JPH08506478A

JPH08506478A - ホモシステインアッセイ

Info

Publication number: JPH08506478A
Application number: JP5513023A
Authority: JP
Inventors: ズンドレハーゲン，エルリング
Original assignee: アクシスバイオケミカルズエイエス; アクシスリサーチエイエス
Priority date: 1992-01-22
Filing date: 1993-01-22
Publication date: 1996-07-16
Anticipated expiration: 2014-03-17
Also published as: EP0726322B2; DE69332891D1; JP2870704B2; AU676480B2; WO1993015220A1; BR9305780A; CZ176394A3; CZ287334B6; HU219607B; EP0623174A1; EP0623174B1; NO942729L; EP0726322B1; RU2121001C1; ES2196116T3; AU4340893A; HUT67550A; NO942729D0; CA2128512A1; DE69332891T3

Abstract

(57)【要約】サンプル、例えば血液、血漿または尿中のホモシステインをアッセイする方法が提供される。この方法は、前記のサンプルを、ホモシステイン変換酵素およびこの酵素のための、ホモシステイン以外の少なくとも１つの基質と接触させる工程、および、クロマトグラフィーで分離することなく、ホモシステイン補助基質および前記の酵素によるホモシステインの酵素変換のホモシステイン変換生成物から選ばれる標識されていないアナライトを評価する工程を含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】ホモシステインアッセイ本発明は、臨床サンプル中のホモシステインのアッセイに関する。ホモシステインは、メチオニンがシステインへと代謝される際に生成する中間アミノ酸である。一般に、体内で生成するホモシステインは、（1）セリンとの縮合によるシスタチオンの形成、あるいは（2）メチオニンへの変換という二つのルートのうちの一つによって、急速に代謝され、正常な条件下での生体内のその濃度（およびその酸化型ホモシスチンの濃度）は、実際上、無視できるものである。しかしながら、生物学的サンプル中のホモシステインのレベルは、多くの場合、臨床的に重要である。なぜならば、ホモシステインはスルフヒドリルアミノ酸を形成する経路の複雑なセットにおいて重要な部分を果たし、その蓄積は、これらの経路において生じる種々の障害（例えば特に先天代謝異常）を表示できるからである。このように、例えばホモシスチン尿症（尿中におけるホモシステインの異常蓄積）は、酵素類、即ちシスタチオンβシンテターゼまたはメチルテトラヒドロ葉酸メチルトランスフェラーゼ（これはホモシステインのメチル化によるメチオニンの生成を触媒する）の欠乏に起因するアミノ酸代謝障害であることが知られている。スルフヒドリルアミノ酸代謝は、葉酸およびビタミンＢ₁₂（コバラミン）の代謝と密接に結び付いており、これらは関連する多様なトランスフォーメーションにおいて、基質または補助因子として作用する。この理由から、ホモシステインの蓄積はまた、コバラミンまたは葉酸塩に依存する酵素の機能不全、あるいはコバラミンまたは葉酸塩の代謝に関連する他の障害または疾患の示指として提案されている。更に、ホモシステインのメチオニンへの変換は、メチル供与体としてS-メチルテトラヒドロ葉酸塩を必要とする反応を当てにしているので、ホモシステイン代謝もまた、他の障害、特には癌と戦うために投与されたメトトレキサートのような抗葉酸塩薬による影響を受ける。従って、ホモシステインのモニタリングは、抗葉酸塩薬による悪性疾患の処置の管理においても提案されている。より最近になって、血液中のホモシステインレベルの増加が、アテローム性動脈硬化症の発症に関連付けられるようになり（Clarkeetal.，NewEng．J．Med．3 24： 1149-1155(1991)参照）、中程度のホモシスチン血症でさえも、現在では心臓疾患または脈管疾患の危険因子と考えられている。従って、ホモシステインの血漿中レベルまたは血中レベルの測定もまた、脈管疾患の診断および処置において重要である。ホモシステインに対する抗体が利用できないため、ホモシステインを直接に測定する免疫学的方法は利用できないが、臨床サンプル中のホモシステインを測定する他の多くの方法が提案されている。これらは全てクロマトグラフィーによる分離を含み、一般的には、次の三つの原理のうちの一つに基づいている。（1）古典的クロマトグラフィーによるアミノ酸分析、（2）放射性により、または他の手段により標識されたS-アデノシン補助基質（c o-substrate）の存在下での、サンプル中のホモシステインと、酵素S-アデノシル-L-ホモシステイン加水分解酵素との反応、次いで、形成された生成物（S-アデノシル-ホモシステイン、SAH）の分離、および定量。一般的に、クロマトグラフィー分離法（HPLCまたはTLC）および放射性測定法が用いられる（Refsumetal.，Clin．Chem．31：624-628(1985)；Kredich et al.，An al．Biochem 116：503-510(1981)；Chui，Am．Ｊ．path．90(4)：446-449(1988) ；Totani et al.，Biochem．Soc．14(6)： 1172-9(1988)；およびSchimizu etal .，Biotechnol．Appl．Biochem 8： 153-159(1986)参照）、（3）サンプル中のホモシステインと蛍光団との反応、次いでHPLC-分離および蛍光分析（Refsum et al.，Clin．Chem．35(9)； 1921-1927(1989)参照）。これらの方法は実施するのに時間を要し、また厄介であり、全て直接定量を当てにしている。より詳しくは、クロマトグラフィー分離は、従来技術の方法の共通の態様であり、高度に特殊で精巧な装置が必要である。このような装置の使用は、日常的な臨床研究業務には、一般的に充分に許容されず、その結果、このようなプロセスは、典型的な臨床研究室の操作における自動化には一般的に従わない。従って、実施するのに簡単で、特異的で、迅速であり、臨床研究室における使用に容易に採用でき、そして特に、費用および時間のかかるクロマトグラフィー分離の必要が避けられるような、ホモシステインの改良アッセイに対する要望がある。本発明は、このようなアッセイを提供しようとするものである。従って、一つの観点によれば、本発明は、サンプル中のホモシステインをアッセイする方法を提供する。この方法は、サンプルを、ホモシステイン変換酵素、例えばS-アデノシル-ホモシステイン（SAH）加水分解酵素、およびこの酵素のための、ホモシステイン以外の少なくとも１つの基質と接触させる工程、およびクロマトグラフィーで分離することなく（即ち試薬および反応生成物を分離することなく）、ホモシステイン補助基質と、前記の酵素によるホモシステインの酵素変換生成物とから選択される標識されていないアナライト（analyte）を評価する（好ましくは光度測定法で）工程を含んでいる。サンプルをホモシステイン変換酵素および基質と接触させた後、アッセイの次の段階を行う前に、少なくとも30秒間、特に少なくとも５分間インキュベートすることが好ましい。本発明のアッセイに用いられるホモシステイン変換酵素は、特に好ましくはSA H-加水分解酵素であるが、他の酵素も使用できる。例えば、べタイン-ホモシステインメチル転移酵素、およびホモシステインの変換反応に関連する他の酵素（例えばGrahamによるTrends Cardiovasc．Med．1：244-249(1991)に記載されている）が挙げられる。本発明の方法により評価されるホモシステイン補助基質は、酵素で触媒されるホモシステイン変換反応、例えばSAH-加水分解酵素で触媒されるホモシステイン変換反応において、ホモシステインと反応する化合物である。ここで用いられる『評価（assessing）』なる用語は、サンプル中に存在するアナライト、例えばホモシステイン補助基質の量、または濃度の絶対値を得るという意味で、かつ、サンプル中のアナライトのレベルを示指する指数値、比率値、百分率値、視覚値または他の値を得るという意味で、定量的測定および定性的測定の両者を包含することを意図している。評価は直接的でも間接的でもよく、実際に検出される化学種は、アナライト自体である必要がないことは勿論であり、例えば、その誘導体または以下に論じるような何か他の基質であってもよい。本発明のアッセイには、アナライトを評価するのために、酵素的技術または免疫学的技術の何れもが好都合に使用される。一つの好ましい酵素的技術において、アナライトを、もう１つの酵素（このアナライトは、このもう１つの酵素のための基質であり、かつ、補助基質であるか、またはアナライトの酵素変換反応の直接的もしくは間接的反応生成物の何れかである）と接触させ、これによって、もう１つの酵素が評価される。