JPH07506248A

JPH07506248A - いずれの型にも属さないインフルエンザ菌の高分子表面タンパク

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Publication number: JPH07506248A
Application number: JP5516604A
Authority: JP
Inventors: バーレンカンプ、スティーヴェン　ジェー．
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Current assignee: Individual
Priority date: 1992-03-16
Filing date: 1993-03-16
Publication date: 1995-07-13
Anticipated expiration: 2013-10-15
Also published as: NO316623B1; NO943431D0; CA2131837C; US5549897A; AU3916893A; US6218141B1; FI116838B; EP0632814B1; KR950700936A; FI944273A0; EP0632814A1; BR9306109A; NO943431L; RU2157816C2; FI944273L; ATE222955T1; PT632814E; GB9205704D0; DE69332243D1; KR100219126B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称いずれの型にも属さないインフルエンザ菌の高分子表面タンパク技術分野本発明は、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌の高分子タンパクに関する。

発明の背景いずれの型にも属さないインフルエンザ菌は、非被包微生物であり、既知のインフルエンザ夾膜抗原に対する抗血清との反応性を欠くことによって規定される。

これらの微生物は一般に人間の上部気管に定着し、中耳炎、副鼻腔炎、結膜炎、気管支炎および肺炎等の感染症の原因となる場合が多い、これらの微生物は多糖類火膜を有さないので、既存のＨｉｂＭｉｉ性夾膜多糖類に対するインフルエンザｂ型ワクチンでは防除することができない、しかし、いずれの型にも属さない系統のインフルエンザ菌は抗ｍ菌性抗体を誘導する表面抗原を生産する０人間の血清における抗細菌活性の標的として、２種類の主要外膜タンパク、Ｐ２およびＰ６が同定されている。しかし、特にいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株におけるＰ２タンパクの配列は変動することが知られている。したがって、Ｐ２に基づくワクチンは全ての系統の微生物に有効とは限らない。

人間の回復期血清に存在する抗体の主要な標的であると考えられる一群の高分子量（ＨＭ　Ｗ　）タンパクがＢａｒｅｎｋａｍｐら（Ｐｅｄｉａｔｒ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄ口、　Ｊ、　、　９　：　３３３−３３９．１９９０）によって同定されている。中耳より分離した一連の株を検査すると、はとんどの株でこのようなタンパクが１〜２種類認められる。しかし、本発明が行なわれるまで、このようなタンパクが純粋な形で単離されていなかったので、これらタンパクの構造は不明であった。

発明のｌ！要本発明省らは、高分子量（ＨＭＷ）インフルエンザ函タンパクの性質をさらに検討するため、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌プロトタイプの２種類の免疫優勢ＨＭＷタンパク（以＠ＨＭＷＩおよびＢＭＷ２と表示する）をコード化した遺伝子をクローン化し、表現させ、配列を決定した。また、別のいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の別の２種類の免疫優勢＋１ＭＷタンパク（ＨＭＷ３およびＨＭ　Ｗ　４と表示する）をコード化した遺伝子をクローン化し、表現させ、はとんど完全に配列を決定した。

したがって、本発明の目的は、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の高分子タンパクをコード化した遺伝子、特ニ）（Ｍ　Ｗ　ｌ　、ＨＭ　Ｗ　２、Ｉｔ　Ｍ　Ｗ　３またはＩｔ　Ｍ　Ｗ　４タンパクならびにいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株によって起こる疾病に対して免疫性を保持しているこれらタンパクの変異体またはフラグメントを＝−ド化した遺伝子の単離および精製されたものを提供することである１本発明の別の目的は、これら遺伝子によって＝ −ド化されたいずれの型にも属さないインフルエンザ函の高分子タンパクを提供することである。

図の簡単な説明図１は、ＨＭＷ１タンパクを＝−ド化した遺伝子のＤＮＡ配列（Ｓ　Ｂ　Ｑ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　ｏ　：　１　）を示す。

図２は、ＨＭＷ１タンパクのアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ：２）を示す。

図３は、ＨＭＷ２タンパクをコード化した遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：３）を示す。

図４は、ＨＭＷ２タンパクのアミノ酸配列（Ｓ　ＥＱＩＤ　Ｎｏ：４）を示す。

図５Ａは、ＨＭＷＩまたはＨＭＷ２＃造遺伝子を含む代表的な組換えファージの制限マツプを示す、構造遺伝子の位置は黒欅で示す。

図５Ｂは、Ｔ７表現ベクターｐ　Ｔ　７−７の制限マツプを示す。

図６は、ニュクレオチド３５１〜４９５８（ＯＲＦａ）（図１と同様）からなるｈ　ｍ　ｗ　１遺伝子の遺伝子クラスターならびにＯＲＦ　ｂニスクレオチド５１１４〜６フ４８および立ニュクレオチド７０６２〜９０ＩＩからなる３′フランク部位における別の２ｆｉｉ類の下流遺伝子のＤ　Ｎ　Ａ配列（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：５）を含む。

図７は、ニュクレオチド７９２〜５２２２　（ＯＲＰｉ）（図３と同様）からなるｈｍｗ２遺伝子の遺伝子クラスターならびに０ＲＦｂニユクレオチド５３７５〜７００９および立ニュクレオチド７２４９〜９１９８からなる３°フランク部位における別の２種類の下ｆｆ１ｆｆｉ伝子（７）ＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：６）を含む。

図８は、ＨＭＷ３タンパクをニード化した遺伝子の部分的ＤＮＡ配列（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ　：　７）である。

図９は、ＨＭＷ４タンパクをコード化した遺伝子の部分的ＤＮＡ配列（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ　：　８）である。

図１Ｏは、ＨＭＷＩ、ＢＭＷ２、ＨＭ　Ｗ　３およびＨＭＷ４タンパクのアミノ酸配列を比較する表である。

発明の詳細な説明それぞれ図１および３に示したＨＭＷ　ＩおよびＨＭＷ２をコード化した遺伝子のＤＮＡ配列、最初の１２５９塩基対が同一であるため、約８０％が同一である。

図２および４に示した２種類のＨＭＷタンパクのアミノ酸配列は、約７０％が同一である。さらに、コード化タンパクは百日咳菌のフィラメント状赤血球凝集表素面タンパクに抗原的に関連している。百日咳菌のフィラメント状赤血球凝集素（ＦＨＡ）に対して調製されたモノクローナル抗体は、両種の高分子タンパクを識別することが知られている。このデータは、ＨＭＷおよびＦ　ＨＡタンパクが同じような生物学的機能を有することを暗示している。ＨＭＷＩおよびＨＭＷ２タンパクのアミノ酸配列は、ＦＨＡタンパクのアミノ酸配列と類似している。さらに、これらの抗原的に関連のあるタンパクは、いずれの型にも属さないほとんどのインフルエンザ菌によって生産されることが知られている。ＨＭＷ　１遺伝子によって表現されたタンパクに対する抗血清は、ＢＭＷ２および百日咳菌ＦＨＡの両者を識別する０本発明は百日咳菌Ｆ　ＨＡに抗原的に関連したいずれの型にも属さないインフルエンザ閑の単離および精製された高分子タンパクを包含し、これらのタンパクは天然材料から得る二とができ、また遺伝子工学的に生産することもできる。

