JPH08509861A - マンノースまたはキシロースに基づく陽性選択 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明により、少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養された真核細胞集団から、形質転換の結果として代謝優勢を有する細胞を同定または選択する方法が提供される。当該方法の特徴は、以下の点にある：ｉ）細胞を（a）当該化合物の代謝に含まれるタンパク質をコードするか、および／または（b）当該タンパク質をコードする遺伝子の活性を制御する領域を含む、ヌクレオチドまたは共挿入ヌクレオチド配列で形質転換されていること、およびii）当該化合物が、マンノースまたはキシロースもしくはそれらの誘導体または前駆体、またはタンパク質の基質、または形質転換細胞によりそのような基質に代謝され得るものであること（ただし当該化合物はタンパク質がマンノース−６−リン酸イソメラーゼである場合、マンノースではない）。本発明はまた、当該化合物の細胞に対する毒性を減少させる薬剤が培地に添加されることを前提に、当該化合物が限定されないものである、前記の方法を含む。毒性軽減剤が培養培地に添加される場合、当該化合物がマンノースであり、ヌクレオチドまたは共挿入ヌクレオチド配列がマンノース−６−リン酸イソメラーゼをコードするものであるのが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 マンノースまたはキシロースに基づく陽性選択 本発明は、その中に所望のヌクレオチド配列が挿入されている、遺伝子的に形 質転換された細胞に、形質転換細胞に選択的優勢（selective advantage）を与 えることにより選択する方法に関する。形質転換細胞が有する選択的優勢は、非 形質転換細胞と比較して、栄養素、成長因子またはエネルギー源のような添加化 合物の高められた利用能によるものであってよい。 遺伝子材料を形質転換により細胞集団中に挿入した場合、ある数の細胞しか形 質転換が成功しないことは知られている。形質転換細胞の同定および分離は、伝 統的に、形質転換細胞は生存および成育できるが、形質転換細胞がその形質転換 によって寛容性である物質により非形質転換細胞は成育が阻害されまたは恐らく 死滅さえする「陰性選択」を使用して成されている。 例えば、植物細胞集団が形質転換された場合、形質転換細胞の選択は、典型的 には抗生物質または除草剤耐性を提供する「選択遺伝子」の存在に基づく。それ 自身形質転換植物中では有用な機能を有しない可能性のある（実際植物中で望ま しくない場合もあり得る）−選択遺伝子は、植物中に挿入すべき所望の遺伝子と 両方の遺伝子が細胞集団内、または細胞の全ての形質転換の実行は、不可能でな いにしても難しいため、むしろ細胞集団内のある程度に挿入されるように組み合 わせて、または共挿入する。次いで、遺伝子的形質転換細胞は、選択遺伝子によ り耐性である抗生物質または除草剤を含む培地上または中で細胞を培養し、−抗 生物質または除草剤耐性遺伝子を有しない−非形質転換細胞は成育阻害または死 滅の対象となるため、それにより形質転換細胞を同定する。 これらの陰性選択法はある不利点を有する。例えば、非形質転換細胞は、成育 培地中の抗生物質または除草剤の存在により死滅し得る。結果として、細胞集団 がコヘレント（coherent）組織である場合、非形質転換細胞の死骸が形質転換細 胞への栄養の供給を遮断し得るという事実のため、もしくは傷害を受けた末期の 非形質転換細胞は有毒化合物を排出し得るため、非形質転換細胞だけでなく、形 質転換細胞も死滅するという危険性がある。 陰性選択の他の不利点は、例えば抗生物質耐性を提供するような不必要な遺伝 子の存在が望ましくない場合があり得る。植物および微生物に抗生物質耐性をコ ードする遺伝子を挿入することが安全か否かについて、環境保護グループおよび 政府当局で懸念されている。この懸念は食用植物ならびに閉鎖環境中での使用の ために設計されていない微生物（例えば農業で使用する微生物）および閉鎖環境 の使用のために設計されているが、突発的にそこから放出され得る微生物につい て特に著しい。 陰性選択の他の不利点は、有毒物質で処理された植物組織または細胞は、細菌 感染により感受性になるということである。これは、アグロバクター（Agrobact erium）が形質転換細胞として使用された場合、細菌成育を妨げるために抗生物 質を使用したとしても、処理組織または細胞で細菌がはびこることがあるため、 問題である。 加えて、陰性選択を使用した細胞または組織の選択は、選択工程に関して遺伝 子を誘発する厳密なタイミングが必要である。無毒化遺伝子の発現前か、有毒化 合物の作用を改善するために充分な遺伝子産物が産生される前にトランスジェニ ック細胞を有毒化合物で処理した場合、トランスジェニックおよび非トランスジ ェニック細胞の両方が死滅するであろう。もし選択が遅すぎれば、トランスジェ ニック細胞または組織の選択は、例えば、形質転換細胞を選択するために使用し た化合物の浸透に対する障壁を形成する非トランスジェニック細胞または組織か らの新芽またはカルス形成により妨げられ得る。 上記の不利点は、非形質転換細胞に障害を与えまたは死滅することなく、かつ 抗生物質または除草剤耐性遺伝子の共挿入なく集団から遺伝子的形質転換細胞を 同定および単離することを可能にした本発明の方法（「陽性選択」または組み合 わさった「陽性／陰性」選択と命名）により、少なくともかなりの程度まで征服 できる。抗生物質または除草剤耐性遺伝子の必要性を除いたという事実に加えて 、本発明の陽性選択法は伝統的な陰性選択よりしばしば遥かに優れており、陽性 および陰性選択の組み合わせは陰性選択単独使用で得られるより高くはなくても 、同等なトランスジェニック新芽の選択頻度が得られる。