JPH09502263A

JPH09502263A - ヒドラジン誘導体化細胞

Info

Publication number: JPH09502263A
Application number: JP7507700A
Authority: JP
Inventors: グラナドス，エドワード・エヌ; チヤウ，ハーバート・エス; ハイマン，ダニエル・エフ; ターラー，マリア・エル
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-08-27
Filing date: 1994-08-22
Publication date: 1997-03-04
Also published as: WO1995006255A1; CA2167931A1; AU7600994A; EP0715720A1; US5637472A; US5591598A

Abstract

(57)【要約】化学的に誘導体化して、ヒドラジド官能基をその細胞表面膜分子上に共有結合で取り込んだ半固体粒子又は細胞の製造方法、及び粒子又は細胞上にあるヒドラジドのレベル決定方法を提供する。該方法は、ヒドラジド官能基が細胞膜分子上に共有結合で取り込まれるように化学的に誘導体化された赤血球細胞を製造して分析し、ヒドラジン誘導体化細胞を製造し、新規細胞を凝集反応で使用して、抗体活性を犠牲にしたり、また問題のエピトープをブロックすることもなく、抗原及び抗体のヒドラジン誘導体化細胞への結合を促進することを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒドラジン誘導体化細胞発明の分野本発明は、ヒドラジド官能基が細胞表面分子上に共有結合で取り込まれるように化学的に誘導体化された細胞の製造及び分析に関する。他の態様では、本発明は固体又は半固体の粒子又は細胞上のヒドラジド基のレベル決定方法に関する。発明の背景歴史的には、赤血球やその誘導体のような細胞が、長年にわたって血球凝集反応のような診断試験で使用されていた。英国特許第１２４４３４４号明細書、更にはＨｉｒａｔａの米国特許第３，７１４，３４５号明細書及び米国特許第３，７１５，４２７号明細書は、血球凝集反応で使用するためのピルビン酸アルデヒド及びホルムアルデヒドによる誘導体化赤血球の製造方法を開示している。ヒトＡ型赤血球は、ウシ血清アルブミン、バクテリオファージ及びγ−グロブリンのような抗原で被覆して、凝集反応で使用することができた。しかしながら、被覆方法は、抗原のカップリング配向を制御しない。ラテックス粒子やクロマトグラフィー樹脂のようなヒドラジン誘導体化物質は抗原や抗体にカップリングされた例がある。ＬｉｎｎｅａｕｓＣ．Ｄｏｒｍａｎの米国特許第４，４２１，８９６号明細書は、ラテックス粒子の凝集反応で使用するためのヒドラジン誘導体化ラテックス粒子の製造を記載している。アミド基をヒドラジン分解すると、５０℃〜約８０℃の温度で約７〜８時間の後にカルボン酸ヒドラジド基が生成した。しかしながら、このような条件は細胞膜には苛酷すぎる。更には、細胞膜は通常、大半がアミド基からなることはない。抗体を固体支持体に固定化する方法も公知である。例えば、抗体の炭水化物側鎖上に生成したアルデヒドと固体支持体上のヒドラジド基との共有結合により、抗体を固体支持体に結合することができる。ヒドラジド親和性は様々な種に由来する免疫グロブリンの結合を支持し、固定化された抗体は、細孔寸法が同様でタンパク質非特定部位固定化法を用いる支持体に比べて生物活性が大きい。ＪｏｎａｔｈａｎＭ．Ｇｅｒｓｈｏｎi等（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１４６；５９−６３（１９８５））は、アジピン酸ジヒドラジド誘導体化酵素の製造を開示している。Ｇｅｒｓｈｏｎｉ等は、反応条件や試薬に対してタンパク質溶液よりも遥かに感受性の高い細胞膜にはこの方法を適用しなかった。従来技術の上記欠陥に鑑みて、本発明の目的は、化学的に誘導体化して、ヒドラジド官能基をその表面分子上に共有結合で取り込んだ半固体粒子又は細胞の製造及び定量方法、並びに粒子又は細胞上にあるヒドラジド基のレベル決定方法である。本発明の他の目的は、抗原や抗体の細胞への結合を制御できる、凝集反応で有用な誘導体化細胞を製造することである。ヒドラジン誘導体化細胞により、このような結合制御が可能となる。本発明の別の目的は、細胞膜の元の状態を維持する条件下でヒドラジン誘導体化細胞を生成することである。本発明の別の目的は、抗体活性を犠牲にすることなく、また問題の抗原エピトープがブロックされることもなく、抗原及び抗体をヒドラジド誘導体化細胞に結合することである。本発明の別の目的は、安定化した赤血球細胞上に最適レベルのヒドラジド官能基を取り込むことにより、最適な抗体カップリングを達成することである。発明の要約上述の目的及びそれに関連する効果は、本発明でヒドラジン誘導体化細胞を製造して使用すれば実現される。本発明は、例えばヒドラジド官能基が細胞の表面分子内に共有結合で取りまれるように化学的に誘導体化された赤血球細胞の製造及び分析を包含する。ヒドラジン誘導体化細胞を製造して凝集反応で使用すれば、化学的に活性化し、その後酸化抗体（糖タンパク質）がその炭水化物残基により共有結合し得る赤血球細胞を製造することができる。