いずれの型にも属さないインフルエンザ菌の公知の系統のファージゲノムライブラリーは標準的な方法によって調製し、ＢＭＷに対して高い力価を有する抗血清を用いて、ライブラリーをスクリーニングして高分子タンパクを表現するクローンを調製する０反応性の高い多くのＤＮＡクローンをプラーク精製し、Ｔ７表現プラスミツトにサブクローン化した。これらはいずれも、見かけ上の分子量がそれぞれ１２５および１２ＯｋＤａで、開放読取りフレームがそれぞれ４．６ｋｂおよび４．４ｋｂのＨＭ　Ｗ　１およびＨＭＷ２と表示した２種類の高分子タンパクのいずれかを表現した。

ＨＭＷＩまたはＨＭＷ２のいず、れかを表現する代表的クローンの特性をさらに検討し、遺伝子を単離し、精製し、配列の決定を行なった。ＨＭＷＩのＤＮＡ配列を図１に示し、相当するアミノ酸配列を図２に示す。

同様に、ＨＭＷ２のＤＮＡ配列を図３に示し、相当するアミノ酸配列を図４に示す、単離したタンパクの部分的精製およびＮ−末端配列分析の結果から、表現されたタンパクはその配列が完全長ＨＭＷ　１およびＨＭＷ２遺伝子産物の残基数４４２から出発することが明らかとなり、いずれもトランケートであると考えられる。

ｈ　ｍ　ｗ　１およびｈｍｗ２遺伝子についてサブクローン化試験を行なった結果から、ＨＭＷタンパクの合成が正しく行なわれるためには、別の下流遺伝子産物が必要であると考えられる。ｈｍｗｌおよびｈ　ｍ　ｗ　２の両遺伝子は、それぞれ立および立と表示した別の２種類の下流開放読取りフレーム（ＯＲＦ）によってフランクされていることが明らかとなった（図６および７参照）。

ｂ　ＯＲＦの長さは＋６３５ｂｐであり、ｈｍｗｌの場合にはニュクレオチド５１１４から６７４８まで、ｈ　ｍ　ｗ　２の場合にはニュクレオチド５３７５から７００９まで広がり、アミノ酸配列の９９％が同一である。

そのアミノ酸配列は、旦、ｍ１ｒａｂｉｌｉｓおよびＳ、ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの溶此素の分泌および活性化に必要なタンパクをコード化している２種類の遺伝子のアミノ酸配列と似ていることが明らかとなった。

ｃＯＲＦの長さは１９５０　ｂｐであり、ｈｍｗ９１９８まで広がり、アミノ酸配列の９６％が同一である。ｈｍｗｌ　、ｇ　ＯＲＦは、９　ｂｐの一連の直接タンデム反復の後に続いている。プラスミツドのサブクローン化においては、ｈｍｗｌ　ｂまたはＣ０ＲＦを妨害すると、ｈｍｗｌの構造遺伝子産物の生産および分泌が損なわれる。

２種類の高分子タンパクを単離し、精製したところ、チンチラにおける中耳炎に対しである程度の防護作用を有し、アトへシンとしての機能を有することが認められた。これらの結果は、これらの高分子タンパクおよびその他のいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の構造的に関連したタンパクを、いずれの型にも属さないインフルエンザに対するワクチンの成分として使用できることを示している。

ここに提供するタンパクは優れた交差反応性抗原であり、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌のほとんどの菌株に存在しているので、これらＩＩ　Ｍ　Ｗタンパクは汎用的インフルエンザワクチンとしての完全な成分であることが明らかである。実際に、これらタンパクはいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株により起こる中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎等の疾病に対する予防的抗原としてのみならず、髄膜炎に対する共役ワクチンにおける予防的Ｈｉｂ多糖類の担体としても使用することができる。また、これらタンノ（りはその他の微生物のその他の抗原、ハプテンおよび多糖類の担体として使用し、これら抗原、）−ブテンおよび多糖類に対する免疫を誘導することもできる。

いずれの型にも属さない異なったインフルエンザ菌株の２種類の高分子タンパク（ＨＭ　Ｗ　３およびＨＭＷ４と表示）をコード化したニュクレオチド配列をほとんど解析し、図８および９に示す。ＨＭＷ３は見かけ分子１１２３　ｋ　Ｄ　ａを有し、ＨＭＷ４は見かけ分子量１２３ｋＤａを有する。これら高分子タンノ（りは、ＨＭＷＩおよびＨＭＷ２タンパクならびにＦＨＡと抗原的に関連している。ＨＭ　Ｗ　３の配列分析はほぼ８５％完全であり、ＨＭ　Ｗ　４の配列分析は９５％完全であるが、各遺伝子の５′末端における短スツレツチの配列が未解析である。

１１ａｌｏには、ここで同定した４種類の高分子タンノ（りのアミノ酸配列の比較を示す、この比較から明らかなように、この比較の範囲でペプチド配列は同一であり、ＨＭＷ３はＨＭＷＩと、ＨＭＷ４はＨＭ　Ｗ　２ときわめてよく似ている。この情報は、各種のいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株からの高分子タンパクの間で配列がかなり相同であることを強く示唆している。

さらに、ＨＭＷＩまたはＨＭＷ２のいずれか、またはその両方の表現を欠く、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌の変異株を構築し、ヒト培養上皮細胞に対する付着性を試験した。大腸菌にＬＬ！ユおよびｈ　ｍ　ｗ　２遺伝子クラスターを表現させ、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ−における付着性を試験した。これらの実験結果は、ＨＭＷＩおよびＨＭＷ２とも付着を仲介するアトへシンであり、インフルエンザ菌のその他の表面構造を欠いているにもかかわらず、この機能は保持されていることを実証している。

本発明者らは、高分子タンパクの単離、精製によって、従来のエピトープマツプ法により主要な保護エピトープを決定し、完全合成または組換えワクチンに組み込むべき決定因子に相当するペプチドを合成することができた。したがって、また本発明は、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌の高分子タンパクの少なくとも１つの保護エピトープに相当するアミノ酸配列を有する合成ペプチドから成る。このようなペプチドの長さは異なり、関連微生物に対して直接または共役体の一部として免疫の誘導に使屈することのできる高分子タンパクの一部を構成し、したがって相当する疾病を予防するワクチンを構成する。また、本発明は、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌株によって起こる疾病を予防することのできる免疫性を保持しているタンパクのあらゆる変異体またはフラグメントを提供する。このような変異体は遺伝子を部分的に欠失または変異させることにより構築し、得られた修飾遺伝子を表現させてタンパクの変異体を得ることができる。

実施例実施例１：急性中耳炎を発症した幼児の中耳液から、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌株５および１２を分離し純粋培養した。ＨＭＷｌおよびＨＭＷ２タンパクをコード化した遺伝子を有する菌株１２から、クロモソームＤＮＡの部分制限消化５ａｕ３Ａを調製し、スクロースグラジェントで分配することによって、クロモソームＤＮＡを調製した。９〜２０ｋｂｐの範囲のＤＮＡフラグメントを含む両分を一緒にし、λＥＭＢＬ３アームに結紮することによってライブラリーを調製した。結紮混合物を、、ＬＪＬｖエエエ１でパッケージとし、大腸菌ＬＥ３９２のＰ２溶原菌を用いプレート上に増幅させた。

