JPH0759590A - 抗トロンビンモノクローナル抗体 - Google Patents
抗トロンビンモノクローナル抗体Info
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- JPH0759590A JPH0759590A JP5229652A JP22965293A JPH0759590A JP H0759590 A JPH0759590 A JP H0759590A JP 5229652 A JP5229652 A JP 5229652A JP 22965293 A JP22965293 A JP 22965293A JP H0759590 A JPH0759590 A JP H0759590A
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- thrombin
- tat
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- monoclonal antibody
- antithrombin
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 トロンビン・アンチトロンビンIII複合体
（ＴＡＴ）を抗原として使用することにより新規抗トロ
ンビンモノクローナル抗体を作製する。 【効果】 ＴＡＴはもとより、トロンビン自体の迅速、
正確且つ簡便なイムノアッセイができる。
（ＴＡＴ）を抗原として使用することにより新規抗トロ
ンビンモノクローナル抗体を作製する。 【効果】 ＴＡＴはもとより、トロンビン自体の迅速、
正確且つ簡便なイムノアッセイができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、抗トロンビンモノク
ローナル抗体に関するものであり、これらのモノクロー
ナル抗体は血漿あるいは血清中のトロンビン・アンチト
ロンビンIII複合体の免疫定量法ならびにトロンビンの
免疫定量法等イムノアッセイの試薬として有用である。
ローナル抗体に関するものであり、これらのモノクロー
ナル抗体は血漿あるいは血清中のトロンビン・アンチト
ロンビンIII複合体の免疫定量法ならびにトロンビンの
免疫定量法等イムノアッセイの試薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】トロンビンは、血液凝固系において重要
な役割を果しており、各種疾病の診断や治療において、
その測定が重要視されている。そしてこのような生体成
分の測定にはイムノアッセイが多用されており、正確な
測定のためには抗トロンビンモノクローナル抗体の作製
が是非とも必要である。
な役割を果しており、各種疾病の診断や治療において、
その測定が重要視されている。そしてこのような生体成
分の測定にはイムノアッセイが多用されており、正確な
測定のためには抗トロンビンモノクローナル抗体の作製
が是非とも必要である。
【０００３】しかしながら、トロンビンは、免疫原性が
弱いだけでなく不安定な物質であるため、これを抗原と
して用いモノクローナル抗体を作成することはできず、
業界での強いニーズがあるにもかかわらず、モノクロー
ナル抗体を用いるトロンビンのイムノアッセイに成功し
た例は知られていない。また、トロンビン・アンチトロ
ンビンIII複合体複合体についても同様である。
弱いだけでなく不安定な物質であるため、これを抗原と
して用いモノクローナル抗体を作成することはできず、
業界での強いニーズがあるにもかかわらず、モノクロー
ナル抗体を用いるトロンビンのイムノアッセイに成功し
た例は知られていない。また、トロンビン・アンチトロ
ンビンIII複合体複合体についても同様である。
【０００４】本発明は、このような技術水準のもとでな
されたものであるが、上記のように、トロンビン・アン
チトロンビンIII複合体ならびにトロンビンの免疫定量
法等に用いることのできる、抗トロンビンモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマは従来存在せず、本発
明において始めて得られたものである。
されたものであるが、上記のように、トロンビン・アン
チトロンビンIII複合体ならびにトロンビンの免疫定量
法等に用いることのできる、抗トロンビンモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマは従来存在せず、本発
明において始めて得られたものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする問題】血液凝固機序の始動、
活性化によって少量の循環プロトロンビンがトロンビン
に変換されるが、トロンビンは急速にアンチトロンビン
III（以下ＡＴIIIと称することもある）と１対１のモル
比で複合体を形成する。
活性化によって少量の循環プロトロンビンがトロンビン
に変換されるが、トロンビンは急速にアンチトロンビン
III（以下ＡＴIIIと称することもある）と１対１のモル
比で複合体を形成する。
【０００６】このトロンビン・アンチトロンビン複合体
（以下ＴＡＴと称することもある）の量を測定すること
によって、循環血の凝固の動態の一端を知り得るものと
推測され、患者の凝固面からの病態解明、血栓形成ある
いは、汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）への進展など
を早期に予知することが可能である。
（以下ＴＡＴと称することもある）の量を測定すること
によって、循環血の凝固の動態の一端を知り得るものと
推測され、患者の凝固面からの病態解明、血栓形成ある
いは、汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）への進展など
を早期に予知することが可能である。
【０００７】一般に使用されているＴＡＴの免疫定量キ
ットは固相化抗体に抗トロンビンポリクローナル抗体を
用いることによって、血漿中のプロトロンビンによる交
差反応を回避しているが、ポリクローナル抗体であるた
め、抗体の特異性及び反応性の一定化、量の安定確保、
プロトロンビンとの交差性回避のための吸収操作の必要
などといった問題点がある。そこで我々はトロンビンを
特異的に認識するモノクローナル抗体の作製を試みた。
ットは固相化抗体に抗トロンビンポリクローナル抗体を
用いることによって、血漿中のプロトロンビンによる交
差反応を回避しているが、ポリクローナル抗体であるた
め、抗体の特異性及び反応性の一定化、量の安定確保、
プロトロンビンとの交差性回避のための吸収操作の必要
などといった問題点がある。そこで我々はトロンビンを
特異的に認識するモノクローナル抗体の作製を試みた。
【０００８】しかしながら、トロンビンは、免疫原性が
弱く、また、それ自体、強力なプロテアーゼであり、免
疫した動物血中の蛋白質を分解したり、自己消化を行う
といった極めて不安定な物質であるので、トロンビンを
免疫原として使用するのには問題がある。したがって、
トロンビンを用いてモノクローナル抗体を効率的に作製
することはできない。
弱く、また、それ自体、強力なプロテアーゼであり、免
疫した動物血中の蛋白質を分解したり、自己消化を行う
といった極めて不安定な物質であるので、トロンビンを
免疫原として使用するのには問題がある。したがって、
トロンビンを用いてモノクローナル抗体を効率的に作製
することはできない。
【０００９】
【問題点を解決するための手段】そこで本発明者らは、
発想を転換して、トロンビン自体を免疫原とするのでは
なく、トロンビンをＡＴIIIと反応させて得たＴＡＴを
免疫原としたところ、プロテアーゼ活性が阻害されてい
