JPH08510244A

JPH08510244A - 新規デオキシガラクトノジリマイシン誘導体

Info

Publication number: JPH08510244A
Application number: JP6525541A
Authority: JP
Inventors: エム．プラット，フランセス; アール．ネイセス，ガブリエル; エイ．ドウェック，レイモンド; ディー．バターズ，テリー
Original assignee: ジー．ディー．サールアンドカンパニー; モンサントカンパニー
Priority date: 1993-05-13
Filing date: 1994-05-11
Publication date: 1996-10-29
Anticipated expiration: 2020-04-06
Also published as: CA2159988C; US6291657B1; DK0698012T3; US5786368A; AU6783294A; DE69401658D1; US5580884A; WO1994026714A1; JP3636363B2; CA2159988A1; ATE148456T1; DE69401658T2; GR3022554T3; EP0698012B1; ES2097653T3; EP0698012A1

Abstract

(57)【要約】アルキルは３〜６個の炭素原子を含有する新規なデオキシガラクトノジリマイシンのＮ−アルキル誘導体が提供される。これらの新規化合物は糖脂質合成の選択的阻害に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】新規デオキシガラクトノジリマイシン誘導体関連出願の引照本出願は，1993年５月13日に出願された係属中の出願一連番号第08/061,645号の一部継続出願である。発明の背景本発明は，アルキル基が３〜６個の炭素原子を含有するデオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）の新規なＮ−アルキル誘導体に関する。これらの新規化合物は糖脂質合成の選択的阻害に有用である。 1993年５月13日に出願された本出願人の係属中の出願，一連番号第08/061,645 号には，デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）においてアルキル基に２〜８個の炭素原子を有するＮ−アルキル誘導体が糖脂質合成の有効な阻害剤として開示されている。ＤＮＪのこれらの誘導体はまた，以前からＮ−連結オリゴ糖プロセッシング酵素，α−グルコシダーゼＩおよびIIの阻害剤であることが知られていた。 Saunierら，J.Biol.Chem.257,14155-14166（1982）；Elbeinら，Ann.Rev.Bioche m.56 ,497-534（1987）。グルコース類縁体として，それらはまた，グルコシルトランスフェラーゼを阻害する可能性を有する。Newburnら，Arch.Oral.Biol.28， 516-536（1983）；Wangら，Tetrahedron Lett．34，403-406（1993）。グルコシダーゼに対するそれらの阻害活性は，抗高血糖剤および抗ウイルス剤としてのこれらの化合物の開発を導いてきた。たとえばＰＣＴ国際出願第ＷＯ87/03903号，米国特許第4,065,562号，第4,182,767号，第4,533,668号，第4,639,436号，第4, 849,430号，第5,011,829号および第5,030,638号参照。発明の簡単な説明本発明によれば，アルキルが３〜６個の炭素原子，好ましくは４〜６個の炭素原子を含有するデオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）の新規なＮ−アルキル誘導体が提供される。これらの新規な化合物は糖脂質合成を選択的に阻害するために有用である。非アルキル化ＤＧＪならびにＤＧＪのＮ−メチルおよびＮ− エチル誘導体はそれぞれ，このような阻害に関して不活性であることが見出されたので，上記阻害活性にはＮ−アルキル鎖の長さが重要であることがわかっている。ＤＧＪのＮ−プロピル誘導体は，わずかに活性であった。すなわち，最低３個の炭素原子のアルキル鎖長が効果に必須であることが明らかにされている。例証により，糖脂質を産生することができる細胞内での糖脂質の生合成は，細胞をこれらの任意の新規化合物の糖脂質阻害有効量で処置することによって選択的に阻害できる。ＤＧＪの活性なＮ−アルキル誘導体は，以前に報告されたＤＮＪのＮ−アルキル誘導体とは異なり，それらはＮ−連結オリゴ糖またはリソソームのグルコセレブロシダーゼのいずれの成熟に影響することもなく，糖脂質の生合成を選択的に阻害するので極めて有利である。たとえば，Ｎ−ブチルＤＮＪとは異なり，本発明のＮ−ブチルＤＧＪは驚くべきことに，プロセッシングα−グルコシダーゼＩおよびIIまたはリソソームのβ−グルコセレブロシダーゼを阻害しない。同様に，デオキシガラクトノジリマイシンを用いて以前に報告された実験的な証明としては，Ｎ−アルキル化（Ｎ−ヘプチルデオキシガラクトノジリマイシン）がある種のβ−グルコシダーゼに対するアフィニティーをわずかに増大させるとの指摘があるのみである［Legler & Pohl，Carb.Res．155，119（1986）］。アルキルが３〜６個の炭素原子を含む新規なＮ−アルキル化デオキシガラクトノジリマイシン類縁体のここに記載される阻害効果は，類似のイミノ糖化合物の相当する活性からは予期し得ないものであった。本発明のさらに他の独自性は，典型例のＤＧＪのＮ−ブチルおよびＮ−ヘキシル誘導体は糖脂質の生合成を完全に防止するのに対し，マンノース，フコースおよびＮ−アセチルグルコサミンのＮ−ブチル誘導体は，糖脂質の生合成には全く影響しないとの所見にも見られる。これらの化合物の糖脂質の生合成に対する阻害作用は，本明細書では，骨髄腫細胞系ＨＬ−60およびリンパ球細胞系Ｈ９において例示する。これらはよく知られ，広く配付されていて容易に入手可能なヒト細胞系である。たとえばＨＬ−60 は，Collinsら，Nature270，347-349（1977）に記載された前骨髄球性細胞である。それらはまたAmerican Type Culture Collection，Rockville，MD，U.S.A. から受入番号ATCC CCL 240で容易に入手できる。Ｈ９細胞は，Gallo & Popovic,Science 224 ，497-500（1984）に記載されたリンパ球起源の細胞である。それらも同じ寄託機関から受入番号ATCC HTB 176として容易に入手できる。ＤＧＪのこれらのＮ−アルキル誘導体による糖脂質生合成の阻害は，本明細書において，Ｎ−ブチルＤＧＪの存在下に培養した場合の例示的な細胞系Ｈ９へのコレラ毒素の結合の低下によってさらに証明される。