プラスミツドのサブクローン化試験のため、代表的な組換えファージのＤＮＡを、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモータφ１０、リポソーム結合部位および多重クローン化部位よりｌＯタンパク上流のＴ７遺伝子の翻訳開始部位を含むＴ７表現プラスミツドｐ”ｒｙ−７中にサブクローン化した（図５Ｂ参照）。

ジデオキシ法によりＤＮＡ配列分析を行い、ＨＭＷ１遺伝子の両ストランドおよびＨＭＷ２遺伝子の単一ストランドの配列を決定した。

ウェスターン免疫プロット分析を行い、反応性ファージクローンにより生産される組換えタンパクを同定した。ＬＥ３９２ｍ胞中で生育させたファージ溶融液またはＬＥ３９２Ｊ１ｍ胞ローンから直接ＹＴプレート上に採取したブラキューをゲル電気泳動用ａ＊＊に溶解させ、電気泳動に供した。７．５％または１１％のポリアクリルアミド改良Ｌ　ａ　ｅ　ｍ　ｍ　Ｉ　ｉゲルを用い、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。ニトロセルロース濾紙にタンパクを載せ、高分子タンパクに対する高力価抗体を含む大腸菌吸着ヒト血清、ついで第２抗体としてアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で探査した。Ｉ！康な成人の血清は、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌の表面暴露高分子タンパクに対する高力価の抗体を含んでいる。このような血清試料の１つをＬ　Ｅ　３９２１１１Ａ胞に吸着させ、スクリーニング用抗血清として使用した。

組換えプラスミツドで形質変換させた大ｙａｍによって生産される組換えタンパクな同定するため、特定のプラスミツドを用いて大腸菌Ｂ　Ｌ　２　＋　（Ｄ　Ｅ　３　）　／　ｐＬ　ｙ　ｓ　Ｓの形質変換を行なった。得られた形質変換株を、５０μｇ　／　ｍ　１のアンピシリンを含むＬブロス中でＡ６ｏｏが０．５となるまで培養した６次に、　ＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加した。　１時間後に細胞を採取し、超音波処理により細胞懸濁液を調製した。試料中のタンパク濃度は、ビシンコニン酸法により測定した１ｗ３タンパク１００μｇを含む細胞懸濁液を電気泳動用緩衝液に溶解させ、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ニトロセルロース濾紙に載せた。

次に、ニトロセルロース濾紙を、大腸菌吸着ヒト血清、ついで第２抗体としてアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で探査した。

また、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌によって表現された、クローン化ＨＭＷＩ遺伝子（ｒ　ＨＭＷＩ）によってコード化されたタンパクに抗原的に関連した高分子タンパクの相同性または非相同性を確認するため、ウェスターン免疫分析を行なった。細菌細胞の超音波懸濁液を電気泳動屈ｌ５ＩｌｉＦ＆に溶解させ、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ニトロセルロース濾紙に載せた０次に、ニトロセルロース濾紙を、ウサギのモノクローナルｒ　ＨＭ　Ｗ　Ｉ抗血清、ついで第２抗体としてアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で探査した。

最後に、百日咳菌のフィラメント状赤血球凝集タンパクと抗原的に関連したタンパクがいずれの型にも属さないインフルエンザ菌によって表現されたことを確認するため、ウェスターン免疫プロット分析を行なった。フィラメント状赤血球凝集素を識別するマウスの免疫グロブリンＧ　（Ｉ　ｇＧ）抗体であるモノクローナル抗体Ｘ３Ｇを用いて、ウェスターンプロットによる細胞懸濁液を探査した。

検出には、第２抗体としてアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧを用いた。

組換えタンパク抗血清を生成させるために、上記のようにｐＨＭＷｌ−４を用いて大腸＠ＢＬ２１　（ＤＢ３　）　／　ｐ　Ｌ　ｙ　ｓ　Ｓの形質変換を行い、Ｉ　ＰＴＧを用いて組換えタンパクの表現を誘導した。ｍ菌細胞の超音波懸濁液を調製し、　＋０．　０００　ｘ　ｇで３０分間遠心分離して上清とペレット画分に分けた。組換えタンパク画分はペレット画分に分画された。ペレット画分からのタンパク１ｍｇを２週間ごとにウサギに皮下注射して免疫投与した。Ｎｋ初の投与にはフロイントの完全アジユバントを用い、その後の投与にはフロイントの不完全アジユバントを用いた。４回注射したのち、ウサギから採血した。ウェスターンプロット分析に先立って、ベクターのみでクローン化することによって形質変換させた宿主大腸面の超音波処理懸濁液に抗血清を吸着させた。

ＨＭＷＩとフィラメント状赤血球凝集素との間の抗原決定因子の分布割合を評価するために、ダルベコのリン酸緩衝生理食塩水に４μｇ　／　ｍ　ｌの割合で溶解したフィラメント状赤血球凝集素溶液を６０μｍ／ウェルの割合で、酵素リンク免疫ソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）　プレート　（Ｃｏｓｔｅｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａ　ｓ　ｓ、）に室温で２時間コーティングした。

ウェルは、血清添加前１時間、ダルベコのリン酸緩衝生理食塩水で調製した１％仔牛血清アルブミンでブロックした。ｒ　ＨＭ　Ｗ　ｌ抗血清を０．１％Ｂｒ１ｊ（Ｓｉ　ｇｍａ、Ｓ　ｔ、Ｌｏ　ｕ　ｉ　ｓ、Ｍｏ、）のリン酸緩衝生理食塩水溶液で連続希釈し、室温で３時間インキュベーションした。プレートを洗浄したのち、ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗つサギＩｇＧ抗体（［３ｉｏ　Ｒａｄ）とともに室温でさらに２時間インキュベーションし、０．０３％のＨ２Ｏ２を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐｌ−１４，２、で０．５４ｍｇ／ｍｌに希釈した２、２−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−ｉ＃）（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）で発色させた。吸光度は、自動ＥＬ　Ｉ　ＳＡ読取り装置で測定した。

ＨＭＷＩおよびＨＭＷ２を表現する組換えファージは、以下のように回復させた。いずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の１２ゲノムライブラリーについて、高分子タンパクに対する高力価抗体を含む大腸菌吸着ヒト血清試料を用い、高分子タンパク表現クローンをスクリーニングした。

反応性の弱いクローンとともに、反応性の強い多くのクローンを同定した。反応性の強い２０種のクローンをブラキエ精製し、ウェスターンプロット法によって組換えタンパクの表現を検定した。反応性の強いクローンは、いずれもＨＭＷＩおよびＨＭＷ２と表示した高分子タンパクのいずれかを表現した。ＨＭＷＩおよびＨＭ　Ｗ　２溶融液中の主要な免疫反応性タンパクのバンドは、それぞれ見かけ分子量１２５および１２０ｋＤａの位置に移動した。主要バンドの他に、各細胞溶融液にはさらに見かけ分子量の高い少量タンパクのバンドが検出された。ＨＭ　Ｗ　２の細胞溶融液中で認められた１　２０ｋＤａ以下の分子量を有するタンパクのバンドは通常は認められず、タンパク分解産物であろうと考えられる。

