JPH0751078A - Ｃ−１０またはｃ−１３ヒドロキシル含有タキサンの酵素加水分解製造法、ｃ−１０アシルオキシ含有タキサンの酵素エステル化製造法、並びにｃ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造用途 - Google Patents

Ｃ−１０またはｃ−１３ヒドロキシル含有タキサンの酵素加水分解製造法、ｃ−１０アシルオキシ含有タキサンの酵素エステル化製造法、並びにｃ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造用途

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JPH0751078A JP6130410A JP13041094A JPH0751078A JP H0751078 A JPH0751078 A JP H0751078A JP 6130410 A JP6130410 A JP 6130410A JP 13041094 A JP13041094 A JP 13041094A JP H0751078 A JPH0751078 A JP H0751078A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、Ｃ−１０またはＣ−１３ヒドロキ
シル含有タキサンの製造の酵素加水分解法、およびＣ−
１０アシルオキシ含有タキサンの製造の酵素エステル化
法を提供する。 【構成】 本発明の酵素加水分解法は、１種以上のＣ−
１０またはＣ−１３アシルオキシ含有タキサンを、上記
アシル基をヒドロキシル基に加水分解しうる酵素もしく
は微生物と接触させることから成る。また本発明の酵素
エステル化法は、１種以上のＣ−１０ヒドロキシル含有
タキサンを、アシル化剤および上記ヒドロキシル基をエ
ステル化してアシルオキシ基を形成しうる酵素もしくは
微生物と接触させることから成る。 【効果】 これら本発明方法は特に、タキソルなどのタ
キサンの製造の中間体として使用しうる化合物の製造に
有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ−１０またはＣ−１
３ヒドロキシル含有タキサン(taxane)の酵素加水分解製
造法、Ｃ−１０アシルオキシ含有タキサンの酵素エステ
ル化製造法、並びにＣ−１３アシルオキシ含有タキサン
の製造用途に関する。更に詳しくは、本発明は、Ｃ−１
０ヒドロキシル含有タキサンの製造の酵素加水分解法、
およびＣ−１０アシルオキシ含有タキサンの製造の酵素
エステル化法に関し、これらの化合物はたとえば、タキ
ソル(taxol)およびタキソル類縁体などの薬理学的活性
タキサンの製造の中間体として使用しうる。また本発明
は、Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンの製造の中間体
として有用な、特にタキソルおよびタキソル類縁体の製
造にも有用な、Ｃ−１３ヒドロキシ含有タキサンの製造
の酵素加水分解法にも関係する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】タキサン
は、医薬分野での有用性が認められているジテルペン化
合物である。たとえば、式：
【化７】 (式中、Ｐｈはフェニル、ＡｃはアセチルおよびＢｚは
ベンゾイルである)のタキサン、すなわちタキソルは、
有効な抗癌剤であることが知られている。天然産生タキ
サン、たとえばタキソルは植物中に見つけることがで
き、植物から単離されている。しかしながら、このよう
なタキサンは植物中に比較的少量でしか存在しないた
め、タキソルの場合、たとえば、該化合物源を形成する
生長の遅いイチイの木が多数要求される。従って、この
分野では、タキソルなどの天然産生タキサンの製造、並
びにその類縁体の製造の半合成法を含む合成法の探索が
続けられている。
【０００３】タキサン環構造の複雑さのために、既に基
本タキサン環構造を有する出発物質の使用によって、環
系上に所定の置換基を含有するタキサンをより容易に製
造しうる。すなわち、たとえば、タキサン環構造を有
し、かつＣ−１３にヒドロキシル基を含有し、および特
にＣ−１０に所定の置換基をも含有する化合物を中間体
化合物とカップリング反応させて、Ｃ−１３に所定の側
鎖を有するタキサン、たとえばタキソルあるいはその類
縁体で例示される、Ｃ−１３にアシルオキシ側鎖を有す
る薬理学的活性タキサンを形成することができる。
【０００４】本発明は、Ｃ−１０に所定の置換基を持つ
タキサンを得る方法を提供する。特に本発明は、Ｃ−１
０ヒドロキシル含有およびＣ−１０アシルオキシ含有タ
キサン化合物の製造法を提供し、これらの化合物は、タ
キソルおよびその類縁体などのタキサンの製造の出発物
質としての有用性が認められる。１つの具体例におい
て、本発明は、Ｃ−１０に直接結合したヒドロキシル基
を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であっ
て、Ｃ−１０に直接結合したアシルオキシ基を含有する
少なくとも１種のタキサンを、上記アシルオキシ基のヒ
ドロキシル基への加水分解を触媒しうる酵素もしくは微
生物と接触させて加水分解を行う工程から成ることを特
徴とする製造法を提供する。
【０００５】他の具体例において、本発明は、Ｃ−１０
に直接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１
種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１０に直接結合し
たヒドロキシル基を含有する少なくとも１種のタキサン
を、アシル化剤および上記ヒドロキシル基のアシルオキ
シ基へのエステル化を触媒しうる酵素もしくは微生物と
接触させて加水分解を行う工程から成ることを特徴とす
る製造法を提供する。さらに本発明は、Ｃ−１３ヒドロ
キシル含有タキサン化合物の製造法を提供し、かかる化
合物はＣ−１３に所定の側鎖を有するタキサンの製造の
出発物質としての有用性が認められる。特に本発明は、
Ｃ−１３に直接結合したヒドロキシル基を含有する少な
くとも１種のタキサンの製造法であって、Ｃ−１３に直
接結合したアシルオキシ基を含有する少なくとも１種の
タキサンを、上記アシルオキシ基のヒドロキシル基への
加水分解を触媒しうる酵素もしくは微生物と接触させ加
水分解を行う工程から成ることを特徴とする製造法を提
供する。
【０００６】本発明は、Ｃ−１０アシルオキシ含有タキ
サンからＣ−１０ヒドロキシル含有タキサンへの、また
Ｃ−１０ヒドロキシル含有タキサンからＣ−１０アシル
オキシ含有タキサンへの有効な製造法を提供する。本発
明によれば、単一のタキサンを加水分解するか、あるい
は異種のタキサン混合物を連続的にまたは同時に加水分
解することができ、また同様に、本発明によれば、単一
のタキサンをエステル化するか、あるいは異種のタキサ
ン混合物を連続的にまたは同時にエステル化すすること
ができる。さらに本発明は、Ｃ−１３アシルオキシ含有
タキサンからＣ−１３ヒドロキシル含有タキサンへの有
効な製造法を提供する。本発明によれば、単一のタキサ
ンを加水分解するか、あるいは異種のタキサン混合物を
連続的にまたは同時に加水分解することができる。
【０００７】以下、本発明についてより詳しく説明す
る。Ｃ−１０の加水分解 好ましい具体例において、本発明は、式I：
【化８】 (式中、Ｒ1はヒドロキシルまたはアシルオキシ、特にＲ
1は後記式ＩＩＩの構造を有する；Ｒ2は水素、ヒドロキ
シル、フルオロ、Ｒ5−Ｏ−、キシロシル、Ｒ6−Ｃ(Ｏ)
−Ｏ−またはＲ6−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−;Ｒ3およびＲ4はそ
れぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールま
たはヘテロシクロ;Ｒ5はヒドロキシル保護基;およびＲ6
は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロア
ルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシク
ロである)の少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含
有タキサン(Ｉ)またはその塩の製造法であって、式Ｉ
Ｉ:
【化９】 (式中、Ｒ1,Ｒ2,Ｒ3およびＲ4は前記と同意義；および
Ｒ7はアシルオキシである)の少なくとも１種のＣ−１０
アシルオキシ含有タキサンまたはその塩を、上記Ｒ7ア
シルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒しう
る酵素もしくは微生物と接触させて加水分解を行うこと
を特徴とする製造法を提供する。本発明の加水分解法に
おいて、式ＩおよびＩＩの化合物の明記されていないキ
ラル中心の全ての立体配置は、単独(すなわち、他の立
体異性体が実質的に存在しない)または他の立体異性体
と混合状態のいずれかにあることが意図される。
【０００８】他の好ましい具体例において、本発明は、
望ましくないアシルオキシＣ−１０基を有する少なくと
も１種の第２タキサンから、望ましいＣ−１０アシルオ
キシ基を有する少なくとも１種の第１タキサンの製造法
を提供するものであり、該製造法は、第２タキサンの酵
素加水分解により少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシ
ル含有類縁体を得た後、所望のアシル基をカップリング
反応させて第１タキサンを得ることによる。この具体例
において、本発明は、たとえば、異なるアシルオキシＣ
−１０基を含有する出発タキサン混合物から、特定Ｃ−
１０アシルオキシ基を有する所望タキサンの製造法を提
供し、なお、出発混合物は所望のタキサンを含有しまた
は含有してなくてもよく、該製造法は、異なるＣ−１０
基の同時または連続的加水分解により、Ｃ−１０にヒド
ロキシル基を有する１種以上のタキサンを得た後、所望
のアシル基をカップリング反応させることによる。この
好ましい方法は特に、たとえばタキソルを産出する植物
の抽出により、異なるＣ−１０アシルオキシ基を有する
タキサン混合物を、他の天然産生タキサンと混合して得
る場合、および最終的にタキソルなどの特定タキサンが
望まれる場合に有用である。アシル基のカップリング反
応は、アシル基形成用の非酵素法で行ってもよい。たと
えば、Ｃ−７保護１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ
(たとえば１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩを、ジメ
チルホルムアミド中のトリエチルシリルクロリドおよび
イミダゾールと接触させて形成される、Ｃ−７がトリエ
チルシリルで保護されたもの)を、低温(たとえば−６０
〜＋７０℃)で、塩化リチウム／塩化アセチルと共にリ
チウムヘキサメチルジシラジド／テトラヒドロフランと
接触させることにより、Ｃ−１０をアシル化することが
できる。別法として、アシル基のカップリング反応は、
本明細書に記載の酵素エステル化法で行ってもよい。本
発明の方法において、出発タキサンのＣ−１０アシルオ
キシ基の立体配置は、Ｃ−１０ヒドロキシル基含有生成
物に保留されていることが好ましい。
【０００９】Ｃ−１０のエステル化 他の好ましい具体例において、本発明は、式ＩＩ:
【化１０】 (式中、Ｒ1はヒドロキシルまたはアシルオキシ、特にＲ
1は後記式ＩＩＩの構造を有する;Ｒ2は水素、ヒドロキ
シル、フルオロ、Ｒ5−Ｏ−、キシロシル、Ｒ6−Ｃ(Ｏ)
−Ｏ−またはＲ6−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−;Ｒ3およびＲ4はそ
れぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキ
ニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールま
たはヘテロシクロ;Ｒ5はヒドロキシル保護基;Ｒ6は水
素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキ
ル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクロ;
およびＲ7はアシルオキシである)の少なくとも１種のＣ
−１０アシルオキシ含有タキサン(ＩＩ)、またはその塩
の製造法を提供するものであり、該製造法は、式Ｉ：
【化１１】 （式中、Ｒ1,Ｒ2,Ｒ3およびＲ4は前記と同意義である)
の少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含有タキサン
(Ｉ)またはその塩を、アシル化剤およびＣ−１０ヒドロ
キシル基のエステル化を触媒しうる酵素もしくは微生物
と接触させて上記Ｒ7アシルオキシ基を形成し、該エス
テル化を行う工程から成る。
【００１０】本発明のエステル化法において、式Ｉおよ
びＩＩの化合物の明記されていないキラル中心の全ての
