JPH10293256A

JPH10293256A - レーザ走査型顕微鏡

Info

Publication number: JPH10293256A
Application number: JP10200697A
Authority: JP
Inventors: Shingo Kashima; 伸悟鹿島
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1997-04-18
Publication date: 1998-11-04

Abstract

(57)【要約】【課題】実際的な２次元でのビーム照射及びビームスキ
ャンを成し得る、複数のビーム照射によって超解像を得
るレーザ走査型顕微鏡を提供する。【解決手段】コリメートされたレーザビームを出射する
第１のレーザ１と、該レーザビームを光軸を含む少なく
とも一つの断面で見たとき二つの光束に分割する光束分
割手段２と、分割された光束の交点近傍、又は該分割さ
れた光束の交点近傍を光学系で投影した位置、又は該光
束分割手段による光束の分割位置に配置されたスキャナ
４を有している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、複数のレーザビー
ムを標本面上に集光させてスキャンさせ、それら複合ビ
ームスポットのある範囲からの螢光を検出することによ
り像を得るレーザ走査型顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来のレーザ走査型顕微鏡に関する先行
技術としては、照明（励起）光学系の光路中に、レーザ
光束を輪帯光束にする手段を備えたレーザ走査型顕微鏡
（特開平２−２４７６０５号公報）や、アキシコンプリ
ズムによりベッセルビームを生成し、それをもう一つの
アキシコンプリズムと投影光学系により標本面に投影す
るようにしたもの（特開平８−１５１５６号公報）があ
る。前者は、輪帯光束にしたレーザビームを標本面に集
光させることにより面内解像力を向上させるようにした
ものであり、また、後者は、アキシコンプリズムにより
ベッセルビームを標本面上に投影することにより焦点深
度の深い像を一度に得るようにしたものであるが、これ
らのものは、いずれも、一つの像を得るのに必要なレー
ザビームは一本である。

【０００３】ところで、上記の如き技術を用いた顕微鏡
より、更に、高い解像度を得るためには、一つの像を得
る為に複数のレーザビームを用いた超解像レーザ走査型
顕微鏡が用いられる。超解像レーザ走査型顕微鏡の原理
に関しては、文献１："Breaking the diff-raction res
olution limit by stimulated emission ： stimulated
-emission-depletion fluoresceuce microscopy / by
S.W.Hell / Optics Letters, Vol.19(1994), pp.780-78
2" ：及び文献２："Improvement of lateral resolutio
n infar-field fluorescence light microscopy by usi
ng two-photon excitationwith offset beams / by S.
W.Hell / Optics Communications, Vol.106(1994),pp.1
9-24" ：に詳しく述べられているが、以下これらについ
て簡単に説明する。

【０００４】文献１に示されたものは、ＳＴＥＤ励起螢
光ＬＳＭと呼ばれるもので、螢光発生を抑制するような
エネルギーを持ったビームを、励起レーザスポットの両
側に近接させて照射することにより実質的に螢光の発生
する領域を小さくし、所謂回折限界以下の小さな領域か
らのみ蛍光を発生させて、超解像を得るというものであ
る。また、文献２に示されたものはダブルビーム螢光Ｌ
ＳＭと呼ばれるもので、二つのレーザビームをスポット
が近接するようにして照射することにより、それら二つ
のスポットの重なった部分のみから螢光を発生させるよ
うにし、実質的に螢光の発生する領域を小さくして、超
解像を得るというものである。

