JPH09503666A

JPH09503666A - アッセイ方法

Info

Publication number: JPH09503666A
Application number: JP7511467A
Authority: JP
Inventors: フォード，エイドリアン・ロバート; レウィントン，ジェイ
Original assignee: メルク・パテント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツンク
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-12
Publication date: 1997-04-15
Also published as: AU7819494A; WO1995010767A1; EP0723658A1; BR9407815A

Abstract

(57)【要約】生物発光性細菌を被検体を含む可能性のある液体試料と混合し、そしてその被検体により生じる光出力の減少を観察することを必要とするアッセイ方法。観察は検査用混合物の初期形成後僅か１５秒〜５分目に開始されるが、この結果、環境的効果からの妨害が減少する。

Description

【発明の詳細な説明】アッセイ方法本発明は、被検体、好ましくは毒物もしくは他の抗微生物剤について、ある液体試料を、シグナル産生性微生物の液体懸濁液の使用によりアッセイする方法に関する。好ましい態様では、このシグナル産生性微生物は生物発光性細菌である。この方法は、その被検体を含む可能性のある液体試料と、その液体懸濁液のアリコートとを一緒に混合することを必要とする。被検体は懸濁液中の微生物により産生されるシグナル（例えば放射される光）を減少させ、そしてそのシグナルの減少がその毒物についてのアッセイとして観察される（英国特許第２００５０１８号）。毒性の指標としての細菌性生物発光の使用は十分に確立されており、そしてＭｉｃｒｏｂｉｃｓＩｎｃ．社により商標Ｍｉｃｒｏｔｏｘとして商品化されているキットは多数の環境検査所で日常的に用いられている。現行の微生物毒性検査に関しては、所定の作用物質の毒性測定値に影響を及ぼす可能性があると思われる特に制約された検査条件および方法に関して用るための微生物試薬についての必要性が存在する。広汎なｐＨ領域にわたり様々な温度で、その試料中の濁度もしくは色についての補正を全く伴わず、かつ最も重要なことにはその試薬に試料を添加することにより生じる浸透ショックについての補正を行うための強浸透性物質の使用を伴わずに使用することが可能な検査を開発することが所望されるであろう。端的に記載すると、試料の環境中で使用可能である検査、すなわちその試料へのいずれかの添加を伴わず、かつその細菌性試薬自体中の妨害性作用物質が最小量である検査についての必要性が存在する。この必要性を満たすことが本発明の目的である。しかし本発明はその必要性を満たす方法およびキットに限定されるのではなく；本発明はそれ以上に広範囲のものであり、それについては本明細書中これ以降に説明されるであろう。本発明は、シグナル産生性微生物の液体懸濁物の使用によってある被検体をアッセイする方法を提供するが、その方法は、その被検体を含む可能性のある液体試料とその液体懸濁物のアリコートとを一緒に混合して検査用混合物を形成し、そしてその後にその微生物により産生されるシグナルを観察することを含み、この方法中、その検査用混合物中にその微生物により産生されるシグナルのサイズが第一期間中には第一速度で変化し、次いで被検体の効果に起因して第二期間中には第二速度で変化し、そしてそのシグナルのサイズの観察を第二期間中の様々な時期に行い、そしてそれらが被検体についてのアッセイとして比較される。本発明をより良く理解するために図１の添付図面が引用として示されており、この図は時間に対する光出力の対数減少のグラフである。このグラフ上の線は以下の実験により作成された。生物発光性細菌の水性懸濁物の４つのアリコートを、１、２、３、および４と番号付される容器に予め入れておく。容器２、３、および４の各々に毒物を含む可能性のある様々な被検体の固定容量の試料を添加する。