JPH09507836A

JPH09507836A - 非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合と混合したキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する合成オリゴマー

Info

Publication number: JPH09507836A
Application number: JP7514623A
Authority: JP
Inventors: アーノルド，ライル・ジョン・ジュニア; ホグレフ，リチャード・イザイス; レイノルズ，マーク・アラン; ライリー，ティモシー・アンドリュー; シュワルツ，デビッド・アーロン; バジェフィ，モルテザ・モニア; ブラウン，ボブ・デール
Original assignee: ジンタ・インコーポレイテッド
Priority date: 1993-11-16
Filing date: 1994-11-16
Publication date: 1997-08-12
Also published as: NZ276956A; AU678085B2; CA2176256A1; EP0729474A1; US6028188A; IL111659A0; EP0729474A4; KR960705837A; WO1995014030A1; AU1181995A; US5792615A

Abstract

(57)【要約】ＲＮＡ標的配列にハイブリダイズする、非−ホスホネートヌクレオシジル間結合と混合された、キラル的に純粋なヌクレオシジル間結合を有するオリゴマー、およびその製法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合と混合したキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する合成オリゴマー発明の背景および序論本発明は、（以下に記載するような）非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合（internucleosidyl linkage）と混合したキラリティー（chirality）的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する合成オリゴマーおよびそれらの合成法に関する。天然のホスホジエステル・ヌクレオシジル間結合およびある種の他のヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーは、そのヌクレオシジル間結合のリン原子（または他の原子）においてキラル中心を持たない。しかしながら、メチルホスホネートおよびメチルホスホノチオエート・ヌクレオシジル間結合を含むこれらのホスホネート・ヌクレオシジル間結合はそのリン原子においてキラルであり、該アルキル基の相対的配向によってＲpまたはＳpのキラリティーを有する。かくして、かかる結合を持つオリゴマーは、理論的に、個々のオリゴマーにつき、２ⁿの異なるジアステレオマー形を有しうる。ここに、ｎは当該オリゴマー配列におけるキラル・ヌクレオシジル間結合の数である。例えば、１０個のキラル・ヌクレオシジル間結合と、１０個の非キラル結合を有する２１量体は、理論的に、１,０２４個のジアステレオマーを有し、１８個のキラル・ヌクレオシジル間結合を有する３７量体は理論的に、２６２,１４４個のジアステレオマーを有する。得られたオリゴマーのヌクレオシジル間メチルホスホネート結合のキラリティーの報告された効果およびそれらの生物学的または物理化学的行動は様々である。立体規則的な、交互するメチルホスホネートおよびホスホジエステル主鎖を有するデカチミジレート・アナログの２つの異性体の製造が報告されている（Mill er，et al.，J．Biol．Chem．255(20):9659-9665(1980)）。該２つの異性体を含有するオリゴマーと相補性ポリヌクレオチドの間の複合体が研究された。異性体１および２のメチルホスホネート基の絶対配置は決定されなかった。２つの異性体を含むオリゴマーと相補性ポリヌクレオチドとによって形成された複合体は、異なった化学量論と熱安定性を有するとされた。ミラーら（Miller et al.）は、メチルホスホネート基がＳp配置であるデカチミジレート・アナログとの複合体形成においては、メチル基は、複合体との溶媒相互反応に対する最小の摂動（ perturbation）効果を有するはずであり、一方、反対に、メチルホスホネート基がＲp配置であるデカチミジレート・アナログとの複合体形成は、メチル基を塩基積み重なり領域から遠ざけ、かつ溶媒へ近ずくように配向させ、「露出したメチル基と、それを取り囲む溶媒との間の望ましくない相互反応」をもたらすと仮説した。１９量体ホスホジエステル・オリゴヌクレオチド（dＡ₁₉、dＵ₁₉またはdＴ₁₉ ）と、１つのホスホジエステル５'−ヌクレオシジル間結合を有する１９量体メチルホスホネート・オリゴヌクレオチド（dＡ₁₉、dＵ₁₉またはdＴ₁₉）との間の二重螺旋（duplex）形成の複合体に関する研究は、dＡ₁₉と、dＴ₁₉またはdＵ₁₉ との間の複合体のトランジション曲線（transition curve）がシャープで、dＡ₁ ₉ と、dＴ₁₉またはdＵ₁₉とのそれと類似しているが、dＴ₁₉またはdＵ₁₉と、dＡ₁₉ の二重螺旋についてのトランジション曲線は著しく広いことを報告しており、ピリミジン鎖を置換した場合のみ、メチルホスホネート・キラリティーが結合安定性に著しく影響を有していたことを著者らに示唆した（Kibler-Herzog，Laura， et al.，Nucleic Acids Research 18(12):3545-3555(1990)）。オクタチミジン・メチルホスホネートの２−ジアステレオマー対（全てＳpとＳpＳpＳpＲpＳpＳpＳp対全てＲpとＲpＲpＲpＳpＲpＲpＲp）と、オクタチミジル酸、オクタチミジン・メチルホスホネート・ジアステレオマーのランダム混合物およびペンタデカデオキシリボアデニル酸と形成した複合体の対比研究は、ヌクレオシジル間メチルホスホネート結合が（dＡ）₁₅のオリゴマーに対する結合に影響しえ、Ｓp配置のメチル基が二重螺旋安定性を減じたことを報告した。（L ensnikowski et al.，Nucleic Acids Research 18(8):2109-2115(1990)）。あるコンピューター・モデルの研究は、ＤＮＡ標的へのメチルホスホネート（ＭＰ）のハイブリダイゼーションが、好ましい疎水性相互反応のため、ＭＰ（Ｓ p）置換によってより安定となり、一方、ＭＰ（Ｓp）は、望ましい疎水性相互反応の少ない二重螺旋を不安定にしたことを報告した。該シミュレーションは、単一のＭＰ（Ｒp）のＭＰ（Ｓp）置換を有するアンチセンス・オリゴマーと比較した（Hausheer et al.，J．Am．Chem．Soc．114:3021-3206(1992)）。自由エネルギー分解法を用いる自由エネルギー摂動アプローチによるＲpおよびＳpメチルホスホネート・オリゴマーの相対的安定性の測定ためのコンピューター・モデル研究が報告された。この研究は、Ｓpジアステレオマーの場合、Ｃ２'およびＣ３'糖（５'方向）炭素および水素は、メチル基と好ましくない相互反応をし、一方、Ｃ５'糖（３'方向）水素はＲpジアステレオマーを不安定にすることを報告した。この研究はＲp配置の安定が望ましいことを報告したが、ある状況では、ＲpおよびＳpジアステレオマーにおける安定性が逆転しうることが認められた。（FergusonおよびKollman，Antisense Research and Development, 1:243-25(1991)）。１つのメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する自己相補性ＤＮＡオリゴマーを用いる二重螺旋の形成の研究が報告された。Ｒp二重螺旋で、報告されたＴmは、置換が鎖の３'−末端に接近するほど増加した。Ｓp二重螺旋で、鎖の中心により近い置換が、二重螺旋のいずれかの末端に近い置換よりも大きな効果（より大きいＴm低下）を生ずるとされた。第２と第３のヌクレオシド（５' −末端から）間の置換の一例において、Ｓp二重螺旋は、対応するＲp二重螺旋よりも高いＴmを有していた。（Bower et al.，Nucleic Acids Research 15(12):4 915-4930(1987)）。一本鎖および塩基対形のジヌクレオシド・メチルホスホネートの分子モデル研究の一つの総説において、ＭＰ（Ｓp）もＭＰ（Ｒp）も二重螺旋構造の立体化学を著しく変化させるようにはみえなかったと報告された。（Latha et al.，J．B iomolecular Structure Dynamics，9(3):613-631(1991)）。アンチセンス因子（agent）のある種の作用を総括した概論において、無細胞抽出物における不十分にハイブリダイズされたラセミ体オリゴデオキシヌクレオシド・メチルホスホネートの不利な点は、多かれ少なかれ、細胞培養系でそれらの提供する利点によってバランスされるとされた。１つのメチルホスホネート結合を有する正常な（デオキシリボヌクレオシド）８量体を用いたある種の報告で、Ｒp結合を有する該オリゴマーがＳp結合を有するオリゴマーよりも高いＴmを有することを見いだしたことが認められた。また、メチルホスホネート塩基ペアリングの配列依存性がキラリティーと同様に重要でありうることも認められた。（Wickstrom，"Antisense DNA Therapeutics Neutral Analogs and Their Stere ochmistry"，Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA，119-132， EricksonおよびIzant編，Raven Press Ltd.，New York(1922)）。チミジン含有ジヌクレオシド・メチルホスホネートのジアステレオマー選択的合成が報告された。(Engels et al.，Nucleosides & Nucleotides 10(1-3):347- 350(1991))。メチルジクロロホスフィンを用いるある種の他のジヌクレオシド・ ner et al，Tetrahedron Letters 30(41):5587-5590(1989)）。発明の概要一つの態様により、本発明は、単一の非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合がところどころに介在するキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーである、混合ヌクレオシジル間結合を有する合成オリゴマーおよびそれらの製造法を提供される。そのようなホスホネート・ヌクレオシジル間結合は、低級アルキル基が炭素原子数１〜３、アリール基が炭素原子数６〜１０の低級アルキルもしくはアリールホスホネート・ヌクレオシジル間結合および低級アルキルもしくはアリールホスホノチオエート・ヌクレオシジル間結合を含む。これらの混合オリゴマーは、単一の非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合の間に、非ホスホネート結合：ホスホネート結合の比が１：約１〜１：約４で介在するホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する。これらのオリゴマーは一本鎖ＲＮＡ標的配列の発現または翻訳を防止または阻害するために使用でき、該ＲＮＡ標的配列に対し、それとハイブリダイズするに十分な相補性であるヌクレオシド塩基配列を有する。好ましい態様において、かかるオリゴマーは、非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合と交互に並ぶ、交互するキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する。とりわけ、本発明は、ＲpまたはＳpキラリティーのいずれかに富むメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合と、非ホスホネート結合との混合からなるヌクレオシジル間結合を有する、ここに記載の混合オリゴマーが、ラセミ・メチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する同じ塩基配列のオリゴマーと比べて、それらの相補性ＲＮＡ標的配列に対して（相対的に）高いまたは低い「ネット（net）」結合親和性を示すという我々の意外な知見に基づくものである。これらのオリゴマーはまた、ジエステル、ホスホノチオエートまたは他のヌクレアーゼ感受性結合を有するオリゴマーと比べて、高いヌクレアーゼ耐性を示す。「ネット」なる語は、オリゴマー試料における各ジアステレオマーに対する個々の結合親和性の平均を意味する。我々は、高結合ジアステレオマーに富む（すなわち、Ｒp配置メチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合に富む）オリゴマー試料が高い「ネット」結合親和性を示すことを見いだした。このような結合親和性の証拠として、我々は、ＭＰキラル中心においてＲp配置に富むオリゴマーが、ＲＮＡ標的配列とのハイブリダイゼーション分析において、ラセミＭＰ結合を持つオリゴマーよりも高いＴmを示し、一方、ＭＰキラル中心においてＳp配置に富むオリゴマーは、低いＴmを示すことを証明した。我々は、ある種の富Ｒpオリゴマーが、二重螺旋においてＲＮＡ標的に結合すると、ＲＮＡ標的配列に対する増強した結合親和性を示すことを見いだした。二重螺旋モードにおける結合に関し、我々は、メチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合のＲp富化が、ラセミ配置と比較して、ヌクレオシジル間結合、すなわち、Ｒp配置の結合１個当たり、約０.９〜１.５℃のＴm増加を与えることを見いだした。特に好ましい態様において、糖部分として２'−Ｏ−メチルリボシル基を有するヌクレオシドを有する本発明のオリゴマーがヌクレアーゼに対する増強した安定性を示し、同じヌクレオシジル間結合を有するが、２'−デオキシリボシル糖部分を有するオリゴマーと比較して高いＴmも示すことを見いだした。特に、我々は２'−デオキシリボシルの２'−Ｏ −メチルリボシルとの置換１個当たり、約１℃のＴm上昇を見いだした。メチルホスホネート・オリゴマーのＤＮＡ標的へハイブリダイズする能力に対するキラリティーの影響は従来から言及されている。文献中に、富Ｒpオリゴーd Ｔメチルホスホネートは、それらのラセミ体よりも、より強固にＤＮＡと結合するといういくつかの報告がある。これらの研究ではＲＮＡよりも、ＤＮＡ標的が使用された。ＤＮＡおよびＲＮＡを用いて形成した螺旋間の構造的相違に鑑み、ＤＮＡ標的で得られたこのようなデータは、ＲＮＡ標的への適用を示唆するものではない。ＤＮＡおよびＲＮＡ間の、ある重要な物理化学的相違は以下に論ずるとおりであり、この点を支持する。一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的いずれかにハイブリダイズしたＤＮＡオリゴマーは、各々、Ｂ型およびＡ型といわれる異なる螺旋幾何学を有する。これら２つの異なる型の螺旋は極めて異なる３次元形状を有する。Ａ型と、Ｂ型の螺旋形の相違は以下のとおり総括できる。「Ａ型二重螺旋は、一般に、Ｃ３'−エンド（Ｎ−タイプ）ひだ（pucker）を持つ糖を含むように符号し、塩基対が螺旋の軸から約１９°傾斜し（傾く）、螺旋の軸から螺旋の端に向かって振れている。その結果、Ａ型構造ではＢ型二重螺旋よりも多い塩基−塩基オーバーラップがある。ＤＮＡのＢ型二重螺旋では、デオキシリボース糖は、一般に、Ｃ２'−エンドひだを有するが、非常に大きな立体配置的融通性を有する。Ｂ型螺旋において、塩基対は螺旋軸に垂直であり、螺旋の中央に集中する。Ａ型二重螺旋では、１回転につき１１〜１２塩基対があり、Ｂ型二重螺旋では１０.４塩基対がある。Hal l，K.B.，"NMR Ｓpectroscopy of DNA/RNA Hybrids"，Current Oppinion in Str uctural Biology 3:336-339(1993)）。そして、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的と形成したハイブリッドが極めて異なる幾何学を持つことができることが知られているので、ＤＮＡ標的で得られたデータを直接、ＲＮＡ標的へ適用できるとは誰も期待しえない。事実、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的にハイブリダイズした２'−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴマーを用いた報文はこの点を支持している（S.M．Freier et al.，"Gene Regulation of Antisense RNA and DNA"，pp.95-107，R.P．EricksonおよびJ.G．Izant編，Raven Press，L td．New York，1992）。いくつかのＤＮＡ配列は他のものよりもＡ型を好むので、ＤＮＡ標的に対しは、ヌクレオシドの糖部分についての２'−Ｏ−メチル修飾により、塩基配列によって不安定化および安定化の両方が観察されたが、ＲＮＡ標的に対しては、常に安定化が観察された。さらに、我々は、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的にハイブリダイズしたラセミ・メチルホスホネート・オリゴマーでＴmにおける著しい相違を観察した。このことは、ＤＮＡ標的でのオリゴマーの評価が、それらをmＲＮＡのアンチセンス・インヒビターとして使用しようとする場合、誤った結果を与えうることを示唆している。すなわち、１つの態様において、遺伝子発現のアンチセンス・インヒビターとして増強された能力を有するアンチセンス・オリゴマーが提供され、これは、非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合、好ましくはホスホジエステル結合の間に介在するＲp配置について増強されたメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーからなる。我々は、これらのキラリティー的に富んだＭＰオリゴマーがＲＮＡ標的配列とより強固にハイブリダイズし、同じ非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合と混合したラセミＭＰヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーと比較した場合、ＲＮＡ標的の翻訳を阻害する増強した能力も示すことを見いだした。別の態様において、本発明は、一本鎖ＲＮＡ標的配列の発現を防止または妨害する活性を有する合成オリゴマーに関し、これは、炭素原子数１〜３の低級アルキルホスホネート・ヌクレオシジル間結合および非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合と混合した炭素原子数１〜３の低級アルキルホスホネート・ヌクレオシジル間結合からなる群から選択されるホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーである。これらの混合オリゴマーは単一の非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合の間に介在するキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を持ち、ＲＮＡ標的配列と相補性のヌクレオシド塩基配列を有する。混合オリゴマーは、非ホスホネート：ホスホネート・ヌクレオシジル間結合の比率１：約１〜１：約４を有する。好ましいキラリティー的に純粋なヌクレオシジル間結合はＲp低級アルキルホスホネート結合、さらに好ましくは、Ｒpメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合を含有する。好ましい非ホスホネート結合には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミダイト（phosphoramidite）、ホスホロフルオリデート、ボラノホスフェート、ホルムアセタールおよびシリル・ヌクレオシジル間結合が包含される。特に好ましい態様によれば、ホスホジエステル結合と交互したキラリティー的に純粋なＲpメチルホスホネート結合を有する富Ｒpオリゴマーが提供される。これらの交互オリゴマーは、ＲＮＡ標的配列に対して増強した結合親和性を示すことが見いだされた。別の好ましい態様によれば、糖部分として２'−Ｏ−メチルリボシル基を有するこれらの混合オリゴマーのヌクレオシドが提供される。我々は、２'−Ｏ−メチルヌクレオシドおよびホスホジエステル結合と交互するキラリティー的に純粋なＲpメチルホスホネート結合を有する混合オリゴマーが、ＲＮＡ標的配列に対して、さらに増強した結合親和性を示すことを見いだした。我々はまた、これらの混合オリゴマーにおいて２'−Ｏ−メチルヌクレオシドとの組み合わせが、２' −デオキシヌクレオシドを有するオリゴマーと比較して、ある種のヌクレアーゼに対するオリゴマーの安定性を増強することを見いだした。さらなる態様において、本発明は、炭素原子数１〜３の低級アルキルホスホネート結合および非ホスホネート結合と混同した炭素原子数１〜３の低級アルキルホスホネート結合であって、ホスホネート結合が単一の非ホスホネート結合の間に介在しているものからなる群から選択されるキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合からなる合成オリゴマー調製物が提供され、該オリゴマーは、ＲＮＡ標的配列に対して相補性である。ここに、これらのオリゴマー調製物はＲＮＡ標的配列に対して増強された「ネット」結合親和性を示す。