【０００５】所謂ＳＴＥＤ螢光ＬＳＭに関するものとし
ては、螢光を発生させる励起用のレーザとその集光位置
の近傍に螢光現象を抑制するための別のレーザビームを
照射／集光させることより、実質的に螢光を発する領域
を小さくし、超解像を行うもの（ＷＯ９５／２１３９
３公報）があり、他方、所謂ダブルビーム螢光ＬＳＭ
に関するものとしては、標本面上に少しオフセットした
二つのビームを照射し、その重なった部分でのみ螢光が
励起されるようにしたもの（ＤＥ４３３４５７０Ｃ
２公報）がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらのもの
は、「複数のビーム照射によって超解像を得るレーザ顕
微鏡」の原理を示してはいるが、いずれも試料上におい
て光軸を含むある一断面の状態しか考えておらず、具体
的な２次元でのビーム照射方法やビームスキャン方法に
関しては何等示されておらず、実現性に欠ける。本発明
は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、実際的な
２次元でのビーム照射及びビームスキャンを成し得る、
複数のビーム照射によって超解像を得るレーザ走査型顕
微鏡を提供することを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明によるレーザ走査型顕微鏡は、コリメートさ
れたレーザビームを出射する光源と、該レーザビーム
を、光軸を含む少なくとも一つの断面で見たとき少なく
とも二つの光束となるように分割する光束分割手段と、
分割された光束の交点近傍、又は該分割された光束の交
点近傍を光学系で投影した位置、又は該光束分割手段に
よる光束の分割位置に配置されたスキャナを有すること
を特徴とするものである。これにより、少なくとも光軸
を含むある断面では複数のビームが形成され、また、そ
の交点は光学系の瞳位置に相当するため、その交点に配
置したスキャナを用いて光束スキャン方式による像取得
ができる。

【０００８】また、本発明によるレーザ走査型顕微鏡
は、好ましくは、レーザビームを出射する、前記光源と
は別の光源と、該別の光源より出射されたレーザビーム
を前記スキャナの光軸上に合流させるための光束結合手
段を有することを特徴とするものである。これにより所
謂ＳＴＥＤ螢光ＬＳＭでは励起用のレーザと螢光抑制用
のレーザを同軸で照射させることが可能となり、他方、
所謂ダブルビーム螢光ＬＳＭでは波長や偏光状態の異な
る二つのレーザを同軸で照射させることが可能となる。

【０００９】また、本発明によるレーザ走査型顕微鏡
は、好ましくは、前記光束分割手段が回折光学素子であ
ることを特徴とするものである。これにより一つのビー
ムを効率良く複数のビームに分割することが可能とな
り、且つ、ビームの分割比や分割方向を自由に設定可能
となる。

【００１０】また、本発明によるレーザ走査型顕微鏡
は、好ましくは、前記光束分割手段がアキシコンプリズ
ムであることを特徴とするものである。これにより一つ
のビームを効率良く円錐状に分割することが可能とな
り、且つ、その頂角の角度を変えることにより、ビーム
の分割方向を自由に設定可能となる。

【００１１】また、本発明によるレーザ走査型顕微鏡
は、好ましくは、前記光束分割手段が複屈折光学素子で
あることを特徴とするものである。これにより一つのビ
ームを効率よく二分割することが可能となり、且つ、複
屈折媒質の結晶軸の方向や形状により、ビームの分割方
向を自由に設定可能となる。

【００１２】また、本発明によるレーザ走査型顕微鏡
は、好ましくは、前記複屈折光学素子がノマルスキープ
リズムであり、該ノマルスキープリズムと偏光板が対に
なり光軸を回転中心として回転することを特徴とするも
のである。これにより分割された二光束の交点（瞳）を
光学素子の外側に形成することが可能となり、更に、光
軸を中心としたある半径の円周上にレーザを照射するこ
とができる。

【００１３】また、本発明によるレーザ走査型顕微鏡
は、好ましくは、前記複屈折光学素子がノマルスキープ
リズムであり、該ノマルスキープリズムとスキャナとの
間にイメージローテータを有し、該イメージローテータ
が光軸を回転中心として回転することを特徴とするもの
である。これにより分割された二光束の交点（瞳）を光
学素子の外側に形成することが可能となり、更に、光軸
を中心としたある半径の円周上にレーザを照射すること
ができる。