更に、陽性選択の使用 は、 １個の遺伝子がレポーター遺伝子および選択遺伝子として使用され得るため、ベ クター構築物の単純化をもたらし、より安定な構築およびレポーターの発現と選 択遺伝子の間の１００％の相関関係という利点を提供する。 選択化合物が、特定の基質上において挿入遺伝子の発現によりもたらされた遺 伝子生産物の作用の結果産生され得るため、陽性選択は、タイミングに関する上 記の問題を排除し得る。従って、選択化合物は選択遺伝子の発現の結果蓄積され 得、充分な量の選択化合物が産生された場合、選択効果が現れる。 本発明により、少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養された真 核細胞集団から、形質転換の結果代謝優勢を有する細胞を同定または選択する方 法を提供し、それは： ｉ）前記細胞が（a）化合物の代謝に含まれるタンパク質をコードするか、およ び／または（b）当該タンパク質をコードする遺伝子の活性を制御する領域を含 むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で形質転換されていること、 および ii）前記化合物がマンノースもしくはキシロースまたはそれらの誘導体または前 駆体、または前記タンパク質の基質であるか、または形質転換細胞によりそのよ うな基質に代謝される（ただし前記化合物は前記タンパク質がマンノース−６− リン酸イソメラーゼである場合、マンノースではない。）。 本発明は、更に少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養された真 核細胞集団から、形質転換の結果代謝優勢を有する細胞を同定または選択する方 法を提供し、それは： ｉ）前記細胞が（a）化合物の代謝に関与するタンパク質をコードするか、およ び／または（b）タンパク質をコードする遺伝子の活性を制御する領域を含むヌ クレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で形質転換されていること、およ びii）前記化合物の細胞に対する毒性を低下させる薬剤を培地に添加する。 好ましくは、毒性を減少させる薬剤を培地に添加する場合、化合物はマンノー スであり、ヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列はマンノース−６− リン酸イソメラーゼをコードする。 「代謝優勢」を有する細胞は、とりわけ、劣勢の細胞より早く成育することが でき、および／または劣勢細胞が利用できない（栄養素前駆体等の）基質を有利 に利用でき、および／または劣勢細胞に毒性またはそうでなければ成育阻害する 基質を無毒化できる。 「化合物の代謝に関与する」タンパク質は、排他的ではないが典型的には、化 合物またはその誘導体または前駆体の産生または利用を、直接または間接的に担 い得る酵素である。タンパク質が化合物に結合し、化合物を細胞または組織また は生物内の他の部位に移し、そうでなければ化合物を隔離し、それによりその局 所能力を変えるのであれば、化合物の代謝にまた関与し得る。 「タンパク質をコードする遺伝子の作用を制御する」ヌクレオチド配列の領域 は、プロモーターにより、またはそれによりプロモーター活性を有することによ り、およびその近接部位内または近くに挿入することにより内因性遺伝子の発現 のレベルを変え得る。「近く」は、１０,０００kbまでを意味する。別法として 、間接制御は、ＲＮＡポリメラーゼの結合をタンパク質をコードする構造遺伝子 のプロモーターに変え、または相補的結合を構造遺伝子の少なくとも一部分のヌ クレオチド配列に変え、従って典型的には細胞中のタンパク質の量を減少するこ とに起因し得る。 マンノースまたはキシロースの「誘導体」は、直接または間接的にマンノース またはキシロースの代謝に関与する任意のタンパク質に利用され、結合し、基質 になりまたは生産物であることができる任意の化合物を意味する。マンノースの 場合、このような誘導体は、エピメラーゼ作用の対象となり、それによりマンノ ースまたは誘導体または前駆体が産生されるグルコースまたはガラクトースのよ うな炭水化物を含むことは認められよう。「誘導体」は、残基が共有またはイオ ン結合している１個またはそれ以上の水酸基を有するマンノースまたはキシロー スをまた含む。このような結合残基は、エステル、エーテル、アミノ基、アミド 基、リン酸基、スルフェート基、カルボキシル基、カルボキシ−アルキル基およ びそれらの組み合わせを含む。もし誘導体化がマンノースまたはキシロースを産 生するためにこのような方法での除去を担うのであれば、マンノースまたはキシ ロース誘導体は、マンノースまたはキシロース前駆体もまた含み得る。 本発明の明細書における「細胞」の語はプロトプラストを含み、「細胞集団」 は組織、器官またはそれらの一部、基質中または上の個々の細胞集団または全生 物、例えば植物を含む。 本発明は、本発明の方法を使用して選択された形質転換細胞および植物細胞の ような形質転換細胞およびこのような細胞由来の植物、子孫または種子を含む。 本発明の方法により選択し得る植物は：トマト、マンゴー、桃、リンゴ、ナシ、 イチゴ、バナナおよびメロンを含む果実；キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、サト ウダイコンならびに小麦、大麦および米のような小穀粒穀物、トウモロコシおよ び綿ならびにジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツおよびタマネギのような 野菜を含む農地作物を含む。 