容器１には同一容量の蒸留水を添加する。全ての添加作業は時間０に実施する。図１中での番号付される線は、この実験において番号付けされる容器からの光出力に相当する： −容器１からの光出力は第一期間Ａ中には緩和な速度で減少し、この減少は３０秒間持続し、そしてその後にはこの実験の持続期間中定常状態を保つ。光出力の初期減少は様々な環境因子：細菌懸濁液の希釈；ｐＨ変化；浸透性の変化；色および濁度の変化に起因すると考えられる。本発明人により取得された所見は本発明の基本を形成するが、その所見とは、これらの環境因子により生じる光出力の変化は非常に短命であるということである。第一期間（この場合３０秒である）の後には光出力のいずれかの別の変化は毒物の存在に起因していた。試験管１には毒物は存在しなかったため、その光出力は３０秒後には定常状態を保っていた。 −試験管２中では第一期間Ａ中の光出力を減少させる環境因子は試験管１におけるものと同一であった。しかし試験管２中の光出力は第二期間Ｂ中に減少し続け、これは第一期間Ａと比較すると一層緩和な速度であったものの、この実験の残りの期間中ずっと持続した。この第二期間Ｂ中の光出力の減少は試験管２中の毒物の存在に起因していた。 −試験管３では環境因子は一層強く、そして第一期間Ａ中に光出力の急激な減少をもたらした。第二期間Ｂ中では光出力の更なる減少は存在せず、このことは容器３に毒物が存在しないことを示す。 −容器４では環境因子が第一期間Ａ中の光出力の急下降を生じ；そして毒物が第二期間Ｂ中の光出力の更なる下降を生じた。各４本の屈曲線は第一期間Ａから第二期間Ｂへの移行時に屈曲を有する。本発明の構想は、その屈曲後および被検体についてのアッセイとしての第二期間Ｂのみの光出力の変化（通常は減少である）を測定することである。検査用試料からの光出力をこの第二期間Ｂ中の対照用試料からの光出力と比較することが好ましく；これら２つの光出力の比率が有意に変化すると、その検査試料中に被検体が含まれることが意味される。従ってこのアッセイを実施して、式［式中、Ｔｘは、ある毒性試料をある検査用試験管に添加した後のｘ分目のシグナルであり、Ｔｙは、その毒性試料をその検査用試験管に添加した後のｙ分目のシグナルであり、Ｃｘは、ある対照試料をある対照用試験管に添加した後のｘ分目のシグナルであり、Ｃｙは、その対照試料をその対照用試験管に添加した後のｙ分目のシグナルであり、ｘおよびｙは前記第二期間内に選択される時期であり、かつｘはｙを上回る］により特定される試料の毒性効果を決定することが可能である。第一期間Ａの持続期間は典型的には１０もしくは１５秒から５分までの範囲内である。時間０秒目からその検査用試料の光出力を継続的にモニターすることによって第一期間Ａの持続期間が容易に決定される。第一期間の持続期間および被検体についてのアッセイとしての光出力の観察の開始についての時間の決定がコンピューターにより制御されることが好ましい。別法では、これらの因子を手作業により決定可能である。別法では、経験により第一期間Ａの持続期間がどのようなものであるかが知られている場合には、光出力の測定を、試薬類を混合して検査用混合物を形成させた後の固定時間、例えば３０秒目もしくは３分目に開始することが可能である。この時限開始時は第二期間Ｂの開始時より早くなるべきではなく、そうでないと環境因子に起因する測定誤差が測定値に混入する可能性が出てくる。一方で時限開始時は第二期間Ｂの開始時より、検査用混合物の光出力が既にあるレベルまでに降下してしまう程までにひどく遅延するべきではなく、そのようなレベルでは不正確な測定が測定が行われるだけであったり、もしくは測定困難であったり、あるいはあまりに低レベルであるためその毒物によるいずれかの有意な後続効果を検出することができなくなったりするためである。既述の発見によってこのアッセイプロトコールにおける更なる改善が可能となり、これは現行で入手可能な市販のアッセイと比較される。ａ）ある市販のアッセイでは、生物発光性細菌の比較的少容量の水性懸濁物を比較的大容量の被検体含有性毒物に添加する。得られる検査用混合物中の細菌濃度は低くなり、そのため光出力は低く、かつ予防措置を採らない限り容易に測定不能レベルへと低下する。