他の態様において、本発明は、予め定めたヌクレオシジル単位の塩基配列を有し、かつ、単一の非ホスホネート結合の間にホスホネート結合が介在する、非ホスホネート結合と混合したキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの製造法を提供するもので、該方法は、キラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する、予め定めたヌクレオシド塩基配列の個々のヌクレオシド二量体、三量体または四量体を互いにカップリングさせることからなる。さらなる態様によれば、式：［式中、Ｘは酸素または硫黄、Ｒは炭素原子数１〜３の低級アルキル、Ｂ１は不利にならない条件下で脱離できるブロック基、Ｚは水素、炭素原子数１〜１０のアルコキシ、ハロゲンまたは炭素原子数３〜６のアルケニルオキシ、Ｂは独立して選択される、所望により保護されたプリンまたはピリミジン塩基、ｎは１、２または３、Ｃpはカップリング基を意味する］で示されるキラリティー的に純粋な新規シントン（synthon）が提供される。カップリング基Ｃpは、都合よくは、もう１つ別のシントンとカップリングしが場合に所望の非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合を与えるように選択する。適当なカップリング基には、詳細な記載の項に記載したものが包含される。特に好ましい態様において、本発明は、ＲＮＡ標的配列に対して増強した結合を示す合成オリゴマーの製造法を提供する。１つの具体例において、この方法は、一本鎖標的配列を同定し、非ホスホネート結合、さらに好ましくは、ホスホジエステル結合と混合したＲp配置のメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを合成する工程を包含し、ここに、オリゴマーは同定したＲＮＡ標的配列と相補性である。ホスホジエステル結合と交互したＲp−ＭＰ結合を有するオリゴマーは、ホスホジエステル・ヌクレオシジル間結合と交互するランダム・ラセミ・メチルホスホネートを有するＲＮＡ標的配列に対して相補性のオリゴマーと比較して、ＲＮＡ標的配列に対して増強された結合を示す。特に好ましい態様によれば、本発明の合成オリゴマーは、キラリティー的に純粋はＲp 配置のメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有するヌクレオシド二量体、三量体または四量体を結合することにより合成できる。さらなる態様において、本発明は、予め定めたヌクレオシド単位の塩基配列を有し、非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合と混合した、キラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの製造法が提供され、該方法は、式：［式中、Ｘは酸素または硫黄、Ｒは炭素原子数１〜３の低級アルキル、Ｂは独立して選択される、所望により保護されたプリンまたはピリミジン塩基、Ｂ１はブロッキング基、Ｚは水素、炭素原子数１〜１０のアルコキシ、ハロゲンまたは炭素原子数３〜６のアルケニル、ｎは１、２または３、Ｃpは、他のヌクレオシドとカップリングした場合に所望の非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合を与えるように選択されるカップリング基を意味する］で示される、キラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する個々に選択したシントンを結合することからなる。定義ここで使用する以下の用語は、特に断らない限り、つぎの意味を有する。「プリン」および「プリン塩基」なる語は、天然のアデニンおよびグアニン塩基のみならず、８−位が置換された塩基、６−位で修飾されたグアニンアナログまたはアデニンアナログ、２−アミノプリン、９−デアザプリン誘導体のような９−位に窒素を置換する炭素を有するプリンのアナログおよび他のプリンアナログのごとき、これらの塩基の修飾物も包含する。「ピリミジン」または「ピリミジン塩基」なる語は、天然のシトシン、ウラシルおよびチミンのみならず、５−プロピニルウラシル、５−ヘテロアリールウラシルおよび報告されたヘテロ芳香部分のようなピリミジンのアナログのごとき、これらの塩基の修飾物も包含する。「ヌクレオシド」なる語は、ヌクレオシジル単位を包含し、それと互換的に使用し、５炭糖および窒素含有塩基からなる核酸のサブユニットをいう。この語は、それらの塩基として、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕを有するヌクレオシジル単位のみならず、シウドイソシトシン、シウドウラシルおよび他の修飾塩基（８−置換プリンのような）のごときピリミジンアナログを包含する。ＲＮＡにおいて、５炭糖はリボースであり、ＤＮＡにおいて、それは２'−デオキシリボースである。ヌクレオシドなる語にはまた、２'−Ｏ−アルキルリボースのような修飾された糖を有するものを含め、そのようなサブユニットの他のアナログも包含する。「ホスホネート」なる語は、基：［ここに、Ｘは酸素または硫黄、Ｒは水素またはアルキルもしくはアリール基を意味する］をいい、ホスホネートおよびホスホノチオエート・ヌクレオシジル間結合の種々の例を包含する。適当なアルキルまたはアリール基には、ホスホネート結合を立体的に障害しない、または相互に反応しない基を包含する。ホスホネート基は「Ｒp」または「Ｓp」配置のいずれかで存在できる。ホスホネート基は、ヌクレオシジル単位またはヌクレオシジル単位と非ヌクレオシジル・モノマー単位を連結するためのヌクレオシジル間結合として使用できる。「低級アルキルホスホネート」なる語は、Ｘが酸素で、Ｒが炭素原子数１〜３の低級アルキルである基をいう。「メチルホスホネート」は、Ｘが酸素、Ｒがメチルの基をいう。「ホスホノチオエート」なる語は、Ｘが硫黄の基をいう。「低級アルキルホスホノチオエート」なる語は、Ｘが硫黄、Ｒが炭素原子数１〜３の低級アルキルの基をいう。「メチルホスホノチオエート」なる語は、Ｒがメチルのホスホノチオエート基をいう。「ホスホジエステル」または「ジエステル」なる語は、基：をいい、ここに、ホスホジエステル基はヌクレオシジル単位を連結するためのヌクレオシジル間リン基結合に使用できる。「非ヌクレオシド・モノマー単位」は、塩基、糖および／またはリン主鎖が他の化学部分で置換されたモノマー単位をいう。「ヌクレオシド／非ヌクレオシド・ポリマー」は、ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド・モノマー単位からなるポリマーをいう。「オリゴヌクレオシド」または「オリゴマー」なる語は、ヌクレオシド間結合により連結した、一般に、約４〜約１００ヌクレオシド長の、しかし、約１００ヌクレオシド長よりも大きくてもよいヌクレオシドの鎖をいう。これらは、通常、ヌクレオシド・モノマーから合成されるが、酵素的手段によっても得ることができる。「オリゴマー」なる語は、ヌクレオシド・モノマーを連結するヌクレオシジル間結合を有するオリゴヌクレオシドの鎖をいい、オリゴヌクレオチド、ノニオン性オリゴヌクレオシド・アルキルおよびアリールホスホネート・アナログ、アルキルおよびアリールホスホノチオエート、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートアナログ、オリゴヌクレオチドのホスホルアミデート・アナログ、ホスホトリエステルのような中性ホスフェートエステル・オリゴヌクレオシド・アナログ、他のオリゴヌクレオシド・アナログおよび修飾オリゴヌクレオシドが包含され、ヌクレオシド／非ヌクレオシド・ポリマーも包含される。この語はまた、モノマー単位間の１つ以上のリン基結合が、ホルムアセタール結合、チオホルムアセタール結合、スルファメート結合、カルバメート結合、アミド結合、グアニジン結合、ニトロオキシド結合または置換ヒドラジン結合のような非リン結合によって置換されているヌクレオシド／非ヌクレオシド・ポリマーも包含する。また、モルホリノ塩基アナログまたはポリアミド塩基アナログのような糖およびリン部分の両方が置換または修飾されたヌクレオシド／非ヌクレオシド・ポリマーも包含する。また、非ヌクレオシドの塩基、糖およびホスフェート主鎖が別の非ヌクレオシド部分によって置換されているか、別の非ヌクレオシド部分がヌクレオシド／非ヌクレオシド・ポリマーに挿入されたヌクレオシド／非ヌクレオシド・ポリマーも包含する。所望により、該非ヌクレオシド部分は、標的配列と相互反応できるか、標的細胞への取り込みを変化させることのできる他の小さな分子との結合に供することができる。「中性オリゴマー」なる語は、ヌクレオシド・モノマーの間のノニオン性ヌクレオシジル間結合（すなわち、陽性および陰性のイオン荷電を持たない結合）を有するオリゴマーをいい、例えば、アルキルまたはアリールホスホネート結合、アルキルまたはアリールホスホノチオエート、ホスホトリエステル結合、特に、中性エチルトリエステル結合のような中性ホスフェートエステル結合、スルファメート、モルホリノ、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよびカルバメート結合のような非リン含有ヌクレオシジル間結合が包含される。所望により、中性オリゴマーは、オリゴヌクレオシドまたはヌクレオシド／非ヌクレオシド・ポリマーと、複合体パートナー（conjugation partner）となる第二の分子との複合体（conjugate）からなってもよい。このような複合体パートナーには、インターカレーションを起こす試薬、アルキル化剤、細胞表面受容体結合物質、親油性剤、ソラレン（psoralen）のような核酸修飾基含有光架橋剤、核酸の標的部分を開裂できる基などが包含されてよい。このような複合体パートナーは、オリゴマーの取り込み、オリゴマーと標的配列の相互反応の修飾またはオリゴマーの薬物動態学的分布の変化をさらに増強しうる。必須の要件は、オリゴマー複合体となるオリゴヌクレオシドまたはヌクレオシド／非ヌクレオシド・ポリマーが実質的に中性であることである。オリゴマーについての「実質的に中性」なる語は、ヌクレオシド・モノマー間のヌクレオシジル間結合の少なくとも約８０％がノニオン性結合であるオリゴマーをいう。「耐酸性」なる語は、デオキシリボオリゴヌクレオチドと比較して、Ｎ−グリコシル結合の加水分解による酸触媒脱プリンに対してオリゴマーが耐性であることをいう。「三重螺旋オリゴマー対」なる語は、所望により１つ以上の部位で共有的に連結し、ＲＮＡまたはＤＮＡのような一本鎖標的核酸の断片に相補性で、それと水素結合でき、したがって、一本鎖標的核酸と共に三重螺旋構造を形成できる第１および第２のオリゴマーをいう。「三本鎖オリゴマー」なる語は、ＤＮＡ二重螺旋、ＲＮＡ二重螺旋またはＤＮＡ−ＲＮＡ二重螺旋のような二本鎖核酸の断片にハイブリダイズでき、それと共に三重螺旋構造を形成できるオリゴマーをいう。「相補性」なる語は、三重螺旋オリゴマー対（または第１および第２のオリゴマー）または三本鎖オリゴマーについていう場合、その核酸の塩基配列との水素結合（および塩基ペアリングまたはハイブリダイジング）を形成または認識し、三重螺旋構造を形成できる塩基配列を有するオリゴマーについていう。「実質的に相補性」なる語は、標的配列の各ヌクレオシドに対する相補性を欠くことがありえ、安定な二重螺旋または三重螺旋複合体を形成するに十分な標的配列に対する結合親和性を有し、場合によって、それにより、標的配列を特異的に認識し、その発現を選択的に阻害またはダウンレギュレーションする三重螺旋オリゴマー対または三本鎖オリゴマーを包含するオリゴマーについていう。「トリプレット」または「３回回転軸」なる語は、標的配列の塩基（一本鎖の場合）または塩基類（二本鎖の場合）、第２鎖および第３鎖の塩基（一本鎖標的配列の場合）または第３鎖の塩基（二本鎖標的の場合）間の３つのヌクレオシドの塩基の水素結合複合体をいう。「ＭＰ（Ｒp）」は、Ｒpキラリティーのメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合をいう。「ＭＰＳ」は、メチルホスホノチオエート・ヌクレオシジル間結合をいう。「ＭＰＳ（Ｒp）」は、Ｒpキラリティーのメチルホスホノチオエート・ヌクレオシジル間結合をいう。「交互するＭＰ（Ｒp）／ＤＥヌクレオシジル間結合」を有するオリゴマーとは、Ｒpキラリティーのメチルホスホネート結合がホスホジエステル結合（ＤＥ）と交互するオリゴマーをいう。「交互するＭＰＳ（Ｒp）ヌクレオシジル間結合」を有するオリゴマーとは、Ｒpキラリティーのメチルホスホネート結合がホスホロチオエート結合（ＰＳ）と交互するオリゴマーをいう。「交互するＭＰＳ（Ｒp）／ＤＥヌクレオシジル間結合」を有するオリゴマーとは、Ｒpキラリティーのメチルホスホノチオエート結合がホスホジエステル結合と交互するオリゴマーをいう。「交互するＭＰＳ（Ｒp）／ＰＳヌクレオシジル間結合」を有するオリゴマーとは、Ｒpキラリティーのメチルホスホノチオエート結合がホスホロチオエート結合（ＰＳ）と交互するオリゴマーをいう。「ＭＰ（Ｒp）／ＤＥ二量体シントン」とは、２つのヌクレオシドが、Ｒpキラリティーのメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合で連結され、そのヌクレオシドの１つが、他のヌクレオシドの３'−ＯＨまたは５'−ＯＨとカップリングする場合、５'−または３'−カップリング基を有するか、あるいはオリゴマーがホスホジエステル・ヌクレオシジル間結合となるジヌクレオシドをいう。「ＭＰ（Ｒp）／ＰＳ二量体シントン」とは、２つのヌクレオシドが、Ｒpキラリティーのメチルホスホネート結合で連結され、そのヌクレオシドの１つが、他のヌクレオシドの３'−ＯＨまたは５'−ＯＨとカップリングする場合、５'−または３'−カップリング基を有するか、あるいはオリゴマーがホスホロチオエート・ヌクレオシジル間結合となるジヌクレオシドをいう。「ＭＰＳ（Ｒp）／ＤＥ二量体シントン」とは、２つのヌクレオシドが、Ｒpキラリティーのメチルホスホノチオエート・ヌクレオシジル間結合で連結され、そのヌクレオシドの１つが、他のヌクレオシドの３'−ＯＨまたは５'−ＯＨとカップリングする場合、５'−または３'−カップリング基を有するか、あるいはオリゴマーがホスホジエステル・ヌクレオシジル間結合となるジヌクレオシドをいう。「ＭＰ（Ｒp）／ＰＳ₂二量体シントン」とは、２つのヌクレオシドが、Ｒpキラリティーのメチルホスホネート結合で連結され、そのヌクレオシドの１つが、他のヌクレオシドの３'−ＯＨまたは５'−ＯＨとカップリングする場合、５'− または３'−カップリング基を有するか、あるいはオリゴマーがホスホロチオエート・ヌクレオシジル間結合となるジヌクレオシドをいう。「２'−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒp）／２'−Ｏ−メチルＤＥ二量体シントン」とは、２つの２'−Ｏ−ヌクレオシドが、Ｒpキラリティーのメチルホスホネート結合で連結され、そのヌクレオシドの１つが、他のヌクレオシドの３'−ＯＨまたは５'−ＯＨとカップリングする場合、５'−または３'−カップリング基を有するか、あるいはオリゴマーがホスホジエステル・ヌクレオシジル間結合となるジヌクレオシドをいう。発明の詳細な記載本発明のオリゴマーで用いるホスホネート・ヌクレオシジル間結合は、ホスホジエステル・ヌクレオシジル間結合のリンのところの２つの非結合（または非架橋）酸素の１つを置換するアルキル基を含み、他の非結合酸素はそのままか、硫黄と置換されている。低級アルキルによる酸素の置換は、どちらの非結合酸素が低級アルキルで置換されるかによって、リンの周囲で、ＲpまたはＳpと称することのできるキラル雰囲気を作りだす。ＲpおよびＳp配置は、つぎのように表すことができる。ここに、Ｘは酸素または硫黄、Ｒは低級アルキルである。非ホスホネート結合と混合したホスホネート結合を有する混合オリゴマーは、各ホスホネート結合のところで、ＲpまたはＳpキラリティーのいずれかを持つことができるので、理論的には、オリゴマーは、２ⁿ個の異なるジアステレオマー形を持つことができる。ここに、ｎは、オリゴマー中のホスホネート・ヌクレオシジル間結合の数である。例えば、理論的には、１０個のホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーは、１,０２４個のジアステレオマーを有し、１８個のホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーは、２６２ ,１４４個のジアステレオマーを有する。非ホスホネート結合と混合したキラリティー的に純粋なホスホネート結合を持つオリゴマーを提供することにより、個々のオリゴマーについてのジアステレオマーの数が減少する。すなわち、１つの態様において、本発明は非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合と混合したキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を持つオリゴマーの合成法に関し、特に好ましい態様では、オリゴマーは、非ホスホネート結合と混合したキラリティー的に純粋なＲp配置のメチルホスホネート結合を持つ。１つの好ましい合成法により、二量体の２つのヌクレオシジル単位を連結するホスホネート結合を有するヌクレオシド二量体が製造され、それらのＲpおよびＳp異性体に分離される。ホスホネート結合のところのキラリティーが明らかな得られた二量体は、ついで、自動ＤＮＡシンセサイザーを用いてそれらが一緒にカップリングできるように誘導体化される（実施例１〜４参照）。二量体はカップリング基を有してもよく、それは二量体間の種々のヌクレオシジル結合の１つとなる。１６の二量体のストックから、適当な二量体を一緒に連結することにより、いずれのヌクレオシド塩基配列を有するオリゴマーも合成できる。所望の数のヌクレオシドを有するオリゴマーが得られるまで、二量体を、成長するオリゴマー鎖に付加させる。得られたオリゴマーは、１つおきのヌクレオシジル間結合（すなわち、カップリングさせた二量体単位のもともとの結合から由来するもの）のキラリティーが明らかである。残りのヌクレオシジル間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、モルホリノ、ホスホルアミダイト、ホスホロフルオリデート、ボラノホスフェート、ホルムアセタール、シリルまたはその他の非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合のような非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合である。実施例１９〜２２は、キラリティー的に純粋な２'−Ｏ−Ｍe二量体の合成に関する化学の好ましい態様を説明するためのものである。２つの二量体の製造を実施例１９および２０で検討し、５'または３'ホスホルアミダイト・モノマーのいずれかを通じて、Ｐ（ＩＩＩ）カップリングの化学を示す。これらの２つの実施例はまた、クメンヒドロパーオキシドまたはカンファースルホニルオキサジリジンを用いて、ヌクレオチド間メチルホスホルアミダイト結合を酸化（ｗ／保持）し、所望のメチルホスホネート結合を与える能力も示している。いずれの試薬も使用できるが、クメンヒドロパーオキシドのような取扱および貯蔵の問題がないので、カンファースルホニルオキサジリジンを使用することが好ましい。実施例２１は、２'−Ｏ−ＣＨ₃グアノシン５'−ＯＨの合成を記載しており、他の３つの５'−ＯＨヌクレオシドに適用できる一般的な方法である。実施例２２は、２' −Ｏ−ＣＨ₃ＵＣ二量体のβ−シアノエチル（ＣＥ）ホスホルアミダイトトによるホスフィチル化を記載する。別法として、三量体および四量体のようなヌクレオシドのより大きなブロックをカップリングさせてキラリティーに富むオリゴマーを得ることができる。２つのキラリティー的に純粋なヌクレオシジル間結合を有する三量体は、適当なキラリティー的に純粋な二量体シントンと、他の１つのヌクレオシドとをカップリングさせ、例えば、Ｒpキラリティーを選択する場合は、得られたＲp−ＲpおよびＲp−Ｓp三量体を分離することにより得ることができる。得られた三量体は、両方のヌクレオシジル間結合におけるキラリティーが明らかである（すなわち、キラリティー的に純粋）。ついで、三量体を、自動ＤＮＡシンセサイザーを用いてそれらが一緒にカップリングできるように誘導体化して三量体シントンを得る。三量体シントンは、それらが一緒にカップリングしてキラリティー的に富んだホスホネート・オリゴマーを与えることのできるカップリング基を有する。（実施例２３および２４参照）。６４の三量体のストックから、適当な三量体を一緒に連結することにより、いずれのヌクレオシド塩基配列を有するオリゴマーも合成できる。所望の数のヌクレオシドを有するオリゴマーが得られるまで、三量体を、順次、成長するオリゴマー鎖に付加させるか、あるいは、別法として、ヌクレオシド・モノマー、二量体および／または三量体とカップリングさせることができる。得られたオリゴマーにおいては、カップリングさせた二量体、三量体または四量体のもともとの結合から由来するヌクレオシジル間結合でのキラリティーが明らかである。すなわち、これらの三量体の使用は、３つのヌクレオシジル間結合ごとに約２つが明らかなキラリティーを有するホスホネート結合を持つオリゴマーを与える。同様な技術に従い、３つのキラリティー的に純粋なヌクレオシジル間結合を有する四量体を製造し、互いにカップリングさせてオリゴマーが得られる。別法として、二量体、三量体およびキラリティーの明らかな（純Ｒpのような）ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを適当な順序で一緒にカップリングさせ、特に所望の配列および長さを有するオリゴマーが得られる。別合成法によれば、所望のキラリティー配置の収率を増加させるカップリングを行うような、ヌクレオシド・シントン（または二量体）のカップリング条件が用いられる。この方法は、個々のヌクレオシド・シントンあるいはキラリティー的に純粋な二量体をカップリングさせるために使用でき、ホスホネート・ヌクレオシジル間結合の各々において所望のキラリティー配置に富んだオリゴマーが得られる。