【００１４】また、本発明によるレーザ走査型顕微鏡
は、一本のコリメートされたレーザビームを出射する光
源と、レーザビームを出射する、前記光源とは別の光源
と、該別の光源より出射されたレーザービームが、周辺
の強度が中心に比べて強いレーザビームであるようにす
る手段と、該別の光源により出射された周辺の強度が中
心に比べて強いレーザビームの平行度を調整可能な光学
系と、該二本のレーザビームを同軸に合流させる光束結
合手段を有することを特徴とするものである。これによ
り所謂ＳＴＥＤ螢光ＬＳＭ励起用のレーザによるレーザ
ビームと螢光抑制用のレーザによるレーザビームを同軸
で照射可能であり、且つ、螢光抑制用のレーザビームを
上記周辺の強度が中心に比べて強いものとすることによ
り、それを集光させた時の点像強度分布は１次暗環が小
さく、中心を０次とした時の１次明環の強度が大きいも
のとすることができる。更に、その周辺の強度が中心に
比べて強いレーザビームを、レーザビームの平行度を調
整可能な光学系を介して、若干発散若しくは収斂させて
顕微鏡光学系に導入することにより、標本面で若干デフ
ォーカスしたスポットとすることが可能となるため、合
焦時以上に０次の強度が低下し、１次明環の強度が強い
ビーム、即ち、光軸を中心とした円周上に強い強度分布
を持つビームとして照射することができる。

【００１５】また、本発明によるレーザ走査型顕微鏡
は、好ましくは、前記周辺の強度が中心に比べて強い別
のレーザビームが、レーザの発振の強度分布自体が中心
に比べて周辺が強くなっているレーザであることを特徴
とするものである。これにより、周辺の強度が中心に比
べて強いレーザビームを形成する光学系が不要でありな
がら上記の如き効果が得られる。

【００１６】また、本発明によるレーザ走査型顕微鏡
は、好ましくは、前記周辺の強度が中心に比べて強い別
のレーザビームが、レーザの発振の強度分布自体がガウ
ス分布となっているビームを輪帯状のビームに変形する
光学系によって形成されていることを特徴とするもので
ある。これにより通常のレーザを用いても、変形光学系
により様々な輪帯度のビームを形成することができ、上
記の効果を可変とすることができる。

【００１７】また、本発明によるレーザ走査型顕微鏡
は、好ましくは、前記レーザビームの平行度を調整可能
な光学系が二群構成からなり、その群間隔が可変となっ
ていることを特徴とするものである。これにより前群
（レーザ側）レンズの後側焦点位置と後群レンズの前側
焦点位置をずらすことにより、後群レンズ通過後の光束
を若干発散光束若しくは収斂光束として顕微鏡光学系に
導入することが可能となり、標本面で若干デフォーカス
したスポットとすることができる。

【００１８】

【発明の実施形態】本発明によるレーザ走査型顕微鏡の
概念図を図１に示す。第１のレーザ１から出射された光
束を、光軸を含む少なくとも一つの断面で見たとき少な
くとも二つの光束となるように分割する光束分割手段２
で二分割し、二分割した光束を投影光学系３で顕微鏡光
学系の瞳近傍のある点で交わらせ、その交点にスキャナ
４を配し、スキャンした光束を瞳投影レンズ５で対物レ
ンズの像位置６に集光させ、走査するようになってい
る。尚、対物レンズの像位置６から標本面までは通常の
顕微鏡と同様の構成となっている（図示省略）。一方、
第２のレーザ７から出射された光束は、投影光学系３と
スキャナ４の間に配された光束結合手段８により第１の
レーザ光学系と同軸に合流されるようになっており、ス
キャナ４がスキャン範囲の中心にあるとき、第２のレー
ザ７から出射されたビームは、対物レンズの像中心に集
光し、第１のレーザから出射されたビームは、それを挟
んでその近傍両側に集光する。ＳＴＥＤ螢光ＬＳＭの場
合、第１のレーザ１が螢光抑制用、第２のレーザ７が螢
光励起用となる。

