオチド）の増幅後、１５μｍの増幅試料を３μ ｍのアガロースゲル添加緩衝液（３０％グリセロールおよび０．２５％ブロモフ ェノールブルー）と混合し、そして次に０．１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド および０．５ＸＴＢＥ緩衝液を含有する３％アガロースゲル（８，５Ｘ６゜０ｘ 〜０．５ｃｍ：２５ｍ１アガロース溶液）で分析した。ゲル電気泳動は、５０ｖ （または５．９Ｖ／ｃｍ）を４０分間ゲルに負荷して行った。結果はエチジウム ブロマイドで染色されたＤＮＡバンドがＵＶ透過照明装置（３１０ｒ＋ｍ波長、 モデルＴト２０、ｕｖｐ社：　ＵＶＰ、　Ｉｎｃ、　、サンガブリエル、カリフ ォルニア州）で視覚化し、ポラロイド型の５７白黒フイルム（ポラロイド社：　 Ｐｏ１ａｒｏｉｄ　Ｃａｒｐ。

ケンブリッジ、マサチューセンツ州）で記録した。フィルムには、暗い灰色から 黒のバンクグラウンド（ゲル）に対して、バンドは白または明るい灰色で現れた 。さらに、増幅生成物の分析は、ポラロイド型５７フイルム上のエチジウムブロ マイドで染色されたＤＮＡバンドを、上記のデンシトメーターを使用して反射密 度を測定することにより行った。反射デンシトメーターは、初めに密度単位が特 定の密度反射を与えた標準密度プラークを標準化した。次にゲルのバックグラウ ンドを測定し７次に各増幅生成物を表すエチジウムブロマイドで染色されたＤＮ Ａバンドを測定する。このように、各アッセイの増幅の応答が測定され、標準曲 線と比較する時、試料中に存在する抗原量を反映した（用量一応答曲線）。

第７図について、レーン３から６は、免疫アッセイ中に存在する種々の抗原量に 応答した００２μｍの結合体を使用した７５塩基レポ一ター配列の増幅反応を表 す。レーン３．４および５の試験試料は、それぞれ１μｇ、　ｌｎｇおよびｔｐ ｇを含有した。レーン６は非特異的結合量（ｎ、　ｓ、　ｂ、　）のために、試 験に被検体が添加されていない対照である。レーン１はＨａｅ　ｍ消化ΦＸ１７ ４分子量マーカーであり、レーン２はλ対照プライマー二量体である。

以下の表１において、結果は第７図の免疫アッセイの投与一応答を表す。７５塩 基生成物の定量は、モデルＲＤ１０７ＲＱｕａｎｔａ　Ｌｏｇデンントメーター を使用して、ポラロイド５７フイルムの反射百分率を測定することにより行った 。エチジウムブロマイド染色の相対強度（反射の百分率）として表されるデータ は、存在する被検体（ウサギＩｇＧ）の量に相関したアッセイ応答を示す。

表１ 直接的標的法において、増加させたＲ−ＩｇＧ被検体濃度に応じて生成された増 幅生成物の相対バンド強度レーン　被検物の量　バンド強度 ５　１、０（Ｉｐｇ）　１０ ４　１、０（ｌｏｇ）　１８ ３　１、０（ｔｕｇ）　２２ データから分かるように増幅アッセイは、被検体の量がｌｏｇ以上存在する時に 達成された。

配列表 配列番号：　１： 配列の特徴： 鎖長・７５　塩基対 種類：　核酸 鎖の数二　−重鎖 トポロジー：　直鎖状 分子の形：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＾ＴＧＣＧＴＡＧＣＡ　ＧＣＴＴＴＡＣＣＧＣＡＧＡＧ八丁Ｃへ？Ｇ　ＣＣ丁入 τＧ丁八へＣ入子ＧＣτへ丁ＣＣ丁　＾ＣＣＴＧ了入入Ｇ丁@６０ ＣＡＴＡＧＣ７ＧＴ７　７ＣＣＴＧ　７５配列番号：　２： 配列の特徴： 鎖長・７５　塩基対 種類・　核酸 鎖の数：　−重鎖 トポロジー：　直鎖状 分子の形：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号：　３： 配列の特徴・ 鎖長ニア５　塩基対 種類、　核酸 鏑の数　−重鎖 トポロジーエ　直鎖状 分子の形：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号：　４： 配列の特徴。

