JPH09508270A

JPH09508270A - 細胞の分離、同定および／または分析のための生存性プローブ

Info

Publication number: JPH09508270A
Application number: JP7519604A
Authority: JP
Inventors: メリッサシーオブライエン; ウェイドイーボルトン
Original assignee: クールターコーポレイション
Priority date: 1994-01-21
Filing date: 1995-01-13
Publication date: 1997-08-26
Also published as: EP0745217A1; WO1995020148A1; EP0745217A4; AU1566995A

Abstract

(57)【要約】本発明で提供する生存性プローブは、独立して充実性腫瘍または非付着性腫瘍を分析するために、独立して使用することができ、またはモノクローナル抗体パネル中に含有させるのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】細胞の分離、同定および／または分析のための生存性プローブ技術分野本発明が提供する生存性プローブは、充実性腫瘍または非付着性の腫瘍を分析するために、独立して使用することができ、またはモノクローナル抗体パネル中に含有させるのに有用である。背景技術生存していない、透過性が亢進された細胞は、フローサイトメトリー分析に際して、顕著な阻害の原因となっている。この阻害を一次的にもたらしているのは、分化抗原形質発現（１３）、生化学的変化（例えば、自発蛍光の増大）（２４）、および細胞死を伴う膜の透過亢進に起因するプローブの非特異的な摂取および結合（６、１５、２０、２２）である。従って、生存細胞の精密な分析のためには、生存していない細胞の排除が必要である（２０）。細胞死の二種類の最も特徴的な過程は、壊死およびアポトーシスである（１、３、５、９、１３、１９）。壊死は、典型的には、酸素圧低下または細胞毒性因子のような細胞外の条件によって引き起こされ、代謝系の崩壊、細胞膨潤化、溶菌および周囲の組織の炎症という順序によって特徴付けられる（１、５、７、９、２３）。一層一般的な現象であるアポトーシス（１、１０）は、プログラムされた細胞死に関連しており、細胞の収縮、クロマチン濃縮および開裂、および最終的には膜の透過性の亢進という順序によって特徴付けられる（１、３、５、７、９、１０、１３）。染色中の細胞が透過亢進するのにつれて、これらの細胞の形態と屈折率との変化によって、これらの細胞の光散乱特性が著しく変化し、膜の一体性が失われることによって、通常は不透過性のプローブの摂取が可能になる。最も一般的に使用されているフローサイトメトリー法による細胞死の識別技術は、三種類の主要なカテゴリーに分けることができる：（１）物理的分離法、（２）微分光散乱法および（３）蛍光プローブによる分染法である。これらの技術は大きくは膜の透過亢進の測定方法であり、この現象が細胞死に等しいことに基づいている（６、１３）。従って、明らかに、試料を透過亢進剤によって処理すると、試料の貯蔵、細胞内標識、またはバイオハザードの制御のためにしばしば必要なことであるが、自然に透過亢進した死亡細胞を、人工的な透過亢進の前には生存していた細胞から識別するという、著しい挑戦がもたらされる。これらの薬剤は、細胞の形態および屈折率を劇的に変化させ、生存している細胞と死亡した細胞、更には相異なる型の細胞の光散乱特性に同一性をもたらす。更に、透過亢進剤によって、透過亢進の前には生存していた細胞を含むすべての細胞に、この溶液中に過剰に存在しているあらゆるプローブや、前に染色された死亡細胞から外部へと漏れだしたあらゆるプローブを摂取させる。この結果、一般的に、固定化および透過亢進によって、死亡細胞を識別するための二種類の最も一般的な新鮮調製技術、即ち、光散乱に基づいた電子的ゲート制御と膜不透過性プローブの摂取との使用が、排除される。このように、透過亢進に先立って死亡していた細胞を識別する必要性があり、またこれを実施するのに適した技術が欠如していた。パーコールおよびフィコール密度勾配分離法のような物理的分離技術によって、浮遊密度が相異なることに基づいて、生存細胞を死亡細胞から分離することができるが（５）、しかし純度および回収率に幅広いバラツキが見られること、選択的な細胞損失があること（１１）、およびある環境下においては細胞毒性が見られること（２１）という不利益を有している。光散乱に基づいた死亡細胞の識別は、しばしば、充実性腫瘍のような異種細胞の混合物に対しては適用できない。これはある種の死亡細胞が、異なる種類の生存細胞の光散乱特性に類似した光散乱特性を有しうるからである（１５、２０）。最後に、既知の蛍光生存性プローブ（例えば、ヨウ化プロピジウム、フルオレセインジアセテート等）のほとんどは、透過亢進剤の使用と和合性であるとは考えられておらず、これは基本的に結合が弱いかまたは可逆的であるために、プローブが、染色細胞から、人工的に透過亢進された非染色細胞中へと漏れだしうるからである（１５、２０）。ポラック等は、エタノールで固定化された試料中で、ＰＩを使用して、死亡細胞を識別することに成功したことを報告した（１４）。