JPH09510740A

JPH09510740A - クイラヤサポニンアジュバントおよびこれを含むワクチン製剤

Info

Publication number: JPH09510740A
Application number: JP8530907A
Authority: JP
Inventors: ホングソップソ; ヘーソングユン; ヨングソンクウォン; ジュングミョングジョ
Original assignee: エルジーケミカルリミテッド
Priority date: 1995-04-13
Filing date: 1996-04-12
Publication date: 1997-10-28
Anticipated expiration: 2016-04-12
Also published as: CN1149875A; JP2761809B2; BR9606311A; US5817314A; AU5290096A; DK0765333T3; EP0765333A1; EP0765333B1; DE69605094T2; TW442293B; KR0184779B1; CA2190344A1; KR960037694A; ATE186541T1; AU678941B2; CA2190344C; ES2140837T3; CN1262958A; AR001618A1; CN1044478C

Abstract

(57)【要約】約９５６ダルトンの分子量を有する新規なサポニン成分、クイラヤサポナリヤモリナの樹皮からこのサポニン成分を分離する方法、このサポニン成分を免疫アジュバントとして含むワクチン製剤、このサポニン成分と第２アジュバントを含有するアジュバント組成物を用いることによって抗原に対する免疫応答を増加させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】クイラヤサポニンアジュバントおよびこれを含むワクチン製剤発明の分野本発明は、新規なサポニン成分およびこれを免疫アジュバントとして含むワクチン製剤に関する。さらに詳細には、本発明は、分子量が約９５６ダルトンである新規サポニン成分、クイラヤサポナリヤモリナ（ＱｕｉｌｌａｊａｓａｐｏｎａｒｉａＭｏｒｉｎａ）の樹皮からサポニン成分を分離する方法、このサポニン成分を免疫アジュバントとして含むワクチン製剤、前記サポニン成分および第２アジュバントを含有するアジュバント組成物を用いることによって抗原に対する免疫応答を増加させる方法に関する。発明の背景生命工学技術は、種々のウイルス外被蛋白質から由来した組換え抗原を含むワクチンの開発に重大な寄与をした。しかし、ＨＩＶ（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ）およびＨＣＶ（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣＶｉｒｕｓ）によって惹起される疾病のような脅威的な疾病を予防できる効果的なワクチンは、組換え抗原の比較的弱い抗原性を増強させ得る効果的なアジュバントがないなどの理由のため、まだ開発されていない。したがって、かかるワクチンに用いられる適切なアジュバントを開発するための研究が集中的に行われてきた。現在、水酸化アルミニウム（ミョウバン（ａｌｕｍ））は、その毒性が低いためヒト用として認可された唯一のアジュバントである。しかし、ミョウバンは、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ（ＨｅｒｐｅｓＳｉｍｐｌｅｘＶｉｒｕｓ）によって惹起される疾病、および住血吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ）、百日咳（ｗｏｏｐｉｎｇｃｏｕｇｈ）および腸チフス（ｔｙｐｈｏｉｄ）に対する抗原と共に用いる時には効果がないと知られている（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，１７２０−１７２７（１９８８）；Ｊａｍｅｓ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，ｉｂｉｄ．，１４０，２７５３−２７５９（１９８８）；ＥｄｅｌｍａｎＲ．，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２，３７０−３８３（１９８０））。したがって、新しいアジュバントを開発する必要性が認識され、かかる必要性に応えて、多くのアジュバント、たとえば、サポニン、油乳剤（ｏｉｌｅｍｕｌｓｉｏｎ）、モノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｌｉｐｉｄＡ）およびフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ ′ｓａｄｊｕｖａｎｔ）などが提案されてきた。しかし、これらのアジュバントはそれぞれ、満足できないアジュバント活性、高い毒性および／または好ましくない副作用を起こすなどの問題点を有すると明らかになった。たとえば、フロイントアジュバントは肉芽腫性炎（ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を起こし得、先行技術に記載されたサポニンは下記の毒性問題が生じ得る。