JPH10507073A - エンドグルカナーゼ活性を有する酵素及び酵素調製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 酵素組成物であって、アルカリ条件において実質的なセルロース分解活性を有し、アクレモニウム属に由来する菌類に由来するか又は産生されるが、但しヒュミコラ・インソレンスDSM 1800、フサリウム・オキシスポルムDSM 2672、ミセリオフトラ・サーモフィラCBS 117.65又はセファロスポリウム種RYM−202に由来するエンドグルカナーゼ（EC３．２．１．４）に対して生起させた抗体と免疫学的に交差反応性でないことを条件とする、酵素組成物。本発明は更にエンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA構築体に関する。本発明の酵素組成物並びに単離された又はクローニング及び発現されたセルラーゼはアルカリセルラーゼを必要とする任意の産業プロセス、例えばデニムのストーンウォッシの如き染色布帛の着色密度に局在的なバリエーションを供するため、紙パルプの水性懸濁物の排水性を向上させるため、リサイクル紙の脱インクのため、洗浄組成物及び布帛柔軟剤のために有用でありうる。

Description

【発明の詳細な説明】 エンドグルカナーゼ活性を有する酵素及び酵素調製品 本発明は酵素組成物、アルカリ条件においてセルロース分解（エンドグルカナ ーゼ）活性をもつ単離酵素、この酵素をコードするDNA構築体、該酵素又は酵素 組成物の製造方法、該酵素又はその組成物を含んで成る洗剤、並びに例えば洗剤 産業、繊維産業及び紙パルプ産業におけるかかる酵素の利用に関する。 発明の背景 エンドグルカナーゼ（EC No.３．２．１．４）はヒドロラーゼの群を構成し、 これはセルロース、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース及び ヒドロキシエチルセルロース）、リシェニンの中の１，４−β−Ｄ−グルコシド 結合、複合β−１，３グルカン、例えば穀類β−Ｄ−グルカン又はキシログルカ ン並びにその他のセルロース部分含有植物材料の中のβ−１，４結合のエンド加 水分解を触媒する。この認定された名称はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカノヒ ドロラーゼであるが、本明細書ではその略語エンドグルカナーゼを使用する。T. -M．Enveri，「Microbial Cellulases」W．M．Fogarty，Microbial Enzymes and Biotechnology，Applied Science Publishers，p．183-224（1983）；Methods in Enzymology，（1988）Vol．160，p．200-391（Wood，W．A．及びKellogg，S. tion」Annu．Rev．Microbiol．(1990)，Vol．44，pp．219-248；Bdguin，P．及 びAubert，J-P.，「The biological degradation of cellulose」FEMS Microbio logy Reviews 13（1994）p．25-58；H enrissat，B.，「Cellulases and their interaction with cellulose」Cellulo se(1994)，Vol．1，pp．169-196を参照のこと。セルロースは多くのゴムとの関 係で見い出され、そしてそれらは例えば果実、野菜及び穀類中の細胞壁の成分で ある。 エンドグルカナーゼは様々なタイプの生物、例えば植物及び微生物により産生 され、そして多種多様な種のエンドグルカナーゼが同定されている。 菌類エンドグルカナーゼはSheppard，P．O.,ら「The use of conserved cellu lase family-specific sequences to clone Cel1ulase homologue cDNAs from F usarium oxysporum」Gene，(1994)，Vol．15，pp．163-167；Saloheimo，A.，ら 「Anovel，small endog lucanase gene，egI5，from Trichoderma reesei isola ted by expression in yeas」Molecular Microbiology(1994)，Vol．13(2)，pp ．219-228；van Arsdell，J．N.ら（1987）「Cloning，characterization，and expression in Saccharomyces cerevisiae of endoglucanase I from Trichoder ma reesei」Bio/Technology 5：6 enes of Trichoderma reesei：complete nucleotide sequence of the endogluc anase I gene」Gene 45：253-263；Saloheimo，M．ら（1988）「EGIII，a new e ndoglucanase from Trichoderma reesei：the characterization of both gene and enzyme」Gene 6 yeast expression of the egll gene from Trichoderma longibrachiatum」App l．Microbiol．Biotechnol.，(1992)，Vol．38，pp.370-375；Ooi，T.ら「Cloni ng and sequence analysis of a cDNA for cellulase（FI-CMCase）from Asperg illus 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complex and are encoded by multigene families」FEMS Microbiol．Lett.，(1995)，Vol．125， No．1，pp．15-21に記載されている。 WO91/17243（Novo Nordisk A/S）はヒュミコラ・インソレンス（Humicola ins olens）DSM 1800由来の高精製度の43KDaのエンドグルカナーゼに対して生起させ た抗体と免疫反応性な均質エンドグルカナーゼ成分より成るセルラーゼ調製品を 開示する。 WO91/17244（Novo Nordisk A/S）は新規の（ヘミ）−セルロース分解酵素、例 えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ又はβ−グルコシダーゼを開示 し、それはトリコデルマ(Trichoderma) 及びフェネロシェート(Phanerochaete)以外の菌類に由来しうる。 WO93/20193はアスペルギルス・アキュレアトゥス(Aspergillus aculeatus)由 来のエンドグルカナーゼを開示する。 WO94/00578（連邦科学及び工業研究機関：Commonwealth Scientific and Indu strial Research Organisation）には、嫌気性前胃菌類、例えばネオカリマステ ィックス・パトリシアルム（Neocallimastix patriciarum）の活性をもつセルラ ーゼをクローニングするための方法が記載されている。 WO94/14953（Novo Nordisk A/S）には例えばワイン又はジュース等を製造する ための植物細胞壁成分を分解又は改質するための菌類エンドグルカナーゼが記載 されている。 WO94/21801(Genencor Inc.)はエンドグルカナーゼ活性を示すトリコデルマ・ ロンジブランチアトウム（Trichoderma longibranchiatum）から単離したセルラ ーゼ系を考慮している。 WO94/26880(Gist Brocades N．V.)はセルロース分解酵素の単離混合物を開示 し、これは好ましくはトリコデルマ、アスペルギルス又はジスポロトリカム（Di sporotrichum）から獲得したものであり、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロ ラーゼ及びキシログルカナーゼ活性を含んで成る。 WO95/02043（Novo Nordisk A/S）にはトリコデルマ・ハージアヌム（T．harzi anum）由来のエンドグルカナーゼを有する酵素が記載され、それは植物細胞壁の 分解又は改質の如き様々な目的のために利用できうる。 Kang，M．G.，Park，H．M.，Kim，Y．S，Lee，J．R.，Kim，Y．K.，Lee，Y．H ．：Abstract from 94th General Meeting，American Society Microbiology，K -112，1994はセファロスポリウム（Cephalosporium）種の株及びアルカリ性範囲 において至適pHを有する３ 種のセルラーゼ（EC ３．２．１．４，Ｐ−Ｉ，Ｐ−II，Ｐ−III）の精製を開 示する。 Peberdy，J．F.，(1987)は、セファロスポリウム種が一定の例外を除きアクレ モニウム（Acremonium）と改名されていることを開示する。 エンドグルカナーゼは工業的に幅広く利用されており、例えば洗剤産業、繊維 産業、紙パルプ加工、並びに食品及び飼料産業において利用されている。 単独又は著しいエンドグルカナーゼ活性が所望される用途のために好ましくは 単一成分又は一成分形態の新規のエンドグルカナーゼの提供についてのニーズが 存在し続けている。 本発明の目的はアルカリ性条件においての有意なセルロース分解活性を有し、 且つ紙パルプ加工、繊維トリートメント、洗濯工程及び／又は動物飼料において 改善された性能を有す新規の酵素を提供する；好ましくは、新規の一成分セルラ ーゼ、より好ましくは一成分エンドグルカナーゼであって組換技術により製造さ れうるものを提供する。 発明の概要 この度驚くべきことに、アルカリ性条件において高いセルロース分解（エンド グルカナーゼ）活性を示す酵素組成物がアクレモニウム属の菌類であって、ヒュ ミコラ・インソレンスDSM 1800、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysp orum）DSM 2672、ミセリオフトラ・サーモフィル(Myceliopthora thermophile) 、CBS 117．65及びセファロスポリウム種RYM−202に対して生起させた抗体と交 差反応性でない菌類により生産される又は誘導されることを発見した。 アクレモニウム（又はセファロスポリウム）に属する菌類生物は一般に抗生物 質を産生できることとして知られているため、セルラーゼは好ましくは組換技術 により産生、即ち、クローニングして発現されるべきである。 即ち、より詳しくは、本発明はアクレモニウム種、セファロスポリウム種、ア クレモニウム・アクレモニウム(A．acremonium)、アクレモニウム・ペルシシヌ ム(A．persicinum)、アクレモニウム・ブラシペニウム(A．brachypenium)、アク レモニウム・ジクロモスプルム(A．dichromosporum)、アクレモニウム・オブク ラバトゥム(A．obclavatum)、アクレモニウム・ピンカートニア(A．pinkertonia e)、アクレモニウム・ロゼオグリセウム(A．roseogriseum)、アクレモニウム・ インコロラトゥム（A．incoloratum）及びアクレモニウム・フラトゥム（A．fur atum）、特にアクレモニウム種CBS 478.94、アクレモニウム種CBS 265.95、アク レモニウム・パーシシヌム（A．persicinum）CBS 169.65、アクレモニウム・ア クレモニウムAHU 9519、セファロスポリウム種CBS 535.71、アクレモニウム・ブ ラシペニウムCBS 866.73、アクレモニウム・ジクロモスポルムCBS 683.73、アク レモニウム・オブクラバトゥムCBS 311.74、アクレモニウム・ピンカートニアCB S 157.70、アクレモニウム・ロゼオグリセウムCBS 134.56、アクレモニウム・イ ンコロラトゥムCBS 146.62及びアクレモニウム・フラトゥムCBS 299.70Hより成 る群から選ばれる菌類から誘導又は産生される新規の酵素に関する。 更に、本発明はエンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含 んで成るDNA構築体に関連し、ここでこのDNA配列はSEQ ID No.