JPH09275993A - Ｋ−２５２ａの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便・安価かつ精製効率が高い、Ｋ−２５２
ａの工業的規模の精製を可能とする方法を提供するこ
と。 【解決手段】 Ｋ−２５２ａを含む乾燥微生物菌体か
ら、抽出液中のＫ−２５２ａ純度が４０％以上になるよ
うに、含水または無水の有機溶媒を用いてＫ−２５２ａ
を抽出し、該抽出液を濃縮することにより、Ｋ−２５２
ａを単離し、これを回収することを特徴とするＫ−２５
２ａの精製法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｋ−２５２ａの発
酵培養液から、工業的に煩雑な工程を用いずに簡便に高
純度のＫ−２５２ａを精製する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｋ−２５２ａは微生物で生産される生理
活性物質である（特開昭６０−４１４８９）。その活性
はプロテインキナーゼＣ阻害剤に分類され種々の薬理作
用を示す。従来のＫ−２５２ａの精製方法は、培養液を
濾過して微生物菌体を取得し、その微生物菌体に含水ま
たは無水の有機溶媒、例えばメタノール、アセトン等を
添加し抽出した後、濾過して微生物菌体と抽出液に分離
し、得られた抽出液を濃縮し無水有機溶媒でさらに収率
良く抽出し、活性炭、ダイヤイオンＨＰ−１０等の吸着
剤、シリカゲル、シラナイズドシリカゲル、酸化アルミ
ナ、デキストラン等の担体を用いたカラムクロマトグラ
フィー方法を組み合わせて分離した後、濃縮し粗結晶を
得る方法である。この方法で得られる結晶の純度、収率
は必ずしも十分ではなく純度を上げるためには再結晶の
工程を必要とすること、および培養液の濾過性が著しく
悪く、少量の濾過は可能であるものの大容量では困難で
ある。

【０００３】また、培養液に直接有機溶媒を添加し抽出
し濾過により抽出液を取得する方法も可能であるが、Ｋ
−２５２ａの有機溶媒に対する溶解度は５〜１０ｇ／ｌ
程度であり、例えばアセトンに対する溶解度は５ｇ／ｌ
と高くないことから、添加する有機溶媒量は培養液と等
量以上必要となり処理容量が極度に多くなること、抽出
液の純度が悪いことからカラム処理等を必要とする。

【０００４】クロマトグラフィーを用いる方法では、吸
着剤および担体への負荷量が低いため多量の吸着剤およ
びクロマト担体を必要とするうえ、有機溶媒も多量に使
用しなければならないことから、生産性も低く工業的に
は必ずしも満足いく精製法ではない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
・安価かつ精製効率が高い、Ｋ−２５２ａの工業的規模
の精製を可能とする方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、Ｋ−２
５２ａを含む乾燥微生物菌体から、抽出液中のＫ−２５
２ａ純度が４０％以上になるように、含水または無水の
有機溶媒を用いてＫ−２５２ａを抽出し、該抽出液を濃
縮することにより、Ｋ−２５２ａを単離し、これを回収
することを特徴とするＫ−２５２ａの精製法が提供され
る。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明においては、微生物菌体か
らＫ−２５２ａを抽出するに当たり、抽出液中のＫ−２
５２ａ純度を４０％以上にすると、該抽出液を濃縮する
ことによりＫ−２５２ａを単離することができる。抽出
液中のＫ−２５２ａ純度を４０％以上にする方法として
は、Ｋ−２５２ａを含む乾燥微生物菌体から、含水また
は無水の有機溶媒を用いてＫ−２５２ａを抽出すること
により行い得る。

【０００８】抽出液中のＫ−２５２ａ純度とは、抽出液
中の全溶質重量に対するＫ−２５２ａの重量割合を示
す。全溶質重量は、抽出液を乾燥させた後の重量を測定
することにより求めることができる。Ｋ−２５２ａ重量
は抽出液の液量と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）等で測定するＫ−２５２ａの濃度から求めることが
できる。

【０００９】本発明に用いるＫ−２５２ａを含む微生物
菌体は、Ｋ−２５２ａ生産能を有する微生物を栄養培地
で培養した培養液から菌体を分離して得られる。Ｋ−２
５２ａ生産能を有する微生物としてはノカルデイオプシ
ス・エスピー（Nocardiopsis sp．） Ｋ−２５２（Ｎ
ＲＲＬ１５５３２、特開昭６０−４１４８９号）等があ
げられる。