サポニンは、飲料の発泡剤、繊維工業における洗剤およびその他多くの商業的な用途を有する植物配糖体（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）である。最近、南アメリカ産木であるクイラヤサポナリヤモリナ（ＱｕｉｌｌａｊａＳａｐｏｎａｒｉａＭｏｌｉｎａ）の樹皮から抽出して得られるクイラヤサポニンの混合物が体液性および細胞性免疫応答を示すことが明らかになった（ＥｓｐｉｎｅｔＲ．Ｇ．，Ｇａｃ．Ｖｅｔ．，１３，２６８−２７３（１９５１）；ＤａｌｓｇａａｒｄＫ．，Ａｒｃｈ．ＧｅｓａｍｔｅＶｉｒｕｓＦｏｒｓｃｈ．，４４，２４３−２５４（１９７４）；ＭｏｒｅｉｎＢ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２２，２８７−２８８（１９８８））。精製したクイラヤサポニンの形態は“Ｑｕｉｌ−Ａ”という名で市販されている（ＩｓｃｏｔｅｃＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ；およびＳｕｐｅｒｆｏｓＢｉｏｓｅｃｔｏｒａ／ｓ，Ｆｒｙｄｅｎｌｕｎｄｓｖｅｊ３０，ＤＫ−Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。しかし、Ｑｕｉｌ−Ａは、トリテルペノイドクイライン酸、すなわちアグリコンが、グリコシド結合を通じて色々な種類や長さの糖残基に結合している一般的化学構造で表される多数の同類配糖体の混合物である。また、このグリコシドの各成分はそれぞれ、非常に多様なアジュバント活性および毒性を示し、したがって、Ｑｕｉｌ−Ａはヒト用の医薬製剤としては安全でないと知られている（Ｋｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５６，４３２−４３８（１９８８））。したがって、安全で効果的なクイラヤサポニン成分を同定し、その製造方法を開発するための研究が行われた。ケンシルら（Ｋｅｎｓｉｌ）は、クイラヤ樹皮粗抽出物のメタノール可溶性分画をメタノール／水（５８：４２（ｖ／ｖ））中で４０ｍＭ酢酸を用いる逆相高圧液体クロマトグラフィー（“ＲＰ−ＨＰＬＣ”）で分離して数種の精製されたサポニン成分を得た。このうち、ＱＳ−１８と命名された成分は、高い溶血活性、すなわち、非常に高い毒性を示すことが明らかになった。一方、ＱＳ−２１と命名された成分は、低い毒性を示した反面、高いアジュバント活性を示した。また、ＱＳ−７およびＱＳ−１７と命名された成分もアジュバント効果を有すると報告された（Ｋｅｎｓｉｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，４３１−４３７（１９９１）；Ｋｅｎｓｉｌｅｔａｌ．，米国特許第５、０５７、５４０号（１９９１））。さらに、上述のＱＳ−２１成分はＨＩＶおよびその他のウイルス抗原の免疫活性を増強させると報告された（Ｋｅｎｓｉｌｅｔａｌ．，ＪＡＭＡ，１９９，１４２３−１４２７（１９９１）；Ｗｕ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，１５１９ −１５２５（１９９２））。しかし、ケンシルらによって開示された製造方法は、シリカゲルクロマトグラフィーおよびＲＰ−ＨＰＬＣを共に使用しなければならないので過度に複雑である。そのうえ、分離したＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−２１成分は、１，８００ないし２，６００ダルトン範囲の分子量を有し、これは樹皮抽出物に存在するクイラヤサポニンのごく一部のみに属する。一方、ケルステンら（Ｋｅｒｓｔｅｎ）は、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて２３個以上のＱｕｉｌ−Ａ成分を分離した。ＱＡ−３と命名された特定成分は、２次元または３次元免疫原性複合体の形態であり、ステロール、リン脂質および抗原と共に用いられる場合、毒性およびアジュバント活性の面においてＱＳ−２１より優れていると明らかになった（Ｋｅｒｓｔｅｎｅｔａｌ．，ＷＯ９２／０６７１０）。しかし、ケルステンらによって開示された免疫原性複合体に含まれているステロールを注射製剤として使用することは認められなかった。また、ケルステンらによって分離及び開示されたＱＡ−３を含むすべての成分は、１，３００ないし２，４００ダルトン範囲の分子量を有するサポニンに限られる。このように、先行研究はクイラヤ樹皮抽出物の他の部分、特に、低分子量クイラヤサポニン成分において、効果的で安全なアジュバントを発見する可能性については全く言及していない。発明の概要したがって、本発明の目的は、ワクチンに用いられる場合、毒性がないかほとんどなく、高いアジュバント活性を示す新規なサポニン成分を提供することである。本発明の他の目的は、クイラヤサポナリヤモリナの樹皮から前記サポニン成分を分離する方法を提供することである。本発明のまた他の目的は、任意の他のアジュバントと共に前記サポニン成分をアジュバントとして含むワクチン製剤を提供することである。