これらの化合物は，したがって，以下の表１および２にそれぞれ例示するように，細菌細胞および細菌毒素の糖脂質受容体の表面発現の阻害により，抗微生物剤としてもまた有用である。糖脂質の生合成に対する阻害効果は，ゴーシェ病の標準的な，現技術水準でのインビトロモデルにおけるグルコセラミドの蓄積を相殺するＤＧＪのＮ−ブチルおよびＮ−ヘキシル誘導体の能力によってさらに例示される。このモデルにおいては，マウスマクロファージ細胞系ＷＥＨＩ−３Ｂを不可逆性グルコセレブロシダーゼ阻害剤，コンズリトールβエポキシド（ＣＢＥ）の存在下に培養してゴーシェ病に認められる遺伝性障害の類似状態が作成された。ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞については，Cancer Res.37, 546-550（1977）に記載されていて，American TypeC ulture Collection，Rockville，MDから受入番号ATCC TIB 68として容易に入手できる。本発明の化合物はリソソームの糖脂質の蓄積を防止し，これは以下の表３に例示するように，ゴーシェ病および他の糖脂質蓄積性障害の管理に有用である。ゴーシェ病は，β−グルコセレブロシダーゼ（β−Ｄ−グルコシル−Ｎ−アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ，EC3.2.1.45）をコードする遺伝子における突然変異によるグルコセレブロシド（グルコシルセラミド，Glc-Cer）の分解能の損傷を特徴とする常染色体性劣性疾患である。この欠損がマクロファージ単球系の細胞におけるGlc-Cerのリソソームへの蓄積を招来する［Barranger & G inns，"The Metabolic Basis of Inherited Diseases"，Scriverら編，1677-169 8頁，McGraw-Hill，New York（1989）；およびBeutler，Science 256，794-799 （1992）］。糖脂質の合成速度を減速することにより，損なわれたGlc-Cerの異化を相殺し，それによりGlc-Cerの平衡レベルの維持を導くことができる。ゴーシェ病の臨床的管理は，現在のところ，患者の対症療法または酵素置換療法のいずれかに頼っている［Beutler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90，5384-5390 （1993）］。酵素置換療法の著しく高額な経費とグルコセレブロシダーゼの静脈内投与の必要性を考慮すると，基質除去のあたりに基盤を置いた経口的に使用できる別の治療法があれば有用な代替療法となる。ＮＢ−ＤＧＪは，α−およびβ −グルコシダーゼ阻害剤に比べて酵素阻害特性の複合性は低いことから，ゴーシェ病および他の糖脂質蓄積性疾患の治療的管理のためには，ＮＢ−ＤＮＪに比べて好ましい代替物を構成する。発明の詳細な説明本明細書は，本発明を形成すると考えられる主題を個々に指摘してそれを明瞭に請求する請求の範囲によって結論づけられるものであるが，添付の図面とともに本発明の以下の例示的な詳細な説明を参照すれば，本発明はより一層明確に理解されるものと確信する。図１は，Ｎ−アルキル化イミノ糖の糖脂質生合成阻害剤としての比較を，一次元薄層クロマトグラフィー（ＩＤ−ＴＬＣ）によって示したものである。ＩＤ− ＴＬＣ分離は［¹⁴Ｃ］−パルミチン酸により標識されたＨＬ−60総細胞性脂質について実施した。細胞は0.5ｍＭのＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ− ＤＮＪ），Ｎ−ブチルデオキシマンノジリマイシン（ＮＢ−ＤＭＪ），Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ−ＤＧＪ）またはＮ−ブチル２−アセトアミド−１，２，５−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール（ＮＢ−ＮＡＧ）のいずれかで処置するかまたは非処置（ＵＴ）とした。糖脂質生合成の阻害はGlc-Cer，ガングリオシドおよび未知種（矢印で指示）の喪失により検出した。Glc-Cerの移動はＴＬＣ上に［¹⁴Ｃ］−Glc-Cer標準を包含させて確認した。放射標識された脂質種はオートラジオグラフィーによって可視化した。図２は，Ａ，ＢおよびCの３部分からなり，ＮＢ−ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＧＪで処置したＨＬ−60細胞の２Ｄ−ＴＬＣ分析結果を示す。２Ｄ−ＴＬＣ分離は，［¹⁴Ｃ］−パルミチン酸によって標識された総ＨＬ−60脂質について実施した。細胞は，0.5ｍＭのＮＢ−ＤＮＪもしくはＮＢ−ＤＧＪのいずれかによって処置するか，または非処置（ＵＴ）とした。脂質は以下のように帰属された（非処理細胞，左側のパネル，図２Ａ）：１，ガングリオシド；２，リソホスパチジルコリン；３，セラミドホスホリルコリン；４，セラミドホスホリルエタノールアミン；５，ホスパチジルコリン；６，ホスファチジルイノシトール；７，ホスファチジルエタノールアミン；８，ホスファチジルグリセロール；９，ジグリコシルセラミド；10，モノグリコシルセラミド；11，コレステロール／脂肪酸／中性脂質；ＮおよびＮ^*は未知種；０はサンプル原点である。ＮＢ−ＤＮＪおよびＮＢ −ＤＧＪ処置後（それぞれ，中央および右側のパネル，図２Ｂおよび２Ｃ），種１（ガングリオシド）；９（ジグリコシルセラミド）；10（モノグリコシルセラミド）およびＮ^*（未知種）は存在しなかった。放射標識された脂質は，オートラジオグラフィーによって可視化された。図３は，糖脂質生合成に対するＮＢ−ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＧＪの用量依存性効果を示す。１Ｄ−ＴＬＣ分析は総細胞性脂質について実施した。ＨＬ−60細胞は指示された濃度（μＭ）でのＮＢ−ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＧＪの存在下，または不存在下（ＵＴ）に［¹⁴C］−パルミチン酸で標識した。［¹⁴Ｃ］−Glc-Cerの移動位置は矢印で示す。脂質はオートラジオグラフィーにより可視化した。図４は，ＡおよびＢの２部分からなり，ＤＮＪおよびＤＧＪのＮ−アルキル鎖の長さの増大の糖脂質の生合成阻害に対する影響を示す。１Ｄ−ＴＬＣ分析は総細胞性脂質について実施した。ＨＬ−60は0.5ｍM濃度のＤＮＪもしくはＤＮＪのＮ−エチル，Ｎ−メチル，Ｎ−プロピル，Ｎ−ブチルおよびＮ−ヘキシル誘導体（左側パネル，図４Ａ），またはＤＧＪもしくはＤＧＪのＮ−エチル，Ｎ−メチル，Ｎ−プロピル，Ｎ−ブチルおよびＮ−ヘキシル誘導体（右側パネル，図４Ｂ）の存在下あるいは不存在下（ＵＴ）に［¹⁴Ｃ］−パルミチン酸で処置した。