本発明は、次の基準を確立するような、充実性腫瘍モノクローナル抗体パネル中に含有させるための生存性プローブを提供するものである：広範な細胞型特異性；生存細胞の非特異的な染色が少ないこと；死亡細胞の染色について信号／ノイズ比率が高いこと；透過亢進手順に耐えるのに十分なほど高い親和性をもって、死亡細胞中で結合すること；および、励起および発光スペクトルが、充実性腫瘍パネル中で他の染料と和合性であること。発明の開示従って、本発明の課題は、充実性腫瘍、好ましくは胸部腫瘍を分析するために、モノクローナル抗体パネル中に含有させるのに有用な、生存性プローブを提供することである。本発明の更に他の課題は、相対的に安定な細胞内抗原を対象とする生存性プローブを提供することである。本発明の更なる課題は、劣化したクロマチンを含有する後期アポトーシスおよび壊死細胞（タイプＩＩＩ）についての情報を提供するような、生存性プローブを提供することである。本発明の更なる課題は、天然のクロマチンを含有する透過亢進細胞（タイプＩ）についての情報を提供するような、生存性プローブを提供することである。本発明の他の課題は、試料の貯蔵、バイオハザードの制御、または細胞内標識に対してしばしば必要とされるような固定化および透過亢進手順に対して耐性であるという、顕著な利点を有する生存性プローブを提供することである。本発明の他の課題は、あらゆる広範な系列の入手可能な蛍光団に対して接合しうる抗体プローブを提供することである。本発明の生存性プローブは、本出願と同時に提出された、「多重パラメーターフローサイトメトリーによる充実性腫瘍の分析」と題された、１３９，６４６号のドケットナンバーを有する出願の方法において採用しうる。この出願を、ここで参照することによって、本明細書中に包含する。本発明の更なる目的、利点および新規な特徴は、部分的には続く明細書の中で説明し、部分的には、以下を審査する際に本分野の当業者にとって明確となるであろうし、または本発明の実施に際して学びうる。本発明の目的および利点は、添付した特許請求の範囲において特に指摘した装置および組み合わせによって、認識でき、達成できる。図面の簡単な発明ここで、本発明の好適な実施形態を実施例によって、本明細書に添付した図面を参照しながら説明する。ここで、図１は、試料の処理のフローチャートを示し；図２は、処理していない細胞の光の散乱（ＬＴ散乱）およびＰＩ染色と、実験的な生存性プローブであるアクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ（アクチン−ＳＦ）、サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ（ＣＫ−ＳＦ）、７−ＡＡＤ、およびＴＯ−ＰＲＯ−３による処理細胞の染色との対比を示し；図３は、処理していない（ＰＩ固定化されていない）細胞の光の散乱（ＬＴ散乱）およびＰＩ染色と、実験的な生存性プローブであるＬＤＳ−７５１（ＬＤＳ）、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ（チューブリン−ＳＦ）、ＥＭＡ、およびＰＩ（ＰＩ固定化）による処理細胞の染色との対比を示す。本発明の実施形態充実性腫瘍には共通にしばしば大規模なアポトーシス集団と壊死集団とが発生し、腫瘍細胞の精密なフローサイトメトリー分析に対して顕著な障害となっている。実際のところ、特に大きな腫瘍や貯蔵試料においては、生存中の腫瘍細胞が、全細胞集団のうちのほんの僅かな小部分であることは、まったく起こり得ることである。これらの生存腫瘍細胞を同定し、分離できるようになるまでは、誤った免疫表現型およびＤＮＡ分析の可能性があるために役にたたず、これは相異なる細胞型および死亡細胞の自発蛍光のバックグラウンドが幅広く変化すること、非特異的な細胞表面への抗体の結合、非特異的な抗体の摂取、および死亡した細胞中におけるクロマチンの劣化に起因している。本発明で提供する生存性プローブは、充実性腫瘍、好ましくは胸部腫瘍を分析するために、モノクローナル抗体パネル中に含有させるのに有用である。本発明者が見いだしたところでは、本発明の生存性プローブは、充実性腫瘍中に見いだされる幅広い細胞に対して情報を与えるという点で十分に広範囲の細胞型特異性を示し（４）；非特異的な結合が少なく；染色および透過亢進手順に耐えるのに十分なほど強固に特異的に結合し；死亡細胞が崩壊する前（光の散乱に基づいて残滓を識別できるか、またはゲートから出せる時点）に充実性腫瘍中で耐えうる時間の間、情報が得られるようにするために、高くかつ安定な蛍光強度を示し；および、腫瘍抗体パネルを構成する四種類の他の蛍光プローブに対して親和性を有している。本発明者が発見したところでは、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣが、前記の基準のすべてを満足するようである。すべての真核細胞中にチューブリンが存在することによって（１８）、腫瘍異質性の問題が回避され；このプローブは、生菌に対する非特異的な結合性を、僅かしか示さないか、まったく示さず、透過亢進された細胞中におけるプローブの結合は、染色および透過亢進手順に耐えるのには十分に強固であり；その信号／ノイズ比率は、細胞の回収後１５日間にわたってさえも、自発蛍光からこの蛍光を明瞭に識別するのに十分なほど高く、その蛍光強度は、この時間経過の間に比較的にゆっくりと消失し；かつこのプローブは、腫瘍抗体パネルを構成する他のプローブと和合性である。サイトケラチン− ＳＡＭ−ＦＩＴＣは、上皮細胞のみに対して特異的であることを除けば、すべての点で満足できた。