るのみでなく、全く予期せざることに、抗トロンビンモ
ノクローナル抗体が得られるだけではなく、得られたモ
ノクローナル抗体を使用すれば、ＴＡＴはもとよりトロ
ンビンのイムノアッセイも可能であるというきわめて有
用な新しい知見を得た。
発想を転換して、トロンビン自体を免疫原とするのでは
なく、トロンビンをＡＴIIIと反応させて得たＴＡＴを
免疫原としたところ、プロテアーゼ活性が阻害されてい
るのみでなく、全く予期せざることに、抗トロンビンモ
ノクローナル抗体が得られるだけではなく、得られたモ
ノクローナル抗体を使用すれば、ＴＡＴはもとよりトロ
ンビンのイムノアッセイも可能であるというきわめて有
用な新しい知見を得た。
【００１０】本発明は、この新知見を基礎とし、更に研
究の結果遂に完成されたものである。以下、本発明につ
いて詳しく説明する。
究の結果遂に完成されたものである。以下、本発明につ
いて詳しく説明する。
【００１１】本発明において抗トロンビンモノクローナ
ル抗体を作製するに当り、モノクローナル抗体の作製方
法それ自体は常法によればよいが、本発明の大きな特徴
のひとつは、抗原としてＴＡＴを選択使用する点であ
る。本発明においては、ＴＡＴを抗原として用いたこと
により、はじめて抗トロンビンモノクローナル抗体の作
製に成功したものであり、したがって該モノクローナル
抗体自体は新規であるし、また、それを産生するハイブ
リドーマも新規である。そしてこのモノクローナル抗体
を使用することにより、ＴＡＴはもとよりトロンビンの
迅速且つ正確、簡便なイムノアッセイがはじめて可能と
なったのである。以下、具体的に本発明を順次説明して
いく。
ル抗体を作製するに当り、モノクローナル抗体の作製方
法それ自体は常法によればよいが、本発明の大きな特徴
のひとつは、抗原としてＴＡＴを選択使用する点であ
る。本発明においては、ＴＡＴを抗原として用いたこと
により、はじめて抗トロンビンモノクローナル抗体の作
製に成功したものであり、したがって該モノクローナル
抗体自体は新規であるし、また、それを産生するハイブ
リドーマも新規である。そしてこのモノクローナル抗体
を使用することにより、ＴＡＴはもとよりトロンビンの
迅速且つ正確、簡便なイムノアッセイがはじめて可能と
なったのである。以下、具体的に本発明を順次説明して
いく。
【００１２】Ａ．抗原の調製 血漿から精製したプロトロンビンをＥｃｈｉｓ ｃａｒ
ｉｎａｔｕｓ ｖｅｎｏｍ、またはＦａｃｔｏｒ Ｖ
ａ、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、ホスホリピドにて活性化し
て、トロンビンとし、血漿から精製したＡＴIIIと反応
させて、ＴＡＴを作製する。ＣＭセファロース ＣＬ−
６Ｂカラム（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｔ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ９５２（１９８８）３７−４
７）及び、抗ＡＴIII抗体固定化カラムによって精製す
る。なお血清及び血漿から抗トロンビン抗体固定化カラ
ムまたは、抗ＴＡＴ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ抗体固定化
カラム等を用いて、ＴＡＴを精製することも可能であ
る。
ｉｎａｔｕｓ ｖｅｎｏｍ、またはＦａｃｔｏｒ Ｖ
ａ、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、ホスホリピドにて活性化し
て、トロンビンとし、血漿から精製したＡＴIIIと反応
させて、ＴＡＴを作製する。ＣＭセファロース ＣＬ−
６Ｂカラム（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｔ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ９５２（１９８８）３７−４
７）及び、抗ＡＴIII抗体固定化カラムによって精製す
る。なお血清及び血漿から抗トロンビン抗体固定化カラ
ムまたは、抗ＴＡＴ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ抗体固定化
カラム等を用いて、ＴＡＴを精製することも可能であ
る。
【００１３】Ｂ．ＴＡＴによるマウスの免疫 雄ＢＡＬＢ／ｃマウスを通常用いるが、他の系のマウス
を使用する事もできる。ＴＡＴの免疫はある間隔で、マ
ウスの腹腔、皮下、あるいは静脈に、血清中の抗体価の
上昇が明らかに認められるまで続け、最終免疫の数日後
に、細胞融合のために脾臓を無菌的に摘出する。
を使用する事もできる。ＴＡＴの免疫はある間隔で、マ
ウスの腹腔、皮下、あるいは静脈に、血清中の抗体価の
上昇が明らかに認められるまで続け、最終免疫の数日後
に、細胞融合のために脾臓を無菌的に摘出する。
【００１４】Ｃ．ハイブリドーマの作製 脾臓を無菌的に摘出し、脾細胞を溶出させ、マウス骨髄
腫細胞と適当な細胞融合促進剤の使用により、細胞を融
合させる。細胞融合に用いる骨髄腫細胞はＰ３−Ａｇ８
−γ、ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−
Ｕ１、ＮＳＩ−Ａｇ４／１、Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．
３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ
１．７、Ｓ１９４／５ＸＸ０．ＢＵ．１等が用いられ
る。好ましい細胞融合促進剤としては、例えば平均分子
量が１０００〜６０００のポリエチレングリコールなど
が挙げられる。また、電気パルスによる融合も可能であ
る。
腫細胞と適当な細胞融合促進剤の使用により、細胞を融
合させる。細胞融合に用いる骨髄腫細胞はＰ３−Ａｇ８
−γ、ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−
Ｕ１、ＮＳＩ−Ａｇ４／１、Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．
３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ
１．７、Ｓ１９４／５ＸＸ０．ＢＵ．１等が用いられ
る。好ましい細胞融合促進剤としては、例えば平均分子
量が１０００〜６０００のポリエチレングリコールなど
が挙げられる。また、電気パルスによる融合も可能であ
る。
【００１５】Ｄ．ハイブリドーマの選択 細胞融合に使用する骨髄腫細胞は、８−アザグアニン耐
性株でヌクレオチド生合成のサルベージ経路に必要なヒ
ポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェ
ラーゼを欠くため、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジンを含む培地）中ではヌクレオチド
の合成ができず、生き残れない。よって細胞融合を行っ
た後、ＨＡＴ培地にて１０〜１４日間培養することによ
り、脾細胞と骨髄腫が融合したハイブリドーマのみを選
択することができる。
性株でヌクレオチド生合成のサルベージ経路に必要なヒ
ポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェ
ラーゼを欠くため、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジンを含む培地）中ではヌクレオチド
の合成ができず、生き残れない。よって細胞融合を行っ
た後、ＨＡＴ培地にて１０〜１４日間培養することによ