それとは対照的に本発明に従うと、被検体の液体試料の容量は、生物発光性細菌の液体懸濁物のアリコートの容量の好ましくは１０倍を上回わることがなく、そして典型的には２．０から０．５倍までである。この制度により、明るくて測定が容易な光出力を提供するのに十分な細菌、および存在するいずれかの被検体の簡便かつ感度の良い検出を可能にするのに十分な試料の使用が可能になる。ｂ）ある市販のアッセイキットでは、生物発光性細菌が再構成用緩衝液と一緒になっている凍結乾燥形態で提供される。この系は海洋性細菌（フォトバクテリウムフィスケリ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｉｓｃｈｅｒｉ））に基づいており、その再構成用緩衝液は、例えば塩のような高浸透性化合物を含むことが必要である。用いられる試料の容積が大きいため、塩（もしくは他の高浸透性化合物）を、生物発光性細菌懸濁物の添加以前にその試料に添加する必要がある。典型的には、被検体を幾つかの希釈率でアッセイし、そしてその各希釈物が同一の塩濃度を有することが必要とされる。例えば生物発光性細菌のような安定化された微生物を本発明に用いることも好ましい。安定化は凍結乾燥により達成されることが好ましい。しかし現行で入手可能な系とは対照的に、再構成用緩衝液は高浸透性非塩化合物（例えば、スクロース、デキストラン、もしくはポリエチレングリコールのようなもの）を含むことも好ましい。更にはこの被検体を場合によっては希釈後に、しかしいずれかの化学試薬の添加は伴わずに検査することが好ましい。具体的には試料の容量が比較的小さく、かつ微生物懸濁液の容量が比較的大きいがために、その試料への高浸透性化合物の添加は、シグナル産生性微生物を保存するのには必須でないこと、例えば生物発光性細菌の死滅を防ぐのに必須ではないことが判明している。本発明のアッセイ方法は、検査用混合物（および対照用混合物）に関しては、いずれかの温度（例えば、５℃〜３５℃の範囲内）で実施可能である。試料および対照の両アッセイ温度は１５℃であることが好ましい。既述の記載は特に生物発光性細菌に関連しており、そしてそれらが実際に好まれる。しかし原理的にはいずれかのシグナル産生性微生物を使用可能である。実施例に報告される結果に基づくと、いずれかのシグナル産生性微生物からのいずれかのシグナルは、比較的短い第一期間中では環境的理由によって、そして比較的長い第二期間ではアッセイ中の試料中の被検体による影響を受けるであろうことを確信を持って予想することが可能である。既述の第二期間中では、光出力（もしくは産生されるシグナル）の測定は検査用混合物と対照用混合物との両方について事前に決定された間隔で実施される。観察事項は図１に類似のグラフにプロットすることが可能である。実際のところ、試料中の被検体（毒物）が第二期間Ｂ中に光出力の減少を生じること、およびその減少が用量反応的であること（すなわち被検体（毒物）の濃度が高ければ高い程光の減少が大きくなる）が見いだされている。その被検体の特性が既知である場合には、従ってこのアッセイを用いて濃度を評定することが可能である。被検体の特性が未知である場合、もしくは被検体の混合物が存在する可能性がある場合には、このアッセイはより定質的な様式に用いられる。現在までの論議により、検査用混合物形成後の第一期間Ａ中の光出力の比較的迅速な減少は、環境的効果、ｐＨ、浸透ショックなどに起因することが推定されている。そして通常はこれが真なることが事実である。しかし他の可能性も予想される。幾つかの状況では試料が高速作用性被検体に加えて一つもしくは複数の他の被検体を含む可能性がある。高速作用性被検体が作用の初期期間に生物発光を完全に消失させはしない濃度で存在する場合には、残存する生物発光を用いて他の被検体の存在を測定することが可能である。ハロゲンは工業プロセス水を処理するのに用いられる高速作用性殺生物剤の具体例である。例えば塩素は発光性細菌に迅速に作用して用量応答性様式で光出力を減少させるが、それは検査用混合物形成後の最初の１分もしくは２分以内であることがしばしばである。