ヒドラジン誘導体化細胞は、細胞膜の元の状態を保持しつつ、抗体活性を犠牲にせず、また問題の抗原エピトープをブロックすることもなく、抗原及び抗体のヒドラジン誘導体化細胞への結合を促進する条件下で生成される。水性媒質中において半固体（例えば赤血球細胞）上にヒドラジドが生成されると、赤血球細胞上での抗体の温和で安定したカップリングが可能となる。本発明の方法では、赤血球細胞を含む固体又は半固体の粒子又は細胞上にあるヒドラジド基のレベルを決定することができる。本発明は更に、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アロ抗体の新規な検出技術を提供する。形質転換した白血球から抽出したＨＬＡ抗原を、モノクローナル抗体フレームワーク（ＭｏＡｂ）により固着赤血球細胞上に固定化させる。次いで、凝集トレーで試験血清をＨＬＡ感作した赤血球細胞と混合して、ＨＬＡ抗原を検出する。適切なインキュベーション期間の後に、肉眼で凝集陽性のものを陰性と区別する。本発明の技術で、マルチパラス（multiparous）血清試料中のアロ抗体の存在を検出するためのフロントラインスクリーニング法を実現する。陽性血清の特異性は後で相補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を用いて調べる。本発明の方法で、ＨＬＡ感作した赤血球細胞の凝集によるアロ抗体検出を実施する。マルチパラス血清のフロントエンドスクリーニングのために本明細書に記載するアッセイを使用すると、幾つかの効果がある。これらの効果には、培養物中で増殖可能なリンパ芽球由来の抗原がいつでも得られること、相補体を必要としないアッセイ、適度に安定な試薬、自動化可能なアッセイの形態や方式、及び自己抗体によって引き起こされる偽陽性の排除の可能性が含まれる。図面の簡単な説明以下の図面を参照しながら、本発明の実施態様の詳細な説明及びその後の添付クレームで本発明の新たな特徴や効果を説明する。図１は、デュラサイト（duracyte）をヒドラジンで活性化して得られた対数蛍光シフトのグラフを示す。左のピークはデュラサイトについてであり、右のピークはヒドラジン誘導体化デュラサイト（ヒドラサイト（hydracyte））についてである。図２は、エルマン試験（ヒドラジド生成の間接測定法）で得られたＯＤ₄₀₅と、ヒドラジド生成の結果である対数蛍光ＬＦＬ２との相関関係を示すグラフである。図３は、抗マウス−ＰＥとデュラサイト（左）及びＷ６／３２−ヒドラサイト（右）の結合によってそれぞれ得られた対数蛍光シフトを示すグラフである。図４は、Ｗ６／３２の濃度を変えて調製したＷ６／３２−ヒドラサイトへの抗マウス−ＰＥの結合によって得られた蛍光シフトを示すグラフである。図５は、抗Ｂ２ＭとＷ６／３２−ヒドラジド（左）及びＨＬＡ−ヒドラサイト（右）の結合によってそれぞれ得られた対数蛍光シフトを示すグラフである。図６は、ＨＬＡ及びＷ６／３２の濃度を変えて調製した種々のＨＬＡ−ヒドラサイトへの抗Ｂ２Ｍ−ＰＥの結合によって得られた蛍光シフトを示すグラフである。発明の詳細な説明定義以下の略語の定義が本発明に適用可能であり、本明細書全体で使用する：略語：ＨＬＡ、ヒト白血球抗原；ＨＡＭＡ、ヒト抗マウス抗体；ＥＬＩＳＡ、エンザイムリンクドイムノアッセイ；ＥＤＡＣ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩；ＭＥＳ、（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＤＭＦ、ジメチルホルムアミド；ＴＢＬ、チオブチロラクトン；ＯＤ、特定波長での光学密度（吸光度）；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；Ｂ２Ｍ、β−２−ミクログロブリン；ＰＥ、フィコエリトリン；ＦＬ、蛍光；ＬＦＬ、対数蛍光；ＣＤＣ、相補体依存性細胞毒性；ＥＢＶ、エプスタイン−バールウイルス；ＭｏＡｂ、モノクローナル抗体；ＣＹＮＡＰ、細胞毒性陰性吸着陽性；ＰＲＡ、パネル反応性抗体。本発明では、レセプター又は基質の細胞膜へのカップリングを制御することができる。膜を破壊しないような温和な条件下において細胞表面をヒドラジンで誘導体化すると、細胞表面上にヒドラジド基が生成する。細胞膜にカップリングした後でも結合部位又はエピトープがその結合相手にとって利用可能であるような場所において、問題のレセプター又は基質をアルデヒドで誘導体化する。次いで、レセプター又は基質上のアルデヒド基と、細胞表面上のヒドラジドとを反応させることにより、レセプター又は基質を細胞表面にカップリングさせることができる。本発明は、生存細胞でも、死滅細胞でも、休眠細胞でも、例えば赤血球、デュラサイト又は細菌等で使用することができる。安定化赤血球細胞（例えば本出願人の米国特許第３，７１４，３４５号明細書及び第３，７１５，４２７号明細書に開示されているようなデュラサイト）や、英国特許第１２４４３４４号明細書に記載された方法に従って製造された細胞のような安定化細胞が最も好適である。細胞膜の表面上に位置するカルボン酸基を、水溶性活性剤（例えばＥＤＡＣ）の存在下でヒドラジンと反応させれば、細胞表面上にヒドラジド基が生成し得る。反応は、試薬を同時添加することにより生起し得る。反応が終了した後、細胞上の利用可能なヒドラジドの概数を調べることができる。ヒドラジド基をチオブチロラクトンと反応させて、チオール誘導体を生成する。