り、脾細胞と骨髄腫が融合したハイブリドーマのみを選
択することができる。
【００１６】Ｅ．抗トロンビンモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマの樹立 細胞融合後、１０〜１４日目の培養上清を採取し、ＥＬ
ＩＳＡ法にて、精製トロンビン、ＴＡＴ、ＡＴIII、プ
ロトロンビンへの反応性の評価を行い、その結果、トロ
ンビンとの反応が認められたｗｅｌｌの細胞をＨＴ培地
（ヒポキサンチン、チミジンを含む培地）にて培養し、
スケールアップをはかり、非免疫マウス脾細胞をフィー
ダー細胞に用いた限界希釈法により、クローニングを行
う。クローニング後、ＥＬＩＳＡ法によって再度スクリ
ーニングを行い、抗体産生能が高く、増殖の良い、しか
も安定なクローンを選択し、抗トロンビン特異抗体産生
ハイブリドーマを得、スケールアップ後、細胞の凍結保
存を行う。
ハイブリドーマの樹立 細胞融合後、１０〜１４日目の培養上清を採取し、ＥＬ
ＩＳＡ法にて、精製トロンビン、ＴＡＴ、ＡＴIII、プ
ロトロンビンへの反応性の評価を行い、その結果、トロ
ンビンとの反応が認められたｗｅｌｌの細胞をＨＴ培地
（ヒポキサンチン、チミジンを含む培地）にて培養し、
スケールアップをはかり、非免疫マウス脾細胞をフィー
ダー細胞に用いた限界希釈法により、クローニングを行
う。クローニング後、ＥＬＩＳＡ法によって再度スクリ
ーニングを行い、抗体産生能が高く、増殖の良い、しか
も安定なクローンを選択し、抗トロンビン特異抗体産生
ハイブリドーマを得、スケールアップ後、細胞の凍結保
存を行う。
【００１７】Ｆ．モノクローナル抗体の製造法 モノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマを血清添
加培地ならびに無血清培地にて培養するイン・ビトロ
法、あるいはハイブリドーマをマウス腹腔に移植して、
腹水を採取する、イン・ビボ法にて行い、硫安塩析、イ
オン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩カラムクロ
マトグラティー、プロテインＡカラムクロマトグラフィ
ー、抗原固定化カラムクロマトグラフィー等によって精
製できる。
加培地ならびに無血清培地にて培養するイン・ビトロ
法、あるいはハイブリドーマをマウス腹腔に移植して、
腹水を採取する、イン・ビボ法にて行い、硫安塩析、イ
オン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩カラムクロ
マトグラティー、プロテインＡカラムクロマトグラフィ
ー、抗原固定化カラムクロマトグラフィー等によって精
製できる。
【００１８】Ｇ．抗トロンビンモノクローナル抗体を用
いた、ＴＡＴ及び、トロンビンの免疫定量 免疫定量法としては、免疫比濁法、ラテックス凝集法、
１ステップサンドイッチＥＩＡ、２ステップサンドイッ
チＥＩＡ、１ステップサンドイッチＲＩＡ、２ステップ
サンドイッチＲＩＡなどがある。
いた、ＴＡＴ及び、トロンビンの免疫定量 免疫定量法としては、免疫比濁法、ラテックス凝集法、
１ステップサンドイッチＥＩＡ、２ステップサンドイッ
チＥＩＡ、１ステップサンドイッチＲＩＡ、２ステップ
サンドイッチＲＩＡなどがある。
【００１９】標識化抗体の標識物質としては、酵素、蛍
光物質、発光物質、放射性物質などがあげられる。酵素
としてはパーオキシダーゼ、グルコース・オキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、ルシフェラーゼなど、蛍光物質はフルオレッセイ
ンイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチ
オシアネートなど、発光物質はルミナール、アクリジニ
ウムエステル、ルシフェリンなど、また、放射性物質と
しては125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈなどを使用することが
できるが、これらの例示したものに限らず、免疫測定法
に使用し得るものであれば、他の物でも使用できる。
光物質、発光物質、放射性物質などがあげられる。酵素
としてはパーオキシダーゼ、グルコース・オキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、ルシフェラーゼなど、蛍光物質はフルオレッセイ
ンイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチ
オシアネートなど、発光物質はルミナール、アクリジニ
ウムエステル、ルシフェリンなど、また、放射性物質と
しては125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈなどを使用することが
できるが、これらの例示したものに限らず、免疫測定法
に使用し得るものであれば、他の物でも使用できる。
【００２０】これらのなかでも標識物質としては酵素が
好ましい、これらの標識物質と抗体の結合は抗体をその
ままあるいは、Ｆ（ａｂ-）2、Ｆａｂ-として、グルタ
ルアルデヒド法、過ヨーソ酸法、マレイミド法などの方
法によって行うことができる。
好ましい、これらの標識物質と抗体の結合は抗体をその
ままあるいは、Ｆ（ａｂ-）2、Ｆａｂ-として、グルタ
ルアルデヒド法、過ヨーソ酸法、マレイミド法などの方
法によって行うことができる。
【００２１】固定化抗体を固定する不溶性担体として
は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、弗素樹脂、
架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、そ
の他、紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組み
合わせなどが挙げられる。
は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、弗素樹脂、
架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、そ
の他、紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組み
合わせなどが挙げられる。
【００２２】また不溶性担体の形状としては、例えばト
レイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、チ
ューブなどの種々の形状が考えられる。
レイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、チ
ューブなどの種々の形状が考えられる。
【００２３】
【実施例】次にこの発明を実施例により詳細に説明す
る。
る。
【００２４】
【実施例１】 ＴＡＴの調製 ＡＴIII（ノイアート、ミドリ十字社）５８．９５ｍｇ
（３．９３ｍｇ／ｍＬ、１５ｍＬ）とトロンビン（トロ
ンビン−ミドリ、ミドリ十字社）３７，５００単位
（２，５００単位／ｍＬ、１５ｍＬ）を０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４の
条件で混合し（モル比２：１）、３７℃で１５分間反応
させてＴＡＴを形成させた。
（３．９３ｍｇ／ｍＬ、１５ｍＬ）とトロンビン（トロ
ンビン−ミドリ、ミドリ十字社）３７，５００単位
（２，５００単位／ｍＬ、１５ｍＬ）を０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４の
条件で混合し（モル比２：１）、３７℃で１５分間反応
させてＴＡＴを形成させた。
【００２５】この混合液を前もって０．０１Ｍ リン酸