本発明のこの態様では、検査用混合物の光出力は第一期間Ａ中に減少するが、これは例えばハロゲンのような高速作用性被検体がその液体試料中に存在することに起因する。その後にその検査用試料の光出力は、存在する可能性のある他の被検体についてのアッセイとして第二期間Ｂ中に観察される。２つもしくはそれを上回る数の被検体が生物発光において有意に異なる速度の作用を有するという他の状況では、期間Ａ、次いで期間Ｂなどにおける光の減少を測定し、そしてそれらを事前に準備されている検定値と比較することにより、同一アッセイにおいて独立にそれらの被検体を定量することが可能である。本発明人はこのことを確認している。別法では、このアッセイの実施以前に中和剤を添加して、その高速作用性被検体と反応させ、その被検体を不活性にさせかつ低速作用性の被検体のアッセイにおける妨害を回避させることを効果的に行うことが可能である。中和剤としては様々な物質を利用することが可能であり、典型的にはハロゲンと反応し、かつ生物発光性微生物を妨害しない還元剤である。好ましい中和剤はチオ硫酸ナトリウムである。本発明に従うと、被検体は、検査用混合物の形成後に光出力（もしくは産生される他のシグナル）を比較的長い第二期間Ｂ中に変化させる（通常は減少させる）ように作用する。この被検体の特性は本発明にとっては重大ではない。多大な数の被検体が用量応答性様式で生物発光性細菌の光出力を減少させることが知られており；その大多数が持続的で緩和な様式で作用することが見いだされている。被検体の例は重金属類、殺生物剤類、抗生物質類、第四級アンモニウム塩類、イオン性洗剤類、非イオン性洗剤類、フェノール類、ハロゲン化炭化水素類、酸類、およびアルカリ類であり、これら全ては本発明の方法により首尾よくアッセイされている。これらの被検体は通常は有毒物質であるかあるいは毒物である。毒性は「生きている生物体に不利な効果を生じる可能性もしくは能力として特定され、一般的には一つの毒物もしくは複数の毒薬の混合物である。毒性は、用量、露出濃度、および露出時間の結果であり、例えば、温度、化学形態、および有効性のような変数により改変される」。殺生物剤および抗生物質が毒物の例である。しかし論理的には十分に高い用量で存在する場合にはいずれかの物質も毒性を示す。被検体はアッセイ予定の液体（一般的には水性液体）の試料であり、すなわちそのような試料中の中の溶液もしくは懸濁液という状態で存在する可能性がある。その例は、河川水、海水、工業的流出液、埋め立てごみ処理地からの流出液、排水、下水、工業プロセスからの水（例えば、冷却塔、製紙用粉砕機、エアコン装置、加湿機、潤滑機）、水泳用プール、液体保有用タンク、オイルタンカー／保存用タンクの水底、でい水、処理用水（すなわち、冷却するのとは反対に、何物かを作成するのに用いられる水）、農業排水（農場構内のスラリー、土地排水）、ならびに飲料水である。本発明は以下の利点を提供する：− ｉ）先に論述される様々な特徴の組み合わせにより、比較的高濃度の生物発光性細菌および比較的少ない容量の被検体含有性試料の使用が、感度を犠牲にすることなく可能になる。ｉｉ）本明細書に提案されるアッセイの形状および分析の方法は、アッセイ用試料への塩の添加を除去することが可能な程度にまで浸透ショックの効果を引き下げる。ｉｉｉ）この検査中に産生されるシグナルは非常に大きいため、試料の色および濁度の効果は、検査用混合物の形成とアッセイ目的のための光測定との間のタイムラグにより容易に補正される。ｉｖ）毒性に影響を及ぼすことのない物理的環境の変化に起因する結果の変動も、やはりそのタイムラグにより除去される。ｖ）以下の実施例に記載される幾つかの毒物に関しては、この系は商業的に入手可能な系の内の少なくとも一つよりは感度が良い。ｖｉ）単一の検査反応を用いる、異なる熱力学的作用を有する２つもしくはそれを上回る数の既知の被検体の混合物を識別および定量する能力。以下のものが引用され：それらは、図２〜６の添付図面（各図面は、時間に対する光出力のｌｏｇ減少のグラフである）；および図７〜９の添付図面（各図面は、具体的に示される変数に対する％毒性効果のグラフである）。実験方法これらの実験に用いられる検査試薬は、一般的に入手可能な海洋微生物フォトバクテリウムホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）ＮＣＩＭＢ８４４である。