特に好ましい植物はサトウダイコンおよびトウモロコシである。 イン・ビボでの本陽性選択法の使用は、形質転換細胞の選択を、隣接する非形 質転換細胞を直接傷付けずに行うため、例えば全植物または植物部分（ここで、 植物または部分は形質転換および非形質転換細胞を含むものである）上で行った 形質転換に関して、特に適切である。このように、形質転換細胞は非形質転換細 胞と比較して選択「優勢」を有する（例えば、新芽形成能力）が、抗生物質また は除草剤を使用した陰性選択の場合のように、非形質転換細胞は傷害または死滅 という意味で深刻な損失を被らない。 形質転換細胞が有する「選択優勢」は、形質転換細胞を、簡単な視覚的手段に より、すなわちマーカー遺伝子の存在を測定するために別のアッセイ−を使用す る必要なく同定できるようにする差異または利点である。 細胞集団は、不活性であり得、直接または間接的に形質転換細胞中で活性化さ れる少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養し得、本化合物は、形 質転換細胞を細胞集団から選択可能にするような選択優勢を提供するように、非 形質転換細胞中で不活性または形質転換細胞中より非形質転換細胞中でのほうが 活性が少ない。 細胞集団は、ヌクレオチド配列の発現または転写により形質転換細胞中で利用 されるようになる化合物を含む培地上または中でまた栽培し得、本化合物は、形 質転換細胞に選択優勢を提供するように、非形質転換細胞中で利用されず、また は非形質転換細胞中であまり利用されない。 ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが形質転換細胞中で不活性 化合物を直接活性化する場合、非形質転換細胞は、典型的には酵素であり得る上 記ポリペプチドを一定量内因性に含むかまたは産生し得る。このような場合、「 不活性化合物」は、化合物または栄養素が単に実質的に形質転換細胞中より、非 形質転換細胞中で活性が低いだけで充分であり得るため、非形質転換細胞中で完 全に不活性である必要はない。言い換えれば、形質転換細胞と非形質転換細胞の 間の最初は不活性な化合物の活性化の量的差異が、選択の目的で充分であり得る 。このような場合、天然酵素と競合する阻害剤または基質を、細胞に加え得る。 特に好適には、阻害剤は天然酵素により活性化され、天然酵素が実質的に完全に 阻害されるレベルまでの活性化阻害剤の産生の自己触媒をもたらす。 不活性化合物の「活性化」が、形質転換細胞による化合物の選択的取り込みを 含み、非形質転換細胞による取り込みは、不可能であるか、少ない程度で行われ るように、化合物の細胞膜の通過を可能にし、形質転換細胞内へ挿入させ、また は他の（細胞小器官）膜を通過させるパーミアーゼまたは他の輸送因子をコード し得る共挿入ヌクレオチド配列で、細胞を形質転換し得る。細胞内への化合物の 促進された取り込みの変わりに、共挿入ヌクレオチド配列は、その産生を、不活 性化合物が位置する部位、例えば細胞質膜の外側または液胞中または小胞体へ代 わりに向ける。 ２種のヌクレオチドが細胞内へ共挿入される場所へ、細胞内の１つのヌクレオ チド配列の存在が他の配列の細胞内の存在を示唆するかまたは存在の可能性を増 大させる方法で所望により各々組み合わせてまたはそうでなければ一緒に挿入し 得る。２個のヌクレオチド配列は、したがって、必須ではないが、典型的には同 じ遺伝子構築物の一部であり、同じベクターを経由して挿入し得る。 挿入ヌクレオチド配列が形質転換細胞内で発現されることが必要であるため、 ２種のヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は、典型的にはヌクレオチド配列の 発現を可能にする制御配列、例えば既知のプロモーターおよび転写ターミネータ ーを一般的に含む。したがって、共挿入ヌクレオチド配列は、一般的には構造的 または制御可能であり得るプロモーターと関連する。 本明細書に記載の方法は、２種のヌクレオチド配列が独立して挿入された場合 も使用し得る。これは、例えば両方の遺伝子の取り込みのために同じ細菌を使用 して、所望のヌクレオチド配列の相対的に多い数のコピーを細胞に取り込ませて 行い得、それにより共挿入ヌクレオチド配列の発現を示す細胞がまた所望のヌク レオチド配列を含有し、発現する確立が相対的に高くなる。同じ細胞内での遺伝 子の共発現をもたらす２個またはそれ以上の遺伝子の個々の挿入は、一般的に低 い確実性が予期され、陽性選択法により得られる改善された選択頻度は、したが ってこのような系で特に有利であると予期される。 選択の目的で使用される化合物は、加えて、陽性および陰性作用の両方を有し 得る。例えば非常に高濃度のマンノースは殆どの植物にとって有毒であるが、マ ンノース代謝酵素を有している細胞においては陰性作用はなくなり、細胞はマン ノースを炭水化物源として使用できるようになるという利点を更に得る。この場 合、１個の化合物および１個の遺伝子が、共に複合陽性および陰性選択系を提供 するが、このような系は、形質転換細胞内の化合物の陰性作用の阻害および化合 物の陽性作用の明示を担う２個またはそれ以上の遺伝子と共に使用してまた確立 し得る。 本方法の更なる態様において、ヌクレオチド配列の発現または転写が、形質転 換細胞中における細胞集団に供給された化合物の代謝の阻止または化合物の合成 の阻止をもたらし、それにより形質転換細胞が、非形質転換細胞から同定または 選択できる。 本方法の更に別の態様において、形質転換細胞は、陽性選択および陰性選択を 組み合わせて選択し得、形質転換細胞中のヌクレオチド配列は、毒素、抗生物質 および除草剤からなる群から選択された少なくとも１つの要素に対する耐性をコ ードするヌクレオチド配列と共挿入され、細胞を培養する培地中または培地上に 形質転換細胞が耐性を示す、毒素、抗生物質および除草剤からなる群から選択さ れた少なくとも１つの要素を含有する。