本発明のまた他の目的は、任意の第２アジュバントと共に前記サポニン成分をアジュバントとして用いることによって、ワクチン製剤中の抗原に対する免疫応答を増加させる方法を提供することである。本発明の一つの態様によって、クイラヤサポナリヤモリナの樹皮から分離し、毒性がないかほとんどない反面、第２アジュバントと配合すると高い相乗的アジュバント活性を示し、約９５０ダルトンの分子量を有するＱＳ−Ｌ１と命名されたサポニン成分が提供される。図面の簡単な説明本発明の前記および他の目的と特徴は、本願に添付された図面を参照とした下記の説明から明らかになる。図１は、クイラヤサポナリヤモリナの樹皮抽出物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示し；図２は、Ｑｕｉｌ−ＡのＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示し；図３は、Ｑｕｉｌ−Ａおよび精製したサポニン成分ＱＳ−Ｌ１、ＱＳ−Ｌ２、ＱＳ−Ｌ３、ＱＳ−Ｌ４およびＱＳ−Ｌ５のシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）結果を示し；図４は、ＱＳ−Ｌ１を電子噴霧イオン化−質量分析装置（ＥＭＩ−ＭＳ）で分析した結果を示し；図５は、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＱＳ−Ｌ１、ＱＳ−Ｌ２、ＱＳ−Ｌ３、ＱＳ−Ｌ４、ＱＳ−Ｌ５およびＱｕｉｌ−Ａのヒツジ赤血球に対する溶血活性を示し、図６Ａおよび６Ｂは、ＨＢｓＡｇ抗原を用いた免疫化において観察されたＱＳ −Ｌ１およびＱＳ−Ｌ１／ミョウバンのアジュバント活性をミョウバンおよびフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）のアジュバント活性と比べた結果を示す。発明の詳細な説明本発明のサポニン成分、すなわち、ＱＳ−Ｌ１は、クイラヤサポナリヤモリナの樹皮から分離され、毒性がないかほとんどない反面、ミョウバンのような他のアジュバントと配合すると驚くほど高い免疫アジュバント活性を示す。本願に用いられた用語“免疫アジュバント”は、抗原と共にヒトに投与するか、試験管内で試験する場合、抗原に対する試験対象の免疫応答を増強させる化合物をいう。ＱＳ−Ｌ１は、電子噴霧イオン化法を用いた質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）に従って分析した結果、ｍ／ｚ９７９．４の分子イオンを有し、また、水／アセトニトリル（７：３（ｖ／ｖ））中で０．１重量％トリフルオロ酢酸水溶液を１ｍｌ／分の流速で用いる４．６ｘ２５０ｍｍバイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ４カラム上の逆相高圧液体クロマトグラフィーで分析した場合約１３．９８分の保持時間を有することによっても特定化される。本発明は、また、キュウ．サポナリヤモリナの樹皮からＱＳ−Ｌ１を分離する方法を提供し、これは下記のように要約できる。まず、キュウ．サポナリヤモリナの形成層を水で処理し、この粗抽出物を凍結乾燥することによってキュウ．サポナリヤモリナの樹皮抽出物を製造する。次いで、（ａ）酢酸水溶液中の樹皮抽出物溶液を遠心分離して上澄液を得；（ｂ）この上澄液を限外透析膜を用いて酢酸水溶液で透析し；（ｃ）生成した透析物を遠心分離して上澄液を得；（ｄ）上澄液を凍結乾燥してサポニン抽出物粉末を得；（ｅ）このサポニン抽出粉末を適切な溶媒に溶かし、溶液をＲＰ−ＨＰＬＣで分離して実質的に純粋なＱＳ−Ｌ１を含む分画を得る段階を含む方法によって、キュウ．サポナリヤモリナの樹皮抽出物からＱＳ−Ｌ１を精製できる。段階（ａ）での酢酸水溶液の濃度は、１０ないし１００ｍＭ、好ましくは４０ｍＭである。段階（ｂ）で用いられた透析膜の分子量カット−オフ値は、１２ないし１４ｋＤであり、これは低分子量の水溶性汚染物質の除去に適当である。段階（ｅ）でＲＰ−ＨＰＬＣを用いた分離は、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣカラムおよび、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を用いて行うことが好ましい。樹皮抽出物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果は３２以上のピークを示す。これらのピークの多数は予備分画によってきれいに分離され得、ＱＳ−Ｌ１と命名された新規低分子量サポニン成分を含む高純度の種々のサポニン成分を提供する。ＱＳ−Ｌ１は４．６ｘ２５０ｍｍバイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ４カラムを用いた時、保持時間１３．９８分で溶出される。ＱＳ−Ｌ１のＥＳＩ−ＭＳ分析はｍ／ｚ９７９．４の分子イオンを示し、Ｎａ寄与分を差し引くとＱＳ−Ｌ１の分子量は約９５６ダルトンであると推論される。