【００１０】栄養培地は、Ｋ−２５２ａ生産能を有する
微生物を培養するのに通常用いられる培地であればいず
れでもよく、例えば通常の放線菌の培養に用いられる栄
養培地があげられる。培養法としては、液体培養、特に
深部攪拌培養法が適している。培養温度は２５〜４０
℃、ｐＨは中性付近で培養することが望ましい。培養液
中のＫ−２５２ａが最大となったところで培養を停止し
精製に用いる培養液を得る。本発明の精製に用いる培養
液のＫ−２５２ａ濃度は、０．５ｇ／ｌ以上が好まし
く、１．０ｇ／ｌ以上が特に好ましい。

【００１１】培養の停止は必要に応じて、塩酸、硫酸、
硝酸、酢酸等の酸、好ましくは硫酸を添加しｐＨ２〜４
に調整することにより行う。微生物菌体は培養液からは
遠心分離により分離し、洗浄することにより得られる。
遠心分離には、通常の遠心分離機が用いられるが、ウエ
ストファリアー、α−ラバル等の遠心分離機を用いるの
が好ましい。これら遠心分離機は、重液区分と軽液区分
に分離するもので完全に微生物菌体と上澄液に分離する
ことはできないが、大量の培養液を連続的に分離処理で
き、かつ洗浄水による微生物菌体の洗浄が同時に行える
点で好ましい。本発明においては、培養液上清は完全に
除くことが必要であるが、洗浄水は除く必要はなく、次
の乾燥工程へ液輸送する場合は、微生物菌体濃度を２０
〜５０％に調整するのが好ましい。

【００１２】微生物菌体を洗浄し濃縮した後、得られる
微生物菌体を乾燥する。乾燥には、ドラムドライヤー、
真空乾燥機、凍結乾燥機等の乾燥機が用いられるが、ド
ラムドライヤーが好ましい。ドラムドライヤーでの乾燥
は、温度９０〜１２０℃、回転数３〜５ｒｐｍの条件下
で、１時間あたり前述の濃縮洗浄微生物菌体１００〜２
００リットルを処理して行う。乾燥微生物菌体の水含量
は０〜１０％が好ましく、０〜５％がより好ましく、０
％が特に好ましい。

【００１３】また、該乾燥微生物菌体を粉砕し乾燥微生
物菌体の粉砕物とすると次の抽出工程で抽出率が向上し
好ましい結果が得られる。粉砕には、例えばスピードミ
ル、ボールミル、ハンマーミル、ロールクラシャー等の
粉砕機が用いられるが、好ましくはスピードミルが用い
られる。微生物菌体の粉砕は、６０メッシュ（約３００
μｍ）を通過する程度の粉砕が好ましい。

【００１４】得られる乾燥微生物菌体または乾燥微生物
菌体の粉砕物に、含水または無水の有機溶媒を添加し、
Ｋ−２５２ａを抽出する。有機溶媒としては水と混ざり
合う有機溶媒が好ましく、例えばアセトン、メチルエチ
ルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、メタ
ノール、エタノール、イソブチルアルコール、ブタノー
ル等のアルコール類、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエス
テル類等があげられる。

【００１５】含水有機溶媒としては上記有機溶媒に水を
添加した有機溶媒をあげることができる。抽出溶媒の含
水率がＫ−２５２ａの抽出率および抽出液中のＫ−２５
２ａ純度に大きく影響し、含水率が高くなるほど抽出率
は向上するものの抽出液中のＫ−２５２ａ純度は低下す
る。従って用いる有機溶媒毎に抽出液中のＫ−２５２ａ
純度が４０％以上となるような含水率を設定すればよ
い。抽出液中のＫ−２５２ａ純度が４０％未満では、次
に述べる単離工程が困難であり、また５０％未満では単
離量の低下傾向が認められる。従って、抽出液中のＫ−
２５２ａ純度は５０％以上が好ましい。含水率は、例え
ばアセトンの場合、１０％未満が好ましく５％未満がよ
り好ましい。

【００１６】抽出に用いる含水または無水の有機溶媒に
添加する乾燥微生物菌体または乾燥微生物菌体の粉砕物
の量は、該乾燥微生物菌体または乾燥微生物菌体の粉砕
物中のＫ−２５２ａが、該溶媒のＫ−２５２ａ溶解量の
０．０２〜１倍となるように添加すればよく、０．２〜
０．６倍となるように添加するのが好ましく、０．３〜
０．４倍となるように添加するのが特に好ましい。

【００１７】例えば、アセトンの場合、Ｋ−２５２ａの
溶解度は５ｇ／ｌであるので、アセトン１リットル中に
Ｋ−２５２ａが０．１〜５ｇ、好ましくは１〜３ｇ、特
に好ましくは１．５〜２ｇとなるように乾燥微生物菌体
または乾燥微生物菌体の粉砕物を添加すればよい。な
お、乾燥微生物菌体および乾燥微生物菌体の粉砕物中の
Ｋ−２５２ａ量は、有機溶媒で抽出したのち前述のＨＰ
ＬＣ等で求めることができる。