ヌクレオチド配列が、少なくとも２種の 異なった選択遺伝子と共挿入されるのが好ましい。 化合物がマンノースまたはキシロースであるのが好ましい。上に示唆したよう に、化合物は、しかしながらマンノース誘導体、例えばマンノース−６−リン酸 もしくはキシロースリン酸のようなキシロース誘導体もしくはマンノースまたは キシロース前駆体であり得る。 細胞は、その中に包含されるのが好ましい任意のヌクレオチド配列で形質転換 し得る。このようなヌクレオチドは、ウィルス、真菌、細菌または線虫耐性を提 供する遺伝子をコードし得る。 細胞は、化合物による形質転換細胞の選択が細菌による形質転換細胞の形質転 換後感染の危険性を減少させる利点を有するように、化合物に感受性のアグロバ クター種のような細菌により形質転換し得る。細胞を、電気泳動、顕微注射法、 微小噴出ガン（micro-projectile gun）の使用ならびにＲiおよびＴiプラスミド での形質転換を含む任意の好適な既知の手段で形質転換し得ることは認められよ う。形質転換細胞は、好適な場合、組換ＤＮＡが安定にゲノム内へ取り込まれて いる全植物に再生し得る。 タンパク質は、好ましくはマンノースまたはキシロース代謝に関与する酵素で ある。このような酵素は、キシロイソメラーゼおよびマンノース−６−リン酸イ ソメラーゼおよびマンノース−１−リン酸−イソメラーゼのようなホスホマンノ イソメラーゼ；炭水化物をマンノースへまたはマンノースをグルコースまたはガ ラクトースのような炭水化物に転換するようなマンノースエピメラーゼ；マンノ ース−６−ホスファターゼーゼおよびマンノース−１−ホスファターゼのような ホスファターゼおよびマンノースまたは誘導体または前駆体の細胞内への輸送に 関与するパーミアーゼを含む。 化合物の細胞への毒性を軽減する薬剤は、典型的にはメチル−Ｏ−グルコース またはフロリジン（phloridzin）のようなグルコース誘導体である。 本発明は以下の文と図を組み合わせて考えて、更に明瞭になるであろう、その 中で図は： 図１は、大腸菌（E.coli）ホスホマンノースイソメラーゼコード領域を含むＢ Ｃl1/ＨindIII制限フラグメントの製造を示す； 図２は、プラスミドＥＰＬ（ピートルザック,Ｍら、Nucleic Acids Res.１４ 、５８５７〜５８６８頁（１９８６））を示す； 図３はバイナリープラスミドｐＢＫＬ４（ニールセン,Ｋ.Ｋ.ら、Mol.Plant.M icrobe Interact.６、４９５〜５０６頁（１９９３））を示す； 図４は、ＧＵＳ遺伝子およびＮＰＴII遺伝子の間にマンＡ（man A）遺伝子を 含むプラスミドｐＢＫＬ４を示す。 大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼコード配列含有バイナリーp（ＢＫＬ４ −マンノース）の構築 大腸菌ホスホマンノースイソメラーゼ（EC5.3.2.8）遺伝子は、プラスミドｐ ＧＳ６３（マイルス,Ｈら、Gene３２、４１〜４８頁（１９８４））（図１）由 来であり、構築物はｐＢＲ３２２由来であり、その中の独自のＰstＩおよびＨin dIII部位の間の領域が、ホスホマンノースイソメラーゼの構造遺伝子（マンＡ） およびフマラーゼ（フムＡ（fum A））の隣接遺伝子のフラグメントを保持する 大腸菌染色体の一部で置き換えられている。ｐＧＳ６３は、したがって、β−ラ クタマーゼ遺伝子の部分を欠失しており、テトラサイクリン上で選択される。 完全なＰstＩ/ＨindIII染色体フラグメントおよびｐＢＲ３２２の３５７bpセ クションを含むＰstＩ/ＢamＨＩフラグメント（２４６６bp）を、ｐＵＣ１８の 多重クローニング部位にライゲーションし、ｐＤＯ１８を形成した（図１参照） 。 ｐＤＯ１８をＨindIIIで消化させ、残った休息３'末端をクレノーポリメラー ゼを使用して満たす。ＨindIII部位（ＨindIII*）で満たされた開放ＤＯ１８プ ラスミド（図１参照）を、ＢcIIで消化させ、ホスホマンノースイソメラーゼコ ード領域を含む１２１８bpＢcII−ＨindIII*フラグメントを、最初にＳmaＩおよ び次いでＢamＨＩで消化させたプラスミド内へクローン化する。得られるプラス ミドをp（ＥＰＬ−マンノース）と呼ぶ。 ｐＥＰＬは、ＣＡＴ遺伝子がＰstＩにより除去されているＣaＭＶＣＮ（フロ ムら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８２、５８２４頁（１９８５）；フロムら、Natu re３ １９、７１９頁（１９８６））から構築した。小リンカー（リンカー：ＰstＩ− ＢamＨＩ−ＢaII−ＰstＩ）を本プラスミドＰstＩ部位に挿入し、pＬise（ｐＬ ）と呼ぶプラスミドを得る。ｐＬは、ＨincIIおよびＢgIIIで消化し、得られる ３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネーターを含むフラグメントを、ＥcoＲ ＶおよびＢgIIIで消化した他のｐＬプラスミドにクローン化する。ＥcoＲＶおよ びＨincIIは、平滑末端部位である。得られる構築物をpEnhanced-Lise（ｐＥＬ ）と呼ぶ。ｐＥＬは、変異体３５Ｓプロモーターをプロモーターの２５０bp上流 の縦列複写と共に含むという点で、本質的にｐＣaＭＶＣＮと異なる。変異体３ ５Ｓプロモーターは天然３５Ｓプロモーター（ケーら、Science２３６、１２９ ９〜１３０２頁（１９８７））の約１０倍高い転写活性を有する。ｐＥＬをＰst ＩおよびＢgIIIで消化し、それによりＮＯＳターミネーターを除去し、ＣaＭＶ ターミネーター（ＤＷ２t）を代わりに挿入する。