JPH08500484A - クローニング及び／または配列ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 クローニング及び／または配列ベクター（１）が、自律増殖ベクター（２）に組込まれた少なくとも１つのヌクレオチドプロモータ配列（３）と、毒素として作用する融合たんぱくをコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列（４）とからなる。ヌクレオチド配列（４）は、いくつかの特別なクローニング部位からなる暗号ヌクレオチド配列（５）とたんぱく毒をコードしているヌクレオチド配列（６）とを融合して得られる。本発明のベクター宿主細胞も、開示の対象である。

Description

【発明の詳細な説明】 クローニング及び／または配列ベクター 発明の主題 本発明は組換えクローンの直接選択を可能にするクローニング及び／または配 列ベクターに係わる。 本発明はこのベクターによって形質転換される原核細胞、このベクターのため の原核宿主細胞、及び組換えクローンの選択及び配列を目的とするこのクローニ ング及び配列ベクターの利用に係わる。 公知技術及び発明の技術的背景 種々の特定クローニング部位を含むファージ（Ｍ１３系）及びプラスミド（ｐ ＵＣ系）クローニングベクターがメッシング等(Messinget al)(P.N.A.S USA,79, 3642-3646頁(1977))，ノランダ等(Norrander et al)（ジーン（Gene）,26,101-1 06頁(1983)）、及びヤーニッシュ−ペロン等(Yanisch-Perron et al)（ジーン（ Gene）,33,103-119頁(1985)）によってつくられた。 これらのベクターの多重クローニング部位(MCS-multiple cloning sites)はＬ ａｃＺ遺伝子の暗号列中に位置する。 組換えベクターを含む形質転換細胞と非組換えベクターを含む細胞との弁別は 、グロンボーン(Gronenborn)及びメッシング(Messing)が記述している“ブルー スクリーン”法を利用して達成される（インビトロにおける単鎖ＤＮＡのメチル 化による新規制限エンドヌクレアーゼ切断部位の導入，ネイチャー，272,375-33 7頁(1978);Methylation of single -stranded DNA in vitro introduces new restriction endonuclease cleavages sites,Nature,272,pp.375-377(1978))。 ただし、この“ブルースクリーン”法には、クローン選択方法(procedure for selecting the clones)ではなくてスクリーニング方法(screening procedure) （弁別）(discrimination))を利用することに不都合がある。 スクリーニングによる弁別は、クローン母集団の中から他のクローンとは異な る特徴（色）に基づいてクローンを識別するというものである。選択(selection )にはこの特徴を必要としない。というのは、この方法で単離されるのは組換え クローンだけだからである。 スクリーニング法は、組換えクローン（白色）と非組換えクローン（青色）の 色に基づく方法である。この色はＸ−ガラクトース（５−ブロモ−４−クロロ− ３−インドリル−β−ガラクトシド）の切断(cleavage)を防ぐマーカーβ−ガラ クトシダーゼの不活性に基づく。非組換えベクターを含む細胞コロニーは官能性 β−ガラクトシダーゼを生成させ、Ｘ−ガラクトース基質を加水分解することに よって青色を発生させる。一般にβ−ガラクトシダーゼにＤＮＡ断片を挿入する とＸ−ガラクトースの切断が防止される。組換えベクターを含む細胞が白色を呈 するのはこのためである。 また、この複雑な方法は極めて高価で、不安定な、使用し難い生成物である基 質Ｘ−ガラクトースを使用しなければならない。 他方、組換え菌株の直接選択（積極選択：positive selection）を可能にする 種々のクローニングベクターが学術文献に記載さ れている。 ピアス等(Pierce et al)等はデンプン液化バチルス(Bacillus amylolique-fac iens)から得られる致死遺伝子ｓａｃＢをバクテリオファージＰ１から誘導され たプラスミドに組込み、特定の大腸菌プロモータの制御下に置いたベクターを記 述している(Proc.Notl.Acad.Sci.,89巻,6号,1992,2056-2060頁)。 