１に示すＮ末端DN A配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列並びにもしくはサッカロマイセス・ セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）DSM 10076中のプラスミドから獲得で きるDNA 配列又はその類似体を含んで成る；又はこのDNA配列はSEQ ID No.３に示すDNA配 列及びもしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 9969中のプラスミドから獲得 できるDNA配列又はその類似体を含んで成る；又はこのDNA配列はSEQ ID No.４に 示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 9977中のプラス ミドから獲得できるDNA配列又はその類似体を含んで成る；又はこのDNA配列はSE Q ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 100 77中のプラスミドから獲得できるDNA配列又はその類似体を含んで成る；又はこ のDNA配列はSEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレ ビジエDSM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列又はその類似体を含んで 成る；又はこのDNA配列はSEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマ イセス・セレビジエDSM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列又はその類 似体を含んで成る。DSM 10076及びDSM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配 列はドナー生物としてアクレモニウム種DSM 265.95をもつ。DSM 9977，DSM 1007 7，DSM 10079及びDSM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列はドナー生物 としてアクレモニウム種DSM 487.94をもつ。 本発明の酵素組成物及び単離又はクローニングし、そして発現したセルラーゼ はアルカリセルラーゼを必要とする任意の工業的プロセス、例えば染色布帛の着 色密度において局部的な変動を供するプロセス、例えばデニムのストーンウォッ シング、パルプ紙の水性懸濁物の排水性を高めるプロセス、リサイクル紙の脱イ ンク性を高めるプロセス、洗剤及び布帛柔軟剤において有用でありうる。 発明の詳細な説明 アルカリ条件において著しいセルロース分解活性をもつ酵素を産 生しうる菌類起源の一次スクリーニングにおいて、菌類起源（例えば土壌から） についてのスクリーニングは土壌希釈、土壌塵、小粒子又は植物根による固形Ch apek and Hetchinson培地上への直接接種により実施でき、そしてこれらの菌類 種はペトリ皿中の慣用の固形培地上への単離培養物の接種により同定できうる。 次に、セルロース分解活性の存在は濾紙上での菌類増殖の目視観察又はアモルフ ァスセルロースを含む固形培地上での透明ゾーンの形成により定性評価し得る。 更に、アルカリ条件下でのセルラーゼ活性の存在はアガーアモルファス酸性膨潤 セルロース上での28℃での７〜10日間の培養、pH９〜10.6のアガーHEC−LAS(線 形アルキルベンゼンスルホネート、濃度0.12〜0.24％)へのブロックの挿入、及 び１／２〜２日間にわたる40℃でのインキュベーション、並びに青色染色HES（M egazyme，Australiaより入手した１％のAZCL−HEC溶液）中での白色透明ゾーン の観察によるセルロース分解活性の目視検査により評価し得る。 好適な態様において、本発明はアクレモニウム属から選ばれた菌類に由来する 又は産生されうる酵素組成物に関する。より好ましくは、本発明はアクレモニウ ム種、即ち、アクレモニウム・パーシシヌム、アクレモニウム・ブラシペニウム 、アクレモニウム・ジクロモスポルム、アクレモニウム・オブクラバトゥム、ア クレモニウム・ピンカートニア、アクレモニウム・ロゼオグリセウム、アクレモ ニウム・インコロラトゥム及びアクレモニウム・フラトゥムより成る群から選は れる菌類に由来する又は産生されうるエンドグルカナーゼ活性を有する酵素組成 物に関する。有用な株の例は、アクレモニウム種CBS 478.94、アクレモニウム種 CBS 265.95、アクレモニウム・パーシシヌムCBS 169.95、アクレモニウム・アク レモニウムAHU 9519、セファロスポリウム種CBS 535.71、アクレモニウム・ブラ シペニウムCBS 866.73、アクレモニウム・ジクロモスポルムCBS 683.73、アクレ モニウム・オブクラバトゥムCBS 311.74、アクレモニウム・ピンカートニアCBS 157.70、アクレモニウム・ロゼオグリセウムCBS 134.56、アクレモニウム・イン コロラトゥムCBS 146.62及びアクレモニウム・フラトゥムCBS 299.70Hである。 アクレモニウム・パーシシヌムCBS 169.95、アクレモニウム・アクレモニウム AHU 9519、アクレモニウム・ブラシペニウムCBS 866.73、アクレモニウム・ジク ロモスポルムCBS 683.73、アクレモニウム・オブクラバトゥムCBS 311.74、アク レモニウム・ピンカートニアCBS 157.70、アクレモニウム・ロゼオグリセウムCB S 134.56、アクレモニウム・インコロラトゥムCBS 146.62及びアクレモニウム・ フラトゥムCBS 299.70H並びにセファロスポリウム種の株は全て商業的に入手で きる株であると信じられ、本特許出願の優先日において対応の寄託機関のカタロ グの中で公開されている。 ブダペスト条約の規定に従いCentraalbureau voor SchimmelcuturesにCBS 478 .94のもとで1994年９月28日に寄託した株はアクレモニウム種に属する。この培 養物は透明な菌糸並びに独立して観察される直立且つ細い鉢状体であってそれか ら透明な分生子が生ずるものの形成を特徴とする。この鉢状体は明瞭な基底隔膜 により規定される。分生子は楕円形である(0.5−１)×（１−２）μｍ。これら の観察はYPG−アガー上での培養増殖に基づく。 ブダペスト条約の規定に従ってCentraalbureau voor SchimmelcuturesにCBS 2 65.95号のもとで寄託した株はアクレモニウム種に属する。酵素 本明細書において、「セルロース分解活性」となる語は酵素のセルロースをグ ルコース、セロビオース、トリオース及びその他のセ ロ−オリゴ糖に分解する能力を意味する。この能力は以下に特定する条件下での カルボキシメチルセルロース(CMC)ゲルの中での透明ゾーンの形成により決定し 得る。 本明細書において「酵素」なる語は、成熟タンパク質又はその前駆体、並びに 全長酵素の活性を本質的に有するその機能性フラグメントを含むものと解される 。更に、「酵素」なる語は前記酵素の相同体を含むつもりである。かかる相同体 は親酵素、即ち親セルラーゼのアミノ酸配列と60％以上の同一性の度合いを示す アミノ酸配列を含んで成る。この同一性の度合いは慣用の方法により決定し得る 。例えばAltshulら、Bull ．Math．Bio．48 ：603-616，1986並びにHenikoff and HenikoffのProc ．Natl．Acad．Sci．USA 89 ：10915-10919，1992を参照のこと 。簡単には、２本のアミノ酸配列を並べ、Henikoff and Henikoff前掲の10のギ ャップ・開放(opening)・ペナルティー、１のギャップ・伸長・ペナルティー及 び「blosum 62」評点マトリックスを利用して整列評点を最適化する。 他方、酵素の相同体はヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に基づいて作製した オリゴヌクレオチドプローブと以下の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド 配列によりコードされるものでありうる：５×のSSCの中で予備浸漬、並びに20 ％のホルムアミド、５×のDenhardt溶液、50mMのリン酸ナトリウムpH6.8及び50 μｇの変性音波処理仔牛胸腺DNAの溶液の中での約40℃で１時間の予備ハイブリ ダイゼーション、それに次ぐ100μＭのATPの添加された同一の溶液の中での約40 ℃でのハイブリダイゼーション、それに次ぐ0.4×のSSCの中での約45℃の温度で の洗浄。 これらの条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は標 準の検出手順（サザンブロッティング）を利用して検定される。 本酵素の相同体は１又は複数個のアミノ酸置換、欠失又は付加を有しうる。こ のような変化は好ましくはささいな種類のもの、即ちタンパク質のフォルディン グ又は活性に有意義な影響を及ぼさないもの、一般には１〜約30個のアミノ酸の ささいな欠失；ささいなアミノー又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端 メチオニン残基の伸長、約20〜25個までの残基の小型のリンカーペプチドの伸長 、又は精製を助長するささいな伸長、例えばポリ−ヒスチジン領域、抗原性ペプ チド又は結合性ドメインの伸長である。一般にはFordらProtein Expression and Purification ２ ：95-107，1991を参照のこと。保存置換の例は塩基性アミノ酸 （例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン 及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、バリン ）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、 及び小型アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メニオニ ン）の群に属する。 かかる置換は分子の機能にとって重要な領域の外部にあり、且つ活性酵素をも たらし続けるように施せることができうることを当業者は理解するであろう。本 発明の酵素の活性に本質的なアミノ酸、それ故好ましくは置換を施さないアミノ 酸は当業界公知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニン・スキャニ ング突然変異誘発（Cunningham and Wells，Science 244, 1081-1085，1989）に 従って同定されうる。後者の技術においては、突然変異を分子中の全ての残基に 導入し、そして得られる突然変異分子をセルロース分解活性について試験し、分 子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。リガンド−レセプター相同作用の部 位は核磁気共鳴、結晶学又は光親和性ラベリングの分析によっても決定できうる 。例えば、de Vosら、Science 255 ：306-312，1992；SmithらJ ．Mol．Biol． 224 ：899-904，1992；Wlodaverら、FEBS Lett ．309：59-64，1992を参照のこと 。 この相同体はアレル変異体、即ち、突然変異を通じて出現する別の遺伝子形態 、又は突然変異した遺伝子によりコードされる改変酵素でありうるが、但し本発 明の酵素と実質的に同一の活性を有する。従って、突然変異はサイレントである か（コード酵素に変化をもたらさない）又は改変アミノ酸配列を有する酵素をコ ードしうる。 本酵素の相同体は属又は種相同体、即ち、別の種に由来する類似の活性を有す る酵素でもありうる。 本酵素の相同体は注目の種の細胞のゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、そ して標準の技術、例えばSambrookらMolecular Cloning ：A Laboratory Manual 第２版Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989 に記載の技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを利用することにより、 又はSambrookら前掲に記載の特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)により相同体の全体又は一部をコードするDNA配列をスクリーニングするこ とにより単離できうる。 