最後に、リンカー（ＰstＩ− ＢamＨＩ−ＳmaＩ−ＳacＩ−ＳaII−ＳphＩ）を促進された３５Ｓプロモーター およびＣaＭＶターミネーターの間に位置するＰstＩ部位に挿入する。本プラス ミドをｐＥＰＬと呼ぶ（図２参照）。 p（ＥＰＬ−マンノース）を、完全促進３５Ｓプロモーター、大腸菌ホスホマ ンノースイソメラーゼおよびＣaＭＶターミネーターコード領域を含むフラグメ ントを単離するためにＨindIIIで消化した。単離フラグメントをバイナリーベク ターｐＢＫＬ４のＨindIII部位にクローン化する（図４）。得られるプラスミド をp（ＢＫＬ−マンノース）と名付ける。ｐＢＫＬ４中のＨindIII部位をカナマ イシン耐性遺伝子およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の間に位置させ る（図３）。マンノースキメラ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴII）お よびＧＵＳ遺伝子は、各々プロモーターおよびターミネーターを有する。図４は 、プラスミドｐＢＬＫ４のＧＵＳおよびＮＰＴII遺伝子の間に挿入されたキメラ ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含むp（ＢＫＬ−マンノース）構築物を 示す。 構築物p（ＢＫＬ−マンノース）を大腸菌から単離し、脱腕（dearmed）ヘルパ ープラスミドpＡＬ４４０４（ヘーケマら、Nature３０３、１７９〜１８０頁（ １９８３）；オームスら、Plasmid７、１５〜２９頁（１９８２））から成るア グロバクテ リウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４内 に、凍結融解法（ホルスターら、Mol.Gen.Genet１６３、１８１〜１８７（１９ ７８））により形質転換する。 ホスホマンノースイソメラーゼをコードする構造遺伝子（マンＡ）の配列は、 マイルスおよびゲストらにより公開されている（Gene３２、４１〜４８（１９８ ４））。無菌保存培養 ソラナム・ツベロサム（Solanum tuberosum）「サツルナ（Saturna）」「ビン チェ（Bintje）」または「ディアネラ（Dianella）」の新芽培養を、２μＭチオ 硫酸銀を添加したＬＳ基質（下記参照）上に温度は２５℃で、培養を１６時間明 ／８時間暗のサイクルに付してリンスマイアーおよびスコーグ（Physiol.Plant. 、１８：１００〜１２７（１９６５））に記載のように維持する。保存培養を２ ０〜４０日後副次培養する。葉は新芽から除去し、それぞれ１個の節を有するよ うに節セグメント（約０.８cm）に切断した。ジャガイモ組織の接種 共培養皿はＬＳ基質（シュークロース３０ｇ／l）、寒天（８ｇ／l）、２,４ −ジクロロフェノキシ酢酸（２.０mg／l）およびトランス−ゼアチン(０.５mg／ l）を含む。 約４０日令新芽培養由来の新芽（高さ約５〜６ｃｍ）を節間セグメント（約０ .８cm）に切断する。ジャガイモ細胞内に包含することを意図した遺伝子を含む バイナリーベクターを含むように形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファ シエンス含有液体ＬＳ−基質（ＬＳ−培地）内にセグメントを置く。このような 遺伝子は、例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、抗生物質カナマイシンに対 する耐性を提供するＮＰＴII遺伝子をコードするものおよび／またはマンノース 代謝に関与するタンパク質、例えばマンノース−６−リン酸イソメラーゼ、マン ノースエピメラーゼ、ホスホマンノースムターゼ等（下記参照）をコードする遺 伝子を含む。アグロバクターは、好適な抗生物質（アグロバクター株の耐性遺伝 子に対応）を含むＹＭＢ−基質（リン酸水素二カリウム（三水和物）（０.６６ ｇ／l）；硫酸マグネシウム（七水和物）（０.２０ｇ／l）；塩化ナトリウム（ ０.１０ｇ／l）；マンニト ール（１０.０ｇ／l）；および酵母抽出物０.４０ｇ／l）中で一晩培養し、６６ ０nmの光学密度（ＯＤ−６６０）を約０.８にする。懸濁液を次いで遠心し、Ｏ Ｄ−６６０のを０.５にするために細胞をＬＳ−培地に再懸濁する。 上記の節間セグメントを、次いで再懸濁アグロバクターの懸濁液中で３０分イ ンキュベーションし、次いで滅菌濾紙にブロットすることにより、セグメントか ら過剰の細菌を除去する。新芽セグメントおよびアグロバクターの共培養 新芽セグメントを細菌と７２時間、白薄葉紙で覆ったペトリ皿中のＬＳ−基質 （上記で定義の通り）中の濾紙上で共培養する。本基質を以後「共培養基質」と 呼ぶ。基質およびセグメントを滅菌濾紙で覆い、ペトリ皿を２５℃に置き、１６ 時間明／８時間暗のサイクルに付す。洗浄方法 共培養４８時間後、新芽セグメントを８００mg／ｌカルベニシリン添加ＬＳ− 培地に移す。このように移したセグメントを、次いで穏やかに振り、付着アグロ バクターを除去または破壊する。形質転換組織の選択 このように洗浄したセグメントを、次いでトランス−ゼアチンの濃度が１mg／ ｌである以外上記と同様であるＬＳ−基質に移し、基質にジベレリン酸（０.１m g／l）およびカルベニシリン（８００mg／l）および所望により硫酸カナマイシ ン（５０mg／l）および／またはマンノース（０〜２０ｇ／l）および／またはシ ュークロース（０〜２０ｇ／l）を添加する。本基質を以後「選択／再生基質」 と呼ぶ。 本セグメントを新鮮基質上で２週間間隔でまたは下記のように副次培養する。 ２〜４週間内に新芽がセグメントから発生し、新しい新芽の形成を約３〜４カ月 続ける。