このベクターのプロモータは、いくつかの特定(specific)クローニング部位（ 制限酵素切断部位：cleavage site fora restriction enzyme）を有する部分を 含む。 遺伝子ｓａｃＢは大腸菌に対して有毒な生成物となるスクロースの加水分解に 触媒として関与するレバンスクラーゼを暗号化(encode)するから、組換えプラス ミドを組入れる突然変異体の直接選択はスクロースを含む培地上で行われる。ス クロースが存在しない場合でもレバンスクラーゼは有毒であるから、バクテリア の細胞質中に多数のプラスミドコピーを得たければレバンスクラーゼの合成を抑 制しなければならない。 ただし、特に多数のベクターコピーを必要とする場合、細胞毒性遺伝子を完全 に抑制することは不可能でないまでも困難である。 従って、細胞毒性遺伝子を抑制することが不可能であればプラスミド生成の段 階で細胞が死に、その結果、（不活性致死遺伝子によって特徴づけられる）突然 変異株に対して淘汰圧が作用する。 この場合、ｓａｃＢ遺伝子によって暗号化された酵素が宿主細胞を殺さないよ うにするためには、この遺伝子の発現を制御するＣＩリプレッサーをクローニン グベクターに組込む必要がある。 また、バクテリア培地はスクロースを含むことが多いから、この操作を行うた めにはスクロースを全く含まない培地を調製しなければならない。 ヘンリッヒ等(Henrich et al)等はバクテリオファージφＸ１７４から得られ るＥ遺伝子を含むベクターを記述しており（ジーン（Gene）,42巻,3号,1986,345 -349頁）、前記Ｅ遺伝子はＬａｃプロモータの制御下にプラスミドｐＵＨ８４に 組込まれる。 この場合、Ｅ遺伝子は６つの特定制限部位（Ｅ遺伝子列全体に位置する）を含 み、大腸菌の細胞を溶解するｇｐＥを暗号化する。この場合、制限部位の１つに 異種の組換え遺伝子が挿入されていれば積極選択が行われる。 ただし、ｇｐＥを暗号化するＥ遺伝子の列に位置する制限部位に外来遺伝子を 挿入すると、ｇｐＥを暗号化するＥ遺伝子に属する無用の列の部分も配列され、 増幅され、特徴づけられるから、外来遺伝子の配列及び／またはＰＣＲによるそ の増幅はさらに困難になる。 クーン等(Kuhn et al)等（ジーン（Gene）,42巻,3号,1986,253-263頁）は、分 裂させることでバクテリアのゲノムを殺す制限酵素を暗号化する大きい遺伝子を 含むベクターを記述しており、前記遺伝子はＬａｃＵＶ５プロモータの制御下に プラスミドｐＫＧ２に組込まれる。 公知のクローニングベクターには、プロモータを不活性化して宿主菌株の死を 招くキラー遺伝子の発現を防止するために、エピソーム形態のＬａｃＩ^qリプレ ッサーを有する宿主菌株中に維持されなければならないという不都合がある。 さらにまた、この菌株を利用してクローニングベクターのコ ピーを多数生成させようとすれば、このリプレッサーはベクターの細胞毒作用を 変化させる淘汰圧またはベクターのコピー発現及び宿主菌株の死を意味する“遺 伝子漏出(genetic leakage)”を防止するのには不適当であろう。 従って、公知文献のうち、操作し易く、かつ微生物によって工業的規模で生産 可能な、即ち、微生物によりこれを殺さずに多数のコピーとして生産可能な大き いヌクレオチド断片を組込むことのできるクローニングベクターを記述している ものは皆無である。 発明の目的 本発明の目的は、簡単にしかも比較的低コストで構成し、生産することができ 、上述した公知技術の不都合を伴なうことなく組換えクローンを直接選択するこ とを可能とする新規のクローニング及び／または配列ベクター、及びその宿主菌 株を提供することにある。 本発明の具体的な目的の１つは、組換えクローンの特定の選択を可能にするベ クターを得ることにある。 本発明の他の目的は、同じプライマーを利用して組換えクローン中で任意の外 来ＤＮＡ断片を（そのサイズに関係なく）配列、拡充及び／または特徴づけを可 能にするベクターを得ることにある。 本発明のさらに他の目的は、組換えクローンからこの外来ＤＮＡ断片を簡単に 抽出することも可能にするベクターを得ることにある。 本発明の目的の最後の１つは、前記ベクターの細胞毒作用を変化させるかまた は宿主菌株の死を招く淘汰圧を作用させること なく前記ベクターの多数のコピーを生成させることを可能にする前記ベクターの ための宿主菌株を得ることにある。 