チオール検出試薬（例えばエルマン試薬［５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）］）を用いて、存在するチオールの量を調べることができる。検出試薬反応中の発色強度は、細胞膜上に存在するチオールの量、従ってヒドラジド基の量と相互に関連し得る。よく知られた種々の試薬や方法を用いて、タンパク質をアルデヒド基で誘導体化することができる。グルコースのようなタンパク質上に位置する炭水化物基を過ヨウ素酸ナトリウム等のような酸化剤で酸化してジアルデヒド誘導体とすることが好ましい。他のアルデヒド生成反応も当業者にはよく知られており、過度の実験を行わずとも上記使用に容易に適合させることができる。本発明は、抗体にカップリングした細胞の製造に特に有用である。好ましい細胞は、安定し、容易に検出できるデュラサイト（赤血球細胞）である。デュラサイトをヒドラジン及びＥＤＡＣと反応させて、ヒドラサイトを生成する。抗体のＦｃ部分上の炭水化物基を過ヨウ素酸ナトリウム等でアルデヒドに酸化することができ、次いでヒドラサイトを誘導体化抗体と反応させることによってヒドラサイトをアルデヒド基にカップリングすることができる。次いで、抗体カップリングヒドラサイトを凝集反応で使用して、試料中に存在する抗原の存在又は量を検出する。抗体カップリングヒドラサイトを使用して、抗原を細胞にカップリングすることもできる。抗原上の特定エピトープに特異的な抗体をヒドラサイトにカップリングし、この抗体−ヒドラサイトが抗原にさらされると、抗原は抗体に結合する。従って、細胞は、特定のエピトープにより抗原にカップリングする。試料を抗原カップリング細胞に暴露して生じた凝集により、抗原上の二次エピトープに対する抗抗原抗体の試料中における存在又は量を調べることができる。抗原を直接ヒドラサイトにカップリングして得られた抗原カップリング細胞を用いれば、同様の結果を得ることができる。抗体−抗原複合体の存在又は量を検出するための他の方法もよく知られており、同様に適用可能である。例えば、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等のような酵素や、フルオレセン等のような蛍光化合物で標識した抗体又は抗原を用いた均質又は不均質イムノアッセイで、抗体−抗原複合体が検出できる。当業者は、過度の実験を行わずとも、これらの検出方法を本発明の原理に容易に適合させることができよう。実施例を含めて、以下の材料や方法についての議論は本発明を例示するものであり、クレームで定義する本発明の範囲を何ら制限するものではない。当業者は、本発明の概念を適用することができる他の多くの使用法を着想することができる。材料及び方法抗体試薬ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）からウサギ抗Ｂ２Ｍ−ＰＥ、ヤギ抗マウス及びヤギ抗マウスＰＥを入手した。血清試薬ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｉｎｃｉｎｎａｔｉ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）からヒト抗ＯＫＴ３血清を購入した。標準的な非洗浄ＮＩＨＣＤＣ法を用いてＰＲＡ及び特異性を調べたヒト抗ＨＬＡアロ血清、及びヒト正常血清試料をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＬｅｉｄｅｎ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。安定化ヒツジ赤血球安定化ヒツジ赤血球（デュラサイト）は、参考として本明細書の一部を構成するものとする米国特許第３，７１４，３４５号明細書に記載の手法を用いてヒツジ血液から調製した。まず、最初は１匹の動物から採取した血液からデュラサイトを調製し、その後１４〜２０匹の動物から得た血液のプールを使用した。実施例１ヒドラジンデュラサイト（ヒドラサイト）反応ｐＨを維持するためにＲａｄｉｏｍｅｔｅｒｐＨスタット（ＡＢＵ９１ＡｕｔｏＢｕｒｅｔｔｅ）を用いてヒドラジン誘導体化デュラサイトを調製した。０．０１Ｍピロリン酸カリウム（ｐＨ６．０）中の１３．３％デュラサイト溶液３７ｍＬを１２５ｍＬのＲａｄｉｏｍｅｔｅｒ反応容器内に添加した。小型撹拌棒を用い、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ撹拌機の撹拌速度を「３」に設定して、この懸濁液を撹拌した。７．５ｍＬの５０％ヒドラジン一塩酸塩水溶液（ｐＨ６．０）を懸濁液に添加して、ヒドラジン溶液の最終濃度を約７．５重量％にした。次いで、１．２Ｍ塩酸によりｐＨを手操作で４．８に調整した。５ｍＬのＥＤＡＣ溶液（５０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．０中０．２ｍｇ／ｍＬ）を懸濁液に添加した。１．０Ｍピロリン酸カリウムを自動添加して、反応物のｐＨを５．０に維持した。約２０時間後に、反応混合物を遠心分離にかけて反応を停止させた。次いで、ヒドラジン誘導体化デュラサイト（ヒドラサイト）をＰＢＳで数回洗浄した。０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中、４℃で得られた１０％細胞懸濁液を保存した。上述の実施例では水溶性ＥＤＡＣを使用したが、他の水溶性ＥＤＡＣ誘導体や水溶性カルボジイミド、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートを使用することもできる。