【００１９】以下、本発明の実施形態につき、図を用い
て具体的に説明する。第一実施形態を図２に示す。本実
施形態の顕微鏡は、レーザ１から出射された光束が、断
面が矩形の等間隔同心円状の反射型回折光学素子９に４
５度の入射角で導かれるようになっており、反射型回折
光学素子９は、その位相差を適切に選ぶことにより０次
光１９と＋１次光２０及び−１次光２１の強度を等しく
することができ、０次光１９が直角に回折（反射）さ
れ、＋１次光２０及び−１次光２１がピッチと波長で決
まるある回折角を持って回折されるようになっている。
このとき、反射型回折光学素子９は、全ての回折光の交
点（瞳）となるように位置するため、これをスキャンす
ることによりスキャナとしても作用し、スキャンされた
光束群は瞳投影レンズ５で対物レンズの像位置６に集光
される。更に、＋１次光２０及び−１次光２１は円錐状
に回折され、対物レンズの像位置６では０次光１９を中
心とし、その周りを２次元的に取り巻くように照射せし
められるため、実用的な２次元でのＳＴＥＤ螢光ＬＳＭ
が可能となる。

【００２０】第二実施形態を図３に示す。本実施形態の
顕微鏡は、第１のレーザ１から出射された光束をアキシ
コンプリズム１０に導入して、円錐状の光束に変換し、
これらの光束の交点（瞳）を瞳リレーレンズ１１で投影
するようになっており、その投影位置には、ガルバノミ
ラー１２が配置されている。また、瞳リレーレンズ１１
とガルバノミラー１２の間には、ビームコンバイナ１３
が配置されており、第２のレーザ７から出射された光束
を第１のレーザ１光学系と同軸に合流させるようになっ
ている。これら合流された光束は、ガルバノミラー１２
でスキャンされ、瞳投影レンズ５で対物レンズの像位置
６に集光される。このとき、対物レンズの像位置６では
第２のレーザ７の集光ビームを中心とし、その周りを第
１のレーザ１からの集光ビームが２次元的に取り巻くよ
うに照射せしめられるので、実用的な２次元でのＳＴＥ
Ｄ螢光ＬＳＭが可能となる。尚、本実施形態では、光束
分割手段としてアキシコンプリズムを用いたので、一つ
のビームを効率良く円錐状に分割することが可能とな
り、且つ、その頂角の角度を変えることにより、ビーム
の分割方向を自由に設定可能となる。

【００２１】第三実施形態を図４に示す。本実施形態の
顕微鏡は、レーザ１から出射された光束を偏光板１４で
直線偏光とし、ノマルスキープリズム１５に導入するよ
うになっており、ノマルスキープリズム１５で常光線と
異常光線に分けられた光束が、入射レーザ光軸と軸対称
なある角度を持った二つの光束となり、イメージローテ
ータ１６を介して、ローカライズ位置１７で交わるよう
になっている。また、このとき、ローカライズ位置１７
は瞳位置に相当するため、ここにガルバノミラー１２を
配し、スキャンした光束を瞳投影レンズ５で対物レンズ
の像位置６に集光させるようになっている。尚、この状
態では、光軸を挟んで対称な二つのビームが対物レンズ
の像位置６に形成され、その二つの集光スポットが走査
されるだけであるが、イメージローテータ１６を高速で
回転させると、二つの集光スポットが光軸を回転中心と
した円環状に形成される。このとき、円環状の集光スポ
ットの半径が集光スポット自体の半径よりも小さくなる
ようなノマルスキープリズムを用いれば、それぞれの集
光スポットに重なる部分ができ、２次元の実際的なダブ
ルビーム螢光ＬＳＭが可能となる。尚、本実施形態にお
いて、イメージローテータ１６を固定させておくか、或
いは用いずに、偏光板１４とノマルスキープリズム１５
を一体として高速で回転させても、上記と同様に円環状
の集光スポットを得ることができる。