また、ＱＳ−Ｌ１は、前記のＲＰ−ＨＰＬＣ方法を用いてＱｕｉｌ−Ａ（ＳｕｐｅｒｆｏｓＢｉｏｓｅｃｔｏｒａ／ｓ，Ｆｒｙｄｅｎｌｕｎｄｓｖｅｊ３０，ＤＫ−Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のような他のクイラヤ抽出物から分離し得る。ＱＳ−Ｌ１の毒性は７２時間内にマウスに死をもたらす腹腔内注射投与量から測定できる。このような実験によれば、ＱＳ−Ｌ１は５００μｇ以下の投与量でマウスに致命的でないことが明らかになった。ＱＳ−Ｌ１を抗原と単独で用いた場合、ＱＳ−Ｌ１は当分野で公知のいくつかのサポニン成分、たとえば、ＱＳ−２１に比べて低い免疫アジュバント活性を示す。しかし、他のアジュバント、たとえば、ミョウバンと配合して用いた場合、ＱＳ−Ｌ１は著しく高い免疫アジュバント活性を示す。このような二つまたはその以上のアジュバントの間の強い相乗的相互作用はこれまで報告されていない。したがって、本発明は、抗原および、ＱＳ−Ｌ１と他のアジュバント、好ましくはミョウバンを含むアジュバント組成物からなるワクチン製剤をさらに提供する。ミョウバンはそれに抗原が吸着された形態であるものが好ましい。本発明に用いるに適切は抗原は特定の抗原に限られるのではなく、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ＨＩＶおよびＨＣＶなどの抗原を含む。本発明の製剤中の抗原の濃度は種々の因子、たとえば、抗原の種類、求められる抗原性の水準、接種する対象の特性および好ましい免疫程度によって調整できる。本発明のワクチン製剤は、注射可能な溶液または懸濁液の形態であり得、これは通常の方法によって製造できる。この製剤はまた、薬剤学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤をさらに含むことができる。適切な賦形剤は、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびこれらの混合物を含む。また、この組成物は湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などを追加的に含み得る。このワクチン製剤の通常的な１回投与量は、製剤の形態によって変わり、前述した種々の関連因子に照らして決定しなければならない。本発明のワクチン製剤中のＱＳ−Ｌ１の一日投与量は１〜５００μｇ、好ましくは１０〜５０μｇであり、ミョウバンの一回投与量は、好ましくは５０μｇ〜５００μｇである。また、本発明は、サポニン成分ＱＳ−Ｌ１を、好ましくはミョウバンを第２アジュバントとして配合して、免疫アジュバントとして用いることによって前記ワクチン製剤中の抗原の抗原性を増加させる方法を提供する。下記参照例および実施例は本発明をさらに詳細に説明するために例示するのみで、本発明の範囲を限定しない。また、以下固体混合物中の固体、液体中の液体および液体中の固体に対する百分率は、特に言及しない限り、それぞれ重量／重量、体積／体積および重量／体積に基づいたものである。参照例：サポニン成分の免疫アジュバント活性測定商品化されたＥｕＶａｘ（ＬＧＣｈｅｍｉｃａｌＬｔｄ．，大韓民国特許第３８８３７号）の製造方法に従って、ミョウバンに吸着されたＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を製造した。ＨＢｓＡｇとミョウバン（３％水酸化アルミニウム）とを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１．２ｍＭ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ８．８ｍＭＫ₃ＰＯ₄、０．８％ＮａＣｌ、ｐＨ６．３−６．５）中で、２５００μｇミョウバンに対してＨＢｓＡｇ１００μｇの比で混合し、混合物をオービタール撹拌機（Ｏｒｂｉｔａｌｓｈａｋｅｒ）“ＲｅｄＲｏｔｏｒ”、Ｈｏｅｆｅｒ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）で６時間撹拌してミョウバンに吸着されたＨＢｓＡｇを得た。その後、ミョウバンに吸着されたＨＢｓＡｇを用いて次のようにサポニン成分の免疫アジュバント活性を測定した。サポニン成分を２ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に溶かした。サポニン溶液５０μｌをミョウバンに吸着されたＨＢｓＡｇ（１００μｇＨＢｓＡｇ／２５００μｇミョウバン）１ｍｌに加えてＨＢｓＡｇワクチン注射液を製造した。５０μｌのワクチン注射液を７ないし８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅ′ｓＲｉｖｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｊａｐａｎ）の背中の２点に各々皮下注射し、３週間隔に同一量のワクチン注射液を用いて２回連続的に追加接種をした。最終の追加接種してから１７日後、マウスの尻尾から血液試料を採取し、次のようにＨＢｓＡｇに対して形成された抗体の力価を測定した。精製したＨＢｓＡｇを５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に０．５μｇ／ｍｌの濃度で溶かした。