実施例およびこの詳細な記載で教示するキラリティー的に純粋なメチルホスホネート二量体および三量体は種々の異なる方法で一緒にカップリングでき、つぎの非限定的なタイプのヌクレオシジル間結合：ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロフルオリデート、ボラノホスフフェート、ホルムアセタールおよびシリルを形成する。ヌクレオシジル・ホスホジエステル結合は、キラリティー的に純粋な二量体または三量体の３'−ＯＨを、ホスホトリエステル・シントン（Reese，C.B.（1978 ）Tetrahedron 34，3142-3179）、ホスホルアミダイト・シントン（Besucage，S .L．およびLayer，R.P.（1992）Tetrahedron 48，2223-2311）、Ｈ−ホスホネート・シントン（Froehler，B.C．et al．編、Protocols for Oligonucleotides a nd Analogs，Synthesis and Properties，Methods in Molecular Biology Vol． 20，ｐ63-80 Humana Press(1993)）またはホスホロモノクロリダイト試薬（Hogr efe，R.I.（1987）Dissertation，Northwestan University）のいずれかに変換することにより得ることができる。ヌクレオシジル間ホスホロチオエート結合は、キラリティー的に純粋な二量体または三量体の３'−ＯＨを、ホスホトリエステル・シントン（Stec，W.J．et a l.,(1991)Nucl．Acids Res．19，5883-5888)）、ホスホルアミダイト・シントン（Lyer，R.P．et al.（1990）JACS 112，1254-1255）、Ｈ−ホスホネート・シントン（Seela F．et al.，J．Org．Chem．56，3861-3869）またはホスホロモノクロリダイト試薬（Hogrefe，R.I.（1987）Dissertation，Northwestan Universit y）のいずれかに変換することにより得ることができる。ヌクレオシジル間ホスホロジチオエート結合は、本明細書の実施例および米国特許５,２１８,０８８号(Gorenstein et al.)のごとくして製造できる。ヌクレオシジル間ホスホトリエステル結合は、キラリティー的に純粋な二量体または三量体の３'−ＯＨを、ホスホトリエステル・シントン（Reese，C.B.（1978）Tetr ahedron 34，3142-3179）、ホスホルアミダイト・シントン（Besucage，S.L．およびLayer，R.P.（1992）Tetrahedron 48，2223-2311）、Ｈ−ホスホネート・シントン（Froehler，B.C．et al．編、Protocols for Oligonucleotides and Ana logs，Synthesis and Properties，Methods in Molecular Biology Vol．20，p6 3-80 Humana Press(1993)）、ホスホロモノクロリダイト試薬（Hogrefe，R.I.（ 1987）Dissertation，Northwestan University）のいずれかに変換すること、または後合成（米国特許５,０２３,２４３号(Tullis)）により得ることができる。ヌクレオシジル間ホスホルアミデート、ホスホロフロリデート、ボラノホスフフェート、ホルムアセタールおよびシリル結合は、キラリティー的に純粋な二量体または三量体の３'−ＯＨを、適当なシントンに変換することにより得ることができる。（これらの各々についてのシントンを得るためにProtocols for Olig onucleotides and Analogs，Synthesis and Properties，Methods in Molecular Biology Vol．20，p 63-80 Humana Press(1993)参照）。有用性および投与ここで提供されるオリゴマーは、高度の選択性で、核酸のような標的配列と高親和性複合体を形成することができる。また、誘導体化オリゴマーは、核酸の標的部位と結合し、一方または両方の鎖の架橋（ソレラン）または開裂（ＥＤＴＡ）により不可逆的に修飾するのに使用できる。開裂のための標的部位を注意して選択することにより、鎖の１つは、選択した核酸配列を特異的に開裂するための分子ハサミとしてに使用できる。別に、本発明のオリゴマーはＲＮアーゼＨ活性化配列を含むことができる。本発明の１つの態様によれば、これらのアンチセンス・オリゴマーは、選択した標的遺伝子から転写されたＲＮＡの一部と相補性の配列を有する。阻害の正確な分子メカニズムは確実には決められていないが、アンチセンス・オリゴマーおよび標的遺伝子から転写されたＲＮＡの間の二重螺旋形成によるものと示唆されている。形成した二重螺旋は、mＲＮＡ配列の翻訳、プロセッシングおよび輸送を阻害できる。本発明のもう一つ別の態様によれば、選択したＲＮＡ標的配列の発現および翻訳の妨害または防止は、オリゴマーが、ＲＮＡ標的配列と相補性であり、三重螺旋複合体を形成し、それによって標的核酸配列の発現を妨害または防止するように選択した配列を有する三重螺旋オリゴマー対として本発明のオリゴマーを用いて三重螺旋を形成させることにより行える。かかる三本鎖形成はいくつかの方法で行うことができる。基本的には、２つの別々または連結したオリゴマーが、一本鎖ＲＮＡと三本鎖を形成できる。一般に、用いるオリゴマーは、標的核酸の配列と相補性の配列を有する。しかし、絶対的な相補性は必要でなく、一般に、標的核酸と安定な二重螺旋（または、場合により、三重螺旋複合体）を形成するに十分な相補性を有するいずれものオリゴマーが適当であると考えられる。安定な二重螺旋形成は、ハイブリダイズするオリゴマーの配列と長さおよびアンチセンス・オリゴマーと標的配列の間の相補性の程度に依存するから、より長いオリゴマーを用いる場合、系は少ない忠実度（相補性）に耐えることができる。これはまた、三重螺旋複合体を形成するオリゴマーでも同様である。しかし、生理学的条件の下、約４０℃以上の融点を有する二重螺旋または三重螺旋構造を形成するに十分な相補性を有する、約８〜約４０ヌクレオシジル単位長のオリゴマーが、本発明の方法に従って、特に好適に使用される。一本鎖標的配列に関し、我々は、メチルホスホネート結合を有するメチルホスホネート・オリゴマーの２つの鎖（第２および第３鎖）および相補性合成ＲＮＡオリゴマーの１つの鎖（第１鎖）が、三重螺旋複合体を形成できることを見いだした。これらの実験によれば、２つのメチルホスホネート鎖が、平行に配向して結合する。実験は、「古典的」な三重螺旋テーマのいずれによっても三重螺旋複合体を形成しえないであろうとされていた、ＡおよびＧヌクレオシドのランダム配列のメチルホスホネート・オリゴマーとの三重螺旋形成を記録した。標的一本鎖ＲＮＡと２つのメチルホスホネート・オリゴマーとの結合により形成したこれらの三重螺旋複合体は、高い親和性（Ｔm＞５０℃）を示す。これら三重螺旋複合体の形成は、マイクロモル濃度以下で翻訳を劇的に阻害することが証明された。三重螺旋複合体は、天然の塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）を用いて形成できる。別に、安定性を増加させることを所望の場合、２−アミノＡ（Ａについて）または５−メチルＣのようなある種の安定化塩基を対応する天然の塩基の代わりに使用できる。これらの塩基は、他の塩基との水素結合相互反応および積み重ね相互反応を増加させることにより、三重螺旋複合体の安定性を増加させることができる。安定性の増加は、効力を増加させる親和性定数の増加をもたらすことができる。ここで提供されるオリゴマーは、核酸断片またはその標的配列と反応して、不可逆的に核酸を修飾、分解または破壊し、不可逆的にその機能を阻害することのできる核酸反応または修飾基を取り込むように誘導体化できる。これらのオリゴマーは、生細胞中の個々の遺伝子またはその標的配列の発現を不活性化、阻害または変更し、発現の選択的不活性化、阻害または変更を可能にすることができうる。標的配列は、ＤＮＡまたは、プレ−mＲＮＡまたはmＲＮＡのようなＲＮＡでよい。mＲＮＡ標的配列は、開始コドン領域、コード領域、ポリアデニレーション領域、mＲＮＡキャップ部位またはスプライス部位を含む。これらのオリゴマーはまた、欠陥または望ましくない生成物を生成するか、活性化されると、望ましくない影響を起こす遺伝子の永久的な不活性化、消滅または破壊にも使用できる。ここで提供するオリゴマーは、核酸の転写領域と安定に会合した二重螺旋または三重螺旋複合体を形成することができるので、これらの複合体は「アンチセンス」または三本鎖療法に有用である。ここで用いる「アンチセンス」療法は、イン・ビトロまたはイン・ビボにおける望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡ配列の不活性化のための特異結合オリゴマーの使用を包含する総合的な用語である。多くの疾病およびその他の症状は、望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡの存在によって特徴付けられ、ある例では、これらは一本鎖であり、他の例では、二本鎖でありうる。これらの疾病および症状は、当該技術分野で一般的に理解されているようなアンチセンス療法の原理を用いて治療できる。アンチセンス療法は、相補性または他のいずれかの特異結合手段、本発明の場合は、二重螺旋または三重螺旋複合体の形成を介して、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列を標的とすることを包含する。本発明で用いるオリゴマーは、単一で投与してもよく、また、隣接または離れた複数の標的用に、または上記の一般的メカニズムによる複合したアンチセンス・メカニズム用に、オリゴマーを組み合わせて投与してもよい。治療用には、オリゴマーは、経口、局所または外用投与を包含する種々の投与様式用に処方できる。その製造過程で酸性条件と接しうる場合または、適用部位の状態、例えば、皮膚の酸性上皮（mantle）と適応するため処方自体をある程度酸性とする場合、耐酸性オリゴマーを含有する医薬処方が有利でありうる。一般的な製剤の技術および処方は、Remington's Pharmaceutical Scienses，Mack Pu blishingに記載されている。オリゴマー活性成分は、一般に、投与様式および投与形態に従って、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、浸蝕性（erodible）ポリマーまたは滑剤を含んでもよい希釈剤または賦形剤のような担体と組み合わされる。典型的な投与形態には、錠剤、粉末、懸濁液、乳液および溶液を含む液体調製剤、顆粒およびカプセルが包含される。本発明のある種のオリゴマーは、通常の薬物デリバリー条件では約４時間まで、また、徐放性形態のデリバリーでは約１２時間まで、胃の中で酸性条件に曝す必要のありうる経口投与に特に適している。ある種の病状の治療には、これらのオリゴマーを徐放性形態に処方することが有利である。米国特許４,８３９,１７７号(Colombo et al.)は、ある種の好ましい徐放性系を記載している。経口投与用に、これらのオリゴマーは、２'−Ｏ−アルキル・ヌクレオシジル単位を有し、これらのオリゴマーは、カプセル、錠剤および液体のような通常および遅放性の経口形態に処方される。皮膚は酸性の上皮を有し、耐酸性のオリゴマーを含む処方が有利であることが証明できるので、２'−Ｏ−アルキル・ヌクレオシジル単位を有するオリゴマーが局所投与用に特に適している。これはまた、中性オリゴマーが皮膚および粘膜を横切るという知見に照らしても有利である。また、耐酸性中性オリゴマーを使用する場合に、酸性媒体（media）を含む処方を提供することも望ましい。局所投与には、本発明で用いるオリゴマーは、当該分野で一般に知られているごとく、軟膏、膏薬（salve）、点眼剤、ゲルまたはクリームに処方される。全身的投与も、経粘膜または経皮手段によって行うことができ、また、化合物を経口投与できる。経粘膜または経皮投与には、浸透すべき障壁に適した浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は、一般に当該分野で知られており、例えば、経粘膜には、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が包含される。また、浸透を容易にするために崩壊剤を使用できる。経粘膜投与は、鼻スプレーの使用や、例えば、吸入または坐剤による投与に適した処方でできる。以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは、本発明を限定するものではなく、当業者の理解範囲内の、現在および将来の発展に基づくいずれの本発明の変形も、本発明の範囲内である。実施例実施例１ＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥ二量体シントンの調製Ａ．液相化学を用いるキラリティー的に純粋なメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する（ＣＴ）二量体の調製２リットル・ロータリーエバポレーター・フラスコに３’−ｔ−ブチルメチルシリルチジン（１０．０ｇ、２８ｍＭ）および５’−ジメトキシトリチル−Ｎ⁴ −イソブチル−３’−メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト−２’−デオキシシトシン（２６．１ｇ、３５ｍＭ）を入れた。固形物をアセトニトリル（５００ｍｌ）に溶解し真空下で蒸発乾固した。この操作をさらに１回アセトニトリル（５００ｍｌ）を用いて繰り返し、ついで、フラスコをアルゴン下で解放し、ラバー・セプタ（rubber septa）で密栓した。この乾燥固形泡をついで、手で撹拌しながらアセトニトリル（ＡＣＮ、５００ｍｌ）に溶かし、テトラゾール（４０４ｍｌ、１８０ｍＭ、ＴＨＦ中０．４５Ｍテトラゾール）で一度に処理した。手の撹拌を３０秒続けた後、フラスコをさらに２．５時間放置し、その後、反応混合物を酸化剤溶液（２７５ｍｌ、Ｉ₂／Ｈ₂ Ｏ／ルチジン／ＴＨＦ、２５ｇ／２．５ｍｌ／１００ｍｌ／９００ｍｌ）で一度に処理した。溶液を手で撹拌し、室温で１５分間放置した。得られた暗琥珀色の溶液を重亜硫酸塩（２ｇ／２５ｍｌ／Ｈ₂Ｏ）で処理した。添加すると、それが過剰のヨウ化物と反応するので、溶液は薄い琥珀色に変わった。ついで、反応混合物を粘稠油状に濃縮し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、５００ｍｌ）に取り、飽和重炭酸塩ナトリウム（２×５００ｍｌ）および水（２×２５０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、淡色の固形の泡に濃縮した。さらに乾燥しで粗製の二量体（３５ｇ）を得た。この粗製の二量体を、５０％アセトニトリルおよび０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ、ｐＨ〜７．０）から開始し、リニア・グラディエントで１００％アセトニトリルまで増加させるプログラム（ＡＣＮＭＥＴＨ）でＨＰＬＣ（逆相、Waters Ｃ18 bondapak）に付した。２つの主ピークに分離され、１つは４．５分のところで、残留ルチジンであり、他は１４．５分のところで、ＲｐおよびＳｐジアステレオマーの混合物である。粗製の生成物（５ｍｇ）を取り、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液）と共にアセトニトリル（１．５ｍｌ）に溶解し、ＲｐとＳｐの割合を定量した。室温で１０分間放置した後、試料をＨＰＬＣに付した。２つの新しいピークが、６．５分および７．１分のところに見られ、後の溶出ピークは消滅した。Ｓｐジアステレオマーと考えられる第１の新しいピークは、２つのピークについての規格化値の６６％（２／１）を示した。粗生成物はまた、５％メタノール加７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（「７５／２５」）中、ＴＬＣ（通常のシリカプレート）分析に付した。ＴＬＣは、Ｒｆが０．４５および０．６４の２つのスポットを示した。早く移動する生成物（Ｒｐ形と考えられる）が遅く移動するものより、強度が少なかった。Ｒｐジアステレオマーは、７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中の、メタノール段階グラディエントを用いる正常相シリカ上で分離された。７．５ｃｍ×６０ｃｍカラムに、シリカ（７００ｇ、最初に２．５リットルのニート（neat）７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中で撹拌した）を充填した。粗二量体を７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（７５ｍｌ）に溶解いし、カラムに載せた。カラムを１％メタノールで開始し、２％そして最後に、Ｒｐ二量体が溶出し始めたら３％に増加した。Ｒｐ二量体は、溶出液中に３％メタノールを維持している間、数床容量にわたって汚れなく溶出した。Ｓｐ二量体は後で３０％メタノールにより溶出した。Ｒｐ二量体の収量は１１．０ｇ、Ｓｐの収量は１７．８ｇであった。Ｒｐ二量体についてＨＰＬＣ分析（ＡＣＮＭＥＴＨ）をしたところ、１４．５分のところに１つのピークが見られた。この生成物のＴＬＣ（７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂、５％メタノール）はＲｆ０．５５の単一のスポットを示し、エタノール中１０％硫酸で処理し、加熱するとトリチルおよび糖の両方が陽性であった。新たに分離したＲｐ二量体（１１．０ｇ、０．０１１Ｍ）をＡＣＮ（１１０ｍｌ）に溶解し、室温で、ＴＢＡＦ（２２ｍｌ、０．０２２Ｍ、ＴＨＦ中１Ｍ）にて一度に処理した。反応混合物を室温で一夜放置した。翌朝、ＴＬＣ（１０％メタノール、７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）で反応の完了を確認した。出発物質は検出されなかったが、少量の５’−ＤＭＴ−ｄＴが観察され、これは、正常相シリカ上で二量体の３’−ＯＨよりもかなり速く移動した。反応混合物をロータリーエバポレーター上で粘稠油状に濃縮し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２００ｍｌ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム（２×１００ｍｌ）および水（２×１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、淡黄色固体の泡に濃縮し、シリカ（１００ｇ、５％メタノール、７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）で精製した。５’−ＤＭＴ−ｄＴを除去したが、１３．５分（ＨＰＬＣ、ＡＣＮＭＥＴＨ）のところに不純物が検出された。これは、はじめ、未反応出発物質（ｔ−ＢＤＭＳ等）と考えられたが、さらなるＴＢＡＦとの処理により、これは問題でないことが判明した。シリカ（１００ｇ）および同じ溶離液を用いる第２のカラムを行い、同様なフラクションを採取した。カラムは成功裏に２つのスポットを分離した。純ＣＴ−Ｒｐ二量体フラクションをプールし、濃縮して、ほぼ白色の固形の泡（５．５ｇ）を得た。Ｂ．キラリティー的に純粋な（ＣＴ）ＭＰ／ＤＥ二量体シントンの調製１００ｍｌ丸底フラスコにＣＴ−３’−ＯＨ二量体（０．５ｇ、０．５５ｍＭ、実施例１Ａの生成物）を入れ、ピリジン（３×２０ｍｌ）と共蒸発させて無水にした。アルゴン下で、フラスコを真空系から外し、ラバー・セプタで密栓した。化合物をアセトニトリル（１０ｍｌ）に再溶解し、ＴＥＡ（２００μｌ、２．５ｅｑ）を加えた。得られた混合物に、手で撹拌しながら室温で、２’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２００μｌ、０．９０ｍＭ、１．６ｅｑ）を一度に加えた。逆相ＨＰＬＣで分析する前に反応混合物を室温に放置した。ＨＰＬＣ（Beckman System Gold、Ｃ１８ bondapack、ＡＣＮ法、溶液Ａは水中、５０／５０ＡＣＮ／０．１ＭＴＥＡＡ、ｐＨ７．０、溶液ＢはＡＣＮ。０〜１００％溶液Ｂのグラディエントを１ｍｌ／分の速度で２５分間行った）は出発物質の完全な変換を示し、粗製物の純度は９０％以上であった。このホスホルアミダイトのジアステレオマーは分離しなかった。反応混合物を真空下で淡黄色固体の泡に濃縮した。直に、この泡を、２％ＴＥＡと共に酢酸エチル／アセトニトリル／塩化メチレン５／１／５で平衡させた通常のフレッシュ・グレードのシリカ（２０ｇ）上でクロマトグラフィーに付して精製し、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９９．３％の灰白色固形の標記生成物を得た（０．５ｇ、収率８２％）。実施例２２’−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒｐ）／２’−Ｏ−メチルＤＥ二量体シントンの調製Ａ．２’−Ｏ−メチルＣモノマー２’−Ｏ−メチルシチジン（５．０ｇ、８ｍＭ）をピリジン（３×２５ｍｌ）と共蒸発させて無水にし、アセトニトリル（５０ｍｌ）に溶解した。この溶液をトリメチルアミン（ＴＥＡ、１．６５ｍｌ、１２ｍＭ、１．５ｅｑ）で処理し、氷浴中で冷却した。この溶液を、２分間を要して、クロロメチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン（Ｃｌ−ＭＡＰ、１．６５ｍｌ）を滴下して処理した。氷浴を外し、反応混合物を２時間撹拌した。反応混合物（ＨＰＬＣにて反応の完了を確認）を濃縮乾固した。残渣を、４％ＴＥＡを含む酢酸エチル／ヘプタン（１：１、２０ｍｌ）に溶解し、同じ溶媒系で平衡したシリカゲル（４０ｇ）に載せた。カラムから溶出する全てのＵＶ吸収溶出液を集め、プールし、濃縮して標記の生成物を得た（５．５ｇ、収率約９０％）。Ｂ．