実施例２ヒドラジンの定量安定化赤血球上で生成したヒドラジドのレベルを以下の方法で調べた。ヒドラサイト懸濁液２００μＬずつを３個の２．０ｍＬ小型遠心管の各々に添加し、２００μＬの非誘導デュラサイト（対照）を別の組の２．０ｍＬの小型遠心管に添加した。各管に８００μＬの食塩水を添加した。次いで、赤血球を撹拌し、卓上遠心分離機を用いて遠心分離した。遠心分離の後に、上清を注意しながら除去した。次いで、赤血球を１ｍＬの食塩水で更に３回洗浄した。最後の遠心分離段階の後に、４００μＬの０．５Ｍピロリン酸カリウム（ｐＨ５．０）を赤血球ペレットに添加し、５０μＬのＤＭＦ：ＴＢＬ（５：２）を撹拌して赤血球を再懸濁させ、この溶液を各管に添加した。管を撹拌し、Ｌａｂｑｕａｋｅ回転機で５時間（室温）回転させた。５時間後、８００μＬの食塩水を各管に添加した。次いで、細胞を遠心分離し、１ｍＬの食塩水で５回洗浄した。最終洗浄の後、２００μＬのエルマン試薬（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０中４ｍｇ／ｍＬ）を各赤血球ペレット（約２００μＬ）に添加した。赤血球を撹拌して、細胞を完全に再懸濁させた。２分後、赤血球を遠心分離した。各上清１００μＬを１．９ｍＬの食塩水で希釈した。次いで、４０５ｎｍで吸光度を読み取った。１．３６×１０⁴／ｃｍ−Ｍのモル吸光係数を用い、ヒドラサイト読み取り値から対照（デュラサイト）読み取り値を引いてヒドラジド生成レベルを算出した。ペレット中の赤血球数は約２．９×１０⁵個なので、０．３のＯＤ₄₀₅（通常値）は、赤血球１個当たりのヒドラジド数１．８７×１０¹¹ 個ということになろう。フローサイトメトリーを使用して、活性化法を実施した。これを実施するために、様々な時間に反応容器から１０μＬの反応物を取り出し、１．０ｍＬのＰＢＳと混合した。希釈試料の蛍光をＥｐｉｃｓＰｒｏｆｉｌｅ II ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｒｐ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）で測定した。測定前に、標準較正及び蛍光チェックを実施した。まず、寸法（ＦＳ）対粒度（ＳＳ）の２つのパラメーターヒストグラムでデータを収集した。点が主として集まるところの周辺にビットマップを描いた。ビットマップ内の細胞について得られたデータから、対数橙色蛍光（ＬＦＬ２）対細胞数及び橙色蛍光（ＦＬ２）対細胞数のヒストグラムを作成した。分析のために、約１０，０００個の細胞をビットマップで収集した。実施例３抗体単離ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，Ｍｄ．）から入手したハイブリドーマＷ６／３２を、標準的な手順を用いて中空繊維装置で増殖させた。５０％飽和硫酸アンモニウムカットを実施して、Ｗ６／３２モノクローナル抗体を中空繊維流体から単離した。次いで、抗体をＰＢＳに対して、次いで０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０に対して徹底的に透析した。次いで、抗体溶液をＢｅｃｋｍａｎＬ７−６５超遠心機（Ｔｉ−４５ローター）にて、３５，０００ｒｐｍ、１０℃で１時間遠心分離して、高分子量凝集体を除去した。次いで、２８０ｎｍで測定したときに１ｍｇ／ｍＬの溶液に対して１．４となる吸光係数を用いて、タンパク質濃度を調べた。吸光度測定が凝集体の光散乱の影響を受けないようにするために、、３２０ｎｍ〜２４５ｎｍの走査を実施した。ＯＤ₃₂₀ ／ＯＤ₂₈₀が０．１より大きく及び／又はＯＤ₂₈₀／ＯＤ₂₅₀が１．９よりも小さければ、タンパク質溶液を超遠心分離により再度清澄化した。実施例４抗体酸化Ｈｏｆｆｍａｎ及びＯ’Ｓｈａｎｅｓｓｙが記載した手順（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，１１２，１１３（１９８８）、同書は参考として本明細書の一部を構成するものとする）に従って、抗体をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した。酸化すべきタンパク質（６．０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬごとに、５０μＬのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液（Ｈ₂Ｏ中１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した。反応容器を手で反転させて試薬を混合し、次いで４℃〜８℃で２時間軽く回転させた。２時間後、グリセロール溶液（タンパク質溶液１ｍＬ当たりＨ₂Ｏ中０．２Ｍ溶液を１００μＬ）を添加して反応を停止させた。次いで、反応停止した溶液を酢酸塩−ＮａＣｌ緩衝液に対して透析し、超遠心分離により再度清澄化した。