立体配置は、単独(すなわち、他の立体異性体が実質的
に存在しない)または他の立体異性体と混合状態のいず
れかにあることが意図される。 本発明のエステル化を
行う任意のアシル化剤が使用されてよい。好ましいアシ
ル化剤は、式ＩＶ: Ｒ11−Ｃ(Ｏ)−Ｌ (ＩＶ) （式中、Ｒ11はアルキル、アルケニル、アルキニル、ア
リール、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはヘテ
ロシクロ;およびＬはエステル基を形成するため置換し
うる脱離可能基である)の化合物である。式ＩＶの好ま
しいＲ11基は、Ｃ1〜6アルキル基などのアルキル基、特
にメチルである。Ｌ基の具体例としては、ハロゲン原
子、ヒドロキシル、アルコキシまたはアルケニルオキシ
基が包含される。好ましいＬ基はアルケニルオキシ基
で、最も好ましくは、ＣＨ2＝ＣＨ−Ｏ−やＣＨ2＝Ｃ
(ＣＨ3)−Ｏ−などのＣ1-6アルケニルオキシである。酢
酸イソプロペニルおよび酢酸ビニルが特に好ましいアシ
ル化剤である。本発明の方法において、出発タキサンの
Ｃ−１０ヒドロキシル基の立体配置は、Ｃ−１０アシル
オキシ基含有生成物に保留されていることが好ましい。
【００１１】Ｃ−１３の加水分解 好ましい具体例において、本発明は、式Ｖ:
【化１２】 （式中、Ｒ12は水素、ヒドロキシル、Ｒ5−Ｏ−、Ｒ6−
Ｃ(Ｏ)−Ｏ−、またはＲ6−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−;Ｒ2は水
素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ5−Ｏ−、キシロシ
ル、Ｒ6−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−、またはＲ6−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ
−;Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素、アルキ
ル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロ
アルケニル、アリールまたはヘテロシクロ;Ｒ5はヒドロ
キシル保護基;およびＲ6は水素、アルキル、アルケニ
ル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、
アリールまたはヘテロシクロである)の少なくとも１種
のＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン(Ｖ)またはその塩
の製造法を提供するものであり、該製造法は、式ＶＩ：
【化１３】 （式中、Ｒ12,Ｒ2,Ｒ3およびＲ4は前記と同意義;および
Ｒ7はアシルオキシである)の少なくとも１種のＣ−１３
アシルオキシ含有タキサン(ＶＩ)またはその塩を、上記
Ｒ7アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触
媒しうる酵素もしくは微生物と接触させて加水分解を行
う工程から成る。本発明の方法において、式Ｖおよび式
ＶＩの化合物の明記されていないキラル中心の全ての立
体配置は、単独(すなわち、他の立体異性体が実質的に
存在しない)または他の立体異性体と混合状態のいずれ
かにあることが意図される。
【００１２】他の好ましい具体例において、本発明は、
望ましくないアシルオキシＣ−１３側鎖を有する少なく
とも１種の第２タキサンから、望ましいＣ−１３アシル
オキシ側鎖を有する少なくとも１種の第１タキサンの製
造法を提供するものであり、該製造法は、第２タキサン
の酵素加水分解により少なくとも１種のＣ−１３ヒドロ
キシル含有類縁体を得た後、所望の側鎖をカップリング
反応させて第１タキサンを得ることによる。この具体例
において、本発明は、たとえば、異なるアシルオキシＣ
−１３側鎖を有する出発タキサン混合物から、特定Ｃ−
１３アシルオキシ側鎖を有する所望タキサンの製造法を
提供し、なお、出発混合物は所望のタキサンを含有しま
たは含有してなくてもよく、該製造法は、異なるＣ−１
３基の同時または連続的加水分解により、Ｃ−１３にヒ
ドロキシル基を有する１種以上のタキサンを得た後、所
望の側鎖をカップリング反応させることによる。この好
ましい方法は特に、たとえばタキソルを産生する植物の
抽出により、異なるＣ−１３アシルオキシ側鎖を有する
タキサン混合物を、セファロマニン(cephalomannine)お
よび他の天然産生タキサンと混合して得る場合、および
最終的にタキソルなどの特定タキサンが望まれる場合に
有用である。本発明の方法において、出発タキサンのＣ
−１３アシルオキシ基の立体配置は、Ｃ−１３ヒドロキ
シル基含有生成物に保留されていることが好ましい。
【００１３】定義 本明細書において、単独または他の基の一部として用い
る各種語句の定義は、以下の通りである。「酵素法」と
は、酵素もしくは微生物を用いる本発明の方法を意味す
る。「加水分解」とは、アシルオキシ基からヒドロキシ基
への形成を意味し、たとえば本発明の方法に従って、水
および／または適当な有機アルコールとの接触によって
行うことができる。「エステル化」とは、ヒドロキシル基
からアシルオキシ基への形成を意味する。「アシル化剤」
とは、アシル基の付与によって上記エステル化を行うこ
とができる化合物を意味する。本発明方法における「酵
素もしくは微生物」の使用には、２種以上の、並びに単
一の酵素もしくは微生物の使用が含まれる。
【００１４】「アルキル」または[alk]とは、好ましくは
ノルマル鎖に１〜１２個の炭素を有する、任意に置換さ
れた直鎖および分枝鎖飽和炭化水素基を意味する。非置
換のアルキル基としては、たとえば、メチル、エチル、
プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、イソ
ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチ
ル、４,４−ジメチルペンチル、オクチル、２,２,４−
トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ド
デシル等が挙げられる。置換基の具体例としては、ハ
ロ、アルコキシ、アルキルチオ、アルケニル、アルキニ
ル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヒ
ドロキシもしくは保護ヒドロキシ、カルボキシル(−Ｃ
ＯＯＨ)、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボ
ニルオキシ、カルバモイル(ＮＨ2−ＣＯ−)、アミノ(−
ＮＨ2)、モノもしくはジアルキルアミノ、およびチオー
ル(−ＳＨ)の群からの１個以上が含まれてよい。
【００１５】「低級alk」または「低級アルキル」とは、上
述のノルマル鎖の炭素数１〜４の、任意に置換されたア
ルキル基を意味する。「アルコキシ」または「アルキルチ
オ」とは、上述のアルキル基がそれぞれ酸素(−Ｏ−)ま
たは硫黄(−Ｓ−)に結合したものを意味する。「アルキ
ルオキシカルボニル」とは、アルコキシ基がカルボニル
基に結合したものを意味する。「アルキルカルボニルオ
キシ」とは、アルキル基がカルボニル基に結合し、次い
で酸素に結合したものを意味する。「モノアルキルアミ
ノ」または「ジアルキルアミノ」とは、それぞれ１または
２個の上記アルキル基で置換されたアミノ基を意味す
る。
【００１６】「アルケニル」とは、上述のアルキルの場合
に定義した任意に置換された基で、少なくとも１つの炭
素−炭素二重結合を有するものを意味する。置換基の具
体例としては、上述の１個以上のアルキル基、および／
またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれ
る。「アルケニルオキシ」とは、上記アルケニル基が酸素
(−Ｏ−)に結合したものを意味する。「アルキニル」と
は、上述のアルキルの場合に定義した任意に置換された
基で、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有するも
のを意味する。置換基の具体例としては、上述の１個以
上のアルキル基、および／またはアルキル置換基として
１個以上の上記基が含まれる。「アルキニルオキシ」と
は、上記アルキニル基が酸素(−Ｏ−)に結合したものを
意味する。
【００１７】「シクロアルキル」とは、好ましくは１〜３
つの環および環１つ当り３〜７個の炭素を有する、任意
に置換された飽和炭素環式環基を意味する。非置換のシ
クロアルキル基としては、たとえばシクロプロピル、シ
クロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロ
ヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデ
シル、およびアダマンチルが挙げられる。置換基の具体
例としては、上述の１個以上のアルキル基、および／ま
たはアルキル置換基として１個以上の上記基が含まれ
る。「シクロアルキルオキシ」とは、上記シクロアルキル
基が酸素(−Ｏ−)に結合したものを意味する。
【００１８】「シクロアルケニル」とは、上述のシクロア
ルキルの場合に定義した任意に置換された基で、部分的
に不飽和の環を構成する少なくとも１つの炭素−炭素二
重結合を有するものを意味する。置換基の具体例として
は、上述の１個以上のアルキル基、および／またはアル
キル置換基として１個以上の上記基が含まれる。「シク
ロアルケニルオキシ」とは、上記シクロアルケニル基が
酸素(−Ｏ−)に結合したものを意味する。
【００１９】「ar」または「アリール」とは、好ましくは１
または２つの環および６〜１２個の環炭素を有する、任
意に置換された炭素環式芳香族基を意味する。非置換の
アリール基としては、たとえば、フェニル、ビフェニル
およびナフチルが挙げられる。置換基の具体例として
は、１個以上、好ましくは３個以下のニトロ基、上述の
アルキル基および／またはアルキル置換基として上記基
が含まれる。「アリールオキシ」とは、上記アリール基が
酸素(−Ｏ−)に結合したものを意味する。
【００２０】「ヘテロシクロ」または「複素環式基」とは、
少なくとも１つの環に少なくとも１個のヘテロ原子を有
する、任意に置換された完全飽和または不飽和の芳香族
または非芳香族環式基、好ましくは各環に５または６個
の原子を有するモノ環式またはジ環式基を意味する。ヘ
テロシクロ基は、たとえば環中に１または２個の酸素原
子、１または２個の硫黄原子、および／または１〜４個
の窒素原子を有してよい。各ヘテロシクロ基は、環系の
炭素またはヘテロ原子のいずれかを介して結合しうる。
ヘテロシクロ基の具体例としては、チエニル、フリル、
ピロリル、ピリジル、イミダゾリル、ピロリジニル、ピ
ペリジニル、アゼピニル、インドリル、イソインドリ
ル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチアゾリル、
ベンゾキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾキサジ
アゾリル、およびベンゾフラザニルが挙げられる。置換
基の具体例としては、上述の１個以上のアルキル基およ
び／またはアルキル置換基として１個以上の上記基が含
まれる。「ヘテロシクロオキシ」とは、上記ヘテロシクロ
基が酸素(−Ｏ−)に結合したものを意味する。「ハロゲ
ン」または「ハロ」とは、塩素、臭素、フッ素および沃素
を意味する。
【００２１】「タキサン」とは、下記タキサン成分を含有
する化合物を意味する。「タキサン成分」とは、式:
【化１４】 の骨格構造(本明細書で用いる環系位置を数字で表示)を
有する成分を意味し、該骨格構造は置換されていてもよ
く、またその環系にエチレン性不飽和結合を含有してい
てもよい。たとえばタキソルに見られるように、４位お
よび５位にオキセタンが縮合した成分が好ましい。
【００２２】「ヒドロキシ(またはヒドロキシル)保護基」
とは、遊離のヒドロキシル基を保護することができ、か
つその保護反応の後で、分子残基を妨害せずに脱離しう
る基を意味する。かかる基、およびその合成は、Ｔ．
Ｗ．グリーンの“有機合成における保護基"(ジョン・ワ
イレイ・アンド・サンズ、１９８１年)、またはフィザ
ー・アンド・フィザーに記載されている。「塩」として
は、無機および／または有機酸および塩基によって形成
される酸性および／または塩基性塩が包含される。「ア
シル」とは、有機カルボン酸の−ＣＯＯＨ基からヒドロ
キシル基を除去して形成される成分を意味する。「アシ
ルオキシ」とは、上記アシル基が酸素(−Ｏ−)に結合し
たものを意味する。
【００２３】Ｃ−１０変性用の出発物質 本発明の出発物質として用いる、Ｃ−１０アシルオキシ
含有、およびＣ−１０ヒドロキシ含有タキサンは、それ
ぞれ本発明の酵素加水分解法またはエステル化法を受け
ることができる化合物であってよい。出発物質として、
合成形成タキサン、あるいは好ましくは天然形成タキサ
ン、たとえばセファロマニン、７−キシロシルタキソ