シリル−保護２’−Ｏ−メチルウリジン２５０ｍｌ丸底フラスコに、５’−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メチルウリジン（５．０ｇ、９．０ｍＭ）を入れ、ジメチルホルアミド（ＤＭＦ、３×２５ｍｌ）と共蒸発させて無水にした。得られた乾燥した泡をＤＭＦ（５０ｍｌ）に取り、イミダゾール（２．４ｇ、３５ｍＭ、３．９ｅｑ）で一度に処理し、ついで、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（３．０ｍｌ、１２ｍＭ、１．３ｅｑ）を滴下した。反応混合物を室温で一夜撹拌した。反応の進行をＨＰＬＣ（ＡＣＮ法）および塩化メチレン中５％メタノールを用いる薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でチェックし、完了していることを確認した（出発物質なし）。反応混合物を氷水に注ぎ、塩化メチレンに取り、水性重炭酸ナトリウムおよび水で数回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、ＴＬＣ上で単一のスポットを与える固体の泡（７．２ｇ）を得た。この固体の泡を塩化メチレン（７０ｍｌ）に溶解し、塩化メチレン／メタノール（２：１）中、２重量％のベンゼンスルホン酸（７０ｍｌ）で一度に処理した。室温で１５分間撹拌した後、ＴＥＡ（１０ｍｌ）で反応混合物をクエンチした。得られた脱トリチル化化合物を粘稠な琥珀色油状に蒸発させ、ニート塩化メチレンで平衡したシリカゲル（１５０ｇ）上に載せた。生成物を、２％メタノール（塩化メチレン中）を用いてカラムから溶出させた。乾燥後、標記の生成物を得た（３．５１ｇ、収率約８０％）。Ｃ．２’−Ｏ−メチル（ＣＵ）二量体の調製シリル−保護２’−Ｏ−メチルウリジン・モノマー（実施例２Ｂの生成物、３．０ｇ、６ｍＭ）を無水ＡＣＮ（３０ｍｌ）中に取った。別に、２’−Ｏ−メチルシチジンアミダイト・モノマー（実施例２Ａの生成物、５．５ｇ、７ｍＭ、１．２ｅｑ）をＡＣＮ（５５ｍｌ）中に取った。両方の溶液を、３Åモレキュラー・シーブ上に室温で一夜放置した。２つの溶液を注意して１つのフラスコにデカントし、テトラゾール（ＡＣＮ中０．４５Ｍ、４２ｍＭ、７ｅｑ、９４ｍｌ）で処理した。得られた反応生成物を４分間撹拌し、クメンヒドロパーオキシド（１．５ｍｌ、１．２ｅｑ）を加えて酸化した。反応混合液を、濃縮乾固し、ついで塩化メチレンに取り、水性重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して固体の泡（７．５ｇ）を得た。ＨＰＬＣによるピーク下の面積を比較して測定したジアステレオマー比はＳｐ：Ｒｐ５７／４３であった。Ｒｐジアステレオマーを、２つのシリカ・カラム（シリカ：粗生成物１００：１、３：１酢酸エチル／塩化メチレン中で平衡させ、１〜５％に増加するメタノール・グラディエントと共に）を用いるカラムクロマトグラフィーにより分離し、純Ｒｐ二量体（合計１．０７ｇ）を単離した。Ｄ．２’−Ｏ−メチル（ＣＵ）二量体の脱保護２’−Ｏ−メチルＣＵ二量体（実施例２Ｃの生成物、１．０７ｇ、０．９０ｍＭ）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解し、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ、１．５ｍｌ、１．５ｅｑ）で一度に処理した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、ＨＰＬＣによりシリル基の脱保護が完了したことを確認した。反応混合物を濃縮し、濃縮物を、シリカゲル（１０ｇ）から、５％メタノールを含む酢酸エチル／塩化メチレン（３：１）で溶出して精製した。汚れのないフラクションを濃縮し、標記の純５’−ＯＨ二量体（５５０ｍｇ）を得た。Ｅ．キラリティー的に純粋な２’−Ｏ−メチルＭＰ２’−Ｏ−メチル／ＤＥ二量体の調製２’−Ｏ−メチルＣＵ３’−ＯＨ二量体（実施例２Ｄの生成物、２３０ｍｇ）をＡＣＮ（２×５ｍｌ）中で共蒸発して無水にした。得られた乾燥泡をＡＣＮ（２．５ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（ＴＥＡ、７３μｌ、２．５ｅｑ）および２’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（ βＣＮＥ、９４μ、２．０ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、ＨＰＬＣ分析で反応の完了を確認した。反応混合物を溶離液（４％ＴＥＡ含有３／１／１酢酸エチル／アセトニトリル／塩化メチレン）に溶解し、同じ溶媒で平衡したシリカゲル（２ｇ）に載せた。カラムを、１％ＴＥＡ含有３／１／１酢酸エチル／アセトニトリル／塩化メチレンを用いて溶出した。汚れのないフラクション３〜２５を濃縮し、アセトニトリルに再溶解し、再び濃縮して固形の泡とした。この泡を十分な真空下で一夜乾燥し、標記の生成物（２００ｍｇ）を得た。実施例３２’−Ｏ−メチルＭＰＳ（Ｒｐ）／２’−Ｏ−メチルＤＥ二量体シントンの調製実施例２に記載の方法に従い、ただし、Ｃ項において、クメンヒドロキシパーオキシドの代わりに当量の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１ −オキシド（Beaucage試薬）を使用してこれらの二量体シントンを得る。実施例４ＭＰＳ（Ｒｐ）／ＤＥ二量体シントンの調製実施例１の方法に従い、ただし、Ａ項において、酸化剤溶液（Ｉ₂／Ｈ₂Ｏ／ルチジン／ＴＨＦ）の代わりに３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−オキシド（Beaucage試薬）を使用してこれらの二量体シントンを得る。実施例５ＭＰ（Ｒｐ）／ＰＳ₂二量体シントンの調製ＭＰ（Ｒｐ）／ＰＳ₂（ホスホロジチオエート）二量体シントンは、つぎのようにして調製する。遊離の３’−ＯＨを持つ異性体的に純粋なＲｐジヌクレオシドを実施例１Ａに記載の方法に従って調製する。このジヌクレオシドを、Plottら(Tetrahedron 47:2449-61(1991))または米国特許５,２１８,０８８号(Gorenstein et al.)に記載の操作を用いて対応するチオホスホルアミダイトに変換する。このジヌクレオシドを無水ピリジンと３回、ついでトルエンと３回共蒸発させる。このジヌクレオシドの一部（１０ｍＭ）を無水ジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解し、０℃にて撹拌しながら、３当量の無水ジイソプロピルエチルアミン、ついで１．５当量のクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノチオメトキシホスフィンを加える。反応が完了するまでＴＬＣでモニターする。実施例１Ｂの操作を用いて生成物を仕上処理し、生成して、ＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥホスホルアミダイトを単離する。実施例６ＭＰＳ（Ｒｐ）／ＰＳ₂二量体シントンの調製ＭＰＳ（Ｒｐ）／ＰＳ₂二量体シントンはつぎのようにして調製する。実施例４の方法に従い、遊離の３’−ＯＨを持つ異性体的に純粋なジヌクレオシドを調製する。このジヌクレオシドを用い、実施例５の方法により、該二量体シントンを調製する。実施例７ＭＰＳ（Ｒｐ）／２’−Ｏ−メチルＤＥ二量体シントン実施例１および３と同様な方法を用い、ただし、適当な保護２’−デオキシヌクレオシドおよび保護２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを用いてＭＰＳ（Ｒｐ）／２’−Ｏ−メチルＤＥ二量体シントンを得る。実施例８交互するＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの調製実施例１の方法に従い、ＣＴＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥ二量体シントンを用い、５ ’−（ＣＴ）−（ＣＴ）−（ＣＴ）−（ＣＴ）−（ＣＴ）−（ＣＴ）−（ＣＴ）−Ａ−３’（配列番号１）を調製した。グループ別けしたジヌクレオシドはＭＰ結合を示し、その立体化学をシリカゲルで速く溶出する異性体（推定Ｒｐ）として固定し、アスタリスクはキラリティー的に純粋な結合を示す。手動カップリングを用いてオリゴマーを合成して、試薬を保存したが、この方法は自動ＤＮＡシンセサイザーでも行うことができる。配列は、メタクリレート担体結合デオキシアデノシンを用い、３’−末端から合成を開始した。ピリジンおよびトルエンと新たに共蒸発させて乾燥させた保護ジヌクレオシドメチルホスホノアミダイト（必要なカップリング当たり、２２ｍｇ）を乾燥１ｍｌカラス・オートサンプラー・バイアルに入れ、無水アセトニトリルに溶解して０．１Ｍの濃度（カップリング当たり２００μｌ）にした。容器をアルゴンでパージし、テフロン・セプタとネジキャップで密栓した。１マイクロモル・スケールのＤＮＡ合成カラム（Milligen）に１マイクロモルのメタクリレート担体結合デオキシアデノシンを充填した。カラムを垂直にリングスタンドに取り付けた。雄雌ルアー・フィッティングを１８ゲージ針と共に底部に取り付け、溶出を調節した。シリンジを用いてカラムをアセトニトリル（１０ｍｌ）で洗浄した。ジクロロメタン中、２％ジクロロ酢酸（３ｍｌ）を１．５分を要してカラムに通し、該担体に結合したヌクレオシドを脱トリチル化した。オレンジ色のジメトキシトリチルカチオンを含有する溶液を保存した。カラムを無水アセトニトリル（各１０ｍｌ）で２回洗浄した。最初のカップリングはつぎのように行った。さらに乾燥したアセトニトリル（１０ｍｌ）をカラムに通した。ついで、ＣＴメチルホスホノアミダイト（２００ μｌ）を１ｍｌシリンジに取った。同様に、無水アセトニトリル中０．４５Ｍテトラゾール（２００μｌ）を、メチルホスホノアミダイト含有シリンジに取った。シリンジ内で試薬を速やかに混合し、３分間を要して、ゆっくりとカラムに滴下した。プランジャーを少し上げ下げしながら、担体との適当な混合を確保した。３分後、酸化剤（１ｍｌ、７３％テトラヒドロフラン、２５％２，６−ルチジンおよび２％水中０．１ＭＩ₂）を１分間でカラムに通した。カラムをアセトニトリル（２０ｍｌ）で洗浄し、２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸、３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、５０％（ｖ／ｖ）ピリジンおよび０．３１２％（ｖ／ｖ）ジメチルアミノピリジンを含有する溶液（６００μｌ）で処理した。ついで、カラムをアセトニトリル（２０ｍｌ）で洗浄した。上記の合成サイクルを合成が完了するまで繰り返した。ジメトキシトリチル吸収に基づく総カップリング効率は９５．７％で、カップリング当たりの平均は９９．３％であった。ついで、オリゴマーを担体から開裂し、脱保護した。担体結合オリゴマーを合成カートリッジから外し、ネジ栓付きガラス１ドラムバイアルに入れた。担体を室温にて、アセトニトリル／エタノール／水酸化アンモニウム溶液（９／９／１、１ｍｌ）で処理した。ついで、エチレンジアミン（１ｍｌ）を反応容器に加え、反応混合物を室温で６時間放置し、反応を完了させた。オリゴマーを含有する上澄液を担体から外し、担体を１／１アセトニトリル／水（２ｍｌ）で２回洗浄し、洗液を上澄液と合した。合した溶液を、水で全容量３０ｍｌに希釈し、６Ｎ塩酸（約４ｍｌ）で中和した。この中和溶液を、予め、アセトニトリル（１０ｍｌ）、５０％アセトニトリル／１００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム（１０ｍｌ）および２５ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム（１０ｍｌ）で順次平衡した、Waters Ｃ１８ Sep-Pakカートリッジを用いて脱塩した。反応混合液をカラムに通した後、水（３０ｍｌ）で洗浄した。ついで、生成物を１／１アセトニトリル／水（５ｍｌ）で溶出した。オリゴマーを、Beckman Ultrasphere逆相４．５×２５０ｍｍカラムと、０．５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート中のアセトニトリルの増加グラディエント（４０分を要して０〜４０％）を用いてＨＰＬＣで精製した。単離収率は４１ＯＤ₂₆₀単位（３５％）であった。この化合物をエレクトロン・スプレー・マススペクトル分析により特徴付けた（計算値４３９１／実測値４３９１）。別法として、上記のオリゴマーは自動ＤＮＡシンセサイザーで合成できる。その場合、適当な二量体シントン（上記手動合成で使用したような）を上記のように、アセトニトリルに０．１Ｍの濃度で溶解する。アミダイト溶液をMilliporeE xpedite DNA Synthesizerのコニカル容器に入れる。他の全ての試薬（酸化剤、脱ブロック、キャッピング剤および活性化剤）を上記手動合成と同様に調製し、適当な割合で、手動で示したと同様に、装置に適用する。表Ｉに、１つの合成サイクルのプログラムパラメータを示す。オリゴマーの脱保護および精製は、上記手動合成オリゴマーと同様に行う。実施例９交互２’−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒｐ）／２’−Ｏ−メチルＤＥヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの調製上記実施例２に従って、２’−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒｐ）／２’−Ｏ−メチルＤＥ二量体シントンを用い、５’−（ＣＵ）−（ＣＵ）−（ＣＵ）−（ＣＵ） −（ＣＵ）−（ＣＵ）−（ＣＵ）−Ａ−３’（配列番号２）を調製した。適当な二量体シントンを０．１Ｍ濃度でアセトニトリルに溶解した。他の全ての使用した試薬は、実施例８と同様であった。１マイクロモル・スケールのＤＮＡ合成カラム（Millipoer）に１マイクロモルのメタクリレート担体結合デオキシアデノシンを充填した。カップリング時間を２分に延ばした以外は、実施例８と同様にして、３’−末端から順次、二量体シントンをカップリングさせた。ジメトキシトリチル吸収に基づく総カップリング効率は５０％、カップリング当たり平均９１％であった。合成の最後にジメトキシトリチルをオリゴマーから除去した。脱保護は実施例８と同様に行った。粗収率は１０３ＯＤ₂₆₀単位であった。オリゴマーを、Beckman Ultrasphere RPと、０．５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート中のアセトニトリルの増加グラディエント（３０分を要して１０〜３０％）を用いてＨＰＬＣで精製した。単離収率は３９ＯＤ₂₆₀単位（３８％）であった。化合物をエレクトロン・スプレー・マススペクトル分析により特徴付けた（計算値４７１３／実測値４７１２）。このオリゴマーは自動ＤＮＡシンセサイザーでも、つぎのようにして合成できる。適当な二量体シントン（上記手動合成で使用したような）を実施例８に記載のように、アセトニトリルに溶解する。アミダイト溶液をMilliporeExpedite DN A Synthesizerのコニカル容器に入れる。他の全ての試薬（酸化剤、脱ブロック、キャッピング剤および活性化剤）を実施例８と同様に調製し、適当な割合で、手動で示したと同様に、装置に適用する。カップリング時間を２分に延ばす以外は実施例８に記載したと同様なカップリング・プログラムを使用する。脱保護は実施例８と同様に行う。オリゴマーは、上記手動合成について記載したと同様にＨＰＬＣで精製できる。実施例１０交互ＭＰ（Ｒｐ）／ＰＳヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの調製交互ＭＰ（Ｒｐ）／ＰＳヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを実施例８の二量体シントンを使用して調製する。合成の他の全てのパラメター、脱保護および精製は実施例８に記載のとおり行う。ただし、酸化剤を３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドの０．１Ｍ溶液または１／１二硫化炭素／ジイソプロピルエチルアミン中の硫黄の０．１Ｍ溶液に代える。実施例１１交互ＭＰＳ（Ｒｐ）／ＤＥヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの調製実施例４の二量体シントンを用いて交互ＭＰＳ（Ｒｐ）／ＤＥヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを調製する。合成の他の全てのパラメター、脱保護および精製は実施例８に記載のとおり行う。実施例１２交互ＭＰＳ（Ｒｐ）／ＰＳヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの調製交互ＭＰＳ（Ｒｐ）／ＰＳヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを実施例４の二量体シントンを使用して調製する。合成の他の全てのパラメター、脱保護および精製は実施例８に記載のとおり行う。ただし、酸化剤を３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドの０．１Ｍ溶液または１／１二硫化炭素／ジイソプロピルエチルアミン中の硫黄の０．１Ｍ溶液に代える。実施例１３交互ＭＰ（Ｒｐ）／ＰＳ₂ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの調製実施例５の二量体シントンを用いて交互ＭＰ（Ｒｐ）／ＰＳ₂ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを調製する。合成の他の全てのパラメター、脱保護および精製は実施例１２に記載のとおり行う。実施例１４交互ＭＰＳ（Ｒｐ）／ＰＳ₂ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの調製実施例６の二量体シントンを用いて交互ＭＰＳ（Ｒｐ）／ＰＳ₂ヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを調製する。合成の他の全てのパラメター、脱保護および精製は実施例１２に記載のとおり行う。実施例１５交互ＭＰ（Ｒｐ）／２’−Ｏ−メチルＤＥヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの調製実施例７の二量体シントンを用いて交互ＭＰ（Ｒｐ）／２’−Ｏ−メチルＤＥヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーを調製する。合成の他の全てのパラメター、脱保護および精製は実施例９に記載のとおり行う。実施例１６２’−Ｆ二量体シントンの調製本発明のオリゴマーの調製に有用な二量体シントンは２’−フルオロヌクレオシドを用いて調製できる。２’−フルオロヌクレオシドの調製法は当該分野で公知である。［例えば、Codington，JOC Vol．29（1964）(2'-FU); Angew．Chem．96 :557-558(1978)およびDoen，JOC 32:1462-1471（1967）(2'-FC); Ikehara，Ch em．Pharm．Bull，29:1034-1038（1981）(2'-FG); Ikehara，J．Carbohydrates ，Nucleosides，Nucleotides 7:131-140(1980)(2'-FA)およびKrug，A.，Nucleos ides & Nucleotides 8:1473-1483(1989)参照。］２’−フルオロヌクレオシドを用いる二量体シントンの調製は２’−Ｏ−メチル二量体シントンについて記載したと同様な操作（例えば、実施例２、３および５参照）を用いて行うことができる。得られた二量体シントンは、実施例９および１５のような２’−Ｏ−メチル二量体シントンについて用いたと同様な方法を用いるオリゴマーの調製に使用できる。実施例１７２’−Ｏ−アリル二量体および三量体シントンの調製およびそれらのオリゴマー合成における使用実施例１、４および１４に記載した二量体および三量体シントンは、２’−Ｏ −アリルヌクレオシドを用いて調製できる。２’−Ｏ−アリルヌクレオシドの調製が、報告されており、商業的に入手可能で、それらのオリゴマー調製における使用も報告されている。［例えば、Iribaren et al.（1990）Proc．Natl．Acad ．Sci．(USA)87:7747-51; Lesnik et al．(1983)，Biochemistry 32:7832-8。］このヌクレオシドは上記した操作を用いて二量体および三量体シントンの調製に使用される。これらのシントンは、実施例５、６、７、９、１２、１３または１５に記載の方法を用いるオリゴマーの調製に使用される。実施例１８ＭＰ（Ｒｐ）／ＭＰ二量体シントンの調製Ａ．液相化学を用いる、キラリティー的に純粋はメチルホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する（ＣＴ）二量体の調製２リットル・ロータリーエバポレータ・フラスコに３’−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン（１０．０ｇ、２８ｍＭ）および５’−ジメトキシトリチル−Ｎ⁴ −イソブチリル−３’−メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト−２’−デオキシシチジン（２６．１ｇ、３５ｍＭ）を入れた。固体をアセトニトリル（５００ｍｌ）に溶解し、真空下で蒸発乾固した。この操作を、アセトニトリル（５００ｍｌ）を用いてもう一度繰り返し、フラスコをアルゴン下で解放し、ラバー・セプタで密栓した。この乾燥固形泡を、手で撹拌しながらアセトニトリル（ＡＣＮ、５００ｍｌ）に溶解し、テトラゾール（４０４ｍｌ、１８０ｍＭ、ＴＨＦ中、０．