Ａｈｎ等が記載する方法「ＵｓｅｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＨｙｄｒａｚｉｄｅａｎｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＴｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅＲｅａｇｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅＦｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎＣａｒｂｏｎｙｌＧｒｏｕｐｓａｎｄｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＯｘｉｄｉｚｅｄＰｒｏｔｅｉｎｏｎＰｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅＧｅｌｓ」（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６１，２４５（１９８７）、同書は参考として本明細書の一部を構成するものとする）を用いて、酸化の度合いを調べた。このような酸化条件下で、各抗体分子に対して約３．６個のアルデヒドが生成した。実施例５Ｗ６／３２−ヒドラサイト酸化したＷ６／３２を以下の方法でヒドラサイトにカップリングした。２ｍＬの１０％ヒドラサイト懸濁液を２．０ｍＬのＳａｒｓｔｅｄｔプラスチックバイアル内に導入した。懸濁液を遠心分離し、上清を除去して、後に２００μＬの充填ヒドラサイトを残した。８００μＬの酸化抗体をバイアルに添加した。充填ヒドラサイトをこの溶液に再懸濁させ、次いでＬａｂｑｕａｋｅＳｈａｋｅｒ（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、反応物を室温で２４時間回転させた。２４時間後、反応混合物を遠心分離し、上清を除去した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、室温で９０分間、１．０％ヒト血清アルブミン溶液（ｐＨ８）で被覆し、ＰＢＳで再度洗浄し、次いでＰＢＳ−アジ化物に再懸濁させて最初の容量にした。懸濁液を４℃で保存した。形質転換リンパ芽球ＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒｏｆＳｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎＷｉｓｃｏｎｓｉｎ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）で特定のヒトドナーの血液を採取して、ＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｄｅｎ，Ｎ．Ｊ．）に輸送し、そこでリンパ球を単離し、Ｂリンパ球をＥＢＶで形質転換した。形質転換したリンパ芽球を本出願人のところに戻して、液体懸濁液培養物中で増殖させた。ＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒｏｆＳｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎＷｉｓｃｏｎｓｉｎで、ＮＩＨ微細リンパ球毒性アッセイを用いて形質転換の前後の表現型Ｉのリンパ球を入手した。実施例６可溶化ＨＬＡＰａｒｈａｍが「ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖｅＨＬＡ−Ａａｎｄ −ＢＡｎｔｉｇｅｎｓｂｙａＳｅｒｉｅｓｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｌｕｍｎｓ」（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４，８７０９（１９７９）、同書は参考として本明細書の一部を構成するものとする）に記載する手順を若干変えて、培養物中で増殖した形質転換細胞からＨＬＡを可溶化した。簡潔に言えば、凍結細胞ペレット１ｇ当たり１．３４ｍＬの１０ｍＭトリス、０．０２５アジ化ナトリウム、ｐＨ８．０を添加し、次いで０．７１ｍＬの２０％Ｂｒｉｊ溶液（１３．３％Ｂｒｉｊ９９、６．７％Ｂｒｉｊ９７）及び０．１６ｍＬの２０ｍＭヨードアセトアミド溶液（１０ｍＭトリス−アジ化物（ｐＨ８．０）中）を添加した。得られた懸濁液を２℃〜８℃で２時間撹拌し、２．０ｍＬの小型遠心管に移し、次いで卓上遠心分離機で５分間遠心分離した。透明な上清を除去し、新しい遠心分離管に移した。浮遊物質を移さないよう注意した。試料を遠心分離し、次いで上清を新しい管に移し、−７０℃で凍結保存した。実施例７ＨＬＡ−ヒドラサイト２ｍＬの１０％Ｗ６／３２−ヒドラサイト懸濁液を２．０ｍＬのＳａｒｓｔｅｄｔバイアルに添加した。遠心分離の後に上清を除去し、ＰＢＳ−アジ化物中の可溶化ＨＬＡ（１０〜３０μｇ／ｍＬ）１：３溶液１．０ｍＬを充填ヒドラサイトに添加した。上述したように、細胞を再懸濁させて室温で１時間回転させた。１時間後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで数回洗浄し、ＰＢＳ−アジ化物で再懸濁させて元の容量にした。次いで、蓋をしたバイアル中の細胞を３７℃で７２時間回転させて「熱処理」させた。熱処理した後に、細胞を洗浄せずに移して、２℃〜８℃で保存した。実施例８血清吸着マウス免疫グロブリンと交差反応するヒト抗体による妨害を排除するために、まず全てのヒト血清試料に固相−液相試薬を組み合わせて吸着させた。これを達成するために、２．