緩衝液ｐＨ６．４で平衡化した、ＣＭセファロース Ｃ
Ｌ−６Ｂカラム（カラム容量４００ｍＬ）にチャージし
た。
緩衝液ｐＨ６．４で平衡化した、ＣＭセファロース Ｃ
Ｌ−６Ｂカラム（カラム容量４００ｍＬ）にチャージし
た。
【００２６】このカラムを上記緩衝液２Ｌで洗浄後、
０．３Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ
６．４までの直線濃度勾配（合計４Ｌ）によって溶離し
た。
０．３Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ
６．４までの直線濃度勾配（合計４Ｌ）によって溶離し
た。
【００２７】この溶出液の各フラクションのＴＡＴ濃
度、トロンビン活性、ＡＴIII濃度を市販キットにて測
定し、ＴＡＴのみを含む分画を集めた。
度、トロンビン活性、ＡＴIII濃度を市販キットにて測
定し、ＴＡＴのみを含む分画を集めた。
【００２８】上記操作を２度繰り返し、次ぎに、０．１
５Ｍ ＮａＣｌを及び０．１％ ＮａＮ3を含む０．１
Ｍ トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化した、アフィ
ニティー精製済ヤギ抗ＡＴIIIポリクローナル抗体固定
化ホルミルセルロファインカラム（カラム容量１４ｍ
Ｌ）にチャージする。このカラムを７０ｍＬの上記緩衝
液で洗浄し、０．３Ｍ 塩化カリウム塩酸緩衝液ｐＨ
２．３（１４０ｍＬ）にてＴＡＴを溶出し、１ｍＭベン
ズアミジン塩酸塩、０．１％ ＮａＮ3、０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む、０．０１Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７．２
にバッファー交換後、限外濾過法によって濃縮し、約５
ｍｇの精製ＴＡＴを得た。
５Ｍ ＮａＣｌを及び０．１％ ＮａＮ3を含む０．１
Ｍ トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化した、アフィ
ニティー精製済ヤギ抗ＡＴIIIポリクローナル抗体固定
化ホルミルセルロファインカラム（カラム容量１４ｍ
Ｌ）にチャージする。このカラムを７０ｍＬの上記緩衝
液で洗浄し、０．３Ｍ 塩化カリウム塩酸緩衝液ｐＨ
２．３（１４０ｍＬ）にてＴＡＴを溶出し、１ｍＭベン
ズアミジン塩酸塩、０．１％ ＮａＮ3、０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む、０．０１Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７．２
にバッファー交換後、限外濾過法によって濃縮し、約５
ｍｇの精製ＴＡＴを得た。
【００２９】このようにして得たＴＡＴは、−８０℃に
保存し、免疫原またはＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＩＡ
用の抗原として使用した。
保存し、免疫原またはＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＩＡ
用の抗原として使用した。
【００３０】
【実施例２】 ＴＡＴ抗原の免疫及びハイブリドーマの作製 （ａ）ＴＡＴ抗原の免疫 上記ＴＡＴ ５０μｇをフロインドの完全アジュバント
のエマルジョン（５００μｌ）のかたちでマウス腹腔内
に投与することにより免疫を行った。（一次免疫）
のエマルジョン（５００μｌ）のかたちでマウス腹腔内
に投与することにより免疫を行った。（一次免疫）
【００３１】２週間後に、同量のＴＡＴをフロインドの
不完全アジュバントのエマルジョンのかたちでマウス皮
下に投与することにより免疫を行った。（二次免疫）
不完全アジュバントのエマルジョンのかたちでマウス皮
下に投与することにより免疫を行った。（二次免疫）
【００３２】さらに、約１か月後細胞融合の数日前に１
〜２回同量のＴＡＴをダルベコ・リン酸緩衝食塩水のか
たちで腹腔内に投与することにより免疫を行った。（最
終免疫）
〜２回同量のＴＡＴをダルベコ・リン酸緩衝食塩水のか
たちで腹腔内に投与することにより免疫を行った。（最
終免疫）
【００３３】（ｂ）細胞融合 ＴＡＴにて免疫した、マウスから脾臓細胞を無菌的に摘
出し、１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０改
変培地（基礎培地に１４０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン、
５５ｍｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、１０ｍｇ／Ｌ
Ｌ−システイン、３ｍｇ／Ｌ アスコルビン酸、３ｍｇ
／Ｌ 塩化コリン、３ｍｇ／Ｌ グルタチオン、５０ｍ
ｇ／Ｌ 硫酸ストレプトマイシン、２０００００単位／
Ｌ ペニシリンＧカリウムを添加）中で眼科用はさみに
て細切し、脾細胞を溶出させ、その脾細胞懸濁液をナイ
ロンメッシュに通し、１０００ｒｐｍ、５分間遠心して
脾細胞を集め、さらに培地にて２回遠心洗浄後、培地に
再懸濁して生細胞数を数えた。
出し、１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０改
変培地（基礎培地に１４０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン、
５５ｍｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、１０ｍｇ／Ｌ
Ｌ−システイン、３ｍｇ／Ｌ アスコルビン酸、３ｍｇ
／Ｌ 塩化コリン、３ｍｇ／Ｌ グルタチオン、５０ｍ
ｇ／Ｌ 硫酸ストレプトマイシン、２０００００単位／
Ｌ ペニシリンＧカリウムを添加）中で眼科用はさみに
て細切し、脾細胞を溶出させ、その脾細胞懸濁液をナイ
ロンメッシュに通し、１０００ｒｐｍ、５分間遠心して
脾細胞を集め、さらに培地にて２回遠心洗浄後、培地に
再懸濁して生細胞数を数えた。
【００３４】予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミ
エローマ）Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３ ３×１０7個
に１５×１０7個の上記脾細胞を加え、ＲＰＭＩ １６
４０改変培地中でよく混合し、２回遠心洗浄を行った。
エローマ）Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３ ３×１０7個
に１５×１０7個の上記脾細胞を加え、ＲＰＭＩ １６
４０改変培地中でよく混合し、２回遠心洗浄を行った。
【００３５】次ぎに上清を吸引し、３７℃に保温してお
いた５０％ポリエチレングリコール４０００溶液１ｍＬ
を１分間かけてゆっくり混ぜながら入れ、さらに１分間
ゆっくりと混ぜ、次に５分間かけてゆっくりとＲＰＭＩ
１６４０改変培地１０ｍＬを添加しながら混ぜ、１０
００ｒｐｍ、５分間遠心して融合細胞を集める。
いた５０％ポリエチレングリコール４０００溶液１ｍＬ
を１分間かけてゆっくり混ぜながら入れ、さらに１分間
ゆっくりと混ぜ、次に５分間かけてゆっくりとＲＰＭＩ
１６４０改変培地１０ｍＬを添加しながら混ぜ、１０
００ｒｐｍ、５分間遠心して融合細胞を集める。
【００３６】１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＲＰ
ＭＩ １６４０改変培地にヒポキサンチン１×１０-
4Ｍ、チミジン１．６×１０-5Ｍを添加したもの）５０
ｍＬに懸濁。