【００１８】乾燥微生物菌体または乾燥微生物菌体の粉
砕物からのＫ−２５２ａの抽出は、好ましくは２０〜８
０℃、より好ましくは３０〜５０℃で、０．１〜２４時
間、より好ましくは０．５〜２時間かけて行う。濾過に
より微生物菌体固形物を除いた抽出液を濃縮することに
よりＫ−２５２ａが析出してくる。濾過は、例えばヌッ
チェ、桐山ロート、フィルタープレス、バスケット分離
機等で行い得る。

【００１９】抽出液の濃縮は減圧下に加温することによ
り行う。濃縮は７００〜７６０ｍｍＨｇ、好ましくは７
２０〜７６０ｍｍＨｇで、温度３０〜８０℃、好ましく
は４０〜５０℃で行う。濃縮は好ましくは使用する含水
または無水の有機溶媒の飽和濃度以下となるまで行う。
濃縮後、濃縮液の温度を下げることによりＫ−２５２ａ
が析出してくるが、温度は使用する含水または無水の有
機溶媒により異なるが、好ましくは１０〜６０℃であ
る。

【００２０】Ｋ−２５２ａの別の析出方法としては、抽
出液を濃縮し抽出溶媒を完全に除いて乾燥させた後、水
を添加しその後有機溶媒を添加する方法があげられる。
添加する水の量は抽出に用いた溶媒容量の０．０１〜１
倍が好ましく、０．１〜０．５倍がより好ましい。ま
た、有機溶媒としては前述の水と混ざりあう有機溶媒が
あげられ、添加する有機溶媒の容量としては添加した水
の０．５〜１．５倍が好ましい。

【００２１】このようにして析出したＫ−２５２ａは、
濾過、乾燥等通常の方法により単離、回収できる。次
に、抽出液中のＫ−２５２ａ純度とＫ−２５２ａの析出
の関係を試験例により説明する。

【００２２】試験例１ 種菌としてノカルディオプシス・エスピー Ｋ−２５２
（ＮＲＲＬ１５５３２号）を用い、第１種培地として、
グルコース０．５ｇ／ｄｌ、溶出デンプン３ｇ／ｄｌ、
ソイビーンミール３ｇ／ｄｌ、コーンスチープリカー
０．５ｇ／ｄｌ、酵母エキス０．５ｇ／ｄｌ、炭酸カル
シウム０．３ｇ／ｄｌ、（殺菌前ｐＨ７．２〜７．４）
の培地を用いる。種菌１白菌耳を５０ｍｌ大型試験管に
入れた上記種培地１４ｍｌに植菌し、３０℃で３日間振
とう培養する。

【００２３】この種培養液４ｍｌを３００ｍｌ容エルレ
ンマイヤーフラスコに入った４０ｍｌの第２種培地に植
菌する。第２種培地の組成は第１種培地の組成と同じで
ある。第２種培養は３０℃で、３日間振とう培養する。
この第２種培養液４０ｍｌを２リットル容バッフル付き
エルレンマイヤーフラスコに入った３００ｍｌの第３種
培地に植菌する。第３種培地の組成は第１種培地の組成
と同じである。第３種培養は３０℃で、４日間振とう培
養する。この第３種培養液９００ｍｌを３０リットル容
ステンレス製ジャーファーメンター中の主発酵培地１６
リットルに植菌する。主発酵培地組成は第１種培地の組
成と同じである。この主発酵培養は３０℃で７日間通気
攪拌方式（回転数３００ｒｐｍ、通気量１６リットル／
分）により行い培養液１６リットルを得た。培養液１リ
ットル中の微生物菌体量は３００ｍｌであり該微生物菌
体中のＫ−２５２ａ含量は２ｇであった。該培養液１リ
ットルを用いて以下のサンプルを調製した。

【００２４】サンプル（１）：培養液を遠心分離し微生
物菌体３００ｍｌを調製した。 サンプル（２）：培養液ごと乾燥機で乾燥させ乾燥培養
物を調製した。 サンプル（３）：培養液を遠心分離し得られる微生物菌
体３００ｍｌを乾燥機で乾燥させ乾燥微生物菌体を調製
した。 サンプル（４）：サンプル（３）をスピードミルで粉砕
し乾燥微生物菌体の粉砕物を調製した。

【００２５】各サンプルに１００％アセトンを添加し３
０℃、２時間放置した後固形物をろ過しＫ−２５２ａの
抽出液を得た。乾燥微生物菌体からのＫ−２５２ａ抽出
率および抽出液中のＫ−２５２ａ純度を測定したのち５
０℃、７６０ｍｍＨｇで５０ｍｌまで濃縮し、１０℃で
２４時間放置しＫ−２５２ａの析出の有無を調査した。
結果を第１表に示す。