［¹⁴ Ｃ］−Glc-Cerの移動位置は矢印で示す。脂質はオートラジオグラフィーにより可視化した。図５および６は，インビトロのゴーシェ病モデルにおけるＮＢ−ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＧＪの分析を示す。とくに図５は，表示濃度（μＭ）におけるＮＢ−ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＧＪのいずれかで処置したＷＥＨＩ−３Ｂ細胞の糖脂質の１Ｄ−ＴＬＣ分析を示し，化学検出（下記方法の項参照）により可視化した。図６は，ＡからＨまでの８部分からなり，ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞のリソソームの透過型電子顕微鏡像を示す：図６Ａ，非処置；図６Ｂ，コンズリトールβエポキシド（ＣＢＥ）処置；図６Ｃ，ＣＢＥおよび500μＭのＮＢ−ＤＮＪ処置；図６Ｅ，ＣＢＥおよび50μＭのＮＢ−ＤＮＪ処置；図６Ｇ，ＣＢＥおよび５μＭのＮＢ−ＤＮＪ処置；図６Ｄ，ＣＢＥおよび500μＭのＮＢ−ＤＧＪ処置；図６Ｆ，ＣＢＥおよび50μＭのＮＢ−ＤＧＪ処置；図６Ｈ，ＣＢＥおよび５μＭのＮＢ− ＤＧＪ処置。図６Ｈの右下隅の目盛り線は６ＡからＨまでのすべての図に適用され，0.1μＭを表す。図７はＮ−連結オリゴ糖プロセッシングに対するＮＢ−ＤＧＪの効果を示す。とくに，ＮＢ−ＤＮＪもしくはＮＢ−ＤＧＪ（0.5ｍＭおよび５ｍＭ）いずれかの存在下または不存在下（−）におけるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現されるgp120のEndo H感受性を示している。矢印は非処理gp120（120k Da）およびEndo H消化後（60kDa）の分子量を示す。低分子量の付加的なバンド（60kDa）が一部のレーンに存在したが，それは固相マトリックスにより沈澱した非特異的タンパク質である。図８はＡ，ＢおよびＣの３部分からなり，糖脂質および糖タンパク代謝酵素活性に対するイミノ糖類縁体の効果を示すグラフ表示である。酵素活性は，以下の試験化合物の表示濃度における存在下に測定した：ＤＮＪ（◆）；ＮＢ−ＤＮＪ（■）；ＤＧＪ（▲）；ＮＢ−ＤＧＪ（●）（下記方法の項参照）。図８Ａ，ＵＤＰ−グルコース：Ｎ−アシルスフィンゴシングルコシルトランスフェラーゼ；図８Ｂ，β−グルコセレブロシダーゼ；図８Ｃ，プロセッシングα−グルコシダーゼ。酵素活性は試験化合物を含まなかった対照反応に対する百分率で表す。図９は，Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシンのレーザー分離質量分析法による分析であり，分子量は220（Ｍ＋Ｈ），純度95％以上で得られたことを示している図10は，Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシンの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。図11は，コレラ毒素結合アッセイのグラフ表示であり，ｙ−軸上にはＨ９細胞あたりのコレラ毒素結合部位の低下％を示している。この場合，コレラ毒素はフルオレセインと接合されていて，非処置（ｕｔ）細胞，およびｘ−軸上に示した様々な濃度（mg/ml）でのＮ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ− ＤＧＪ）処置，または比較のためのＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ− ＤＮＪ）処置細胞の細胞表面への結合レベルはフローサイトメトリーにより測定された。本発明をさらに詳細に説明するために以下の詳細な実施例が行われたが，本発明はこれらの特定の実施例またはその細部に限定されるものではないことを理解すべきである。実施例材料および方法化合物：Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）は，Searle/Monsanto社（St．Luis，MO，U.S.A.）から入手した。またデオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ），デオキシフコノジリマイシン（ＤＦＪ），デオキシマンノジリマイシン（ＤＭＪ），および２−アセトアミド−１，２，５−トリデオキシ−１，５ −イミノ−Ｄ−グルシトール（ＮＡＧ）は，Cambridge Research Biochemicals （Northwich，Cheshire，U.K．）から入手した。ＤＧＪ，ＤＦＪ，ＤＭＪおよびＮＡＧは，適当なアルデヒドを用い，Fleetら，FEBS Lett．237，128-132（1988 ）に記載の慣用操作により，水素下，パラジウム黒の存在下に，還元的にＮ−アルキル化した。反応混合物はセライトを通してろ過し，溶媒は真空下に蒸発させて除去した。得られたＮ−アルキル化類縁体は２ＭＮＨ₃（水溶液）中イオンン交換クロマトグラフィー［Dowex（登録商標）AG50-X12，Ｈ⁺型］によって精製し，溶媒を蒸発により除去した。これらの化合物は凍結乾燥し，Varian Unity 5 00型分光光度計上500ＭHｚでの１Ｄ¹Ｈ−ＮＭＲ，およびマトリックス補助レーザー分離（Finnegan）によって分析した。合成された化合物はすべて純度95％以上であった。以下に用いられる前述のＮ−アルキル化化合物の合成の代表例を次に示す。例１Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシンの製造の代表的例においては，30 mg（184μmol）のデオキシガラクトノジリマイシンを，１mlの50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ5.0に溶解し，これに20mgのパラジウム黒を添加した。反応容器内を水素雰囲気下に維持し，100μl（1.1mmol）のブチルアルデヒドを導入した。反応混合物を室温（約20℃）で16時間撹拌した。反応はセライト（30 〜80メッシュ）のベッド（１ｇ）を通してろ過して停止させ，反応生成物を，充填した４mlのDowex（登録商標）AG50-X12（Ｈ⁺型）樹脂を含むカラムを用いてクロマトグラフィーにより分離した。Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシンをクロマトグラフィーカラムから２Ｍアンモニアにより溶出した。その分子量はレーザー分離質量分析法によって測定して220（Ｍ＋Ｈ）であり，その化学構造は，１Ｄ¹Ｈ−ＮＭＲによりそれぞれ図９および10に示すように確認された。