【００２２】第四実施形態を図５に示す。本実施形態の
顕微鏡は、第１のレーザ１としてＴＥＭ11のレーザ（ビ
ームの強度分布のピークが周辺部にあり、周辺の強度が
中心に比べて強いもの）を用い、そこから出射された光
束を正パワーのレンズ２枚からなる所謂ケプラー型のビ
ーム平行度調整可能光学系１８に導入するようになって
いる。また、第１レンズの後側焦点位置と第２レンズの
前側焦点位置をずらして、ビーム平行度調整可能光学系
１８を通過後の光束が若干発散光束若しくは収斂光束と
なるようにビームの平行度を調整し、該調整された光束
をガルバノミラー１２でスキャンさせ、瞳投影レンズ５
で対物レンズの像位置６に若干デフォーカス状態で照射
するようになっている。他方、第２のレーザ７としては
通常のＴＥＭ00のものを用い、ビーム平行度調整可能光
学系１８とガルバノミラー１２の間に配されたビームコ
ンバイナ１３により第１のレーザ光学系と同軸に合流さ
れるようになっている。第２のレーザ７より出射された
レーザビームは瞳投影レンズ５に導入され、対物レンズ
の像位置６に集光し、スキャンされるようになってい
る。尚、ＴＥＭ00のレーザの強度分布を図６(a) に、Ｔ
ＥＭ11のレーザの強度分布を図６(b) にそれぞれ示す。

【００２３】第１のレーザ１による集光スポットは、図
７(b) に示す如く、０次（中心）の強度２２が低下し、
１次明環の強度２３が強いビーム、即ち光軸を中心とし
た円周上に強い強度分布を持ち、第２のレーザ７による
集光スポットは、図７(a) に示す如く、通常の０次の強
度２２が最も強いものとなる。このとき、第１のレーザ
１による集光スポットはＳＴＥＤ螢光ＬＳＭの螢光抑制
用となり、第２のレーザ７による集光スポットは螢光励
起用となり、実用的な２次元でのＳＴＥＤ螢光ＬＳＭが
可能となる。即ち、本実施形態によれば、ＳＴＥＤ螢光
ＬＳＭ励起用のレーザと螢光抑制用のレーザを同軸で照
射可能であり、且つ、螢光抑制用のレーザを上記周辺の
強度が中心に比べて強いものとすることにより、それを
集光させた時の点像強度分布は１次暗環が小さく、中心
を０次とした時の１次明環の強度が大きいものとするこ
とができ、更に、その周辺の強度が中心に比べて強いレ
ーザビームを、レーザビームの平行度を調整可能な光学
系を介して、若干発散若しくは収斂させて顕微鏡光学系
に導入することにより、標本面で若干デフォーカスした
スポットとすることが可能となるため、合焦時以上に０
次の強度が低下し、１次明環の強度が強いビーム、即
ち、光軸を中心とした円周上に強い強度分布を持つビー
ムとして照射することができる。

【００２４】また、本実施形態とは異なり、第１のレー
ザ１として通常のＴＥＭ00のレーザを用い、光学系で輪
帯光束を形成するようにしても同様の効果が得られる。
尚、この場合、輪帯光束を形成することができるもので
あれば、特開平２−２４７６０５号や特開平８−１５１
５６号、或いは本出願人による特開平８−３３４７０１
号の公報に示された方法等、いずれの方法を用いてもよ
い。

【００２５】また、上記いずれの実施形態も、これらの
構成に限定されるものではなく、様々な組み合わせで構
成できる。特に、ビームコンバイナに関しては、第１の
レーザと第２のレーザの波長が異なる場合はダイクロイ
ックミラー等を用い、波長が同じ場合は偏光方向を変
え、偏光ビームスプリッタ（コンバイナ）等を用いれば
第１のレーザと第２のレーザによるレーザビームを効率
よく合流させ得る。なお、各実施形態では、スキャナは
一つしか図示されていないが、図示されたスキャナと瞳
投影レンズの間にリレーレンズを設けて第２のスキャナ
に瞳を投影することによって、２つのスキャナによる２
次元走査が実現できる。

【００２６】以上説明したように、本発明のレーザ走査
型顕微鏡は前述の特許請求の範囲に記載した特徴の他に
も、以下のような特徴を有している。

【００２７】（１）前記光束分割手段が回折光学素子で
あることを特徴とする請求項１又は２に記載のレーザ走
査型顕微鏡。

【００２８】（２）前記光束分割手段がアキシコンプリ
ズムであることを特徴とする請求項１又は２に記載のレ
ーザ走査型顕微鏡。

【００２９】（３）前記光束分割手段が複屈折光学素子
であることを特徴とする請求項１又は２に記載のレーザ
走査型顕微鏡。

【００３０】（４）前記複屈折光学素子がノマルスキー
プリズムであり、該ノマルスキープリズムと偏光板が対
になり光軸を回転中心として回転することを特徴とする
（３）に記載のレーザ走査型顕微鏡。