本発明の酵素は単離形態、即ち、土壌、可能としてはモンゴリアン土壌である 天然環境以外の条件下で供される。好適な形態において、この単離酵素はその他 のタンパク質、特に菌類起源のその他の酵素を実質的に含まない。本発明の酵素 は、例えば、アクレモニウム属に由来する菌類から単離し得るが、但しこの酵素 はヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）DSM 1800、フサリウム・オ キシスポルム（Fusarium oxysporum）DSM 2672、ミセリオフトラ・サーモフィル （Myceliopthora thermophile）CBS 117.65又はセファロスポリウム種RYM−202 由来のエンドグルカナーゼ（EC ３．２．１．４）に対して生起させた抗体と免 疫学的に交差反応性でな いことが条件とされる。一の態様において、本発明の酵素はアクレモニウム種、 即ち、アクレモニウム・パーシシヌム、アクレモニウム・アクレモニウム、セフ ァロスポリウム種、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロ モスポルム、アクレモニウム・オブクラバトゥム、アクレモニウム・ピンカート ニア、アクレモニウム・ロゼオグリセウム、アクレモニウム・インコロラトゥム 及びアクレモニウム・フラトゥムの上清液から獲得できる。 単離酵素は例えばSDS−PAGEにより特性決定し得、そして当業界公知の手順を 利用してアッセイできうる。例えば、本発明の酵素は約７以上、好ましくは約８ 以上、特に約９以上の至適pHを有す。 更に、本発明の単離酵素及び酵素組成物は好ましくはpH8.5での活性と比べてp H10において50％以上の比活性を有し、その活性は適当な基質に対するSavi単位 で測定した。 好ましくは、本発明の単離酵素及び酵素組成物は線形アルキルベンゼンスルホ ン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナ トリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウ ム及びα−スルホ−脂肪酸エステルの存在下で安定である。 酵素は高純度形態で、即ち、SDS−PAGEによる決定に従い90％以上、より好ま しくは95％以上、そして最も好ましくは99％以上の純度で供されるのが好ましい 。 更なる観点において、本発明はエンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードす るDNA配列を含んで成るDNA構築体に関連し、このDNA配列は ａ）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列並 びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから獲 得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列並 びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから獲 得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列 並びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから 獲得できるDNA配列と相同体である、又は ii）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列 並びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから 獲得できるDNA配列と同一のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする 、又は iii）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配 列並びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドか ら獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列によりコードされるポリペプチドと相 同性であるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列 並びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから 獲得できるDNA配列によりコードされる精製されたエンドグルカナーゼに対して 生起した抗体と免疫反応性であるポリペプチドをコードする、 類似体、 を含んで成る。 SEQ IDNo..１及びNo.２にそれぞれ示すＮ末端及びＣ末端部分DNA 配列はサッ カロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから獲得できる対応の部分D NA配列と同一であるものと信じられている。 サッカロマイセス・セレビジエ株はブダペスト条約に従い、DSM（Deutsche Sa mmlurg von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Maascheroder Weg 1b，D -38125 Braunschweig，Germany）に1995年６月30日にて寄託番号DSM 10076のも とで寄託した。 更なる別の観点において、本発明はエンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコー ドするDNA配列を含んで成るDNA構築体に関連し、このDNA配列は ａ）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列と相同性である、又は ii）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列と同一のプローブとハイブリ ダイズする、又は iii）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列によりコ ードされるポリペプチドと相同性であるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードされる精製され たエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫反応性であるポリペプチド をコードする、 類似体、 を含んで成る。 SEQ ID No.３に示すDNA配列はサッカロマイセス・セレビジエDSM 9969中のプ ラスミドから獲得できる対応の部分DNA配列と同一であると信じられている。 このサッカロマイセス・セレビジエ株はブダペスト条約に従い、DSM（Deutsch e Sammlurg von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Maascheroder Weg 1 b，D-38125 Braunschweig，Germany）に1995年５月11日にて寄託番号DSM 9969の もとで寄託した。 更なる別の観点において、本発明はエンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコー ドするDNA配列を含んで成るDNA構築体に関連し、このDNA配列は ａ）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列と相同性である、又は ii）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列と同一のプローブとハイブリ ダイズする、又は iii）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列によりコ ードされるポリペプチドと相同性であ るポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードされる精製され たエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫反応性であるポリペプチド をコードする、 類似体、 を含んで成る。 SEQ ID No.４に示すDNA配列はサッカロマイセス・セレビジエDSM 9977中のプ ラスミドから獲得できる対応の部分DNA配列と同一であると信じられている。 このサッカロマイセス・セレビジエ株はブダペスト条約に従い、DSM（Deutsch e Sammlurg von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Maascheroder Weg 1 b，D-38125 Braunschweig，Germany）に1995年５月11日にて寄託番号DSM 9977の もとで寄託した。 更なる別の観点において、本発明はエンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコー ドするDNA配列を含んで成るDNA構築体に関連し、このDNA配列は ａ）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列と相同性である、又は ii）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセ ス・セレビジエDSM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列と同一のプロー ブとハイブリダイズする、又は iii）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列により コードされるポリペプチドと相同性であるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードされる精製され たエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫反応性であるポリペプチド をコードする、 類似体、 を含んで成る。 SEQ ID No.５に示すDNA配列はサッカロマイセス・セレビジエDSM 10077中のプ ラスミドから獲得できる対応の部分DNA配列と同一であると信じられている。 このサッカロマイセス・セレビジエ株はブダペスト条約に従い、DSM（Deutsch e Sammlurg von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Maascheroder Weg 1 b，D-38125 Braunschweig，Germany）に1995年６月30日にて寄託番号DSM 10077 のもとで寄託した。 更なる別の観点において、本発明はエンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコー ドするDNA配列を含んで成るDNA構築体に関連し、このDNA配列は ａ）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列の 類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列と相同性である、又は ii）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列と同一のプローブとハイブリ ダイズする、又は iii）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列により コードされるポリペプチドと相同性であるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードされる精製され たエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫反応性であるポリペプチド をコードする、 類似体、 を含んで成る。 SEQ ID No.６に示すDNA配列はサッカロマイセス・セレビジエDSM 10079中のプ ラスミドから獲得できる対応の部分DNA配列と同一であると信じられている。 このサッカロマイセス・セレビジエ株はブダペスト条約に従い、DSM（Deutsch e Sammlurg von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Maascheroder Weg 1 b，D-38125 Braunschweig，Germany）に1995年６月30日にて寄託番号DSM 10079 のもとで寄託した。 