再生新芽の発根 再生新芽をカルベニシリン（５００mg／l）を加えたＬＳ−基質から成る発根 基質に移す。再生新芽の土壌への植え変え 新規発根再生新芽（植物）（高さ約２〜３cm）を発根基質から土壌に植え変え 、１６時間明／８時間暗サイクルおよび２００〜４００μＥ／sqm／秒の成育室 に置く。植物が十分確立された場合、それらを温室に移し、そこでそれらを塊茎 が発育し、植物の上部が老境を示すまで成育させる。形質転換体の遺伝的同定の確認 再生新芽のトランスジェニック遺伝子型を： （a）ラッドケら（Theor.Appl.Genet.７５,６８５〜６９４（１９８８））記載 のＮＰＴII測定を行う；または （b）ホダルら（Plant.Sci.８７,１１５〜１２２（１９９２））に従った共挿入 β−グルクロニダーゼ遺伝子による酵素発現におけるＧＵＳ測定を行う；または （c）マンノース代謝に関与する酵素、例えばホスホマンノースイソメラーゼを コードする挿入遺伝子のmＲＮＡの発現を測定するまたは酵素の活性を測定する ：ことにより確認する。実施例１ 再生植物を、新芽セグメントを細菌と共培養せず、その上で重要な洗浄工程を 省く以外、上記のように産生する。実験開始４０日目まで再生新芽の数を測定す る。表１は、アグロバクターで形質転換していないジャガイモ茎セグメント由来 の新芽再生のマンノースによる阻害を示す。表１から、マンノースが有効にその ような新芽の再生を阻害し、シュークロースがそのような再生を促進することを 見ることができる。一般にマンノースは、ほとんどの植物種において炭水化物源 として使用されない。マンノースを植物に加えた場合、代謝され、マンノース− ６−リン酸が蓄積される。マンノース−６−リン酸は、マンノース−６−リン酸 イソメラーゼによりフルクトース−６−リン酸に変換され、その変換される量は イソメラーゼの活性に依存する。このようなフルクトース−６−リン酸は植物に より利用されるが、実際高濃度のマンノースは植物にとって（代替炭水化物源が 利用可能であってもなくても）有毒である。したがって、表１から見られるよう に、新芽形成は、シュークロースの利用能に拘わりなく、シュークロースが高濃 度で存在している場合でさえ、マンノース濃度が５〜１０ｇ／ｌの場合完全に阻 害される。 実施例２ 再生植物を上記のように産生する。新芽セグメントと共インキュベーションす るアグロバクターを、細菌がＧＵＳおよびマンノース−６−リン酸イソメラーゼ コード遺伝子を含むベクターを有するように上記のようにして得られた構築物p （ＢＫＬ−マンノース）で形質転換する。 トランスジェニック（ＧＵＳ＋）新芽を、マンノースの新芽に対する毒性を減 少させる薬剤（メチル−３−Ｏ−グルコース）の存在下でマンノース代謝能力を 基本にして選択する。ＧＵＳ＋新芽を約５ｇ／ｌの濃度のマンノースの存在下で の成育の能力を基本にして選択する。 新芽セグメントの形質転換に使用したアグロバクターがマンノース−６−リン 酸イソメラーゼコード遺伝子を欠く以外p（ＢＫＬ−マンノース）と同様のベク ターを有するものである対照実験をまた行った。再生形質転換新芽を５ｇ／ｌマ ンノースおよび２０ｇ／ｌシュークロース存在下で成育させた場合、ＧＵＳ＋形 質転換体は得られなかった。実施例３ 新芽セグメントの形質転換に使用するアグロバクターがマンノース−６−リン 酸イソメラーゼコード遺伝子を欠く以外p（ＢＫＬ−マンノース）と同様のベク ターを有するものである更なる実験を行う。このようなベクターは、形質転換さ れた細胞にカナマイシン耐性を与えるＮＰＴIIコード遺伝子を含む。したがって 、ＧＵＳ＋形質転換体は、５０mg／ｌの濃度で存在するカナマイシンに対するそ れらの耐性を基本にして選択する。この後者の選択において、選択された細胞の 実施例２より低い割合がＧＵＳ＋である。実施例４ アグロバクターをp（ＢＫＬ−マンノース）で形質転換し、ＧＵＳ＋形質転換 体を、そのカナマイシン（５０mg／ml）上での成育の能力を基本にして選択する 以外、実施例３を繰り返す。この場合、選択された新芽の実施例３より低い割合 がＧＵＳ＋である。実施例５ アグロバクターの接種および共培養工程を除く以外ＰＣＴ／９２／００２５２ の実施例１３に記載のような標準葉ディスク法をタバコで行う。ベンジルアデニ ン（１mg／l）をサイトキニンとして使用し、炭水化物含量を下記のようにする 。各々の葉ディスクからの再生新芽の数を２１日後に記録する。 表２は、Ｄ−キシロースが、シュークロースが存在する場合、新芽再生を阻害 しないこと、加えてＤ−キシロースは炭水化物源として使用されないことを示す 。Ｄ−キシルロースは新芽再生の間の良好な炭水化物源である。 キシロースはキシロースイソメラーゼによりキシルロースに変換できる。した がって、機能的キシロースイソメラーゼ遺伝子および好適なプロモーターおよび ターミネーターの制御下にある更なる構造遺伝子を、植物、その部分またはそれ らの細胞に挿入し、形質転換植物、その部分またはそれらの細胞を、炭水化物源 としてのキシロース代謝の能力を基本にして選択する。実施例６ 外植体は、選択／再生基質にカナマイシンおよびカルベニシリンを添加しない 以外、上記の「形質転換組織の選択」に記載のように産生して処理し、植物を形 質転換しない。したがって、副次培養は、下記に示唆する量でキシロースを添加 する選択／再生基質へ、共培養基質から外植体を移された場合のみである。再生 新芽の数は１２週間後に記録する。 表３は、Ｄ−キシロースが（Ｄ−マンノースと比較して）、シュークロースが 存在する場合、新芽再生の弱い阻害剤であり、更にＤ−キシロースはキシロース 代謝酵素またはタンパク質の点では非形質転換である植物において炭水化物源と して作用しないことを示す。更に、Ｄ−キシルロース（５ｇ／l）を、シューク ロース非存在下で基質に加え、９週間後外植体当たり２.