例２Ｎ−ヘキシルデオキシガラクトノジリマイシンの同様の製造には，カプロアルデヒドで当量のブチルアルデヒドを置換したことを除いて，例１の合成操作および化合物分析を反復した。その分子量はレーザー分離質量分析法により測定して 248（Ｍ＋Ｈ）であり，その化学構造は１Ｄ¹Ｈ−ＮＭＲにより確認された。例３Ｎ−プロピルデオキシガラクトノジリマイシンの同様の製造には，プロパノイルアルデヒドで当量のブチルアルデヒドを置換したことを除いて，例１の合成操作および化合物分析を反復した。その分子量はレーザー分離質量分析法によって測定して206（Ｍ＋Ｈ）であり，その化学構造は１Ｄ¹Ｈ−ＮＭＲによって確認された。上述の例示的実施例１〜３で製造されたＮ−アルキル化デオキシガラクトノジリマイシン化合物は出発原料のデオキシガラクトノジリマイシンに基づき68〜74 ％の総収率で得られ，純度は95％以上であった。酵素および酵素アッセイ：ブタ肝臓α−グルコシダーゼＩおよびラット肝臓α−グルコシダーゼIIを均質にまで精製し，以前にKarlssonら，J.Biol.Chem．268，570-576（1993）に記載された［¹⁴Ｃ］−グルコース標識Glc₃Man₉GlcNAc₂基質を用いて，慣用の操作で検定した。 β−Ｄ−グルコシル−Ｎ−アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ（グルコセレブロシダーゼ）はヒト胎盤から単離し，報告されている標準方法［Furbish ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，3560-3563（1977）；Dale & Beutler，同誌73 , 4672-4674（1976）］に従って均質に精製した。グルコセレブロシダーゼ活性は，窒素下にクロロホルム：メタノール（2:1 v/v）溶液から予め乾燥したグルコシルセラミド（１ｍＭ），Triton（登録商標）X-100非イオン界面活性剤（0.25 ％v/v）およびタウロデオキシコール酸ナトリウム（0.6％ v/v）を含有する緩衝液（50μlの50ｍＭクエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ5.0）の超音波処理懸濁液に酵素（５〜50μl）を添加して測定を行った。37℃で15〜60 分インキュベートしたのち，反応は500μlのクロロホルム：メタノールを添加して停止させ，遠心分離して相を分離した。上相は，Folchの理論下相［Folchら，J.Biol.Chem.226, 497-509（1957）］によって２回洗浄し，AG50-X12イオン−交換樹脂を用いて脱塩し，真空中で乾燥した。反応生成物は，高速陰イオン交換クロマトグラフィー（Dionex BioLC System）により分離し，パルス電流滴定によって検出した。酵素で放出されたグルコースの量は，包含された対照単糖に対して実験的に決定されたグルコース応答ファクターの適用によって，ピーク面積から計算された［Buttersら，Biochem.J.279, 189-195（1991）］。ＵＤＰ−グルコース：Ｎ−アシルスフィンゴシングルコシルトランスフェラーゼ（EC2.4.1.80）活性はラット脳ホモジネートおよびマウスマクロファージ組織培養細胞（ＷＥＨＩ−３Ｂ）ホモジネート中，報告されている慣用操作［Vunnam & Radin，Chem．& Phys．of Lipids 26,265-278（1980）；Shukla & Radin，Ar ch.Biochem.Biophys.283 ，372-378（1990）］を以下のように適合させた方法を使用して測定した。すなわち，ジオレオイルホスファチジルコリン，および200n molのセラミドIV型（Sigma）を含有するセレブロシドリポソームを，40ｍＭの2- ［Ｎ-モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液，ｐＨ6.5，５ｍＭＭｎＣｌ₂，2.5ｍＭＭｇＣｌ₂，１ｍＭＮＡＤＨおよび８μＭＵＤＰ−［¹⁴Ｃ］−グルコース（318mCi/mmol，Amersham International，Amersham，U.K.）の組成を有する反応混合物（100μl）に添加した。37℃で１〜２時間インキュベートしたのち，ＥＤＴＡ（25ｍＭ）およびＫＣｌ（50ｍＭ）を添加して反応を停止させた。放射標識された糖脂質を500μlのクロロホルム：メタノール（2:lv/v）で10分間抽出し，相を分離した。下相はFolchの理論上相で２回洗浄し，一部をシンチレーションカウンティングのために採取した。イミノ糖の阻害活性を試験する場合には，これらを適当な濃度でホモジネートに添加し，10 分間プレインキュベートしたのち，セラミド含有リポソームとともに超音波処理した。対照反応は，内因性アクセプターへの移動活性を測定するために，セラミドを含有しないリポソームで実施した。糖脂質分析：ＨＬ−60細胞はPlattら，Eur.J.Biochem.208, 187-193（1992）の記載に従い，慣用操作によって培養した。ＨＬ−60細胞は5×10⁴細胞／mlでイミノ糖の存在下または不存在下に24時間培養した。標識はBuuters & Hughes［In Vitro 17,83 1-838（1981）］の二次元薄層クロマトグラフィー（２Ｄ−ＴＬＣ）の慣用法で追跡した。略述すれば，［¹⁴Ｃ］−パルミチン酸（56.8mCi/mmol，ICN/Flow）をウシ胎児血清中超音波処理プレパレーション（FCS，Techgen，London，U.K.，0. 5μCi/ml）として添加し，培地中にイミノ糖を維持しながらさらに３日間細胞を培養した。細胞を収穫し，リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄し，１mlのクロロホルム：メタノール（2:1 v/v）中に抽出し，等カウントを負荷して一次元ＴＬＣ［１Ｄ−ＴＬＣ，クロロホルム：メタノール：水（65:25:4）］によって分離した。二次元分離には，上述のように一次元分離を行い，プレートを真空下に一夜乾燥させて，テトラヒドロフラン：ジメトキシメタン：メタノール：水（10:6:4:1）の溶媒を用いて二次元に分離した。プレートを風乾し，Hyperfilm- ＭＰ高速オートラジオグラフィーフィルム（Amersham）に露出させた。細胞培養および代謝標識：可溶性組み換えgp120を発現するＣＨＯ細胞（MRC AIDS Directoed Programme Reagent ProjectのP.Stevens博士より入手）の培養およびこれらの細胞の放射標識は，Karlssonら，J.Biol.Chem.268, 570-576（1993）に記載されている慣用操作によって行った。