更なる別の観点において、本発明はエンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコー ドするDNA配列を含んで成るDNA構築体に関連し、このDNA配列は ａ）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列と相同性である、又は ii）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列と同一のプローブとハイブリ ダイズする、又は iii）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列により コードされるポリペプチドと相同性であるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードされる精製され たエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫反応性であるポリペプチド をコードする、 類似体、 を含んで成る。 SEQ ID No.７に示すDNA配列はサッカロマイセス・セレビジエDSM 10084中のプ ラスミドから獲得できる対応の部分DNA配列と同一であると信じられている。 サッカロマイセス・セレビジエ株はブダペスト条約に従い、DSM（Deutsche Sa mmlurg von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ，Maascheroder Weg 1b，D-38125 Braunschweig，Germany）に1995年６月30日に て寄託番号DSM 10084のもとで寄託した。 本明細書において、SEQ ID No.１，２，３，４，５又は６に示す部分DNA配列 の「類似体」とは、エンドグルカナーゼ活性を示し、特性ｉ）〜iv）のいづれか 又は全てを有する酵素をコードする任意のDNA配列を意味するつもりである。こ の類似DNA配列は、 ａ）SEQ ID No.１，２，３，４，５又は６に示すDNA配列に基づき、例えば本明 細書に記載の手順を利用してエンドグルカナーゼ活性を有する酵素を産生する別 の又は近縁（例えば同種）の生物から単離されたものであって、それ故例えば本 明細書に示すDNA配列を含んで成るDNA配列のアレル又は種変異体であってよく、 ｂ）SEQ ID No.１，２，３，４，５又は６に示すDNA配列に基づき、例えばこのD NA配列によりコードされるエンドグルカナーゼの別のアミノ酸配列をもたらしめ ないが、当該酵素の産生を意図とする宿主生物のコドン用法に対応するヌクレオ チド置換の導入により、又は別のアミノ酸配列にもたらしうるヌクレオチド置換 の導入により構築されたものであってよい。しかしながら、後者の場合、アミノ 酸変化は好ましくはささいな種類のもの、即ちタンパク質のフォルディング又は 活性に有意義な影響を及ぼさないもの、一般には１〜約30個のアミノ酸のささい な欠失；ささいなアミノ−又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端メチオ ニン残基の伸長、約20〜25個までの残基の小型のリンカーペプチドの伸長、又は 精製を助長するささいな伸長、例えばポリ−ヒスチジン領域、抗原性ペプチド又 は結合性ドメインの伸長である。一般にはFordらProtein Expression and Purif ication 2 ：95-107，1991を参照のこと。保存置換の例は塩基性アミノ酸（例え ばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン及びア スパラギン）、疎水性ア ミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えばフ ェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、及び小型アミノ酸（例えばグリ シン、アラニン、セリン、トレオニン、メニオニン）の群に属する。 かかる置換は分子の機能にとって重要な領域の外部にあり、且つ活性酵素をも たらし続けるように施せることができうることを当業者は理解するであろう。本 発明の酵素の活性に本質的なアミノ酸、それ故好ましくは置換の施さないアミノ 酸は当業界公知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニン・スキャニ ング突然変異誘発（Cunningham and Wells，Science 244, 1081-1085，1989）に 従って同定されうる。後者の技術においては、突然変異を分子中の全ての残基に 導入し、そして得られる突然変異分子をセルロース分解活性について試験し、分 子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。リガンド−レセプター相同作用の部 位は核磁気共鳴、結晶学又は光親和性ラベリングの分析によっても決定できうる 。例えば、de Vosら、Science 255 ：306-312，1992；SmithらJ ．Mol．Biol．22 4 ：899-904，1992；Wlodaverら、FEBS Lett ．309：59-64，1992を参照のこと。 本発明のDNA構築体のDNA配列によりコードされるエンドグルカナーゼはコード 酵素の一体化部分として存在するセルロース結合性ドメイン(CBD)又はこのエン ドグルカナーゼ酵素に導入されうる別の起源に由来するCBDを含んで成りうる。 上記のｉ）において言及している相同性は第一配列の第二配列からの派生を示 唆する２本の配列間の同一性の度合いとして決定される。この相同性は当業界に 公知のコンピュータープログラム、例えばGCGプログラム・パッケージにおいて 供されるGAP（Needleman，S．B．and Wunsch，C．D．Journal of Molecular Bio logy，48：4 43-453，1970）により適宜決定できうる：DNA配列対比のための5.0のGAP生成（c reating）ペナルティー及び0.3のGAP伸長ペナルティーの設定によってGAPを使用 し、このDNA配列のコード領域は、SEQ ID No．１，２，３，４，５，６もしくは ７のそれぞれに示す（全長又は部分）DNA配列又はサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10076，DSM 9969，DSM 9977，DSM 10077，DSM 10079もしくはDSM 10084の それぞれの中のプラスミドから獲得できるDNA配列のコード領域と好ましくは40 ％以上、より好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、より好ましくは70 ％以上、更により好ましくは80％以上、特に90％以上の同一性の度合を示す。 上記のii）において言及するハイブリダイゼーションとは、類似のDNA配列が 当該エンドグルカナーゼ酵素をコードするDNA配列と同一のプローブと、以降の 材料及び方法の章に詳細してある一定の特定の条件下でハイブリダイズすること を示唆することを意図している。通常、類似のDNA配列はこのDNA配列と高度に相 同性であり、例えば本発明のエンドグルカナーゼをコードするSEQ ID No．１， ２，３，４，５，６又は７に示す（全長又は部分）DNA配列と70％以上、例えば7 5％以上、80％以上、85％以上、90％以上、又は更には95％以上相同性である。 上記のiii）において言及している相同性は第一配列の第二配列からの派生を 示唆する２本の配列間の同一性の度合いとして決定される。この相同性は当業界 に公知のコンピュータープログラム、例えばGCGプログラム・パッケージにおい て供されるGAP（Needleman，S．B．and Wunsch，C．D．Journal of Molecular B iology，48：443-453，1970）により適宜決定できうる：ポリペプチド配列対比 のための3.0のGAP生成ペナルティー及び0.1のGAP伸長ペナルティーの設定によっ てGAPを使用し、類似DNA配列によりコードされる ポリペプチドは、SEQ ID No.１，２，３，４，５，６もしくは７のそれぞれに示 す（全長又は部分）DNA配列又はサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076，DSM 9969，DSM 9977，DSM 10077，DSM 10079もしくはDSM 10084のそれぞれの中のプ ラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA構築体によりコードされる酵素 と好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、特に90％以上の同一性の度合 を示す。 上記の特性iv）との関連で、それはDSM 10076，DSM 9969，DSM 9977，DSM 100 77，DSM 10079もしくはDSM 10084株のそれぞれから単離されたDNA配列によりコ ードされ、且つ前記DNA配列で形質転換された宿主生物において生産されたエン ドグルカナーゼ、又はDSM 10076，DSM 9969，DSM 9977，DSM 10077，DSM 10079 もしくはDSM 10084のそれぞれから生産されたエンドグルカナーゼを意味するつ もりである。その免疫反応性は以降の材料及び方法の章において記載した方法に より決定できうる。 更なる観点において、本発明は本発明のDNA構築体を担持する発現ベクター、 このDNA構築体又は発現ベクターを含んで成る細胞、及びエンドグルカナーゼ活 性を示す酵素を製造する方法であって、前記細胞を酵素の生産が可能となる条件 下で培養し、そして該酵素をこの培養物から回収することを含んで成る方法に関 する。 更なる別の観点において、本発明はエンドグルカナーゼ活性を示す酵素であっ て、 ａ）本発明のDNA構築体によりコードされる、 ｂ）本発明の方法により製造される、及び／又は ｃ）SEQ ID No.１，２，３，４，５，６もしくは７のそれぞれに示す（全長又は 部分）DNA配列、又はサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076，DSM 9969，DSM 9977，DSM 10077，DSM 10079もしくは DSM 10084のそれぞれの中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードされ る精製されたエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫反応性である、 酵素に関する。 上記ｃ）に記載のエンドグルカナーゼはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10 076，DSM 9969，DSM 9977，DSM 10077，DSM 10079もしくはDSM 10084の株のそれ ぞれから単離したDNA配列によりコードされ、且つ前記DNA配列で形質転換された 宿主生物において生産されたものであるか、又はDSM 10076，DSM 9969，DSM 997 7，DSM 10077，DSM 10079もしくはDSM 10084の株それぞれにより生産されたもの でありうる。 酵母の中での発現クローニング エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードする本発明のDNA配列は以下を含 む一般的な方法により単離されうる： ― アクレモニウム種、特にアクレモニウム種CBS 478.94又はCBS 265.95由来のDNAライブラリーを適当なベクターの中でクロー ニングする、 ― 適当な酵母宿主細胞を前記ベクターで形質転換する、 ― この宿主細胞を前記DNAライブラリー中のクローンによりコー ドされる任意の注目の酵素が発現される適当な条件下で培養す る、 ― かかるクローンにより生産される酵素の任意のエンドグルカナ ーゼ活性を決定することにより陽性クローンについてスクリー ニングする、そして ― かかるクローンから前記酵素をコードするDNAを単離する。 この一般的な方法は引用することで本明細書に組入れるWO94/14593号に更に開 示されている。より詳しいスクリーニング方法の説明 は以下の実施例６に示している。 