しかし天然に存在するものもしくは組換え体のいずれかの他の細菌を使用して、本質的に類似する結果が得られている。これらの細菌はタービドスタット内で培養し、ラクトース／塩化カリウム凍結保護物質中に再懸濁させ、１００μｌアリコートに分配し、そして凍結乾燥した。細菌試薬の各バイアルは一回のアッセイ用に意図される。アナラール（Ａｎａｌａｒ）水中の７．５％ｗ／ｖスクロースからなる０．５ｍｌの再構成用緩衝液をその試薬に添加した。得られる細菌懸濁物は２０分後には少なくとも４０分間持続する安定な光シグナルを産生する。検査中の０．５ｍｌの被検体試料をこのバイアルに添加した。いずれかの浸透ショックもしくは他の試料効果をある期間にわたって生じさせたが、これらは可変的でありかつ検査にかけられる試料に依存する。その後に基準光測定値を測定して、いったん浸透ショックおよび他の環境的効果を生じながらも、被検体による有意な毒性効果を生じる以前の細胞の状態を表した。後続の光測定値をその基準光測定時から時限間隔を空けて測定していった。被検体を、最初に記録された測定値と、一回もしくは複数回の時間間隔を空けた時点での測定値との間の光損失を測定することによりアッセイした。実施例１フェノールが被検体であった。６０ｍｇの結晶性フェノールを差をとることにより計量して取り出し、そしてアナラール（Ａｎａｌａｒ）水中で１リットルにメスアップした。この溶液を更に４０ｍｇ／ｌおよび２０ｍｇ／ｌに希釈した。これらの被検体溶液の０．５ｍｌの試料を周囲の温度で用いて既述の系の０．５ｍｌの生物発光性細菌懸濁物との検査用混合物を作成した。光出力を、この検査用混合物の形成後０、３、５、１０、および２０分目に測定した。図２はこれらの時限測定時での光出力の減少を、新しく形成された検査用混合物の初期光出力と比較して示している。１０分後の測定値は、被検体含有性試料と対照試料との間を識別することが可能な程のものではない。２０分後には４０および６０ｐｐｍのフェノールを含む試料はその対照試料から識別可能となる（しかし２０ｐｐｍのフェノールでは識別可能となってはいない）。図３は光出力のｌｏｇ減少のグラフであり、検査用混合物の形成後３分目の光測定値を開始点として用いていることを除いては図２に相当する。一層明確な特徴が出現している。６０ｐｐｍのフェノール試料は５分後には明らかに識別可能となった。３つの全被検体試料は、１０分後には対照試料から明確に識別可能となった。この実施例および後の実施例では、環境効果が優勢となる第一期間Ａ（図１）の持続期間の測定は試みていない。この実験での経験は、第一期間の持続期間は常に３分を下回ることを示していた。そのため３分目の光出力測定値を基本値として用い、そしてそのことにより２０ｐｐｍ程の低濃度でのフェノールの存在の明確な表示が可能となる。実施例２ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を被検体として用いた。２０ｍｇのＳＤＳを差をとることにより計量して取り出し、そしてアナラール（Ａｎａｌａｒ）水中で１リットルにメスアップした。その後にこの溶液を更に１ｍｇ／ｌ、０．５ｍｇ／ｌ、および０．２５ｍｇ／ｌに希釈した。この方法は実施例１に記載されるものであるが、例外は時限測定を検査用混合物の形成後０、２．５、５、１０、および１５分目に実施したことであった。図４は、検査用混合物の形成後０分目に取得された測定値に基づく光出力のｌｏｇ減少のグラフである。これらの図は、明らかに異なる結果が様々な時間間隔での測定値から取得されるというものである。図５は、検査用混合物の形成後２．５分目に取得される光出力図を基準として用いた対応グラフである。ここでは結果は明確であり、そして０．２５ｐｐｍ程の低ＳＤＳ濃度が１０分後には対照から明白に識別可能となる。実施例３臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を被検体として用いた。１１２ｍｇのＣＴＡＢを差をとることにより計量して取り出し、そしてアナラール（Ａｎａｌａｒ）水中で１リットルにメスアップした。