０ｍＬの１０％Ｗ６／３２−ヒドラサイト懸濁液を２．０ｍＬのＳａｒｓｔｅｄｔプラスチックバイアルに添加し、次いで遠心分離した。次いで、上清を除去し、廃棄した。次いで、１ｍＬの血清を残りの２００μＬの細胞ペレットに添加した。更に、表現型がＷ６／３２と同じ非特異抗体（ＩｇＧ２Ａ）（２００μＬの６ｍｇ／ｍＬ緩衝Ｋ溶液）を、ウシ血清アルブミン（１００ μＬの４０ｍｇ／ｍＬ緩衝Ｋ溶液）、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．７５塩化ナトリウム、及び０．０２ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）と共に添加した。次いで、充填細胞を血清希釈混合物中に再懸濁させ、次いでＬａｂｑｕａｋｅ回転機で１時間回転させた。次いで、管を遠心分離し、吸着希釈した血清を凝集分析のために除去した。実施例９ＨＬＡ定量標準サンドイッチＥＬＩＳＡを用い、ウサギ抗ヒトＢ２Ｍを捕捉抗体として、Ｗ６／３２を特異抗体として、ヤギ抗マウスアルカリ性ホスファターゼを二次標識抗体として使用して、リンパ芽球から抽出したＨＬＡを定量した。最初に、結果を相対単位として記録した。その後、市販のＳａｎｇｓｔａｄｓＨＬＡＥＬＩＳＡキット（ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ）を使用して、実際値を調べた。抽出した細胞の大半で、１ｍＬの抽出溶液に対して４０〜１２０μｇのＨＬＡが得られた。実施例１０フローサイトメトリー分析ＰＥ標識ヤギ抗マウス及びＰＥウサギ抗ヒトＢ２Ｍを用いて、Ｗ６／３２−ヒドラサイト及びＨＬＡ−ヒドラサイトをフローサイトメトリーにより常法分析した。これを達成するために、２５μ ＬのＷ６／３２−ヒドラサイト（１０％）を２００μＬの血清管にて１００μＬのＰＢＳで希釈した（重複２試料）。管を短時間遠心分離にかけ、上清を除去した。この時点で、５０μＬの抗マウス−ＰＥ１／５希釈液又は抗Ｂ２Ｍ−ＰＥ１／４０希釈液を細胞に添加した。約２０％ヤギ血清及び１０％ウシ血清及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む緩衝液を使用して、抗マウス−ＰＥ又は抗Ｂ２Ｍ −ＰＥの希釈液を生成した。対照管には希釈剤だけを添加した。Ｄａｕｄｉ細胞系からの抽出物も対照として使用した。細胞を撹拌し、室温で２時間回転させて再懸濁させた。２時間後、細胞を１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。フロー分析のために、１０μＬの細胞懸濁液を１．０ｍＬのＰＢＳを含む管に移した。次いで、ＣｏｕｌｔｅｒＥｐｉｃｓＰｒｏｆｉｌｅ IIフローサイトメーターでこれらの希釈細胞を分析した。実施例１１凝集３２μＬの吸着希釈血清を「Ｖ」底９６ウェルマイクロタイタートレーに添加して、凝集を実施した。４μＬのＨＬＡ−ヒドラサイトと共に、緩衝液Ｋ（１３．５μＬ）を追加した。次いで、反応混合物を完全に混合した。凝集ウェルを覆って蒸発しないようにし、トレーを３時間放置した。「０」と記録された陰性反応では、全てのヒドラサイトはウェルの底に沈降して、堅いボタン状のもののように見えた。「１」から「４」と記録された陽性反応では、ボタン状のものはより拡散しているか又は存在しなかった。結果ヒドラサイト調製表Ｉは、デュラサイトからのヒドラサイトの調製で得られた活性化レベルについての典型的な値を示す。各デュラサイトロットは、種々の動物から採血したヒツジ赤血球をプールしたものである。上述のように、デュラサイト（対照）及びヒドラサイトをＴＢＬ及びエルマン試薬と反応させた後に、ＯＤ₄₀₅値を得た。活性化レベルに関しては、デュラサイトのロット内及びロット間で良好な再現性が認められた。常法では、ヒドラサイトを、赤血球１個当たり１．２４×１０¹¹ 〜３．２×１０¹¹個の活性化レベルで使用した（ＯＤ₄₀₅は０．２〜０．５）。必要とあれば、より高い活性化レベルを使用することができる。しかしながら、値が６．２×１０¹¹個以上に達すると、細胞の不可逆的なクランピングが生じ得る。図１は、デュラサイト（右）及びヒドラサイト（左）の対数橙色蛍光（ＬＦＬ２）の差を示している。有意な変位があるので、ＬＦＬ２を使用して活性化反応を監視した。図２は、ＴＢＬ及びエルマン試薬で処理した活性化デュラサイトの光学密度と、フローサイトメーターで測定した活性化デュラサイトのＬＦＬ２との間に線形相関関係が存在することを示している。図１のデータから０．９８０の相関係数が得られた。Ｗ６／３２−ヒドラサイトフローサイトメトリーにより、ヤギ抗マウス抗体での凝集力価でＷ６／３２− ヒドラサイトを分析した。抗マウス力価について得られた一般的な値は１／６４，０００及び１／１２８，０００であった。これらの力価はそれぞれ、抗マウスの検出レベル１５．６〜７．８ｎｇ／ｍＬに相当する。フローサイトメトリー分析の結果を図３及び図４に示す。図３は、抗マウス− ＰＥがＷ６／３２−ヒドラサイトに結合すると、抗マウス−ＰＥと対照ヒドラサイトとの結合に比べて有意な蛍光シフトが生じることを示している。カップリング反応でＷ６／３２濃度を増すと、得られる蛍光シフトも増加する（図４）。活性レベルが１．２４×１０¹¹よりも低いヒドラサイトを使用するほど、カップリングするＷ６／３２の量も低下する。