λＥＭ［ＩＬ３クローンベクターのみを接種したＬＥ３９２の溶融液は、同じ血清試料で免疫学的にスクリーニングしても、反応性を示さなかった。したがって、認められた活性は、交差反応性大腸菌タンパクまたはλＥＭＢＬ３コード化タンパクによるものではなかった。さらに、組換えタンパクはヤギ抗ヒトＩｇＧ抱合体のみ、正常なウサギ血清、または多くの健康な乳幼児の血清とは反応しないので、免疫グロブリンとは非特異的に結合しない。

ＨＭＷＩまたはＨＭＷ２組換えタンパクのいずれかを表現する代表的なりローンについて、さらに性質を検討した。２種類のファージの制限マツプは、ＨＭＷｌおよびＨＭＷ　２　ｍ造遺伝子を含め、お互いに異なっていた０図５Ａは、ＨＭＷＩまたはＨＭ　Ｗ　２構造遺伝子を含む代表的組換えファージの制限マツプを示す。

構造遺伝子の位置は、点棒で示す。

Ｔ７表現プラスミツドＴ７−７（図５ＡおよびＢ）を用い、ＨＭＷ　ｌプラスミツドのサブクローンを構築した。また、ＨＭ　Ｗ　２プラスミツドのサブクローンも構築し、これらの結果はＨＭＷＩｌｌｌｊ築物の結果と同様であった。

ＨＭＷＩＩＦＩ造遺伝子のおおよその位置および複写の方向は、まずｏ　ＨＭ　Ｗ　ｌプラスミツドを用いて決定した（図５Ａ）。　このプラスミツドは、　λ ＨＭＷＩからの８．５ｋｂ　ＢａｍＨＩ−３ａ　ｌ　ＩフラグメントをＢ　ａ　ｍ　ＨＩ−およびＬ工」ｌ−カット　ｐＴ７−７中に挿入することによって構築した。ＤＨＭＷＩで形質変換させた大腸菌は、　Ｉ　ＰＴＧで強く誘導される見かけ分子量１１５ｋＤａの免疫反応性組換えタンパクを表現した。このタンパクは親ファージによって表現される１　２５ｋＤａの主要タンパクに比較して著しく小さかったことから、このタンパクは溶融タンパクとして表現されたか、カルボキシ末端基でトランケートしているものと考えられる。

この構造遺伝子の３′末端をさらに正確に局在化するため、ｐ　ＨＭＷ　Ｉ　Ｉｆ築物の３１末端から連続的に欠失させることにより別のプラスミツドを構築した。プラスミツドｐＨＭＷｌ−■は１．ＨＭＷ　１をＰｇｔｌで消化し、得られた８、８ｋｂフラグメントを単離し、再結紮することにより構築した。プラスミツドＤＨＭＷｌ−２は、ＨｉｎｄｌｌｌでｐＨＭＷｌを消化し、得られた７、５ｋｂのフラグメントを単離し、再結紮することによって構築した。ｐＨＭＷＩ− １またはｐＨＭＷＩ−２のいずれのプラスミツドで形質転換した大腸菌も、見かけ分子量１１５ｋＤａの免疫反応性組換えタンパクを表現した。これらの結果は、構造遺伝子の３°末端がＨｉｎｄｌ１１部位の５°であることを示唆している。

遺伝子の５°末端をさらに正確に局在化するため、プラスミツドＤＨＭＷＩ−４およびｐ　ＨＭ　Ｗ　１−７を構築した。プラスミツドＤＨＭＷＩ−４はλＨＭ〜Ｖ　Ｉからの５．　Ｉ　ｋｂ　ＬｉＪＩＬＨＩ　Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　＋フラグメントを上流の３．８ｋｂ　ＥｃｏＲｒ−ＢａｍＨ菰フラグメントを含むｐ”ｒｙ−ｙ由来プラスミツドにクローン化することによって構築した。ｐＨＭＷＩ− ４によって形質変換した大腸菌は、見かけ分子量約１６０ｋＤａの免疫反応性タンパクを表現した。タンパクの生産はｒＰＴＧで誘導されるが、これら形質変換体におけるタンパク生産レベルは、上記のｐ　ＨＭ　Ｗｌ−２による形質変換体に比較して著しく低かった。プラスミツドｐｉ（ＭＷＩ−７はＤＨＭＷＩ−４をＮ」Ｌ」−！およびｍ＋で消化することによって構築した。

この二重消化によって得られた９、０ｋｂｐフラグメントを単離し、末端をブルント化し、再結紮した。また、ｐＨＭＷｌ−７で形質変換させた大腸菌も見かけ分子量１６０ｋＤａの免疫反応性タンパクを表現した。

このタンパクはその大きさにおいて、ｐＨＭＷｌ−４による形質変換体と同一であった。したがって、ＩＩ　ＭＷｌ構造遺伝子の開始コドンは５ＪＬｉ１部位の３゛であると考えられる。ＤＮＡ配列分析によって、この結論を確認した。

上記のように、λＨＭＷＩファージクローンは１２５ｋＤａの主要免疫反応性バンドを表現し、一方完全長遺伝子であると考えられるＩ−Ｉ　Ｍ　Ｗ　ＩプラスミツドクローンＤＨＭＷＩ−４およびｐＨＭＷｌ−７は約１６０ｋＤａの免疫反応性タンパクを表現した。このような大きさの差は予想を超えるものであった。

　１つの可能性として、ＨＭＷＩ遺伝子生産物の正しいプロセス化に必要な別の遺伝子または遺伝子群がサブクローン化の過程で欠失したものと考えられる。この可能性を確認するために、プラスミツドＤＨＭＷＩ−１４を構築した。この構築物はｐＨＭＷｌをＦＬ！ＬＬｌおよびＭＬユ■で消化し、ｐＨＭＷｌ−４から単離した７、６ｋｂｐのＮ　ｄ　ｅ　Ｉ　−Ｍ　ｌ　ｕ　Ｉフラグメントを挿入することによって生成させた。このような構築物は、もとのＨＭＷ　１フアージに存在している完全長ＨＭＷ　ｌ遺伝子ならびにＨＭＷＩ遺伝子のＤＮＡ３’　を含むものと考えられる。このプラスミツドで形質変換した大腸菌は、見かけ分子量＋２５および１６０ｋＤａの主要免疫反応性タンパクならびに別の分解産物を表現した。

１２５および１６０ｋＤａのバンドは、ＨＭＷＩファージの溶融液中で検出される主要および少量免疫反応性バンドと同一であった。興味あることに、ＤＨＭＷｌ−１４＃１築物は非誘導条件下でも著しい量のタンパクを表現した。このようなこ°とは、その他の構築物では認められなかった。

＋２５ｋＤａのタンパクと１６０ｋＤａのタンパクの間の関係は、明らかではない、以下に記載するように、配列分析で、Ｉ（ＭＷ＋Ｗｌ子はｌ　５９　ｋ　Ｄ　ａのタンパクをコード化していると予想される。　＋６０ｋＤａのタンパクは１２５ｋＤａの成熟タンパクのが１駆体であり、一方のタンパクから他方のタンパクへの変換は２種類の下流遺伝子の生産物に依存するものと考えられる。