その後にこの溶液を更に１１．２ｍｇ／ｌ、５．５１ｍｇ／ｌ、および２．７５ｍｇ／ｌに希釈した。実施例１および２におけるものと同一の方法に従い、そして光出力測定値を検査用混合物の形成後２．５、５、および１０分目に調査した。図６は、基準として２．５分目の測定値を用いる光出力のｌｏｇ減少のグラフである。様々な希釈率でＣＴＡＢを含む全試料は、初期検査用混合物形成後５分目および１０分目に行われた測定値については対照および互いの測定値とは明らかに識別可能であった。実施例４硫酸亜鉛（Ｚｎ）を被検体として用いた。１ｇの硫酸亜鉛７水和物を差をとることにより計量して取り出し、そしてアナラール（Ａｎａｌａｒ）水中で１リットルにメスアップして２２０ｍｇＺｎ⁺⁺／リットルの作業用濃度を作製した。その後にこの溶液を更に２７．５ｍｇＺｎ⁺⁺／リットル、１３．７５ｍｇＺｎ⁺⁺／リットル、および６．８７ｍｇＺｎ⁺⁺／リットルに希釈した。以下の表は初期検査用混合物形成後５分目に残存する光を示しており、様々なＺｎ濃度での初期検査用混合物形成後の２．５分目に残存する光の％として表示されている。亜鉛のような強力な被検体を用いたとしても、本発明の方法を用いてその被検体の効果を検出することは依然として可能であった。実施例５３本のバイアルの検査用試薬（先の「実験方法」に記載される）を既述の要領で処理したが、例外としてそれらの試薬を１ｍｌの７¹/₂％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液で再構成し、そして１５℃に２時間放置した。その後にそれらのバイアルの内容物を合わせ、そして６¹/₂ｍｌのアリコートに再分配した。硫酸亜鉛の一連の希釈物をアナラール（Ａｎａｌａｒ）水中で調製して、最終濃度を０．００１、０．０１、０．１、１．０、および１０ｍｇ／リットルとした。この６本の再構成化検査用試薬を温度制御化アッセイ用ラック（１５℃）に配置した。各添加間の時間を適当に遅らせることによりルミノメーターでの光値の測定が可能になるが、¹/₂ｍｌの量の水（対照）および硫酸亜鉛の５つの希釈物をこれら６本のバイアルに、濃度が高くなる順に添加した。各バイアルからの光出力を、試料の添加後２、５、１０、１５、および２０分目に測定した。硫酸亜鉛に対するフォトバクテリウムホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）の感度についての未処理データこのデータは図７にグラフとして示される。毒性は、式から算出され、これはすなわち２０分目での０．１ｍｇ／ｌについては効果＝［１−｛（１５０００÷４６０００）÷（３４０００÷４７０００）｝］×１００％＝５４．９２％となる。実施例６濁度の効果についての補正本発明の遅延時間の役割により、毒性の分析が始まる以前に濁度のような迅速な効果がその試薬に影響を及ぼすことが可能になるはずである。この実験の設計により、毒性の分析がある遅延時間後に行われるとすると、高レベルの濁度は硫酸亜鉛の標準溶液の毒性効果所見（先に詳細が記載される要領で算出される）を変化させることがないことが示される。方法アメルレックス（Ａｍｅｒｌｅｘ）ラテックス溶液を濁度の源として用いるために、１：１００、１：２００、１：４００、および０（ラテックス非含有性）に水中で希釈した。４９０ｎｍでのパーセンテージ光透過率（波長は検査用試薬の放射に近くなるように選択される）を各希釈物について測定した。ＡＭＥＲＬＥＸは登録商標である。硫酸亜鉛をこのアメルレックス（Ａｍｅｒｌｅｘ）溶液および水対照に添加して最終濃度を０．１ｐｐｍとし、そして完全に混合した。９バイアルの検査用試薬を先の実施例５に記載される要領で再構成し、そしてそれらを合わせた。再構成化試薬を１７本の¹/₂ｍｌアリコートに分配し、そして１５℃の温度制御化アッセイラック内に入れた。¹/₂ｍｌ量のラテックス希釈物を個別のバイアルに三重検定用に添加したが、ただし各添加間に適切な遅延時間を用いてルミノメーター内での光の値の測定を可能にした。硫酸亜鉛を含まない水の試料をブランク対照として用いた。各バイアルからの光出力を、試料の添加直後、ならびに試料の添加後２分目および５分目に再度測定した。