ＭＩ １６４０改変培地にヒポキサンチン１×１０-
4Ｍ、チミジン１．６×１０-5Ｍを添加したもの）５０
ｍＬに懸濁。
【００３７】前日に１×１０6ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ
／ｗｅｌｌづつフィーダー細胞（非免疫マウス脾細胞）
を分注し、３７℃、３％炭酸ガスの条件で培養してい
た、４８ｗｅｌｌプレートに上記融合細胞を０．５ｍＬ
／ｗｅｌｌづつ分注し３７℃、３％炭酸ガスの条件で培
養。
／ｗｅｌｌづつフィーダー細胞（非免疫マウス脾細胞）
を分注し、３７℃、３％炭酸ガスの条件で培養してい
た、４８ｗｅｌｌプレートに上記融合細胞を０．５ｍＬ
／ｗｅｌｌづつ分注し３７℃、３％炭酸ガスの条件で培
養。
【００３８】１８時間後に培養液をＨＡＴ培地（ＨＴ培
地にアミノプテリン１．６３×１０-7Ｍを添加したも
の）に半量交換し、ついで適時に新しいＨＡＴ培地に半
量交換していき、ＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドー
マを選択した。
地にアミノプテリン１．６３×１０-7Ｍを添加したも
の）に半量交換し、ついで適時に新しいＨＡＴ培地に半
量交換していき、ＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドー
マを選択した。
【００３９】（ｃ）抗トロンビンモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマの樹立 細胞融合後１０〜１４日目の培養上清を採取し、ＥＬＩ
ＳＡ法にて精製トロンビン（エンザイム・リサーチ
社）、ＴＡＴ、ＡＴIII（ミドリ十字社）、プロトロン
ビン（エンザイム・リサーチ社）への反応性の評価を行
った。
生ハイブリドーマの樹立 細胞融合後１０〜１４日目の培養上清を採取し、ＥＬＩ
ＳＡ法にて精製トロンビン（エンザイム・リサーチ
社）、ＴＡＴ、ＡＴIII（ミドリ十字社）、プロトロン
ビン（エンザイム・リサーチ社）への反応性の評価を行
った。
【００４０】Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｍａ
ｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６（Ｎｕｎｃ社）に各種抗原を１μ
ｇ／ｍＬ、１００μＬ／ｗｅｌｌづつ分注、４℃、一晩
静置した。
ｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６（Ｎｕｎｃ社）に各種抗原を１μ
ｇ／ｍＬ、１００μＬ／ｗｅｌｌづつ分注、４℃、一晩
静置した。
【００４１】次ぎに０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１
５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２にて３回
洗浄後、０．１％ ウシ血清アルブミン、０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２にて室温で、２
時間ブロッキングした。
５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２にて３回
洗浄後、０．１％ ウシ血清アルブミン、０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２にて室温で、２
時間ブロッキングした。
【００４２】３回上記洗浄液にて洗浄後、各ｗｅｌｌに
培養上清１００μＬを添加して、室温にて２時間反応さ
せた。
培養上清１００μＬを添加して、室温にて２時間反応さ
せた。
【００４３】上記洗浄液にて６回洗浄後、洗浄液にて
１，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗
マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（生化学工業社）を各ｗｅ
ｌｌに１００μＬづつ添加。室温にて１時間反応後、上
記洗浄液にて６回洗浄し、基質液（１．０４ｍｇ／ｍＬ
オルトフェニレンジアミン、０．００９％ 過酸化水
素水、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸緩
衝液ｐＨ６．０）を各ｗｅｌｌに１００μＬづつ添加
し、室温にて７分反応後、４Ｎ ＨＣｌを１００μＬづ
つ添加して、反応を停止させ、プレートリーダーにて４
９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
１，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗
マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（生化学工業社）を各ｗｅ
ｌｌに１００μＬづつ添加。室温にて１時間反応後、上
記洗浄液にて６回洗浄し、基質液（１．０４ｍｇ／ｍＬ
オルトフェニレンジアミン、０．００９％ 過酸化水
素水、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸緩
衝液ｐＨ６．０）を各ｗｅｌｌに１００μＬづつ添加
し、室温にて７分反応後、４Ｎ ＨＣｌを１００μＬづ
つ添加して、反応を停止させ、プレートリーダーにて４
９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４４】その結果、トロンビンとの反応が認められ
たｗｅｌｌの細胞を１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地
にて培養し、スケールアップをはかり、非免疫マウス脾
細胞を用いた限界希釈法により、クローニングを行っ
た。
たｗｅｌｌの細胞を１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地
にて培養し、スケールアップをはかり、非免疫マウス脾
細胞を用いた限界希釈法により、クローニングを行っ
た。
【００４５】クローニング後、上記ＥＬＩＳＡ法によっ
て再度スクリーニングを行い、抗体産生能が高く、増殖
の良い、しかも安定なクローンを選択し、抗トロンビン
特異抗体産生ハイブリドーマ、ＨＴ−１、ＨＴ−２、Ｈ
Ｔ−３、ＨＴ−４を得、スケールアップ後、細胞の凍結
保存を行った。
て再度スクリーニングを行い、抗体産生能が高く、増殖
の良い、しかも安定なクローンを選択し、抗トロンビン
特異抗体産生ハイブリドーマ、ＨＴ−１、ＨＴ−２、Ｈ
Ｔ−３、ＨＴ−４を得、スケールアップ後、細胞の凍結
保存を行った。
【００４６】
【実施例３：モノクローナル抗体の製造】 （イン・ビトロ法）各ハイブリドーマを１５％ウシ胎児
血清を含むＲＰＭＩ １６４０改変培地にて培養して、
培養上清よりモノクローナル抗体を得ることは可能であ
るが、ウシ胎児血清中のＩｇＧ及びＴＡＴ、ＡＴIII、
プロトロンビンのコンタミンを回避するために、無血清
培地、今回はＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ
社）を用いた。
血清を含むＲＰＭＩ １６４０改変培地にて培養して、
培養上清よりモノクローナル抗体を得ることは可能であ
るが、ウシ胎児血清中のＩｇＧ及びＴＡＴ、ＡＴIII、
プロトロンビンのコンタミンを回避するために、無血清
培地、今回はＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ
社）を用いた。
【００４７】３７℃、５％ＣＯ2の条件で１週間培養