アクチン、ＥＭＡ、および７−ＡＤＤは、全時間経過の間にわたって、十分に高い信号／ノイズ比率を示さなかった。ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＬＤＳ−７５１、およびＰＩ（処理された細胞）は、生存している細胞と死亡した細胞との双方を同じように染色するので、本出願における生存に関しては情報を与えない。膜の透過亢進が、壊死の際にはクロマチン劣化よりも先行し、アポトーシスの際にはクロマチン劣化に続くという、最近の報告は（１、５、７、１３）、表１に示すように、死亡細胞に少なくとも三種類のはっきりとした型が発生することを意味している。本発明は、こうしたカテゴリー分類を支持している。ＤＮＡ−特異的プローブによる染色が、細胞死の開始時に最も強く、集菌後の細胞齢が増加するのにつれて、減少するという事実から、Ｉ型およびＩＩＩ型の死亡細胞の存在が示唆されている。ＩＩ型の死亡細胞の存在を、生膜および劣化したクロマチンと共に、予期させるのは、低い前方散乱を有する（アポトーシスに際して、細胞容積の減少がクロマチンの劣化に先行することを示唆している）（７）細胞の百分率が、生存性プローブ（処理された細胞中のＴＯ−ＰＲＯ−３、ＬＤＳ−７５１、およびＰＩを除く。これらのすべては生存細胞と死亡した細胞とを区別することなく染色した）に対して陽性の細胞の百分率よりも定常的に高い（表２および表３）ことである。更に、本発明の生存性プローブが対象としている相対的に安定な細胞内抗原は、劣化したクロマチンを含有するアポトーシス後期および壊死後期の細胞（ＩＩＩ型）に対して、更には天然のクロマチンを含有する透過亢進された細胞（Ｉ型）に対して、伝統的なＤＮＡ特異的な生存性染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）よりも一層有用な情報を与えることが証明されている。本発明は、試料の貯蔵、バイオハザードの制御または細胞内標識のためにしばしば必要とされるように、固定化および透過亢進手順に対して耐性であるという、顕著な利点を有している。最後に、本発明は、広範な系列のあらゆる入手可能な蛍光団に対して結合しうる抗体プローブの使用を教示しており、これは固定された、しばしば広範囲の発光スペクトルを有するもっと伝統的な染料プローブよりも、広い適用の可能性を有している。本発明の好適な実施形態においては、生存性プローブがサイトケラチンである。本発明の最も好適な実施形態においては、この生存性プローブがチューブリンである。本発明は、下記のような二種類の時間系列の研究を提供しており、ここで、腫瘍細胞系を誘起させて細胞の酸素圧低下の条件に入り、充実性腫瘍の内部の酸素圧低下環境を刺激することを意図しており、ここで多数の生存性プローブによるこれらの染色の度合いを比較する。最初の研究が関連しているのは、標準として、透過亢進なしの、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によるＭＤＡ（胸部腫瘍）細胞系の染色であり、および、透過亢進を伴う、抗−アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、抗−サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、７−アミノアクチノマイシンＤ（７− ＡＡＤ；高親和性のＤＮＡインターカレーターであり、約６５０ｎｍに発光最大値を有する）（１６、１７）およびＴＯ−ＰＲＯ−３（膜不透過性の、高親和性のＤＮＡインターカレーターであり、６６１ｎｍに発光最大値を有しており、核酸に結合されたときを除いて、最小の蛍光を有する）によるＭＤＡ（胸部腫瘍）細胞系の染色である。第二の研究に含まれるのは、標準としての、透過亢進なしのＰＩによるＭＤＡ細胞の染色であり、および、透過亢進を伴う、抗−チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、臭化エチジウムモノアジド（ＥＭＡ、光活性化された、共有結合しているＤＮＡインターカレーターであり、約６００ｎｍに発光最大値を有している）（１５）、ＬＤＳ−７５１（生体核酸染料であり、６７０ｎｍに発光最大値を有している）（２０）およびＰＩによるＭＤＡ細胞の染色である。材料ＰＢＳ、リゾホスファチジルコリン、「ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）」、トリパンブルー、抗−α−平滑筋アクチンモノクローナル抗体、および７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を、シグマケミカルコーポレーション（ミズーリ州、セントルイス）から入手した。ＦＢＳおよび純メタノールを、ハイクローン社（ユタ州、ローガン）およびＪＴベーカーインコーポレーテッド（ニュージャージー州、フィリップスバーグ）からそれぞれ入手した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染料（ＤＮＡ調製キットから；５０μｇ／ｍｌのＰＩ、４ＫＵ／ｍｌのウシ膵臓ＩＩＩ型ＲＮＡｓｅ、０．１％のＮａＮ₃、生理的食塩水および安定化剤）および抗−サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣモノクローナル抗体は、クールターコーポレーション（フロリダ州、マイアミ）から入手した。