略述すれば，ＣＨＯ細胞を機械的に収穫し，0.1ＭｐＨ7.2 のリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄して，メチオニンおよびシステインを含まない，１％透析ＦＣＳ補充，ＲＰＭＩ−1640培地（ICN-Flow Laboratorie s,High Wycombe，Bucks，U.K.）中に再懸濁した。細胞（10⁷/ml）はＮＢ−ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＧＪの存在下または不存在下に１時間プレインキュベートしたのち，100μCi/mlのTran³⁵Ｓ−標識（ICN-Flow）を４時間添加した。上清を収集して，30kDaカットオフ膜（Amicon，Danvers，MA，U.S.A．）を使用して10分の１に濃縮した。免疫沈降：免疫沈降は，Karlsson（前出）により記載された慣用操作で実施した。上清を mAb ABT 1001モノクローナル抗体（American Biotechnologies Inc.,Cambridge ，MA，U.S.A.）0.5μg/100μl上清と，室温において30分間，ついでヒツジ抗− マウスＩｇＧ１−コート磁性ビーズ（Dynal Ltd.，Wirral，Merseyside，U.K.，サンプルあたりビーズ1.2×10⁷個）を加え，４℃で１時間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ中２％Triton（登録商標）X-100で３回，ＰＢＳで３回洗浄した。gp120を100μlの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に加熱（95℃，５分間）しながら溶出させた。各サンプルを２つの等量のアリコートに分割して，25 μlのd Ｈ₂Ｏを添加して最終容量を50μlとした。各サンプルの半分の一方には２μlのエンドグリコシダーゼＨ（エンドＨ，１単位/ml，Boehringer Mannheim Ltd.,Lewes，Sussex，U.K．）を添加し，他方の半分は未処理のまま放置した。消化は37℃で18時間行い，50μlのＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元サンプル緩衝液（95℃ ，５分）の添加により停止させた。糖ペプチド分析：ＨＬ−60およびＢＷ5147細胞は，ＲＰＭＩ−1640および10％ＦＣＳ中で培養した。細胞を，２ｍＭのＮＢ−ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＧＪの存在下または不存在下に，１％透析ＦＣＳを補充した還元グルコースＲＰＭＩ−1640培地（Flow）中で 30分間インキュベートした。［³Ｈ］−マンノース（16.5Ci/mmol，AmerSham）を 200μCi/mlで添加し，細胞をさらに３時間培養した。洗浄した細胞ペレットを10 ｍＭ塩化カルシウムおよび0.02％ナトリウムアジド含有50ｍＭトリス塩酸塩緩衝液，ｐＨ7.5中に懸濁し，100℃に５分間加熱した。冷却後，Pronase（登録商標）酵素を0.04％（w/v最終濃度）に添加し，トルエン下に37℃で96時間インキュベートし，Pronase（登録商標）のアリコートを24時間ごとに添加した。消化は５分間煮沸して停止させ，13000ｇで10分間遠心分離して糖ペプチドを回収した。Foddyら，Biochem.J．233，697-706（1986）の慣用操作に従って，サンプルを ConA-Sepharose（登録商標）クロマトグラフィーで分画した。インビトロゴーシェ病モデル：インビトロのゴーシェ病モデルは以下のように調製した。すなわちＷＥＨＩ− ３Ｂ細胞（American Type Culture Collection，Rockville，MD，U.S.A．）を，ＲＰＭＩ−1640培地，10％ＦＣＳ中，50μＭコンズリトールβエポキシド（ＣＢＥ，Toronto Research Chemicals，Downsview，Canada）の存在下または不存在下に，ＮＢ−ＤＮＪもしくはＮＢ−ＤＧＪとともにまたはこれらを加えないで，対数期増殖に14日間維持した。細胞を３日ごとに継代し，この間を通じて化合物濃度を維持させた。同数（５×10⁶）の細胞を収穫し，１mlのクロロホルム：メタノール（2:1 v/v）中，４℃で一夜抽出し，抽出物を遠心分離し，クロロホルム：メタノール抽出液はそのままにして，ペレットは上述したと同様にして室温で２時間再抽出した。プールした抽出液を窒素下に乾燥させ，10μlのクロロホルム：メタノール（2:1 v/v）に再溶解し，クロロホルム：メタノール：水（10: 6:4:1）中１Ｄ−ＴＬＣによって分離した。プレートを風乾し，α−ナフトール（メタノール中１％w/v）ついで50％（v/v）硫酸を用いて可視化した。透過型電子顕微鏡：電子顕微鏡検鏡用細胞（１処置あたり１×10⁷個）を収穫し，無血清ＲＰＭＩ −1640培地中で３回洗浄し，２％グルタルアルデヒド（v/v）と20ｍＭのHepes（ v/v）を含有する培地中に氷上で２時間固定した。細胞を20ｍＭ塩化カルシウム（w/v）含有0.1Ｍカコジレート緩衝液中で洗浄した。細胞を，1.5％フェロシアン化カリウム（w/v）含有25ｍＭカコジレート緩衝液（w/v）中１％四酸化オスミウムにより，氷上で２時間後固定した。サンプルをエタノール系列によって脱水し，プロピレンオキシドに移し，Embed800（Electron Microscopy Science，PA ，U.S.A．）に包埋した。切片を酢酸ウラニル／クエン酸鉛で染色し，Hitachi 6 00顕微鏡を用いて75kvで観察した。ＮＢ−ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＧＪによる３日間処理後のＨ９ヒトリンパ球細胞系へのコレラ毒素の結合分析：方法：細胞はＲＰＭＩ−1640培地中で対数期増殖に維持した。コレラ毒素Ｂ鎖（Sigma）をフルオレセインイソチオシアネート（Sigma）に接合させ，Plattら,Eur.J.Biochem.208 ，187-193（1992）に記載された慣用操作によりフローサイトメトリー分析を実施した。分析には，ＦＡＣＳcan Cytometer（Becton Dickin son,Sunnyvale，CA，USA）によって実施した。生存細胞に関するデータは蛍光強度の増加を10⁴桁のlog₁₀目盛りのグラフ上に集めた。データは，細胞あたりのコレラ毒素結合部位の低下率をｙ−軸，化合物濃度をｘ−軸として表示した。コレラ毒素：細胞表面結合の特異性はこの相互作用を100倍モル過剰のＧＭＩ誘導オリゴ糖，Gal βGalNAcβ4（NeuAc α3）Gal β4Glcβ3Cerにより阻害することによって確立された。