ル、タキソル、バッカチンＩＩＩ、脱アセチルバッカチ
ンＩＩＩ、またはタキソルＣ(Ｃ−１３タキソル側鎖の
ベンゾイル基がn−ペンタノイル基で置換されたタキソ
ル類縁体)が挙げられ、これらの１種または混合物が使
用されてよい。“天然形成"タキサン出発物質は好まし
くは、タキサン産生植物組織、特にタキサス(Ｔaxus)属
の植物、たとえばタキサス・バッカタ(Ｔaxus baccat
a)、タキサス・カスビダタ(Ｔaxus cuspidata)、タキサ
ス・ブレビホリア(Ｔaxusbrevifolia)、タキサス・ウオ
リチアナ(Ｔaxus wallichiana)、タキサス・メディア
(Ｔaxus media)、タキサス・ヒックジィ(Ｔaxus hicks
ii)、特にタキサスx．メディア・ヒックジィの組織また
は誘導組織の植物細胞培養および／または抽出によって
得られる。植物組織の具体例としては、針状葉、樹皮お
よび全実生が含まれる。本発明方法のＣ−１０ヒドロキ
シおよびアシルオキシ含有タキサン出発物質を得る好ま
しい方法については、ラオの「Ｐharmaceutical Ｒesear
ch」(１０、５２１〜５２４頁、１９９３年);キングスト
ンの「Ｐharmac. Ｔher.」(５２、１〜３４頁、１９９１
年);またはこれらの実例を参照。
【００２４】Ｃ−１３変性用の出発物質 本発明の出発物質として用いるＣ−１３アシルオキシ含
有タキサンは、本発明の酵素加水分解を受けることがで
きる化合物であってよい。出発物質として、合成形成タ
キサン、あるいは好ましくは天然形成タキサン、たとえ
ばセファロマニン、７−キシロシルタキソル、タキソ
ル、７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソル、１０
−脱アセチルタキソル、またはタキソルＣが挙げられ、
これらの１種または混合物が使用されてよい。“天然形
成"タキサン出発物質は好ましくは、タキサン産生植物
組織、特にＴaxus属の植物、たとえばＴaxus baccata、
Ｔaxus cuspidata、Ｔaxus brevifolia、Ｔaxus wallic
hiana、Ｔaxus media、Ｔaxus hicksii、特にＴaxus
x．media hicksiiの組織または誘導組織の植物細胞培
養および／または抽出によって得られる。植物組織の具
体例としては、針状葉、樹皮および全実生が含まれる。
本発明方法のＣ−１３アシルオキシ含有タキサン出発物
質を得る好ましい方法については、ラオの「Ｐharmaceut
ical Ｒesearch」(１０、５２１〜５２４頁、１９９３
年);キングストンの「Ｐharmac. Ｔher.」(５２、１〜３
４頁、１９９１年);またはこれらの実例を参照。
【００２５】Ｃ−１０変性用の酵素および微生物 本発明で用いる酵素もしくは微生物は、本明細書に記載
の酵素加水分解法またはエステル化法を触媒しうる酵素
もしくは微生物であってよい。酵素もしくは微生物物質
は、起源または純度にかかわらず、自由状態、またはた
とえば物理的吸着または閉じ込めによる支持体への固定
状態で使用しうる。微生物の具体例としては、ノカルジ
オイデス(Ｎocardioides)、ノカルジア(Ｎocardia)、ロ
ードコッカス(Ｒhodococcus)、ミクロポリスポラ(Ｍicr
opolyspora)、サッカロポリスポラ(Ｓaccharopolyspor
a)、プソイドノカルジア(Ｐseudonocardia)、エルスコ
ビア(Ｏerskovia)、プロミクロモノスポラ(Ｐromicromo
nospora)およびイントラスポランジウム(Ｉntrasporang
ium)属に属する微生物が挙げられる。特に好ましい微生
物は、ノカルジオイデス属に属する微生物、たとえば、
ノカルジオイデス・アルブス(albus)、ノカルジオイデ
ス・フラブス(flavus)、ノカルジオイデス・・フルブス
(fluvus)、ノカルジオイデス・ルテウス(luteus)、ノカ
ルジオイデス・シンプレックス(simplex)およびノカル
ジオイデス・サーモリラシナス(thermolilacinus)、特
にノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４(Ｓ
Ｃ１３９１０)、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ
５５４２５(ＳＣ１３９１１)およびノカルジオイデス・
ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)である。
本明細書で用いる「ＡＴＣＣ」とは、言及する微生物の寄
託所である、メリーランド州２０８５２、ロックビル、
パークラウン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション(Ａmerican Ｔype Ｃult
ure Ｃollection)の受入番号を指称する。上記微生物Ａ
ＴＣＣ５５４２４、５５４２５および５５４２６は１９
９３年５月１２日に寄託されている。「ＳＣ」とは、スク
イブ・カルチャー・コレクション(Ｓquibb culture col
lection)の一員として微生物に付与される呼称を意味す
る。
【００２６】生物学的に純粋な微生物のノカルジオイデ
ス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４(SC13910)、ノカルジ
オイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１
１)およびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４
２６(ＳＣ１３９１２)は、新規な微生物である。また本
発明によれば、これら微生物のミュータントも、本明細
書に記載の加水分解法またはエステル化法での使用、た
とえば化学的手段、物理的手段(たとえばＸ線)または生
物学的手段(たとえば分子生物学法による)による変性し
たものの使用が意図されていることを理解すべきであ
る。
【００２７】ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５
４２４(ＳＣ１３９１０)およびＡＴＣＣ５５４２５(Ｓ
Ｃ１３９１１)は、培地Ａ９４[コーン浸漬リカー(corn
steepliquor)(３５ｇ)、セレロース(２０ｇ)、(ＮＨ4)2
ＳＯ4試薬級(５ｇ)、ＣaＣＯ3(３.５ｇ)、大豆油(５ｍ
ｌ)および蒸留水(１ｌ)]で培養されてよい。これらの微
生物は、土壌(ニューブランズウイック州、ニュージャ
ージー州の試料より)から単離されたもので、かつ種々
の培地において好気性生長を示すグラム陽性の不動生物
である。固形ＹＳ培地(酵母エキス０.２％、スターチ１
％)において、菌糸体は白味乃至明クリーム色を呈す
る。生長は両固形および液体媒地において、暗拡散性色
素の生成に関係する。微視的に、液体培養での生長は、
多量分枝菌糸からなる菌糸集合体によって特徴づけられ
る。
【００２８】ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５
４２６(ＳＣ１３９１２)は、培地Ａ９４[コーン浸漬リ
カー(３５ｇ)、セレロース(２０ｇ)、(ＮＨ4)2ＳＯ4試
薬級(５ｇ)、ＣaＣＯ3(３.５ｇ)、大豆油(５ｍｌ)およ
び蒸留水(１ｌ)]で培養されてよい。この微生物は、土
壌(ニューブランズウイック州、ニュージャージー州の
試料より)から単離されたもので、かつ種々の培地にお
いて好気性生長を示すグラム陽性の不動生物である。固
形ＹＳ培地(酵母エキス０.２％、スターチ１％)におい
て、菌糸体は暗クリーム色を呈する。微視的に、液体培
養での生長は、多量分枝菌糸からなる菌糸集合体によっ
て特徴づけられる。上記微生物のノカルジオイデス・ア
ルブスＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)およびＡＴ
ＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)、およびノカルジオイ
デス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)
は、「Ｂergeys' Ｍanual of Ｓystematic Ｂacteriolog
y」(Ｖol.２、Ｐ．Ｈ．Ａ．スニース著、１９８６年)の
記載に従って、ノカルジオイデス・アルブスおよびノカ
ルジオイデス・ルテウスの菌株として同定される。
【００２９】本発明の加水分解またはエステル化法で用
いる酵素の具体例は、加水分解酵素、特にエステラー
ゼ、プロテアーゼまたはリパーゼである。好ましい酵素
としては、微生物、特に上述の微生物から誘導されるも
のが包含される。これらの酵素は、たとえば疎水性相互
作用クロマトグラフィー、ゲル濾過、次いでアニオン交
換カラムの使用といった抽出および精製法によって単離
することができる。本発明はさらに、当該加水分解法ま
たはエステル化法を行うことができ、かつたとえば上述
の方法によって、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ
５５４２４(ＳＣ１３９１０)およびＡＴＣＣ５５４２５
(ＳＣ１３９１１)、およびノカルジオイデス・ルテウス
ＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)から単離しうる酵
素を提供するものである。
【００３０】Ｃ−１３変性用の酵素および微生物 本発明で用いる酵素もしくは微生物は、本明細書記載の
酵素加水分解を触媒しうる酵素もしくは微生物であって
よい。酵素もしくは微生物物質は、起源または純度にか
かわらず、自由状態、またはたとえば物理的吸着または
閉じ込めによる支持体への固定状態で使用しうる。
【００３１】本発明方法による、出発Ｃ−１３アシルオ
キシ含有タキサンの酵素加水分解に好適な微生物を選択
する好ましい方法は、新規なスクリーニング法の使用に
よるもので、該スクリーニング法は、 (a)固形の生長培地として、(i)スクリーニングされる微
生物が生長し、(ii)出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキ
サンを混和すると、溶解しないため濁り外観を呈し、お
よび(iii)本発明加水分解法のＣ−１３ヒドロキシル含
有タキサン生成物および必要に応じて開裂Ｃ−１３側鎖
生成物を混和すると、溶解するため透明外観を呈する生
長培地を選択し、 (b)上記工程(a)で選択した、たとえばペトリ皿内の生長
培地に予め出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサンを混
和しておき、かつ微生物の生長を発生せしめる条件下
で、該生長培地に上記微生物を入れて接触せしめ、次い
で (c)上記微生物による加水分解が可能であることを示す
透明ゾーンが、微生物の生長が起こる領域付近で出現す
るかどうかを観察する 工程から成る。
【００３２】透明ゾーンの形成は、加水分解が起こった
こと、すなわち、微生物が本発明加水分解法での使用に
好適となりうることを示す。本明細書で用いる語句「透
明」および「濁り」とは、互いに相対的なものとして解釈
すべきである。従って、出発Ｃ−１３アシルオキシ含有
タキサンを、懸濁状態で見ることができるよう十分な量
で、生長培地と混和して使用し(この場合、“濁り"外観
を呈する)、そして透明度は、懸濁状態の可視性の初期
程度に相対させて、すなわち、初期可視性の低下度とし
て判定する。
【００３３】本発明によって提供される他の好ましいス
クリーニング法は、以下の点を除いて上記方法に相当す
る。すなわち、選択される固形の生長培地では、出発Ｃ
−１３アシルオキシ含有タキサンを混和すると、溶解す
るため透明外観を呈し、一方、本発明の加水分解法のＣ
−１３ヒドロキシル含有タキサン生成物を混和すると、
溶解しないため(および必要に応じて好ましくは開裂Ｃ
−１３側鎖も溶解しないため)、濁り外観を呈する。微
生物の生長が起る領域付近での濁りゾーンの観察は適当
な微生物の選定を可能ならしめる。
【００３４】本発明のスクリーニング法の特に好ましい
具体例は、後記実施例に記載する。かかる好ましいスク
リーニング法は、出発Ｃ−１３アシルオキシ含有タキサ
ンとＣ−１３ヒドロキシル含有タキサン生成物におい
て、本発明による加水分解が起こったか否かを観察しう
る限界まで、その相対的溶解性が異なる場合に好適に使
用することができる。Ｃ−１３加水分解で用いる微生物
の具体例としては、ノカルジオイデス(Ｎocardioide
s)、ノカルジア(Ｎocardia)、ロードコッカス(Ｒhodoco
ccus)、ミクロポリスポラ(Ｍicropolyspora)、サッカロ
ポリスポラ(Ｓaccharopolyspora)、プソイドノカルジア
(Ｐseudonocardia)、エルスコビア(Ｏerskovia)、プロ
ミクロモノスポラ(Ｐromicromonospora)およびイントラ
スポランジウム(Ｉntrasporangium)属に属する微生物が
挙げられる。特に好ましい微生物は、ノカルジオイデス