抗−α−チューブリンは、ザイムドラボラトリーズインコーポレーテッド（カリフォルニア州、サンフランシスコ）から入手した。ＦＩＴＣ−結合ヒツジ０抗−マウスＦ（ａｂ’）フラグメント（ＳＡＭ−ＦＩＴＣ）は、サイレナスラボラトリーズ（オーストラリア、ビクトリア）から入手した。臭化エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）およびＴＯ−ＰＲＯ−３を、モルキュラープローブスインコーポレーテッド（オレゴン州、ユージーン）から入手した。ＬＤＳ−７５１をエクサイトン社（オハイオ州、デイトン）から入手した。細胞培養物ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ乳癌腫瘍細胞系（アメリカンタイプカルチャーコレクション、メリーランド州ロックビル）の単層培養物を、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン社、ユタ州ローガン）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（バイオホイットテイカー社、メリーランド州、ウオーカーズビル）中で、３７ ℃で、加湿雰囲気中で５％ＣＯ₂で成長させた。この培養物を、回収に先立って対数成長条件の下に維持した。本明細書で示した時間系列研究のそれぞれについて、細胞を毎日回収し（週末を除く）、次いで、固く封をした状態で、３７℃で、加湿雰囲気中で５％ＣＯ₂で保持し、腫瘍内の酸素圧低下を刺激した。各研究において、１２回の連日の細胞の回収に際して、各バッチからの試料を、フローサイトメトリー分析のために処理した。細胞の染色本発明者等の充実性腫瘍のモノクロナール抗体パネル中に含有させるための生存性プローブを評価するために、充実性腫瘍の表面及び核内を同時に染色するために、本発明者等の実験室で採用されている手順に従って、試料を処理した。それぞれの時間経過研究において、１２個の毎日（週末を除く）の細胞のバッチの最後のものを回収した後に、トリパンブルーによる生存性染色および顕微鏡的評価のために、各バッチから分割試料（アリコート）を採取した。次いで、各バッチからの細胞を、１試験当り１×１０⁶個の細胞の割合で、１２×７５ｍｍのシリコン化されたガラス製の試験管内に分割した。各実験において、試料を２つの集団に分けた：標準として、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によって染色すべき非処理（即ち、下記の充実性腫瘍染色処理によって処理されていない）系列、および、他の生存性染料によって染色され、下記の充実性腫瘍染色処理（図１）によって処理されるべき系列とである。このようにして、研究１においては、ＭＤＡ細胞の毎日の回収物（０日の最も若い細胞から、１５日の最も古い細胞にわたる）について、７種類の試料（非処理の非染色の対照例；非処理のＰＩ染色した標準；処理された、非染色の対照例；及び、アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、７−ＡＡＤ、又はＴＯ−ＰＲＯ−３のいずれかによって染色された４種類の処理された試料）が存在していた。研究２においては、ＭＤＡ細胞の毎日の回収物についてやはり７種類の試料（非処理の非染色の対照例；非処理のＰＩ染色された標準；処理された非染色の対照例；およびチューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、ＥＭＡ、ＬＤＳ−７５１又はＰＩによって染色された、４種類の処理された試料）が存在していた。銘記すべきことに、むしろイソタイプの対照例よりも、染色されていない細胞をここでは使用し、抗体標識細胞に対する蛍光のバックグラウンドを確立した。細胞の内側での抗体染色の強度は、標的抗原に対する特異的な結合、非特異的な抗体の結合、抗体の捕捉、および染料それ自体の非特異的な結合を含む、複数の因子が組み合わされた結果である。明らかに、標的抗原に対する特異的結合の測定が目的である場合には、イソタイプの対照例を使用して、非特異的な蛍光の水準を評価しなければならない。しかし、この場合におけるように、目的が、単に蛍光抗体の摂取によって生存細胞から透過性が亢進された細胞を識別することである場合には、抗体が摂取されればされるほど（特異的であろうと、非特異的であろうと）、識別が良好となる。本出願における識別因子は、特異的であるよりも、むしろ全体的であるので、蛍光性のイソタイプの対照例は不要である。細胞を分割した後には、ＰＩによって染色されるべき処理されていない系列と、これらの染色されていない対照例とを、５００×ｇで５分間、室温で遠心分離し、デカンテーションした。染色されていない対照例を、２．５％ＦＢＳ（ＰＢＳＦ）を補充したＰＢＳに再懸濁し、このＰＩ染色された試料を、１ｍｌ中に再懸濁し、フローサイトメトリー分析に先立って、暗中で室温で２０分間インキュベートした。この残りの試料を上記のように遠心分離し、デカンテーションした。染色されていない対照例と、７−ＡＤＤ、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＬＤＳ−７５１、ＥＭＡまたはＰＩによって染色されるべき細胞とを、２００μｌのＰＢＳＦ中に再懸濁させ、１５分間室温でインキュベートした。