発明の特徴的要素 本発明は自律増殖ベクター(autonomously replicating vector)内に組込まれ た形で少なくとも１つのプロモータヌクレオチド配列と、毒物として作用する融 合たんぱくを暗号化する(encoding)少なくとも１つの暗号ヌクレオチド配列(cod ing mucleotide sequence)を含み、前記ヌクレオチド配列がいくつかの特定クロ ーニング部位を含む暗号ヌクレオチド配列とたんぱく毒を暗号化するヌクレオチ ド配列とを融合することによって得られる新規のクローニング及び／または配列 ベクターに係わる。 自律増殖ベクターは、組換えウィルスまたはｐＵＣプラスミドのような組換え プラスミドであることが好ましい。 プロモータヌクレオチド配列は、毒物として作用する融合たんぱくを暗号化す るヌクレオチド配列の発現を可能にするならいかなるプロモータであってもよい 。 このプロモータヌクレオチド配列は、Ｌａｃオペロンプロモータから成ること が好ましい。 本発明の好ましい実施例では、たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列に融 合するヌクレオチド配列の特定クローニング部位（ＭＣＳ）が本発明のベクター のヌクレオチド配列の残り部分には存在しない。 たんぱく毒を暗号化する遺伝子のヌクレオチド配列は、たんぱくＣｃｄＢを暗 号化する野性型遺伝子のヌクレオチド配列の全部または一部であることが有利で ある。 たんぱく毒を暗号化する遺伝子のヌクレオチド配列に制限酵素ＳｍａＩ切断部 位が存在しないことが好ましい。 本発明はまた、本発明のクローニングベクターで形質転換される原核細胞に係 わる。 本発明はまた、染色体Ｉ^q及び高い形質転換効率を有し、融合たんぱくの毒性 に対する耐性を授ける突然変異を有し、さらに／または融合たんぱくに対する抗 毒素であるたんぱくを暗号化する遺伝子を有する、本発明のベクターのための原 核宿主細胞に係わる。 本発明のベクターのための原核宿主細胞は、サブユニットＡを暗号化する遺伝 子、またはサブユニットＢを暗号化する遺伝子においてジャイレースの突然変異 を有し、融合たんぱくに対する耐性を授与し、さらに／または融合たんぱくに対 する抗毒素であるたんぱくＣｃｄＡを暗号化する遺伝子を有することが好ましい 。 原核細胞は、ジャイレースのＧｙｒＡポリペプチドのアミノ酸配列においてア ルギニン４６２をシステインに代えて融合たんぱくに対する耐性を授ける突然変 異を有する大腸菌細胞であることが好ましい。 この原核宿主細胞は、ＬａｃＩ^q突然変異をも有することが好ましい。 本発明は、本発明のベクターの断片、特に本発明のベクターに挿入される外来 ヌクレオチド断片を配列及び／または（例えばＰＣＲによって）拡充するための プライマーにも係わる。 これらのプライマーは、いくつかの特定クローニング部位を含む本発明のベク ターのヌクレオチド配列の両側に位置するヌクレオチド配列とハイブリット化す る(hybridize)１０ない し３０個のヌクレオチドの配列からなることが好ましい。 本発明は、組換えクローンの選択及び配列を目的とする本発明に従ったベクタ ーの利用にも係わる。 図面の簡単な説明 図１は、本発明のクローニングベクターの模式的説明図である。 図２は、遺伝子ｃｃｄＢの、たんぱくＣｃｄＢを暗号化するヌクレオチド配 列図である。 図３及び図４は、それぞれクローニングベクターｐＫＩＬ１８及びｐＫＩＬ １９の融合たんぱくを暗号化するヌクレオチド配列図である。これらの配列には 各種制限酵素に対する複数の特定切断部位を含むヌクレオチド配列が含まれる。 これらのクローニングベクターｐＫＩＬ１８及びｐＫＩＬ１９は、Ｆプラスミド の野性型ｃｃｄＢ遺伝子とプラスミドｐＵＣ１８との間、及びプラスミドｐＵＣ １９との間のインビトロ組換えによって得られた。 発明の好ましい実施例の説明 本発明では、クローニング及び／または配列ベクター１が自律増殖ベクター(a utonomously replicating vector)２に組込まれた所で少なくとも１つのプロモ ータヌクレオチド配列３と、毒素として作用する融合たんぱくを暗号化する(enc ode)少なくとも１つのヌクレオチド配列４を含み、複数の（多重の）特定クロー ニング部位（ＭＣＳ）を含む暗号ヌクレオチド配列(coding mucleotide sequenc e)５（またはポリリンカー）とたんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列（６） とを融合することによって前記ヌクレオチド配列４を得る。 