結果糖脂質生合成の阻害剤としてのＮ−アルキル化イミノ糖の比較：グルコース類縁体，ＮＢ−ＤＮＪおよび４種のピラノース類縁体（ＮＢ−ＤＭＪ，マンノース類縁体；ＮＢ−ＤＦＪ，フコース類縁体；ＮＢ−ＤＧＪ，ガラクトース類縁体；およびＮＢ−ＮＡＧ，Ｎ−アセチルグルコサミン類縁体）について，500μＭ化合物濃度におけるＨＬ−60細胞内糖脂質への放射標識パルミテートの代謝性取り込みの阻害能を，１Ｄ−ＴＬＣ分析法を用いて上述の方法により評価した（図１）。ＮＢ−ＤＮＪのほかに，糖脂質の生合成を特異的に阻害した唯一の類縁体はＮＢ−ＤＧＪであった。他のすべての類縁体は効果がなかった。ＮＲ−ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＧＪはいずれもGlc-Cer，ガングリオシドおよび未知脂質種の生合成を阻害し，これは係属中の出願，一連番号08/061,645号に記載されている以前のＮＢ−ＤＮＪでの観察と一致した。ＮＢ−ＤＮＪおよびＮＢ− ＤＧＪがこの細胞系で全スペクトルの糖脂質に対して匹敵する効果を示すことを確認するため，２Ｄ−ＴＬＣを行い個々の糖脂質種をさらに分割した（図２）。糖脂質種の全体的喪失が500μＭのＮＢ−ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＧＪ両者で達成された。とくに，いずれの化合物による処置後にも，ガングリオシド，未知の脂質（Ｎ^*）ならびにモノおよびジヘキサシドの両種は存在しなかった。リン脂質組成および相対的な濃縮は処置に無関係に同等で，これは係属中の出願，一連番号08/061,645号におけるＮ−アルキル化イミノ糖がスフィンゴミエリンまたはリン脂質の生合成に影響しないとの以前の観察と一致した。この２つの類縁体をある濃度範囲でＩＤ−ＴＬＣにより比較したところ（図３），50μＭ〜500μＭ濃度で両類縁体ともに完全な糖脂質阻害を示したが，0.5〜５μＭという低濃度においても両化合物とも部分的な阻害を生じた。両類縁体とも試験した用量範囲において細胞毒性を示さなかった。糖脂質の生合成阻害におけるＤＮＪおよびＤＧＪのＮ−アルキル鎖長の増大の影響：一連のＮ−アルキル化ＤＮＪおよびＤＧＪ誘導体について，それらの糖脂質生合成阻害能を１Ｄ−ＴＬＣにより比較した（それぞれ図４Ａおよび４Ｂ）。非アルキル化イミノ糖，ならびにＮ−メチルＤＮＪ，Ｎ−エチルＤＮＪ，Ｎ−メチルＤＧＪおよびＮ−エチルＤＧＪは糖脂質の生合成に影響しなかった。検出可能な Glc-Cerの喪失により測定すると，両母体化合物のＮ−プロピル類縁体は部分的阻害活性を示したが，ＤＮＪおよびＤＧＪのＮ−ブチルおよびＮ−ヘキシル誘導体は糖脂質の生合成を完全に阻害した。すなわち，これらのデータは，以前の出願，一連番号08/061,645号（Ｎ−メチル誘導体がＮ−ブチルおよびＮ−ヘキシルＤＮＪと比較された）のデータと一致した。糖脂質の生合成の完全阻害を達成するために必要な最小のＮ−アルキル鎖長があり，ブチルおよびヘキシルが至適である。インビトロ−ゴーシェ病モデルにおけるＮＢ−ＤＧＪの分析：ＷＥＨＩ−３Ｂマウスマクロファージ細胞系は，不可逆性のグルコセレブロシダーゼ阻害剤ＣＢＥでの処置によってゴーシェの細胞に類似するように誘導することができる。ＮＢ−ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＧＪのGlc-Cer蓄積防止能をこの系で比較した（図５）。いずれの類縁体も５〜50μＭの用量範囲でＣＢＥ誘発糖脂質蓄積を防止した。したがって，これらのデータはＮＢ−ＤＮＪが，このインビトロゴーシェ病モデルにおける糖脂質蓄積の防止にＮＢ−ＤＮＪと同程度に有効であることを示している。ＮＢ−ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＧＪいずれかで処置した細胞からのリソソームの状態を透過型電子顕微鏡により評価した（図６）。いずれの類縁体も，ＣＢＥで処置した細胞のリソソームに認められる糖脂質の蓄積を防止することが見出された。糖脂質生合成経路に対するＮＢ−ＤＧＪの特異性：ＣＨＯ細胞系は，α−グルコシダーゼＩおよびIIの阻害を回避するように働くゴルジ体のエンドマンノーシダーゼの有意なレベルを欠く点において独特である［Karlssonら，J.Biol.Chem.268, 570-576（1993）；Hiraizumiら，J.Biol.Chem .268 ，9927-9935（1993）］。その結果，この系はα−グルコシダーゼ阻害を試験するための明確な細胞系を提供する。ＮＢ−ＤＮＪは以前に，組換えgp120を発現するこの細胞系において試験され，gp120上にエンドＨに対して完全な感受性を示すグルコシル化された高マンノースオリゴ糖の維持を生じることが見出された［Karlssonら，前出］。ＣＨＯ細胞内で発現するgp120のＮ−連結オリゴ糖の分析をＮＢ−ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＧＪの存在下または不存在下に実施した（図７）。0.5ｍＭもしくは５ｍＭのＮＢ−ＤＮＪによるＣＨＯ細胞の処置では完全なエンドＨ感受性gp120 Ｎ−連結グリカンを生じ，エンドＨに部分的に感受性であった非処置gp120と対照的であった。非処置gp120のこの部分的感受性はgp120が各分子あたり約50％の高マンノースＮ−連結オリゴ糖をもつことに起因する［Mizuochiら，Biochem.J. 254, 599-603（1988）；Mizuochiら，Biomed.Chrom.2，260-270（1988）］。しかしながらガラクトース類縁体，ＮＢ−ＤＧＪをこの系において0.5ｍＭおよび５ｍＭ濃度で試験したところ，gp120はエンドＨに対して部分的に感受性のままであり，非処理のgp120分子と識別できなかった。これはガラクトース類縁体が α−グルコシダーゼＩおよびIIの阻害剤として作用しなかったことを示唆した。内因性糖タンパク質の合成に対する作用を試験するために，放射標識した糖ペプチドを，処置したＨＬ−60およびマウスＢＷ5147細胞から単離して，それらの Con A-Sepharose（登録商標）に対する親和性を分析した。この操作は，二触角および高マンノース／ハイブリッドＮ−グリカンから四触角および三触角複合Ｎ −グリカンを効率的に分割する［Foddyら，Biochem.J.233, 697-706（1986）］。ＮＢ−ＤＮＪの添加は，プロセッシンググルコシダーゼが阻害された結果としてConA-Sepharose（登録商標）カラムから溶出する糖ペプチドの親和性を変化させる（図４）。したがって，非結合グリカン（四触角および三触角種）の比率は減少し，Con A-Sepharose（登録商標）に強固に結合して500ｍＭのメチルマンノシドで溶出する高マンノース／ハイブリッドグリカンの相当する増加が見出された。