この残りの試料を、ＰＢＳＦ（蛋白質の濃度は不明）中のアクチンの１：２００の希釈液、ＰＢＳＦ（蛋白質の濃度は不明）中のチューブリンの１：２００の希釈液、またはＰＢＳＦ中の２５μｇ／ｍｌのサイトケラチン（３種類の抗体に対する最適用量は、先に滴定によって決定したが、データは示していない）のいずれかの各２００μｌの中に再懸濁し、１５分間室温でインキュベートした。次いで、すべての試料を、それぞれ２ｍｌのＰＢＳによって洗浄し、上記のように遠心分離し、デカンテーションした。次いで、染色されていない対照例を、２００μｌのＰＢＳＦ中に再懸濁させ、１５分間室温でインキュベートした。アクチン、チューブリンまたはサイトケラチンによって染色された試料を、ＰＢＳＦ中の４８．８μｇ／ｍｌのＳＡＭ−ＦＩＴＣを２００μｌ中に再懸濁させ、室温で１５分間、暗中でインキュベートした。７−ＡＤＤで染色された細胞を、試験当たり１ｍｌの２５μｇ／ｍｌの７−ＡＤＤ（４９．７５ｍｌのＰＢＳＦ中の２５０μｌの貯蔵溶液：貯蔵溶液は、メタノール中に５ｍｇ／ｍｌである）中に再懸濁させ、暗中で、１５分間、室温でインキュベートした。ＴＯ−ＰＲＯ−３で染色された細胞を、１ｍｌ／試験のＰＢＳＦ中の５μＭのＴＯ−ＰＲＯ中に再懸濁させ、暗中で、１５分間、室温でインキュベートした。ＬＤＳ−７５１で染色された細胞を、１０μｌの２μ ｇ／ｍｌのＬＤＳ−７５１を含有する試験当たり１ｍｌのＰＢＳＦ（４．９５ｍｌのＰＢＳＦ中の５０μｌの貯蔵溶液：貯蔵溶液は、メタノール中に１ｍｌ当たり０．２ｍｇのＬＤＳ−７５１である）中に再懸濁させ、暗中で、１５分間、室温でインキュベートした。ＥＭＡで染色された細胞を、５μｇ／ｍｌのＥＭＡを１０μｌ／試験（４．８７５ｍｌのＰＢＳＦ中の１２５μｌの貯蔵溶液：貯蔵溶液は、メタノール中に１ｍｌ当たり０．２ｍｇのＥＭＡである）中に再懸濁させ、１５分間、室温で、蛍光ライトバルブから２０ｃｍ離れた位置でインキュベートした。ＰＩで染色された細胞を、処理されていない細胞に使用したのと同じＰＩ溶液を１ｍｇ／試験の中に再懸濁し、暗中で、１５分間、室温でインキュベートした。次いで、すべての試料を上記のように洗浄し、次いで２００μｌ／試験のＰＢＳＦ中に再懸濁させ、１５分間、暗中で室温で（腫瘍試料の表面の抗原染色を刺激するために）インキュベートした。次いで、すべての試料を上記のようにして２回以上洗浄した。この上澄み液をデカンテーションした後、各試料を、１％パラホルムアルデヒド中の２０μｇ／ｍｌの２５℃のリゾホスファチジルコリン１ｍｌ中に再懸濁させ、２分間、室温でインキュベートし、５００×ｇで５分間室温で遠心分離し、デカンテーションした。次いで、これらの試料を、１ｍｌ／試験の−２０℃の純メタノール中に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートし、次いで、上記したように遠心分離した。デカンテーションの後、試料を、１ｍｌ／試験の４℃の０．１％ＮＰ４０中に再懸濁させ、氷上で５分間インキュベートし、次いで上記のように遠心分離した。デカンテーションの後、試料を、２００μ ｇ／試験のＰＢＳＦ中に再懸濁させ、暗中で１５分間室温で（腫瘍試料の細胞内の抗原染色を刺激するために）インキュベートし、次いで上記のように洗浄した。最後に、試料を、フローサイトメトリーに先立って、１ｍｌ／試験のＰＢＳＦ中に再懸濁させた。フローサイトメトリー５個のフォトマルチプライヤーチューブおよび３個のレーザー（水冷の５Ｗのアルゴンレーザー、１５ｍＷで作動する空冷の４８８ｎｍのアルゴンレーザー、および１０ｍＷの空冷式の６３３ｎｍのヘリウム−ネオンレーザー）を備えている「ＥＰＩＣＳＥＬＩＴＥ」フローサイトメーター（コールターコーポレーション、フロリダ州、マイアミ）で、試料を分析した。ＴＯ−ＰＲＯ−３で染色された試料を、６３３ｎｍの励起で分析し；他のすべての試料を、空冷されたアルゴンレーザーによって、４８８ｎｍの励起で分析した。アクチン−、サイトケラチン−、およびチューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣの蛍光発光を、５５０ｎｍのダイクロイックロングパスフィルターによって反射させ、５２５ｎｍのバンドパスフィルターを通した。ＰＩおよびＥＭＡ蛍光を、６５０ｎｍのダイクロイックロングパスフィルターによって反射させ、６１０ｎｍのバンドパスフィルターを通した。７−ＡＡＤ、ＴＯ−ＰＲＯ−３、およびＬＤＳ−７５１蛍光は、６５０ｎｍのダイクロイックロングパスフィルターを通過し、６７５ｎｍのバンドパスフィルターを通過した。染色されていない対照例の自発発光を、染色された試料と適合したフィルター装置と同じフィルター装置によって測定した。各試料についてリストされたフォーマットの中に、５０００個の結果を、前方および側方散乱の直線的増幅および蛍光の４０の対数的増幅と共に、収集した。情報の入手と分析とは、「ELITE」ソフトウエアによって実行し；カラーグラフィックスは、「WinList」ソフトウエア（メイン州、トップシャム、ベリティソフトウエアハウス）および「ＥＸＣＥＬ」ソフトウエア（ワイオミング州、レッドモンド、マイクロソフトコーポレーション）によって実行した。最初の時間経過研究の結果を、図２および表２に示してある。