この溶液をマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎｔｙｐｅ１，ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ，Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のウェルに２００μｌ／ウェルの量で加えた後、３７℃で２時間培養した。その後、０．２％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含有するリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を２５０μｌ／ウェルの量でウェルに加えた。プレートを３７℃で１時間培養して残っている蛋白質吸着部位を遮断することによって、以降に起こり得る非−特異的反応を防止した。このウェルを０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含有するＰＢＳ（“洗浄液 ”）で２回洗浄した。マウスから得た血液試料を０．２５％（ｗ／ｖ）ゼラチン、１．０ｍＭＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００および０．０２％（ｖ／ｖ）チメロサールを含むＰＢＳ（“希釈液”）で４００倍に希釈し、さらに前記希釈液で２倍階段希釈法にしたがって最終的に８１９，２００倍になるまでさらに希釈してウェルに加えた。３７℃で２時間培養したプレートのウェルを洗浄液で５回洗浄し、前記希釈液を用いて４，０００倍希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された抗−マウス抗体（ＡｍｅｒｉｃａｎＱｕａｌｅｘ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１０６ＰＳ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む溶液を２００ μｌ／ウェルの量でウェルに加えた。この結果物を３７℃で２時間培養し、前記洗浄液で５回洗浄した。その後、Ｏ −フェニレンジアミン二塩酸（ＯＰＤ）錠剤（Ｓｉｇｍａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を５０ｍＭクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かして製造した基質溶液２００μｌを各ウェルに加え、プレートを室温の暗所で３０分間培養した。この結果物に４Ｎ硫酸をウェル当り５０μｌずつ加えて発色を中止させ、タイターテックマルチスキャンプラス（ＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｉｓｃａｎＰｌｕｓ（Ｆｌｏｗｌａｂ））を用いて４９２ｎｍで各ウェルのＯ．Ｄ．を測定した。抗体力価はＯ．Ｄ．値が０．５に至るに必要な希釈倍数の逆数で決定した。実施例１：クイラヤサポナリヤモリナからサポニン成分の分離（段階１）精製したサポニン抽出物の製造キュウ．サポナリヤモリナの樹皮を水で抽出して得られたサポニンを５０％以上含有する抽出物をベルグハンセン社（ＢｅｒｇｈａｎｓｅｎＣｏｒｐ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。このサポニン粉末を４０ｍＭ酢酸水溶液に２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かした。生成した溶液を遠心分離機（ＢｅｃｋｍａｎＪ２−２１，ＪＡ１４）で１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不溶性物質を除いた。上澄液を１２ないし１４ｋＤａの分子量カット−オフ値を有する限外透析膜（ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＩｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．１３２６７６）を用いて、５０倍容量の４０ｍＭ酢酸溶液で２回透析することによって低分子量の水溶性物質を除いた。透析物を再び遠心分離して不溶性不純物を完全に除き、上澄液を凍結乾燥することによって精製されたサポニン粉末を得た。このように得られたサポニン抽出物のシリカゲル薄層クロマトグラフィー結果は、この抽出物の組成および純度がＱｕｉｌ−Ａと非常に類似するということを示す。 (段階２)Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによるサポニン成分の分離段階１で得られたサポニン抽出物を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かした。生成した溶液０．１ｍｌを０．１％ＴＦＡ溶液であらかじめ平衡化されたＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ，４．６ｘ２５０ｍｍ）に１ｍｌ／分の流速で通した。