α−グルコシダーゼ阻害剤による処置後の糖ペプチド組成における類似の全体的変化はよく確立されている［Moore & Spiro，J.Biol.Chem.265,13104-13 112（1990）］。ガラクトース類縁体，ＮＢ−ＤＧＪでは，Con A-Sepharose（登録商標）クロマトグラフィーによる糖ペプチドプロファイルに変化を示さなかった。これらのデータを確認するため，グルコシダーゼの阻害を，精製α−グルコシダーゼＩおよびIIの混合物を使用して直接インビトロで測定した（図８）。ＮＢ−ＤＮＪはグルコシダーゼＩおよびIIを0.36μＭのＩＣ₅₀で阻害したのに対しＮＢ−ＤＮＪはわずかな阻害を示したにすぎなかった（ＩＣ₅₀，2.13μＭ，表５）。これらのデータは，インビトロα−グルコシダーゼアッセイおよび無傷細胞系アッセイのいずれにおいても，ＮＢ−ＤＧＪがＮ−連結オリゴ糖のプロセッシングを阻害しないという確実な証拠を提供するものである。ＤＮＪおよびそのＮ−アルキル化誘導体はGlc-Cerのグルコースおよびセラミドへの切断に必要なリソソームグルコセレブロシダーゼ精製酵素の阻害剤である［Osiecki-Newmanら，Biochim.Biophys.Acta,915，87-100（1987）］。係属中の出願，一連番号08/061,645号におけるインビトロゴーシェ病モデルでの最近の試験では，ＣＢＥの不存在下でもＮＢ−ＤＮＪの存在下にインキュベートされたＷＥＨＩ−３Ｂ細胞でGlc-Cerの蓄積が観察された。したがって，ＤＮＪのＮ−ブチル誘導体はまた，細胞環境において，グルコセレブロシダーゼの阻害剤としても作用することが明白であった。そこで，ＮＢ−ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＧＪの阻害活性を，それらのヒト胎盤グルコセレブロシダーゼ阻害能を定量的に検討するために，直接測定した（表５）。ＮＢ−ＤＮＪは0.52ｍＭのＩＣ₅₀で触媒作用の中等度の阻害を与えたのに対し，ＮＢ−ＤＧＪは試験した最高濃度（１ｍＭ）でも酵素活性を阻害しなかった。この２つの類縁体によって達成された酵素阻害率に換算すると，１ｍＭのＮＢ−ＤＮＪは90％阻害を生じたのに対し，１ｍＭのＮＢ−ＤＧＪは非阻害性であり（図８），これによりＮＢ−ＤＮＪと比較して有利で予期できない選択的なＮＢ−ＤＧＪの阻害活性がさらに確認された。ＵＤＰ−グルコース：Ｎ−アシルスフィンゴシングルコシルトランスフェラーゼの阻害：ラット脳またはマウスマクロファージ組織培養細胞を用いてトランスフェラーゼ活性の決定には，外因的に添加したセラミドアクセプターおよびＵＤＰ−グルコースドナーの両者の飽和キネティックスを追跡した。これらの条件下では，Ｎ −ブチル化ＤＮＪおよびＤＧＪはいずれもグルコーストランスフェラーゼの中等度の阻害剤であった（ＩＣ₅₀はそれぞれ2.95ｍＭおよび60.88ｍＭ，表５）。それらの非修飾母体同族体は，試験した最高濃度それぞれ6.1および5.0ｍＭにおいても阻害は示さなかった（図８）。ＮＢ−ＤＧＪ処置Ｈ９ヒトリンパ球細胞系へのコレラ毒素結合の解析：細菌および細菌トキシンの糖脂質受容体の表面発現を阻害する代表的Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ−ＤＧＪ）の活性は，様々な濃度でのＮＢ−ＤＧＪの存在下に，Ｈ９細胞をコレラ毒素結合部位へ暴露することによって例示された。特異的プローブとしては，コレラ毒素Ｂ鎖のＧＭＩ結合特異性の利点を考慮した［van Heyningen，Nature 249，415-417（1974）;Karlsson，Ann .Rev.Biochem.58 ，309-350（1989）］。ＮＢ−ＤＧＪの存在下に培養したＨ９細胞へのコレラ毒素の結合は約70％低下した（図11）。これは細胞表面からのＧＭ１の喪失と一致し，比較ではＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）で得られた約90％の低下（図11）より低いが，ＮＢ−ＤＧＪによる糖脂質の阻害にさらに証明を提供するものであった。これらの結果から，イミノ糖誘導体には表１および２それぞれに示したように，細菌の糖脂質受容体および細菌毒素の表面発現を阻害することによる抗−微生物剤としての用途があることが明らかである。細胞を，上に示したように，化合物の存在下または不存在下に［³Ｈ］-マンノースで４時間放射標識した。洗浄後の細胞はPronase（登録商標）酵素で完全に消化し，得られた糖ペプチドは前述のように，Con A-Sephrose（登録商標）クロマトグラフィーにより分画化した。非結合性（複合四触角および三触角Ｎ−グリカン），10ｍＭメチルグルコシド溶出性（複合二触角Ｎ−グリカン），またはさらに500ｍＭメチルマンノシドでの溶出性（オリゴマンノースおよびハイブリッドＮ−グリカン）の放射標識糖ペプチドの百分率を，プールした溶出液から回収された放射能の評価により計算した。酵素は前述の操作に従い，図８中に示した濃度の類縁体を用いて検定した。図８からのデータを対数グラフ用紙上に上述のようにプロットして，ＩＣ₅₀値を正確に評価した。それらの細胞内糖脂質生合成の阻害剤としての使用に加え，本明細書に記載の阻害剤は，慣用の方法，好ましくは医薬的に許容される希釈剤および担体との製剤の型で，糖脂質蓄積性欠損患者への投与にも使用することができる。これらの薬剤は遊離アミンの型でもそれらの塩の型ででも使用できる。医薬的に許容される塩誘導体の例は，たとえば塩酸塩である。投与される活性薬剤の量は有効量，すなわち，医学的に有益であってその使用に伴う利点を越える毒性作用を示さない量でなければならない。成人の１日投与量は通常活性化合物約１〜約100mgの範囲である。好ましい投与経路はカプセル，錠剤，シロップ，エリキシル等の型での経口投与であるが，非経口的投与も可能である。治療用剤形としての，医薬的に許容される希釈剤および担体中活性化合物の適当な製剤は本技術分野における一般的な成書，たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences，Arthur Osol 編，16版，1980，Mack Publishing Co.，Easton，PA.，U.S.A刊を参照することによって調製できる。本開示を読んだのちの本技術分野の熟練者には，本発明の精神および範囲から逸脱することなく，様々な他の実施例が明白であろう。このような他の実施例はすべて，請求範囲に包含することが意図される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年２月２０日【補正内容】補正の説明（１）捕正１および２頁は明細書１頁１行〜２頁１行、「明細書・・・・・不活性であることが見出され」を訂正するものである。