図２において、最も右側の欄は、対応する列の細胞のバッチを回収後に保持した日数を示している（５、６、１２、１３日目は週末に対応しており、この間は細胞は回収されていない）。この次の欄は、各バッチから得られた処理されていない細胞の光散乱の結果を示している（これらのヒストグラムの各々においては、前方散乱がＹ軸上にあり、側方散乱はＸ軸上にある）。この残りの欄は、染色されていない細胞の蛍光ヒストグラムを（緑色で）示し、各欄の頂部上に示されたプローブによって染色された細胞のヒストグラムによって（緑色以外の色で）電子的に重ね合わされている。すべての機器のセッティングは、この実験が続く間、変更しないで保持した。蛍光ヒストグラムは、４０の対数目盛り上にある。すべてのヒストグラムは、５，０００個の自動目盛りの結果を含んでいる。一般的には、死亡細胞は、前方角度の光散乱の減少を示し、９０℃の光散乱に増大を示し、（人工的な透過亢進に先立って、または人工的な透過亢進をしないで）蛍光プローブ（１７）によって染色されたときには、蛍光に増大を示す。従って、我々の基準を満足するためには、生存性プローブは、図２および図３において、３つの特性を示さなければならない。（１）生存細胞の染色を示さないか、ほとんど示さないこと（即ち、図２および図３の第一列中の試験試料の緑色でないピークが、染色されていない対照例の緑色のピークに適合していなければならず、これらは可能な限り接近して重なっている）；（２）図２および図３において光散乱によって示されているように、試料中の生存細胞および死亡細胞の割合に対応する蛍光の二峰性があること（即ち、試験試料中の緑色でないピークが、光散乱ヒストグラムが生存細胞および死亡細胞の双方の存在を示している列中（基本的には１〜４日）で二峰性でなけれぱならず、光散乱ヒストグラムが、生存細胞のみまたは死亡細胞のみの存在を示している列中（基本的には０日および７〜１５日）では単峰性でなければならない）；および（３）死亡細胞の蛍光染色が、染色されていない対照例の自発蛍光よりも顕著に明るいこと（即ち、試験試料の陽性の緑色ではないピークが、これらに重なっている染色されていない対照例の緑色のピークから、可能な限り遠く離れていなければならない）。強調すべきことは、各蛍光ヒストグラム中の緑色のピークが、陰性に染色された細胞ではなく、（緑色以外の色で、染色された試料と電子的に重なっている）染色されていない対照例に対応していることである。図２において、生存細胞の非特異的な染色は、アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣおよびサイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣに対して最適であり、７−ＡＤＤについはてぼやけており、ＰＩについては比較的に明るく、ＴＯ−ＰＲＯ−３については非常に明るい。ＰＩ、アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、サイトケラチン−ＳＡＭ −ＦＩＴＣおよび７−ＡＤＤの蛍光分布は、これらの陰性（生存細胞）および陽性（死亡細胞）のピークの相対的比率について、光散乱およびトリパンブルーの摂取（データは示していない）に対応している；ＴＯ−ＰＲＯ−３の蛍光の分布は、この時間経過の間中、単峰性に止まっていた。本出願に適している３種類のプローブ（アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣおよび７−ＡＤＤ）のうち、サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣは、最も高い信号／ノイズ比率を示し、１５日間にわたって自発蛍光から識別可能であり続ける。４日目には、アクチン染色も、７−ＡＤＤ染色も、自発蛍光とは顕著に異なっていた。ＰＩは、その可逆性の結合のために、ＴＯ−ＰＲＯ−３は、生存細胞と死亡細胞との双方を実質的に区別することなく強く染色することのために、本出願の生存性プローブとしては受け入れられない。表２において、研究１で採用した種々の生存性プローブによって陽性に染色された細胞の百分率は、死亡細胞の低い前方散乱特性および高い側方散乱特性を示す細胞の百分率に匹敵する。特定のプローブが生存細胞を非特異的に染色したので、染色の陽性の百分率は、染色されていない細胞に対してよりも、双峰性の分布における陰性のピークに対して計算した。双峰性が完全に失われた各欄中の点では、この表中にダッシュが現れている。興味深いことに、光散乱に基づいた百分率は、蛍光に基づいた百分率よりも、定常的にかつ顕著に高い。ＰＩ、アクチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、サイトケラチン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣおよび７−ＡＤＤは、７−ＡＤＤの分布の双峰性が失われたときに，４日間を通してかなりの陽性をもたらした。ＰＩ、アクチン、およびサイトケラチンの陽性は、回収の後１５日を通して、かなりのものであり続けた。この発見が重要である。なぜなら、これが示唆するところでは、ＤＮＡ特異性の染料に対して、より大きな寸法の抗体サンドイッチ複合体は、染色を阻害しないからである。この研究の間のＴＯ−ＰＲＯ−３の単峰性の分布と、その生存細胞の強い染色によって、ここでは染色依存性についての情報が得られなくなった。蛍光強度の平均チャンネル値も報告されている。