自律増殖ベクター２とは、微生物に導入し、微生物中で組換え、及び／または 微生物中で増殖することができるウィルスやプラスミド（好ましくはＰＵＣ系組 換えプラスミド）のようなヌクレオチド構造を意味する。 図１は本発明のクローニングベクターを示す説明図であり、このベクターはノ ランダ等(Norrander et al)（オリゴデオキシヌクレオチド系突然変異誘発を利 用した改良型Ｍ１３ベクターの構造，ジーン,26,101-106頁(1983);Construction of improved M13 vectors using oligodeoxinucleotide-directed mutagenesis ,Gene,26,pp.101-106(1983)）及びヤーニッシュ−ペロン等(Yanisch-Perronet a l)（改良型Ｍ１３ ファージクローニングベクター及び宿主細胞：Ｍ１３ｍｐ１ ８及びｐＵＣ１９ベクターのヌクレオド配列，ジーン,33,103-119頁(1985);Impr oved M13 phage cloning vectors and host strains : nucleotidesequences of the M13mp18 and pUC19 vectors,Gene,33,pp.103-119(1985)）が報告している ｐＵＣ系（ｐＵ１８及びｐＵＣ１９）プラスミドから構成されている。 複数の（多重の）特定クローニング部位（ＭＣＳ）を含む暗号ヌクレオチド配 列５は、複数の制限酸素切断部位を含む短い暗号配列(coding sequence)（また はポリリンカー）を意味する。 本発明のベクターにポリリンカーが含まれていることの利点は、単一の短い配 列に異なるクローニング部位が存在することであり、これにより： ……同じプライマーを利用してこのベクターに挿入されるいかなるＤＮＡ断片 も迅速に配列し、増幅することが可能になる。 ……制限部位の近接効果に助けられてクローン化断片を迅速に抽出することが 可能になる。従って、公知技術とは異なり、この近接が本発明のベクターの他の 配列からの無用な断片の配列、増幅、特徴づけを回避する。 たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列６は、本来有毒で宿主細胞の１つま たは２つ以上の生活機能にとって特異な活性を示すたんぱくを暗号化するすべて の（野性型）ヌクレオチド構造を意味する。 たんぱく毒は、例えばたんぱくＣｃｄＢ及びＣｃｄＡのような解毒素または抗 毒素、たんぱくＫｉｄ及びそのアンタゴニストＫｉｓ、たんぱくＰｅｍＫ及びそ のアンタゴニストＰｅｍＩ、たんぱくＤｏｃ及びそのアンタゴニストＰｈｄ、た んぱくＨｏＫ及びそのアンタゴニストＳｏＫ、及びプラスミドを起源とする、ま たは起源としないその他の毒性分子の存在をも特徴とする。 この場合、たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列はたんぱくＣｃｄＢ（細 胞死の制御）を暗号化し、かつＦプラスミドのｃｃｄ部位（図２）から得られる 野性型遺伝子ｃｃｄＢから成る。 Ｆプラスミドのｃｃｄ部位は２つの野性型遺伝子ｃｃｄＡ及びｃｃｄＢを含み 、これら２つの遺伝子はＨ及びＧまたはｌｅｔＡ及びｌｅｔＤとも呼称され、そ れぞれ７２または１０１個のアミノ酸からなるたんぱくを暗号化する（ベックス 等、ミニ−Ｆ暗号化たんぱく；新規１０．５キロダルトンスピーシズの同定，EM BO J.2,1853-1861(1983);Bex et al、Mini-F encoded proteins;identification of a new 10.5 kilodalton species.EMBO J.2,1853-1861(1983)；三木等、大腸 菌における性因子Ｆによる細胞分裂の制御．Ｉ．４２．８４−４３．６Ｆセグメ ントによる宿主菌の細胞分裂とプラスミドＤＮＡの複製との関 連づけ，J.Mol.Bio.174,605-625(1984);Mikiet al、Control of cell division b y sex factorF in E.coli.I.The 42.84-43.6 F segment couples cell division of the host bacteria with replicationof plasmid DNA,J.Mol.Bio.,174,605- 625(1984)。 