ＨＭＷＩ遺伝子の配列分析（図１）から、ニュクレオチド３５１のＡＴＧコドンから始まり、ニュクレオチド４９５９のＴＡＧストップコドンで終了する４゜６０８ｂＤの開放読取りフレーム（ＯＲＦ）が認められた。配列ＡＧＧＡＧを有する推定リポソーム結合部位は、推定開始コドンの１０ｂｐ上流で始まる。ＯＲＦの開始から２５０ｂｐ以内にその他の５種類のフレーム内ＡＴＧコドンが存在するが、これらのｔＴ＋Ｉには典型的なリポソーム結合部位が存在していない。ＯＲＦの５′フランキング領域は、７ｂ、の配列Ａ　Ｔ　Ｃ−ｒ　ＴＴＣを１６回繰り返す一連の直接タンデム反復を含んでいる。これらのタンデム反復は、　＋００ｂｐの推定開始コドンの５”で終了する。ｒｈｏ−非依存性転写ターミネータ−のａｂｐ逆転反復特性が存在し、ニュクレオチド４９８３、すなわち２５ｂｐの推定転写ストップの３′で始まる。３種類の読取りフレームの全てのＯＲＦの上流および下流に、多重終了コドンが存在する。ＨＭＷＩ遺伝子によってコード化されたタンパクのアミノ酸配列（図２）は１５９．０００の分子量を有し、ＨＭＷＩ−４およびＨＭＷＩ−７形質変換体によって表現されるタンパクの見かけ分子量とよく一致した。アミノ末端のアミノ酸配列は、典型的なシグナル配列の特性を示していない、ｐＨＭＷｌの生成に使用したＢ　ａ　ｍＨ１部位は、ｂｐ１７４３から１７４８までのニュクレオチド配列からなっている。１１ｍＨ１部位のＯＲＦ下流は１１１　ｋＤａのタンパクをコード化していると予想され、ｏ　ＨＭ　Ｗ　１−コード化溶融タンパクの見かけ分子量として推定される１１５ｋＤａとよく一致する。

ＨＭ　Ｗ　２遺伝子の配列（図３）は、ニエクレオチド３５２のＡＴＧコドンで始まり、ニュクレオチド４７８３のＴＡＧストップコドンで終わる４、４３１ｂｐのＯＲＦからなっている。ＨＭＷ２遺伝子のＯＲＦの最初の１，２５９ｂｐは、ＨＭＷＩ遺伝子と同一である。その後配列は分岐しはじめるが、全体的に８０％同一である。ＨＭＷ２配列のニスクレオチド９３位に付加している単一塩基を除き、ＨＭＷＩとＨＭ　Ｗ　２の５゛フランキング領域は対応する開始コドンから３１０ｂＤ上流まで同一である。したがって、ＨＭＷ２！伝子の前に、同じセットのタンデム反復およびｔｌ　Ｍ　Ｗ１遺伝子の５′に横たわる同じ推定リポソーム結合部位が存在する。ＨＭＷＩのＯＲｐの同定された３′と同−で、ニュクレオチド４８０４で始まる推定転写ターミネータ−が認められる。２ａｉ類の遺伝子の長さの差は、主としてニュクレオチド３８３９で始まるＨＭＷ２配列におけるギャップ１８６ｂｐによるものである。ＨＭＷ２遺伝子によってコード化されたタンパクのアミノ酸配列（図４）は１５５，０００の分子量を有し、ＨＭＷＩ道伝子のアミノ酸配列と７１％同一である。

ＨＭＷＩおよびＨＭＷ２遺伝子のアミノ酸配列（Ｉ２１２および４）は、百日咳菌の表面タンパクであるフィラメント状赤血球凝集素のアミノ酸配列と同様であった。Ｉ−！ＭＷＩのフィラメント状赤血球凝集素配列を比較するための初期および最適ＴＦＡＳＴＡスコアーは、それぞれ８７および１８６で、ワードサイズは２であった。比較のための２スコアーは、４５．８であった。

ＨＭ　Ｗ　２のフィラメント状赤臘球凝集素配列を比較１゛るための初期および最適ＴＦＡＳＴＡスーアーは、それぞれ６８および＋９６であった。後者の比較のためのＺスコアーは、４８．７であった。初期および最適ＴＦＡＳＴＡスコアーならびに２スコアーの範囲から、ＨＭＷＩおよびＨＭ　Ｗ　２　Ｍ伝子産物とフィラメント状赤す球凝集素の間には生物学的に意義のある関連があると考えられる。ＨＭＷｌ、ＨＭＷ２およびフィラメント状赤血球凝集素のアミノ酸配列を並べて比較する特表千７−５０６２４８　（８）と、これらの配列のアミノ末端で最も顕著な類似性が認められた。推定ペプチド配列における最初の２２個のアミノ酸のうち２０個のアミノ酸は同一であった。

さらに、配列から、最初の２００個のアミノ酸の範囲で、５種類の共通するアミノ酸ストレッチ、Ａ　ｓ　ｎ　−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉ　ｌｅおよびいくつかの類ストレッチ配列の同一性が認められた。

実施例２：ＨＭＷＩフィラメント状赤血球凝集素の関連性をさらに探求するため、ＨＭＷＩ −４組換えタンパク（「ＨＭＷＩ）に対して調製した抗血清の精製フィラメント状赤血球凝集素識別能力を評価した。ｒＨＭＷ＋ＨＭＷＩ、フィラメント状赤血球凝集素を用いたＥＬＩＳＡで用量相関性のある反応を示した。この検定で、免疫投与前のウサギ血清は、はとんど活性を示さなかった。また、ｒ　ＨＭ　Ｗ　１抗証清についてウェスターンプロット分析を行い、この検定システムでも精製フィラメント状赤血球凝集素に対して弱いが、陽性の反応が認められた。

ＨＭＷＩ遺伝子産物に相当する天然インフルエンザタンパクを同定し、ＨＭＷＩクローン化遺伝子産物に抗原的に関連したタンパクがいずれの型にも属さないその他のインフルエンザ菌株にどの程度普遍的に存在しているか明らかにするため、ｒＨＭＷｌ抗血清を用いたウェスターンプロットでインフルエンザ菌のパネルをスクリーニングした。抗血清は相同性菌株１２における１２５および１２０ｋＤａタンパク、すなわちそれぞれＨＭＷＩおよびＨＭ　Ｗ　２遺伝子の推定成熟タンパク産物のバンドを両方とも識別した。

いずれの型にも属さない非相同性のインフルエンザ菌株のスクリーニングにｍいた場合、　ｒ　ＨＭ　Ｗ　１抗血清は１２５種類の疫学的に関連のない株の７５％における高分子タンパクを識別した。一般に、抗血清は各非相同性菌株の１００〜１５０ｋＤａの範囲にあるｌまたは２種類のタンパクバンドと同じパターンで反応したが、相同性菌株で認められたものとは同一ではなかった。