一般的には、０日後には、生存細胞が優勢であることのために染色が最小である場合には（ＴＯ−ＰＲＯ−３についてを除く）、すべてのプローブの蛍光強度が、相異なる速度で減少する。ＰＩおよびＴＯ−ＰＲＯ−３の蛍光強度は極端な減少を示し、サイトケラチンがこれに続き、アクチンと７−ＡＤＤとが並んでこれに続く。逆に、自発蛍光（緑色のヒストグラム）は、回収後の細胞齢と共に、特にスペクトルの緑色の領域においては、定常的に増大する。第二の時間経過研究の結果を、図３および表３に示す。双方の形式は、図２および表２の形式とそれぞれ同じである。処理されていない細胞の光散乱、自発蛍光およびＰＩ染色は、図２のものと同様である。図３において、生存細胞の非特異的な染色は、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣについて最適であり、ＰＩ（処理された細胞と処理されていない細胞との双方において）、ＬＤＳ−７５１、およびＥＭＡについて比較的に高い。処理されていない細胞中のＰＩ、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣ、およびＥＭＡの蛍光分布は、これらの陰性および陽性のピークの相対的比率中の光散乱およびトリパンブルーの摂取に対応していた：処理細胞中のＰＩおよびＬＤＳ−７５１の蛍光分布は、この時間経過の間、実質的に単峰性に留まっていた。本出願に適している二つのプローブ（チューブリン− ＳＡＭ−ＦＩＴＣおよびＥＭＡ）のうち、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣは、最も高い信号／ノイズ比率を示し、１５日間を通して染色されていない細胞から非常に異なったままであった。７日目には、ＥＭＡの染色と自発蛍光との差が、０日目における生存細胞中の非特異的染色の水準とほぼ同じであった。ＰＩはその可逆的な結合のために、ＬＤＳ−７５１は、定常的に単峰性の蛍光分布であるために、本出願の生存性プローブとしては許容できない。表２におけるように、表３における死亡細胞の光散乱に基づいた百分率は、定常的にかつ顕著に、蛍光に基づいた百分率よりも高い。処理されていない細胞中のＰＩ、チューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣおよびＥＭＡは、この時間経過の間にわたって、比較的に陽性をもたらした。処理された細胞中のＬＤＳ−７５１およびＰＩの分布が定常的に単峰性であるために、ここではこれらは生存性プローブ依存性については情報を与えない。処理された試料中と、処理されていない試料中との双方における、ＰＩの平均蛍光強度は、この時間経過の間に急激に減少し、一方、ＥＭＡおよびチューブリン−ＳＡＭ−ＦＩＴＣの平均蛍光強度は、ゆっくりと減少した。興味深いことには、ＬＤＳ−７５１の蛍光強度は、この時間経過の間に周期的であるように見え、一方、他のすべてのプローブは、蛍光強度の直線的な減少を示している。本明細書中に引用されているすべての引用文献は、本出願が属する技術分野において、当業者の習熟水準を示す。各引用文献を、本明細書中で各引用文献が引用された位置で、参照によってそれぞれ本明細書中に包含する。本技術分野に習熟した者であれば理解できるであろうように、上記の手順および方法においては、特定の試薬および条件を概説したけれども、本発明の思想および範囲によって包含されることを意図する変更を加えることができる。従って、この手順および方法は、本発明を説明するために与えられたものである。こうした他の手段は、続く請求の範囲において規定される本発明の意図および思想の範囲内に包含されるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１２月２９日【補正内容】請求の範囲１．透過亢進剤によって処理された異種の生物試料中の死亡細胞を識別する方法であって、（ａ）生存性プローブによって前記試料を染色し、このプローブが、固定化および透過亢進に対して耐性であり；（ｂ）蛍光測定機器によって分析し；（ｃ）蛍光測定機器の結果からヒストグラムを得；および（ｄ）このヒストグラムを分析することを特徴とする方法。２．前記生存性プローブが核酸特異的な染料であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。３．前記生存性プローブが、細胞内抗原であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。４．前記生存性プローブがチューブリンであることによって更に特徴付けられる、請求項３記載の方法。５．前記生存性プローブが細胞骨格抗原であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。６．前記細胞骨格抗原がサイトケラチンであることによって更に特徴付けられる、請求項５記載の方法。７．前記細胞が悪性細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。８．前記悪性細胞が充実性腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項７記載の方法。９．前記悪性細胞が胸部腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項７記載の方法。１０．