４５Ｍテトラゾール）で一度に処理した。手による撹拌をさらに３０秒続け、フラスコをさらに２．５分間放置し、酸化剤溶液（２７５ｍｌ、Ｉ₂／Ｈ₂Ｏ／ルチジン／ＴＨＦ；２５ｇ／２．５ｍｌ／１００ｍｌ／９００ｍｌ）で一度に処理した。この溶液を手で撹拌し、室温に１５分間放置した。得られた暗琥珀色溶液を重亜硫酸（２ｇ／２５ｍｌ／Ｈ₂Ｏ）で処理した。酸化剤を添加すると、過剰のヨウ化物と反応するので、溶液は薄い琥珀色に変わった。反応混合物を粘稠油状に濃縮し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、５００ｍｌ）に取り、飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ２５０ｍｌ）および水（２ｘ２５０ｍｌ）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、薄く着色した固形の泡に濃縮し、これをさらに乾燥して粗製の二量体を得た。粗製の二量体を、５０％アセトニトリルおよび０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ、ｐＨ〜７．０）で開始し、２０分で１００％アセトニトリルまで増加するリニア・グラディエントを用いるプログラム（ＡＣＮＭＥＴＨ）のＨＰＬＣ（逆相、Waters Ｃ１８ bondapack）に付した。２つの主ピークが分離し、１つは４．５分のところで、残留ルチジンであり、もう１つは１４．５分のところで、ＲｐおよびＳｐジアステレオマーの混合物であった。粗生成物（５ｍｇ）を取り、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ、０．５ｍｌ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液）と共に、アセトニトリル（１，５ｍｌ）に溶解してＲｐおよびＳｐの比率を定量した。室温で１０分間撹拌した後、試料をＨＰＬＣに付した。２つの主ピークが６．５分および７．１分のところに認められ、遅い溶出ピークは消滅した。最初の新しいピークがＳｐジアステレオマーと考えられ、２つのピークに対する規格化値の６６％（２／１）を示した。粗生成物を、５％メタノール加７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（「７５／２５」）中て、ＴＬＣ（正常相シリカプレート）により分析した。ＴＬＣは、Ｒｆ０．４５および０．６４の２つのスポットを示し、速く展開する生成物（Ｒｐ形と考えられる）は遅く移動する生成物より強度が少なかった。このＲｐジアステレオマーを、７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中、メタノールの段階グラディエントを用いる正常相シリカで分離した。７．５ｃｍｘ６０ｃｍのカラムに、シリカ（７００ｇ、最初に、２．５リットルの７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中でスラリー化）を充填した。ついで、粗製の二量体を７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（７５ｍｌ）に溶解し、カラムに載せた。カラムを１％メタノールで開始し、２％および最後に３％に増加し、ここでＲｐ二量体が溶出しはじめた。溶離液を３％メタノールに維持している間、数床容量にわたって汚れのないＲｐ二量体が溶出した。Ｓｐ二量体は後に３０％メタノールで溶出させた。Ｒｐ二量体の収量は１１．０ｇ、Ｓｐ二量体の収量は１７．８ｇであった。Ｒｐ二量体についてＨＰＬＣ分析（ＡＣＮＭＥＴＨ）を行い、１４．５分のところに１つのピークを認めた。生成物のＴＬＣ（７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂、５％メタノール）は、Ｒｆ０．５５の単一スポットを示し、エタノール中、１０％硫酸で処理し、加熱すると、トリチルおよび糖の両方が陽性であった。新たに分離されたＲｐ二量体（１１．０ｇ、０．０１１Ｍ）をＡＣＮ（１１０ｍｌ）に溶解し、室温にてＴＢＡＦ（２２ｍｌ、０．０２２Ｍ、ＴＨＦ中１Ｍ）で一度に処理した。反応混合物を室温で一夜放置した。翌朝、ＴＬＣ（７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂、１０％メタノール）で反応の完了を確認した。出発物質は検出されなかったが、少量の５’−ＤＭＴ−ｄＴが認められ、二量体の３ ’−ＯＨよりも正常相シリカ上をかなり速く移動した。反応混合物をロータリーエバポレータで粘稠油状に濃縮し、ジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ１００ｍｌ）および水（２ｘ１００ｍｌ）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、淡黄色固体の泡に濃縮し、シリカ（１００ｇ、５％メタノール含有７５／２５ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）上で精製した。５’−ＤＭＴ−ｄＴは除去したが、１３．５分（ＨＰＬＣ、ＡＣＮＭＥＴＨ）に不純物が検出された。これは、最初、未反応出発物質と考えられたが（ｔ−ＢＤＭＳ他）、さらにＴＢＡＦで処理したところ、これは問題ないことが判明した。シリカ（１００ｇ）および同じ溶離液を用いる第２のカラムを行い、同様なフラクションを集めた。カラムは成功裏に２つのスポットを分離した。純ＣＴ−Ｒｐフラクションをプールし、濃縮してほぼ白色の固形の泡（５．５ｇ）を得た。Ｂ．キラリティー的に純粋な二量体シントンの調製上記で調製したＣＴ−３’−ＯＨ二量体（５．５ｇ、６ｍＭ）をピリジンと２回共蒸発させて無水とした。アルゴン下、得られた固形の泡をロータリーエバポレータから外し、ラバー・セプタで密栓した。固形の泡を９／１ＡＣＮ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂（１００ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．７ｍｌ、１２ｍＭ）で処理した。マグネットスターラーで撹拌しながら、反応混合物を、室温で、クロロメチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン（Ｃｌ−ＭＡＰ、１．５ｍｌ、８ｍＭ）を滴下して処理した。反応をＨＰＬＣ（ＡＣＮＭＥＴＨ）でモニターしたところ、１．５時間後に完了し、２つの主生成物を示した。１つは３．５分のところで、ピリジンであり、第２は１４．３分のところで、所望のアミダイトであった。反応混合物を、部分的に真空を用いて、ロータリーエバポレータで濃縮した。得られた淡琥珀色のスラッジを含むフラスコをアルゴン下で密栓した。粗製の生成物を直に、シリカ（６０ｇ、３％ＴＥＡ含有１／１／１ＡＣＮ／ＥｔＯＡｃ／ＣＨ₂Ｃｌ₂で平衡）を充填したフラッシュカラムに通した。生成物はこの溶離液で速やかに溶出し、全てのＵＶ陽性フラクションを集め、プールし、濃縮した。得られた固形の泡をＡＣＮと共蒸発して残留するＴＥＡを除去し、ついで十分な真空で一夜乾燥した。最終生成物は、灰白色固体の泡（５ｇ）であった。実施例１９５’−メチルホスホノアミダイト・モノマーを経る２’−Ｏ−Ｍｅ，ＧＧ（５ ’−Ｏ−ＤＭＡ，３’−Ｏ−βＣＥ，Ｎ²ＩＢＵ）ＭＰ（Ｒｐ）二量体の調製５００ｍｌＲＢＦに、２’−ＯＭＥ−Ｇ（３’−Ｏ−ｔＢＤＰＳ，５’−ＯＨ，Ｎ²ＩＢＵ）（３０．５ｇ、０．０５Ｍ）を入れ、ピリジン（１ｘ１００ｍｌ）およびアセトニトリル（２ｘ１００ｍｌ）で無水にした。得られた乾燥固形の泡を、アルゴン下ロータリーエバポレータから外し、無水ＡＣＮ（３００ｍｌおよびトリエチルアミン（１０．５ｍｌ、０．０７５Ｍ、１．５ｅｑ）で処理した。フラスコをラバー・セプタで密栓し、クロロメチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン（１０．９ｍｌ、０．０６Ｍ、１．２ｅｑ）で処理（滴下）した。反応混合物を室温で一夜撹拌した。翌朝、ＨＰＬＣ（Beckman Gold，RP，Waters Ｃ１８ bondapak; λ２５４ｎｍ、２０分プログラム５０／５０ＡＣＮ／０．１ＭＴＥＡＡ−１００％ＡＣＮ）で、反応混合物が出発物質を含まないことを確認した。反応混合物を濃縮し、２％ＴＥＡ含有３：１酢酸エチル／ヘプタン中シリカ（２２５ｇ）上で精製した。生成物をプールし、濃縮して固形の泡（２５ｇ、６７％）を得た。ＨＰＬＣによると、純度８６％であった。この生成物をＡＣＮ中に取り、所望のアミダイトの１０％溶液とし、モレキュラーシーブ上で保存した。アルゴン・バルーン・オーバーヘッドを有する火炎乾燥した５００ｍｌフラスコに、グラスウールを入れた滴下ロートで、２’−ＯＭｅ−Ｇ（５’−アミダイト，３’−ｔＢＤＰＳ，Ｎ²ＩＢＵ）のストック溶液（１００ｍｌ、１０ｇ、０．０１３Ｍ、１．２５ｅｑ）を、２’−ＯＭｅ−Ｇ（５’−ＤＭＴ，３’−ＯＨ，Ｎ²ＩＢＵ）のストック溶液（７１．１ｍｌ、７．１ｇ、０．０１１Ｍ、１．０ｅｑ）と共に移した。反応混合物をエチルチオ−テトラゾール（３０．９ｍｌ、ＡＣＮ中２５重量％溶液、５．０ｅｑ）で一度に処理し、室温で５分間撹拌した。ついで、クメンヒドロパーオキシド（２．１ｍｌ、tech.、８０％）で一度に処理した。５分後、反応混合物を飽和重亜硫酸ナトリウム（２０ｍｌ）でクエンチした。反応混合物をＨＰＬＣで分析し、１．２／１．０（Ｓｐ／Ｒｐ）比を有する８６％二量体であることを確認した。ついで、反応混合物をロータリーエバポレータに入れ、ＡＣＮを除去した。得られた濃縮物をジクロロメタン（ＤＣＭ、１５０ｍｌ）に取り、飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ７５ｍｌ）および水（１ｘ７５ｍｌ）で洗浄した。水性洗液を合し、ＤＣＭ（１ｘ７５ｍｌ）で抽出し、元の有機相と合し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、淡琥珀色固形の泡に濃縮した。この固形の泡、２’−Ｏ−Ｍｅ−ＧＧ（５’−ＤＭＴ，３’−ｔＢＤＰＳ，Ｎ² ＩＢＵ）ＭＰ（Ｒｐ／Ｓｐ）生成物（１２．６ｇ、０．００９４Ｍ、１．０ｅｑ）をＴＨＦ（１２０ｍｌ）に取り、ＴＢＡＦ（１４．２ｍｌ、ＴＨＦ中１Ｍ、０．０１４Ｍ、１．５ｅｑ）で一度に処理し、室温で一夜放置した。翌朝、ＨＰＬＣにて脱シリル化をモニターしたところ、純度８４％であった（４４％Ｓｐおよび４０％Ｒｐ）。反応混合物に少量のシリカゲルを加え、１０分間撹拌した後、反応混合物を、少量のシリカゲル床を入れた焼成グラスロートに通した。ＤＣＭ中１０％メタノールで床から生成物を溶出させた。濾液を濃縮し、ＤＣＭに取り、飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ７５ｍｌ）および食塩水（１ｘ７５ｍｌ）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、粘稠油状に濃縮した。これは１４ｇであったが、強いクメンヒドロパーオキシド臭がした。この油をＡＣＮ中に取り、２３重量％溶液とし、２インチのプレパラティブＨＰＬＣカラムで精製した（Beckman Gold，RP，Kromasil Ｃ１８、１０ｕ，λ２９５ｎｍ，６０ｍｌ／分、isocratic４５％ＡＣＮおよび５５％Ｈ₂Ｏ）。３回別々のＨＰＬＣを行い、純Ｒｐフラクションをプールし、濃縮して、１００％純度のＧＧ（３’−ＯＨ）Ｍｐ（Ｒｐ）二量体（３．３ｇ）を得た。実施例２０３’−メチルホスホノアミダイト・モノマーを経る２’−Ｏ−Ｍｅ−ＣＵ（５ ’−ＤＭＴ，３’−ＯＨ，Ｎ⁴ＩＢＵ）ＭＰ（Ｒｐ）二量体の調製２’−Ｏ−Ｍｅ−ＤＭＴ−保護シチジン（５０ｇ、０．０８２Ｍ、１．０ｅｑ）をピリジン（３ｘ１００ｍｌ）およびＡＣＮ（１ｘ１００ｍｌ）と共蒸発させて無水にした。フラスコをアルゴン下で外し、撹拌棒を入れ、ＡＣＮ（５００ｍｌ）、ＴＥＡ（２２．７ｍｌ、０．１６３Ｍ、２ｅｑ）を加え、アルゴン・バルーン・オーバーヘッドを有するセプタで密栓した。この溶液を、２０ｍｌプラスチック・シリンジを用いてＣｌ−ＭＡＰ（１９．２ｍｌ、０．１１Ｍ、１．３ｅｑ）で滴下処理し、室温で一夜撹拌した。翌朝、反応をＨＰＬＣでチェックし、出発物質の消失を確認した。反応混合物を濃縮し、シリカゲル（３００ｇ）と２％ＴＥＡ含有５０／５０ＥｔＯＡｃ／ヘプタンを用いて精製した。溶離液（４リットル）をカラムに通し、全てのＵＶ陽性物質をプールし、固形の泡（５２ｇ、純度９５％（ＨＰＬＣ）、８４％回収）に濃縮した。生成物をＡＣＮに取り、所望の３’−メチルホスホノアミダイトの１０重量％溶液とし、この溶液をモレキュラーシーブに加えた。モレキュラーシーブ上で一夜放置した後、このストック溶液（１００ｍｌ、１０ｇ、０．０１３Ｍ、１．２５ｅｑ）を、Ｕ，５’−ＯＨのストック溶液（５１ｍｌ、５．１ｇ、０．０１Ｍ、１．０ｅｑ）と共に、火炎乾燥した５００ｍｌ丸底フラスコに入れた。ＥＴＴ（６７ｍｌ、モレキュラーシーブ上、ＡＣＮ中１０％溶液、６．７ｇ、０．０５２Ｍ、５．０ｇ）を滴下ロートから一度に加え、反応混合物を室温にて５分間撹拌した。このホスファイト中間体をカンファースルホニルオキサジリジン（ＣＳＯ）溶液（３６ｍｌ、モレキュラーシーブ上、ＡＣＮ中１０％）で５分間酸化した。反応混合物をＨＰＬＣでチェックし、１．２／１．０（Ｓｐ／Ｒｐ）の割合の二量体７９％を含むことを確認した。反応混合物を濃縮し固形の泡とし、ＤＣＭ（１５０ｍｌ）に取り、実施例１９と同様に仕上処理した。得られた固形の泡は、ＨＰＬＣにより８９％二量体と確認され、さらに精製することなく、脱シリル化した（下記参照）。この固形の泡、２’−Ｏ−Ｍｅ−ＣＵ（５’−ＯＤＭＴ，３’−ＯｔＢＤＰＳ，Ｎ⁴ＩＢＵ）ＭＰ（Ｓｐ／Ｒｐ）二量体をＴＨＦ（１００ｍｌ）に取り、テトラブチルアンモニウムフルオリド（１２．３ｍｌ、ＴＨＦ中１Ｍ、０．０１２Ｍ、１．５ｅｑ）で一度に処理した。１時間後、反応混合物をＨＰＬＣにてチェックして、出発物質の消失により反応の完了を確認した。反応混合物を、１０％メタノール含有３：１ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭを用いてシリカゲル上で精製した。ついで、精製二量体（８ｇ、１．５／１．０、Ｓｐ／Ｒｐ）をプレパラティブＨＰＬＣ精製した、さらに２回同様に精製して、純Ｒｐ二量体３’−ＯＨ（３．３ｇ）を得た。実施例２１保護３’−ＯＨを経る２’−Ｏ−Ｍｅ−Ｇ（５’−ＯＨ，３’−ＯｔＢＤＰＳ，Ｎ²ＩＢＵ）ＭＰ（Ｒｐ）の調製ＤＭＴ−保護２’−Ｏ−Ｍｅグアノシン（２５ｇ）をＤＭＦ（３ｘ１００ｍｌ）と共蒸発させて無水にした。固体の泡をアルゴン下でロータリーエバポレータから外し、無水ＤＭＦ（２５０ｍｌ）に溶解した。この溶液を、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（１５．３ｍｌ、０．０５６Ｍ、１．５ｅｑ）およびイミダゾール（１０．１ｇ、０．１５Ｍ、４．０ｅｑ）で処理し、均一溶液となるまで手で撹拌し、一夜放置した。翌朝、反応をＨＰＬＣでチェックし、出発物質の消失を確認した。手で撹拌しながら、反応混合物を氷水（３００ｍｌ）に注いだ。固体をブフナー・ロートに集め、冷水でリンスし、ＤＣＭ（２５０ｍｌ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム（３ｘ２００ｍｌ）および水（１ｘ１００ｍｌ）で洗浄した。水性相を合し、ＤＣＭ（２ｘ１００ｍｌ）で抽出した。有機相を合し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮して、新たにシリル化された生成物（３５ｇ）を含む固体の泡を得た（わずかに理論値より多い）。この固形の泡、２’−Ｏ−Ｍｅ−Ｇ（５’−ＯＤＭＴ，３’−ＯｔＢＤＰＳ，Ｎ²ＩＢＵ）をＤＭＦ（１５０ｍｌ）に溶解し、マグネットスターラーで撹拌しながら、ベンゼンスルホン酸（２６０ｍｌ、７５／２５ＤＣＭ／ＭｅＯＨ中１Ｍ溶液、０．０２６Ｍ、０．６７ｅｑ）で一度に処理した。反応を１０分間進行させた。このとき、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨのＴＬＣは脱シリル化の完了を示した。ＴＥＡ（２０ｍｌ）で、反応を直にクエンチし、このとき、溶液は、濃透明琥珀色から淡透明黄色に変化した。溶液を粘稠油状に濃縮し、ＤＣＭ中０．５％メタノールで平衡させたシリカゲル（２５０ｇ）上で精製した。同じ溶離液で遊離のトリチルを除去し、ついで、生成物をＤＣＭ中６％メタノールで溶出した。生成物を含むフラクションをプールし、濃縮して標記化合物（２１．８ｇ、ＨＰＬＣ純度９８．５％、総収率９１％）を得た。実施例２２ＵＣ，３’−ＯＨを経る２’−Ｏ−Ｍｅ−ＵＣ（５’−ＯＤＭＴ，Ｎ⁴ＩＢＵ）−３’ＣＥホスホルアミダイトの調製２’−Ｏ−ＭｅＵＣ（５’−ＤＭＴ，３’−ＯＨ，Ｎ⁴ＩＢＵ）ＭＰ（Ｒｐ／Ｍｐ）二量体（９８０ｍｇ）をＡＣＮ（３ｘ１０ｍｌ）と共蒸発させて無水にした。固体の泡を無水ＡＣＮ（１０ｍｌ）に取り、これにＴＥＡ（３２５μｌ、２．３２ｍＭ、２．２５ｅｑ）を加え、ついで、２’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（４６０μｌ、２．６ｍＭ、２．０ｅｑ）を滴下した（１ｍｌガラスシリンジで）。反応混合物を一夜放置した。ＴＬＣおよびＨＰＬＣは反応の完了を示した。反応混合物を、１％ＴＥＡを含有する３：１：１ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ：ＡＣＮで平衡したシリカ（３０ｇ）を充填した１，５ｘ２０ｃｍカラムに載せ、同じ混合液で生成物を溶出し、精製した生成物を含有するフラクションをプールし、濃縮して純アミダイト（６００ｍｇ）を得た。実施例２３ＭＰ（Ｒｐ）／ＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥ三量体シントンの調製実施例１８の二量体シントンを用いて上記の三量体シントンを調製する。二量体シントンを、３’−ヌクレオシドのモノマー・ホショルアミダイトへのカップリングについての実施例１８Ａの方法に従い、５’−ＯＨ，３’−シリル化ヌクレオシドにカップリングさせる。選択した５’−ＯＨ，３’−シリル化ヌクレオシド（１当量）と、異性体的に純粋なＲｐ二量体メチルホスホンアミド（１．２５当量）を丸底フラスコに計り込み、アセトニトリルと共蒸発させた乾燥する。得られた泡をアセトニトリルに溶解し、アセトニトリル中、０．４５Ｍテトラゾール溶液（４．５当量）で処理する。３分後、実施例１８Ａの記載のとおり反応混合物を酸化し、仕上げる。３ ’−シリル化三量体のジアステレオマーを、二量体の分離についての実施例１８Ａの記載と同様にしてシリカゲルで分離する。ジアステレオマーの配置を２−ＤＮＭＲ（ROSEY）を用いて決定する。２つのヌクレオシジル間結合の所望のキラル配置（Ｒｐ／Ｒｐ）を有する三量体を、実施例１８に記載の方法を用いてクロロ−β−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトと反応させて三量体シントンに変換する。実施例１Ｂの方法を用いてこの三量体シントンを仕上げ、精製する。実施例２４ＭＰ（Ｒｐ）／ＭＰ／ＤＥヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーの調製実施例２３の三量体シントンを用いて、実施例８の方法に従い、二量体を該三量体に代えて、上記のオリゴマーを調製する。全ての合成パラメータ、脱保護および精製は、実施例８に記載のとおりである。実施例２５オリゴリボヌクレオシドの調製オリゴリボヌクレオチドは以下の操作を用いて合成できる。オリゴリボヌクレオチドは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ− ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノホスホルアミダイトヌクレオシド（Millipore，Hilford，MA）を用いて合成した。合成は、標準的Milligenホスホルアミダイト操作を用い、Milligen 8750 自動ＤＮＡシンセサイザーにより、１マイクロモル・スケールで行った。ただし、より立体障害性の２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルＲＮＡが十分反応できるように、カップリング時間を１２分に延長して行った。合成は、Milliporeから購入したコントロール多孔ガラス結合２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリチルリボヌクレオシドから開始した。全ての他のオリゴヌクレオシド合成試薬はMilliporeの標準的プトロコールに記載のとおりとした。合成後、オリゴヌクレオチドは無菌的、ＲＮアーゼ・フリー条件下で取り扱った。水は０．５％ジエチルピロカーボネートで一夜処理し、ついでオートクレーブした。全てのガラス容器は、３００℃で少なくとも４時間焼いた。まず、担体結合オリゴマーを、３／１水酸化アンモニウム／エタノールで５５ ℃にて１５分間処理して、オリゴヌクレオチドを脱保護し、担体から開裂した。オリゴヌクレオチドを含有する上澄液をデカントし、蒸発乾固させた。得られた残渣をテトラヒドロフラン中１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド（０．６ｍｌ、水分含量５％以下）で室温にて２４時間処理した。水性２Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（０．６ｍｌ、ｐＨ７）を加えて反応をクエンチした。反応混合物を、滅菌水を用いてBio-Rad １０DGカラムに通して脱塩した。ついで、脱塩オリゴヌクレオチドを乾燥した。このオリゴリボヌクレオチドの精製を、標準的方法（Maniatis，T．et al.，M olecular Cloning: A Laboratory Manual，p184-185(Cold Spring Harbor 1982) ）を用い、１５％１９／１ポリアクルアミド／ビスアクリルアミドおよび７Ｍウレアを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。