表１に示されているアセトニトリル濃度勾配を用いて結合しているサポニンを溶出させ、溶出物を２１４ｎｍで検出した。３２個以上のサポニン成分が異なる保持時間で溶出されることが観察された。保持時間によって分画を集めて多数の純粋なサポニン成分を得た。サポニン抽出物中の各サポニン成分は相対比０．１３〜３２％の範囲で多様に分布していた。参照例の方法に従って、精製したサポニン成分の免疫アジュバント活性を測定し、比較的に高い免疫原性増強効果を示す５個の成分をそれぞれＱＳ−Ｌ１、ＱＳ−Ｌ２、ＱＳ−Ｌ３、ＱＳ−Ｌ４およびＱＳ−Ｌ５と命名した。この５個の成分に該当するピークの面積（％）およびこれらの保持時間は表２に示す。この５個の成分に該当するピークの位置は図１に示す。ＱＳ−Ｌ１、ＱＳ−Ｌ２、ＱＳ−Ｌ３、ＱＳ−Ｌ４またはＱＳ−Ｌ５を含む各分画を凍結乾燥し、前記と同様なＲＰ−ＨＰＬＣ手順を繰り返して９０〜９７％の範囲の純度の各成分を得た。同様なＲＰ−ＨＰＬＣ手順をＱｕｉｌ−Ａ（ＳｕｐｅｒｆｏｓＢｉｏｓｅｃｔｏｒａ／ｓ，Ｆｒｙｄｅｎｌｕｎｄｓｖｅｊ３０，ＤＫ− Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に適用したところ、成分の相対比が樹皮抽出物からのものと多少異なることを除いては、前記と同一なセットのサポニン成分が観察された。（段階３）精製したサポニン成分のシリカゲル薄層クロマトグラフィー段階２で得られたサポニン成分ＱＳ−Ｌ１、ＱＳ−Ｌ２、ＱＳ−Ｌ３、ＱＳ− Ｌ４およびＱＳ−Ｌ５各１μｇおよびＱｕｉｌ−Ａ（ＳｕｐｅｒｆｏｓＢｉｏｓｅｃｔｏｒａ／ｓ，Ｆｒｙｄｅｎｌｕｎｄｓｖｅｊ３０，ＤＫ−Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）４０μｇをシリカゲル薄層クロマトグラフィープレート（Ｓｉ６０ＨＰＴＬＣＥ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ）に加え、展開液としてクロロホルム／メタノール／蒸留水（６２：３２：６（ｖ／ｖ／ｖ））の混合物を用いて３〜４時間溶出させた。プレートを８０℃で約１時間乾燥した後、バイアル試薬（Ｂｉａｌ′ｓｒｅａｇｅｎｔ；ＯｒｃｉｎｏｌＦｅｒｒｉｃＣｈｌｏｒｉｄｅ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０−７８７５）をその上に噴霧して発色させた。その後、プレートを８０℃で３０分間乾燥し、サポニン成分の糖残基を選択的に染色した。その結果は図３に示し、ここで第１列はＱｕｉｌ−Ａであり、第２列はＱＳ−Ｌ１、第３列はＱＳ−Ｌ２、第４列はＱＳ−Ｌ３、第５列はＱＳ−Ｌ４であり、各サポニン成分は単一バンドで表されている。実施例２：質量分析法サポニン成分ＱＳ−Ｌ１の分子量は、電子噴霧イオン化（ＥＳＩ−ＭＳ）方法を用いるＶＧＱｕａｔｔｒｏＬＣ／ＭＳ（ＶａｃｃｕｍＧｅｎｅｒａｔｏｒ，ＵＫ）で測定し、ここで溶離液としてアセトニトリル／蒸留水／酢酸（６０：４０：０．５（ｖ／ｖ／ｖ））を用いた。その結果、図４に示したように、９７９．４（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｎａ］⁺イオン性分子ピークが検出された。しかし、ナトリウムイオンがそれに含まれているので、前記（ｍ／ｚ）値から２３を減じなければならない。したがって、純粋なＱＳ−Ｌ１の分子量は、約９５６ダルトンと測定され、これはケルステンら（ＷＯ９２／０６７１０）によって開示されたＱＡ−３の分子量、すなわち、１８６２ダルトンに比べて非常に小さい。また、これは、ケンシルら（Ｖａｃｃｉｎｅ，９２，３５−４０，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）によって開示されたＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ −２１の分子量、すなわち、それぞれ２３７１、２１７４および２０１２とも相当異なる。したがって、ＱＳ−Ｌ１は新規なクイラヤサポニン成分であるということが確認された。実施例３：サポニン成分およびＱｕｉｌ−Ａの毒性粗クイラヤサポニン成分を投与した時、マウスでの毒性の主な徴候は肝の壊死として現れる。ＱＳ−Ｌ１、ＱＳ−Ｌ２、ＱＳ−Ｌ３、ＱＳ−Ｌ４、ＱＳ−Ｌ５およびＱｕｉｌ−Ａの毒性を調べるため、８週齢のＣＤ−１雄マウス（Ｃｈａｒｌｅ′ｓＲｉｖｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｊａｐａｎ）に表３に示されているようにそれぞれ１２５、２５０または５００μｇのサポニン成分およびＱｕｉｌ−Ａを皮内注射した。対照群には生理食塩水のみを注射した。その結果、サポニン成分およびＱｕｉｌ−Ａの投与後７２時間内に死んだマウスの数をケンシルら（Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，４３１−４３７（１９９１））によって開示された結果と比べて表４に示した。前記結果は、Ｑｕｉｌ−Ａがずいぶん高い毒性を示し、この毒性の主要な原因はＱＳ−１８に該当すると推定されるＱＳ−Ｌ４であるということを示す。ＱＳ −Ｌ１およびＱＳ−Ｌ２は５００μｇの投与量水準で毒性をほとんど示さなかった。