前記細胞が非付着性の腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。１１．前記非付着性の腫瘍細胞が、造血系の腫瘍形成細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項１０記載の方法。１２．前記細胞が、劣化したクロマチン（ＩＩＩ型）細胞を含有する後期アポトーシス細胞および後期壊死細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。１３．前記細胞が天然のクロマチンを含有している（Ｉ型）ことによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。１４．前記細胞を抗体プローブによって染色することによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。

Claims

【特許請求の範囲】１．異種の生物試料中の死亡細胞を識別する方法であって、（ａ）生存性プローブによって細胞を染色し、このプローブが、固定化および透過亢進手順に対して耐性であり、および（ｂ）蛍光測定機器によって分析することを特徴とする方法。２．前記生存性プローブが核酸特異的な染料であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。３．前記生存性プローブが、細胞内抗原であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。４．前記細胞内抗原がチューブリンであることによって更に特徴付けられる、請求項３記載の方法。５．前記生存性プローブが細胞骨格抗原であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。６．前記細胞骨格抗原がサイトケラチンであることによって更に特徴付けられる、請求項５記載の方法。７．前記細胞が悪性細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。８．前記悪性細胞が充実性腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項７記載の方法。９．前記悪性細胞が胸部腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項７記載の方法。１０．前記細胞が非付着性の腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項１記載の方法。１１．前記非付着性の腫瘍細胞が、造血系の腫瘍形成細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項１０記載の方法。１２．劣化したクロマチンを含有するアポトーシス後期の細胞（ＩＩＩ型）を識別する方法であって、（ａ）生存性プローブによって細胞を染色し、このプローブが固定化および透過亢進手順に対して安定であり；および（ｂ）フローサイトメトリーによって分析することによって特徴付けられる方法。１３．劣化したクロマチンを含有する壊死細胞（ＩＩＩ型）を識別する方法であって、（ａ）細胞を生存性プローブによって染色し、このプローブが固定化および透過亢進に対して耐性であり、および（ｂ）フローサイトメトリーによって分析することによって特徴付けられる方法。１４．天然のクロマチンを含有する透過亢進された細胞（Ｉ型）を識別する方法であって、（ａ）細胞を生存性プローブによって染色し、このプローブが固定化および透過亢進に対して耐性であり、および（ｂ）フローサイトメトリーによって分析することによって特徴付けられる方法。１５．異種生物試料中の死亡細胞を識別する方法であって、（ａ）細胞を生存性プローブによって染色し、このプローブが固定化および透過亢進手順に対して耐性であり；（ｂ）抗体プローブによって染色し；および（ｃ）蛍光測定機器によって分析することによって特徴付けられる方法。１６．前記生存性プローブが核酸特異的染料であることによって更に特徴付けられる、請求項１５記載の方法。１７．前記生存性プローブが細胞内抗原であることによって更に特徴付けられる、請求項１５記載の方法。１８．前記細胞内抗原がチューブリンであることによって更に特徴付けられる、請求項１７記載の方法。１９．前記生存性プローブが細胞骨格抗原であることによって更に特徴付けられる、請求項１５記載の方法。２０．前記細胞骨格抗原がサイトケラチンであることによって更に特徴付けられる、請求項１９記載の方法。２１．前記細胞が悪性細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項１５記載の方法。２２．前記悪性細胞が充実性腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項２１記載の方法。２３．前記悪性細胞が胸部腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項２１記載の方法。２４．前記細胞が非付着性の腫瘍細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項１５記載の方法。２５．前記非付着性の腫瘍細胞が、造血系の腫瘍形成細胞であることによって更に特徴付けられる、請求項２４記載の方法。