モノクローナル抗体Ｘ３Ｃは、百日咳菌のフィラメント状赤血球凝集素タンパクに対するマウスＩｇＧ抗体である。この抗体は培養チャイニーズノームスター卵母細胞およびＨｅ　Ｌ　ａ　Ｊｌｌ胞の百日咳菌細胞への結合を阻害し、精製フィラメント状赤血球凝集素による赤血球の凝集を阻害する。ウェスターンプロット分析を行い、このモノクローナル抗体を上記のいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の同じパネルに対してスクリーニングした。モノクローナル抗体Ｘ３Ｃは、紐換えタンパク抗血清によって識別されたいずれの型にも属さないインフルエンザ１１２株における高分子タンパクを識別した。さらに、モノクローナル抗体は、組換えタンパク抗血清によって識別されたものと同一の、いずれの型にも属さない非相同性インフルエンザ菌株のサブセットにおけるタンパクバンドを識別した。

場合によって、フィラメント状赤血球凝集素モノクローナル抗体は、組換えタンパク抗血清によって識別された２種類のバンドのうち１種類のみを識別すると思われる。全体的に、モノクローナル抗体Ｘ３Ｇは、われわれが保管しているいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の約３５％におけるｒ　ＨＭ　Ｗ　１抗血清によって識別されるものと同じ高分子タンパクを識別した。

実施例３：ＨＭＷｌ、ＨＭＷ２またはその両方のタンパクの表現を欠失する変異株を構築し、細菌の付着におけるこれらタンパクの役割を検討した。以下の手順を用いた。

ＤＨＭＷｌ−１４（実施例１１　図５Ａ）をＢａｍＨｌで消化し、ついでｏＵＣ４Ｋから１．３ｋｂ　ＢａｎＨｌフラグメントで単離したカナマイシンカセットに結紮した。得られたプラスミツド（ｐＨＭＷＩ−１７）Ｘｂａｌで消化して直線化し、いずれの型にも属さないインフルエンザ菌株＋２に形質変換させ、カナマイシン抵抗性コロニーを選抜した。これら一連のコロニーについてサザーン分析を行ったところ、形質変換体の２群、すなわちＨＭＷＩｌ’Ｆｊ造遺伝子に挿入したものとＪ（Ｍ　Ｗ　２　＠造遺伝子に挿入したもの、が認められた。

これらのクラスのそれぞれからｌ変異株を選抜してさらに試験した。

両タンパクの表現を欠失する変異株は、以下のプロトコールにしたがって回復させた。ＤＮＡの２．１ｋｂフラグメントをｐＨＭ　Ｗ　−１５のＨＭＷＩ摺造遺伝子の３′位に広がるＪＬＬｉＲｌの２部位間で切除したのち、ｃ＋ＬＪｃ４Ｋからのカナマイシンカセットを１゜３ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントとして挿入した。得られたプラスミツド（ｐ　ＨＭ　Ｗ　１　１６　）　＆　Ｌｂ、１で消化して直線化し、　１２株に形質変化させたのち、ふたたびカナマイシン抵抗性コロニーを選抜した。これらコロニーの代表的飼料についてサザーン分析を行ったところ、８カセツト中７カ七ツトでＨＭＷ　１およびＨＭ　Ｗ　２の両座に挿入されていることが確認された。

これらの変異株からｌ変異株を選抜し、さらに試験した。

目的とする表現型を確認するため、紐換えＨＭＷＩタンパクに対するポリクローナル抗血清を／ｎいて、変異株のウェスターンプロット分析を行った。親株は！２５　ｋ　Ｄ　（１’）　ＨＭ　Ｗ　Ｉ　オ、１：　（ｊ　Ｉ　２０　ｋ　Ｄ　）ＨＭ　Ｗ　２９７バクを表現した。一方、ＨＭＷ２変７４にハ＋　２０　ｋ　Ｄタンパクを表現することができず、ＨＭ　Ｗ　ｌ変異株は１２５ｋＤタンパクを表現することができなかった。

二Ｊｔ変異株はいずれのタンパクも表現すること、ができなかった、全細胞溶融、外膜のプロフィールおよびフロニーの形態に基づいて、野生型と変異株はその他の点では相互に同一であった。透過型電子顕微鏡により、４株のいずれも線毛を表現しないことが確認された。

チャン上皮細胞に対する野生型１２株の付着能力を測定した。この検定では、細菌をブロス中で培養し、密度的−２ｘ　１０’ｃ　ｆ　ｕ／ｍ　＋まで生育させた。約２ｘ　１０’ｃ　ｆ　ｕ／ｍ　Ｉを上皮細胞単層に接種し、プレートをＩ　６５ｘｇで５分間遠心分順してｌａｉ！と上皮Ｊｌｌ胞の表面を接触させた。

３７℃の５％ｃ０２中で、３０分間培養したのち、単層をＰＢＳで５回洗浄して非付着微生物を除去し、ＰＢ３中トジトリプシンＤＴＡ　（）リプシン０．０５％、ＥＤＴＡｏ、５％ンで処理してプラスチック担体から剥離させた。ウェルの内容物を混合し、希釈液を固体培地に蒔き、単層あたりの付着ＭＡ菌数を得た。

単層あたりの付着ｃｆｕ数を接種したｃｆｕ数で割って付着率を算出した。

下表１（表は本明！ＩＡ書の最後に添付する）に示すように、この系統はきわめて効率よく付着し、接種原の約９０％が単層に付着した。ＩＩＭＷＩを表現するが、■（ＭＷ２は表現しない変異株（Ｉ（ＭＷ２−）による付着もきわめて効率よく、野生型の付着性とほぼ同等であった。一方、ＨＭ　Ｗ　２は表現するが、ＨＭ　Ｗ　ｌの表現を欠く株（ＩＩＭｗ＋−）による付着は、野生に比較して焼＜１５倍低かった。二重変異株（ＨＭＷ　ｌ−／ＨＭＷ２−）の付着はさらに低く、野生型に比較して約５０倍、ＨＭＷＩ変異株に比較して約３倍低下した。これらのことを−緒にして考えると、ＨＭ　Ｗ　ＩタンパクおよびＨＭ　Ｗ　２タンパクはいずれもチャン上皮細胞に対する付着に影響を及ぼずものと考えられる。興味あることに、この細胞系に対する付着を最高とするためには、１（ＭＷＩを必要とするが、ＨＭ　Ｗ　２は必要ないと考えられる。

実施例４ニプラスミツドｐＨＭＷ１−１６およびＤＨＭＷＩ−１７を用い、実施例３で記載した菌株１２にもちいたと同じスキームにしたがって、いずれの型にも属さない３種類のインフルエンザ菌株の５変異株、すなわちｈｍｗｌ様（ｈｍｗ３と表示）遺伝子座に挿入したカナマイシン遺伝子を有する１株、ｈｍｗＺ様（ｈｍｗ± と表示）遺伝子座に挿入した第２株、両遺伝子座に挿入した第３の株を単離した。予想したように、ウェスターンプロット分析で、カナマイシンカセットを坦ｍｗ＋様遺伝子座に挿入した変異株は＋　２５ｋＤの１（ＭＷ３タンパクの表現を喪失し、一方ｈ　ｍ　ｗ　Ｚ様遺伝子座に挿入した変異株は１２３ｋＤのＩＩ　Ｍ　Ｗ　４タンパクを表現することができなかった。二重挿入を有する変異株は、いずれの高分子タンパクも表現することができなかった。