結果結果を以下の表および図８に示す。ａ）ラッテクス溶液の濁度ｂ）ラテックス溶液の毒性毒性は既述の式を用いて算出し、この場合、対照値は亜鉛もしくはラテックスを全く含まない試験管から取得した。た。例えば、ラテックを全く含まない場合に関する２〜５分目の毒性効果については、％毒性効果＝［１−｛（２２４÷２８５．４）÷（２５９．４÷２２７．９）｝］×１００％＝３１．０４％となる。結果および論議全濃度のラテックスは同量の硫酸亜鉛を含むため、各バイアルの毒性効果は同一になるであることが予測されるはずである。標準方法では遅延時間は存在せず、この方法では測定された毒性は見かけ上増加し、このことはラテックスの存在が濃度依存的様式で検査の反応に影響を及ぼすことを示す。アメルレックス（Ａｍｅｒｌｅｘ）は多数の生物学的アッセイ系の非毒性構成成分であるため、これが生物体の生存率におけるいずれかの直接的影響の原因となっているという見込みはなさそうであり、そしてそのためその生物体により産生される生物発光性シグナルの妨害がその原因となっている公算がより強い。遅延時間方法を用いると、この反応は一層平坦になり、各試料中に予想どうりの同一測定毒性値が示される。ラテックスの存在下では多数の毒性測定値の減少が存在するが、このことが毒性の測定に有意な影響を及ぼすことはなく、かつこれは恐らくは生物体上での僅かながらの緩衝効果に起因するものと思われる。より短い遅延時間を用いてこの効果を減少／除去することが可能であった。更には、ラテックスの存在が０分と２分との間での未処理の光測定値の減少をより強めるものの、毒性の測定用に利用可能なシグナルの量が元のものの僅か２０％に過ぎないとしてもこの遅延時間方法を依然として首尾よく使用することが可能であることは特筆するべきである。これはすなわち、その妨害効果が０分目と２分目との間の光喪失の８０％の説明となる場合である。実施例７色の影響についての補正遅延時間を使用すると、毒性が測定される以前に、試料中の色に起因するシグナルのいずれかの吸収を生じることが可能性になるはずである。この実験の設計により、遅延時間方法を用いるとすると、標準濃度の亜鉛が様々な妨害性色濃度の範囲にわたってその試薬に同一の毒性反応を産生することが示される。方法０．２％のフェノール（Ｐｈｅｎｏｌ）レッド溶液（Ｓｉｇｍａ社）を１：１０、１：１０００、１：１０，０００に希釈し、そして４９０ｎｍでの光の透過率を測定した。硫酸亜鉛を全ての溶液およびフェノールレッド非含有性対照（すなわち水である）に添加して最終濃度を０．１ｐｐｍとし、そして完全に混合した。８バイアルの検査用試薬を先の実施例５に記載される要領で再構成し、そして合わせ、その後に¹/₂ｍｌのアリコートに分配した。全てのフェノールレッド溶液の検査は、その有色溶液の添加以前、そしてそれに次いで¹/₂ｍｌの有色溶液の添加後２分目および５分目に¹/₂ｍｌアリコートの検査用試薬内での光測定値を測定することにより三重検査で実施した。３本の対照試験管（硫酸亜鉛もしくはフェノールレッドを含まない水）も用いた。試験管内の硫酸亜鉛の毒性反応は、既述の式を用い、基準光測定値として０分目（すなわち、有色溶液の添加以前）もしくは２分目のいずれかを用いて評定した。結果を以下の２つの表および図９に示す。結果４９０ｎｍでの光の透過率結果および論述実施例６に記載される濁度実験と同様に、フェノールレッドの各濃度における毒性のレベルは同一であるはずであり、検査した色の濃度にわたり平坦な反応を生じた。明らかなことではあるが、遅延時間方法はそのような反応を生じる一方で、標準的な０〜５分の方法は色の濃度に依存する毒性のレベル増加を示す。この事例においてはフェノールレッドが非毒性であると述べることは可能ではないため、毒性測定値の内の幾分かの増加が試料の毒性の真の差異に起因する可能性がある。しかしながら、色の濃度を２ｌｏｇに増加させたとしても遅延時間方法では毒性に全く差異が生じないことが見いだされており、かつ同一の濃度変化に関する標準方法での毒性測定値の増加は僅か３５％程度であり、このことはフェノールレッドに起因するいずれかの毒性はその毒性が異常に迅速で、試料の添加２分以内に生じることがなものではない限り有意なものではないことを示している。繰り返し記述するが、フェノールレッドに起因するいずれかの毒性は短めの遅延時間を用いることにより評定することが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者レウィントン，ジェイイギリス国カーディフシーエフ４・４ジェイエル，ヒース，ヒースウッド・ロード 45