属に属する微生物、たとえば、ノカルジオイデス・アル
ブス(albus)、ノカルジオイデス・フラブス(flavus)、
ノカルジオイデス・フルブス(fluvus)、ノカルジオイデ
ス・ルテウス(luteus)、ノカルジオイデス・シンプレッ
クス(simplex)およびノカルジオイデス・サーモリラシ
ナス(thermolilacinus)、特にノカルジオイデス・アル
ブスＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)およびＡＴＣ
Ｃ５５４２５(ＳＣ１３９１１)、およびノカルジオイデ
ス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)であ
る。
【００３５】上述の如く、生物学的に純粋な微生物のノ
カルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１
３９１０)、ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ５５
４２５(ＳＣ１３９１１)およびノカルジオイデス・ルテ
ウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)は、さらに本
発明によって提供される新規な微生物である。また本発
明によれば、これら微生物のミュータントも、本明細書
記載の加水分解法での使用、たとえば化学的手段、物理
的手段(たとえばＸ線)または生物学的手段(たとえば分
子生物学法による)による変性したものの使用が意図さ
れていることを理解すべきである。本発明方法で用いる
酵素の具体例は、加水分解酵素である。好ましい酵素と
しては、微生物、特に上述の微生物から誘導されるもの
が包含される。これらの酵素は、たとえば後記実施例に
記載されるような抽出および精製法により単離、特にこ
れらの微生物が培養されている培地において、たとえば
アニオン交換カラム、次いで疎水性相互作用クロマトグ
ラフィーおよびゲル濾過の使用による、細胞外に見られ
る活性画分の精製により単離することができる。本発明
はさらに、当該加水分解法を行うことができ、かつたと
えば上述の方法によって、ノカルジオイデス・アルブス
ＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)およびＡＴＣＣ５
５４２５(ＳＣ１３９１１)、およびノカルジオイデス・
ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ１３９１２)から単離
しうる酵素を提供するものである。
【００３６】Ｃ−１０およびＣ−１３変性における酵素
および微生物の使用 微生物を用いる場合、細胞は、元のままの湿潤細胞ある
いは凍結乾燥、噴霧乾燥もしくは加熱乾燥細胞などの乾
燥細胞の状態で、または破壊細胞もしくは細胞抽出物な
どの処理細胞物質の形状で使用されてよい。また遺伝学
的設計微生物の使用も意図されている。宿主細胞はいず
れの細胞であってもよく、たとえば上述の触媒作用を行
うことができる１種以上の酵素を発現する１または複数
の遺伝子を含有するよう変性された、エシェリキア・コ
リ(Ｅscherichia coli)が挙げられる。１種以上の微生
物を用いる場合、本発明の酵素加水分解法またはエステ
ル化法は、微生物の発酵の後に(発酵および加水分解ま
たはエステル化の２段階で)またはそれと同時に行って
よく、すなわち、後者の場合、発酵と加水分解またはエ
ステル化をその場で(発酵と加水分解またはエステル化
を１段階で)行うことができる。
【００３７】微生物の生長は、適当な培地の使用により
通常の技術によって達成しうる。生長する微生物の適当
な培地としては、微生物細胞の生長に必要な栄養素を付
与するものが含まれる。生長用培地はたとえば、必要な
炭素源、窒素源、および要素(たとえば痕跡量)を包含す
る。また誘導物質を加えてもよい。本明細書で用いる語
句「誘導物質」としては、微生物細胞内で所望の酵素活性
の形成を増大する化合物が含まれる。
【００３８】炭素源としては、シュガー類、たとえばマ
ルトース、ラクトース、グルコース、フラクトーズ、グ
リセロール、ソルビトール、スクロース、スターチ、マ
ンニトール、プロピレングリコール等;有機酸類、たと
えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等;およびア
ルコール類、たとえばエタノール、プロパノール等が包
含される。窒素源としては、Ｎ−ＺアミンＡ、コーン浸
漬リカー、大豆ミール、ビーフエキス、酵母エキス、糖
蜜、ベーカー酵母、トリプトン、ヌトリゾイ(nutriso
y)、ペプトン、イースタミン(yeastamin)、アミノ酸類
(たとえばグルタミン酸ナトリウム等)、硝酸ナトリウ
ム、硫酸アンモニウム等が包含される。痕跡要素として
は、マグネシウム、マンガン、カルシウム、コバルト、
ニッケル、鉄、ナトリウムおよびカリウム塩が包含され
る。またホスフェート類を痕跡量または好ましくはそれ
以上の量で添加してもよい。
【００３９】使用する培地に、１種以上の炭素もしくは
窒素源または他の栄養素を含ませてよい。生長用の好ま
しい培地としては、水性培地、特に後記実施例に記載の
ものが包含される。反応混合物の撹拌およびエアレーシ
ョンは、加水分解またはエステル化工程を、たとえば微
生物の生長段階でのフラスコ振盪培養または発酵タンク
で行うとき、その工程中の有効な酸素の量に影響を及ぼ
す。撹拌の回転数は１００〜２５０ＲＰＭが好ましく、
また１分当り１〜１０容量部の空気／培地１容量のエア
レーションが好ましい。
【００４０】微生物の生長および／または本発明に係る
加水分解またはエステル化の場合、培地のpＨは約６〜
８.５が好ましく、また温度は約２４〜３７℃が好まし
い。加水分解またはエステル化はたとえば、１〜４８時
間といった期間にわたりインビトロで行うか、あるいは
好ましくは所望生成物の収量が最大になるまで行うこと
ができる。本発明の加水分解法は、６〜８のpＨで、特
に非塩基性条件下で行うことが好ましい。また加水分解
反応培地として水性液体の使用が好ましいが、有機液
体、または相溶性もしくは非相溶(二相)有機液体／水性
液体混合物も使用しうる。エステル化の場合、有機溶媒
または二相有機／水性反応培地の使用が好ましいが、他
の培地を使用してもよい。
【００４１】Ｃ−１０変性の場合、出発物質(Ｃ−１０
ヒドロキシまたはアシルオキシ含有タキサン)とエステ
ル化または加水分解反応培地の合計重量に対し、０.０
２５〜２.５重量％の出発物質を用いることが好まし
い。本発明のエステル化法において、アシル化剤とＣ−
１０ヒドロキシル含有タキサンの好ましいモル比は、約
１:１〜１０００:１である。出発物質に対して使用する
酵素もしくは微生物の量は、本発明の酵素加水分解また
はエステル化の触媒作用を可能ならしめるように選定す
る。本発明の加水分解法またはエステル化法を採用する
とき、それぞれ９０％(出発アシルオキシ含有タキサン
に対して得られるＣ−１０加水分解生成物の％)以上の
収率、または５０％(出発ヒドロキシル含有タキサンに
対して得られるＣ−１０アシル化生成物の％)以上の収
率を得ることが好ましい。加水分解またはエステル化
は、出発タキサンのＣ−１０で選択的に行うことができ
る。すなわち、その大部分が(たとえば単独で)Ｃ−１０
のみ加水分解またはエステル化されている生成物を、他
の位置での加水分解またはエステル化を伴なわずに得る
ことができる。
【００４２】Ｃ−１３変性の場合、出発物質(Ｃ−１３
アシルオキシ含有タキサン)と加水分解反応培地の合計
重量に対し、０.０２５〜０.２５重量％の出発物質を用
いることが好ましい。出発物質に対して使用する酵素も
しくは微生物の量は、本発明の酵素加水分解の触媒作用
を可能ならしめるように選定する。本発明の加水分解法
を採用するとき、９０％(出発アシルオキシタキサンに
対して得られるＣ−１３加水分解生成物の％)以上の収
率を得ることが好ましい。すなわち、その大部分が(た
とえば単独で)Ｃ−１３のみ加水分解されている生成物
を、他の位置での加水分解を伴なわずに得ることができ
る。
【００４３】分離 本発明方法のＣ−１０アシルオキシまたはヒドロキシル
含有生成物、および以下に記載の如きカップリング反応
生成物(coupled products)は、たとえば抽出、蒸留、結
晶化、およびカラムクロマトグラフィーなどの方法によ
って、単離および精製することができる。同様に、本発
明のＣ−１３加水分解法のＣ−１３ヒドロキシル含有生
成物、および以下に記載の如きカップリング反応生成物
も、たとえば抽出、蒸留、結晶化、およびカラムクロマ
トグラフィーなどの方法によって、単離および精製する
ことができる。
【００４４】実用性 タキサンは、上述のタキサン成分を含有するジテルペン
化合物である。特に興味のあるタキサンは、１１,１２
−位がエチレン性結合を介して結合し、かつ１３−位が
側鎖を有するタキサン成分を含有するタキサンであっ
て、かかるタキサンはタキソルで例示される。薬理学的
活性なタキサン、たとえばタキソルは、乳癌、卵巣癌、
結腸癌または肺癌などの癌、黒色腫および白血病に苦し
む患者を治療する抗腫瘍剤として使用しうる。
【００４５】Ｃ−１０変性によって得られる化合物 本発明のＣ−１０加水分解法またはエステル化法によっ
て得られる化合物は特に、Ｃ−１０に所望の置換基を有
する化合物の製造を可能ならしめることにより、上述の
薬理学的活性タキサンの製造の中間体として有用であ
る。従って、たとえば、本発明方法に従いＣ−１０変性
によって製造される化合物がまたＣ−１３にヒドロキシ
ル基を有する場合、該化合物をＣ−１３アシルオキシ側
鎖形成中間体化合物、たとえばβ−ラクタムとカップリ
ング反応させて、タキソルまたはその類縁体などのＣ−
１３アシルオキシ側鎖含有タキサンを得ることができ
る。この点について、Ｃ−１０の変性のための本発明方
法を採用する前に、あるいはその途中に、あるいはその
後に、本発明方法に係るＣ−１３の変性を行うことがで
きる。
【００４６】本発明方法に従って製造されるアシルオキ
シまたはヒドロキシル含有化合物は、必要に応じて、Ｃ
−１３アシルオキシ側鎖カップリング反応に使用する前
に変性してもよい。たとえば、Ｃ−１３以外の位置の１
個以上のヒドロキシル基を、カップリング反応の前に保
護し、後に脱保護することができる。本発明の加水分解
法およびエステル化法によって得られ、上記の如く任意
に変性したＣ−１０アシルオキシおよびヒドロキシル含
有タキサンは、たとえば、列挙したものなどのＣ−１３
アシルオキシ側鎖含有タキサンの製造に使用されてよ
く、またヨーロッパ特許公開Ｎｏ.４００９７１、Ｕ.
Ｓ.特許Ｎ４８７６３９９、Ｕ.Ｓ.特許Ｎｏ.４８５７６
５３、Ｕ.Ｓ.特許Ｎｏ.４８１４４７０、Ｕ.Ｓ.特Ｎｏ.
４９２４０１２、Ｕ.Ｓ.特許Ｎｏ.４９２４０１１、お
よびキングストンの「Ｐharm. Ｔher.」、(Ｖol.５２、１
〜３４頁、１９９１年)、特にポスらのＵ.Ｓ.特許出願
Ｎｏ.０７／９９５４４３(１９９２年１２月２３日出
願)(代理人ドケットＮｏ.ＬＤ６０)およびソッタシル
(Ｔhottathil)らのＵ.Ｓ.特許出願Ｎｏ.０８／０３３５
９８(１９９３年３月１９日出願)(代理人ドケットＮｏ.
ＬＤ５７)に記載の方法で製造しうる。
【００４７】Ｃ−１３変性によって得られる化合物 本発明の加水分解法によって得られるＣ−１３ヒドロキ
シル含有化合物は特に、上記Ｃ−１３側鎖含有タキサン
の製造の中間体として有用である。特に、当該方法に従
って製造されるＣ−１３ヒドロキシル含有化合物は、側
鎖形成中間体化合物、たとえばβ−ラクタムとカップリ
ング反応させて、Ｃ−１３側鎖含有タキサンを得ること
ができる。かかる側鎖の付加は本質的に、タキサン生成
物に対し増大もしくはより望ましい薬理学的活性を付与
し、あるいは出発化合物に比べて、増大もしくはより望
ましい薬理学的活性を有するタキサンへより容易に変換
されるタキサン生成物を形成しうる。
【００４８】本発明方法に従って製造されるＣ−１３ヒ
ドロキシル含有化合物は任意に、カップリング反応によ
る側鎖形成での使用前に変性することができる。たとえ
ば、本発明方法に係るＣ−１０の変性は、本発明のＣ−
１３加水分解法の前、その途中または後に行うことがで
き、および／またはＣ−１３以外の位置の１個以上のヒ
ドロキシル基をカップリング反応の前に保護し、後に脱
保護してもよい。本発明の加水分解法によって得られ、
上記の如く任意に変性したＣ−１３ヒドロキシル含有タ
キサンは、たとえば、列挙したものなどのＣ−１３アシ
ルオキシ側鎖含有タキサンの製造に使用されてよく、ま
たヨーロッパ特許公開Ｎｏ.４００９７１、Ｕ.Ｓ.特許
Ｎｏ.４８７６３９９、Ｕ.Ｓ.特許Ｎｏ.４８５７６５
３、Ｕ.Ｓ.特許Ｎｏ.４８１４４７０、Ｕ.Ｓ.特許Ｎｏ.
４９２４０１２、Ｕ.Ｓ.特許Ｎｏ.４９２４０１１、お
よびキングストンの「Ｐharm. Ｔher.」(Ｖol.５２、１〜
３４頁、１９９１年)、特にポスらのＵ.Ｓ.特許出願Ｎ
ｏ.０７／９９５４４３(１９９２年１２月２３日出願)
(代理ドケットＮｏ.ＬＤ６０)およびソッタシルらのＵ.