ゲルは幅２０ｃｍ、長さ４０ｃｍ、厚さ６ｍｍであった。オリゴリボヌクレオチド（６００Ｄ単位）を１．２５％ブロモフェノールブルーを含有する水（２００μｌ）に溶解し、ゲルに載せた。ゲルを３００Ｖで一夜泳動させた。生成物のバンドをＵＶで検出し、切り取り、０．５Ｍ酢酸ナトリウムで一夜溶出した。生成物を、製造者提供プロトコールを用い、Waters Ｃ１８ Sep-Pakカートリッジで脱塩した。生成物をキナージング（kinasing）で³²Ｐ標識し、ＰＡＧＥで分析した。実施例２６ラセミ・メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドの調製このオリゴマーは、５’−（ジメトキシトリチル）デオキシヌクレオシド− ３’−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メチル］−ホスホノアミダイト・モノマーを用いて合成した。以下の修正をした外は、製造者の推奨に従い、Bioser ach Model ８７５０ＤＮＡシンセサイザーを用いて、メタクリレートポリマー担体上で固相合成を行った。ｄＧ以外のモノマーを、１００ｍＭの濃度でアセトニトリルに溶解した。ｄＧは１００ｍＭの濃度で１／１アセトニトリル／ジクロロメタンに溶解した。脱保護（DEBLOCK）試薬：ジクロロメタン中、２．５％ジクロロ酢酸。酸化剤（OXIDI ZER）試薬：０．２５％水、２５％２，６−ルチジン、７２．５％テトラヒドロフラン中、２５ｇ／リットルのヨウ素。ＣＡＰＡ：アセトニトリル中１０％無水酢酸。ＣＡＰＢ：ピリジン中０．６２５％Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン。ついで、オリゴヌクレオチドを担体から開裂し、脱保護した。担体結合オリゴヌクレオチドを、合成カートリッジから出し、ネシ栓付ガラス１ドラムバイアルに入れた。担体を、アセトニトリル／エタノール／水酸化アンモニウム（９／９／１）の溶液（１ｍｌ）で室温にて３０分間処理した。ついで、反応容器にエチレンジアミン（１ｍｌ）を添加し、６時間反応させた。オリゴヌクレオチドを含有する上澄液を担体から除き、担体を１／１アセトニトリル／水（２ｍｌ）で２回リンスし、上澄液と合した。合した溶液を水で希釈して全量３０ｍｌとし、６Ｎ塩酸（約４ｍｌ）で中和した。この中和溶液を、予め、順次、アセトニトリル（１０ｍｌ）、５０％アセトニトリル／１００ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム（１０ｍｌ）および２５ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム（１０ｍＭ）で平衡したWaters Ｃ１８ Sep-Pakカートリッジで脱塩した。反応混合液をカラムに通した後、水（３０ｍＭ）で洗浄した。ついで、生成物を１／１アセトニトリル／水（５ｍｌ）で溶出した。このオリゴヌクレオチドを、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム中アセトニトリルのグラディエントを用いる逆相カラム（Whatman RAC II）上のＨＰＬＣにより精製した。実施例２７交互メチルホスホネート−ジエステル主鎖を有する２’−Ｏ−メチルオリゴマーの合成および精製（ａ）試薬および材料合成試薬ＭＡＰモノマー：５’−ジメトキシトリチル−Ｎ⁴−イソブチリル−２’−Ｏ −メチルシチヂン−３’−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスホノアミダイト（Ｃ_me−ＭＡＰ）、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ²−イソブチリル−２’− Ｏ−メチルグアノシン−３’−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスホノアミダイト（Ｇ_me−ＭＡＰ）、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスホノアミダイト（Ｕ_me−ＭＡＰ）、Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスホノアミダイト（Ａ_me−ＭＡＰ）。２−シアノエチルモノマー：５’−ジメトキシトリチル−Ｎ⁴−イソブチリル −２’−Ｏ−メチルシチヂン−３’−［２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｃ_me−ＤＥ）、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ²− イソブチリル−２’−Ｏ−メチルグアノシン−３’−［２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｇ_me−ＤＥ）、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−［２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｕ_me−ＤＥ）、Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’−［２−シアノエチル− Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ａ_me−ＤＥ）。溶媒：無水アセトニトリル脱保護：ジクロロメタン中２．５％ジクロロ酢酸ＣＡＰＡ：無水アセトニトリル中４０％無水酢酸ＣＡＰＢ：無水ピリジン中０．２５％ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）酸化剤：ＭＡＰモノマー用のGenta酸化剤（０．２５％水、２５％２，６− ルチジン、７３％テトラヒドロフラン中２５ｇヨウ素）酸化剤：ホスホジエステル用市販（Glen Research）の酸化剤活性化剤：無水アセトニトリル中０．４５Ｍテトラゾール担体結合ヌクレオシド（ｂ）交互メチルホスホネートおよびホスホジエステル主鎖を有する２’−Ｏ −メチルオリゴヌクレオチドの固相担持合成このオリゴマーを、Biosearchからの８９００ Expedite型シンセサイザーで合成した。メチルホスホノアミダイトモノマーＡ_me−ＭＡＰ、Ｇ_me−ＭＡＰ、Ｃ_me −ＭＡＰおよびＵ_me−ＭＡＰを、各々、アセトニトリル中１００ｍＭの濃度で、ポートＡ、Ｇ、ＣおよびＴに入れた。ホスホジエステル結合用の２−シアノエチルホスホルアミダイトモノマーＡ_me−ＤＥ、Ｇ_me−ＤＥ、Ｃ_me−ＤＥおよびＵ_me −ＤＥを、ポート６、７、８および９に入れた。メチルホスホネートカップリング用の低水分酸化剤を酸化剤ポートに入れ、市販の酸化剤（Glen Researchより）を、ジエステル結合酸化用のＡｕｘポートに入れた。メチルホスホネートおよびジエステルの１５マイクロモル・スケールのカップリング・プログラムを以下の表に示す。アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）からのオリゴマー配列は以下のとおりである。５’−ｔ_mp−２’−Ｏ−メチル［Ｃ_de−Ｕ_mp−Ｕ_de−Ｃ_mp−Ｃ_de−Ａ_mp−Ｕ_de− Ｇ_mp−Ｃ_de−Ａ_mp−Ｕ_de−Ｇ_mp−Ｕ_de−Ｕ_mp−Ｇ_de−Ｕ_mp−Ｃ_de−Ｃ_mp］−Ｔ（配列番号３）チミジン固体担体を用い、ｎ−１オリゴマーを合成した。括弧ないの全ての塩基は、２’−Ｏ−メチルである。トリチウム化（tritated）モノマーの利用しやすさから、５’−末端をデオキシ−Ｔとして選択した。放射能汚染を避けるため、該５’−末端Ｔをシンセサイザーの代わりにシリンジを用いて手動で固体担体を通じで試薬を加えた。非トリチウム化およびトリチウム化オリゴマーをこの方法で合成した。（ｃ）脱保護および脱塩乾燥支持体を合成カラムから取り出し、１０ｍｌの頂部がネジのバイアルに入れ、後記するワンポット手法によって脱保護した。ビーズに、ＡＣＮ／エタノール−ＮＨ₄ＯＨ（４５：４５：１０）を含有する溶液４ｍｌを添加し、混合物を撹拌し、室温で３０分間放置した。混合物に蒸留エチレンジアミン４ｍｌを添加し、該バイアルをロータリーミキサーに取り付け、室温で６時間反応させた。溶液を取り出し、水で希釈し、６ＮＨＣｌで中和した。それをさらに水で５％有機物まで希釈した。次いで、試料を、予め膨潤させたＣ−１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．Ｗａｔｅｒｓ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）で脱塩し、ＡＣＮ、１００ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）中５０％ＡＣＮおよび２５ｍＭＴＥＡＢの各１５ｍｌで洗浄した。オリゴマーのカラムへの吸収に続き、該カラムを、水１５ｍｌ、次いで、水中の２５％ＡＣＮ５ｍｌ、次いで水中の５０％ＡＣＮ５ｍｌで溶出した。６０％アイソクラチックＡＣＮ／５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用い、順相ＣｙｃｌｏｂｏｎｄＨＰＬＣカラム上のクロマトグラフィーによって、各溶出物をＡ２６０ＵＶ吸収性物質の量につき分析した。各１５μｍｏｌ合成により、通常は、２６０ｎｍにおいて１５００−２０００ＯＤ単位の粗製物質が得られる。（ｄ）精製オリゴマー溶液を十分乾燥し、５０％ＡＣＮ／水１０００μＬに再溶解し、半分取用ＣｙｃｌｏｂｏｎｄＨＰＬＣカラムで精製した。ベースラインの分離には、約５００ＯＤの粗製オリゴマーを各回クロマトグラフィーに付し、引き続いてＳｐｅｅｄ−Ｖａｃで濃縮した。オリゴマーから酢酸アンモニウムを除去するには、２回の水との共蒸発で十分であった。電子スプレイイオン化を用い、質量分析によって非トリチウム化オリゴマーをさらに分析した。このオリゴマーについての計算した質量は６４４７.５であり、実測値は６４４８であった。非トリチウム化の並列にてのＰＡＧＥ分析のＨＰＬＣスパイクによって、トリチウム化オリゴマーをさらに分析した。実施例Ａ交互ＣＴ配列を有するが異なる骨格を有するオリゴマーの実験同一のヌクレオチド配列（交互ＣＴ）を有するが異なる骨格（異なるヌクレオシジル間結合）を有する一連のオリゴマーを実施例に記載したごとくに調製した。（実施例１Ａに記載したごとくに調製した）キラル的に純粋なＲ_pダイマー（ＣＴ）を用いて２’−デオキシＭＰ（Ｒｐ）／ＭＰオリゴマーを調製した。実施例２に従って調製したＲｐ（ＣＵ）ダイマーを用いて２’−Ｏ−メチル−ＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥオリゴマーを調製した。対照オリゴマー（ａ）２’−デオキシヌクレオシドおよび全てのホスホジエステルヌクレオシジル間インテイク(intake)を有する２’−デオキシの全てのＤＥ、（ｂ）２’−Ｏ−メチルヌクレオシドおよび全てのホスホジエステルヌクレオシジル間結合を有する２’−Ｏ−メチルの全てのＤＥはOligos等から購入した。ハイブリダイゼーション実験は以下の手法に従って行った：アニーニング反応混合物は等モル量のオリゴマーおよびＲＮＡ標的オリゴマー（２.４μＭ合計鎖濃度）、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７.２）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１ｍＭＥＤＴＡおよび０．０３％カリウムサルコシレートを含有するものであった。反応混合物を８０℃まで加熱し、次いで、約４ないし６時間にわたって４℃まで冷却した。次いで、アニールした試料を１ｃｍの石英キュベットに移し、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピューターと接続した温度制御した６×６試料ホールダーを含有するＶａｒｉａｎＣａｒｙモデル２Ｅ分光光度計を用い、Ｔｍを温度の関数として２６０ｎｍにおける吸光度によってモニターした。温度を１℃／分のランプ速度にて５℃から８０℃まで変化させた。各溶融体プロフィールについてのＴｍを、吸光度−対-温度に対応する曲線の第１次導関数の最大に対応する点として決定r.。以下の表ＩＩは結果をまとめる。これらは、交互ＭＰＲｐヌクレオシジル間結合を有するこれらのオリゴマーはＲＮＡ標的にハイブリダイズした場合に改良された結合安定性を呈することを検討する。実施例Ｂヘビ毒ホスホジエステラーゼによる５’−エキソヌクレアーゼ分解に対するオリゴマーの安定性以下の実施例は、（ａ）全てのジエステル（ＤＥ）骨格と比較した２’−デオキシＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ骨格の増強されたヌクレアーゼ安定性；および（ｂ）２ ’−デオキシＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ骨格と比較した２’−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ骨格の増強されたヌクレアーゼ安定性を示す。以下の配列：5'-CTCTCTCTCTCTCTA-3'［配列番号１］（２’−デオキシ糖について）；あるいは：5'-CUCUCUCUCUCUCUA-3'［配列番号２］（２’−Ｏ−メチル糖について）を有するオリゴマーを評価した。クロタラス・アダマンテウス(crotalus adamanteus)からのヘビ毒ホスホジエステラーゼＩ（ＰＤＥ−Ｉ）はＵＳ Biochemicals,Inc.から購入した。全てのジエステル（ＤＥ）骨格オリゴマーはOligos等から購入した。他のオリゴマーは前記した実施例に記載したごとくに合成した。各オリゴマーのアリコット（０．０７５Ａ₂₆₀単位）をピペットでポリプロピレン製マイクロ遠心管に入れ、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ^TM真空遠心機（Savant,Inc. ）で乾燥した。次に、該管を氷上に置き、ＰＤＥ−Ｉのアリコットを各管（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.８、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０.４％グリセロールの９５μＬ中の０.１９単位）に添加した。ゼロ時点の試料をアセトニトリル（３５μｌ）で直ちに希釈し、ドライアイス／イソプロパノール浴中で凍結し、後で分析するために−２０℃で保存した。次いで、残存する試料を３７℃で水浴中に入れた。各特定の時点につき試料を水浴から取り出し、アセトニトリルで希釈し、ゼロ時点の試料につき記載したごとくに凍結した。ヌクレアーゼ分解実験の最後において、試料を個々に解凍し、モデル1２６バイナリグラジエントポンプモジュールおよびモデル１６８ダイオードアレイ検出器を装備したＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ装置を用い、逆相ＨＰＬＣによって直ちに分析した。２０００μｌ試料ループを備えた手動インジェクターを用いて試料をカラムに注入した。ＶｙｄａｃＣ４ Proteinカラムをこれらの実験で用いた（Ｖｙｄａｃカタログ番号９０１０１９、４．６ｍｍ内径×２５０ｍｍ長）。デュアル溶媒系：緩衝液Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０）中の１％アセトニトリル；緩衝液Ｂ＝５０ｍＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）中の５０％アセトニトリルで溶出を行った。溶媒の液速を、ランの最初の１分間にわたって０.０５から１.０ｍｌ／分まで増大させ、ランの残りについては１.０ｍｌ／分に維持した。各骨格についてのグラジエント条件は以下の通りであった：全ての−ＤＥ骨格−５−２５％緩衝液Ｂ（２.５−９分）、２５−４５％緩衝液Ｂ（９.０−２２.５分）、４５−１００％緩衝液Ｂ（２２ .５−２８.０分）；２’−デオキシＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ骨格−５−３５％緩衝液Ｂ（２.５−１２.５分）、３５−５０％緩衝液Ｂ（１２.５−２２.５分）、５０ − １００％緩衝液Ｂ（２２.５−２７.５分）；２’−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥ骨格 −５−５０％緩衝液Ｂ（２.５−１７.５分）、５０−６５％緩衝液Ｂ（１７.５−２７.５分）、６５−１００％緩衝液Ｂ（２７.５−３１.０分）。（分解しなかった）各骨格オリゴマーについての保持時間は以下の通りであった：全ての−ＤＥ１５.７分２’−デオキシ−ＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ１８.５分２’−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ１８.６分ピークの初期溶出の様相および全長オリゴマーに対応するピークの面積の減少（または完全な喪失）によって分解を判断した。ゼロ時点に対して３７℃における各時点につきピーク高およびピーク面積を比較することによってパーセント分解を決定した。次いで、ｌｏｇ（％全長）一対一時間をプロットし、ｌｏｇ（５０％）＝１.６９９に対応する値を見い出すことによって、ＰＤＥ−Ｉの存在下における各オリゴマーについての半減期を決定した。以下の結果は２の別々の実験から得た。実施例ＣＨｅＬａ細胞からの細胞質溶解物における２’−デオキシＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥオリゴマーの安定性本実施例は、２’−デオキシ混合骨格オリゴマーが、実験の間にわたって検出限界内でＨｅＬａ細胞溶解物で完全に安定であることを示す。ＨｅＬａ細胞の細胞質溶解物はEndotronics,Inc.（ミネアポリス、ＭＮ）から購入した。この調製物は、５×充填細胞容量中の低張bounce溶解物である。２− （Ｎ−モルホリノ）エタンスルホネート（ＭＥＳ、０.５Ｍ溶液、ｐＨ６.０）０ .４ｍｌを氷上の細胞溶解物３.６ｍｌに添加し、温和な撹拌にて混合することによって、それを緩衝化した。オリゴマーのアリコットを乾燥し、次いで、前記実施例に記載したごとくにＨｅＬａ細胞溶解物（９５μｌ）で希釈した。次いで、試料を３７℃でインキュベートし、実施例Ｂに記載したごとくに分析した。実施例ＤＣＯＳ−７細胞からの細胞質溶解物における２’−デオキシＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥおよび２’−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ骨格オリゴマーの安定性以下の実施例は２’−デオキシＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥ［配列番号１］および２’ −Ｏ−メチルＭＰ（Ｒｐ）／Ｄｅ［配列番号２］骨格オリゴマーは、ＣＯＳ−７細胞溶解物、従って、同一の配列を有する対応する全ての−ＤＥ骨格オリゴマーにおける分解に対して少なくとも５００倍安定であることを示す。これらの実施例用のＣＯＳ−７細胞溶解物は以下のごとくに調製した。ＣＯＳ −７細胞は９０％密集まで増殖させ、０.２５％トリプシンを用いてバラバラにし、遠心によって収集した。細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、次いで、２０℃で一晩凍結した。次に、ペレットを約等容量の溶解緩衝液（２ .５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.２、２.０ｍＭＭｇＣｌ₂、０.１％ＮＰ−４０）に再懸濁し、１ｍｌの滅菌したポリプロピレン製ピペットで１０回吸い上げ、吸い下げし、次いで、１００００×Ｇで５分間遠心した。次いで、得られた上清の約４０％を用いて、２０ストロークにてのＤｏｕｎｃｅホネゲナイザー（Ａタイプの乳棒）で細胞ペレットを溶解させた。次いで、この懸濁液を前記したごとくに遠心し、上清を、第１の再懸濁からの上清の残りと合した。得られた溶液は、元の充填細胞ペレットの約１〜１.５倍容量である。得られた細胞溶解物からのアリコットを、オリゴマーとのインキュベーションに先立ち、２５ｍＭトリス− アセテート（最終ｐＨ７.４）または２５ｍＭＭＥＳ（最終ｐＨ６.０）で緩衝化した。各オリゴマーのアリコット（０.０７５Ａ₂₆₀単位）を滅菌したポリプロピレン製マクロ遠心管中で乾燥し、次いで、氷上にて、ＣＯＳ−７溶解物１０μｌに再懸濁した。水（９０μｌ）およびアセトニトリル（３５μｌ）を直ちにゼロ時間の試料に添加し、それらをドライアイス／エタノール浴中で凍結させ、後の分析のために−２０℃で保存した。次いで、残りの試料を水浴中で３７℃でインキュベートした。特定の時点で、試料を水浴から取り出し、水およびアセトニトリルで希釈し、ゼロ時点の対照について記載したごとくに正確に凍結した。細胞溶解物とのインキュベーションの後、試料を個々に解凍し、水（５３５μ ｌ）で希釈し、実施例Ｂに記載したごとくに逆相ＨＰＬＣによって直ちに分析した。分解を、実施例Ｂに記載したごとくに、得られたクロマトグラムから決定した。結果を表ＶＩにまとめる。実施例Ｅエシェリキア・コリ（Escherichia coli）からの細菌細胞溶解物における２’ −デオキシＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ骨格オリゴマーの安定性以下の実施例は、２’−デオキシＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥオリゴマーは、イー・コリ(E．coli)からの細胞溶解物において、同一の配列を有する全ての−ＤＥオリゴマーよりも少なくとも２０００倍安定であることを示す。イー・コリ細胞溶解物は以下のごとくに調製した。