好ましい免疫学的技術において、アナライトは、アナライトともう１つのハプテン（例えばポリハプテンまたはアナライトの標識された類似体）とにより抗体に競合的に結合させること、および結合したハプテンまたは結合しなかったハプテンを評価することを含む操作を用いて評価される。本発明により用いられる好ましいホモシステイン変換酵素は、S-アデノシル- ホモシステイン加水分解酵素（SAH-加水分解酵素）であり、この酵素は、下記のホモシステイン反応（10⁶M^-1の平衡定数Ｋを有する反応である）を触媒する。この反応は、反応条件、反応関与体の濃度等に応じて、どちらの方向にも進行しうる。上記の反応スキームにおいて、アデノシンは、ホモシステイン補助基質である。しかしながら、アデノシンの類似体または関連化合物のような他の補助基質も、本発明のアッセイ方法に使用できる。本発明のアッセイは、ホモシステインがSAH-加水分解酵素の阻害剤として作用し、ホモシステインおよびアデノシンを形成する加水分解反応を抑制し、反応平衡をSAH合成の方に移行させるという特別の利点を有する。このように、サンプル中のホモシステインの量は、SAH-加水分解酵素によるホモシステイン補助基質（例えばアデノシン）の生成または消費、従って反応混合物中で得られるその濃度に対して、間接的に影響を及ぼす。本発明においては、反応混合物中で得られるホモシステイン補助基質（例えばアデノシン）の濃度または濃度変化を、サンプル中のホモシステインの初期濃度に関する示指として用いることができる。即ち、アナライトが補助基質である場合には、本発明のアッセイは、ホモシステインが直接的に評価されるよりはむしろ、ホモシステインの酵素触媒変換反応におけるその補助基質の濃度を測定することにより、ホモシステインが間接的に評価されるという点で、従来法と異なっている。このことは、典型的な臨床研究室の操作には好適であるが、ホモシステインの従来法によるアッセイには使用できなかった検出方法、例えば光学的方法を用いて、本発明によるアッセイを日常的臨床使用に特に好適化できるという直接的利点を有する。本発明の好ましいアッセイ方法において、SAH-加水分解酵素反応はどちらの方向にも使用できる。即ち、もし試験サンプルをアデノシンおよびSAH-加水分解酵素と接触させるならば、アデノシンの量は、消費されたホモシステインの量と対応する量で消費され、従ってサンプル中のホモシステインの量は、アデノシン濃度の変化から測定することができる。アデノシン類似体および／またはアデノシンを生成する化合物を、アデノシン自体の代わりに用いることができる。本発明の他の好ましい態様においては、反対方向の反応を用いることもできる。試験サンプルを、SAH（一般的に過剰）およびSAH-加水分解酵素と接触させることができる。次いでSAHの加水分解から、ホモシステインおよびアデノシンが形成される。試験サンプル中に存在するどのホモシステインも、この正味反応に逆らい、従ってアデノシンの生成（その量がモニターされる）を阻害する。従って、本発明の方法に用いられるSAH-加水分解酵素基質は、SAHまたはアデノシン、あるいはこれらの類似体および前駆体である。体内のスルフヒドリルアミノ酸代謝およびトランスメチル化反応の経路の複雑な系統には、多くの酵素類が影響を及ぼす。これらの経路および反応は充分に研究されており、また関連する酵素の調節的役割も調査されている。このような酵素の一つ、SAH-加水分解酵素の役割は、Uelandによる総説、Pharmacological Re view 34： 223-253に論じられている。Trewyn et al．は、J．Biochem．Biophys ．Met．4： 299-307(1981)において、SAH-加水分解酵素の調節的役割の調査を記述しており、SAH-加水分解酵素の酵素活性のアッセイを提供している。Garras e t al．は、Analytical Biochem．199：112-118(1991)において、他のホモシステイン反応経路を記述しており、特に、メチオニンシンターゼで媒介されるホモシステインの変換についてのアッセイを提供している。前述したように、Graham（前出）は、更なる酵素媒介ホモシステイン変換を記述している。これら多様な反応の補助基質および変換生成物は、特に免疫学的評価手段を採用する際に、本発明のアッセイのアナライトとして用いることができる。本発明によりアッセイされる臨床サンプルは、生物学的液体または組織抽出物から導かれるものであってよく、またアッセイに先立ち前処理を施してもよい。しかしながら、一般的には血漿サンプルまたは尿サンプルが用いられる。血漿中または尿中では、存在するホモシステインの相当の割合は、ジスルフィド架橋によりアルブミンのような循環タンパクに結合していることがあり、また、ホモシステインは、他のジスルフィド誘導体（一般的にはホモシステイン-システイン結合体）の形態で存在していることもある。従って、サンプル中に存在する全ホモシステインの推定量を得るために、還元剤でサンプルを処理し、ジスルフィド結合を開裂させてフリーなホモシステインを遊離させることが望ましい。ジスルフィド化合物は、チオール類（例えば、ジチオトレイトール（DTT）、ジチオエリスリトール（DTE）、2-メルカプト-エタノール、システイン-チオグリコレート、チオグリコール酸、グルタチオンおよび類似の化合物）により容易に、かつ特異的に還元される。直接の化学的還元は、水素化硼素類（例えば水素化硼素ナトリウム）またはアマルガム（例えばナトリウムアマルガム）を用いて達成することができ、あるいは更に専門的な還元剤、例えばホスフィンまたはホスホロチオエートも使用できる。ジスルフィドの還元は、Jocelynにより Metho ds ofEnzymology 143：243-256(1987)に概説されており、そこには広範囲にわたる好適な還元剤が列挙されている。アデノシンまたは他のホモシステイン補助酵素は、公知の方法で評価できる。一般に、分光法（例えば比色法、分光光度法または分光蛍光法）による検出に頼る方法、および免疫学的方法は、これらの方法が臨床研究室での使用に特に容易に適合できるので好ましい。酵素反応に基づく方法、あるいはモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体との反応に基づく方法は、これらの方法が簡単かつ迅速であり、実施するのに比較的に安価であるので特に好ましい。従って、例えば、アナライトを分光法で、例えば分光光度法で検出可能な生成物に直接的または間接的に変換する酵素との反応をモニターすることにより、アナライトを評価できる。好適な酵素（これは勿論、ホモシステイン加水分解酵素の他の基質、特にホモシステインと反応してはならない）としては、アデノシン脱アミノ酵素（これはアデノシンをイノシンに変換する）、およびアデノシンキナーゼ（これはアデノシンおよびATPをADPおよびリン酸アデノシンに変換する）が挙げられる。このような酵素（これは作用して、形成された生成物を更なる検出可能な生成物に変換する）は、他の酵素と更に組み合わせることができる。免疫学的方法の例としては、アナライトと、これに特異的な抗体（これらの抗体は、それ自体が検出可能であるか、または例えばサンドイッチアッセイで更に反応させて、検出可能な生成物を形成できる）との反応を伴う方法が挙げられる。しかしながら、一つの特に魅力的な免疫学的方法は、蛍光団で標識されたアナライトの類似体、好ましくは補助基質、例えばフルオレセイン標識アデノシンの使用を伴っており、このアナライトおよび未標識アナライトを、アナライトに対する抗体と接触させることができる。得られた生成物を、偏光励起放射線を用いる蛍光偏光アッセイに付すると、未標識アナライト濃度の指示を、蛍光放射線の偏光解消度から導くことができる。アデノシン抗体は、商業的に入手することができ（例えばPaessel ＆ L orei GmbH, Frankfurt，GermanyおよびSerotech Ltd.，Oxford，United Kingdom から）、蛍光偏光免疫アッセイ（FPIA）技術は、充分に確立されている（例えば US-A-4420568およびUS-A-4593089、並びにTDX技術に関するAbbot Laboratories による他の刊行物参照）。従って、本発明のアッセイに有用な検出スキームの例としては、次のスキームが挙げられる。競合する化学発光ATP反応と一緒に、例えば下記の反応と一緒に、あるいはATP／アデノシンキナーゼに対して競合する蛍光団標識アデノシンと一緒に、あるいは蛍光偏光測定により行われる評価と一緒に。スキーム（2）および（3）に関し、イノシンおよび尿酸は、明確なUV吸収特性を有しており、従って動的測定により、分光光度法でモニターすることができる。しかしながら、尿酸またはイノシンのUV検出の使用は、この方法の感度がやや劣り、紫外線および紫外線透過性サンプル容器を必要とする点で、ある限界を有している。従って、比色検出または電子センサーに頼るのが更に有利なことがあり、このような方法、特に比色法は、一般に臨床研究室において好まれる。これに関し、スキーム（2）の反応は、アデノシン脱アミノ酵素により生成したアンモニアを、公知の比色測定技術を用いて容易に検出できる点で、特に有用である。即ち、例えばサンプル中に生成したアンモニアを反応させて、着色生成物を形成することができ、その形成は、分光光度法で検出できる。