大腸菌においては、ＦプラスミドのＣｃｄＢたんぱくは細胞毒であり、その致 死作用はたんぱくＣｃｄＡによって中和される（カルイ等、Ｈａｍ２２、すなわ ち、宿主細胞によって致死的であり、ラムドイドプロファージのｒｅｃＡ依存性 の誘導を促進するミニ−Ｆ突然変異、EMBO J.2,1863-1868(1983):Karouiet al、H am22,a mini-F mutation which is lethal to host cell and promotes recA-de pendent inductionof lambdoid prophage.EMBO J.2.1863-1868(1983)；小倉及び 平賀、宿主細胞分裂をプラスミド増殖に関連づけるミニ−Ｆプラスミド遺伝子、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,4784-4788(1983):Ogura and Hiraga,Mini-F plasmi d gene that couple host celldivision to plasmid proliferation,Proc.Natl. Acad.Sci.USA,80,4784-4788(1983)；三木等、大腸菌における性因子Ｆによる細 胞分裂の制御、４２．８４−４３．６Ｆセグメント上におけるインヒビタたんぱ くとトリガたんぱくに対する遺伝子の同定、J.Mol.Bio.174,627-646(1984b):Mik i et al,Control of cell division by sex factor F in E.coli.Identificatio n of genes for inhibitor protein and trigger protein on the 42.84-43.6 F segment,J.Mol.Biol.174,627-646(1984b))。 たんぱくＣｃｄＢがその致死作用を行う分子メカニズムは解明されている；た んぱくＣｃｄＢはＤＮＡトポイソメラーゼIIに対して有毒性である。 II型のＤＮＡトポイソメラーゼは重要かつ遍在的な酵素であり、ＤＮＡへ一時 的に２本鎖切断を導入することによってＤＮＡのトポロジーを変える。切断−再 結合の過程でトポイソメラーゼIIはＤＮＡ基質とともに切断したＤＮＡの５′末 端に酵素が共有結合している中間複合体を形成する。トポイソメラーゼIIがＤＮ Ａと共有結合しているこの過渡的な中間生成物に“切断可能複合体(cleavable c omplex)”の名称が与えられている（ワン，ＤＮＡトポイソメラーゼ、Annu.Rev. Biochem.54,1165-97,1985;Wang,DNA topoisomerases.Annu.Rev,Biochem.54,665- 97,1985;マックスウェル及びジェラート、ＤＮＡトポイソメラーゼの機械作用的 側面、Advan.Protein Chem.38,69-107,1986;Maxwell & Gellert,Mechanistic as pects of DNA topoisomerases.Advan.Protein Chem,38,67-107,1986;リュウ、抗 腫瘍薬としてのＤＮＡトポイソメラーゼ毒素、Annu.Rev.Biochem.58.351-375,19 89;Liu,DNA topoisomerasepoisons as antitumor drugs,Annu.Rev.Biochem.58.3 51-375,1989）。 真核生物においても原核生物においても、切断可能なトポイソメラーゼII−Ｄ ＮＡ複合体は、ジャイレース（バクテリアのトポイソメラーゼII）に作用する“ キノロン”系抗生物質や噛乳類のトポイソメラーゼIIに作用する抗癌剤（アクリ ジン及びエピポドフィロトキシン(epipodophyllotoniins)）などのような強力な 治療剤のターゲットである。トポイソメラーゼ毒 の治療効果は切断可能な複合体を安定させるその能力と相関関係にある。 ＤＮＡトポイソメラーゼIIはあらゆる生体に必須の酵素であり、種の進化にお いて極めて安定である。即ち、ＣｃｄＢたんぱくは広範囲の原核生物にとって潜 在的に細胞毒性である作用を有する。 野性型ｃｃｄＢ遺伝子は、サイズが小さいからプラスミドのサイズを過度に大 きくすることなくプラスミドに挿入することができ、その結果、プラスミドが外 来ＤＮＡの大きい断片を含むことができる。また、サイズが小さいだけに、Ｆプ ラスミドの野性型ｃｃｄＢ遺伝子は極めて少ない制限部位を含む；従って、加え られる多重クローニング部位（ＭＣＳ）の特定性(uniqueness)を簡単に維持する ことができる。 