鎖長ニア５　塩基対 種類　核酸 鎖の数・　−重鎖 トポロジー・　直鎖状 分子の形：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号：　５゜ 配列の特徴： 鎖長：１７　塩基対 種類・　核酸 鎖の数　−重鎖 トポロジー６　直鎖状 分子の形：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＾ＴＧＣＧτ＾ＧＣＡ　ＧＣＴ丁丁ＡＣ１７配列番号二　６゜ 配列の特徴・ 鎖長：１７　塩基対 種類、　核酸 鎖の数・　−重鎖 トポロジー：　直鎖状 分子の形：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＣＡＧＧＭＡＣ八ＧＣフＡフへＡＣ：Ｌ’７配列番号＝　７： 配列の特徴。

鎖長ニア５　塩基対 種類二　核酸 鎖の数・　−重鎖 トポロジー　直鎖状 分子の形：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 入ＴＧ：ＧＴＡＧＣＡ　ＧＣＴＴＴＡＣＣＧＣへＧ＾Ｇへ〕Ｃ入τＧ　ＣＣＴＡ ？ＧＴＡＣＣＡＴＧＣ丁入丁Ｃ入子　λＣＣ丁ＣＴＡ＾丁入@６０ Ｇ丁＾ＧＡＡＡＣＡＧ　Ｃ？ＧＡＣ７５配列番号、　８・ 配列の特徴： 鎖長ニア５　塩基対 種類：　核酸 鎖の数　−重鎖 トポロジー：　直鎖状 分子の形：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＴＣＡＧＣτＣ丁丁　丁ＣＴＡＣＴＡ丁丁＾　Ｃ＾ＧＧＴＡＧＧＡＴ　ＡＧＣ 八ＴへＧ丁入Ｃ入子入ＧＧＣ＾丁ｑ入　ＴＣＴＣＴＧＣＧＧ噤@６０ 人入ＡＧＣＴＧＣ丁八　ＣＧＣＡ了　７５配列番号・　９： 配列の特徴・ 鎖長　７５　塩基対 種類、　核酸 鎖の数：　−重鎖 トポロジー、　＠鎖状 分子の形：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡ　ＣＡＡＡＣＡＣＴＧＧ　ＣＴＧＧＴＣＴＧＴＧ　ＧＴＧ ＣＴＧＴＧＣＴ　？Ｇ？ＴＣＣＣ１ｊＧ　？Ｃ１ｊＡＧ丁＾囃噤@６０ Ｇ丁丁ττＣＴＧＧＧ　丁τｃｃ丁　７５配列番号：１０ 配列の特徴： 鎖長：１７　塩基対 種類　核酸 鎖の数、　−重鎖 トポロン−・　直鎖状 分子の形　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ７配列 ＡＣＣＡＡＣＣＣＡＧ　イイＣＡＡ　１７配列番号：１１ 配列の特徴： 鎖長ニア５　塩基対 種類：　核酸 鎖の数二　一本鎖 トポロジー：　直鎖状 分子の形：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 配列番号：　１２゜ 配列の特徴・ 鎖長・１６　塩基対 種類・　核酸 鎖の数二　一本鎖 トポロジー：　＠鎖状 分子の形：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡ　ＣＡＡＡＣＡ　１６配列番号・　１３・ 配列の特徴： 鎖長、１７　塩基対 種類・　核酸 鎖の数、　−重鎖 トポロジー　直鎖状 分子の形：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＴＣＡＧＣＴＧｒＴ　ＴＣＴＡＣＴＡ　”Ａ　Ｂ　ＣＤ ＦＩＧ、１ Ａ　Ｂ　ＣＤ 検出 Ａ　Ａ’　Ｂ　Ｂ＋　（Ｃ’ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、６ フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＯＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ、　ＦＩ。

ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＯ，ＮＺ、　ＰＬ、　Ｒ ○、　ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ（７２）発明者　モラン、ジョン・リ チャードアメリカ合衆国すウスカロライナ州２９４０１チャールストン・キック ストリートナンバ（７２）発明者　ヘンドリクソン、ニドウィン・アールアメリ カ合衆国プラウエア用１９７０７ホツケシン・キックスゲラントロード４９ （７２）発明者　ハトフィールド、テイナ・マリーアメリカ合衆国メリーランド 州２１９２１エルクトン・シマロンサークル１４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ｉ）被検体を固定化して、固定化された標的核酸配列を含有する被検体依存性 リポーター系を形成する工程、（ｉｉ）前記標的核酸配列を核酸複製組成物と接 触させ、（ｉｉｉ）前記標的核酸配列を複製する工程、および（ｉｖ）複製され た標的核酸配列を検出する工程、を含んでなる、被検体に応じて固定化された標 的核酸配列の複製により増幅が達成される、被検体の増幅された検出の方法。 ２． （ａ）固定化された捕捉試薬、被検体、および標的核酸配列を含むリポーター接 合体から構成された被検体依存性リポーター複合体を形成する工程、 （ｂ）前記複合体を核酸複製組成物と接触させる工程、（ｃ）前記標的核酸配列 を複製させる工程、ならびに（ｄ）前記複製された標的核酸配列を検出する工程 、を含んでなる、請求の範囲１の方法。 ３． （ａ）固定化された捕捉試薬、被検体、および酵素を含むリポーター接合体から 構成された被検体依存性リポーター複合体を形成する工程、（ｂ）前記複合体を 核酸複製基質と接触させて、固定化されたレセプター上に堆積する活性化された 核酸複製中間体を生成し、これにより堆積した核酸複製生成物を生成する工程、 （ｃ）前記堆積した核酸複製生成物を核酸複製組成物と接触させる工程、 （ｄ）前記堆積した核酸複製生成物の標的核酸配列を複製させる工程、ならびに （ｄ）前記複製された標的核酸配列を検出する工程、を含んでなる、請求の範囲 １の方法。 ４． （ａ）固定化された捕捉試薬、被検体、および酵素を含むリポーター接合体から 構成された被検体依存性リポーター複合体を形成する工程、（ｂ）前記複合体を 固定化されたレセプター上に堆積する活性化された結合性中間体を生成し、これ により堆積した結合性生成物を生成する工程、 （ｃ）前記堆積した結合性生成物を核酸複製接合体と接触させて、堆積した核酸 複製結合性対の複合体を生成する工程、（ｄ）前記堆積した結合性対の複合体を 核酸複製組成物と接触させる工程、 （ｅ）前記堆積した結合性対の複合体の標的配列を複製する工程、ならびに （ｆ）前記複製された標的核酸配列を検出する工程、を含んでなる、請求の範囲 １の方法。 ５．被検体依存性リポーター系に１または２以上の参照核酸配列および前記参照 配列を複製する手段を追加的に添加し、これにより前記参照配列を前記標的配列 に加えて複製し、これにより被検体のより正確な検出および定量のための内部対 照として働かせる工程をさらに含む、請求の範囲１方法。 ６、工程（ｉｉ）において、被検体依存性リポーター系を、複製対照をさらに含 む核酸複製組成物と接触させ、ここで前記接触は前記複製対照の参照配列が前記 標的配列に加えて複製される条件下に実施し、そして 工程（ｉｖ）において、前記複製された参照配列を検出しかつ別々に定量し、こ れにより複製された参照配列に対する複製された標的配列の比を決定する際に、 被検体の濃度が測定される、工程をさらに含む、請求の範囲１の方法。 ７．工程（ｉ）において、被検体依存性リポーター系内で、前記固定化された標 的核酸配列に加えて参照核酸配列の接合体を固定化し、工程（ｉｉ）において、 前記被検体依存性リポーター系を核酸複製組成物と接触させ、ここで前記組成物 は前記参照核酸配列の接合体の参照配列を複製する手段をさらに含み、 工程（ｉｉｉ）において、前記参照配列を前記標的配列と同時に複製し、そして 工程（ｉｖ）において、前記複製された参照配列を検出しかつ別々に定量し、こ れにより複製された参照配列に対する複製された標的配列の比を決定する際に、 被検体の濃度が測定される、工程をさらに含む、請求の範囲１の方法。 ８．熱安定性核酸ポリメラーゼを使用して、前記被検体依存性リポーター系の核 酸配列の複製を達成する、請求の範囲１または５の方法。 ９．前記標的配列または参照核酸配列が一本鎖であり、そして一方の末端に第１ プライマー結合性配列を含有し、そして他方の末端に前記第１プライマー結合性 配列に対して相補的である配列を含有する、請求の範囲１または５の方法。 １０．前記標的配列または参照核酸配列に対して相補的ではない配列をそれらの ５′末端に含有するプライマーを使用して、前記被検体依存性リポーター系の核 酸配列の複製を達成する、請求の範囲１または５の方法。 １１．熱安定性リガーゼを使用して、前記被検体依存性リポーター系の核酸配列 の複製を達成する、請求の範囲１または５の方法。 １２．シグナル発生核酸配列塩基を前記複製された核酸配列内に組み込む、請求 の範囲１または５の方法。 １３．前記シグナル発生核酸配列塩基が放射性部分を含有するように修飾された 塩基からなる、請求の範囲１２の方法。 １４．前記シグナル発生核酸配列塩基が発光体部分を含有するように修飾された 塩基からなる、請求の範囲１２の方法。 １５．前記シグナル発生核酸配列塩基が化学発光体部分を含有するように修飾さ れた塩基からなる、請求の範囲１２の方法。 １６．前記シグナル発生核酸配列塩基が酵素部分を含有するように修飾された塩 基からなる、請求の範囲１２の方法。 １７．前記シグナル発生核酸配列塩基が蛍光体部分を含有するように修飾された 塩基からなる、請求の範囲１２の方法。 １８．前記蛍光性塩基が前記複製された配列内に位置して前記蛍光性塩基類の間 のエネルギーの転移を可能とする、請求の範囲１７の方法。 １９．前記蛍光性塩基類が前記複製された核酸配列内に約１２塩基以下離れて位 置する、請求の範囲１８の方法。 ２０．結合性対の第１構成員に接合された核酸塩基が複製された核酸配列内に組 み込まれている、請求の範囲１または５の方法。 ２１．前記結合性対の第２構成員を含む固定化されたレセプター上に複製された 核酸配列の堆積により前記配列を固定化し、そして前記固定化された複製核酸配 列をさらに検出することによって、複製された核酸配列の検出および定量を達成 する、請求の範囲２０の方法。 ２２．結合性対の前記第１構成員がビオチンである、請求の範囲２０の方法。 ２３．工程（ｉｉｉ）後、サイズ分離技術を使用して非組み込み核酸塩基から前 記複製された核酸配列を分離し、そして（ｉｖ）前記複製された核酸配列を検出 することをさらに含む、請求の範囲１または５の方法。 ２４． （ａ）各々が固定化された捕捉試薬、被検体、および標的核酸配列を含むリポー ター接合体から構成された被検体依存性リポーター複合体を形成する工程であっ て、前記標的核酸配列が単一の試料の中に存在するリポーター接合体の各型につ いて異なる長さである工程、（ｂ）前記リポーター複合体を核酸複製組成物と接 触させる工程、（ｃ）前記標的核酸配列を複製する工程、ならびに（ｄ）配列の 長さに基づいて核酸配列を検出しかつ区別する技術を使用して、前記複製された 標的核酸配列を検出する工程であって、異なる長さの配列の存在を検出するとき 、単一試料の中の異なる被検体を測定する工程、 を含んでなる、前記試料の中の１より多くの異なる被検体を検出する請求の範囲 ２の方法。 ２５．各リポーター接合体が結合性対の１構成員から構成されており、前記結合 性対が化学的カップリング結合を通して標的核酸配列の５′末端に取り付けられ ており、ここで前記標的核酸配列が５′末端上および３′末端上にプライマー結 合領域を含有する、請求の範囲２４の方法。 ２６．前記試料において使用する異なるリポーター接合体の各々が独特の長さを 有する標的核酸配列を含み、そしてさらに前記試料中の異なる標的配列の各々が 同一組のプライマーを使用して複製することができる、請求の範囲２５の方法。 ２７． （ａ）被検体の試料に固定化された捕捉試薬を添加する工程、次いで（ｂ）標的 核酸配列からなるリガンドリポーター接合体を添加する工程であって、前記リポ ーター接合体のリガンドが前記固定化された捕捉試薬への結合について前記被検 体と競争する工程、（ｃ）結合しないリガンドリポーター接合体を前記固定化さ れた被検体複合体から洗浄除去する工程、 （ｄ）洗浄された結合しないリガンド接合体を核酸複製組成物と接触させる工程 、 （ｅ）前記標的核酸配列を複製する工程、ならびに（ｆ）複製された標的核酸配 列の存在を検出し、これにより前記試料の中の被検体の存在を検出する工程、 を含んでなる、増幅を標的核酸配列の複製により達成し、そしてリガンドリポー ター接合体の競争的結合に基づく、被検体の検出および定量のための請求の範囲 １の方法。 ２８． （ｉ）被検体の試料を固定化された捕捉試薬と接触させ、これにより被検体を固 定化する工程、 （ｉｉ）リポーター接合体を前記試料に添加し、これにより被検体に応じて固定 化された被検体依存性リポーター複合体を形成する工程、（ｉｉｉ）溶液の中に 遊離したままの過剰のリポーター接合体を前記試料から分離する工程、 （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の遊離リポーター接合体を核酸複製組成物と接触させる 工程、 （ｖ）工程（ｉｖ）の遊離リポーター接合体の標的核酸配列を複製する工程、な らびに （ｖｉ）工程（ｖ）の複製された標的核酸配列を検出しかつ定量し、これにより 前記試式料の中の被検体の存在を決定する工程、を含んでなる、非固定化リポー ター接合体の標的核酸配列の複製により増幅を達成する、被検体の増幅された検 出の方法。