Ｓ.特許出願Ｎｏ.０８／０３３５９８(１９９３年３月
１９日出願)(代理人ドケットＮｏ.ＬＤ５７)に記載の方
法で製造しうる。式ＶＩのＣ−１３アシルオキシ含有タ
キサンの製造が好ましい。
【００４９】Ｃ−１０変性用の好ましい化合物 本発明のＣ−１０加水分解法において、式ＩＩのタキサ
ンまたはその塩を用いることが好ましく、これにより、
酵素加水分解は、式Ｉの対応化合物またはその塩を付与
する。本発明のＣ−１０エステル化法において、同様
に、式Ｉのタキサンまたはその塩を用いることが好まし
く、これにより、酵素エステル化は式ＩＩの対応化合物
またはその塩を付与する。
【００５０】式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ7はＲ11−Ｃ
(Ｏ)−Ｏ−(特にＲ11はメチルなどのアルキル)が好まし
く;Ｒ2はヒドロキシまたはキシロシルが好ましく;Ｒ3は
メチルなどのアルキルが好ましく;Ｒ4はフェニルなどの
アリールが好ましく;およびＲ1はヒドロキシルまたは下
記式ＩＩＩの基が好ましい。
【化１５】 (式中、Ｒ8およびＲ9はそれぞれ独立して、アルキル、
アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニ
ル、アルキニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルキ
ルオキシ、シクロアルケニル、シクロアルケニルオキ
シ、アリール、アリールオキシ、ヘテロシクロまたはヘ
テロシクロオキシ;およびＲ10は水素またはヒドロキシ
ル保護基である) 式ＩおよびＩＩのタキサンの具体例としては、セファロ
マニン、１０−脱アセチルタキソル、７−キシロシルタ
キソル、タキソル−Ｃ、７−キシロシル−１０−脱アセ
チルタキソル、タキソル、バッカチンＩＩＩ、１０−脱
アセチルバッカチンＩＩＩ、７−キシロシルバッカチン
ＩＩＩ、および７−キシロシル−１０−脱アセチルバッ
カチンＩＩＩである。１０−脱アセチルバッカチンＩＩ
Ｉの形成(たとえば酢酸の形成を伴う)のため、たとえば
加水分解酵素を用いるバッカチンＩＩＩの酵素加水分解
は、本発明の好ましい具体例である。この反応は、本発
明の酵素エステル化法によって逆にすることができる。
最終的に、本明細書記載の方法でタキソルを製造するこ
とが好ましい。
【００５１】Ｃ−１３変性用の好まし化合物 本発明方法において、式ＶＩのタキサンまたはその塩を
用いることが好ましく、これにより、Ｃ−１３の酵素加
水分解は、式Ｖの対応化合物またはその塩を付与する。
式ＶおよびＶＩにおいて、Ｒ12はアセチルオキシなどの
Ｒ6−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−またはヒドロキシルが好ましく;Ｒ2
はヒドロキシルまたはキシロシルが好ましく;Ｒ3はメチ
ルなどのアルキルが好ましく;Ｒ4はフェニルなどのアリ
ールが好ましく;およびＲ7は下記式ＩＩＩの基が好まし
い。
【化１６】 (式中、Ｒ8,Ｒ9およびＲ10は前記と同意義である) 式ＶＩの出発タキサンの具体例は、セファロマニン、１
０−脱アセチルタキソル、７−キシロシルタキソル、タ
キソル−Ｃ、および７−キシロシル−１０−脱アセチル
タキソルの１種もしくは混合物またはタキソルである。
好ましい加水分解生成物は、バッカチンＩＩＩ、１０−
脱アセチルバッカチンＩＩＩ、７−キシロシルバッカチ
ンＩＩＩ、および７−キシロシル−１０−脱アセチルバ
ッカチンＩＩＩである。
【００５２】加水分解後のカップリング反応は、式ＩＩ
ＩのＣ−１３アシルオキシ基を有する上記式ＶＩのタキ
サン生成物を付与することが好ましい。本明細書記載の
加水分解およびカップリング反応によって、最終的にタ
キソルを製造することが好ましい。本発明方法のいずれ
においても、反応体または生成物の水和物などの塩また
は溶媒化合物を使用したりあるいは適宜に製造すること
ができる。
【００５３】
【実施例】次に実施例を挙げて、本発明をより具体的に
説明するが、これらの実施例は単に例示であって、本発
明の技術的範囲を制限するものでは決してない。
【００５４】実施例１ バッカチンＩＩＩの１０−脱アセチル化:−土壌から単
離したノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６
（ＳＣ １３９１２)を、１０ｍｌ培地を含有する５０ｍ
ｌ三角フラスコで、２８℃、１５０ｒｐｍにて３日間生
長させる。培地は蒸留水１Ｌ当り最終ｐＨ６．８±０．
２で、バクト(Ｂacto)・トリプトン１０ｇ、バクト・酵
母エキス５ｇ、トリブチリン６ｍｌ、および０.０６ｍ
ｌのツィーン(Ｔween)８０を含有する。細胞を遠心分離
で採取し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤
(ｐＨ７)で洗い、２ｍｌの同緩衝剤に再懸濁する。かか
る細胞懸濁液に、２０μｌのメタノール中の０.５ｍｇ
のバッカチンＩＩＩを加え、懸濁液を周囲温度(約２３
℃)にて、フィッシャー・ロト−ラック(Ｆisher Ｒoto
−Ｒack)で２０時間混合する。懸濁液を塩化メチレンで
抽出し、抽出物を蒸発し、再溶解し、以下に記載のＨＰ
ＬＣ方法２で検定する。サンプルは、０.２５７ｍｇ／
ｍｌの１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩおよびほんの
痕跡量のバッカチンＩＩＩを含有する(変換率１００
％)。また、他の３つの培地で生長した菌株ＡＴＣＣ５
５４２６の洗った細胞も、この形質変換を行った。
【００５５】実施例２ バッカチンＩＩＩの脱アセチル化:−蒸留水１Ｌ当り最
終ｐＨ６.８±０.２で、１０ｇのバクト・トリプトン、
５ｇのバクト・酵母エキスおよび０.０６ｍｌのツィー
ン８０を含有する２０ｍｌ培地で生長したノカルジオイ
デス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ １３９１２)
を用い、これを４Ｌ三角フラスコ内の１Ｌの同培地に接
種する。フラスコを２８℃で３日間振とうし、次いで遠
心分離で細胞を採取する。細胞ペレットを６００ｍｌの
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤(ｐＨ７)で洗い、再び遠
心分離して、３６.６ｇの湿潤細胞を得る。細胞を−７
２℃で冷凍し、２日で２.５ｇに凍結乾燥し、乳鉢と乳
棒で粉砕し、２℃で貯蔵する。１.９８ｍｌの５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝剤(ｐＨ７)、５０ｍｇの乾燥細胞お
よび０.５ｍｇのバッカチンＩＩＩを２０μｌのメタノ
ール中、ロト−ラックを用い周囲温度にて下記表１に示
す時間(分)で混合する。反応は２Ｌのメタノールを加え
て停止する。沈澱物をマイクロフュージ(microfuge)で
除去し、サンプルを以下に記載のＨＰＬＣ方法１で検定
する。得られる結果を表１に示す。
【表１】 １０−脱アセチル 時間 バッカチンＩＩＩ バッカチンＩＩＩ 変換率 (分) (ｍｇ／ｍｌ） (ｍｇ／ｍｌ） (％) ０ ０.００７ ０.２５２ − ３０ ０.０５１ ０.１４３ ２２ ６０ ０.１０６ ０.１０６ ４６ １２０ ０.２０４ ０.０３４ ８８
【００５６】実施例３ タキソルの１０−脱アセチル化:−ノカルジオイデス・
ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ １３９１２)の部分
的精製抽出物[ウオットマン(Ｗhatman)ＤＥ５２にてア
ニオン交換クロマトグラフィーにより精製)は、３４ミ
リユニット／酵素(ｍｌ)を含有する。(なお、１ミリユ
ニットは、０.２５ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩおよ
び１％のメタノールを含有する５０ｍＭリン酸カリウム
緩衝剤(ｐＨ７)中、２８℃にて１分当り、１ｎモルのバ
ッカチンＩＩＩを１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩに
加水分解できる酵素の量である。)５０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝剤(ｐＨ７)、０.５ｍｇのタキソル、１％のメ
タノールおよび３４ミリユニットの酵素を含有する２ｍ
ｌを、フィッシャー・ロト−ラックにて２８℃で３.５
時間培養する。塩化メチレン４ｍｌによる抽出で、反応
を停止する。抽出物を乾燥し、メタノールに再溶解し、
以下に記載のＨＰＬＣ方法３で検定する。サンプルは
０.０７５ｍｇのタキソルおよび０.１８６ｍｇ／ｍｌの
１０−脱アセチルタキソルを含有する(変換率７８％)。
【００５７】ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５
４２６(ＳＣ１３９１２）の他の精製:−１％のトリプト
ンおよび０.５％の酵母エキスを含有する培地にて、発
酵器内でノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２
６を生長させる。全ての精製ステップは、５０ｍＭリン
酸塩緩衝剤(ｐＨ７.２)中、４℃で行う。細胞を緩衝剤
中１０％Ｗ／Ｖで懸濁し、溶解(lysis)のため１０００
０ｐｓｉで、ミクロ−流動化装置へ２回通す。次いで細
胞溶解産物を、２４０００×ｇで１５分間遠心分離して
透明にする。硫酸アンモニウムを６０％飽和まで加え、
生成する沈澱物を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含有する緩
衝剤に懸濁し、疎水性相互作用クロマトグラフィー[Ｈ
ＩＣ−エーテル(トーヤ(Ｔoya)−パール)]カラム(５.５
×２.６ｃｍ)に、流速２ｍｌ／分で適用する。酵素活性
を緩衝剤で溶離する。次いで活性画分を、ファーマシア
・セファクリル(Ｐharmacia Ｓephacryl)Ｓ−２００ゲ
ル濾過カラム(２.６×８４ｃｍ)に０.５ｍｌ／分で装填
する。カラムからの活性画分を、アニオン交換(ＢioＲa
d−Ｑ２)カラム(２ｍｌカラム、流速２ｍｌ／分)に装填
し、活性を０〜０.８Ｍ−ＮａＣｌ／４２ｍｌの塩勾配
で溶離する。活性画分をプールし、上述のセファクリル
Ｓ−２００カラムに適用する。ドデシル硫酸ナトリウム
含有のゲルにおける、酵素の分子量は４００００±１０
０００と推定される。上記方法の各種ステップで得られ
る結果は、以下の通りである。 蛋白質 活性 比活性 回収率 ステップ＊ 容量 (ｍｇ) (ｍｕ) (ｍｕ／ｍｇ) (％) 細胞抽出物 １００ ４５０ ２０５０ ４.５ − 硫酸アンモニ ニウム ７０ １９６ ２８３０ １４.４ １３８ ＨＩＣ (エーテル) ７ ２４ ９５３ ３９.９ ４６.５ セファクリル Ｓ−２００ ７ ０.７ １９０ ２７１ ９.３ Ｂio Ｒad− Ｑ２ ３ ０.０９ ５１ ５６７ ２.５ セファクリル Ｓ−２００ ８ ０.０３ ２６ ８６７ １.３ 注＊)Ｃ−１０−脱アセチル酵素の精製: １ミリユニット(ｍｕ)の酵素は、０.２５ｍｇ／ｍｌの
バッカチンＩＩＩおよび１％のメタノールを含有する５
０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤(ｐＨ７)中２５℃にて、１
ｎモル／分のバッカチンＩＩＩの１０−脱アセチルバッ
カチンＩＩＩへの変換を触媒する。蛋白質は、ＢioＲad
プロテイン・エッセイ・リエーゼント(Ｐrotein Ａssa
y Ｒeagent)で測定した。
【００５８】実施例４ １０−脱アセチルバッカチンＩＩＩのバッカチンＩＩＩ
へのアセチル化:−５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤(ｐＨ
７.２)中のノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４
２６(ＳＣ １３９１２)(１０％Ｗ／Ｖ)を、ミクロ流動
化装置で破壊し、１０−デアセチラーゼ酵素を抽出物か
ら、３時間の撹拌によりウオットマンＤＥＡＥセルロー
スＤＥ５２アニオン交換体に吸着せしめる(１０ｇ抽出
蛋白質／ＤＥ５２(ｌ))。ＤＥ５２を濾取し、緩衝剤で
洗い、凍結乾燥して０.０９１ミリユニット酵素／固体
(ｍｇ)を得る。０.２ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝剤
(ｐＨ８)、１００ｍｇの固定酵素(すなわち、ＤＥ５２
レジンに固定)、１.８ｍｌの水、２ｍｇの１０−脱アセ
チルバッカチンＩＩＩおよび０.５ｍｌの酢酸ビニル
を、室温にて磁気棒で１４.５時間激しく撹拌する。反
応混合物を塩化メチレンで抽出する。抽出物を乾燥し、
メタノールに再溶解して、以下に記載のＨＰＬＣ方法１
で分析する。サンプルは０.６８８ｍｇ／ｍｌの１０−
脱アセチルバッカチンＩＩＩおよび０.２０３ｍｇ／ｍ
ｌのバッカチンＩＩＩを含有する(変換率１９％)。
【００５９】ＨＰＬＣ方法 方法１ カラム:ヒュレット・パッカード(Ｈewlett Ｐackard)ハ
イパージル５ミクロンＯＤＳ Ｃ１８、２００×４.６
ｍｍ 移動相:５５％メタノール、４５％水 流速:１ｍｌ／分 カラム温度:周囲 検出波長:２３０ｎｍ方法２ カラム:フェース・セパレーションズ・インコーポレイ
テッド(コネチカット州ノルウオーク)のミクロボア・ス
フェリソーブ・フェニル(microbore sopherisorb pheny
l)１５０×２.０ｍｍ、３ミクロン 移動相:溶剤Ａ:１５ｍＭ−ＫＨ2ＰＯ4(トリフルオロ酢
酸でｐＨ４に調整）、 溶剤Ｂ:アセトニトリル 時間(分) 溶剤Ａ(％) 溶剤Ｂ(％) ０ ７５ ２５ ２０ ５５ ４５ ２３ ４０ ６０ ２４ ２５ ７５ ２８ ７５ ２５ カラム温度:３５℃ 検出波長:２３０ｎｍ方法３＊ カラム:Ｈewlett Ｐackardハイパージル５ミクロンＯＤ
Ｓ Ｃ１８、２００×４.６ｍｍ 移動相:６０％メタノール、４０％水 流速:１ｍｌ／分 カラム温度:周囲 検出波長:２３５ｎｍ 注＊)モンサラットらの「Ｄrug Ｍetabolism and Ｄispo
sition」(１８、８９５−９０１頁、１９９０年)も参
照。
【００６０】実施例５ 実生エキスの加水分解:−タキサス属ヒックジイ実生の
エタノール抽出物を、ナノフィルターで１０〜１５倍に
濃縮する。０.５ｍｌの抽出物、０.５ｍｌの１Ｍリン酸
カリウム緩衝剤(ｐＨ７)、ノカルジオイデス・アルブス
ＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ １３９１１)からの５４ミリ
ユニットの部分精製酵素(アニオン交換クロマトグラフ
ィーおよび硫酸アンモニウム沈澱で精製)および水４ｍ
ｌを、フィッシャー・ロト−ラックにて２８℃で４８時
間培養する。(なお、ＡＴＣＣ５５４２５からの酵素
は、本明細書記載のＣ−１３の加水分解に使用しう
る。)第２チューブは同じ混合物を含有し、またノカル
ジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ １３９
１２)からの１４ミリユニット酵素が実施例４に記載の
如く５００ｍｇのＤＥ５２に固定されている。２８℃に
て２３時間の培養後、ＤＥ５２におけるＡＴＣＣ５５４
２６からの第２部分の１４ミリユニット酵素を、４ｍｌ
の水と共に加え、培養を２２時間続ける。対照サンプル
は酵素を受容せず。サンプルを塩化メチレンで抽出し、
蒸発した抽出物をメタノールに溶解して、上記ＨＰＬＣ
方法２で分析する。得られる結果を、下記表２に示す。
【００６１】表２の結果から、ＳＣ １３９１１からの
Ｃ−１３デアシラーゼによる処理後、タキソル、セファ
ロマニン、７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソル
および１０−脱アセチルタキソルが枯渇し、一方、バッ
カチンＩＩＩおよび１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ
の量の増大が認められる。(１０−脱アセチルバッカチ
ンＩＩＩ＋バッカチンＩＩＩ)と初期タキソルのモル比
は、１１７％から４３６％増大した。実生エキスを、Ｓ
Ｃ １３９１１からのＣ−１３デアシラーゼとＳＣ １３
９１２からのＣ−１０デアシラーゼの両方で処理する
と、バッカチンＩＩＩは１０−脱アセチルバッカチンＩ
ＩＩに変換し、１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩの濃
度は、初期値に比べて６倍増大した。このように、タキ
サン混合物をＣ−１３デアシラーゼおよびＣ−１０デア
シラーゼで処理すると、原理生成物(principle produc
t)として１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩが得られ
る。
【００６２】
【表２】
【００６３】実施例６ タキソルのＣ−１３側鎖を除去しうる微生物の菌株の選
択:−蒸留水１５０ｍｌ中の(Difco)スピリット・ブル−
寒天培地(５.２５ｇ)を、製造業者の指示に従い、殺菌
し、部分的に冷却する。培地は１ｌ当り、１０ｇのトリ
プトン、５ｇの酵母エキス、２０ｇの寒天、および０.