後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心して、培養上清を
得、硫酸アンモニウムを最終５０％飽和濃度になるよう
に攪拌しながら徐々に加え、４℃にて１時間静置後、１
２０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、沈殿物を得た。
後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心して、培養上清を
得、硫酸アンモニウムを最終５０％飽和濃度になるよう
に攪拌しながら徐々に加え、４℃にて１時間静置後、１
２０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、沈殿物を得た。
【００４８】沈殿物を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０
ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ７．２にて溶解し、５００倍量
の同バッファーにて透析した。
ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ７．２にて溶解し、５００倍量
の同バッファーにて透析した。
【００４９】この透析物を結合用バッファー（３Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む１．５Ｍ グリシン緩衝液ｐＨ９．０）と
等量混合し、結合用バッファーにて平衡化したプロティ
ンＡアガロースカラムにチャージした。そして１０倍量
の同バッファーにて洗浄後、５倍量の溶出バッファー
（０．１Ｍ クエン酸緩衝液ｐＨ３．０）にて溶出し、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ3を含む１０
ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ７．２にバッファー交換を行
い、精製モノクローナル抗体を得た。
ａＣｌを含む１．５Ｍ グリシン緩衝液ｐＨ９．０）と
等量混合し、結合用バッファーにて平衡化したプロティ
ンＡアガロースカラムにチャージした。そして１０倍量
の同バッファーにて洗浄後、５倍量の溶出バッファー
（０．１Ｍ クエン酸緩衝液ｐＨ３．０）にて溶出し、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ3を含む１０
ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ７．２にバッファー交換を行
い、精製モノクローナル抗体を得た。
【００５０】（イン・ビボ法）リタイアーのＢＡＬＢ／
ｃ系マウスの腹腔に１匹当たり、プリスタン（２，６，
１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬを
投与し、１４日目にイン・ビトロで増殖させたハイブリ
ドーマを１×１０7個細胞移植した。１０〜１４日後に
各ハイブリドーマにつき１匹のマウスから約３〜１０ｍ
Ｌの腹水が得られ、腹水中の抗体濃度は１〜２０ｍｇ／
ｍＬであった。腹水からのモノクローナル抗体の精製は
上記のイン・ビトロ精製法と同様の方法で行った。
ｃ系マウスの腹腔に１匹当たり、プリスタン（２，６，
１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬを
投与し、１４日目にイン・ビトロで増殖させたハイブリ
ドーマを１×１０7個細胞移植した。１０〜１４日後に
各ハイブリドーマにつき１匹のマウスから約３〜１０ｍ
Ｌの腹水が得られ、腹水中の抗体濃度は１〜２０ｍｇ／
ｍＬであった。腹水からのモノクローナル抗体の精製は
上記のイン・ビトロ精製法と同様の方法で行った。
【００５１】
【実施例４：モノクローナル抗体のタイピング】各ハイ
ブリドーマ培養上清を用い、Ｍｏｕｓｅ Ｔｙｐｅｒ
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）にてマウス免疫グロブリンのクラ
ス、サブクラスの同定を行った。結果を下記の表１に示
す。
ブリドーマ培養上清を用い、Ｍｏｕｓｅ Ｔｙｐｅｒ
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）にてマウス免疫グロブリンのクラ
ス、サブクラスの同定を行った。結果を下記の表１に示
す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
【実施例５：モノクローナル抗体の特異性テスト】腹水
から精製したモノクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ
法にて特異性テストを行った。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ
ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６（Ｎｕｎｃ社）
に各種精製抗原（トロンビン、ＴＡＴ、ＡＴＩＩＩ、プ
ロトロンビン）を１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ｗｅｌｌ
づつ分注、４℃、一晩静置した。次ぎに０．１％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液
ｐＨ７．２にて３回洗浄後、０．１％ ウシ血清アルブ
ミン、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ
７．２にて室温で、２時間ブロッキングした。３回上記
洗浄液にて洗浄後、各ｗｅｌｌにブロッキング溶液にて
段階希釈した精製モノクローナル抗体１００μＬを添加
して、３７℃、２時間反応させた。
から精製したモノクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ
法にて特異性テストを行った。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ
ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６（Ｎｕｎｃ社）
に各種精製抗原（トロンビン、ＴＡＴ、ＡＴＩＩＩ、プ
ロトロンビン）を１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ｗｅｌｌ
づつ分注、４℃、一晩静置した。次ぎに０．１％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液
ｐＨ７．２にて３回洗浄後、０．１％ ウシ血清アルブ
ミン、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ
７．２にて室温で、２時間ブロッキングした。３回上記
洗浄液にて洗浄後、各ｗｅｌｌにブロッキング溶液にて
段階希釈した精製モノクローナル抗体１００μＬを添加
して、３７℃、２時間反応させた。
【００５４】上記洗浄液にて６回洗浄後、洗浄液にて
１，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗
マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（生化学工業社）を各ｗｅ
ｌｌに１００μＬづつ添加。３７℃にて１時間反応後、
上記洗浄液にて６回洗浄し、基質液（１．０４ｍｇ／ｍ
Ｌ オルトフェニレンジアミン、０．００９％ 過酸化
水素水、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸
緩衝液ｐＨ６．０）を各ｗｅｌｌに１００μＬづつ添加
し、室温にて２０分反応後、４Ｎ ＨＣｌを１００μＬ
づつ添加して、プレートリーダーにて４９２ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。結果を下記の表２に示す。
１，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗
マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（生化学工業社）を各ｗｅ
ｌｌに１００μＬづつ添加。３７℃にて１時間反応後、
上記洗浄液にて６回洗浄し、基質液（１．０４ｍｇ／ｍ
Ｌ オルトフェニレンジアミン、０．００９％ 過酸化
水素水、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸
緩衝液ｐＨ６．０）を各ｗｅｌｌに１００μＬづつ添加
し、室温にて２０分反応後、４Ｎ ＨＣｌを１００μＬ
づつ添加して、プレートリーダーにて４９２ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。結果を下記の表２に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】
【実施例６：サンドイッチＥＩＡによるＴＡＴ濃度の測
定】精製ＴＡＴをヒト血漿に添加後、エンザイグノスト
ＴＡＴ（ベーリングベルケ社）にて再度ＴＡＴ濃度測定
を行ったものを検体に用いた。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ
ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６（Ｎｕｎｃ社）
に抗トロンビン抗体（ＴＨ−１）１０μｇ／ｍＬ、１０
０μＬ／ｗｅｌｌづつ分注、４℃、一晩静置した。次ぎ
に０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ ＮａＣｌを
含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２にて３回洗浄後、０．１％
ウシ血清アルブミン、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．２にて室温で、２時間ブロッキング
した。３回上記洗浄液にて洗浄後、各ｗｅｌｌに検体を
１００μＬを添加して、３７℃、２時間反応させた。
定】精製ＴＡＴをヒト血漿に添加後、エンザイグノスト
ＴＡＴ（ベーリングベルケ社）にて再度ＴＡＴ濃度測定
を行ったものを検体に用いた。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ
ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６（Ｎｕｎｃ社）
に抗トロンビン抗体（ＴＨ−１）１０μｇ／ｍＬ、１０
０μＬ／ｗｅｌｌづつ分注、４℃、一晩静置した。次ぎ
に０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ ＮａＣｌを
含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２にて３回洗浄後、０．１％
ウシ血清アルブミン、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．２にて室温で、２時間ブロッキング
した。３回上記洗浄液にて洗浄後、各ｗｅｌｌに検体を
１００μＬを添加して、３７℃、２時間反応させた。
【００５７】上記洗浄液にて６回洗浄後、洗浄液にて
１，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗
ＡＴIII抗体（ダコ社）を各ｗｅｌｌに１００μＬづつ
添加。３７℃にて１時間反応後、上記洗浄液にて６回洗
浄し、基質液（１．０４ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジ
アミン、０．００９％ 過酸化水素水、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ６．０）を各
ｗｅｌｌに１００μＬづつ添加し、室温にて３０分反応
後、４Ｎ ＨＣｌを１００μＬづつ添加して、プレート
リーダーにて４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
１，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗
ＡＴIII抗体（ダコ社）を各ｗｅｌｌに１００μＬづつ
添加。３７℃にて１時間反応後、上記洗浄液にて６回洗
浄し、基質液（１．０４ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジ
アミン、０．００９％ 過酸化水素水、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ６．０）を各
ｗｅｌｌに１００μＬづつ添加し、室温にて３０分反応
後、４Ｎ ＨＣｌを１００μＬづつ添加して、プレート
リーダーにて４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５８】結果を図１に示す。なおＡＴIII、プロト
ロンビン共に３００μｇ／ｍＬまでほとんど交差性は認
められなかった。
ロンビン共に３００μｇ／ｍＬまでほとんど交差性は認
められなかった。
【００５９】
【実施例７：サンドイッチＥＩＡによるトロンビン濃度
の測定】検体には精製トロンビン（エンザイム・リサー
チ社）を０．１％ ウシ血清アルブミン、０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２にて希釈して用
いた。
の測定】検体には精製トロンビン（エンザイム・リサー
チ社）を０．１％ ウシ血清アルブミン、０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２にて希釈して用
いた。
【００６０】エンザイグノストＴＡＴ（ベーリングベル
ケ社）のウサギ抗トロンビン抗体固定化チューブを用
い、各チューブに検体を２００μＬを添加して、３７
℃、２時間反応させた。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、
０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２に
て５回洗浄後、グルコースオキシダーゼ標識抗トロンビ
ンモノクローナル抗体（ＴＨ−２）１Ｕ／ｍＬを各ｗｅ
ｌｌに２００μＬづつ添加し、３７℃にて２時間反応
後、上記洗浄液にて５回洗浄し、基質液（０．０５５ｍ
ｇ／ｍＬ オルトジアニシジン、１６．７ｍｇ／ｍＬ
グルコース、３３μｇ／ｍＬ ペルオキシダーゼ、を含
む０．１Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７．０）を各ｗｅｌｌに
２００μＬづつ添加し、室温にて２時間反応後、４Ｎ
ＨＣｌを２００μＬづつ添加して、プレートリーダーに
て４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
ケ社）のウサギ抗トロンビン抗体固定化チューブを用
い、各チューブに検体を２００μＬを添加して、３７
℃、２時間反応させた。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、