意外にも、発明者等はたんぱくＣｃｄＢを暗号化するヌクレオチド配列６と複 数の（多重の）特定クローニング部位（ＭＣＳ）を含む暗号ヌクレオチド配列（ ポリリンカー５）との同相融合(in-phase fusion)の結果、毒として作用する融 合たんぱくを暗号化し、従って、組換えプラスミドを直接選択（キラー選択：ki ller selection）するためのベクターの生成を可能にするヌクレオチド配列４が 得られるとの所見を得た。 得られたプラスミドは、ｌａｃプロモータに関して両方向に二重消化制限断片 (doubly digested restriction fragments)をクローン化することを可能にする 。特定クローニング部位の１つに制限断片が挿入されると遺伝子融合の遺伝子情 報が遮断され、その結果、非官能性の遺伝子融合生成物が合成される。挿入によ る遺伝子融合不活性化は常に終了コドンの導入時、または読取りフレームの変更 時に行われねばならない。 このような手つかずのクローニングベクターを有する細胞は 官能性の有毒融合たんぱくを形成し、死滅する。 遺伝子融合の特定クローニング部位の１つに外来ＤＮＡ断片が挿入されると毒 の生成が妨げられる。 組換えベクターを有する細胞は成育可能であるが、手つかずのベクターを有す る細胞は生育できない。固形培地上での簡単な培養によるこのキラー選択によっ て非組換えベクター（生育不能クローン）を有する細胞を排除し、組換えクロー ン（生育可能クローン）を選択することができる。例Ｉ：プラスミド ｐＫＩＬ１９の構成 ｃｃｄＢ遺伝子を、ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＵＬＢ２２０８を利用する ＰＣＲ（ベルナルド及びクットリエール、ミニＦプラスミドＣｃｄＡたんぱくの ４１個のカルボキシ末端残渣はＣｃｄＢたんぱくのキラー作用に拮抗するに十分 である。Mol.Gen.Genet.226,297-304(1991);Bernard and Couturier,The 41 car boxy-terminal residues of the miniFplasmid CcdA protein are sufficient t o antagonizethe killer activity of the CcdB protein,MolGen.Genet.226,297 -304(1991)）及び合成オリゴヌクレオチドによって増幅した。 野性型ｃｃｄＢ遺伝子をＭＣＳ１９多重クローニング部位のコドンを有するフ レーム内で再クローン化し、生の状態の(native)ｃｃｄＢ遺伝子の開始コドンを 排除するため、野性型ｃｃｄＢ遺伝子の両側にＥｃｏＲＩ制限部位を発生させる ように合成オリゴヌクレオチド配列を選択した。ＰＣＲ反応から得られたＤＮＡ を酵素ＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位へクローニ ングした。ＭＣＳ１９多重クローニング部位に対応するコドンを追加されたｃｃ ｄＢ遺伝子をＬａｃプロモータから読取ることを可能にする 配向でＥｃｏＲＩ断片が一体化されている処理後のプラスミドをｐＫＩＬ２と命 名した。プラスミドｐＫＩＬ２は野性型バクテリアにとって致死的である（Ｃｃ ｄＢｓ感応性）。 ｐＫＩＬ２は２つのＳｍａＩ部位をも有し、その１つは多重クローニング部位 に存在し、他方はｃｃｄＢ遺伝子の中央領域に存在する。後者は部位に向けた変 異誘発によって排除された。得られたプラスミドｐＫＩＬ３は、特定のＳｍａＩ 部位を有し、依然として２つのＥｃｏＲＩ部位を有する。ｃｃｄＢの下流に存在 するＥｃｏＲＩ部位はその付着末端(cohesive end)における充填(filling)によ って排除した。 得られたプラスミドｐＫＩＬ１９（図３）は多重クローニング部位を含む配列 ５内に特定のＥｃｏＲＩ制限部位を有する。例II：プラスミドｐＫＩＬ１８の構成 ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＫＩＬ１９及び合成オリゴヌクレオチドを使用 して、ＰＣＲによってｃｃｄＢ遺伝子を増幅した。ｃｃｄＢ遺伝子をＭＣＳ１８ 多重クローニング部位のコドンを有するフレーム内で再クローン化することがで きるようにｃｃｄＢ遺伝子の両側にＨｉｎｄIII部位を発生させるように合成オ リゴヌクレオチドの配列を選択した。