下表１に示すように、野生型５は高い付着性を示し、接種菌株の単層あたりの付着率はほとんど８０％であった。ＨＭＷＺ様タンパクの表現を欠失した変異株も付着率がかなり高かった。一方、ＨＭＷ　ｌ様タンパクの表現ができない変異株の付着率は、野生型に比較して約５倍減少し、二重変異株の付着率はさらに低かった（約２５倍）、ギムザ染色試料を検査したところ、これらの知見が確認された（表示せず）、シたがって、菌株５で得られた結果は、菌株１２ならびにＨＭＷＩおよびＨＭＷ２タンパクで得られた知見と一致した。

実施例５：ＨＭＷＩおよびＨＭＷ２タンパクの付着機能を確認し、そのだのインフルエンザ菌表面構造のＨＭ　Ｗ　ＩおよびＪ（Ｍ　Ｗ　２の効果をそれぞれ個別に検査するため、それぞれプラスミツドｐＨＭＷ１−１４およびＤＩ（ＭＷ２−２１を屈い、ｈ　ｍ　ｗ　ｌおよびｈｍｗ２遺伝子クラスターを大腸菌のＤ　Ｈ５αに導入した。対照として、クローニングベクターｐＴ７−７を大腸菌のＤＨ５αに導入した。ウェスターンプロット分析で、ｈｒｎｗｌ遺伝子を含む大腸菌Ｄ　Ｈ５ αは１２５ｋＤタンパクを表現するが、ｈｍｗ２遺伝子を有する同じ菌株は１２ＯｋＤシンタンパク現することが確認された。　ｐＴ７−７を含む大腸菌ＤＨ５ αは、組換えＨＭＷＩに対する抗血清と反応することができなかった。透過型電子顕微鏡で観察１−だところ、大腸菌のいずれの菌株にも線毛またはその他の表面付属器は認められなかった。

大腸菌による付着性を定量的に測定し、いずれの型にも属さない野生型のインフルエンザ菌株１２の付着性と比較した。下表２に示すように、ベクターのみを含む大腸菌ＤＨ５αによる付着率は、菌株１２に比較して１％低かった。一方、ｈ　ｍ　ｗ　Ｉ遺伝子クラスターを有する大＄９　菌Ｄ　Ｈ５αの付着レベルは菌株１２とほぼ同等であった。ｈｍｗ２遺伝子を含む大腸菌Ｄ　Ｉ−（５αによる付着率は菌株１２による付着率に比較して約６倍低かったが、ＤＴ７−７のみを有する大腸菌Ｄ　Ｉｔ５αによる付着に比較して２０倍増加した。これらの結果は、ＨＭＷＩおよびＨＭＷ２タンパクがチャン角膜細胞に対する付着をそれぞれ独自に仲介することを示している。これらの結果は、実施例３および４に記載したインフルエンザ菌株の結果と一致するが、チャン上皮細胞に関してはＨＭ　Ｗ　２に比較してＩＩＭＷＩの方が効果的であることを示している。

ｐＴ７−７、ｐＨＭＷｌ−１４またはｏ　ＩＩ　Ｍ　Ｗ　２−２１を有する大腸菌＋（ｕ　［０１を用いた実験で、Ｄ　Ｈ５α誘導体で得られた結果が確認された（表２９　ＩＫｉ　）。

実施例６：以下のようにして、いずれの型にも属さないインフルエンザ面（Ｎ　Ｔ　Ｉ（Ｉ　）株１２から、ＨＭＷＩおよびＨＭ　Ｗ　２を単離し、精製した。いずれの型にも属さないインフルエンザ面の凍結保存株をチョコレートプレートにストリークし、　３７℃の５％ＣＯ２中で１夜培養した。ヘミンおよびＮＡＤをそれぞれ１０Ｍｇ　／　ｍ　＋の割合で添加した脳−６騨浸出物（ＢＨＩ）ブロスのスターターカルチャー５０　ｍ　ｌをチョコレートプレートに接種した。スターターカルチャーを吸光度が帆６〜０．　８　（６００ｎｍ）に達するまで培養し、ＢＨＩを補給した５　００　ｍ　ｌ容フラスコ６本にスターターカルチャー中の細菌を８〜１０ｍ１／フラスーの割合で接種した。５００　ｍ　ｌ容フラスコ中でｍ菌をさらに５〜６時間培養した。その時の吸光度は１．　５またはそれ以上であった。培養液を、１０．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離した。

ＮａＣｌ帆５Ｍ５Ｎ　ａ　２ＥＤＴＡ　Ｏ，０１Ｍ。

Ｑ、ＱＩＭ）リス　５０ＭＭ１．１０−フエナスロリン、ＤＨ７，５からなる抽出用溶液２５０　ｍ　ｌに［ｉのベレットを懸濁させた。細胞の超音波処理または破壊は行わなかった。、ｍ胞懸ｍ液を０℃の氷上に６０分間静置した後、４℃ 、　１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、無傷の細胞および細胞破片のほとんどを除去した。上清を集め、４℃、　＋００．　ＯＯＯｒｐｍで６０分間遠心分離した。再度上清を集め、４℃で０゜０１Ｍリン酸緩衝液、　ｐＨ６，０に対して１夜透析した。

試料を４℃、　１０．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分層し、透析の過程で沈殿した不溶性の破片を除去した。

あらかじめ０．ＯＩＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６で平衡させた１０ｍ１＋７）ＣＭセファロースカラムに上清を載せ、０．０１Ｍのリン酸緩衝液でカラムを洗った。０゜０１Ｍリン酸緩衝液中０〜０．５ＭのＫＣＩグラジェントでタンパクをカラムから溶出し、両分を集めてゲル分析に供した。カラム画分についてコマセゲル分析を行い、高分子タンパクを含む両分を同定した。高分子タンパクを含む両分を一緒にし、　１〜３　ｍ　ｌに濃縮して、ゲル濾過カラムに適用する試料を調製した。

セファロースＣＬ−４Ｂゲル濾過カラムは、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７，５で平衡化した。高分子タンパクを含む濃縮試料をゲル濾過カラムに載せ、カラム画分を集めた。カラム画分についてコマセゲル分析を行い、高分子タンパクを含む両分を同定した。高分子タンパクを含むカラム画分を一緒にした。

相同性菌株を用いて実験的に発症させた中耳炎に対するタンパクの防護作用を試験した。

フロイントのアジュバントに乳化させたＩＩ　Ｍ　ＸＶ　ｌ　−ＨＭ　Ｗ　２タンパク混合物４０μｇを、　３力月ごとにチンチラ穫ウサギの皮下に注射した。

最終投与後１力月時に３００ｃ　ｆ　ｕのＮＴＨＩｉ１株１２を鼓室内接種によって惹起処置した。

対照群では５匹中５匹に感染が認められたのに対して、免疫投与動物では１００匹中５で感染が認められた。感染動物間で、惹起処置７日後の中耳液中の幾何のに対して、対照群の動物では７．４ｘｌＱ’個であった。

免疫投与後の血清抗体力価は、非感染動物と感染動物で差がなかった。しかし、免疫動物における感染はＨＭＷシンタンパク現におけるダウンレギュレーション細菌の出現と均一な関連があったことから、免疫学的プレッシャーによってｌ／ａ菌が選抜されたことを暗示している。

このデータは免疫投与後の防御が完全でなかったことを示しているが、ＨＭＷアトへシンタンパクが本質的に重要な防御抗原であり、多成分Ｎ　Ｔ　Ｉ−１１ワクチンのｌ成分になりうろことを暗示している。