（２）補正３頁は請求の範囲の差しかえである。明細書新規デオキシガラクトノジリマイシン誘導体関連出願の引照本出願は，1993年５月13日に出願された係属中の出願一連番号第08/061,645号の一部継続出願である。発明の背景本発明は，アルキル基が３〜６個の炭素原子を有し，糖脂質合成の選択的阻害に有用なデオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）のＮ−アルキル誘導体に関する。 1993年５月13日に出願された本出願人の係属中の出願，一連番号第08/061,645 号には，デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）においてアルキル基に２〜８個の炭素原子を有するＮ−アルキル誘導体が糖脂質合成の有効な阻害剤として開示されている。ＤＮＪのこれらの誘導体はまた，以前からＮ−連結オリゴ糖プロセッシング酵素，α−グルコシダーゼＩおよびIIの阻害剤であることが知られていた。 Saunierら,J.Biol.Chem.257,14155-14166（1982）；Elbeinら，Ann.Rev.Biochem .56 ,497-534（1987）。グルコース類縁体として，それらはまた，グルコシルトランスフェラーゼを阻害する可能性を有する。Newburnら，Arch.Oral.Biol.28, 516-536（1983）；Wangら，Tetrahedron Lett．34，403-406（1993）。グルコシダーゼに対するそれらの阻害活性は，抗高血糖剤および抗ウイルス剤としてのこれらの化合物の開発を導いてきた。たとえばＰＣＴ国際出願第ＷＯ87/03903号，米国特許第4,065,562号，第4,182,767号，第4,533,668号，第4,639,436号，第4, 849,430号，第5,011,829号および第5,030,638号参照。発明の簡単な説明本発明によれば，アルキルが３〜６個の炭素原子，好ましくは４〜６個の炭素原子を含有し，糖脂質合成を選択的に阻害する，デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）のＮ−アルキル誘導体が使用される。非アルキル化ＤＧＪならびにＤＧＪのＮ−メチルおよびＮ−エチル誘導体はそれぞれ，このような阻害に関して不活性であることが見出され請求の範囲１．アルキルは３〜６個の炭素原子を含有するデオキシガラクトノジリマイシンのＮ−アルキル誘導体の，糖脂質を産生できる細胞における糖脂質の生合成を阻害する医薬を製造するための使用。２．アルキル基は４〜６個の炭素原子を含有する「請求項１」に記載の使用。３．アルキル基はブチルである「請求項２」に記載の使用。４．アルキル基はヘキシルである「請求項２」に記載の使用。５．阻害有効量は約50μＭから約500μＭである「請求項１」に記載の使用。６．糖脂質はグルコセラミドをベースとしたグリコスフィンゴ脂質である「請求項１」に記載の使用。７．糖脂質はリソソーム糖脂質である「請求項１」に記載の使用。８．糖脂質は，ゴーシェ病に冒された細胞内に蓄積するグルコセラミドである「請求項１」に記載の使用。９．アルキルは３〜６個の炭素原子を含有するデオキシガラクトノジリマイシンのＮ−アルキル誘導体の，細菌および細菌毒素の糖脂質受容体の表面発現を阻害する医薬を製造するための使用。 10．アルキル基は４〜６個の炭素原子を含有する「請求項９」に記載の使用 11．アルキル基はブチルである「請求項10」に記載の使用 12．アルキル基はヘキシルである「請求項10」に記載の使用。 13．阻害有効量は約50μＭから約500μＭである「請求項９」に記載の使用 14．細菌毒素はコレラ毒素である「請求項９」に記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者プラット，フランセスエム. イギリス国オーエックス１３キューユーオックスフォード，サウスパークスロード（番地なし），ユニバーシティーオブオックスフォードデパートメントオブバイオケミストリィ，グリコバイオロジィインスチチュート気付 (72)発明者ネイセス，ガブリエルアール. アメリカ合衆国 63017 ミズーリ州チェスターフィールド，ミュールソウルト 13939 (72)発明者ドウェック，レイモンドエイ. イギリス国オーエックス１３キューユーオックスフォード，サウスパークスロード（番地なし），ユニバーシティーオブオックスフォードデパートメントオブバイオケミストリィ，グリコバイオロジィインスチチュート気付 (72)発明者バターズ，テリーディー. イギリス国オーエックス１３キューユーオックスフォード，サウスパークスロード（番地なし），ユニバーシティーオブオックスフォードデパートメントオブバイオケミストリィ，グリコバイオロジィインスチチュート気付

Claims

【特許請求の範囲】１．アルキルは３〜６個の炭素原子を含有するＮ−アルキルデオキシガラクトノジリマイシン。２．アルキルはブチルである「請求項１」に記載のＮ−アルキルデオキシガラクトノジリマイシン。３．アルキルはヘキシルである「請求項１」に記載のＮ−アルキルデオキシガラクトノジリマイシン。４．アルキルはプロピルである「請求項１」に記載のＮ−アルキルデオキシガラクトノジリマイシン。５．糖脂質を産生可能な細胞内での糖脂質の生合成を阻害する方法において，細胞をアルキルが３〜６個の炭素原子を含有するデオキシガラクトノジリマイシンのＮ−アルキル誘導体の糖脂質阻害有効量に暴露することによる方法。６．アルキル基は４〜６個の炭素原子を含有する「請求項５」に記載の方法。７．アルキル基はブチルである「請求項６」に記載の方法。８．アルキル基はヘキシルである「請求項６」に記載の方法。９．阻害有効量は約50μＭから約500μＭである「請求項５」に記載の方法。 10．糖脂質はグルコセラミドをベースとしたグリコスフィンゴ脂質である「請求項５」に記載の方法。 11．糖脂質はリソソームの糖脂質である「請求項５」に記載の方法。 12．糖脂質は，ゴーシェ病に冒された細胞内に蓄積するグリコセラミドである「請求項５」に記載の方法 13．細菌および細菌毒素の糖質受容体の表面発現を阻害する方法において，アルキルが３〜６個の炭素原子を含有するデオキシガラクトノジリマイシンのＮ− アルキル誘導体のその発現の阻害有効量に，その発現を生じやすい細胞を暴露することからなる方法。 14．アルキル基は４〜６個の炭素原子を含有する「請求項13」に記載の方法。 15．アルキル基はブチルである「請求項14」に記載の方法。 16．アルキル基はヘキシルである「請求項14」に記載の方法。 17．阻害有効量は約50μＭから約500μＭである「請求項13」に記載の方法。 18．細菌毒素はコレラ毒素である「請求項13」に記載の方法。