Methods of E nzymatic Analysis(Bergmeyer)Volume 1：1049-1056(1970)に記載されているこのような方法の一つは、アンモニアとフェノールとを、次亜塩素酸塩の存在下にアルカリ性条件で反応させて、着色色素インドフェノールを形成することに頼っている。ニトロプルシドナトリウムは、触媒として使用できる。例えばフェノールの種々の誘導体を用いるこの方法の変法も、使用できる。着色最終生成物は、サンプル中のアンモニア濃度、従ってアデノシン濃度に正比例する量で形成される。スキーム（3）において、キサンチン酸化酵素反応はそれ自体、例えばレドックス指示薬を用いて酸化／還元電位を評価することにより、あるいはO₂消費、即ち更に詳しくは、H₂O₂の形成を例えば電子センサーを用いて測定することにより、蛍光原体または色原体の検出に適している。この目的のために多くのレドックス指示薬を使用することができ、溶液中のH₂O₂およびO₂をアッセイするための広範囲の方法が文献に記載されている。実際に、H₂O₂は臨床アッセイにおいて頻繁に検出されている。好適なレドックス指示薬としては、メチレンブルー、2,6-ジクロロフェノール、インドフェノール、およびKodack Laboratorie ＆ ResearchProducts，Catalo g No．53の表１に列挙されているレドックス指示薬が挙げられるが、その他のものも勿論使用できる。パーオキシダーゼ活性を有する酵素、例えばホースラディッシュパーオキシダーゼを添加して、レドックス反応を促進することができる。沈降する色原体を望むならば、MTTテトラゾリウムを、キサンチン酸化酵素または他の同様の酵素と組み合わせて用いることができる。沈降する色原体または蛍光原体の使用により、固定された色または蛍光の読み取りを得て、ホモシステイン濃度の可視的指示を得ることができる。スキーム（4）においては、化学発光ATP反応を用いてアデノシン濃度が評価される。化学発光に基づくアッセイは、達成できる検出限界が低いため、また必要な機器が比較的簡単なため、大きな可能性を有している。化学発光反応を用いて、アナライト、例えばATPまたはH₂O₂を検出することができ、最も有効であり、かつ最もよく知られているこのような反応の一つは、発光飛翔昆虫の生体発光反応である。発光飛翔昆虫ルシフェリンは、べンゾチアゾール構造を有するが、他の生物原からの他の構造有するルシフェリン類も利用できる。分析の目的のためには、AT P、ルシフェリンまたはルシフェラーゼは、この反応を用いて直接にアッセイできるだろう。例えばスキーム（3）に示すように、H₂O₂が生成する使用可能な他の化学発光反応は、ヒドロパーオキシダーゼ触媒を用いるルミノール反応であり（ルミノールは、5-アミノ-2,3-ジヒドロ-フタラジン-1,4-ジオンである）、その結果、425nmで光が発生する。例えばスキーム（3）からの過酸化水素は、パーオキシオキサレートとアクリジニウムエステル類（後者は中性pHの水溶液として）との非酵素的化学発光反応を用いて評価することもできる。アデノシンキナーゼの基質特異性が比較的広いので、スキーム（4）における蛍光団で標識されたアデノシンの使用、および蛍光偏光測定による評価が可能である。更に、この広い特異性を用いて、前処理として、サンプルにアデノシンキナーゼを、好ましくは還元剤（例えばDTT）と組み合わせて添加することにより、内在性アデノシン（または他のアデノシンキナーゼヌクレオシド基質）を償うことができる。本発明の多くの態様において、アナライト（例えばアデノシン）がサンプル中に既に変化する量で存在しており、従ってアッセイにおける可能な誤差源を与えるので、サンプルをこのように酵素で前処理することが望ましい。バックグラウンドアナライト含有量は、サンプルの一部について、ホモシステイン変換酵素（例えばSAH-加水分解酵素）を用いずにアッセイを行うことによって償うことができる。しかしながら、このような操作は時間がかかり、アッセイを更に扱いにくくする。その代わりの方法は、内在性アナライトを変換または除去するのに役立つ剤、例えばバックグラウンドアデノシンを除去するアデノシンキナーゼまたはアデノシン脱アミノ酵素のような酵素で前処理することである。前記のように、行おうとするアッセイに要する時間が不必要に長くなるのを避けるために、サンプルのこのような処理は、サンプルを還元剤で前処理してホモシステインを遊離化させるときに、有利に行うことができる。アナライトの評価のために分光測定技術または比色定量技術を用いるほかにも、他の測定技術を使用できる。その中でも使用可能な最も有用な技術は、粒子凝集技術および免疫沈降技術である。ポリクローナル抗体を用いる場合には、直接の粒子凝集反応または直接の免疫沈降反応を用いてもよいが、SAH-加水分解酵素をホモシステイン変換酵素として使用する場合には、これは一般に好ましくない。しかしながら、沈降阻害技術または粒子凝集阻害技術を使用できる。これらの技術は、結合に際して、濁り測定または比濁測定によって検出可能な沈降物または粒子凝集物を生じる抗体／ハプテンの組み合わせの使用を頼りにしている。抗体／ハプテン複合体の形成が、アナライト、例えばSAHによって阻害される場合には、沈降物／凝集物の減量からSAH含有量を評価することができる。この反応は、下記のように表すことができる。ホモシステイン変換酵素として、SAH-加水分解酵素を用いて本発明のアッセイを行う場合には、SAH-加水分解酵素を還元剤の存在下に保存するか、またはこれをアッセイに使用する前に還元剤で処理することが有利である。そうしないで保存すると、SAH-加水分解酵素が不活性化されること、およびこの還元剤の使用が保存中の不活性化を防止するか、またはアッセイに使用する前に再活性化を生じさせることが見出された。種々の還元剤（例えばDTT、システイン、メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、水素化硼素ナトリウムなど）を使用できるが、DTTは、例えば約５m Mの濃度において特に適している。DTT自体は低いpHで保存すべきなので、アッセイ用キットは、好都合には、低いpH（例えば約３）ではあるが、低い緩衝能を有するDTT溶液と、実質的に中性pHであり、好ましくは緩衝されたSAH-加水分解酵素（これは部分的または完全に不活性であってよい）の別個の溶液とを含むことができる。これらの溶液を合併すると、酵素を中性pHで再活性化することができる。この合併は、所望により試験サンプルの存在下で行うか、またはそのすぐ後で試験サンプルを添加して行うことができるので、ホモシステインの遊離化を同時に行うことができる。他の上記の還元剤も同様に、SAH-加水分解酵素の安定化／活性化のため、およびサンプルを還元してホモシステインを遊離化させるための両方に使用できる。不活性化SAH-加水分解酵素の活性化への還元剤の使用は、本発明のもう一つの観点を形成する。更に、もう一つの観点において、本発明は、第１区画内の不活性化SAH-加水分解酵素と、第２区画内の還元剤、例えば酸性媒質（例えばpH３）中のDDTとを含むキットを提供する。このキットを用いる場合には、SAH-加水分解酵素は、これをアッセイに使用する直前に、還元剤と混合して活性化することができる。保存中またはアッセイ自体におけるSAH-加水分解酵素の安定性を向上させるために、他の添加物を有利に使用できる。これらの添加物としては、NAD⁺、グルタチオン、多価アルコール類および糖類（例えばイノシトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、グリセリン、エチレングリコール、蔗糖、ラクチトール（lactitol）など）、可溶性ポリマー、例えばある種のデキストラン類、およびタンパク質（例えば担体タンパク質）が挙げられる。本発明のアッセイに抗体を用いる場合には、これらの抗体はポリクローナルであってもよいが、モノクローナルであることが好ましい。所望の抗体が商業的に入手できない場合には、これらは標準的な技術により製造できる。即ち、例えば James Goodingにより”Monoclonal antibodies，principle and practice”，Ac ademic Press，London，1983，Chapter 3に記載されているようにして、動物において、またはモノクローナルまたはポリクローナルのハイブリドーマにおいて、抗体を産生させることができる。モノクローンは、酵素（１つまたは２つ以上）に対して所望のハプテンと他の基質とを識別するクローン、例えばアデノシンとSAHとを識別するクローンを選択するために保存しなければならない。アナライト（例えばSAH）とだけ反応するポリクローナル抗体は、精製して、交叉反応する抗体、即ちアナライトのほかにも他の基質と反応する抗体、例えばアデノシンおよびSAHの両方と反応する抗体を除去すべきである。これは、例えばSAHがアナライトである場合には、固定化アデノシンを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。抗体を製造する際には、ハプテンとしては、アナライト自体、または最も適切な結合領域、例えば酵素反応に関与する結合領域から離れた領域と考えられるアナライトの部分を含む他の分子が用いられる。ハプテンは、好都合には、マクロ分子、例えばBSAまたはヘモシアニンと結合される。