実施例７ＨＭＷＩから、多くの合成ペプチドを、１！製した。次に、これらのペプチドに対して抗血清を生成させた。

ペプチドＨＭＷＩ−Ｐ５に対する抗ペプチド抗血漬はＨＭＷＩを識別することが確認された。ペプチドＨＭＷｌ−Ｐ５はＨＭＷＩのアミノ酸＋４５３〜１４８Ｉヲ含ミ、Ｖ　Ｄ　Ｅ　Ｖ　Ｉ　Ｅ　Ａ　Ｋ、　ＲＩ　Ｌ　Ｂ　Ｋ　Ｖ　Ｋ　Ｄ　Ｌ　Ｓ　Ｄ　ＥＥＲＥＡＬＡＫＬＧ　（ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ　：　９）の配列を有し、図１０に示した塩基１４９８〜１５７６に相当する。

この知見は、ＤＮＡ配列および得られたタンパクは読取りフレームで正しく説明されており、この配列から誘導されるペプチドは免疫原性を有する形で生産されることを実証している。

開示の要約本開示を要約すると、本発明はいずれの型にも属さないインフルエンザ閑の高分子量タンパク、前記の高分子量タンパクをコード化した遺伝子およびこのようなタンパクを含むワクチンを提供するものである０本発明の範囲内で改良が可能である。

表１．いずれの型にも属さないインフルエンザ菌によるチャン上皮細胞の付着に対１−る高分子タンパク突然変異の影響付　着　率１菌　株　接種量に対　野生株に対する割合　する割合（％）　（％）　ｍｓ菌株１２の誘導株野生型　８７．７±Ｅ１．９　１００．Ｏｆ　６．７ＨＭＷＩ変異株　６．０± ０．９　６．ｌｌ＋　１．ＯＨＭＷ２変異株　１１９．９±１０．８　１０２．１＋２．３ＨＭＷ１／ＨＭＷ２変異株　２．０±０．３　２−３＋　０．３’閑株５の跣導株野生型　７８．７＋　３．２　１００．０＋　４．ＩＨＭＷＩ変異株　１５．７ ±２．６　１９．９±３．３８ＭＷ２変異株　１０３．７ｆ　１４．０　１３１．７±１７．１に重変異株　３．５±０．６　４．４±ｏ、ｇネ　数値は、代表的な実験の３〜４回反復の平均上標準誤差を表す。

＊零菌株１２誘導株の付着率は菌株１２野生株に対する割合、菌株５誘導株の付着率は菌株５野生株に対する割合表２．　ｈｍｗｌまたはｈ　ｍ　ｗ　２遺伝子クラスターを有する大腸＠　Ｄ　１１５αおよびＨＢ　ｌ　０１による付着手付　着　率インフルエンザ菌株１２＃を菌　株６　に対する比ＤＨ５ａ　（ｐＴ７−７）　０．７＋０．０２ＤＨ５ａ　（ｐＨＭＷｌｌ　４）　１１４．２±１５．９ＤＨ５ａ　（ｏ　ＨＭＷ２−２１）　１４．０：ｔ＝３．７ＨＢ　Ｉ　Ｏ１（ｐＴ　７−７）　１．２＋０．５ＨＢ　Ｉ　０１　（ｐＨＭＷｌ−１４）　９３．６±１５．８夏（Ｂ　Ｉ　０　１　（ｐＨＭＷ２−２　１）　３．６　±　０．９ネブラスミツドｏ　ＨＭ　Ｗ　１−１４はｈｍｗｌ！伝子クラスターを含み、ＤＨＭＷ２−２１はｈ　ｍ　ｗ　２遺伝子クラスターを含む、ｐＴ７−７はこれら構築物に使用したクローニングベクターである。

傘傘数値は代表的な実験からの３反復の平均上標’４！誤差を表す。

Claims

【特許請求の範囲】

１．いずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の高分子量タンパクをコード化した遺伝子であって、単離および精製した遺伝子。
２．いずれの型にも属さないインフルエンザ菌株によって起こる疾病に対して免疫性を有するタンパクＨＭＷ１、ＨＭＷ２、ＨＭＷ３またはＨＭＷ４、前記のタンパクの変異体またはフラグメントをコード化した請求項１に記載の遺伝子。
３．図１に示すＤＮＡ配列を有し、図２に示したアミノ酸配列を有するタンパクＨＭＷ１をコードした請求項２に記載の遺伝子。
４．図３に示すＤＮＡ配列を有し、図４に示したアミノ酸配列を有するタンパクＨＭＷ２をコードした請求項２に記載の遺伝子。
５．図８に示すＤＮＡ配列を有し、図１０に示したアミノ酸配列を有するタンパクＨＭＷ３をコードした請求項２に記載の遺伝子。
６．図９に示すＤＮＡ配列を有し、図１０に示したアミノ酸配列を有するタンパクＨＭＷ４をコードした請求項２に記載の遺伝子。
７．いずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の高分子量タンパクをコード化した構造遺伝子のニュクレオチド配列と、前記の構造遺伝子によって完全にコード化された遺伝子産物を効果的に表現するための副遺伝子の少なくとも１つの下流ニュクレオチド配列とからなる遺伝子クラスターであって、精製および単離された遺伝子クラスター。
８．タンパクＨＭＷ１またはＨＭＷ２、および２つの下流副遺伝子をコード化したＤＮＡ配列からなる請求項７に記載の遺伝子クラスター。
９．図６に示すＤＮＡ配列を有する請求項８に認載の遺伝子クラスター。
１０．図７に示すＤＮＡ配列を有する請求項８に記載の遺伝子クラスター。
１１．請求項１に記載の遺伝子にユード化されているいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の高分子量タンパク、またはいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株によって起こる疾病に対する免疫性を保持しているその変異体またはフラグメント。
１２．図１に示すＤＮＡ配列によってコード化され、図２に示ナアミノ酸配列を有し、見かけ分子量１２５ｋＤａを有するＨＭＷ１である請求項１１に記載のタンパク。
１３．図３に示すＤＮＡ配列によってコード化され、図４に示すアミノ酸配列を有し、見かけ分子量１２０ｋＤａを有するＨＭＷ２である請求項１１に記載のタンパク。
１４．百日咳菌のフィラメント状赤血球凝集素表面タンパクに抗原的に関連したいずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の単離、精製された高分子量タンパク。
１５．ＨＭＷ１、ＨＭＷ２、ＨＭＷ３またはＨＭＷ４である請求項１４に記載のタンパク。
１６．抗原、ヘプテンまたは多糖類にリンクさせ、前記の抗原、ヘプテンまたは多糖類に対する免疫反応を誘導させるための請求項１１または１４に記載のタンパクからなる共役体。
１７．前記の多糖類がインフルエンザ菌ｂ型に対して防御効果を有する多糖類である請求項１６に記載の共役体。
１８．いずれの型にも属さないインフルエンザ菌株の高分子量タンパクの少なくとも１つの防護エピトープに相当するアミノ酸配列を有する合成ペプチド。
１９．前記のタンパクがＨＭＷ１、ＨＭＷ２、ＨＭＷ３またはＨＭＷ４である請求項１８に記載のペプチド。