ＨＬＡ−ヒドラサイト抗Ｂ２Ｍ−ＰＥを用いて、ＨＬＡのＷ６／３２−ヒドラサイトに対する結合をフローサイトメトリーで追跡した。図５は、抗Ｂ２Ｍ−ＰＥがＨＬＡ−ヒドラサイトと結合すると、抗Ｂ２Ｍ−ＰＥとＷ６／３２−ヒドラサイトとの結合によって得られる蛍光に比べて有意なシフトが生じることを示している。図６は、結合段階中にＨＬＡの量が増すと、結合するＨＬＡの量が増し、より多量のＷ６／３２がヒドラサイトにカップリングしている細胞に結合するＨＬＡの量が増すことを示している。Ｗ６／３２濃度が最小のときには、ＨＬＡとの結合が飽和してしまうことも判明し得る。血清吸着正常反応物及びアロ反応物の大半が、常法では対照として含まれるＷ６／３２ −ヒドラサイトと反応することが知見された。ヒト血清のマウスＩｇＧとのこの種の反応性は文献に詳しく記載されており、現在ではＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）と称されているので、上記結果は驚くほどのものではない。この反応性は許容できないので、これらの妨害を排除するのに幾つかの方法が評価された。固相 −液相吸着を組み合わせた手順はこのＨＡＭＡを排除するのに適することが知見された。この評価は、抗ＯＫＴ３治療を受けている患者のヒト血清試料５０個を含んでいた。これらの試料のＨＡＭＡＥＬＩＳＡ力価は１／１００〜１／２０，０００であった。固相−液相吸着を用いると、５０個の試料中４９個で、ヒト抗Ｗ６／３２妨害の除去が達成された。妨害が排除されなかった１個の試料は、得られた試料の中で最も高いＥＬＩＳＡ力価（１／１０，０００）を示した。ＨＬＡ−誘導妨害Ｗ６／３２−ヒドラサイトでもＤａｕｄｉ（対照）細胞抽出物に結合したＷ６／３２−ヒドラサイトでもなく、ＨＬＡ−ヒドラサイトで試験したときに、ほとんど全ての正常血清が固相−液相吸着の後でさえも陽性凝集を示すことが知見された。Ｄａｕｄｉはβ−２−ミクログロブリンを生成せず、表面上にはＨＬＡ（クラスＩ）を有さない。妨害の深刻度は結合したＨＬＡの量と互いに関連していた。本明細書ではこの現象を「ＨＬＡ誘導妨害」と呼ぶ。これらの妨害を排除するために幾つかの方法を試した後に、ＨＬＡ−ヒドラサイトを３７℃で７２時間加熱するとこれらの障害が排除されることが知見された。興味深いことに、細胞に結合したＨＬＡの量（抗Ｂ２Ｍ−ＰＥ結合によって決定（データは図示せず））は、加熱「処理」のために変化するようには思えなかった。ＨＬＡ−ヒドラサイト表IIは、使用する種々のリンパ球の同定及びＩ型ＨＬＡの特異性を示している。対応するリンパ芽球からＨＬＡを抽出し、次いでＷ６／３２−ヒドラサイトに結合して、対応するＨＬＡ−ヒドラサイトを生成した。抗Ｂ２Ｍ−ＰＥを個々のＨＬＡ−ヒドラサイトに結合したときに得られた蛍光シフトＦＬ２’を表IIに示す。Ｉ型ＨＬＡは単一重鎖及び共通軽鎖（Ｂ２Ｍ）からなるので、この測定を使用して、各ヒドラサイトに結合した全ＨＬＡを間接的に定量した。盲凝集の研究アッセイでアロ血清を正常血清と区別できることを実証するために、盲研究でＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した１６３血清を試験した。Ｌｅｉｄｅｎから入手したＣＤＣ結果と今回の凝集結果との比較を表IIIに示す。凝集アッセイ及びＣＤＣアッセイの両方で５８血清が陽性であることが判明した。２２血清は凝集アッセイでは陽性で、ＣＤＣアッセイでは陰性であった（偽陽性）。９血清は凝集アッセイでは陰性で、ＣＤＣアッセイでは陽性であり（偽陰性）、７４血清はＣＤＣアッセイ及び凝集アッセイの両方で陰性であった（真陰性）。表IIIのデータから、ｐ＜０．０００１で、６３．９７のχ二乗値が得られた。これらの結果は、本アッセイを使用して、ＨＬＡアロ反応性が陰性である正常血清を効率よく同定できることを示している。通常のマルチパラス血清のサンプリングでは、試料の１０〜２０％がＣＤＣ陽性に過ぎないので、この試験は、ＣＤＣで試験せねばならない試料の数をかなり低減する好都合な手段である。ＣＤＣで得られた特異性を、凝集によって得られた特異性と比較した。凝集陽性であることが判明した５８血清のうち、ＮＩＨＣＤＣにより明白な特異性を備えていると判明したのは僅か４７血清であった。これらの４７血清の比較を表IVに示す。４７血清中３２血清（６８％）と、適度な適合性が見られた。マルチパラス血清のフロントエンドスクリーニングで本明細書に記載のアッセイを使用すると、幾つかの効果がある。これらの効果には、培養物中で増殖可能なリンパ芽球由来の抗原がいつでも得られること、相補体を必要としないアッセイ、４℃〜８℃で適度に安定な試薬、自動化可能なアッセイの形態や方式、及び自己抗体による偽陽性の排除の可能性が挙げられる。４℃〜８℃で良好な安定性が観察された。添加剤を使用して−２０℃で試薬を凍結させ安定性を改善することが可能であると考えられる。９つのＣＤＣ陽性血清が凝集アッセイでは陰性であったが、これらの血清はＣＤＣでは（恐らく自己抗体のために）非特異的であるか又は弱かった。２２個のＣＤＣ陰性血清でアロ反応性が検出されたということは、凝集アッセイが、標準的な非洗浄ＣＤＣ法では陽性にならないＣＹＮＡＰ陽性ＨＬＡ−アロ抗体を検出し得ることを示唆している。リガンドの赤血球へのカップリング方法は多数文献に記載されている。これらの方法のいずれも、Ｆｃ領域の炭水化物部分を通じてリガンド（抗体）を固定化する特定部位カップリング法を使用していない。