当該酵素をコードするDNA配列は例えばアクレモニウム種のcDNAライブラリー をスクリーニングし、そして適切な酵素活性（即ち、エンドグルカナーゼ活性） を発揮するクローンについて選別することによって単離したものであるか、又は サッカロマイセス・セレビジエDSM 10076，DSM 10077，DSM 10079もしくはDSM 1 0084（これらはそれぞれDSM〔Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zel lkuturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-31824 Braunshweig，Germany〕に1995 年６月30日にブダペスト条約のもとで寄託してある）又はサッカロマイセス・セ レビジエDSM 9969もしくは9977（これらはそれぞれDSM〔Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH〕に1995年５月11日にブダペスト条約 のもとで寄託してある）に由来する。次に適当なDNA配列を例えば実施例６に記 載の標準手順によりこのクローンから単離できうる。 相同性の酵素をコートするDNA配列、即ち類似DNA配列はその他の微生物から獲 得できるものと期待される。例えば、このDNA配列はその他の菌類、例えばアス ペルギルス(Aspergillus)種の株、特にＡ．アキュレアトゥス（A．aculeatus） もしくはＡ．ニガー（A．niger）の株、トリコデルマ(Trichoderma)種の株、特 にＴ．リーセイ（T．reesei）、Ｔ．ビリデ(T．viride)、Ｔ．ロンジブラシアト ゥム（T．longibrachiatum）、Ｔ．ハージアヌム（T．harzianum）もしくはＴ． コニンジイ(T．koningii)、又はフサリウム（Fusarium）種の株、特にＦ．オキ シスポルム（F．oxysporum）、又はヒュミコラ種の株、又はネオカリマスティッ クス（Neocallimastix）種、ピロマイセス(Piromyces)種、ペニシリウム(Penici llium)種、アガリクス（Agaricus）種又はファネロシェーテ(Phanerochaete)種 の株に由来しうる。 他方、本発明のエンドグルカナーゼをコードするDNAは、公知の手順に従い、 適当な起源、例えば任意の上記の生物由来のDNAから、本明細書において開示す るDNA配列に基づいて調製された合成オリゴヌクレオチドプローブの利用により 簡単に単離されうる。例えば、適当なオリゴヌクレオチドプローブはSEQ ID No ．１，２，３，４，５，６もしくは７記載の任意の（全長又は部分）配列に示す ヌクレオチド配列又はその任意の適当なサブ配列に基づいて調製されうる。 様々なタイプの酵素のための多種多様な指標系がアガープレート上での酵母コ ロニーのスクリーニングのために利用されうる。例えば、セルラーゼ及びエンド グルカナーゼはコンゴレッドで染色した後のカルボキシメチルセルロース中の透 明ゾーンにより同定されうる。 核酸構築体 本明細書において用いる「核酸構築体」なる語はcDNA、ゲノムDNA、合成DNA又 はRNA起源の任意の核酸分子を意味することを意図する。「構築体」なる語は核 酸セグメントであって、一本鎖又は二本鎖であり、且つ注目の酵素をコードする 完全又は部分天然ヌクレオチド配列を基礎としうる核酸セグメントを意味するつ もりである。 本発明の酵素をコードする核酸構築体は適切にはゲノム又はcDNA起源であり得 、例えばゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、次いで当該酵素全体又は一部を コードするDNA配列を標準の技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを利 用するハイブリダイゼーション（Sambrookら、前掲参照）によりスクリーニング することによって得られる。 本酵素をコードする核酸構築体は確立された標準方法、例えばBe aucage and Caruthers Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869に記載のホス ホアミジット法又はMatthesら EMBO Journal 3（1984）801-805記載の方法によ り合成的に調製することもできうる。ホスホアミジット法によれば、オリゴヌク レオチドを例えば自動DNA シンセサイザーで合成し、精製し、アニーリングし、 ライゲーションし、そして適当なベクターの中にクローニングする。 更に、この核酸構築体は合成とゲノム起源との複合体、合成とcDNA起源との複 合体、又はゲノムとcDNA起源との複合体であってよく、それは合成、ゲノム又は cDNA起源のフラグメントを標準の技術に従って（適宜）ライゲーションすること により調製でき、そのフラグメントは核酸構築体全体の様々な部分に対応してい る。 この核酸構築体は例えば米国特許第4,683,202号又はSaikiらScience 239（198 8）487-491に記載の特異的プライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応によって も調製できうる。 核酸構築体は好ましくは本明細書及び請求の範囲においてもっぱら使用する意 味のDNA構築体である。 組換ベクター 本発明の酵素をコードするDNA構築体を含んで成る組換ベクターは組換DNA手順 に簡単に委ねることのできうる任意のベクターであってよく、そしてベクターの 選定はそれを導入すべき宿主細胞に往々にして依存するであろう。即ち、このベ クターは自己複製式ベクター、即ち、染色体外質として存在するベクターであっ てその複製が染色体の複製とは独立したもの、例えばプラスミドでありうる。他 方、このベクターは、宿主細胞の中に導入したときに宿主細胞ゲノムの中に組込 まれ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製するものであってよい。 このベクターは好ましくは発現ベクターであって、その中で本発 明の酵素をコードするDNA配列がこのDNAの転写のために必要な追加のセグメント に作用可能式に連結されているものである。一般に、発現ベクターはプラスミド もしくはウィルスDNAに由来するか、又は両者の要素を含みうる。「作用可能式 に連結」なる語は、セグメントがその意図する目的のために協力し合って機能す るように、例えばプロモーターにおいて転写が開始され、そして酵素をコードす るDNA配列伝いで進行するように並んでいることを意味する。 このプロモーターは選定の宿主細胞の中で転写活性を示しうる任意のDNA配列 であってよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種のタンパク質をコードする 遺伝子に由来しうる。 酵母宿主細胞の中での使用にとって好適なプロモーターの例には、酵母解糖系 遺伝子(HitzemanらJ ．Biol．Chem．255(1980)，12073-12080；Alber and Kawasa ki, J ．Mol．Appl．Gen．1(1982)，419-434)又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺 伝子(YoungらGenetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaen derら編)，Plenum Press，New York，1982)又はTPI1（US 4,599,311）もしくはA DH2 −4c （RussellらNature 304(1983)，652-654）プロモーターが含まれる。 糸状菌宿主細胞において使用するのに適当なプロモーターの例は、例えばADH3 プロモーター(Mcknightら、The EMBO J ．4(1985)，2093-2099)又は tpiAプロモ ーターである。その他の有用なプロモーターの例はＡ．オリザ(A．oryzae)TAKA アミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロ テイナーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラー ゼ、Ａ．ニガー又はＡ．アワモリ（A．awamori）グルコアミラーゼ（gluA）、リ ゾムコール・ミーヘイ・リパーゼ、Ａ．オリザアルカリ性プロテアーゼ、Ａ．オ リザトリオースホスフェートイソメラ ーゼ又はＡ．ニドゥランス(A．nidulans)アセトアミダーゼをコードする遺伝子 に由来するものである。TAKAアミラーゼ及びgluAプロモーターが好ましい。 細菌宿主細胞において使用するのに適当なプロモーターの例には、バチルス・ ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニックアミ ラーゼ遺伝子、バチルス・リシェニホルミス（B．licheniformis）アルファーア ミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス（B．amyloliquefaciens） BANアミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリス(B．subtilis)アルカリプロテアー ゼgen、又はバチルス・プミルス（B．pumilus）キシロシダーゼ遺伝子のプロモ ーター又はファージラムダＰ_RもしくはＲ_Lプロモーター、又はＥ．コリ(E．coli )のlac ，trp もしくはtac プロモーターが含まれる。 本発明の酵素をコードするDNA配列はまた、必要ならば、適当なターミネータ ーに作用可能式に連結されていてよい。 本発明の組換ベクターは更に注目の宿主細胞の中でベクターが複製できるよう にするDNA配列を含んで成りうる。 このベクターは選択マーカー、例えば宿主細胞の欠陥を補完する生成物をもた らす遺伝子、例えばジヒドロホレートリダクターゼ（DHFR）をコードする遺伝子 又はシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）TPI遺伝子（ P．R．Russell，Gene 40，1985，pp．125-130に記載）をコードする遺伝子を含 んで成りうる。糸状菌に関しては、選択マーカーにはamdS，pyrG，argB，niaD，sC が含まれる。 本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路に導くため、分泌シグナル配列（リーダー 配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる）を組換ベクターの中に施し てよい。この分泌シグナル配列は適正な リーディングフレームの中でこの酵素をコードするDNA配列と連結する。分泌シ グナル配列は一般にこの酵素をコードするDNA配列に対して５’側に配置する。 この分泌シグナル配列は通常この酵素と結合しているか、又は別の分泌タンパク 質をコードする遺伝子に由来しうる。 酵母細胞からの分泌のため、この分泌シグナル配列は発現酵素を細胞の分泌経 路に効率的に導くことを確実にする任意のシグナルペプチドをコードしうる。こ のシグナルペプチドは天然シグナルペプチドもしくはその機能性部分であるか、 又は合成ペプチドでありうる。適当なシグナルペプチドはα−因子シグナルペプ チド（US 4,870,008参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（O．Hag enbuchleら、Nature 289，1981，pp．643-646参照）、改変カルボキシペプチダ ーゼシグナルペプチド（L．A．Vallsら、Cell 48, 1987，pp．887-897参照）、 酵母BAR1シグナルペプチド（WO87/02670参照）、又は酵母アスパラギン酸プロテ アーゼ３（YAP3）シグナルペプチド（M．Egel-Mitaniら、Yeast 6, 1990，pp．1 27-137参照）であることが見い出された。 酵母の中での効率的な分泌のため、リーダーペプチドをコードする配列はシグ ナル配列の下流、且つ酵素をコードするDNA配列の上流に挿入してもよい。リー ダーペプチドの機能は、発現酵素が小胞体からゴルジ装置へと導かれ、そして更 に培養培地への分泌のために分泌小胞体へと導かれるようにすることにある（即 ち、細胞壁を通じる又は少なくとも細胞膜を通じて酵母細胞のペリプラズマ空間 に至る酵素の輸送）。リーダーペプチドは酵母α−因子リーダーであってよい（ その利用は例えばUS 4,546,082，EP 16,201，EP 123,294，EP 123,544及びEP 16 3,529に記載されている）。他方、リーダーペプチドは合成リーダーであってよ く、即ち天然では見つから ないリーダー配列であってよい。