２新芽の再生が可能で あった。実施例７ 選択／再生基質にメチル−３−Ｏ−グルコース（ＭＯＧ）を表４で示唆する濃 度で加える以外、実施例５を繰り返す。生存外植体の割合を８週間後に記録する 。 表４は、ＭＯＧによる共処理は、感受性植物組織におけるマンノースの毒性効 果を阻害することを示す。炭水化物源として作用する化合物にとって最適の濃度 でマンノースは毒性であるため、ＭＯＧの添加は、マンノースの形での最適炭水 化物源を基質に添加することを可能にする。これは、他の炭水化物源非存在下で の陽性選択剤としてのマンノースの利用を可能にする。 実施例８ 再生／選択基質がマンノース（１５ｇ／l）および下記表５に示唆する濃度の メチル−３−Ｏ−グルコースを含み、シュークロースを含まない以外、実施例７ を繰り返す。形質転換植物材料はマンノース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子に ついてトランスジェニックである。２１日後、選択した新芽を回収する。全ての 回収した新芽で、共挿入β−グルクロニダーゼ遺伝子の発現を測定し、外植体当 たりのトランスジェニックβ−グルクロニダーゼ発現（ＧＵＳ＋）新芽の全数（ ２回の収穫で）を、選択新芽の全数中のβ−グルクロニダーゼ発現（ＧＵＳ＋） 新芽の関数として計算する（表５）。 表５は、マンノースがメチル−３−Ｏ−グルコースと共に添加された場合、ト ランスジェニック新芽の選択は、他の炭水化物源非存在下で、マンノースの高い 濃度でさえ可能であることを示す。 実施例９ ＭＯＧをフロリジンに変える以外、実施例８を繰り返す。表６は、マンノース をフロリジンと共に加えた場合、１００％トランスジェニック新芽の選択が、他 の炭水化物シュークロース非存在下で高濃度のマンノースで可能であることを示 す。炭水化物輸送阻害剤の添加により、いかに交差摂食およびエスケーパーの産 生を最小にできるかという例である。 実施例１０ 表７は、マンノース以外の化合が、とりわけ大腸菌由来のマンノース−６−リ ン酸イソメラーゼ遺伝子を含むトランスジェニック植物において選択薬剤として 使用し得ることを示唆する。 実施例１１ 葉柄を含む子葉を外植体として使用しているＰＣＴ特許出願場番号ＰＣＴ／Ｄ Ｋ９２／００１０８に記載のいわゆるコット−ペット（cot-pet）法により、サ トウダイコンを形質転換する。苗木は、４〜７週間１２℃で、１６時間昼／８時 間夜の体制で発芽および成育させた種子由来である。子葉は、節の下２〜３mmを 切断し、離し（tawn apart）、暗い中または明るい中で、キシロース存在下また は非存在下に培養する。表８は、光の存在下ではサトウダイコンはキシロースを 炭水化物源として使用するが、暗い中では使用しないことを示し、とりわけキシ ロー スイソメラーゼ遺伝子に対してトランスジェニックであるサトウダイコンのキシ ロース基本陽性選択は、暗い中で行うべきであることを示唆する。 実施例１２ とりわけマンノース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子についトランスジェニッ クな外植体を産生し、選択／再生基質に、表９に示唆するようにマンノースおよ びシュークロースを添加する。再生新芽の数を１１週間後に記録する。表９は、 メチル−３−Ｏ−グルコース含有基質上での再生新芽の数を、マンノースおよび メチル−３−Ｏ−グルコース非存在下の基質上の新芽再生の数に対するパーセン トとして示す。 本発明が、上記の実施例に限定されないことは認められよう。例えば、マンノ ースまたはキシロース代謝、もしくはマンノースまたはキシロース誘導体もしく はマンノースまたはキシロース前駆体の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子 の特異的発現組織は、上記酵素のモジュレーターの基質にそれらを暴露すること によりこのような組織の成育制御の調節に使用し得る。更に、マンノースまたは キシロース（それらの誘導体または前駆体を含む）は、このようなキシローウま たはマンノースまたはそれらの前駆体又は誘導体の代謝に関与するタンパク質を コードする遺伝子を含むように形質転換された選択的優勢穀物に対して選択的除 草剤として使用し得る。 本発明の方法の使用は： ｉ）例えばホスホマンノースイソメラーゼコード遺伝子の挿入により、全般にま たはある組織／細胞型においてフルクトース−６−リン酸またはそれらの誘導体 の濃度が減少した真核生物； ii）例えばホスホマンノースイソメラーゼコード遺伝子の挿入により、全般にま たはある組織／細胞型においてマンノース−６−リン酸またはそれらの誘導体の 濃度が増加した真核生物； iii）細胞内にホスホマンノースイソメラーゼコード遺伝子を挿入したことによ り、全体またはある細胞型のホスホマンノースイソメラーゼ活性が増加した、真 核生物： を産生することもまた認められよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 ハルルップ、アンナ デンマーク国デーコー―2860ソボー、ゴア キス・アレー18番 (72)発明者 イェアスボー、モーテン デンマーク国デーコー―4800ニーケビン グ・ファルステア、フォーレマーケン21番 (72)発明者 クレイベアウ、イェッテ・ディーナ デンマーク国デーコー―4000ロスキレ、ド マーヴェンゲット16デー番、１ヴェー (72)発明者 ニールセン、ヨーン デンマーク国デーコー―2300コペンハーゲ ン・コー、コンゲディブスアレー１番、３ ホー (72)発明者 オケルス、フィン・ティーゲ デンマーク国デーコー―4000ロスキレ、コ ンゲマーケン11番 (72)発明者 ペーターセン、ステーン・グルアイアー