SAHについては、所望のエピトープは、チオエーテル橋にあるか、またはその付近にあり、従って、マクロ分子に結合されたSAH自体を使用できるが、“単純化された”分子、例えば下記式（Ｉ）（式中、Ｒ₁およびＲ₂は同一でも異なっていてもよく、水素原子またはＯＲ₄基であり、ここでＲ₄は低級（例えばＣ_1-6、特にＣ_1-4）脂肪族基、例えばアルキル基、好ましくはメチル基またはエチル基であるか、あるいはＲ₁とＲ₂は一緒になって酸素原子を示し、Ｒ₃はアミン部分またはカルボキシル部分である）で表される化合物の１つ、あるいはその塩またはエステル（例えばＣ_1-4アルカノールとのエステル）を用いて、再びマクロ分子と結合させることが好ましい。従って、ハプテンとして使用できる式Ｉの化合物の例には、下記のものが含まれる。このような“単純化された”構造は、アナライトと標識された類似体とが、抗体との結合反応に関与する場合のアッセイに用いられる、上記の標識された類似体にも採用できる。従って、シグナルを与える部分Ｒ^*（これは、例えば発蛍光団、発色団、放射性ラベル、酵素的ラベル、化学発光性ラベル、および免疫アッセイに普通に用いられる他のラベルから選ぶことができる）をアナライトと結合させて例えばＲ^*−ＳＡＨにするか、あるいはエピトープを含有する単純化された分子と結合させて例えばにすることができる。このような標識された部分は、所望により、粒子、ポリマー、タンパク質または他の物質と結合させうることは、言うまでもない。標識されたフラノース6-チオエーテル類および式Ｉの化合物は、新規であり、本発明の更なる観点を形成する。もう一つの観点からみると、本発明は、式Ｉの化合物の製造方法を提供する。この方法は、下記の工程：（a）式II （式中、Ｒ₁およびＲ₂は前記定義のとおりであり、各Ｒ₅は保護された水酸基であるか、または両方のＲ₅は一緒になってアルキレンジオキシ基、例えば保護されたビスヒドロキシ基（例えば-OC(CH₃)₂O-）である）で表される化合物を、式I II Ｒ₆（ＣＨ₂）₃Ｈａｌ（III）（式中、Ｒ₆はＲ₃基または保護されたＲ₃基であり、Ｈａｌはハロゲン原子、例えば臭素原子である）で表されるハロゲン化プロピルと反応させ、次いで、所望により保護基を脱離する工程；（b）（Ｒ₃がアミノ基である式Ｉの化合物を製造するために）式IIの化合物を、アクリロニトリルと反応させ、還元し、そして得られたシアノプロピルチオ- エーテル生成物から保護基を脱離する工程；および（c）Ｒ₃がカルボキシル基である式Ｉの化合物をエステル化する工程；の少なくとも１つからなる。式IIIの出発化合物は、標準的技術により製造することができるか、あるいは文献から公知である。式IIの出発化合物は、対応する1-ヒドロキシメチル-フラノースから、シス-ヒドロキシ基の保護、臭素化およびこれに続くチオ尿素との置換反応、および加水分解によって製造できる。1-ヒドロキシメチル-フラノースは、普通の水酸基保護剤、例えばアセトンとの反応により、シス-ヒドロキシ基を保護することができる。式Ｉの化合物を製造するための反応スキームの例としては、次のスキームが挙げられる（化合物（1）および（3）は商業的に入手できる）。反応混合物中の物質（これは場合により反応混合物から沈降させるか、または分離される）によるUV吸収、可視光線吸収または蛍光は、反応の終点で（シグナルが安定になった時に）、あるいは１つまたは２つ以上の所定の時点で測定することができるが、その代わりに、幾つかの測定を異なる時点で行う動的測定法を採用することもできる。本発明のアッセイを実施するには、必要な試薬を反応混合物に順次に、または同時に添加することができる。しかしながら、多くの好ましい態様においては、１つまたは２つ以上の反応を、後続の反応（１つまたは２つ以上）のための試薬を添加する前に、多少の時間進行させることが有利なことがある。試験サンプルをアデノシンおよびSAH-加水分解酵素と反応させる場合の一例としては、ホモシステインおよびアデノシンからのSAHの形成を、アデノシン評価操作を開始する前に、多少の時間行うことが好ましい。臨床化学分析において、検量の目的で標準曲線を使用することは、普通に行われていることである。従って、本発明の方法を実施するに際しては、臨床上のサンプルの代わりに、ホモシステイン含有量が既知のサンプルを用いて、測定すべき応答／シグナルに関する標準曲線を作成することができ、次いで未知のサンプルのホモシステイン含有量を、この標準曲線から外挿により計算することができる。即ち、シグナル形成分子またはレドックス電位を正確に定量する必要はない。本発明のアッセイ方法は、体液または組織のホモシステイン含有量に関連するか、またはこの含有量に現れる異常状態または異常になる可能性のある状態を診断またはモニターするのに使用することができる。これらの例としては、アテローム性動脈硬化症、血液病、ビタミン欠乏症および／または先天代謝異常が挙げられる。本方法は、医薬品、例えば抗-葉酸塩薬の効果を評価するためにも使用できる。他の観点からみると、本発明は、所望によりキットフォーマットとしての、サンプル中のホモシステインのアッセイに用いられる分析用製品を提供する。この分析用製品は、ホモシステイン変換酵素；この酵素のための、ホモシステイン以外の基質；シグナル形成剤;および所望により、シグナルの評価手段を含んでいる。一つの好ましい態様において、この分析用製品は、ホモシステイン変換酵素、例えばS-アデノシル-ホモシステイン加水分解酵素；この酵素のための、ホモシステイン以外の１種または数種の基質；ホモシステインの補助基質およびホモシステインの酵素変換生成物から選ばれるアナライトの検出可能な誘導体;および所望により、前記の検出可能な誘導体を分光法または比色法で評価して、サンプルのホモシステイン含有量の表示を与える手段を含んでいる。もう一つの態様において、分析用製品は、アデノシン；S-アデノシル-ホモシステイン加水分解酵素；アデノシン変換酵素；所望により、このアデノシン変換酵素の補助基質；および前記の補助基質からの、または前記のアデノシン変換酵素によるアデノシンの酵素変換生成物からの、光度法で検出可能な応答を生成させる手段を含んでいる。即ち、例えば、アデノシン変換酵素はアデノシンキナーゼであってよく、生成手段はATP、ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含みうる。あるいは、アデノシン変換酵素はアデノシン脱アミノ酵素であってよく、変換手段はヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチン酸化酵素およびパーオキシダーゼを含みうる。更にもう一つの観点において、本キットは、アデノシン；S-アデノシル-ホモシステイン；所望によりマトリックスに結合させた抗-S-アデノシル-ホモシステイン抗体；この抗体のためのポリハプテン；および所望により、抗体：ポリハプテン複合体の凝集または沈降を光度法で評価するための手段を含んでいる。この態様において、ポリハプテンは好都合には、例えば下記式で表されるぺンダント残基を残す複数のフラノース6-チオエーテルが結合しているバックボーンポリマーによって供給することができる。これらは、例えば、式Ｉのカルボン酸（あるいはその無水物または酸ハライド）と、複数のぺンダントアミンを有するポリマー（例えばポリリジン）とを反応させるか、あるいは式Ｉのアミンと、複数のぺンダントカルボキシル基を有するポリマーとを反応させることによって製造できる。本キットにおいて、全てのまたは幾つかの試薬は、反応混合物の反応を進行させるためのフォーマット／マトリックスであってもよいように、乾燥形態で存在することができる。同様に、本キットは、前記のように、検出可能なアナライトまたは誘導体の評価手段として、比較的安価な分光装置または比色装置、例えば検出可能なアナライトなどに特徴的な波長で光強度を検出するのに供される光源と検出器との配置、あるいはもっと単純な比色検量チャートを含むことができる。本発明を下記の非限定的実施例により更に説明する。実施例１９のアッセイは、特に好ましい。実施例１サンプル（検量のためのホモシステイン水溶液、臨床アッセイのための血漿または尿）を、還元剤（例えば10mMジチオトレイトール）によって前処理した。このサンプルを、ウサギIgG５mg/ml、アデノシン脱アミノ酵素20mU/ml、ヌクレオシドホスホリラーゼ20mU/ml、キサンチンオキシダーゼ20mU/ml、ホースラディッシュパーオキシダーゼ500mU/ml、ジチオトレイトール10mmol/l、リン酸ナトリウム100mmol/l、PH7.40に調節、およびS-アデノシル-1-ホモシステイン加水分解酵素100mUからなる37℃の溶液に、好ましくは10^-6〜10^-5mol/lの範囲のホモシステイン最終濃度となるまで加えた。同時に、または次に、しかし好ましくは、サンプル中のアデノシンを変換させるために10分間のインキュベートの後、アデノシンを最終濃度5.10^-6mol/lとなるまで加えた。ＵＶ吸収を10分間測定し、292nmにて動的モード（kineticmode）で反応を測定し、ΔＡ／Δｔを計算した。臨床テストのためには、ホモシステイン濃度は、既知標準試料を用いて作成した標準曲線に内挿することによって計算することができる。実施例２（実施例１についての）サンプルを、還元剤（例えば10mMジチオトレイトール）によって前処理した。