合成リーダーペプチドは例えばWO92/02463又は WO92/11378に記載の通りにして構築される。 糸状菌において使用するためには、シグナルペプチドはアスペルギルス種アミ ラーゼもしくはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミーヘイ リパーゼもしくはプロテアーゼをコードする遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノーザ リパーゼをコードする遺伝子に由来するのが好都合でありうる。このシグナル配 列は好ましくはＡ．オリザ、TAKAアミラーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、 Ａ．ニガー酸安定性アミラーゼ又はＡ．ニガーグルコアミラーゼをコードする遺 伝子に由来するのが好ましい。 本酵素をコードするDNA配列、プロモーター並びに任意的にターミネーター及 び／又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションし、そしてそれらを複製に とって必須な情報を含む適当なベクターの中に挿入するための手順は当業者に公 知である（例えば、Sambrookら、前掲参照）。 宿主細胞 宿主細胞に導入する本酵素をコードするDNA配列は注目の宿主に対して同種又 は異種のいづれであってもよい。宿主細胞に対して同種であるなら、即ち天然で 宿主細胞により産生されるなら、それは一般に別のプロモーター配列に作用可能 式に連結されているか、又は適宜、その天然環境とは異なる分泌シグナル配列及 び／もしくはターミネーター配列に作用可能式に連結されている。「同種」なる 語は注目の宿主生物にとって天然の酵素をコードするcDNA配列を含むことを意図 する。「異種」なる語は天然では宿主細胞により発現されないDNA配列を含むこ とを意図する。即ち、DNA配列が別の起源に由来しうるか、又は合成配列であっ てよい。 本発明のDNA構築体又は組換ベクターを導入すべき宿主細胞は本 酵素を産生できる任意の細胞であってよく、そして細菌、酵母、菌類及び高等真 核細胞が含まれる。 培養されることで本発明の酵素を生産できるようになる細菌宿主細胞の例はグ ラム陽性菌、例えばバチルスの株、例えばＢ．スブチリス、Ｂ．リシュニホルミ ス、Ｂ．レンタス(B．Ientus)、Ｂ．ブレビス(B．brevis)、Ｂ．ステアロサーモ フィルス、Ｂ．アルカロフィルス(B．alkalophilus)、Ｂ．アミロリケファシエ ンス（B．ａmyloliquefaciens）、Ｂ．コアギュランス（B．coagulans）、Ｂ． サーキュランス（B．circulans）、Ｂ．ロータス(B．lautus)、Ｂ．メガテリウ ム（B．megatherium）もしくはＢ．スリンジエンシス（B．thuringiensis）の株 、又はストレプトマイセス（Streptomyces）の株、例えばＳ．リビダンス(S．li vidans)もしくはＳ．ムリヌス（S．murinus）、又はグラム陰性菌、例えばエッ シェリヒア．コリ（Ｅ．コリ）である。細菌の形質転換はプロトプラスト形質転 換により、又は周知の態様でコンピテント細胞を用いることにより行えうる（Sa mbrookら、前掲参照）。 酵素を細菌、例えばＥ．コリにおいて発現させるとき、本酵素はサイトプラズ マの中で一般に不溶性顆粒（封入体として知られる）として保持されうるか、又 は細菌分泌配列によりペリプラズマ空間へと導かれうる。前者の場合、細胞を溶 解させ、そして顆粒を回収し、次いで変性させ、その後その酵素を変性剤を希釈 することによりリフォルディングする。後者の場合、酵素は細胞を例えば音波処 理又は浸透圧ショックにより破壊してペリズマ空間の内容物を遊離させ、次いで 酵素を回収することによりペリズマ空間から回収できうる。 適当な酵母細胞の例にはサッカロマイセス種又はシゾサッカロマイセス種、特 にサッカロマイセス・セレビジエ又はサッカロマイセ ス・クルイベリ(S．kluyveri)の株の細胞が含まれる。酵母細胞を異種DNAで形質 転換し、そしてそれから異種酵素を産生する方法は例えば引用することで本明細 書に組入れるUS 4,599,311，US 4,931,373，US 4,870,008，5,037,743及びUS 4, 845,075に記載されている。形質転換細胞は選択マーカー、一般には薬剤耐性、 又は特定の栄養素、例えばロイシンの非存在下で増殖する能力により決定される 表現型により選別される。酵母の中で使用するのに適当なベクターはUS 4,931,3 73に開示のPOT1ベクターである。本発明の酵素をコードするDNA配列には例えば 上記の如きシグナル配列及び任意的にリーダー配列が先行しうる。適当な酵母細 胞の更なる例はクルイベロマイセス(Kluyveromyces)、例えばＫ．ラクチス(K．l actis)、ハンセヌラ(Hansenula)、例えばＨ．ポリモルファ(H．polymorpha)、又 はピヒア（Pichia）、例えばＰ．パストリス(P．pastoris)の株である（Gleenso nら、J ．Gen．Microbiol．132，1986，pp．3459-3465；US 4,882,279参照）。 その他の菌類の例は糸状菌、例えばアスペルギルス種、ニューロスポラ（Neur ospora）種、フサリウム（Fusarium）種、又はトリコデルマ(Trichoderma)種、 特にＡ．オリザ、Ａ．ニドゥランス(A．nidulans)又はＡ．ニガーの株である。 タンパク質の発現のためのアスペルギルス種の利用は例えばEP 272,277，EP 230 ,023に記載されている。Ｆ．オキシスポルムの形質転換は例えばMalardierら、1 989，Gene 78：147-156に記載の通りに実施できうる。 宿主細胞として糸状菌を使用する場合、それは本発明のDNA構築体で、好都合 には組換宿主細胞が得られるようにDNA構築体を宿主染色体の中に組込むことに より形質転換できうる。この組込みが一般に有利と考えられ、その理由はDNA配 列が細胞の中で安定的に維持される傾向にあるからである。宿主染色体へのDNA 構築体の組込 みは慣用の方法、例えば相同又は異種組換により実施できうる。 上記の形質転換又はトランスフェクションした宿主細胞を次に適当な栄養培地 の中で、本酵素の発現が可能となる条件下で培養し、次いで得られる酵素を培養 物から回収する。細胞を培養するのに用いる培地宿主細胞を増殖させるのに適当 な任意の慣用の培地、例えば最小培地又は適当な補助剤を含む複合培地でありう る。適当な培地は商業的供給者から入手できるものであるか、又は公開の処方（ 例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ）に従って調 製されうるのである。細胞により生産された酵素は培養培地から、宿主細胞を遠 心又は濾過により培地から分離し、硫酸アンモニウムの如き塩によりその上清液 又は濾液のタンパク質性成分を沈殿し、注目の酵素の種類に応じてイオン交換ク ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ フィー等の如き様々なクロマトグラフィー手順により精製することを含む慣用の 手順により回収できうる。 更なる別の観点において、本発明は酵素調製物を有するセルロース又はセルロ ース材料の処理に関連し、それは上記のエンドグルカナーゼ活性を示す酵素に富 んでいる。 例えば、本発明の酵素調製品は植物細胞壁含有材料の分解又は改変にとって有 用であり、ここでこの調製品は上記のエンドグルカナーゼ活性をもつ酵素に富ん でいる。 本発明の酵素に富む本酵素調製品は例えば多重酵素活性を含んで成る酵素調製 品、特に多重植物細胞壁分解酵素、例えばPectinex（商標）、Pectinex Ultra S P(商標)、セルキャスト又はセルザイム（全て、Novo Nordisk A/Sより入手可能 ）を含んで成りうる。本明細書において、「富む」なる語は、この酵素調製品の エンドグルカナーゼ活性が例えば1.1以上の富化倍率で、好都合には上記の方法 により調製した本発明の酵素の添加により上昇していることを意味することを意 図する。 他方、セルロース分解（エンドグルカナーゼ）活性をもつ酵素に富む酵素調製 品は本発明の酵素の主要酵素成分として含んで成りうるもの、例えば一成分酵素 調製品でありうる。 スクリーニング及び発現クローニングは以下を利用することにより実施できう る： 材料及び方法 ドナー生物：mRNAをアクレモニウム種CBS 478.94及びアクレモニウム種CBS 265. 95のそれぞれから単離し、セルロース含有発酵培地の中で十分な通気が確実とな るように撹拌しながら増殖させた。菌糸を４〜６日間の増殖後回収し、液体窒素 の中で瞬間凍結し、そして−80℃で保存した。 酵母株：使用したサッカロマイセス・セレビジエ株はyNG231（MATα；leu２；ur a３−52；his４−539；pep４−delta １；cir＋）又はJG169（MATα； ura３−5 2；leu２−３，112；his３−D200；pep４−1137；prcl::HIS３；prbｌ:: LEU２ ；cir＋）とした。 プラスミド：酵母TPIプロモーターを含む発現プラスミドpYHD17は商業的に入手 できるプラスミドpYES2.0（Invitrogen）から調製した。このプラスミド及びそ の構築はWO93/11249に更に記述され、その内容は引用することで本明細書に組入 れる。 アスペルギルス発現ベクターpHD414はプラスミドp775の誘導体である（EP 238 ,023）。pHD414の構築はWO93/11249に更に記載されている。 全RNAの抽出はグアニジニウムチオシアネートでの処理、それに次ぐ5.7ＭのCs Clクッションを通じての超遠心により行い、そして ポリ（Ａ）⁺RNAの単離はWO94/14953に記載の手順を利用するオリゴ（dT）−セル ロースアフィニティークロマトグラフィーにより実施した。 cDNA合成及び修飾：二本鎖cDNAは５μｇのポリ（Ａ）⁺RNAから、RNase Ｈ法（Gu bler & Hoffman 1983，Sambrookら1989）により、ヘアーピン修飾を利用して合 成した。この手順はWO95/02043に更に述べられている。マング・ビーン・ヌクレ アーゼ（Bethesda Research Laboratories）で処理した後、ds cDNAをT4 DNAポ リメラーゼ（Invitrogen）で平滑末端にし、そしてこのcDNAを非パリンドローム Bst XIアダプター（Invitrogen）にWO95/02043に記載の通りにしてライゲーショ ンさせた。 cDNAライブラリーの構築：付加せしめたds cDNAを遠心により回収し、70％のEtO Hで洗い、そして25mlのH₂Oに再懸濁した。大量スケールライブラリーライゲーシ ョンの前に、４通りの試験ライゲーションを１μｌづつのds cDNA（反応チュー ブ＃１〜＃３）、２単位のT4リガーゼ（Invitrogen）並びに50ng（チューブ＃１ ）、100ng（チューブ＃２）及び200ng（チューブ＃３及び＃４）のBst XI切断酵 母発現ベクター（pYES 2.0ベクター（Invitrogen）又はpYHD17のいづれか）を含 む10μｌのライゲーションバッファー（上記と同）の中で実施した。 至適条件を利用し、大量スケールライゲーションを40μｌのライゲーションバ ッファーの中で設定した。１μｌのアリコートをエレクトロコンピテントＥ．コ リ1061細胞の中に形質転換し、そしてこの形質転換細胞を力価検定し、そしてそ のライブラリーをLB＋アンピシリンプレート上で5000〜7000c.f.u.／プレートで プレート培養した。各プレートに３mlの培地を加えた。細菌をかき取り、１mlの グリセロールを加え、そしてプールとして−80°で保存した。残り の２mlはDNA単離のために用いた。更なる詳細はWO95/02043を参照のこと。 酵母ライブラリーの構築：細菌クローンの全てが酵母の中で試験されることを確 実にするため、オリジナルプール中の細菌クローンの数の５倍以上の数の酵母形 質転換体を最低限用意した。 個々のプールに由来する精製プラスミドDNA（100ng／μｌ）の１μｌのアリコ ートを40μｌのコンピテントＳ．セレビジエJG169細胞(500mlのYPD中でOD600＝1 .5；低温DIWで２回、低温の１Ｍのソルビトールで１回洗浄、１Ｍのソルビトー ル0.5mlに再懸濁：Becker & Guarante，1991)にエレクトロポレーションした(20 0Ω．1.5kV，25μＦ）。１mlの１Ｍの低温ソルビトールの添加後、80μｌのアリ コートをSC＋グルコース−ウラシルアガープレート上に250〜500c.f.u.