ＰＣＲ反応から得られたＤＮＡを酵素Ｈｉ ｎｄIIIによって消化し、プラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｄIII部位へクローン化 した。得られたプラスミドは、ＭＣＳ１８多重クローニング部位に対応するコド ンを追加されたｃｃｄＢ遺伝子をＬａｃプロモータから読取ることを可能にする 配向でＨｉｎｄIII断片が一体化されており、ｐＫＩＬ４と命名した。プラスミ ドｐＫＩＬ４は、ＣｃｄＢ⁵−感応性バクテリアにとって致死的である。 ｃｃｄＢ遺伝子のＨｉｎｄIII部位下流は、その付着末端における充填によっ て排除した。得られたプラスミドはｐＫＩＬ１８（図４）で あって、特定のＳｍａＩ部位とともに特定のＨｉｎｄIII制限部位を有する（ｐ ＫＩＬ１９からつくられたからである）。例III：菌株ＣｃｄＢｒ及びＣｃｄＢＳの構成 バクテリア内にプラスミドｐＫＩＬ１８及びｐＫＩＬ１９を維持できるように するためには、毒として作用する融合たんぱくの致死作用にバクテリアが耐えね ばならない。意外にも、染色体突然変異ｇｙｒＡ４６２は菌株に融合たんぱくの 有毒性に対する全面的な耐性を授ける。 さらにはまた、プラスミドｐＫＩＬ１８及びｐＫＩＬ１９はプラスミドｐＵＣ １８及びｐＵＣ１９から直接誘導され、ＬａｃプロモータからｃｃｄＢ遺伝子を 発現させるから、これらのプラスミドをＬａｃＩ^q菌株中に維持することが好ま しい。即ち、本発明の場合には、これらの遺伝子の連続的な過発現は特定の突然 変異に有利な淘汰圧を作用させないが、ＬａｃＩ^q菌株はＬａｃプロモータから の発現を抑制してバクテリアの機能を保護することにより迅速な世代時間(gener ation time)を可能にする（菌株によるベクターの増産）。 菌株ＨＢ１０１ ＬａｃＩ^q，ＬａｃＹ^r（マニアティス等，モレキュラークロ ーニング ラボラトリーズ マニトバ．コールド スプリング ハーバー ラボ ラトリ ニューヨーク;Maniatis et al,Molecular Cloning Laboratories Man.C old Spring Habor Laboratory N.Y.）から誘導され、染色体Ｉ^q及び高い形質転 換効率を特徴とする菌株Ｄ１２１０（サドラー等、ジーン8,279-300頁(1980);Sa dler et al,Gene 8,pp.279-300(1980)）をプラスミドｐＣＯＳ２．１で形質転換 した。カナマイシン耐性を授与するこのプラスミドはエルウイニア クリサンセ ミ ３６６５ (Erwinia chrysanthemi 3665)からｒｅｃＡ遺伝子を搬送し、大腸菌中での組換え(recombination)を可能 にする。ＣｃｄＢ^R ｇｙｒＡ４６２，ｚｅｉ２９８：：Ｔｎ１０菌株でＰ１フ ァージの溶解産物(lysate)を調製し、これを利用して菌株Ｄ１２１０／ｐＣＯＳ ２．１を感染させた。テトラサイクリンに対して耐性である被形質導入体(trans ductants)を選択し、ＣｃｄＢたんぱくに対するその耐性及び感受性をテストし た。次いでＣｃｄＢ^R被形質導入体の１つからプラスミドｐＣＯＳ２．１を除き( cured)、ＫＩＢ２２と命名した。 菌株ＫＩＢ２２はプラスミドｐＫＩＬ１８及びｐＫＩＬ１９の理想的な宿主菌 株を構成し、菌株Ｄ１２１０は組換えプラスミドを選択するための理想的な宿主 を構成する。 即ち、菌株ＫＩＢ２２は（ｐＵＣプラスミドの生成量に比較して）高いＤＮＡ 抽出効率を有し、予期せぬことであるが、ｐＫＩＬ１８及びｐＫＩＬ１９によっ て暗号化される融合たんぱくに対する耐性を有する。 従って、この微生物を利用して本発明のクローニングベクターを、前記微生物 の死を伴なうことなく工業規模で多数のコピーという形で生産することができる 。 選択は、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド；Is opropyl-Beta-D-thiogalactopyranoside）及びアンピシリン(ampicillin)を含有 する培地にバクテリアを分散させることによって簡単に行うことができる。 菌株ＫＩＢ２２は、Ｎｏ．ＬＭＧ Ｐ−１２６０１としてベルギー微生物総合 収集機関(the Belgian Coordinated Collectionsof Microorganisms (BCCM)）の 微生物研究所−バクテリアコレクション(the Laboratorium voor Microbiologie -Bacterienverzameling (LMG))に寄託された。 