このサンプルを、ウサギIgG５mol/l、アデノシン脱アミノ酵素20mU/ml、キサンチンオキシダーゼ20mg/ml、ヌクレオシドホスホリラーゼ 20mU/ml、ホースラディッシュパーオキシダーゼ500mU/ml、ジチオトレイトール10mmol/l、リン酸ナトリウム 100mmol/l、pH7.40に調節、およびs-アデノシル-1-ホモシステイン加水分解酵素 20mUからなる溶液に、好ましくは10^-6〜10^-5mol/lの範囲のホモシステイン最終濃度となるまで加えた。次いで、好ましくは、サンプル中のアデノシンに転換を起させるために10分間のインキュベートの後、S-アデノシル-1-ホモシステインを最終濃度5.10^-5mol/lとなるまで加え、ＵＶ吸収を10分間測定した。292nmでの動的モードで、ΔＡ／Δｔを計算した。臨床テストのためには、ホモシステイン濃度は、既知標準試料を用いて作成した標準曲線に内挿することによって計算することができる。実施例３アッセイ緩衝液： 0.1Mリン酸塩緩衝液pH7.4：１mg/mlのウサギIgGおよび10mmol/lのチジオトレイトールを含む。アッセイの手順： 150μｌのアッセイ緩衝液に、３mUのS-アデノシル-1-ホモシステイン加水分解酵素と、サンプル（好ましくは実施例１および２で説明されたように前処理された）とを加えた。アッセイ緩衝液に溶解したアデノシンを、最終濃度2.5×10^-5m ol/lとなるまで加えることにより、酵素反応を開始した。10分間のインキュベートの後、アデノシン脱アミノ酵素20mU、ヌクレオシドホスホリラーゼ20mU、キサンチンオキシダーゼ20mUおよびホースラディッシュパーオキシダーゼ375mUを含むアッセイ緩衝液の溶液750μｌを加えた。292nmでのＵＶ吸収を５分間測定した。ΔＡ／Δｔを計算した。これと平行して、S-アデノシル-1-ホモシステイン加水分解酵素を加えることなくアッセイを再度行う。２つのΔＡ／Δｔ値の差を決定し、既知標準試料を用いて作成した標準曲線に内挿することによってホモシステイン濃度を計算する。実施例４最初のインキュベーションまで、実施例３で説明されたように、アッセイ手順を行う。次いで、10分間のインキュベーションの後、フルオレセイン標識アデノシンおよびモノクローナル抗-アデノシン抗体とを含むアッセイ溶液を添加する。残存するアデノシンおよびフルオレセイン標識アデノシンは、抗体への結合を競争する。抗体に結合した標識アデノシンの量を、従来の蛍光偏光技術によってアッセイし、標準曲線に内挿することによってホモシステイン濃度を計算する。実施例５アッセイ緩衝液： 0.1Mリン酸塩緩衝液pH7.4：１mg/mlのウサギIgGおよび10mmol/lのジチオトレイトールを含む。SAH-加水分解酵素溶液： 40mU/mlのS-アデノシル-1-ホモシステイン加水分解酵素をアッセイ緩衝液に溶解する。アデノシン溶液：５×10^-8mol/mlのアデノシンをアッセイ緩衝液に溶解する。アデノシン脱アミノ酵素溶液：アッセイ緩衝液に溶解した200mU/mlのアデノシン脱アミノ酵素。フェノール／ニトロプルシド溶液：水中の10mg/mlのフェノールおよび50μg/mlのニトロプルシドナトリウム。次亜塩素酸塩溶液： 11mmol/lのNaOClを125mM NaOHに溶解する。アッセイ手順：１． 75μｌのアデノシン溶液および75μｌのSAH-加水分解酵素溶液を、サンプル（好ましくは実施例１〜４で説明された方法で前処理された）と混合し、37℃ で10分間保持する。２． 100μｌのアデノシン脱アミノ酵素溶液を加え、混合物を37℃で５分間保持する。３． 750μｌのフェノール／ニトロプルシド溶液と、750μｌの次亜塩素酸塩溶液を加える。37℃で30分間保持した後、628nmで吸光度を測定する。これと平行して、SAH-加水分解酵素を加えないで再度アッセイを行う。２つの628nmでの吸光度値の差を決定し、この差を、既知標準試料を用いて作成した標準曲線に内挿することによってホモシステイン濃度を計算する。実施例６蛍光団標識SAHの形成ジメチルホルムアミド中のSAH10mmol/l溶液を調製し、次いで100 mmol/lリン酸塩緩衝液pH=7.5で１：10に希釈する。この溶液に、フルオレセインイソチオシアネートを、最終濃度１mmol/lとなるまで加える。室温で60分間のインキュベートの後、SAH-フルオレセイン結合体を、25mM酢酸アンモニウム（pH7. 0）およびメタノールの濃度勾配混合物を用いた260nmでのChromasil C-18カラムによるHPLCで精製する。実施例７抗-SAH-抗体の形成ａ）抗原の形成： 125mmol/l NaClを含んだ、25mmol/lリン酸塩緩衝液pH=7.4中のSAH１mmol/l溶液に、ウシ血清アルブミンを、最終濃度５mg/lとなるまで加える。この混合物に、ビス（スルホスクシニミジル）スベレートを、最終濃度１mm ol/lとなるまで加え、混合物を放置して60分間反応させる。（この結合反応においてＰＨを低く保持して、ホモシステインアミン官能基におけるよりも、アデノシルアミンにおける結合を刺激する）。溶液のタンパク質性フラクション（BSA とSAHとの間の結合体をも含む）を、溶離液としてリン酸塩緩衝生理食塩水を用いたPharmacia Superose 12カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーにより単離する。ｂ）ハイブリドーマの形成：上述の抗原を用い、James W.Goodingが“Monoclonal antibodies：Principle and Practice”，Academic Press，ロンドン，1983，第３章で説明している手順により、ハイブリドーマを形成する。ｃ）ハイブリドーマの選択：（i）抗-SAH-抗体を産生するハイブリドーマを、以下のようにして同定する：ハイブリドーマの上澄液のIgG含有量を、従来のELISA技術で測定する。次いで、キュベット中で、上澄液を、50mmol/lリン酸塩、120mmol/l NaCl、pH=7.4、および0.1mg/mlのウサギIgGからなる緩衝液と、最終濃度が0.1μmol/lマウスIgGとなるまで混合する。上記実施例６に従って形成されたフルオレセイン標識SAHを、最終濃度0.02μmol/lとなるまで加える。10分間のインキュベーションの後、蛍光偏光ユニットを備えた分光蛍光光度計を用いて、偏光度を次のようにして測定する。Ａ＝入射光の水平偏光面が、発光のフィルトレーションのために用いられるフィルタの偏光面と直交である場合の蛍光強度と、Ｂ＝入射光の水平偏向面が、発光のフィルトレーションのために用いられるフィルタの偏向面と垂直である場合の蛍光強度とを測定し、かつ、494nmの励起波長を用いて517nmの発光を検出する。偏光度は、以下のように計算される。（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）低い偏光度は、モノクローナルマウス抗体がSAHに結合していないことを示す。（ii）（i）に従って選択されたハイブリドーマから、アデノシンおよび／またはホモシステインに対して反応性の抗体を産生するハイブリドーマを以下のようにして同定する：ハイブリドーマ上澄液からのモノクローナル抗-SAH-抗体を、下記実施例９で説明されるようにマイクロタイターウェルの表面にコートする。25mmol/lリン酸塩、120mmol/l NaClおよび１mg/lのウサギIgGを含むPH=7.4の緩衝液中の炭素-14標識アデノシン（または炭素-14標識ホモシステイン）、Amersham Ltd，英国から入手、をマイクロタイターウェルに加える。60分間のインキュベートの後、同様の緩衝液（勿論アデノシンまたはホモシステインを含まない）で３回洗浄する。ウェルに保持された高い放射活性は、ハイブリドーマがアデノシン（またはホモシステイン）それ自身に結合する抗体を産生したことを示す。これら抗体はアッセイに用いない。（iii）モノクローナルIgGの産生：上記（i）に従ってSAHに結合するが、上記（ii）に従ってアデノシンまたはホモシステインには結合しない抗体を、モノクローナルIgGの産生のために選択する。選択されたハイブリドーマを、従来の技術に従って、マウスでの腹水の産生、あるいは試験管内での細胞培養物の産生に用いる。更に、モノクローナル抗体を、従来の技術に従って、腹水または細胞培養物から単離する。James W．Gooding “Monoclonal antibodies：Princeple an d practice”，AcademicPress，London，1983を参照せよ。実施例８ L-ホモシステインの蛍光偏光イムノアッセイ酵素溶液： 50mmol/1リン酸塩緩衝液pH=7.4：0.2mg/mlのウサギIgG、120mmol/l のNaCl、10mmol/lのジチオトレイトール、10U/lのS-アデノシル-1-ホモシステイン-加水分解酵素および0.1mmol/lアデノシンを含む。フルオレセイン一標識SAH溶液：実施例６に従って形成されたフルオレセイン結合SAHを、125mmol/lのNaClおよび0.2mg/mlのウサギIgGを含む50mmol リン酸塩緩衝液PH=7.4に、最終濃度１μmol/lとなるまで溶解する。