０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液ｐＨ７．２に
て５回洗浄後、グルコースオキシダーゼ標識抗トロンビ
ンモノクローナル抗体（ＴＨ−２）１Ｕ／ｍＬを各ｗｅ
ｌｌに２００μＬづつ添加し、３７℃にて２時間反応
後、上記洗浄液にて５回洗浄し、基質液（０．０５５ｍ
ｇ／ｍＬ オルトジアニシジン、１６．７ｍｇ／ｍＬ
グルコース、３３μｇ／ｍＬ ペルオキシダーゼ、を含
む０．１Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７．０）を各ｗｅｌｌに
２００μＬづつ添加し、室温にて２時間反応後、４Ｎ
ＨＣｌを２００μＬづつ添加して、プレートリーダーに
て４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６１】結果を図２に示す。
【００６２】
【発明の効果】ＴＡＴを免疫原としてはじめて採用した
ことにより、抗トロンビンモノクローナル抗体の効率的
製造に成功した。しかもこの抗体は新規物質であり、そ
してこれを使用することにより、ＴＡＴはもとより、ト
ロンビン自体の定量、定性を含む広範なイムノアッセイ
も可能となった。
ことにより、抗トロンビンモノクローナル抗体の効率的
製造に成功した。しかもこの抗体は新規物質であり、そ
してこれを使用することにより、ＴＡＴはもとより、ト
ロンビン自体の定量、定性を含む広範なイムノアッセイ
も可能となった。
【図１】ＴＡＴ スタンダードカーブを示す。
【図２】トロンビン スタンダードカーブを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ Ｄ 33/573 Ｚ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】 トロンビン・アンチトロンビンIII複合
体で免疫した動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し
て得た、抗トロンビンモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマクローン。 - 【請求項２】 トロンビンとトロンビン・アンチトロン
ビンIII複合体に反応し、プロトロンビン及びアンチト
ロンビンIIIと反応しない抗原抗体反応特異性を有する
モノクローナル抗体。 - 【請求項３】 トロンビンと反応し、トロンビン・アン
チトロンビンIII複合体、プロトロンビン及びアンチト
ロンビンIIIと反応しない抗原抗体反応特異性を有する
モノクローナル抗体。 - 【請求項４】 請求項２又は請求項３に記載の抗トロン
ビンモノクローナル抗体を１種又は２種以上使用するこ
とを特徴とするトロンビン・アンチトロンビンIII複合
体の免疫分析法。 - 【請求項５】 請求項２又は請求項３に記載の抗トロン
ビンモノクローナル抗体を１種又は２種以上使用するこ
とを特徴とするトロンビンの免疫分析法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5229652A JPH0759590A (ja) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | 抗トロンビンモノクローナル抗体 |
| EP94306112A EP0640621A3 (en) | 1993-08-24 | 1994-08-18 | Anti-thrombin monoclonal antibody. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5229652A JPH0759590A (ja) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | 抗トロンビンモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0759590A true JPH0759590A (ja) | 1995-03-07 |
Family
ID=16895561
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5229652A Pending JPH0759590A (ja) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | 抗トロンビンモノクローナル抗体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0640621A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0759590A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017083410A (ja) * | 2015-10-30 | 2017-05-18 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 |
| CN107043423A (zh) * | 2016-02-05 | 2017-08-15 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 凝血酶抗体、其抗原结合片段及医药用途 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07238099A (ja) * | 1994-02-25 | 1995-09-12 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | モノクローナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定法 |
| CN116284417B (zh) * | 2023-02-09 | 2023-10-31 | 山东大学 | 一种凝血酶-抗凝血酶复合物抗体、制备方法及其应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0644876B2 (ja) * | 1985-12-13 | 1994-06-15 | 株式会社ヤトロン | 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法 |
| CA2137785A1 (en) * | 1993-04-15 | 1994-10-27 | Dade International Inc. | Immunoassay and test kit for thrombin-antithrombin iii complex |
-
1993
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-
1994
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017083410A (ja) * | 2015-10-30 | 2017-05-18 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | トロンビン・アンチトロンビン複合体の測定試薬及び測定方法 |
| CN107043423A (zh) * | 2016-02-05 | 2017-08-15 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 凝血酶抗体、其抗原结合片段及医药用途 |
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