１５ｇスピリット・ブルーを含有する。かかる培地に殺
菌フィルターを介して、メタノール１ｍｌ中のタキソル
２５ｍｇおよびツィーン８０(１０μｌ)を加える。１０
０ｍｍ×１５ｍｍのペトリ皿に、１５ｍｌ培地を用い
る。平板(plate)を冷却および乾燥した後、土壌サンプ
ルを以下の如くプレートアウトする。２ｇの土壌を４０
ｍｌの水に懸濁する。懸濁液のサンプルを水で１００倍
に希釈し、平板１つ当り０.１ｍｌを散布する。使用す
る水は、０.２２μフィルターで濾過した。平板を２８
℃で培養し、透明なゾーンで囲まれたコロニーを選択す
る。選択の基準は、タキソルが培地における使用濃度で
溶解せず、平板に濁り外観を付与し、これに対し、バッ
カチンＩＩＩおよび加水分解で生成する側鎖は溶解する
ことにより、コロニーの周囲に透明ゾーンを形成するこ
とである。選択した微生物は、ノカルジオイデス・アル
ブス菌株ＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ １３９１０）および
ＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ １３９１１)、およびノカル
ジオイデス・ルテウス菌株ＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ １
３９１２)である。
【００６４】実施例７ タキソルからＣ−１３側鎖の除去:−本例の反応は、後
記反応工程Ｉに従って進行する。１０ｍｌ培地含有の５
０ｍｌ三角フラスコに、実施例６に記載の如く土壌から
単離したノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５
４２４(ＳＣ １３９１０)またはＡＴＣＣ５５４２５(Ｓ
Ｃ１３９１１）を接種し、２８℃、１５０ＲＰＭで２日
間振とうする。培地は蒸留水１ｌ当り、ｐＨ６.８±０.
２で、１０ｇのバクト・トリプトン、５ｇのバクト・酵
母エキスおよび０.０６ｍｌのツイーン８０を含有す
る。遠心分離で細胞を除去し、上層液のｐＨを１Ｍ−Ｋ
Ｈ2ＰＯ4で８.６６から７へ調整する。
【００６５】各上層液２ｍｌにタキソル０.５ｍｇ／メ
タノール２０μｌを加え、混合物を周囲温度(約２３
℃）で２１時間撹拌する。溶液を４ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で
抽出する。抽出物をＮ2下室温にて乾燥し、メタノール
に再溶解し、ＨＰＬＣ(上記方法３)で分析する。菌株Ａ
ＴＣＣ５５４２４(ＳＣ １３９１０）からの上層液は、
０.００８ｍｇ／ｍｌのタキソルおよび０.１６３ｍｇ／
ｍｌのバッカチンＩＩＩを付与する(変換率９４.９モル
％）。菌株ＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１）から
の上層液は、０.０１４ｍｇ／ｍｌのタキソルおよび０.
１６６ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩを付与する(変換
率９６.７モル％)。(なお、バッカチンＩＩＩおよび開
裂した側鎖生成物は、ＬＣ−ＭＳで同定した。）反応工程１
【化１７】
【００６６】実施例８ セファロマニンからＣ−１３側鎖の除去：−それぞれ１
０ｍｌの培地(コーン浸漬リカー３５ｇ、セレロース２
０ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4５ｇ、ＣａＣＯ3３.５ｇ、および
大豆油５ｍｌ、蒸留水で１ｌに調整）を含有する２つの
５０ｍｌ三角フラスコにそれぞれ、０.５ｍｌのノカル
ジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ １
３９１１)を接種する。２８℃、１５０ＲＰＭでの２日
培養後、これら２つの培養物を、実施例７で用いた１ｌ
の培地を含有する４ｌフラスコに加える。２８℃、２０
０ＲＰＭで７２時間後、遠心分離で細胞を除去し、上層
液を１Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4でｐＨ８.１６からｐＨ７に調整
する。セファロマニン０.５ｍｇ／メタノール２０μｌ
を、転倒型振盪器(フィッシャー・ロト−ラック)にて、
上層液２ｍｌと共に１７時間培養する。溶液を塩化メチ
レンで抽出し、抽出物を蒸発し、メタノールに再懸濁
し、ＨＰＬＣ(上記方法２)で分析する。セファロマニン
濃度は、０.１７５ｍｇ／ｍｌから０に減少し、０.１１
０ｍｇ／ｍｌのバッカチンＩＩＩが生成した(分析した
初期セファロマニン濃度に対して８９モル％収率)。
【００６７】実施例９ ７−キシロシルタキソルからＣ−１３側鎖の除去:−実
施例８において、１ｌ培地を３日の代わりに２日間培養
する以外は、同様にして、ノカルジオイデス・アルブス
菌株ＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ １３９１０)およびＡＴ
ＣＣ５５４２５(ＳＣ １３９１１)からの酵素を製造す
る。ノカルジオイデス・ルテウス菌株ＡＴＣＣ５５４２
６(ＳＣ １３９１２)を実施例８のノカルジオイデス・
アルブス菌株ＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ １３９１１)の
場合と同様に生長させる。３日後、遠心分離で細胞を採
取し、６００ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤(ｐ
Ｈ７)で洗い、再び遠心分離する。３６.６ｇの湿潤細胞
を−７２℃で冷凍し、２日で２.５２ｇに凍結乾燥し、
乳鉢と乳棒で粉砕し、２℃で貯蔵する。菌株ＡＴＣＣ５
５４２４(ＳＣ １３９１０)およびＡＴＣＣ５５４２５
(ＳＣ１３９１１)からの１.８ｍｌ上層液と、菌株ＡＴ
ＣＣ５５４２６(ＳＣ １３９１２)からの５０ｍｇ乾燥
細胞をそれぞれ１.８ｍｌ水中で、フィッシャー・ロト
−ラックにて、室温で０.５ｍｇの７−キシロシルタキ
ソル／０.２ｍｌのメタノールと共に４２時間培養す
る。反応液を塩化メチレンで抽出し、乾燥した抽出物を
メタノールに溶解し、ＨＰＬＣ(上記方法３)で分析す
る。各酵素の場合、７−キシロシルタキソルは０.２１
８ｍｇ／ｍｌから０に減少した。各サンプルの主要生成
物は、ＨＰＬＣ−マススペクトロメトリーにより同定し
たところ、７−キシロシルバッカチンＩＩＩであった。
バッカチンＩＩＩ標準に対して、ＡＴＣＣ５５４２４
(ＳＣ １３９１０)、ＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ １３９
１１)、およびＡＴＣＣ５５４２６(ＳＣ １３９１２)は
それそれ、０.１１２、０.１１８、および０.１２０ｍ
ｇ／ｍｌの７−キシロシルバッカチンＩＩＩ生成物濃度
を付与した。バッカチンＩＩＩおよび７−キシロシルバ
ッカチンＩＩＩに対し２３５ｎｍで同じ吸光係数を用い
ると、計算収率は８８％、９３％、および９４％(それ
ぞれモル％)となる。
【００６８】実施例１０ 植物細胞混合物の加水分解：−１ｇのタキサス属ヒック
ジイ針状葉を、メタノール／酢酸(５０００：１)１０ｍ
ｌで抽出する。１０ｍｌ抽出物に、水／酢酸(５００：
１)１０ｍｌを加える。混合物を４８０００×ｇ、２０
℃で１０分間遠心分離する。ペレットを捨てる。４ｍｌ
抽出物とノカルジオイデス・アルブス菌株ＡＴＣＣ５５
４２４(ＳＣ１３９１０)またはＡＴＣＣ５５４２５(Ｓ
Ｃ１３９１１)からの１６ｍｌ上層液(実施例９の記載に
準じ製造)を、２８℃、１５０ＲＰＭにて５０ｍｌ三角
フラスコ内で、４２時間振とうする。サンプルを塩化メ
チレンで抽出し、蒸発した抽出物をメタノールに溶解
し、ＨＰＬＣ(上記方法２)で分析する。酵素処理および
該処理せずの場合の、タキサン濃度および(バッカチン
ＩＩＩ＋１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ)／初期タ
キソルのモル比を、下記表３に示す。
【表３】 針状葉抽出物の酵素加水分解： 10-脱アセチル 7-キシロシル- 酵素源 ハ゛ッカチンIII ハ゛ッカチンIII 10-脱アセチル セファロマニン タキソル モル比* (μg/ml) (μg/ml) タキソル(μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) なし 0.126 痕跡 0.012 0.153 0.392 50.4 SC13910 0.602 0.319 0.000 0.000 0.000 359.3 SC13911 0.959 0.294 0.000 0.000 0.000 492.8 注＊)(ＤＡＢ＋Ｂ)÷(初期タキソル)のモル％で表示 ＤＡＢ＝１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ Ｂ＝バッカチンＩＩＩ
【００６９】実施例１１ 酵素の精製およびタキサンの加水分解：−５００ｍｌ三
角フラスコ内の１００ｍｌの培地（コーン浸漬リカー３
５ｇ、セレロース２０ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、炭酸
カルシウム３.５ｇ、および大豆油５ｍｌ、蒸留水で１
ｌに調整）に、同培地中のノカルジオイデス・アルブス
ＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ １３９１１)１ｍｌを接種
し、２８℃で２日間振とうする。この培養物２０ｍｌ
を、４ｌ三角フラスコ内のトリプトン１０ｇおよび酵母
エキス５ｇ含有の蒸留水１ｌ(ｐＨ６．８±０．２)へ移
す。フラスコを２８℃で３日間振とうし、遠心分離で細
胞を除去し、上層液を１Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4でｐＨ７.８９
からｐＨ７に調整する。
【００７０】全ての精製ステップは４℃で行う。上層液
を、５ｃｍ直径カラム内の１５０ｍｌウオットマンＤＥ
５２アニオン交換体／２５ｍＭリン酸カリウム緩衝剤
(ｐＨ７)に適用する。カラムを１５０ｍｌ緩衝剤、次い
で０.２５Ｍ−ＮａＣｌ含有の４５０ｍｌ緩衝剤で洗
う。酵素活性を緩衝剤＋０.４５Ｍ−ＮａＣｌで溶離す
る。流速は５ｍｌ／分である。ＤＥ５２カラムからの最
も活性な画分に、硫酸アンモニウム(１００ｍｇ／ｍｌ)
を加え、溶液を、２.６ｃｍ直径カラム内の１００ｍｇ
／ｍｌ硫酸アンモニウム含有の５０ｍＭリン酸カリウム
緩衝剤(ｐＨ７)中、３０ｍｌファーマシア・フェニル・
セファロース(Ｐharmacia Ｐhenyl Ｓepharose)ＣＬ−
４Ｂ(疎水性相互作用クロマトグラフィー)に流速１.６
ｍｌ／分で適用する。カラムを１５０ｍｌ緩衝剤＋２０
ｍｇ／ｍｌ硫酸アンモニウムで洗い、次いで活性を緩衝
剤のみで溶離する。フェニル・セファロースカラムから
の最も活性な画分を、アミコン(Ａmicon)ＹＭ１０膜を
用いる限外濾過で４ｍｌまで濃縮し、次いでファーマシ
ア・セファクリル(Ｐharmacia Ｓephacryl)Ｓ−２００
ゲル濾過カラム(２.６×８４ｃｍ)へ流速０.６５ｍｌ／
分で通す。比活性の最も高い画分は、ドデシル硫酸ナト
リウム(ＳＤＳ)ゲルにおいて分子量４９０００±１００
００のシングルバンドを有した。精製について下記表４
に要約する。(なお、１ミリユニット(ｍｕ)の酵素は、
０.２５ｍｇ／ｍｌタキソルおよび１％メタノール含有
の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤中、２８℃にて１ｎモ
ル／分のタキソルのバッカチンＩＩＩへの変換を触媒す
る。)
【００７１】
【表４】 容量 蛋白質 活性 比活性 回収率 ステップ (ml) (mg) (mu) (mu/mg) (％) 培地 1000 885 4664 5.27 − DE52 99 104 1194 11.5 25.6 フェニル・セファロースCL-4B 16 6.45 801 124 17.2 セファクリルS-200 8.8 0.150 164 1093 3.5 上記精製した酵素の活性を証明するため、下記表５に挙
げるタキサン物質を用いて、以下に示す実験を行った。
【００７２】２.０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
剤(ｐＨ７)に、０.５ｍｇタキサン基質および１％メタ
ノールを含有するサンプル(サンプル１,２,３,４および
５)を調製する。また、２．０ｍｌの５０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝剤(ｐＨ７)に、０.５ｍｇタキサン基質およ
び１％メタノールに加えて、上記フェニル・セファロー
スＣＬ−４Ｂステップで精製した酵素の１０ｍｕ酵素を
含有するサンプル(サンプル１ｅ,２ｅ,３ｅ,４ｅおよび
５ｅ)も調製する。全てのサンプルは、フィッシャー・
ロト−ラックを用い２８℃にて１６時間混合する。サン
プル１,１ｅ,２,２ｅ,５および５ｅは、４ｍｌの塩化メ
チレンで抽出する。２ｍｌの抽出物を乾燥し、１ｍｌの
メタノールに再溶解し、ＨＰＬＣ方法３で分析する。サ
ンプル３,３ｅ,４および４ｅは、２ｍｌのメタノールで
希釈し、ＨＰＬＣ方法３で分析する（これら後者のサン
プルのみ、Ｃ−１３側鎖を測定した)。