アッセイ溶液： 125mmol/lのNaClおよび0.2m9/mlのウサギIgGを含む50mmol/lリン酸塩緩衝液PH=7.4に、最終濃度0.1μmol/lとなるように溶解した、例えば実施例７に従って形成されたモノクローナル抗-SAH抗体（これはアデノシンと反応しない、好ましくはホモシステインとも反応しない）。アッセイ作業：キュベット中に、15μｌの血漿（最初に既知ホモシステイン含有量のサンプルのシリーズ）を、100μｌの酵素溶液と混合し、37℃で15分間保持する。100μｌのフルオレセイン-標識SAH溶液を加え、次いで1.0mlの抗体溶液を加える。蛍光偏光ユニットを備えた分光蛍光度計を用いて、上記実施例７（c ）（i）で説明されたように、偏光度を測定し、ホモシステイン濃度に対してプロットする。実施例６および７の標識ハプテンおよび抗体の代わりに、実施例１１および１３または１５のそれらを用いてアッセイを行うこともできる。実施例９マイクロタイター酵素-結合イムノアッセイ（a）酵素溶液実施例８のものを用いる。（b）パーオキシダーゼ-標識SAH溶液： 0.5 mgのホースラディッシュパーオキシダーゼを、１mlの精製水に溶解する。0.02mol/lの過ヨウ素酸ナトリウム溶液200μｌを加え、混合物を室温で20分間攪拌し、10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH=4.4に対して一晩透析する。SAHを、最終濃度0.1mmol/lとなるまで加え、PHを6.0に調節する。この溶液を室温で４時間攪拌する。水素化硼素ナトリウムの４mg/ml溶液100μｌを、新たに調製して加え、溶液を４℃で２時間インキュベートする。パーオキシダーゼおよびそのSAH結合体を、Superose ６（Pharmacia，スウェーデン）のカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーで単離する。（c）マイクロタイターウェルにコートされた抗-SAH-抗体：マウスIgGに対して免疫されたヒツジから得たポリクローナルヒツジIgGを、100mmol/lホウ酸塩緩衝液pH=9.0に、最終濃度１mg/mlとなるまで溶解する。この溶液300μｌを、ポリスチレンマイクロタイタープレートの各々のウェルに満たす。37℃で120分間のインキュベートの後、ウェルをリン酸塩緩衝生理食塩水で５回洗浄する。その後、上記実施例７に従って調製したモノクローナルマウスIgG抗SAH-抗体を、リン酸塩緩衝生理食塩水に、最終濃度50μg/mlとなるまで溶解する。このモノクローナルIgG溶液200μｌを、各々のウェルに加え、37℃にて120分間インキュベートする。次いで、ウェルを、0.1mg/mlのウサギIgGを含むリン酸塩緩衝生理食塩水溶液で５回洗浄する。（d）アッセイ作業： 25μｌの血漿（最初に既知ホモシステイン含有量のサンプルのシリーズ）を、500μｌの酵素溶液と混合し、37℃にて15分間保持する。5 0μｌのパーオキシダーゼ-標識SAH溶液を加え、次いで混合し、250μｌのこの混合物を、上記（c）に従って製造され、すべてpH7.4に緩衝された抗-SAH-抗体コートマイクロタイターウェル中に加える。37℃で60分間のインキュベートの後、 0.1mg/mlのウサギ IgGを含むリン酸塩緩衝生理食塩水溶液で３回洗浄する。各々のウェルに、0.015 ％の過酸化水素を含む0.1mol/lクエン酸塩緩衝液pH=6.0中のオルトーフェニレンジアミン１mg/ml溶液100μｌを加える。10〜30分後、各々のウェルの450nmでの吸光度を測定する。吸光度をホモシステイン濃度に対してプロットする。実施例１０ハプテンの製造 3-S-（1-アンヒドロ-D-リボフラノシル）-チオプロピルアミン（a）活性化ヒドロキシ-保護メルカプタン（上記スキーム（E）の化合物（8））１当量のメチルβ-D-リボフラノシド（上記化合物（1）、市販されている）を、５当量のトリメチルシリルメタンスルホネートおよび１当量のボロントリフルオライドエーテル化物の混合物と、Jun et al．（Carb．Res．163：247-2 61(1987)）の手順を用いて反応させる。0.5当量の1-アンヒドロ-D-リボース生成物（化合物（2））を、微粉末形態で、小分けにして、新たに蒸留したアセトン1 00mlに濃硫酸6.3 mlをゆっくり加えて製造したアセトン／硫酸混合物に、アイスバス中で連続的に攪拌しながら加える。アイスバスを除き、室温で８時間反応を継続させる。得られた固体白色結晶塊をクロロホルムに溶解し、水酸化ナトリウム溶液、希塩酸および最後に水で洗浄し、乾燥し、次いで蒸発乾固（evaporatio n down）させて、1-アンヒドロ-D-リボース（化合物（2））の2,3-イソプロピリデン-D-リボニック誘導体を得る。１当量のこの化合物および２当量の四硼化炭素を、乾燥エーテルに溶解し、氷上で冷却する。絶えず攪拌するとともに氷上で冷却しながら、２当量のトリフェニルホスフィンをゆっくり加える。アイスバスを除き、混合物を室温になるまで放置して反応を起こさせ、ホウ化水素を円滑に発生させる。反応が完了した後、過剰の試薬を、メターノルの添加により急冷する。硼素化誘導体（化合物（6））を、濾過および濾液の蒸発乾固によって単離する。この硼素化誘導体に、温水に溶解したチオ尿素（１当量）を加え、精留アルコール（rectified spirit）で希釈する。混合物を還流し、周期的によく震盪し、これを硼素化誘導体が溶解した後、略30分間継続する。反応混合物を氷上で冷却し、濾過により固体を得、これをアルカリ水で処理して、有機相中のヒドロキシ-保護メルカプタン（化合物（7））を製造する。この化合物を、メタノール中のメトキシドで処理することにより、活性化形態に変える。次いで、これを更に以下のように反応させる。（b）3-S-（1-アンヒドロ-D-リボフラノシル）チオプロピルアミン１当量の新たに調製された実施例１０（a）の化合物（化合物（8））を、１当量のアクリロニトリルと反応させて、チオエーテル（化合物（9））を得る。次いで、これを乾燥エーテル中のLiAlH4で処理して還元し、遊離の非保護アミン（化合物（10））を、塩酸水溶液で処理して単離する。Ｒ₁およびＲ₂が水素以外の対応するアミノプロピルチオエーテルは、同様にして、例えば市販の化合物（1）および（3）を出発原料として用いて製造される。実施例１１ハプテンの標識ジメチルホルムアミド（DMF）中の実施例１０の化合物50mmol/lの溶液を、0.1 mM重炭酸塩溶液（pH9.2）中で１：５（体積）に希釈する。この溶液に、フルオレセインイソチオシアネートを、最終濃度12mmol/lとなるまで加える。室温で60 分間のインキュベートの後、実施例１０の化合物のフルオレセイン結合体を、20 mM酢酸アンモニウム（pH7.0）およびメタノールの濃度勾配混合物を用いたKroma sil 100ÅC-18カラムによるRPCで精製する。実施例１２抗原の調製 50mmol/lリン酸塩、125mmol/l NaCl（pH7.4）緩衝液中の実施例１０の化合物１mmol/lの溶液に、ウシ血清アルブミン（BSA）を、最終濃度５mg/lとなるまで加える。この混合物に、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートを、最終濃度1.2mmol/lとなるまで加え、混合物を放置して60分間反応させる。タンパク質性フラクション（これはハプテン-BSA結合体を含む）を、溶離液としてリン酸塩緩衝生理食塩水を用いたPharmacia Superose 12カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーにより単離する。実施例１３抗体の調製実施例１２の抗原を用いて、上記実施例７と同様にして実施例１０の化合物の抗体を調製する。好ましいのはホモシステインと反応する抗体であるので、SAH と反応しない抗体およびアデノシンと反応する抗体は、除かれる。実施例１４ハプテンの製造 N-ヒドロキシスクシンイミジル3-S-（1-アンヒドロ-D-リボフラノシル）チオブタノエート１当量の新たに調製された実施例１０（a）の化合物を、１当量の4-ブロモ酪酸エチルと反応させて、エステル化合物（11）を得る。これをジオキサン中で、水酸化ナトリウム水溶液を用いた塩基性加水分解によって遊離酸に加水分解し、塩酸水溶液を用いた処理によって保護基を脱離させて、保護されていない遊離酸（化合物（12））を得る。１当量のこの化合物を、氷冷ジメチルホルムアミド中の２当量のN-ヒドロキシスクシンイミドと混合し、これに1.2当量のジシクロヘキシルカルボジイミドを、絶えず攪拌しながら加える。この反応を室温で18時間継続させた後、混合物を冷却し、氷冷エーテルを加える。沈澱したNHS-エステル（化合物（13））をDMF／エーテルから再結晶し、乾燥し、次いで乾燥剤上にて４℃で貯蔵する。Ｒ₁およびＲ₂が水素以外の対応するNHS-エステルは、同様にして、例えば市販の化合物（1）および（3）を出発原料として用いて製造される。実施例１５：ハプテンの標識 DMF中の実施例１４の化合物50mmol/l溶液を、0.1M重炭酸塩緩衝液（pH 9.2）中で1:5（容量）に希釈する。この溶液に、5-アミノアセタミド-フルオレセイン（フルオレセイニルグリシンアミド）を最終濃度が12mmol/lになるように加える。