【００３１】（５）前記複屈折光学素子がノマルスキー
プリズムであり、該ノマルスキープリズムとスキャナと
の間にイメージローテータを有し、該イメージローテー
タが光軸を回転中心として回転することを特徴とする
（３）に記載のレーザ走査型顕微鏡。

【００３２】（６）前記周辺の強度が中心に比べて強い
別のレーザビームが、レーザの発振の強度分布自体が中
心に比べて周辺が強くなっているレーザであることを特
徴とする請求項３に記載のレーザ走査型顕微鏡。

【００３３】（７）前記周辺の強度が中心に比べて強い
別のレーザビームが、レーザの発振の強度分布自体がガ
ウス分布となっているビームを輪帯状のビームに変形す
る光学系によって形成されていることを特徴とする請求
項３に記載のレーザ走査型顕微鏡。

【００３４】（８）前記レーザビームの平行度を調整可
能な光学系が二群構成からなり、その群間隔が可変とな
っていることを特徴とする請求項３に記載のレーザ走査
型顕微鏡。

【００３５】

【発明の効果】本発明によれば、複数のビーム照射によ
って超解像を得るレーザ走査型顕微鏡に於いて、実際的
な２次元でのビーム照射及びビームスキャンを可能と
し、超解像レーザ走査型螢光顕微鏡を現実的に構成でき
る。

【００３６】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるレーザ走査型顕微鏡の概念図であ
る。

【図２】本発明の一実施形態を示す構成概要図である。

【図３】本発明の他の実施施形態を示す構成概要図であ
る。

【図４】本発明の更に他の実施施形態を示す構成概要図
である。

【図５】本発明の更にまた他の実施施形態を示す構成概
要図である。

【図６】レーザの強度分布を示す図であり、(a) は、Ｔ
ＥＭ00のレーザの強度分布，(b) は、ＴＥＭ11のレーザ
の強度分布をそれぞれ示す。

【図７】図５の実施形態におけるレーザビームの点像分
布強度を示す図であり、(a) は、通常の点像分布強度、
(b) は、輪帯開口デフォーカス時の点像分布強度をそれ
ぞれ示す。

【符号の説明】

１第１のレーザ２光束分割手段３投影光学系４スキャナ５瞳投影レンズ６対物レンズの像位置７第２のレーザ８光束結合手段９反射型回折光学素子１０アキシコンプリズム１１瞳リレーレンズ１２ガルバノミラー１３ビームコンバイナ１４偏光板１５ノマルスキープリズム１６イメージローテータ１７ローカライズ位置１８ビーム平行度調整可能光学系１９０次光２０＋１次光２１ −１次光２２０次（中心）強度２３１次明環の強度

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コリメートされたレーザビームを出射する
光源と、該レーザビームを、光軸を含む少なくとも一つ
の断面で見たとき少なくとも二つの光束となるように分
割する光束分割手段と、分割された光束の交点近傍、又
は該分割された光束の交点近傍を光学系で投影した位
置、又は該光束分割手段による光束の分割位置に配置さ
れたスキャナを有することを特徴とするレーザ走査型顕
微鏡。
【請求項２】レーザビームを出射する、前記光源とは別
の光源と、該別の光源より出射されたレーザビームを前
記スキャナの光軸上に合流させるための光束結合手段を
有することを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査型
顕微鏡。
【請求項３】一本のコリメートされたレーザビームを出
射する光源と、レーザビームを出射する、前記光源とは
別の光源と、該別の光源より出射されたレーザービーム
が、周辺の強度が中心に比べて強いレーザビームである
ようにする手段と、該別の光源により出射された周辺の
強度が中心に比べて強いレーザビームの平行度を調整可
能な光学系と、該二本のレーザビームを同軸に合流させ
る光束結合手段を有することを特徴とするレーザ走査型
顕微鏡。