特定部位カップリングで得られる活性部位の配向は適切なので、抗体の固相試薬へのこの特定部位カップリングはランダムカップリング手順よりも優れていることが示唆された。抗体の固相への特定部位カップリングは、抗体を酸化して（アルデヒドを生成し）、次いでこれを、抗体のアルデヒド基との反応に利用できるヒドラジド基を有する固相とカップリングすることにより達成され得る。本発明は、赤血球細胞（デュラサイト）の活性化法を提示し、この方法を使用して、活性Ｗ６／３２を活性化デュラサイト（ヒドラサイト）にカップリングすることができ、この活性化デュラサイトをＨＬＡに結合して、ＨＬＡアロ血清を検出できることを示した。本発明では、固相又は細胞上にあるヒドラジド基の定量方法を提示する。ｐＨ５．０でアミンよりも速く、アミンよりも多量のヒドラジドと反応するＴＢＬを使用してヒドラジドをスルフヒドリルに変換し、このスルフヒドリルをエルマン試薬で定量できることが判明した。これは、安定化した細胞上に調製されたヒドラジドの間接的な定量法となる。エルマン定量の他に、フローサイトメーターを用いたＬＦＬ２細胞の測定が、統計法で細胞のヒドラジド誘導体化の実際の進展をフォローする非常に好都合な方法である。ヒドラジド誘導体化速度は反応容器の寸法、撹拌速度、温度及びｐＨと共に変動し得るので、上記方法が非常に好都合で役立つ。本発明を特に特定の材料及び実施例を参照して説明したが、以下のクレームで定義する本発明の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細に変形を加えることができることは当業者には自明であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者チヤウ，ハーバート・エスアメリカ合衆国、カリフオルニア・94070、サン・カルロス、クレストビユー・ドライブ・927 (72)発明者ハイマン，ダニエル・エフアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイービル、ドレーク・407 (72)発明者ターラー，マリア・エルアメリカ合衆国、イリノイ・60085、ウオークガン、レークハースト・ロード・573、アパートメント・２・エル

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞膜内に共有結合で取り込まれたヒドラジド官能基を有し、酸化抗体がその炭水化物残基を通じて共有結合する化学的に誘導体化された細胞を含む診断試薬。２．細胞が、赤血球、デュラサイト、細菌又は安定化細胞である請求項１に記載の試薬。３．ａ）細胞と共有結合したヒドラジンにカップリングした抗原と試料とを混合し、ｂ）混合物中に生成した抗原−抗体複合体の存在を、試料中の抗体の存在を示すものとして調べる段階を含む試料中の抗体の存在を検出するための方法。４．ａ）細胞と共有結合したヒドラジンにカップリングした抗原と試料とを混合し、ｂ）混合物中に生成した抗原−抗体複合体の存在を、試料中の抗原の存在を示すものとして調べる段階を含む試料中の抗体の存在を検出するための方法。５．ヒドラジド官能基が細胞膜分子内に共有結合で取り込まれ、これにＨＬＡ抗原が、該ＨＬＡ抗原のエピトープに特異的な抗体により間接的に結合され得るように化学的に誘導体化された赤血球細胞を含んでいる、抗ヒトＨＬＡアロ抗体の免疫診断検出のための診断試薬。６．赤血球細胞が、細胞膜内に共有結合で取り込まれたヒドラジド官能基を有する化学的に誘導体化された安定化デュラサイトからなり、酸化抗体がその炭水化物残基を通じて前記細胞に共有結合する請求項５に記載の診断試薬。７．ＨＬＡフレームワークに結合するモノクローナル抗体を通じて細胞膜内に共有結合で取り込まれたヒドラジド官能基を有する化学的に誘導体化された赤血球細胞に結合したＨＬＡ抗原を含み、ＨＬＡと結合した赤血球細胞をアロ抗体の存在下で凝集させる抗ヒトＨＬＡアロ抗体の検出に適した診断試薬。８．ａ）ヒトリンパ芽球からＨＬＡ抗原を単離し、ｂ）細胞をヒドラジンで活性化して、反応性ヒドラジド官能基を取り込んだ後に安定化した細胞に抗体をカップリングし、ｃ）ＨＬＡ抗原を細胞カップリング抗体に結合することにより、単離したＨＬＡ抗原を間接的に細胞にカップリングし、ｄ）ＨＬＡアロ抗体が存在すればＨＬＡカップリング細胞と結合させるのに十分な条件下で、ＨＬＡアロ抗体を含むと思われる試料と、ＨＬＡ／抗体カップリング細胞とを合わせ、ｅ）得られた凝集反応生成物の存在を、試料中のＨＬＡアロ抗体の存在を示すものとして調べることを含む、細胞凝集の検出によるＨＬＡアロ抗体の検出方法。９．細胞が、細胞膜内に共有結合で取り込まれたヒドラジド官能基を有する化学的に誘導体化された安定化赤血球細胞からなり、酸化抗体がその炭水化物残基を通じて前記細胞に共有結合する請求項８に記載のＨＬＡアロ抗体の検出方法。１０．ヒドラジン塩酸塩又はその水溶性塩の１種を含んでいる水溶性活性化剤を添加することにより細胞を活性化する請求項９に記載のＨＬＡアロ抗体の検出方法。１１．活性化剤が更に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩又はその水溶性塩もしくは類似体の１種（例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート）を含んでいる請求項１０に記載の方法。１２．活性剤の個々の成分を細胞に同時に添加する請求項１１に記載の方法。