Claims

【特許請求の範囲】１．シグナル産生性微生物の液体懸濁物の使用による、被検体を含む可能性のある液体試料とその液体懸濁物のアリコートとを一緒に混合して検査用混合物を形成させ、そしてそれに次いでその微生物により産生されるシグナルを観察することを含む、ある被検体をアッセイする方法であって、検査用混合物中の微生物により産生されるシグナルのサイズは、その検査用混合物の形成の時点から測定される第一期間中に第一速度で変化し、そしてそれに次いで被検体の効果に起因して第二期間中に第二速度で変化し、そしてそのシグナルのサイズの観察はその第二期間中の様々な時期に実施され、かつ被検体についてのアッセイとしての比較が行われる方法。２．対照試料とシグナル産生性微生物のアリコートとを含む対照混合物も作成され、そして検査用混合物中の微生物により産生されるシグナルを、被検体のアッセイとしての第二期間中に対照混合物中の微生物により産生されるシグナルと比較する、請求の範囲１に記載の方法。３．第一期間が１０秒から５分までである、請求の範囲１もしくは請求の範囲２に記載の方法。４．第一期間の持続期間の決定、および被検体についてのアッセイとしてのシグナルの観察を開始する時点がコンピューターにより制御される、請求の範囲１〜３の内の一つに記載の方法。５．液体試料の容量がシグナル産生性微生物の液体懸濁液のアリコートの容量の１０倍を上回ることがない、請求の範囲１〜４の内のいずれか一つに記載の方法。６．シグナル産生性微生物が細菌であり、かつその液体懸濁物が凍結乾燥された細菌を、強浸透性非塩化合物を含む再構成用緩衝液を用いて再構成することにより形成する、請求の範囲１〜５の内のいずれか一つに記載の方法。７．液体試料が場合によっては希釈後に用いられるが、ただしいずれかの化学的試薬の添加は伴わない、請求の範囲１〜６の内の一つに記載の方法。８．シグナル産生性微生物が遺伝子工学的に作製される生物発光性細菌である、請求の範囲１〜７の内のいずれか一つに記載の方法。９．アッセイを実施して、式［式中、Ｔｘは、ある毒性試料をある検査用試験管に添加した後のｘ分目のシグナルであり、Ｔｙは、その毒性試料をその検査用試験管に添加した後のｙ分目のシグナルであり、Ｃｘは、ある対照試料をある対照用試験管に添加した後のｘ分目のシグナルであり、Ｃｙは、その対照試料をその対照用試験管に添加した後のｙ分目のシグナルであり、ｘおよびｙは前記第二期間内に選択される時間であり、かつｘはｙを上回る］により特定される試料の毒性効果を決定する、請求の範囲１〜８の内のいずれか一つに記載の方法。１０．検査用混合物中の微生物により産生されるシグナルのサイズが環境的効果に起因して第一期間中に第一速度で変化する、請求の範囲１〜９の内のいずれか一つに記載の方法。１１．検査用混合物中の微生物により産生されるシグナルのサイズが液体試料中での高速作用性被検体の存在に起因して第一期間中に第一速度で変化する、請求の範囲１〜９の内のいずれか一つに記載の方法。１２．被検体が毒物である、請求の範囲１〜１１の内のいずれか一つに記載の方法。１３．異なる反応速度を有する第一および第二被検体をシグナル産生性微生物の液体懸濁物の使用により分析を行うが、ただし第一および／または第二被検体を含む可能性のある液体試料と、その液体懸濁物のアリコートとを一緒に混合して検査用混合物を作成し、そしてそれに次いでその微生物により産生されるシグナルを観察することを含む方法であって、検査用混合物中の微生物により産生されるシグナルのサイズは、第一被検体の効果に起因して第一期間中に第一速度で変化し、そしてその後に第二被検体の効果に起因して第二期間中に第二速度で変化し、そしてそのシグナルのサイズの観察は両被検体についてのアッセイとして両方の期間中に実施される方法。