【００７３】表５に、培養後に各サンプルに残留するタ
キサン基質の量(ｍｇ／ｍｌ)、並びに培養の終りに存在
する生成物タキサンの量(ｍｇ／ｍｌ)を表記する。表５
から明らかなように（サンプル１ｅ,２ｅ,３ｅ,４ｅお
よび５ｅ参照）、上述の如く精製した酵素は、列挙した
タキサン基質の加水分解によって、Ｃ−１３側鎖の除去
に有効であることが認められる。
【表５】 精製酵素によるタキサンの加水分解： 側 鎖サンフ゜ル 基 質 残 量 生 成 物 mg/ml (mg/ml) １ タキソル 0.268 0.003 １ｅ 0.030 ハ゛ッカチンIII 0.170 ２ セファロマニン 0.239 ２ｅ 0.011 ハ゛ッカチンIII 0.190 ３ 7-キシロシルタキソル 0.250 ３ｅ 0.016 7-キシロシルハ゛ッカチンIII 0.182 0.066 ４ 7-キシロシル-10- 0.250 脱アセチルタキソル ４ｅ 0.113 7-キシロシル-10- 0.108 0.044 脱アセチルハ゛ッカチンIII ５ 10-脱アセチルタキソル 0.257 ５ｅ 0.000 10-脱アセチルハ゛ッカチンIII 0.150
【００７４】実施例１２ 実生エキスの加水分解:−タキサス属ヒックジイ実生の
エタノール抽出物を、ナノフィルターで１０〜１５倍に
濃縮する。０.５ｍｌの抽出物、０.５ｍｌの１Ｍリン酸
カリウム緩衝剤(pH7)、ノカルジオイデス・アルブスＡ
ＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)からの５４ミリユニ
ットの部分精製酵素(上記実施例１１参照)および水４ｍ
ｌを、フィッシャー・ロト−ラックにて２８℃で４８時
間混合する。対照サンプルは酵素を受容せず。サンプル
を塩化メチレンで抽出し、蒸発した抽出物をメタノール
に溶解し、ＨＰＬＣ方法２で分析する。得られる結果を
下記表６に示す。
【表６】 実生エキスの加水分解： 10-DAB bacc-III ceph XDT タキソル 10-DAT タキソルC 酵素源 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) なし 0.167 0.142 0.243 0.246 0.401 0.201 痕跡 SC13911 0.400 0.771 0.000 0.027 0.000 0.014 0.000 (DAB+B)/(初期タキソル) 酵素源 モル% 収率 なし 116.8 SC13911 436.3 表６中、 １０−ＤＡＢは１０−脱アセチルバッカチンＩＩＩ ｂａｃｃ−ＩＩＩまたはＢはバッカチンＩＩＩ ｃｅｐｈ はセファロマニン ＸＤＴは７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソル １０−ＤＡＴは１０−脱アセチルタキソル である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ラメシュ・エヌ・パテル アメリカ合衆国ニュージャージー州ブリッ ジウォーター、キャボット・ヒル・ロード 572番 (72)発明者 ラズロ・ジェイ・ザルカ アメリカ合衆国ニュージャージー州イース ト・ブランズウィック、ウェリントン・ロ ード５番

Claims (55)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｃ−１０に直接結合したヒドロキシル基
    を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であっ
    て、Ｃ−１０に直接結合したアシルオキシ基を含有する
    少なくとも１種のタキサンを、上記アシルオキシ基のヒ
    ドロキシル基への加水分解を触媒しうる酵素もしくは微
    生物と接触させて加水分解を行う行程から成ることを特
    徴とする製造法。
  2. 【請求項２】 式Ｉ： 【化１】 (式中、Ｒ1はヒドロキシルまたはアシルオキシ；Ｒ2は
    水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ5−Ｏ−、キシロシ
    ル、Ｒ6−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−またはＲ6−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−；
    Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素、アルキル、ア
    ルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケ
    ニル、アリールまたはヘテロシクロ；Ｒ5はヒドロキシ
    ル保護基；およびＲ6は水素、アルキル、アルケニル、
    アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリ
    ールまたはヘテロシクロである)の少なくとも１種のＣ
    −１０ヒドロキシル含有タキサン(Ｉ)またはその塩の製
    造法であって、式II： 【化２】 (式中、Ｒ1,Ｒ2,Ｒ3およびＲ4は前記と同意義；および
    Ｒ7はアシルオキシである)の少なくとも１種のＣ−１０
    アシルオキシ含有タキサン(II)またはその塩を、上記Ｒ
    7アシルオキシ基のヒドロキシル基への加水分解を触媒
    しうる酵素もしくは微生物と接触させることによる請求
    項１に記載の製造法。
  3. 【請求項３】 式IIのタキサンがバッカチンIIIで、式
    Ｉのタキサンが１０−脱アセチルバッカチンIIIである
    請求項２に記載の製造法。
  4. 【請求項４】 加水分解法に用いる出発物質のアシルオ
    キシ含有タキサンが、アシルオキシ含有タキサンの混合
    物である請求項１に記載の製造法。
  5. 【請求項５】 タキサン混合物が、植物組織の植物細胞
    培養および／または抽出によって得られ、かつ植物がタ
    キサス属の１種である請求項４に記載の製造法。
  6. 【請求項６】 ノカルジオイデス(Nocardioides)、ノカ
    ルジア(Nocardia)、ロードコッカス(Rhodococcus)、ミ
    クロポリスポラ(Micropolyspora)、サッカロポリスポラ
    (Saccharopolyspora)、プソイドノカルジア(Pseudonoca
    rdia)、エルスコビア(Oerskovia)、プロミクロモノスポ
    ラ(Promicromonospora)またはイントラスポランジウム
    (Intrasporangium)属の１つに属する微生物を使用する
    請求項１に記載の製造法。
  7. 【請求項７】 ノカルジオイデス属に属する微生物を使
    用する請求項６に記載の製造法。
  8. 【請求項８】 微生物が、ノカルジオイデス・アルブス
    (albus)、ノカルジオイデス・フラブス(flavus)、ノカ
    ルジオイデス・フルブス(fulvus)、ノカルジオイデス・
    ルテウス(luteus)、ノカルジオイデス・シンプレックス
    (simplex)およびノカルジオイデス・サーモリラシナス
    (thermolilacinus)からなる群から選ばれる請求項７に
    記載の製造法。
  9. 【請求項９】 微生物が、ノカルジオイデス・アルブス
    ＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)、ノカルジオイデ
    ス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)およ
    びノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(Ｓ
    Ｃ１３９１２)からなる群から選ばれる請求項８に記載
    の製造法。
  10. 【請求項１０】 酵素が、ノカルジオイデス、ノカルジ
    ア、ロードコッカス、ミクロポリスポラ、サッカロポリ
    スポラ、プソイドノカルジア、エルスコビア、プロミク
    ロモノスポラまたはイントラスポランジウム属の１つに
    属する微生物から誘導される請求項１に記載の製造法。
  11. 【請求項１１】 酵素が、ノカルジオイデス属に属する
    微生物から誘導される請求項１０に記載の製造法。
  12. 【請求項１２】 酵素が、ノカルジオイデス・アルブ
    ス、ノカルジオイデス・フラブス、ノカルジオイデス・
    フルブス、ノカルジオイデス・ルテウス、ノカルジオイ
    デス・シンプレックスおよびノカルジオイデス・サーモ
    リラシナスからなる群から選ばれる微生物から誘導され
    る請求項１１に記載の製造法。
  13. 【請求項１３】 酵素が、ノカルジオイデス・アルブス
    ＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)、ノカルジオイデ
    ス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)およ
    びノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(Ｓ
    Ｃ１３９１２)からなる群から選ばれる微生物から誘導
    される請求項１２に記載の製造法。
  14. 【請求項１４】 得られるタキサン生成物を、Ｃ−１３
    にアシルオキシ基含有のタキサンの製造に用いる請求項
    １に記載の製造法。
  15. 【請求項１５】 Ｃ−１０に直接結合したアシルオキシ
    基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であっ
    て、Ｃ−１０に直接結合したヒドロキシル基を含有する
    少なくとも１種のタキサンを、アシル化剤および上記ヒ
    ドロキシル基のアシルオキシ基へのエステル化を触媒し
    うる酵素もしくは微生物と接触させてエステル化を行う
    行程から成ることを特徴とする製造法。
  16. 【請求項１６】 式II： 【化３】 (式中、Ｒ1はヒドロキシルまたはアシルオキシ；Ｒ2は
    水素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ5−Ｏ−、キシロシ
    ル、Ｒ6−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−またはＲ6−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−；
    Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素、アルキル、ア
    ルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケ
    ニル、アリールまたはヘテロシクロ；Ｒ5はヒドロキシ
    ル保護基；Ｒ6は水素、アルキル、アルケニル、アルキ
    ニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールま
    たはヘテロシクロ；およびＲ7はアシルオキシである)の
    少なくとも１種のＣ−１０アシルオキシ含有タキサン(I
    I)またはその塩の製造法であって、式Ｉ： 【化４】 (式中、Ｒ1,Ｒ2,Ｒ3およびＲ4は前記と同意義である)の
    少なくとも１種のＣ−１０ヒドロキシル含有タキサン
    (Ｉ)またはその塩を、アシル化剤およびＣ−１０ヒドロ
    キシル基のエステル化を触媒しうる酵素もしくは微生物
    と接触させて、上記Ｒ7アシルオキシ基を形成すること
    による請求項１５に記載の製造法。
  17. 【請求項１７】 式IIのタキサンがバッカチンIIIで、
    式Ｉのタキサンが１０−脱アセチルバッカチンIIIであ
    る請求項１６に記載の製造法。
  18. 【請求項１８】 エステル化法に用いる出発物質のヒド
    ロキシル含有タキサンが、ヒドロキシル含有タキサンの
    混合物である請求項１５に記載の製造法。
  19. 【請求項１９】 タキサン混合物が、植物組織の植物細
    胞培養および／または抽出によって得られ、かつ植物が
    タキサス属の１種である請求項１８に記載の製造法。
  20. 【請求項２０】 ノカルジオイデス、ノカルジア、ロー
    ドコッカス、ミクロポリスポラ、サッカロポリスポラ、
    プソイドノカルジア、エルスコビア、プロミクロモノス
    ポラまたはイントラスポランジウム属の１つに属する微
    生物を使用する請求項１５に記載の製造法。
  21. 【請求項２１】 ノカルジオイデス属に属する微生物を
    使用する請求項２０に記載の製造法。
  22. 【請求項２２】 微生物が、ノカルジオイデス・アルブ
    ス、ノカルジオイデス・フラブス、ノカルジオイデス・
    フルブス、ノカルジオイデス・ルテウス、ノカルジオイ
    デス・シンプレックスおよびノカルジオイデス・サーモ
    リラシナスからなる群から選ばれる請求項２１に記載の