／プレー トとなるようにプレートし、そして30℃で３〜５日インキュベートした。 陽性コロニーの同定：３〜５日間の増殖後、アガープレートを数セットのSC＋ガ ラクトース−ウラシルアガープレート上にレプリカプレート培養した。一セット のレプリカプレートは0.1％のAZCL HEセルロースを含んだ。これらのプレートを 30℃で３〜７日インキュベートした。エンドグルカナーゼ陽性コロニーは青色の 輪で囲まれたコロニーとして同定された。 酵素陽性コロニー由来の細胞をアガーの上に単一コロニー単離体のためにまき 、そして同定した各エンドグルカナーゼ産生コロニーについて酵素産生単一コロ ニーを選別した。 陽性クローンの特性決定：陽性クローンは単一コロニーとして得られ、cDNAイン サートをその酵母コロニーから直接ビオチニル化ポリリンカープライマーを利用 して増幅し、磁性ビーズ（Dynabead M−280，Dynal）系により精製し、そして連 鎖停止法（Sangerら、1977 ）及びシーケナーゼシステム(United States Biochemical)を利用して各cDNAク ローンの５’末端を配列決定することによりそれぞれ特性決定した。 アスペルギルスにおける発現のためのcDNA遺伝子の単離：１又は複数のエンドグ ルカナーゼ産生酵母コロニーを５mlのガラス試験管中の20mlのYPD培地の中に接 種した。この試験管を30℃で２日振盪した。細胞を3000rpmで10分遠心により回 収した。 DNAをWO94/14953に従って単離し、そして50μｌの水に溶かした。このDNAを標 準の手順によりＥ．コリに形質転換した。プラスミドDNAを標準の手順を利用し てＥ．コリから単離し、そして制限酵素分析により分析した。cDNAインサートを 適当な制限酵素を利用して切り出し、そしてアスペルギルス発現ベクターの中に ライゲーションした。 アスペルギルス・オリザ又はアスペルギルス・ニガーの形質転換：プロトプラス トは引用することで本明細書に組入れるWO95/02043第16頁第21行〜第17頁第12行 に記載の通りにして調製できうる。 100μｌのプロトプラスト懸濁物を10μｌのSTC(1.2Ｍのソルビトール、10mMの トリス−HCl，pH＝7.5，10mMのCaCl₂)中の５〜25μｇの適当なDNAと混合する。 プロトプラストをp3SR2(Ａ．ニドゥランスamdS遺伝子担持プラスミド)と混合す る。この混合物を室温で25分放置する。0.2mlの60％のPEG4000(BDH 29576)，10m MのCaCl₂及び10mMのトリス−HCl，pH＝7.5を加え、そして静かに（２回）混合し 、そして最後に0.85mlの上記溶液を加え、そして静かに混合した。この混合物を 室温で25分放置し、2500ｇで15分遠心し、そしてそのペレットを1.2Ｍのソルビ トール２mlの中に再懸濁した。１分以上の沈降後、プロトプラストを1.0Ｍのス クロース、pH7.0、窒素源としての10mMのアセトアミド及びバックグランド増殖 を 阻止するための20mMのCsClを含む最少プレート(Cove，Biochem．Biophys．Acta 113 （1966）51-56)上にまく。37℃で４〜７日間のインキュベーション後、胞子 を拾い、そして単一コロニーのために広げる。この手順を繰り返し、そして２回 目の再単離の後に単一コロニーの胞子を規定の形質転換体として保存する。 Ａ．オリザ形質転換体の試験 各形質転換体を10mlのYPGに接種し、そして増殖させた。37℃で２〜５日のイ ンキュベーション後、10mlの上清液を除去した。エンドグルカナーゼ活性を上記 の通りにAZCL HEセルロース又はAZCLβ−グルカンにより同定した。 ハイブリダイゼーション条件（本発明のＤＮＡ構築体の特性ｉ）の評価において 利用）： オリゴヌクレオチドプローブと「類似」DNA配列との間でのハイブリダイゼー ションを決定するために適当な条件はハイブリダイズするDNAフラグメントを含 むフィルターの５×のSSC中での予備浸漬並びに５×のSSC，５×のDenhardt溶液 、50mMのリン酸ナトリウム、pH6.8及び50μｇの変性音波処理仔牛胸腺DNAの溶液 中での〜50℃での１ｈの予備ハイブリダイゼーション、それに次ぐ50μCiの32− Ｐ−dCTPラベル化プローブの添加された同一の溶液の中での〜50℃で18ｈのハイ ブリダイゼーション、２×のSSC，0.2％のSDSの中での50℃で30分にわたる３回 の洗浄を含む。 ハイブリダイゼーションにおいて使用する適当なオリゴヌクレオチドプローブ はSEQ ID No.１（又は２，３，４，５，６もしくは７）に示すDNA配列に基づい て調製できうる。 免疫交差反応性：免疫交差反応能を決定するうえで利用する抗体は精製エンドグ ルカナーゼの利用により調製できうる。より詳しくは、本発明のエンドグルカナ ーゼに対する抗血清をN．AxelsenらA Ma nual of Quantitative Immunoelectrophoresis ，Blackwell Scientific Publica tion，1973、第23章又はA．Johnstone and R．Thorpe Immunochemistry in Prac tice ，Blackwell Scientific Publication，1982(より詳しくはpp．27-31)に従 って生起されることができうる。精製イムノグロブリンは抗血清から、例えば塩 沈殿（(NH₄)₂SO₄）、それに次ぐ透析及び例えばDEAE−Sephadexでのイオン交換 クロマトグラフィーにより獲得し得る。タンパク質の免疫化学特性決定はアウタ ーロニー二重拡散分析（O．Ouchterlony Handbook of Experimental Immunology （D．M．Weir編）、Blackwell Scientific Publications，1967，pp．655-706） により、交差免疫電気泳動（N．Axelsenら、前掲、第３及び４章）により、又は ロケット免疫電気泳法（N．Axelsenら、第２章）により行われうる。 培地 YPD：10ｇの酵母抽出物、20ｇのペプトン、900mlに至るH₂O。オートクレーブに かけ、100mlの20％のグルコース（除菌濾過）を添加。 YPM：10ｇの酵母抽出物、20ｇのペプトン、900mlに至るH₂O。オートクレーブに かけ、100mlの20％のマルトデキストリン（除菌濾過）を添加。 10×のBasal塩：75ｇの酵母窒素ベース、113ｇのコハク酸、68ｇのNaOH，1000ml に至るH₂O、除菌濾過。 SC−URA：100mlの10×のBasal塩、28mlのビタミン抜き20％のカスアミノ酸、10m lの１％のトリプトファン、900mlに至るH₂O。オートクレーブにかけ、3.6mlの５ ％のトレオニン及び100mlの20％のグルコース又は20％のガラクトースを添加。 SC−URA アガー：SC−URA，20ｇ／１のアガー添加。 AZCLβ−グルカン、AZCLキシログルカン、AZCL HEセルロース(Me gazyme，Australia)。 用途洗浄組成物 本発明に従うと、セルラーゼは一般は洗浄組成物の一成分となりうる。この場 合、それは洗浄組成物の中に無塵顆粒、安定化液体、又は保護酵素の形態で含ま れうる。無塵顆粒は例えばUS 4,106,991及び4,661,452(共にNovo Industri A/S) に開示の通りに製造し得、そして当業界公知の方法により任意的にコーティング が施されうる。ワキシーコーティング材料の例は1,000〜20,000の平均分子量を もつポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50 のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが 12〜20個の炭素原子を含み、そして15〜80個のエチレンオキシド単位のあるエト キシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ −及びトリグリセリドである。流動層技術による適用に適するフィルム形成コー ティング材料の例は特許GB 1,483,591に示されている。液体酵素調製品は例えば プロピレングリコールの如きポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸又は硼酸の 確立された方法に従う添加により安定化されうる。その他の酵素安定剤が当業界 に公知である。保護酵素はEP 238,216号に開示の方法に従って調製されうる。 本発明の洗浄組成物は任意の慣用の形態、例えば粉末、顆粒、ベースト又は液 体であってよい。液体洗浄は一般に70％までの水と０〜30％の有機溶媒を含む水 性系でも、非水性系でもよい。 この洗浄組成物は１又は複数種の界面活性剤を含んで成り、それぞれアニオン 、非イオン、カチオン、又は双性イオンであってよい。この洗剤は通常０〜50％ のアニオン界面活性剤、例えば線形アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、アル ファーオレフィンスルホネ ート(AOS)、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）（AS）、ア ルコールエトキシスルフェート(AEOS又はAES)、第二アルカンスルホネート(SAS) 、アルファースルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−もしくはアルケニルコハ ク酸、又は石けんを含むであろう。それは更に０〜40％の非イオン界面活性剤、 例えばアルコールエトキシレート（AEO又はAE）、カルボキシル化アルコールエ トキシレート、ノニフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アル キルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪 酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えばWO 92/06154に記載）を含むであろう。 この洗浄組成物は更に１又は複数種のその他の酵素、例えばアミラーゼ、リパ ーゼ、キュチナーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼ、例え ばラッカーゼを含んで成りうる。 この洗剤は１〜65％の洗剤ビルダー又は錯形成剤、例えばゼオライト、ジホス フェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロ三酢酸(NTA )、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸(DTMPA)、ア ルキル−もしくはアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層状シリケート（ 例えばHoechst由来のSKS−６）を含みうる。この洗剤はビルダー抜き、即ち、洗 剤ビルダーを本質的に含まないものであってもよい。 この洗剤は１又は複数種のポリマーを含んで成りうる。その例はカルボキシメ チルセルロース(CMC)、ポリ（ビニルピロリドン）（PVP）、ポリエチレングリコ ール(PEG)、ポリ（ビニルアルコール）(PVA)、ポリカルボキシレート、例えばポ リアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレー ト／アクリル酸コポリマーである。 この洗剤は漂白系を含んでよく、それはH₂O₂起源、例えば過硼酸塩又は過炭酸 塩を含んで成ってよく、それは過酸形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエ チレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）と 組合せてよい。他方、この漂白系は例えばアミド、イミド又はスルホン型のペル オキシ酸を含んで成りうる。 本発明の洗浄組成物の酵素は慣用の安定化剤、例えばポリオール、例えばプロ ピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼 酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステルを利用して安定化し得、そしてこの組成物 は例えばWO92/19709及びWO92/19708に記載の通りにして処方されうる。 この洗剤は更に慣用の洗浄成分、例えば布帛コンディショナー、例えば粘土、 発泡促進剤、発泡抑制剤、腐触防止剤、土壌懸濁剤、土壌再付着防止剤、染料、 殺菌剤、蛍光増白剤又は香料も含みうる。 pH（水性溶液中で使用濃度において測定）は通常中性又はアルカリ性、例えば ７〜11の域であろう。 