【００２６】

【表１】

【００２７】以上のことから、培養上澄み液を除いた微
生物菌体を乾燥することにより少量の有機溶媒で高純度
のＫ−２５２ａ抽出液を得ることができ、該抽出液を濃
縮するだけでＫ−２５２ａが析出されることがわかる。

【００２８】試験例２ 試験例１のサンプル（４）を用い、１００％アセトンの
替りに含水アセトンを用いる以外は試験例１の方法でＫ
−２５２ａを抽出した。抽出率および抽出液中のＫ−２
５２ａ純度を測定したのち５０℃、７６０ｍｍＨｇで５
０ｍｌまで濃縮し、１０℃で２４時間放置しＫ−２５２
ａの析出の有無を調査した。結果を第２表に示す。

【００２９】

【表２】

【００３０】以上のことから、抽出液中のＫ−２５２ａ
純度がＫ−２５２ａの析出に大きく影響していることが
わかる。また、アセトン濃度９０％以下、すなわち抽出
液中のＫ−２５２ａ純度が３９％以下ではＫ−２５２ａ
は析出しなかった。以下に本発明の実施例を示す。

【００３１】

【実施例】

実施例１ 試験例１と同様に培養して培養液を得た。培養液１６リ
ットル（Ｋ−２５２ａは２ｇ／ｌ，微生物菌体量４．８
リットル）を濃硫酸にてｐＨ２に調整後、高速遠心分離
機（日立製、ＣＲ−２０）にて洗浄および微生物菌体分
離を行ない微生物菌体濃度５０％の洗浄微生物菌体懸濁
液（９．６リットル）を得た。得られた洗浄微生物菌体
懸濁液をドラムドライヤー（カツラギ工業、３１５ｍｍ
径×３５０ｍｍ）に液輸送し、乾燥処理を行った。乾燥
は１０５℃で１２時間行い、乾燥微生物菌体１．４ｋｇ
を取得した。この乾燥微生物菌体をスピードミル（ダル
トン製、Ｐ−０２Ｓ）により粉砕した。９５％アセトン
２０Ｌを添加し、４０℃で２時間静置し抽出後、ヌッチ
ェを用い濾過し、ろ液１８リットルを得た。該ろ液を、
減圧濃縮機（東京理科機器、Ｎ−２ＮＷ）を用いて５０
℃、７６０ｍｍＨｇの減圧下で、０．５リットルまで濃
縮した後、温度１０℃に冷却した。その結果、２３ｇの
Ｋ−２５２ａが結晶として析出した。結晶の純度は９５
％であった。

【００３２】実施例２ 実施例１で得た１６リットルの培養液を６ｋｌの主発酵
培地の入った２０ｋｌのファーメンターでさらに７日間
（回転数３００ｒｐｍ，通気量１８リットル）培養し培
養液６ｋｌ（Ｋ−２５２ａは２ｇ／ｌ，微生物菌体量
１．８ｋｌ）を得た。該培養液６ｋｌを濃硫酸にてｐＨ
３に調整した後、ソイビーンミール等の不溶物を振動ふ
るい（興和工業製、ＫＦ−７００）により除去し、実施
例１で用いた遠心分離機により洗浄および微生物菌体分
離を行ない微生物菌体濃度約３０％の洗浄微生物菌体懸
濁液を得た。得られた洗浄微生物菌体を実施例１で用い
たドラムドライヤーにて乾燥し乾燥微生物菌体１６５ｋ
ｇを取得した。得られた乾燥微生物菌体を実施例１の粉
砕機で粉砕した後、９５％アセトン３．３ｋｌで抽出し
た。抽出液を実施例１の濾過機で濾過した後、５℃、７
６０ｍｍＨｇの減圧下で、１．１リットルまで濃縮し、
１０℃で静置した。その結果、４ｋｇのＫ−２５２ａが
結晶として析出した。結晶の純度は９３％であった。

【００３３】

【発明の効果】本発明により、簡便・安価かつ精製効率
が高い、Ｋ−２５２ａの工業的規模の精製を可能とする
方法が提供される。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｋ−２５２ａを含む乾燥微生物菌体か
   ら、抽出液中のＫ−２５２ａ純度が４０％以上になるよ
   うに、含水または無水の有機溶媒を用いてＫ−２５２ａ
   を抽出し、該抽出液を濃縮することにより、Ｋ−２５２
   ａを単離し、これを回収することを特徴とするＫ−２５
   ２ａの精製法。
2. 【請求項２】 乾燥微生物菌体が乾燥微生物菌体の粉砕
   物である請求項１記載の方法。