常温で60分間インキュベートした後、3-S-（1-アンヒドロ-D-リボフラノシル）チオブタン酸のフルオレセイン結合体を、Kromasil 100Å，C-18カラムおよび 20mM酢酸アンモニウム（pH7.0）とメタノールとの濃度勾配混合物を用いるRPCにより精製する。実施例１６抗原の製造 BSAの溶液（50mmol/lリン酸塩、125mmol/l NaCl（pH7.4）緩衝液中、５mg/l）に、実施例１４の化合物を最終濃度が１mmol/lになるように加える。この混合物を60分間反応させ、BSA-ハプテン結合体を含有しているタンパク質性フラクションを、Pharmacia Superose 12カラム、溶離剤としてのリン酸塩緩衝塩水を用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより単離する。実施例１７抗体の製造前記の実施例７と同様にして、実施例１２の抗原を用いて、実施例１４の化合物に対する抗体を製造する。SAHと反応しない抗体およびアデノシンと反応する抗体は、ホモシステインと反応する抗体であるので、除くことが好ましい。実施例１８蛍光偏光免疫アッセイ酵素溶液：４mg/mlのカゼインを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液（pH 7.4）、120mmol/l NaClおよび10 U/l S-アデノシル-L-ホモシステイン-加水分解酵素。ジチオトレイトール（DTT）-溶液：ジチオトレイトールを水に溶解して、50mmol/lの濃度となし、HClでPHを3.0に調整する。アデノシン-溶液： 50mmol/lリン酸塩緩衝液（pH7.4）中の1.8mmol/lアデノシン。フルオレセイン-標識SAH溶液：実施例６により調製した、フルオレセインに結合されたSAHを含有する50mmol/ lリン酸塩緩衝液（pH7.4）。抗体溶液： 120mmol/l NaClおよび１mg/mlカゼインを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液（p H7.4）に、最終濃度0.1μmol/lになるように溶解したモノクローナル抗-SAH抗体（例えば実施例７による）。アッセイの実施：工程１：キュベット中で、15μlのサンプル、10μlの酵素溶液および10μlのアデノシン-溶液を、10μlの酸性DTT-溶液と混合し、37℃で15分間保持する。工程２：このキュベットに、100μlのフルオレセイン-標識SAH溶液および1.0mlの抗体溶液を加える。蛍光偏光ユニットを備えた分光蛍光計を用いて、前記の実施例７（c）（i）に記載されたようにして偏光度を測定し、ホモシステイン濃度に対してプロットする。実施例１９蛍光偏光免疫アッセイ酵素溶液：１mg/mlのカゼインを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液（pH 7.4）、120mmol/l NaClおよび10 U/l S-アデノシル-L-ホモシステイン-加水分解酵素。ジチオトレイトール（DTT）-溶液：ジチオトレイトールを水に溶解して、50rrLmol/lの濃度となし、HClでPHを3.0 に調整する。フルオレセイン-標識SAH溶液／アデノシン-溶液：実施例６により調製した、フルオレセインに結合されたSAH10μmol/lを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液（pH 7.4）および1.8mmol/lアデノシン。抗体溶液： 120mmol/l NaClおよび１mg/mlカゼインを含有する50mmol/lリン酸塩緩衝液（p H7.4）に、最終濃度0.1μmol/lになるように溶解したモノクローナル抗-SAH抗体（例えば実施例７による）。アッセイの実施：キュベット中で、10μlの血漿、100μlの酵素溶液および10μlの標識されたSA H／アデノシン-溶液を、30μlの酸性DTT-溶液と混合し、37℃で15分間保持する。インキュベートした後、1.0 mlの抗体溶液を加える。蛍光偏光ユニットを備えた分光蛍光計を用いて、前記の実施例７（c）（i）に記載されたようにして偏光度を測定し、ホモシステイン濃度に対してプロットする。実施例１８および１９のアッセイは、実施例１１および１３、または１５および１７の標識されたハプテンと抗体とを、実施例６および７のそれらの代わりに用いて行うこともできる。実施例２０発光アッセイアッセイ緩衝液Ｉ：１mg/mlのカゼインを含有する50mM Pipes-緩衝液（pH 6.6）、10mM DTT、0.5m M MgCl₂および30mM KCl。アッセイ緩衝液II： 40mM Hepes-緩衝液（pH 7.75）、４mmol/l EDTA、20mM塩化マグネシウムおよび0.36mmol/l DTT。アッセイ緩衝液III： 1.6μg/mlのルシフェラーゼ（ホタル： Photinus pyralisから）を含有する40 mM Hepes-緩衝液（pH 7.75）、700μmol/l D-ルシフェリン、20mmol/l塩化マグネシウム、４mmol/l EDTA、0.36mmol/l DTTおよび0.3mmol/l AMP。アッセイ操作： 130μlのアッセイ緩衝液Ｉに、３ＵのS-アデノシル-1-ホモシステイン加水分解酵素を加え、この混合物に20μlのサンプルを加え、37℃で15分間インキュベートする。次いでアッセイ緩衝液Ｉに溶解したアデノシンを、最終濃度が５ｘ10^-6 mol/lとなるように加える。37℃で５分間インキュベートした後、0.7ｘ10^-5mo l/lのATPを含むアッセイ緩衝液Ｉ 750μlおよびアデノシンキナーゼ１mUを加え、得られた溶液を更に37℃で５分間インキュベートする。この溶液を、アッセイ緩衝液IIで1:100（容量）に希釈し、この希釈溶液500μlを、直ちにアッセイ緩衝液III500μlに加える。アッセイ緩衝液IIおよびIIIの両方は、常温（21℃）に平衡化した。生じた発光を光度計において550nmで読み取る。これと平行して、S-アデノシル-1-ホモシステイン加水分解酵素が存在していないアッセイを行う。臨床試験のためには、ホモシステイン濃度は、s-アデノシル-1-ホモシステイン加水分解酵素が存在した場合に生じた発光と、この酵素が存在しない場合に生じた発光との差を、標準曲線に外挿することにより計算できる。実施例２１ポリクローナル抗体の製造実施例１２および１６の抗原に対するウサギポリクローナル抗体を、Dako Cor poration，Copenhagen，Denmarkにより出されたプロトコールに従って産生させる。集めた抗血清から、同じプロトコールに従ってポリクローナルIgGを精製する。ポリクローナル抗体は、これらの抗体を、アデノシンとホモシステイン残基とが固定化されたRacti-ゲルカラムに通すことにより（Pierce Chemical Compan y，Belfiumから提供されたゲルおよびプロトコール）、アデノシンおよびホモシステイン残基と反応する抗体からその場で精製される。SAHと反応しない抗体も、除かれる。選ばれた抗体は、前記の実施例のアッセイに使用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/543 ５４５Ｔ 8310−2ＪＳ 8310−2Ｊ (31)優先権主張番号９２０４９２２．０ (32)優先日 1992年３月６日 (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプルを、ホモシステイン変換酵素および該酵素のための、ホモシステイン以外の少なくとも１つの基質と接触させる工程、および、クロマトグラフィーで分離することなく、ホモシステイン補助基質と、該酵素によるホモシステインの酵素変換生成物とから選択される標識されていないアナライトを評価する工程を含むことを特徴とする、サンプル中のホモシステインをアッセイする方法。２．前記サンプルを、前記アナライトに対する抗体および前記標識されていないアナライト以外の、前記抗体に対するハプテンと接触させ、該アナライトの評価を、該抗体に結合しているハプテンまたは結合していないハプテンの何れかの評価により、間接的に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。３．前記ハプテンが、ポリハプテンであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。４．前記ハプテンが、前記標識されていないアナライト中にも存在しているエピトープ構造単位を有する標識された分子であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。５．前記抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２〜４の何れかに記載の方法。６．前記抗体が、担体マトリクスに結合した抗体であることを特徴とする、請求項２〜５の何れかに記載の方法。７．前記サンプルを、前記アナライトを転換するのに役立つ第２酵素と接触させ、該アナライトの評価を、該アナライト以外の該第２酵素の基質または該第２酵素による該アナライトの酵素変換生成物の基質の何れかの評価により、間接的に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。