遠心によって約２×１０³¹ 細胞をペレット化し、トリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７.５）１０ｍｌに再懸濁し、室温で５分間インキュベートした。次に、ジチオスレイトールおよびリゾチウムを各々２ｍＭおよび１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、得られた懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、混合物を、氷上にて、１０回軽く音波処理し、７０００ｒｐｍで２０分間遠心した。目視観察に基づいて、この手法は細胞を十分には溶解させなかったと判断され、従って、上清（容量＝５ｍｌ）を収集し、４℃で貯蔵し、細胞ペレットをトリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７.５）１ｍｌに再懸濁させた。再懸濁させた細胞ペレットを５ラウンドの凍結／解凍に暴露し、次いで、８０００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた上清（約７０μｌ）を次いで前記工程からの上清（約５ｍｌ）と合し、６０００×Ｇで５分間遠心していずれの残存する夾雑物もペレット化した。最終上清は、元の細胞ペレット容量（１００μｌ）の約５７倍容量中に約５０％の溶解細胞を含有すると見積もられた。オリゴマーのアリコット（０.０５０Ａ₂₆₀単位）を滅菌したポリプロピレン製のミクロ遠心管中で乾燥し、氷上、９５μｌの細胞溶解物に再懸濁した。３７℃ におけるインキュベーション、ＨＰＬＣ分析、およびオリゴマー分解の定量を実施例Ｂに記載したごとくに行った。結果を以下にまとめる。実施例Ｆスタフイロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)からの細菌細胞溶解物における２’−デオキシＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ骨格オリゴマーの安定性［配列番号１］以下の実施例は、２’−デオキシＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥオリゴマーは、エス・アウレウス(S．aureus)からの細胞溶解物において、同一の配列を有する全ての− ＤＥオリゴマーよりも少なくとも４００倍安定であることを示す。エス・アウレウス細胞溶解物は、以下の就職：（ｉ）約４×１０¹⁰細胞を含有する細胞ペレットで溶解を行い；（ｉｉ）リゾチウムの代わりにリゾスタフィンょ用い（５００単位、Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）；および（ｉｉｉ）合計１０回の凍結／解凍サイクルを５回のものの代わりに使用した以外は、実施例４でイー・コリについて記載したごとくにエス・アウレウス細胞溶解物を調製した。３７℃におけるオリゴマーとのインキュベーション、ＨＰＬＣ分析およびクロマトグラムからのオリゴマー分解の測定は、実施例Ｅでイー・コリでの実験につき記載したごとくに正確に行った。結果を以下にまとめる。実施例Ｇ単一用量静脈内投与に続く［³Ｈ］−標識した全ての−２’−Ｏ−メチルＭＰ／ＤＥオリゴマーの安定性本実験で用いたオリゴマーは以下の配列を有していた：ここに、括弧内の全てのヌクレオシドは２’−Ｏ−メチルリボシドであった。オリゴマー３３１１−１なる語の「［³Ｈ］オリゴマー」は５’−Ｃヌクレオシドおよび隣接２’−Ｏ−メチルＣヌクレオシドを連結するメチルホスホネート結合中にトリチウム化メチル基を有していた。オリゴマー３３１１−２なる用語の「冷オリゴマー」はトリチウム標識を有していなかった。後記するごとく、前記オリゴマーの２の異なる処方を動物への投与およびサンプリングに使用した。（ａ）血圧レベル３３１１−２（「冷オリゴマー」）２.５ｍｇを蒸留水中の５％デキスチロースの滅菌溶液５００μＬに溶解させた。３３１１−１（「［³Ｈ］オリゴマー」、特異的活性＋４００Ｃｉ／モル）を蒸留水中の５％デキスチロースの滅菌溶液２００μＬら溶解させた。両溶液を一緒に混合して、５ｍｇ／ｍの最終オリゴマー濃度；および１１１μＣｉ／ｍｌの放射能濃度とした。得られた試料を氷上に移して、動物への投与およびサンプリングに供した。雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（各々、約０．２４ｋｇ）に、内在させた尾静脈カニューレを介してこのオリゴマー混合物（動物当たり２７０μＬ、５ｍｇ／ｋｇ、３０μＣｉ）を投与した。血液試料（約２５０μＬ）を投与後２、５、１０、２０、３０、４５分、ならびに１、１.５、３および５時間に投与にカニューレを介して採取した。血液試料を直ちにＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒに移し、遠心して血清を得た。血清試料をドライアイス上で凍結し、次いで、ドライアイス上に移して分析のために研究所に送った。（ｂ）尿／糞３３１１−２（「冷オリゴマー」）０.６ｍｇおよび３３１１−３１の０. ６ｍｇ（「［³Ｈ］オリゴマー」、特異的活性−４００Ｃｉ／モル）を１×リン酸緩衝生理食塩水（１０×ストックから調製、ＧＩＢＣＯ）６００μＬに溶解させ、氷上に移して、投与およびサンプリングのために研究者に送った。到着に際し、この試料を４℃で保存した。雄Sｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（投与の時点で約８〜１０週齢）はＴａｃｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入した。投与の少なくとも２４時間先立ち、２匹の動物に、長期に内在させるＳ−２７頚静脈カテーテル（ＩＩＴＣ，Ｉｎｃ．，ＷｏｏｄｌａｎｄＨｉｌｌｓ，ＣＡ）を外科手術により植え込んだ。投与の日、動物を最も近いグラムに体重わけした。オリゴマー試料を適当なサイズのプラスチック製シリンジに吸い込んで、必要な用量０.１ｍｌまでの測定を可能とした。投与用シリンジを投与の直前および直後に秤量し、投与したオリゴマーの正確な量を重量につき測定した。各ラットに対する投与した現実の用量は０.４４および０.５４ｍｇ（１.２７ないし１.５３ｍｇ／ｋｇ体重）の間であった。尿および糞を投与の４、８、２４および４８時間後に採取した。これらの試料を排出直後に凍結し、全収集期間の間凍結した。次いで、尿試料を軽く解凍し、アリコットを取り出して、全放射能を測定した。次いで、尿試料をドライアイス上で凍結させたまま、分析のために研究所に送った。（ｃ）試料の処理および分析血清試料を氷上で解凍し、２のアリコット（５μＬ）を取り出し、液体シンチレーションカウンティングによって全放射能の測定のためにシンチレーション流体に添加した。血清のアリコット（１００μＬ）を以下のごとくにＨＰＬＣ分析のために加工した。まず、１００ｍＭのＥＤＴＡ（二ナトリウム塩）１.４μ Ｌを、内部標準として使用する３３１１−２（「冷オリゴマー」）０.１ＯＤ₂₆₀ 単位と共に添加した。次に、アセトニトリル中のＮＰ４０洗剤の１％溶液１００ μＬを添加し、試料をミクロ遠心管中で回転させて、蛋白質を除去した。上清を取り出し、別の容器に移し、真空下で乾燥した。次いで、得られた残渣を酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ、ｐＨ７）１００μＬに再懸濁した。５０ｍＭＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７.０）１０μＬおよび内部標準としての３３１１−２（「冷オリゴマー」）を尿１００μＬに添加することによって、尿試料を加工した。モデル１２６デュアルグラジエント溶媒モジュールおよびモデル１６８ダイオードアレイ検出器を装備したＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ^TM装置でＨＰＬＣ分析を行った。充填したＦｌｏ／Ｏｎｅベータ検出器を、トリチウムカウントの測定用に使用した。ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７.０）中の２.５％ないし４５％アセトニトリルの直線グラジエント、液速＝１.０ｍＬ／分を用いて、クロマトグラフィーをＶｙｄａｃＣ４カラムで行った。２６０ｎｍでモニターし、内部標準（３３１１−２）の溶出時間を測定することによって、全長オリゴマーを同定した。同一保持時間に対応するピークにおける放射能を積算し、合計積算放射能に対して比較して、各試料におけるパーセント全長オリゴマーを測定した。以下の表は結果をまとめる。本実施例は、全ての−２’−Ｏ−メチル、交互ＭＰ／ＤＥオリゴマーは、約１時間まで、血液中で実質的に分解されていないことを示した。また、オリゴマーの有意分量が、非分解形態で尿に排出された。本発明者らは、本実施例より、この特別の骨格タイプを有するオリゴマーは、医薬適用に対し、in vivoで十分に安定であると結論する。実施例Ｈ種々の骨格修飾（非キメラ）オリゴマーのヌクレアーゼ安定性実験本実施例で記載した各実験において、以下の配列：5'-CTCTCTCTCTCTCTA-3'［配列番号１］（２’−デオキシ糖につき）；または5'-CUCUCUCUCUCUCUA-3'［配列番号２］（２’−Ｏ−メチル糖につき）を有する種々の骨格修飾オリゴマーを評価した。全ての−ジエステル（ＤＥ）骨格オリゴマーはＯｌｉｇｏｓ等から購入した。他の骨格オリゴマーは前記実施例に記載したごとくに合成した。（ａ）精製したヘビ毒ホスホジエステラーゼの存在下における安定性実験クロタルス・アダマンテウス(crotalus adamanteus)からのヘビ毒ホスホジエステラーゼＩ（ＰＤＥ−Ｉ）はＵＳ Biochemicals,Inc.から購入した。各オリゴマーからのアリコット（０.０７５Ａ₂₆₀単位）をピペットでポリプロピレン製ミクロ遠心管に入れ、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ^TM真空遠心管（Savant,Inc.）で乾燥した。次に、該遠心管を氷上に置き、ＰＤＥ−Ｉのアリコットを各管（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.８、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０.４％グリセロールの９５μＬ中の０.１単位／ｍＬ）に添加した。ゼロ時点試料を直ちにアセトニトリル（３５μＬ）で希釈し、ドライアイス／イソプロパノール浴中で凍結し、後の分析のために−２０℃で保存した。次いで、残存する試料を３７℃の水浴に入れた。次いで、各特定時点についての試料を水浴から取り出し、アセトニトリルで希釈し、ゼロ時点試料につき記載したごとくに凍結した。ヌクレアーゼ分解実験の最後において、試料を個々に解凍し、モデル１２６バイナリグラジエントポンプモジュールおよびモデル１６８ダイオードアレイ検出器を装備したＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ装置を用い、逆相ＨＰＬＣによって、直ちに分析した。２０００μＬ試料ループ付きの手動インジェクターを用いるカラムに試料を注入した。ＶｙｄａｃＣ４Ｐｒｏｔｅｉｎカラムをこれらの実験で用いた（Ｖｙｄａｃカタログ番号９０１０１９、４.６ｍｍ内径 ×２５０長）。デュアル溶媒系：緩衝液Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ、ｐＨ７.０）中の１％アセトニトリル；緩衝液Ｂ＝５０ｍＭＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）中の５０％アセトニトリルで溶出を行った。溶媒の液速はランの最初の１分間にわたって０.０５から１.０ｍＬ／分まで増加させ、残りのランについては１.０ｍＬ／分に保持した。各骨格についてのグラジエント条件は以下の通りであった：全ての−ＤＥ骨格−５−２５％緩衝液Ｂ（２.５−９分）、２５−４５％緩衝液Ｂ（９.０−２２.５分）４５−１００％緩衝液Ｂ（２２ .５−２８.０分）；２’−デオキシＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ骨格−５−３５％緩衝液Ｂ（２.５−１２.５分）、３５−５０％緩衝液Ｂ（１２.５−２２.５分）、５０ −１００％緩衝液Ｂ（２２.５−２７.５分）；２’−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ骨格−５−５０％緩衝液Ｂ（２.５−１７.５分）、５０−６５％緩衝液Ｂ（１７.５−２７.５分）、６５−１００％緩衝液Ｂ（２７.５−３１.０分）。各骨格オリゴマー（非分解）についての平均保持時間は以下の通りであった：全ての−ＤＥ：１５.７分２’−デオキシＭＰ（Ｒ_p）／ＤＥ１８.５分２’−Ｏ−メチルＭＰ（Ｒ_p）／２’−Ｏ−メチルＤＥ１８.６分初期に溶出したピークの様相および全長オリゴマーに対応するピークの面積の減少（または完全な喪失）によって分解を判断した。（ｂ）ＨｅＬａ細胞溶解物における安定性実験ＨｅＬａ細胞の細胞質溶解物はEndotronics,Inc.（ミネアポリス、ＭＮ）から購入した。この調製物は５×充填細胞容量中の低張ｄｏｕｎｃｅ溶解物である。２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホネート（ＭＥＳ、０.５Ｍ溶液、ｐＨ６. ０）０.４ｍＬを氷上の細胞溶解物３.６ｍＬに添加し、温和な撹拌で混合することによってそれをｐＨ６.０に緩衝化した。オリゴマーのアリコットを乾燥し、次いで、前記実施例で記載したごとくにＨｅＬａ細胞溶解物（９５μＬ）で希釈した。次いで、試料を３７℃でインキュベートし、正確に前記実施例に記載したごとくに逆相ＨＰＬＣによって分析した。（ｃ）アフリカミドリザル腎臓ＣＯＳ−７細胞からの細胞溶解物における安定性実験これらの実験についてのＣＯＳ−７細胞溶解物は以下のごとくに調製した。ＣＯＳ−７細胞を９０％密集まで増殖させ、０.２５％トリプシンを用いてバラバラにし、遠心によって収集した。細胞ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、次いで、−２０℃で一晩凍結させた。次に、ペレットをほぼ等容量の溶解緩衝液（２.５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.２、２.０ｍＭＭｇＣｌ₂、０. １％ＮＰ−４０）に再懸濁し、滅菌した１ｍＬのポリプロピレン製ピペットを通して吸い上げ、吸い下げし、次いで、１００００×Ｇで５分間遠心した。次いで、得られた上清の約４０％を用いて、２０ストロークにてのｄｏｕｎｃｅホネゲナイザー（タイプＡ乳棒）中で細胞ペレットを溶解させた。次いで、この懸濁液を前記したごとくに遠心し、上清を、第１の再懸濁からの上清の残りと合した。得られた溶液は元の充填細胞ペレットの約１〜１.５倍容量である。得られた細胞溶解物からのアリコットを、オリゴマーとのインキュベーションに先立って、２５ｍＭトリス−アセテート（最終ｐＨ７.４）または２５ｍＭＭＥＳ（最終ｐＨ６.０）いずれかで緩衝化した。各オリゴマーのアリコット（０.０７５Ａ₂₆ ₀ 単位）を滅菌ポリプロピレン製ミクロ遠心管中で乾燥し、次いで、氷上のＣＯＳ−７細胞溶解物１０μＬに再懸濁した。水（９０μＬ）およびアセトニトリル（３５μＬ）をゼロ時点試料に直ちに添加し、それらをドライアイス／エタノール浴中で凍結し、後の分析のために−２０℃で貯蔵した。次いで、残存する試料を３７℃の水浴中でインキュベートした。特定の時点において、試料を水浴から取り出し、水およびアセトニトリルで希釈し、正確にゼロ時点対照につき記載したごとくに凍結した。細胞溶解物とのインキュベーションに続き、試料を個々に解凍し、水（５３５μＬ）で希釈し、前記したごとくに逆相ＨＰＬＣによって直ちに分析した。（ｄ）エシェリキア・コリからの細胞溶解物における安定性実験イー・コリ細胞溶解物を以下のごとくに調製した。約２×１０¹¹胞を遠心によってペレット化し、トリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７.５）１０ｍＬに再懸濁し、室温にて５分間インキュベートした。次に、ジチオスレイトールおよびリゾチウムを各々２ｍＭおよび１ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、得られた懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、混合物を氷上で軽く１０回音波処理し、７０００ｒｐｍで２０分間遠心した。目視検査に基づいて、この手法は細胞を十分には溶解しなかったと見積もられ、従って、上清（容量＝５ｍＬ）を収集し、４℃で貯蔵し、細胞ペレットをトリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７ .５）に再懸濁した。再懸濁した細胞ペレットを５ラウンドの凍結／解凍に暴露し、軽く音波処理して染色体ＤＮＡを破壊し、次いで、８０００ｒｐｍで５分間遠心した。次いで、得られた上清（約７００μＬ）を前記工程からの上清（約５ｍＬ）と合し、６０００×Ｇで５分間遠心して、いずれの残存する夾雑物もペレット化した。最終上清は、元の細胞ペレット容量（１００μＬ）の約５７倍中に約５０％の溶解された細胞を含有すると評価された。オリゴマーのアリコット（０.０５０Ａ₂₆₀単位）を滅菌ポリプロピレン製ミクロ遠心管中で乾燥し、氷上の細胞溶解物９５μＬに再懸濁した。３７℃でのインキュベーション、ＨＰＬＣ分析、およびオリゴマー分解の定量を正確に前記したごとくに行った。（ｅ）スタフィロコカル・アウレウス(Staphylococcal aureus)からの細胞溶解物における安定性実験エス・アウレウス(S．aureus)細胞溶解物は、以下の修飾、（ｉ）溶解は約４×１０¹⁰細胞を含有する細胞ペレットで行った、（ｉｉ）リゾチウムの代わりにリゾスタフィンを使用した（５００単位、Sigma,Inc.）；および(iii)合計１０の凍結／解凍サイクルを５回のものの代わりに使用した以外はイー・コリについて前記したごとくに調製した。３７℃におけるオリゴマーとのインキュベーション、ＨＰＬＣ分析およびクロマトグラムからのオリゴマー分解の測定を、正確に前記実施例でイー・コリの実験につき記載したごとくに行った。結果ゼロ時点対照に対して、各実験における各時点についてのピーク高およびピーク面積を比較することによって、パーセント分解を決定した。次いで、ｌｏｇ（％全長）−対−時間をプロットし、ｌｏｇ（５０％）＝１. ６９９に対応する値を見い出すことによって、ＰＤＥ−Ｉの存在下における各オリゴマーについての半減期を決定した。以下の表はこれらの実験からの結果をまとめる。生物学的培地における骨格アナログの分解率実施例ＩＲｐキラルダイマーから調製した混合塩基配列を含有するオリゴマーにてのＲＮＡ標的に対する増強された結合安定性本実施例に記載する方法に従ってオリゴマーを合成し、それは生物学的に関連するｍＲＮＡ標的に相補的な混合オリゴヌクレオチド配列を有していた。Ｔｍ測定は前記実施例に記載した方法で行った。以下の表ＸおよびＸＩに記載したデータは、ＭＰ＜ＲｐリッチＭｐ＜ＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥ交互の順で、相補的ＲＮＡ標的に対する結合親和性が増加したことを示す。実施例Ｊ（ＣＴ）₇Ａモデル配列と共にＲｐメチルホスホネート結合を含有する異なる骨格タイプのＴｍおよび結合親和性の比較前記実施例に記載した方法により、オリゴマーセットにつき、Ｔｍおよび結合親和性決定を行った。以下の表は種々の異なる骨格（各オリゴマーは同一のワトソン−クリック水素結合塩基配列を有する）につき決定した結合データをまとめる。２’−Ｏ−メチル糖を有するオリゴマーはチミジンの代わりにウリジン塩基を有していた。結果を以下の表ＸＩＩに記載する。このデータは、キラル的に純粋なＲｐ−ＭＰ／ＤＥ交互骨格を有するオリゴマーは、Ｒｐリッチの全ての−ＭＰ骨格を有する同一配列のオリゴマーと比較して、増強された結合親和性を呈することを示す。これらの観察は、２’−Ｏ−メチルリボフラノース糖を持つヌクレオシドを有するオリゴマーにも当てはまる。ＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥ骨格を有するオリゴマーは、対応するホスホロチオエートオリゴマーよりも高い結合親和性を有することが示された。加えて、全ての２’−Ｏ−メチルリボフラノシルヌクレオシドを有するＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥオリゴマーは、同一のヌクレオシド塩基配列を有する通常のホスホジエステルオリゴマーよりも高い結合親和性を有していた。実施例Ｋ非真核生物レポーター遺伝子、クロラムフェニコールトランスフェラーゼのスプライスアクセプター部位に対して標的化された交互ＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥアンチセンスオリゴマーでの細胞培養における蛋白質合成の阻害遺伝子発現を阻害しまたは減少させる本発明のオリゴマーの能力をさらに示すために、以下の実施例は、真核生物細胞培養系において選択的に蛋白質合成を阻害する本発明のＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥアンチセンスオリゴマーの能力を説明する。ＣＯＳ−７細胞を標的レポーター遺伝子または対照非標的レポーター遺伝子いずれかをコードするプラスミドで一時的にトランスフェクトした。次いで、これらの細胞を本発明の混合アンチセンスオリゴマーまたは対照オリゴマーで処理し、次いで、レポーター遺伝子の発現につきアッセイした。プラスミド以下のプラスミドを本実施例で使用した。ｐＧ１０３５：ｐＲｃ／ＣＭＶベクターに挿入した、スプライサーＣＡＴｐＧ１０３６：ｐＲｃ／ＣＭＶベクターに挿入した、野生型ＣＡＴｐＧ１０４０：ｐＲｃ／ＣＭＶベクターに挿入した、ＵＣＡＴｐＧＬ２：ルシフェラーゼ発現プラスミド（Promega）ｐＳＶβ：β−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（Clonetech）プラスミドｐＧ１０３５、ｐＧ１０３６およびｐＧ１０４０の記載は以下の通りである。