デンマーク国デーコー―2610ロズオウア、 レーセンブローヴァイ32アー番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養された真核細胞集団 から、形質転換の結果として代謝優勢を有する細胞を同定または選択するにあた り、ｉ）前記細胞が（a）化合物の代謝に含まれるタンパク質をコードするか、 および／または（b）当該タンパク質をコードする遺伝子の活性を制御する領域 を含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で形質転換されているこ と、およびii）前記化合物がマンノースもしくはキシロースまたはそれらの誘導 体または前駆体、または前記タンパク質の基質であるか、または形質転換細胞に よりそのような基質に代謝されることができること（ただし、前記化合物は、前 記タンパク質がマンノース−６−リン酸イソメラーゼである場合、マンノースで はない。）を特徴とする方法。 ２．少なくとも１種の化合物を含む培地上または中で培養された真核細胞集団 から、形質転換の結果として代謝優勢を有する細胞を同定または選択するにあた り、ｉ）前記細胞が（a）化合物の代謝に含まれるタンパク質をコードするか、 および／または（b）当該タンパク質をコードする遺伝子の活性を制御する領域 を含むヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド配列で形質転換されているこ と、およびii）前記化合物の細胞に対する毒性を低下させる薬剤を培地に添加す ることを特徴とする方法。 ３．化合物はマンノースであり、ヌクレオチド配列または共挿入ヌクレオチド 配列はマンノース−６−リン酸イソメラーゼをコードするものである、請求項２ 記載の方法。 ４．ヌクレオチド配列（共挿入ヌクレオチド配列を含む。）の少なくとも１つ が、当該配列が挿入された生物によって奸まれるコドンが使用されて、当該配列 のタンパク質コード成分が内因性である生物中において非修飾ＤＮＡの発現で得 られたのと実質的に類似しているタンパク質を産生するように修飾されたＤＮＡ を含むものである、請求項３記載の方法。 ５．当該化合物が非形質転換細胞中で不活性であるか、または形質転換細胞中 よりも非形質転換細胞中で活性が低いか、または非形質転換細胞よりも形質転換 細胞に対して毒性が低いものであり、ヌクレオチド配列の発現または転写が化合 物の細胞への利用を増加させるか、または細胞中に内因的に存在する酵素の活性 を高めるものであり、かくして形質転換細胞中の酵素活性の方が非形質転換細胞 中の酵素活性よりも大となるものであるか、またはヌクレオチド配列の発現また は転写が、形質転換細胞中の当該化合物の代謝阻害または当該化合物の合成阻害 を導くものであり、それにより形質転換細胞が非形質転換細胞から同定できる、 請求項１〜４の何れかに記載の方法。 ６．細胞が、プロモーターにより制御され得る構造遺伝子の近くにあるＤＮＡ 配列と同種組換が可能な外因性プロモーターをコードしているヌクレオチド配列 で形質転換されている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 ７．化合物がマンノースである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８．化合物がマンノース−６−リン酸、キシロースまたはＤ−マンノースアミ ンである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ９．タンパク質が酵素である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 １０．酵素が、ホスホシュガー−イソメラーゼ、ホスホシュガー−ムターゼ、 ホスファターゼ、シュガーエピメラーゼ、シュガー−パーミアーゼおよびホスホ シュガー−パーミアーゼからなる群から選択されるものである、請求項９に記載 の方法。 １１．タンパク質がマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼである、請求 項１〜６および８〜１０のいずれかに記載の方法、またはタンパク質がキシロー スイソメラーゼである、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。 １２．ムターゼがホスホマンノムターゼおよびホスファターゼがマンノース− ６−ホスファターゼである、請求項１０記載の方法。 １３．細胞が化合物に感受性の細菌で形質転換される、請求項１〜１２の何れ かに記載の方法。 １４．形質転換細胞が陽性選択および陰性選択を組み合わせて選択されたもの であり、当該形質転換細胞内のヌクレオチド配列は、毒素、抗生物質および除草 剤からなる群から選択された少なくとも１つに対する耐性をコードする更なるヌ クレオチド配列を共挿入されており、その中または上で細胞を培養する培地は形 質転換細胞が耐性を有する毒素、抗生物質および除草剤からなる群から選択され た少なくとも１つを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。 １５．所望のヌクレオチド配列を、少なくとも２つの異なった選択遺伝子と共 挿入する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。 １６．毒性軽減剤がメチル−３−Ｏ−グルコースおよびフロリジンからなる群 から選択されるものである、請求項１〜１５の何れかに記載の方法。 １７．請求項１〜１６の何れかに記載の方法を使用して選択される、形質転換 細胞。 １８．植物細胞である、請求項１７記載の形質転換細胞、およびそのような細 胞由来の植物、子孫または種子。