ＱＳ−２１と同一であると推定されるＱＳ−Ｌ５は、５００μｇ投与量で５匹のマウス中３匹が死んだため、高い毒性を有すると思われる。実施例４：サポニン成分の溶血活性ケルステンら（ＷＯ９２／０６７１０）またはケンシルら（ＵＳＰ５、０５７、５４０号（１９９１））の方法に従って、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を用いてＱＳ−Ｌ１、ＱＳ−Ｌ２、ＱＳ−Ｌ３、ＱＳ−Ｌ４、ＱＳ−Ｌ５およびＱｕｉｌ −Ａの溶血活性を測定した。まず、ＱＳ−Ｌ１、ＱＳ−Ｌ２、ＱＳ−Ｌ３、ＱＳ−Ｌ４、ＱＳ−Ｌ５およびＱｕｉｌ−Ａ各５００μｇ／ｍｌを２倍階段希釈法によって４μｇ／ｍｌの最終濃度までそれぞれ希釈した。アルセルベル溶液（Ａｌｓｅｒｂｅｒ′ｓＳｏｌｕｔｉｏｎ）に分散したＳＲＢＣ（ＫｏｒｅａｍｅｄｉｃａｌＣｏ．）５ｍｌを１５ｍｌコニカル管に入れた後、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿したＳＲＢＣに生理食塩水１０ｍｌを加え、この混合物を前記と同様な条件下で遠心分離した。この洗浄過程を１回さらに繰り返した。沈殿したＳＲＢＣを回収し、４％（ｖ／ｖ）の最終濃度で生理食塩水に分散させた。ＳＲＢＣ溶液１５０μｌすつを９６−ウェル丸底マイクロタイタープレートの各ウェルに加え、前記で製造したサポニン成分希釈液を５０ μｌ／ウェルの量でウェルに加えた。３７℃で３０分間培養した後、マイクロプレート遠心分離機を使って３０分間培養した後、マイクロプレート遠心分離機（Ｈａｎｉｌ，Ｋｏｒｅａ）を用いてプレートを２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して溶血しなかった細胞を沈殿させた。各ウェルの上澄液１００μｌを平底マイクロタイタープレートのウェルに移し、ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）マイクロタイタープレートリーダーを使って吸光度を測定した。その結果は図５に示し、ここでＱＳ−Ｌ３、ＱＳ−Ｌ４およびＱＳ−Ｌ５は２０μｇ／ｍｌでずいぶん高い溶血活性を示した反面、ＱＳ−Ｌ１は５００μｇ／ｍｌまで溶血活性を示さなかった。この結果は、ＱＳ−Ｌ１が５００μｇ／ｍｌまでの濃度で選択的にミョウバンに吸着された抗原に対する免疫アジュバントとして安全で効果的に使用され得ることを示す。実施例５：サポニン成分の免疫アジュバント活性サポニン成分ＱＳ−Ｌ１、ＱＳ−Ｌ２、ＱＳ−Ｌ３、ＱＳ−Ｌ４およびＱＳ− Ｌ５の免疫アジュバント活性は参照例と同様な手順に従って測定し、その結果から得られた抗体力価を表５に示す。サポニン成分ＱＳ−Ｌ１、ＱＳ−Ｌ２、ＱＳ−Ｌ３、ＱＳ−Ｌ４およびＱＳ− Ｌ５は、ミョウバンと配合して用いた時、ミョウバン単独で用いた場合より優れた免疫アジュバント活性を示した。特に、ミョウバン＋ＱＳ− Ｌ１は最も高い免疫アジュバント活性を示した。したがって、実施例３および本実施例の結果から分かるように、ミョウバン＋ＱＳ−Ｌ１は毒性がほとんどなくかつ既存の他のアジュバントより優れた免疫アジュバント活性を示す。実施例６：サポニン成分ＱＳ−Ｌ１を免疫アジュバントとして含むワクチン製剤他の免疫アジュバントと共に用いる場合、ワクチン製剤中のＱＳ−Ｌ１の免疫アジュバント活性は次のように測定した。まず、２０μｇＨＢｓＡｇ／５００μｇミョウバン／ｍｌを含む組換えＢ型肝炎ワクチンであるＥｕＶａｘ（ＬＧＣｈｅｍｉｃａｌＬｔｄ．Ｋｏｒｅａ）１ｍｌを、サポニン成分ＱＳ−Ｌ１を２ｍｇ／ｍｌ濃度で蒸留水に溶かしたＱＳ −Ｌ１溶液５０μｌと混合してミョウバンとＱＳ−Ｌ１を免疫アジュバントとして含むＢ型肝炎ワクチン製剤（製剤１）を製造した。一方、ミョウバンに吸着していない20μｇ／ｍｌ遊離ＨＢｓＡｇ１ｍｌを２ｍｇ／ｍｌＱＳ−Ｌ１５０μｌと混合してＱＳ−Ｌ１のみをアジュバントとして含むＢ型肝炎ワクチン製剤（製剤２）を製造した。陽性対照群としては、２０μｇ／ｍｌの濃度でＦＣＡを同量のＨＢｓＡｇと混合することによって製造した、油中水型エマルジョン形態のフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）をアジュバントとして含有するＢ型肝炎ワクチン製剤（製剤３）を用いた。製剤１、２、３およびＥｕＶａｘ各５０μｌずつを７ないし８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの背中の２点に皮下注射した。製剤３、すなわち、ＦＣＡ製剤０．１ｍｌはマウスに腹腔内注射した。マウスの追加免疫化および抗体力価の測定は参照例と同様な方法で行われ、ただし、製剤３でのＦＣＡは追加接種時にフロイント不完全アジュバントに交替された。その結果を下記表６に示す。表６から分かるように、ＱＳ−Ｌ１は単独で用いた場合、ミョウバンを単独で用いた場合より低い免疫アジュバント活性を示した。しかし、ＱＳ−Ｌ１をミョウバンと配合して用いた時、ＱＳ−Ｌ１はミョウバンを単独で用いた時の活性の３〜４倍に当たる高い免疫アジュバント活性を示した。したがって、ミョウバン＋ＱＳ−Ｌ１は、ミョウバン単独より優れた免疫アジュバントとして使用され得る。