１．ｐＧ１０３５（スプライサーＣＡＴ）およびｐＧ１０３６（野生型ＣＡＴ）ならびに合成スプライス部位の配列Ａ．プラスミドｐＧ１０３６を創製するのに使用した野生型ＣＡＴ遺伝子の配列：Ｂ．スプライサーＣＡＴおよびプラスミドｐＧ１０３５を創製するためにＣＡＴ暗号配列内に挿入したイントロンの全配列：イントロンをそれに挿入したＣＡＴ遺伝子の領域を前記配列Ａに示す。野生型ＣＡＴＤＮＡ（Pharmacia）をｐＲｃ／ＣＭＶ(Invitrogen)に挿入してプラスミドｐＧ１０３６を得た。該配列はｍＲＮＡとして示す。塩基４０９および４１０をｐＧ１０３５に対する比較のために標識する。前記配列Ｂとして示す合成イントロンをＣＡＴＤＮＡに挿入してプラスミドｐＧ１０３５を得た。成熟ｍＲＮＡ配列は上方ケースに示し、イントロン配列は下方ケースに示す。スプライスドナーの標準グアノシンは標識した＋４０９であり、これはＣＡＴオープンリーディングフレームの塩基４０９に対応する。イントロンの第１の塩基は標識した１である。標準分岐地点アデノシンは塩基３９であって、標準イントロンスプライスアクセプターグアノシンはイントロンの塩基８７である。塩基４１０はＣＡＴオープンリーディングフレームの回復を記す。オリゴマーをそれに対して標的化する配列には下線を施す。コンセンサススプライス部位塩基はボールドフェースのイタリック体で示す(Smith et al.，1989;Green 1986)。合成ＤＮＡＰＣＲプライマーを用いてクローンｐＧ１０３５を創製して、オープンリーディングフレームの最初の２／３および合成イントロンの半分を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩ５’断片ならびにイントロンの第２の半分およびオープンリーディングフレームの最後の１／３を含有するＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ断片を得た。これらを３−方向連結にてＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ切断ｐＲｃ／ＣＭＶと合して最終のプラスミドを得た。イントロンを含有する人工ＣＡＴ遺伝子をスプライサーＣＡＴと命名する。前記のものに適用可能な文献はSm ith CWJ，Patton JG,およびNadal−Ginard B，(1989)、「遺伝子発現の対照における交互スプライシング(Alternative splicing in the control of gene expre ssion)」、Annual Reviews in Genetics 23:527-77; Green，MR(1986)、「プレ −ｍＲＮＡスプライシング(Pre-mRNA splicing)」、Annual Reviews in Genetic s 20:671-708を含む。２．ｐＧ１０４０（ＵＣＡＴ）５’−非翻訳領域およびアミノ末端野生型ＣＡＴ：ｐＧ１０４０、ＵＣＡＴ：ＡＵＧスタートコドンの回りの野生型およびｐＧ１０４０ＵＣＡＴの配列を示す。オリゴマーについての標的部位を命名し、下線を施し、各標的部位に対するキメラオリゴマーの数を真下に示す。ＵＣＡＴは合成ＤＮＡＰＣＲプライマーを用いて野生型ＣＡＴＤＮＡ (Pharmacia)から作成した。得られた断片はＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）、ＮｏｔＩ（３’末端）断片をベクターｐＲｃ／ＣＭＶ(Invitrogen)にクローン化した。オープンリーディングフレームの第１のアデノシンは＋１と命名される。野生型およびｐＧ１０４０の間のアミノ酸変化は保存的である。スプライスアクセプター部位オリゴマー：３３７３−１Ａ、２４量体、２’−Ｏ−Ｍｅ（ＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥ）３３７３１１Ｂ，１８量体、２’−Ｏ−Ｍｅ（ＭＰ（Ｒｐ）／ＤＥ）ＸＶ−７、２４量体、全てのホスホロチオエート：細胞調製および処理トランスフェクション開始の前日に、１２ウェルプレート様式にて、ＣＯＳ７細胞を１.５×１０⁵細胞／ウェルにて平板培養した。全ての培養を３７℃で維持した。翌日、トランスフェクションミックスを調製した。１２ウェルプレートの各ウェルにつき、オリゴマー（０.１、０.３または１.０μＭ）を、Optimem(Gib co/BRL)中の１μｇのｐＧＬ２またはｐＳＢβ＋標的ＣＡＴプラスミドの１μｇおよびやはりOptimemの０.５ｍｌ中の１８.７５μｇのTransfectam（交互オリゴマー用、Promega）またはLipofectamine（全てのＰＳオリゴマー用、Promega）と合した。これらの量は、合計１ミリリットル中の、各々、６.９または４.５または２.０ないし１の、オリゴマー＋ＤＮＡに対するカチオン性脂質の比を与えた。ｐＧＬ２およびｐＳＶβはトランスフェクションおよびオリゴマー特異性対照として供した。培養培地をアスピレーターで取り出し、細胞をウェル当たりOptimem(Gibco/BR L)１ｍｌで２回濯いだ、次いで、トランスフェクションミックス１ｍｌを各ウェルに添加した。細胞を１６時間、トランスフェクションミックス中で培養した。該ミックスを除去し、完全な培養培地(ＤＭＥＭ＋１０％胎児ウシ血清およびペニシリン／ストレプトマイシンストックの１／１００希釈、全てGibco/BRLからのもの)１ｍｌで置き換え、細胞をさらに５時間インキュベートした。ＰＢＳ中で２回濯ぐことによって細胞溶解物を調製し、１×リポーター溶解緩衝液(Promega)０.５ｍｌで処理した。バラバラにし溶解した細胞をピペットで１ .５ｍｌの管に入れ、ＣＯ₂／ＥｔＯＨで１回凍結し、解凍した。次いで、粗製溶解物を１０分間遠心して細胞夾雑物をペレット化し、上清を回収し、直接アッセイするか、または−２０℃で凍結した。次いで、細胞溶解物をＣＡＴ、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ活性につきアッセイし、合計蛋白質濃度を後記するごとくに測定した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイプロトコルこのアッセイは一般に以下のごとくに行った。まず、以下の反応混合物を各試料について調製した：６５ｍｌ０.２５Ｍトリス、ｐＨ８／０.５％ＢＳＡ４μｌ ¹⁴Ｃ−クロラムフェニコール、５０ｎＣｉ／μｌ (Dupont)、および５μｌ５ｍｇ／ｍｌｎ−ブチリル補酵素Ａ（Pharmacia）ＣＡＴストック(Promega)を０.２５Ｍトリス、ｐＨ８／０.５％ＢＳＡ中に１：１０００、１：１００００および１：９００００に系列希釈することによってＣＡＴ標準曲線を調製した。元のストックＣＡＴは７０００単位／ｍｌであった。次いで、ＣＡＴ溶解物を、最終容量５０ｍｌとして、トリス／ＢＳＡ緩衝液を含む標識管に添加した。次いで、反応混合物７４ｍｌを各管に添加し、これを次いで、典型的には、３７℃のオーブン中、約１時間インキュベートした。５００μｌのプリスタン／混合キシレン（２：１）(Sigma)を各管に添加することによって反応を停止した。次いで、管を２分間撹拌し、５分間回転した。上相４００ｍｌを５ｍｌのScinti verse(Fisher)を含むシンチレーションバイアルに移した。次いで、試料をPacka rdシンチレーションカウンターで計数した。ルシフェラーゼアッセイプロトコル本アッセイは標準的な手法に従って一般に以下のごとくに行った。溶解物２０ μｌをルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)１００μｌと合し、(Promegaによって推奨されるごとくに)２０秒間内シンチレーションカウンター(Packard)で計数した。 β−ガラクトシダーゼアッセイプロトコル本アッセイは一般に以下のごとくに行った。０.２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０／０.５％ＢＳＡ中に１：１０００および１：９０００と系列的に希釈することによってβ−ｇａｌ標準曲線を作成した。ストックβ−ｇａｌは１０００単位／ｍｌ(Promega)であった。かくして、１：１０００希釈については、１μ ｌストックβ−ｇａｌ酵素を１０００μｌトリス／ＢＳＡ緩衝液中に希釈し、１：９０００希釈については、１００μｌの１：１０００希釈をさらに１０００μ ｌのトリス／ＢＳＡ緩衝液中に希釈した。次いで、ウェル当たり溶解物７５μｌ(未処理マクイロタイタープレート、Cor ning)を添加した。７５μｌの２×β−ｇａｌ反応緩衝液(Promega)を各管に添加した。インキュベーションは典型的には３７℃のオーブン中、約１〜１.５時間進行させた。プレートを、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)でＡ₄ ₀₅ （４０５ｎｍ）にて読み取った。蛋白質アッセイプロトコル試料を未処理マイクロタイタープレート(Corning)にて調製した。一連の蛋白質標準を以下のごとくに二連で調製した。１．６μｌ１×レポーター溶解緩衝液（Promega）２．６μｌ７５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（Promega）３．６μｌ１００ｍｇ／ｍｌＢＳＡ４．６μｌ２５０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ５．６μｌ４００ｍｇ／ｍｌＢＳＡ６．６μｌ５００ｍｇ／ｍｌＢＳＡ７．６μｌ１０００ｍｇ／ｍｌＢＳＡ８．６μｌ１５００ｍｇ／ｍｌＢＳＡウェル当たり６μｌの溶解物を添加し、続いて、ウェル当たり３００μｌのCo omassie Proteinアッセイ試薬(Pierce)を添加した。次いで、個々の試料プレートをマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)でＡ₅₇₀にて読み取った。ＣＡＴ活性値、を溶解物の蛋白質含量および所与の他のパラメーターに対して正規化した。これらの実験の結果は以下の通りである。抗−スプライス部位オリゴマー−対−ｐＧ１０３５およびｐＧ１０３６（アンチセンスオリゴマーによるスプライシング阻害）高Ｔｍオリゴマーによるスプライスアクセプター部位へのアクセスの滅菌阻害は２の可能な結果を有する：（１）スプライシングは起こらず、イントロンを飛ばして、ｍＲＮＡにミスセンスまたはナンセンス配列が残る、（２）強制的な交互スプライシングが起こり、価値ある暗号配列がｍＲＮＡから喪失されるか、あるいは（３）スプライシングが破壊され、プレ−ｍＲＮＡが破壊される。これらの結果のいずれも生物学的に不活性なミスセンスまたはナンセンスｍＲＮＡを生じ、あるいは不安定な分解されたＲＮＡを生じる。オリゴマーをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、溶解物を作成し、前記したごとくにアッセイした。全てのオリゴマーは培養培地中で１.０μＭ最終であった。結果はパーセント阻害±標準偏差として与える。Ｎ．Ｄ．＝測定せず。全ての試料を三連で行った。結果は、交互オリゴマーを用いてスプライス部位配列を標的化した場合に、ＣＡＴ発現の特異的阻害を示す。全てのホスホロチオエートオリゴマーの場合において、ｐＧ１０３６発現はｐＧ１０３５と同様に概略阻害され、これにより遺伝子発現に対する大きな非特異的効果が明らかとされた。結果は、細胞の非オリゴマー処理に対するパーセント遺伝子発現として与える。濃度は前記し、データ欄はマイクロモルで表す。ＣＡＴレベルは前記したごとくに三連で測定し、実験は複数回反復した。オリゴマーのＴｍは前記したごとくに測定した。これらの高Ｔｍオリゴマーが、用量依存的に、標的遺伝子ｐＧ１０３５の発現を阻害したことに注意されたい。該２４量体および１８量体は、１.０マイクロモルにおいて、各々、ＣＡＴ発現を７４％および９０％低下させる。いずれのオリゴマーも非スプライシングＣＡＴ遺伝子、ｐＧ１０３６の発現を有意に阻害した。ｐＧ１０３５に対する効果は一般にスプライシングの非特異的干渉によるものではないことを示すために、ｐＧＬ２をさらなる対照として使用した。ｐＧＬ２はルシフェラーゼ遺伝子をコードし、ｐＧ１０３５におけるイントロンに関係しないイントロンを含有する。ルシフェラーゼの発現は３３７３−１の２４Ａ量体または１８Ｂ量体によって阻害されないことに注意されたい。実施例Ｌ特異性測定単一または複数の誤対合した相補的遺伝子標的およびオリゴマーは、完全対合標的の、不完全非特異的標的からのオリゴマー識別を見積もる交差実験を提供した。本実施例は、実施例４１で使用したオリゴマーに関する０−または４−塩基の誤対合を有するＣＡＴｍＲＮＡ標的の調製を示す。ｐＧ１０４０（ＵＣＡＴ）およびｐＧ１０４２（ＵＣＡＴ４ｍｍ）５’−非翻訳領域およびアミノ末端およびオリゴマー：野生型ＣＡＴ：ｐＧ１０４０、ＵＣＡＴ：ｐＧ１０４２、ＵＣＡＴ４の誤対合：ｐＧ１０４０（ＵＣＡＴ）およびｐＧ１０４２（ＵＣＡＴ）４ｍｍの間の誤対合は星印（＊）で示す。これらのプラスミドによって生じたｍＲＮＡにおける全ての他の塩基は同一である。野生型ＣＡＴ遺伝子の配列を比較のために示す。オープンリーディングフレームの最初のアデノシンは＋１と命名される。オリゴマー標的部位には下線を施す。これらの標的遺伝子いずれかに対する所与のオリゴマーについては、本発明者らは、正確に定義した程度の誤対合を持つ対照標的を掌握していることは認識されるであろう。これは、以下の手法に例示される、完全な対合および正確に定義された誤対合標的に対する１のオリゴマーのテストを可能とする。ｐＧ１０４０、ＵＣＡＴ：ｐＧ１０４２、ＵＣＡＴの４の誤対合：オリゴマーＸＶ−２はｐＧ１０４０に対する完全な対合であるが、ｐＧ１０４２に対して４つの誤対合を有する。４つの公知の誤対合塩基における例外を除き同一である２の標的ｍＲＮＡに対するこの１のオリゴマーの相対的効果は、かくして、決定できる。プラスミドｐＧ１０４０およびｐＧ１０４２は、正確に突然変異されたＤＮＡ断片を増幅するための合成ＤＮＡＰＣＲプライマーを用いて作製した。次いで、断片をＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）、ＮｏｔＩ（３’末端）断片としてベクターｐＲｃ／ＣＭＶ(Invitrogen)にクローン化し、陽性クローンを同定した。誤対合は、当該手法で使用するＰＣＲプライマーの配列によって正確に制御でき、ＡＵＧコドンの丁度５’側の領域におけるシリーズのごとき正確な誤対合の定義された配列を作製できる。これは、以下の実施例で示される。１の誤対合：２の誤対合３の誤対合４の誤対合５の誤対合本実施例で実験すべきｍＲＮＡ内の標的配列は−１８から＋３まで伸びる。頂部配列に対する突然変異体ｍＲＮＡにおける誤対合は肉太の上方ケースで示される。本実施例におけるオリゴマー配列、２１量体は各ｍＲＮＡの直下に示され、非変異体である。各々の引き続いてのｍＲＮＡに対するオリゴマーにおける誤対合を上方のケースで示す。他の同一の標的における正確に知られた誤対合の数を増加させるこの方法を用い、種々のオリゴマー化学（例えば、ホスホロチオエート−対−混合骨格）の特異性および作用様式（例えば、滅菌フロッカー−対−ＲＮａｓｅＨ切断剤）を正確に決定できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レイノルズ，マーク・アランアメリカ合衆国92130カリフォルニア州、サンディエゴ、エクスバリー・コート4588 番 (72)発明者ライリー，ティモシー・アンドリューアメリカ合衆国93444カリフォルニア州、ニポモ、ケント・ストリート190番 (72)発明者シュワルツ，デビッド・アーロンアメリカ合衆国92024カリフォルニア州、エンシニタス、バレダ1544番 (72)発明者バジェフィ，モルテザ・モニアアメリカ合衆国92130カリフォルニア州、サンディエゴ、エクスバリー・コート4626 番 (72)発明者ブラウン，ボブ・デールアメリカ合衆国92024カリフォルニア州、エンシニタス、ノース・ウィロウ・スプリング・ドライブ445番

Claims

【特許請求の範囲】１．ＲＮＡ標的配列にハイブリダイズする合成オリゴマーの製法であって、（ａ）単一の一本鎖ＲＮＡ標的配列を同定し；（ｂ）非ホスホネートヌクレオシジル間結合と混合した、低級アルキル−またはアリールホスホネートヌクレオシジル間結合および低級アルキル−またはアリールホスホノチオエートヌクレオシジル間結合よりなる群から選択されるキラル的に純粋なホスホネートヌクレオシジル間結合を有する合成オリゴマーを合成する工程よりなり、ここに、該キラル的に純粋なホスホネート結合は、約１のホスホネート結合に対して１の非ホスホネート結合から約４のホスホネート結合に対して１の非ホスホネート結合の比で単一の非−ホスホネートヌクレオシジル間結合の間に散在し、ここに、該オリゴマーは該同定されたＲＮＡ標的配列に対して実質的に相補的である該製法。２．該キラル的に純粋なホスホネート結合が１ないし３個の炭素原子のアルキル基を有するＲｐ低級アルキルホスホネート結合である請求項１記載の製法。３．該Ｒｐ低級アルキルホスホネート結合がＲｐメチルホスホネート結合である請求項２記載の製法。４．ホスホネート結合に対する非−ホスホネート結合の該比率が約１に対して１ないし約３に対して１である請求項３記載の製法。５．該オリゴマーのヌクレオシドが、１ないし１０個の炭素原子の２’−Ｏ− アルキルリボシル、２’−ハロ−リボシル、３ないし６個の炭素原子の２’−Ｏ −アルケニルリボシルおよび２’−デオキシリボシルから選択される糖部位としての２’−置換リボシル基を有する請求項３記載の製法。６．該非−ホスホネート結合が、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホジチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロフルオリデート、ボラノホスフェート、ホルムアセタールおよびシリルよりなる群から選択される請求項１記載の製法。７．該オリゴマーが、式：［式中、Ｘは酸素または硫黄、Ｒは１ないし３個の炭素原子のアルキル；Ｚは水素、１ないし１０個の炭素原子のアルコキシ、ハロゲンまたは３ないし６個の炭素原子のアルケニルオキシ；Ｂは独立して選択され、所望により保護されていてもよいプリンまたはピリミジン塩基；Ｂ１はブロッキング基であって、Ｃｐはカップリング基を意味する］で示されるキラル的に純粋なヌクレオシドダイマーを一緒に結合することによって合成される請求項１記載の製法。８．Ｘが酸素であってＲがメチルである請求項７記載の製法。９．該キラル的に純粋なホスホネート結合がＲｐ立体配置である請求項８記載の製法。１０．Ｚが水素またはメトキシである請求項９記載の製法。１１．非−ホスホネート結合がホスホジエステル結合である請求項１０記載の製法。１２．Ｚがメトキシである請求項１１記載の製法。１３．非ホスホネートヌクレオシジル間結合と混合した、１ないし３個の炭素原子の低級アルキルホスホネートヌクレオシジル間結合および１ないし３個の炭素原子の低級アルキルホスホノチオエートヌクレオシジル間結合よりなる群から選択されるホスホネートヌクレオシジル間結合を有する合成オリゴマーである一本鎖ＲＮＡ標的配列の発現を妨げまたはそれに干渉することに活性を有する合成オリゴマーであって、ここに、該ホスホネート結合は、ホスホネート結合に対する非ホスホネート結合が１に対して約１ないし４に対して約１の比で単一の非− ホスホネートヌクレオシジル間結合の間に散在し、ここに、該オリゴマーは該ＲＮＡ標的配列に実質的に対して相補的である該合成オリゴマー。１４．該ホスホネート結合がキラル的に純粋なＲｐメチルホスホネート結合である請求項１３記載のオリゴマー。１５．該非−ホスホネート結合がホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロフルオリデート、ボラノホスフェート、ホルムアセタールおよびシリルよりなる群から選択される請求項１４記載のオリゴマー。１６．該オリゴマーのヌクレオシドが糖部位として２’−Ｏ−メチルリボシル基を有する請求項１５記載のオリゴマー。１７．非−ホスホネート結合と混合した、１ないし３個の炭素原子の低級アルキルホスホネート結合および１ないし３個の炭素原子の低級アルキルホスホノチオエート結合よりなる群から選択されるキラル的に純粋なホスホネートヌクレオシジル間結合を有するオリゴマーよりなる合成オリゴマー調製物であって、ここに、該オリゴマーは単一の非−ホスホネート結合の間に散在し、ここに、該オリゴマーはＲＮＡ標的配列に対して相補的であり、ここに、該オリゴマー調製物は相補的ＲＮＡ標的配列に対する増強された「正味の」結合親和性を示す該合成オリゴマー調製物。１８．キラル的に純粋なホスホネートヌクレオシジル間結合を有する個々のヌクレオシドのダイマー、トリマーまたはテトラマーを一緒に結合することを特徴とする、ヌクレオシド単位の所定の塩基配列を有し、かつ非−ホスホネートヌクレオシジル間結合と混合されたキラル的に純粋なホスホネートヌクレオシジル間結合を有するオリゴマー、ここに、該ホスホネートヌクレオシジル間結合が単一の非−ホスホネートヌクレオシジル間結合の間に散在する該オリゴマーの製法。１９．該オリゴマーが、式：［式中、Ｘは酸素または硫黄、Ｒは１ないし３個の炭素原子のアルキル；Ｚは水素、１ないし１０個の炭素原子のアルコキシ、ハロゲンまたは３ないし６個の炭素原子のアルケニルオキシ；Ｂは独立して選択され、所望により保護されていてもよいプリンまたはピリミジン塩基；Ｂ１はブロッキング基；ｎは１、２または３であって、Ｃｐはカップリング基を意味する］で示されるキラル的に純粋なシントン(synthon)を一緒に結合することによって合成される請求項１記載の製法。２０．式：［式中、Ｘは酸素または硫黄、Ｒは１ないし３個の炭素原子のアルキル；Ｚは水素、１ないし１０個の炭素原子のアルコキシ、ハロゲンまたは３ないし６個の炭素原子のアルケニルオキシ；Ｂは独立して選択され、所望により保護されていてもよいプリンまたはピリミジン塩基；Ｂ１はブロッキング基；ｎは１、２または３であって、Ｃｐはカップリング基を意味する］で示されるキラル的に純粋なシントン(synthon)。