８．前記アナライトが、前記補助基質の１つであることを特徴とする、請求項１〜７の何れかに記載の方法。９．前記酵素が、S-アデノシルーホモシステイン加水分解酵素であり、前記アナライトが、アデノシンであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。１０．前記サンプルを、さらに前記ホモシステイン変換酵素以外のアデノシン変換酵素と接触させ、前記アナライトがアデノシンであり、アデノシンの評価を、補助基質の評価、または該アデノシン変換酵素によるアデノシン変換の反応生成物の評価により間接的に行うことを特徴とする、請求項８に記載の方法。１１．前記アデノシン変換酵素が、アデノシンキナーゼであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。１２．前記アデノシン変換酵素が、アデノシン脱アミノ酵素であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。１３．前記アナライトが、前記変換生成物の１つであることを特徴とする、請求項１〜７の何れかに記載の方法。１４．前記酵素が、S-アデノシルーホモシステイン加水分解酵素であり、前記アナライトが、S-アデノシル-ホモシステインであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。１５．前記サンプルが、還元剤により前処理された血液、血漿または尿のサンプルであることを特徴とする、請求項１〜１４の何れかに記載の方法。１６．前記アナライトの評価を、光学測定法で行うことを特徴とする、請求項１〜１５の何れかに記載の方法。１７．前記評価を、分光測定法または比色測定法で行うことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。１８．前記評価を、濁度測定または比濁測定で行うことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。１９．前記評価を、蛍光偏光検知で行うことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。２０．前記アナライトの評価を、標識されたS-アデノシル-ホモシステイン上、または標識されたフラノース6-チオエーテル上の、発色団または発蛍光団の検出により、間接的に行うことを特徴とする、請求項１〜７、１３〜１７および１９の何れかに記載の方法。２１．血液、血漿または尿のサンプルを還元剤で処理し：該サンプルを、アデノシンおよびS-アデノシル-ホモシステイン加水分解酵素と接触させ；生成した混合物をインキュベートし、次いでATPおよびアデノシンキナーゼと接触させ、この混合物を少なくとも１分間インキュベートし；生成した混合物を、ルシフェリンおよびルシフェラーゼと接触させ、発光を検出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。２２．血液、血漿または尿のサンプルを還元剤で処理し；該サンプルを、アデノシンおよびS-アデノシルーホモシステイン加水分解酵素と接触させ；生成した混合物をインキュベートし、次いでアデノシン脱アミノ酵素、ヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチン酸化酵素およびパーオキシダーゼと接触させ、この混合物のＵＶ吸収を評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。２３．前記サンプルを、アデノシンおよびs-アデノシル-ホモシステイン加水分解酵素と接触させ；生成した混合物をインキュベートし、次いで発蛍光団で標識されたS-アデノシル-ホモシステインまたは発蛍光団で標識されたフラノース6- チオエーテルと接触させ；生成した混合物を、モノクローナル抗-S-アデノシル- ホモシステイン抗体と接触させ；抗体と結合した発蛍光団標識化合物または抗体と結合しなかった発蛍光団標識化合物を、蛍光偏光により評価し、これにより、サンプルの初期ホモシステインレベルの示指を得ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。２４．前記サンプルを、アデノシンおよびS-アデノシル-ホモシステイン加水分解酵素と接触させ；生成した混合物をインキュベートし、次いで標識されたS-アデノシル-ホモシステインまたは標識されたフラノース6-チオエーテルと接触させ；生成した混合物を、担体マトリクスに結合したモノクローナル抗-S-アデノシル-ホモシステイン抗体と接触させ；抗体担体マトリクスを洗浄し；抗体と結合した標識化合物を光学的に評価し、これにより、サンプルの初期ホモシステインレベルの示指を得ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。２５．前記抗体と結合した標識された化合物の標識を反応させて、光学的に評価される発色団を発生させることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。２６．評価を、抗体：ポリハプテン結合体の沈降または凝集の評価により行うことを特徴とする、請求項３に記載の方法。２７．ホモシステイン変換酵素；この酵素により触媒されるホモシステイン変換反応のための、ホモシステイン以外の基質；シグナル形成剤；および所望により、シグナルの評価手段を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法によるサンプル中のホモシステインのアッセイに用いられる分析用キット。２８．前記ホモシステイン変換酵素として、s-アデノシル-ホモシステイン加水分解酵素；前記酵素のためのシグナル形成基質として、標識されたS-アデノシルーホモシステイン；所望により担体マトリックスに結合された抗-S-アデノシル-ホモシステイン抗体；および所望により、前記シグナル検出手段として、前記標識されたS-アデノシル-ホモシステインまたはその検出可能な誘導体を光学測定法で評価することにより、サンプルのホモシステイン含有量を与える手段を含むことを特徴とする、請求項２７に記載のキット。２９．前記ホモシステイン変換酵素として、S-アデノシル-ホモシステイン加水分解酵素；前記酵素のための基質として、アデノシン；S-アデノシル-ホモシステイン加水分解酵素以外のアデノシン変換酵素；所望により、前記アデノシン変換酵素のためのアデノシン補助基質；および前記シグナル検出手段として、前記補助基質から、または前記アデノシン変換酵素によるアデノシンの酵素変換生成物から、光学測定法で検出可能な応答を生じさせる手段を含むことを特徴とする、請求項２７に記載のキット。３０．前記アデノシン変換酵素が、アデノシンキナーゼであり、前記生成手段が、ATP、ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含むことを特徴とする、請求項２９に記載のキット。３１．前記アデノシン変換酵素が、アデノシン脱アミノ酵素であり、前記生成手段が、ヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチン酸化酵素およびパーオキシダーゼを含むことを特徴とする、請求項２９に記載のキット。３２．前記ホモシステイン変換酵素として、S-アデノシルーホモシステイン加水分解酵素；前記酵素のための基質として、アデノシン；所望によりマトリックス粒子に結合された抗-S-アデノシル-ホモシステイン抗体；前記抗体のためのポリハプテン；および所望により、前記シグナル検出手段として、抗体：ポリハプテン複合体の凝集または沈降を光学測定法で評価する手段を含むことを特徴とする、請求項２７に記載のキット。３３．前記ハプテンとして、下記式（Ｉ）（式中、Ｒ₁およびＲ₂は同一でも異なっていてもよく、水素原子またはＯＲ₄基を意味するか、あるいはＲ₁とＲ₂は一緒になって酸素原子を意味し、Ｒ₃はアミノ基またはカルボキシル基を意味し、Ｒ₄はＣ_1-6脂肪族基を意味する）で表される化合物、あるいはその塩またはエステルが用いられることを特徴とする、請求項２に記載の方法。３４．前記ハプテンとして、標識されたフラノース6-チオエーテルが用いられ、その標識された部分が発色団または発蛍光団または放射性原子を含み、チオエーテル部分がトリメチレンチオ部分を含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。３５．前記標識されたチオエーテルとして、請求項３３で定義された式Ｉの標識された化合物が用いられることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。３６．前記酵素として、還元剤との接触によって活性化される不活性化SAH-加水分解酵素が用いられることを特徴とする、請求項９に記載の方法。３７．第１区画内の不活性SAH-加水分解酵素と、第２区画内の還元剤とを含み、前記第１および第２区画の内容物の混合に際して、活性化 SAH-加水分解酵素が生成されることを特徴とする、請求項２７に記載のキット。３８．前記第２区画が、酸性媒質中のジチオスレイトールを含むことを特徴とする、請求項３７に記載のキット。