    製造法。
  23. 【請求項２３】 微生物が、ノカルジオイデス・アルブ
    スＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)、ノカルジオイ
    デス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)お
    よびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６
    (ＳＣ１３９１２)からなる群から選ばれる請求項２２に
    記載の製造法。
  24. 【請求項２４】 酵素が、ノカルジオイデス、ノカルジ
    ア、ロードコッカス、ミクロポリスポラ、サッカロポリ
    スポラ、プソイドノカルジア、エルスコビア、プロミク
    ロモノスポラまたはイントラスポランジウム属の１つに
    属する微生物から誘導される請求項１５に記載の製造
    法。
  25. 【請求項２５】 酵素が、ノカルジオイデス属に属する
    微生物から誘導される請求項２４に記載の製造法。
  26. 【請求項２６】 酵素が、ノカルジオイデス・アルブ
    ス、ノカルジオイデス・フラブス、ノカルジオイデス・
    フルブス、ノカルジオイデス・ルテウス、ノカルジオイ
    デス・シンプレックスおよびノカルジオイデス・サーモ
    リラシナスからなる群から選ばれる微生物から誘導され
    る請求項２５に記載の製造法。
  27. 【請求項２７】 酵素が、ノカルジオイデス・アルブス
    ＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)、ノカルジオイデ
    ス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)およ
    びノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(Ｓ
    Ｃ１３９１２)からなる群から選ばれる微生物から誘導
    される請求項２６に記載の製造法。
  28. 【請求項２８】 アシル化剤が、式IV： Ｒ11−Ｃ(Ｏ)−Ｌ (IV) (式中、Ｒ11はアルキル、アルケニル、アルキニル、ア
    リール、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはヘテ
    ロシクロ；およびＬは置換されてエステル基を形成しう
    る脱離可能基である)の化合物(IV)である請求項１５に
    記載の製造法。
  29. 【請求項２９】 アシル化剤が酢酸ビニルである請求項
    ２８に記載の製造法。
  30. 【請求項３０】 得られるタキサン生成物を、Ｃ−１３
    にアシルオキシ基含有のタキサンの製造に用いる請求項
    １５に記載の製造法。
  31. 【請求項３１】 ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ
    ５５４２６(ＳＣ１３９１２)から単離された、請求項１
    の加水分解または請求項１５のエステル化を行うことが
    できる酵素。
  32. 【請求項３２】 Ｃ−１３に直接結合したヒドロキシル
    基を含有する少なくとも１種のタキサンの製造法であっ
    て、Ｃ−１３に直接結合したアシルオキシ基を含有する
    少なくとも１種のタキサンを、上記アシルオキシ基のヒ
    ドロキシル基への加水分解を触媒しうる酵素もしくは微
    生物と接触させて加水分解を行う行程から成ることを特
    徴とする製造法。
  33. 【請求項３３】 式Ｖ： 【化５】 (式中、Ｒ12は水素、ヒドロキシル、Ｒ5−Ｏ−、Ｒ6−
    Ｃ(Ｏ)−Ｏ−またはＲ6−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−；Ｒ2は水
    素、ヒドロキシル、フルオロ、Ｒ5−Ｏ−、キシロシ
    ル、Ｒ6−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−またはＲ6−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−；
    Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素、アルキル、ア
    ルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケ
    ニル、アリールまたはヘテロシクロ；Ｒ5はヒドロキシ
    ル保護基；およびＲ6は水素、アルキル、アルケニル、
    アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリ
    ールまたはヘテロシクロである)の少なくとも１種のＣ
    −１３ヒドロキシル含有タキサン(Ｖ)またはその塩の製
    造法であって、式VI： 【化６】 (式中、Ｒ12,Ｒ2,Ｒ3およびＲ4は前記と同意義；および
    Ｒ7はアシルオキシである）の少なくとも１種のＣ−１
    ３アシルオキシ含有タキサン（ＶＩ）またはその塩を、
    上記酵素もしくは微生物と接触させることによる請求項
    ３２に記載の製造法。
  34. 【請求項３４】 式VIのタキサンが、セファロマニン、
    ７−キシロシル−１０−脱アセチルタキソル、１０−脱
    アセチルタキソル、７−キシロシルタキソル、タキソル
    −Ｃ、および／またはタキソル、および式Ｖのタキサン
    が、バッカチンIII、１０−脱アセチルバッカチンIII、
    ７−キシロシル−１０−脱アセチルバッカチンIII、お
    よび／または７−キシロシルバッカチンIIIである請求
    項３３に記載の製造法。
  35. 【請求項３５】 加水分解法に用いる出発物質のアシル
    オキシ含有タキサンが、Ｃ−１３に異なる側鎖を有する
    アシルオキシ含有タキサンの混合物である請求項３３に
    記載の製造法。
  36. 【請求項３６】 タキサン混合物が、植物組織の植物細
    胞培養および／または抽出によって得られ、かつ植物が
    タキサス属の１種である請求項３５に記載の製造法。
  37. 【請求項３７】 ノカルジオイデス、ノカルジア、ロー
    ドコッカス、ミクロポリスポラ、サッカロポリスポラ、
    プソイドノカルジア、エルスコビア、プロミクロモノス
    ポラまたはイントラスポランジウム属の１つに属する微
    生物を使用する請求項３２に記載の製造法。
  38. 【請求項３８】 ノカルジオイデス属に属する微生物を
    使用する請求項３７に記載の製造法。
  39. 【請求項３９】 微生物が、ノカルジオイデス・アルブ
    ス、ノカルジオイデス・フラブス、ノカルジオイデス・
    フルブス、ノカルジオイデス・ルテウス、ノカルジオイ
    デス・シンプレックスおよびノカルジオイデス・サーモ
    リラシナスからなる群から選ばれる請求項３８に記載の
    製造法。
  40. 【請求項４０】 微生物が、ノカルジオイデス・アルブ
    スＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)、ノカルジオイ
    デス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)お
    よびノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６
    (ＳＣ１３９１２)からなる群から選ばれる請求項３９に
    記載の製造法。
  41. 【請求項４１】 酵素が、加水分解酵素である請求項３
    ２に記載の製造法。
  42. 【請求項４２】 酵素が、ノカルジオイデス、ノカルジ
    ア、ロードコッカス、ミクロポリスポラ、サッカロポリ
    スポラ、プソイドノカルジア、エルスコビア、プロミク
    ロモノスポラまたはイントラスポランジウム属の１つに
    属する微生物から誘導される請求項３２に記載の製造
    法。
  43. 【請求項４３】 酵素が、ノカルジオイデス属に属する
    微生物から誘導される請求項４２に記載の製造法。
  44. 【請求項４４】 酵素が、ノカルジオイデス・アルブ
    ス、ノカルジオイデス・フラブス、ノカルジオイデス・
    フルブス、ノカルジオイデス・ルテウス、ノカルジオイ
    デス・シンプレックスおよびノカルジオイデス・サーモ
    リラシナスからなる群から選ばれる微生物から誘導され
    る請求項４３に記載の製造法。
  45. 【請求項４５】 酵素が、ノカルジオイデス・アルブス
    ＡＴＣＣ５５４２４(ＳＣ１３９１０)、ノカルジオイデ
    ス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５(ＳＣ１３９１１)およ
    びノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６(Ｓ
    Ｃ１３９１２)からなる群から選ばれる微生物から誘導
    される請求項４４に記載の製造法。
  46. 【請求項４６】 加水分解を行った後、Ｃ−１３以外の
    位置のヒドロキシル基が任意に保護された、Ｃ−１３に
    直接結合したヒドロキシル基を含有する少なくとも１種
    のタキサンを、Ｃ−１３にアシルオキシ側鎖を形成する
    化合物とカップリング反応させる請求項３２に記載の製
    造法。
  47. 【請求項４７】 加水分解およびカップリング反応から
    なる方法によって、最終的にタキソルを製造する請求項
    ４６に記載の製造法。
  48. 【請求項４８】 Ｃ−１３に直接結合したアシルオキシ
    基を含有するタキサンと接触させたときに、上記アシル
    オキシ基を加水分解してＣ−１３に直接結合するヒドロ
    キシル基を形成しうる微生物を選択する方法であって、 (ａ) 固形の生長培地として、(i) スクリーニングされ
    る微生物が生長し、(ii) 出発Ｃ−１３アシルオキシ含
    有タキサンを混和すると、溶解しないため濁り外観を呈
    し、および (iii) 所定のＣ−１３ヒドロキシル含有タ
    キサン生成物および必要に応じて所定の開裂Ｃ−１３側
    鎖生成物を混和すると、溶解するため透明外観を呈する
    生長培地を選択し、 (ｂ) 上記行程(ａ)で選択した生長培地に予め出発Ｃ−
    １３アシルオキシ含有タキサンを混和しておき、かつ微
    生物の生長を発生せしめる条件下で、該生長培地に上記
    微生物を入れて接触せしめ、次いで (ｃ) 上記微生物による加水分解が可能であることを示
    す透明ゾーンが、微生物の生長が起こる領域付近で出現
    するかどうかを観察する工程から成ることを特徴とする
    微生物の選択法。
  49. 【請求項４９】 Ｃ−１３に直接結合したアシルオキシ
    基を含有するタキサンと接触させたときに、上記アシル
    オキシ基を加水分解してＣ−１３に直接結合するヒドロ
    キシル基を形成しうる微生物を選択する方法であって、 (ａ) 固形の生長培地として、(i) スクリーニングされ
    る微生物が生長し、(ii) 出発Ｃ−１３アシルオキシ含
    有タキサンを混和すると、溶解するため透明外観を呈
    し、および (iii) 所定のＣ−１３ヒドロキシル含有タ
    キサン生成物および必要に応じて所定の開裂Ｃ−１３側
    鎖生成物を混和すると、溶解しないため濁り外観を呈す
    る生長培地を選択し、 (ｂ) 上記行程(ａ)で選択した生長培地に予め出発Ｃ−
    １３アシルオキシ含有タキサンを混和しておき、かつ微
    生物の生長を発生せしめる条件下で、該生長培地に上記
    微生物を入れて接触せしめ、次いで (ｃ) 上記微生物による加水分解が可能であることを示
    す濁りゾーンが、微生物の生長が起こる領域付近で出現
    するかどうかを観察する工程から成ることを特徴とする
    微生物の選択法。
  50. 【請求項５０】 生物学的に純粋な微生物ノカルジオイ
    デス・アルブスＡＴＣＣ５５４２４。
  51. 【請求項５１】 生物学的に純粋な微生物ノカルジオイ
    デス・アルブスＡＴＣＣ５５４２５。
  52. 【請求項５２】 生物学的に純粋な微生物ノカルジオイ
    デス・ルテウスＡＴＣＣ５５４２６。
  53. 【請求項５３】 ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ
    ５５４２４から単離された、請求項３２の加水分解を行
    うことができる酵素。
  54. 【請求項５４】 ノカルジオイデス・アルブスＡＴＣＣ
    ５５４２５から単離された、請求項３２の加水分解を行
    うことができる酵素。
  55. 【請求項５５】 ノカルジオイデス・ルテウスＡＴＣＣ
    ５５４２６から単離された、請求項３２の加水分解を行
    うことができる酵素。
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