クローニングベクターｐＫＩＬ１９は、Ｎｏ．ＬＭＢＰ２７８１として、ベル ギー微生物総合収集機関の分子生物学研究所−プラスミド コレクション(the L aborium voor Moleculaire Biologie-Plasmiden Collectie (LMBP))に寄託され た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．自律増殖ベクター(autonomously replicating vector)（２）に組込まれた 形で少なくとも１つのプロモータヌクレオチド配列（３）と毒素として作用する 融合たんぱくを暗号化する少なくとも１つのヌクレオチド配列（４）とを含み、 いくつかのクローニング部位を含む暗号ヌクレオチド配列（５）とたんぱく毒を 暗号化するヌクレオチド配列（６）とを融合することによって前記ヌクレオチド 配列（４）を得ることを特徴とするクローニング及び／または配列ベクター。 ２．自律増殖ベクター（２）が組換えウィルスであることを特徴とする請求の範 囲第１項に記載のベクター。 ３．自律増殖ベクター（２）が組換えプラスミドであることを特徴とする請求の 範囲第１項に記載のベクター。 ４．自律増殖ベクター（２）が組換えｐＵＣプラスミドであることを特徴とする 請求の範囲第３項に記載のベクター。 ５．プロモータヌクレオチド配列（３）がＬａｃオペロンプロモータから成るこ とを特徴とする請求の範囲第１項から第４項までのいずれかに記載のベクター。 ６．たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列（６）と融合するヌクレオチド配 列（５）の特定クローニング部位(unique cloning sites)がクローニングベクタ ーのヌクレオチド 配列の残り部分に存在しないことを特徴とする請求の範囲第１項から第５項まで のいずれかに記載のベクター。 ７．たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列（６）がたんぱくＣｃｄＢを暗号 化する野性型遺伝子のヌクレオチド配列のすべてまたは一部から成ることを特徴 とする請求の範囲第１項から第６項までのいずれかに記載のベクター。 ８．たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列（６）に制限酵素ＳｍａＩの切断 部位(cleavage site)が存在しないことを特徴とする請求の範囲第７項に記載の ベクター。 ９．寄託Ｎｏ．ＬＭＢＰ２７８１に相当することを特徴とする請求の範囲第１項 から第８項までのいずれかに記載のベクター。 １０．請求の範囲第１項から第９項までのいずれかに記載のクローニングベクタ ーで形質転換される原核細胞。 １１．好ましくは染色体Ｉ^q及び高い形質転換効率を有し、融合たんぱくの毒性 に対する耐性を授ける突然変異を有し、及び／または融合たんぱくに対する抗毒 素であるたんぱくを暗号化する遺伝子を有することを特徴とする請求の範囲第１ 項から第９項までのいずれかに記載のクローニングベクターのための原核宿主細 胞。 １２．ジャイレースのサブユニットＡを暗号化する遺伝子またはジャイレースの サブユニットＢを暗号化する遺伝子中に突然 変異を有し、融合たんぱくに対する耐性を授け、及び／または融合たんぱくに対 する抗毒素であるたんぱくＣｃｄＡを暗号化する遺伝子を有することを特徴とす る請求の範囲第１１項に記載のクローニングベクターのための原核宿主細胞。 １３．ジャイレースのＧｙｒＡポリペプチドのアミノ酸配列中でアルギニン４６ ２をシステインに代える突然変異を有し、それによって融合たんぱくに対する耐 性を授けることを特徴とする請求の範囲第１１項または第１２項に記載の大腸菌 細胞。 １４．ＬａｃＩ^q突然変異を有することを特徴とする請求の範囲第１１項から第 １３項までのいずれかに記載の細胞。 １５．Ｎｏ．ＬＭＧＰ−１２６０１として寄託されていることを特徴とする請求 の範囲第１１項から第１４項までのいずれかに記載の細胞。 １６．いくつかの特定クローニング部位を含むヌクレオチド配列（５）の両側に 位置する配列とハイブリッド化する１０ないし３０個のヌクレオチドの配列から 成ることを特徴とする請求の範囲第１項から第９項までのいずれかに記載のベク ターの断片。 １７．組換えクローンの選択を目的とする請求の範囲第１項から第９項までのい ずれかに記載のクローニングベクターの利用。