この結果はミョウバンとサポニン成分ＱＳ−Ｌ１が相乗作用を起こして免疫アジュバント活性を増加させ得ることを示す。実施例７：細胞性免疫応答に対するＱＳ−Ｌ１の影響細胞性免疫応答に対するＱＳ−Ｌ１の影響を、実施例６で製造したＢ型肝炎ワクチン製剤で注射した後、ＨＢｓＡｇで処理されたマウスから得られた脾臓細胞の増殖反応を測定することによって調べた。脾臓細胞の増殖はビアースら（Ｂｙａｒｓ）の方法（Ｖａｃｃｉｎｅ，９，３０９−３１７（１９９１））に従って測定した。まず、参照例の方法に従って、実施例６で製造したワクチン製剤でマウスを免疫した。最終の追加接種をしてから２週後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、これから脾臓細胞を得た。脾臓細胞を２ｘ１０⁵個、１０％牛胎児血清および２ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地が入っているＵ−型９６−ウェル培養プレートのウェルに入れた。対照群として用いられた４個のウェルを除いた各ウェルにＨＢｓＡＧを１μｇ／ｍｌの濃度で加えた。プレートを３７℃で７％ＣＯ₂大気下で４日間培養した。培養が終わると、³Ｈ−チミジン（ＡｍｅｒｓｈａｍＣａｔ．Ｎｏ．ＴＲＫ６８６）０．５μＣｉを各ウェルに加えてプレートを前記と同様な条件下で２４時間さらに培養した。細胞収穫機（Ｓｋａｔｒｏｎ）を用いて細胞を集め、細胞内に結合された³Ｈ−チミジンの量を液体シンチレーション計測管で測定した。各アジュバントの免疫アジュバント活性は下記式によって計算された刺激指数（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ，ＳＩ）で示した：ＳＩ＝ＨＢｓＡｇで処理した試料のｃｐｍＨＢｓＡｇで処理しなかった試料のｃｐｍこの結果を図６Ａおよび６Ｂで示すが、ここで２匹（図６Ａ）または４匹（図６Ｂ）のマウスに各ワクチン製剤を与える二つの独立的な実験を実施した。“正常”はＨＢｓＡｇで処理しなかったマウスからの脾臓細胞をいう。ミョウバンと共に結合しているＱＳ−Ｌ１を含むワクチンはミョウバンのみを含むワクチン製剤より細胞性免疫応答が顕著に高いことを示す。本発明を前記特定実施形態と関連させて記述したが、添付した特許請求範囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変化させ得ることは勿論である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者クウォンヨングソン大韓民国デジョン 302−173 ソ−グデュンサン−ドング＃970 ヒャングチョンアパートメント 107−504 (72)発明者ジョジュングミョング大韓民国デジョン 305−390 ユソング −グジョンミン−ドング＃464−１エキシポアパートメント 509−401

Claims

【特許請求の範囲】１．水／アセトニトリル（７／３；ｖ／ｖ）中の０．１ｗｔ％トリフルオロ酢酸溶液を用い、４．６ｘ２５０ｍｍバイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ４カラム上、１ｍｌ／分の流速で逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により分析したとき約１４分の保持時間；及びＥＳＩ−ＭＳで分析したとき、ｍ／ｚが９７９．４の分子イオンにより特徴付けられるＱＳ−Ｌ１と命名されたクイラヤ樹皮抽出物から分離した実質的に純粋なサポニン成分。２．（ａ）酢酸水溶液中の樹皮抽出物溶液を遠心分離して上澄液を得ること、（ｂ）１２〜１４ｋＤ範囲の分子のカット−オフ値を有する限外透析膜を用いて酢酸水溶液で該上澄液を透析すること、（ｃ）生成した透析物を遠心分離して第２上澄液を得ること、（ｄ）前記第２上澄液を凍結乾燥してサポニン抽出物粉末を得ること、及び（ｅ）前記サポニン抽出物粉末を適切な溶媒に溶かし、この溶液を０．１％トリフルオロ酢酸を含む３０〜４０％アセトニトリルの線形濃度勾配下にＣ４ＲＰ −ＨＰＬＣカラムを用いるＲＰ−ＨＰＬＣにかけることによって実質的に純粋なＱＳ− Ｌ１を含む分画を得ることを含むクイラヤサポナリヤモリナの樹皮抽出物から請求項１に記載のサポニン成分ＱＳ−Ｌ１を分離する方法。３．抗原、免疫アジュバントとして請求項１に記載のサポニン成分ＱＳ−Ｌ１および第２アジュバントを含むワクチン製剤。４．前記第２アジュバントがミョウバンである請求項３に記載のワクチン製剤。５．前記抗原がミョウバンに吸着している請求項４に記載のワクチン製剤。６．前記抗原がＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である請求項３に記載のワクチン製剤。７．ＱＳ−Ｌ１を１〜５００μｇ／単一投与量の範囲の量で含有する請求項３に記載のワクチン製剤。８．請求項１に記載のサポニン成分ＱＳ−Ｌ１を免疫アジュバントとして第２アジュバントと共に用いることを含むワクチン製剤中の抗原の抗原性を増加させる方法。９．前記第２アジュバントがミョウバンである請求項８に記載の方法。１０．前記ワクチン製剤中のＱＳ−Ｌ１の量が１〜５００μｇ／単一投与量の範囲である請求項８に記載の方法。