本発明の範囲に属する洗浄組成物の特定の形態には以下のものが含まれる： １）以下を含んで成る600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として処方した 洗浄組成物： ２）以下を含んで成る600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として処方した 洗浄組成物： ３）以下を含んで成る600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として処方した 洗浄組成物： ４）以下を含んで成る600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として処方した 洗浄組成物： ５）以下を含んで成る水性液体洗浄組成物： ６）以下を含んで成る水性構築型液体洗浄組成物： ７）以下を含んで成る600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として処方した 洗浄組成物： ８）以下を含んで成る顆粒として処方した洗浄組成物： ９）以下を含んで成る顆粒として処方した洗浄組成物： 10）以下を含んで成る水性液体洗浄組成物： 11）以下を含んで成る水性液体洗浄組成物： 12）以下を含んで成る600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として処方した 洗浄組成物： 13）線形アルキルベンゼンスルホネートの全部又は一部を（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）アルキ ルスルフェートに置き換えた１）〜12）に記載の洗浄組成物。 14）以下を含んで成る600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として処方した 洗浄組成物： 15）以下を含んで成る600ｇ／ｌ以上のバルク密度を有する顆粒として処方した 洗浄組成物： 16）追加の成分として又は既に記載した漂白系の代替品として安定化又は封入化 過酸を含む１）〜15）に記載の洗浄製剤。 17）過硼酸塩が過炭酸塩に置き代った１），３），７），９）及び12）記載の洗 浄組成物。 18）マンガン触媒を更に含む１），３），７），９），12），14）及び15）に記 載の洗浄組成物。このマンガン触媒は、例えば「Efficient manganese catalyst s for low-temperature bleaching」Nature 369，1994，pp．637-639に記載の化 合物のいづれかでありうる。 19）液体非イオン界面活性剤、例えば線形アルコキシル化第一アルコール、ビル ダー系（例えばホスホネート）、酵素及びアルカリを含んで成る非水性洗浄液と して処方された洗浄組成物。この洗剤はアニオン界面活性剤及び／又は漂白系も 含んで成りうる。 本発明のセルラーゼは洗剤の中に一般に利用されている濃度で組込まれる。現 時点では、本発明の洗浄組成物中で、このセルラーゼは洗浄液１リットル当り0. 00001〜１mg（純粋な酵素タンパク質として計算）に相当する量で加えられうる ものと考えられている。パルプ及び紙用途 製紙パルプ産業において、本発明に係る酵素調製品は好都合には例えば下記の 通りに適用されうる： ─ 樹木の皮剥ぎ用：本発明に係る酵素調製品による予備処理は機械式ドラムで の皮剥ぎの前に形成層を分解し得、好都合なエネルギー節約をもたらす。 ─ ファイバー除去用：セルロースファイバー含有材料の本発明は酵素調製品に よる精製又は叩解の前での処理は、ファイバー間表面に対するセルラーゼの加水 分解作用に基づきエネルギー消費の削減をもたらしうる。本発明の酵素調製品の 使用は公知の酵素の利用と 比べて改善されたエネルギー節約をもたらし得る。その理由は、本発明の酵素組 成物がファイバー壁に対して一層強い侵入能力を有し得るからである。 ─ ファイバー改質用、即ち、一層深く浸透する酵素を必要とする、ファイバー 壁の部分加水分解が必要とされるファイバー性能の向上のため（例えば、粗いフ ァイバーをより柔軟性にするため）。ファイバーの深遠処理は機械パルプ又はリ サイクルパルプの混合物の如き高収量パルプについては今まで不可能とされてい た。これはファイバー壁の孔質マトリックスの物理的拘束により酵素分子の通過 を阻止するファイバー壁構造の性質に原因する。本発明の酵素組成物はファイバ ー壁に浸透することができるものと考えられる。 ─ 排水性向上のため。製紙パルプの排水性はパルプの加水分解酵素、例えばセ ルラーゼによる処理によって向上しうる。本発明に係る酵素調製品の利用は一層 効率的であり、例えばファイバーの間にある及び製紙装置のワイヤーメッシュの 中にある中空空間をふさいでしまうことにより排水率を制約する微細画分中（フ ァイバー塊より成る）の強力に水和したマイクロフィブリルの束を高度に緩和し うる。パルプをセルラーゼ処理にかけると、カナダ標準自由度（Canadian stand ard freeness：CSF）は上昇し、そしてSchopper−Riegler排水指数は低下する。 例えば、引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,923,565号；TAPPI T22 7，SCAN C19：65を参照のこと。 ─ ファイバー間結合用。加水分解酵素はファイバー間結合能を向上するために 製紙パルプの製造において適用される。この酵素はファイバー表面の不純物、例 えばセルロース塊をすすぎ落し、ファイバー壁に対する結合力をもつ露出セルロ ースの面積を大きくし、それ故ファイバー間水素結合能を高める。このプロセス はデホルニフ ィケーション(dehornification)とも呼ばれる。本発明に係るセルラーゼ含有酵 素調製品により作った製紙及び段ボール紙は強められた強度又は低められた粒状 面、より滑らかな面及び向上したプリント性を有する。このような改良は修飾／ 誘導化酵素の向上した浸透能の結果と信じられる。 ─ 酵素的脱インク用：セルラーゼの如き加水分解酵素の利用によるパルプ処理 中又は後のリサイクル紙の部分加水分解はインク粒子の除去及び凝塊を助長する ことで知られる。本発明に係る酵素調製品の利用はファイバー壁のフィブリル状 マトリックスへの酵素分子のより良い浸透に基づき表面構造からのインクの一層 効率的な脱離を供し得る。この処理により表面は軟化し、これによりインク粒子 は効率的に脱離する。脱離したインク粒子の凝塊も、ファイバーに由来するイン ク粒子に付加していることの見い出されたセルロース断片のより効率的な加水分 解に基づき、向上する。 リグノセルロースパルプの処理は、例えばWO91/14819，WO91/14822，WO92/175 73及びWO92/18688に記載の通りにして実施されうる。織物用途 別の態様において、本発明はバイオ・ポリシングプロセスにおける本発明に係 る酵素調製品の利用に関する。バイオポリシングは糸の表面の特殊な処理であり 、これは布帛の湿潤性の低下を損うことなく取り扱い性及び外観に関する布帛の 品質を高める。バイオポリシングの最も重要な効果は少ない毛羽立ち及び毛玉、 増大した耐久柔軟性及び改変した吸水性を特徴としうる。バイオポリシングは通 常メリヤス及び織布の製造のウェット加工において行われる。ウェット加工は例 えば脱サイズ、筋付け（スコアリング）、漂白、洗濯、染色／プリンティング及 び最終仕上げの如き工程を含んで成る。これらの工程の際、布帛は多かれ少なか れ機械的作用にかけられる 。一般に、織物を編んだ又は織った後、布帛を脱サイズ工程にかけ、次いで筋付 け段階等にかける。脱サイズは織物からのサイズの除去の作業である。機械ルー ム上で織る前、ワープ糸は往々にしてその引張強さを強めるためにサイズデンプ ン又はデンプン誘導体でコーティングされている。織った後、サイズコーティン グは、均質、且つ耐洗濯性結果を確実にするために、布帛を更に処理する前に除 去しておかなければならない。バイオポリシングの効果を得るためにはセルロー ス分解及び機械作用の組合せが必要であることが知られる。「超柔軟性」はセル ラーゼによる処理を柔軟剤による慣用の処理と組合せたときに達成されることも 知られる。セルロース布帛のバイオポリシングのための本発明の酵素調製品の利 用は有利と考えられ、例えばより完全なポリシングが達成されうる。バイオポリ シングは例えばWO93/20278に記載の方法の適用により得られうる。ストーンウォッシング 染色布帛、特にデニム布帛又はジーンズにおいて「ストーンウォッシュ」外観 （着色の局在摩耗）は、かかる布帛より成るデニム又はジーンズを軽石の存在下 で洗濯して布帛の着色の所望の局在減少を供することによって、又は布帛を酵素 で、特にセルロース分解酵素で処理することにより供されることが知られる。酵 素処理はUS4,382,864号に開示の如き単独で、伝統的なプロセスに必要とされる よりも少量の軽石を伴って、又はWO95/09225に開示の如きパーライトを伴って実 施されうる。セルロース分解活性の決定 セルロース分解酵素はCMCを加水分解し、それ故インキュベーション混合物の 粘度を高める。得られる粘度の低下は振動式粘度計(例えばSofraser，France由 来のMIVI 3000)により決定し得る。Ｓ−CEVUで測定するセルロース分解活性の測 定値は下記のアッセイに従 って決定されうる： Ｓ−CEVUアッセイは、サンプルのカルボキシ−メチルセルロース(CMC)の溶液 の粘度を下げる能力を測定することによりサンプル中の触媒活性体の量を定量す る。このアッセイは以下の通りに実施して：40℃；pH7.5；0.1Ｍのリン酸バッフ ァー；30分の時間；CMC基質の粘度を下げる相対酵素標準品の使用（カルボキシ メチルセルロース Hercules ７ LFD）；酵素濃度約0.15Ｓ−CEVU／ml。 更に、１ Savi Ｕ（単位）は１分当り１μmoleのグルコース当量を形成できる 酵素量と定義する。 本発明を以下の非限定例で更に説明する。 実施例１ ヒュミコラ・インソレンスDSM 1800由来のアルカリセルラーゼとの関係の同定 アクレモニウム種CBS 265.95、アクレモニウム種CBS 478.94、アクレモニウム ・パーシシヌムCBS 169.95、アクレモニウム・アクレモニウムAHU 9519及びセフ ァロスポリウム種CBS 535.71の株と、ヒュミコラ・インソレンスDSM 1800由来の アルカリセルラーゼとの関係の同定のためにアウターロニー免疫拡散試験を利用 した。 出願人により、ヒュミコラ・インソレンスDSM 1800に対する抗血清が生起され 、そして１〜１／16の希釈率で使用された。アモルファスセルロースアガー培地 上で増殖させた菌類のブロックを、１リットルのPBST（リン酸バッファー食塩水 ）当り0.5mlのTween 20を含むpH7.4にNaOHにより調整された0.9％のBacto−アガ ーPBSTのウェルの中に挿入した。セルラーゼ菌類により誘導されたブロックの周 辺で、それぞれのウェルをそれぞれの希釈率の抗血清（１〜１／16）で充填した 。小さなペトリ皿を大きめの皿に入れ、湿った詰め綿を入れて乾燥を防ぎ、そし て37℃で一夜インキュベートした。 アクレモニウム種CBS 265.95、アクレモニウム種CBS 478.94、アクレモニウム ・パーシシヌムCBS 169.95、アクレモニウム・アクレモニウムAHU 9519及びセフ ァロスポリウム種CBS 535.71を含むどのブロックも抗血清と沈殿弓を形成しなか った。 実施例２ アモルファスセルロースに対するアルカリセルラーゼ活性の決定 材料及び方法：基質の調製 ：20ｇの酸膨潤AVICEL^*ストック溶液（調製については以下参照。こ れは１ヶ月間保存できる）を5000rpmで20分遠心し、上清液を注ぎ出し、そして 沈殿物を30mlのバッファーの中に再懸濁した。次いでこの懸濁物を5000rpmで20 分遠心し、上清液を注ぎ出し、そして沈殿物を全部で30ｇに至るようにバッファ ーに再懸濁した。これは10ｇのAVICEL／ｌの基質濃度に相当する。バッファー ：0.1ＭのバルビタールpH8.5又は0.1ＭのグリシンpH10.0酵素溶液 ： 酵素はpH8.5又はpH10.0にて0.2〜１Ｓ−CEVU／mlの活性にまで希釈した。試薬 ： ２％のNaOH，PHBAH−試薬：1.5ｇのｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド及び5. 0ｇの酒石酸ナトリウムを100mlの２％のNaOHに溶かした。 基質、バッファー及び酵素溶液を4.00ｇ／ｌの最終基質濃度となるように混合 した。材料 ： ５ｇのAvicel^*（Art．2331 Merck） 150mlの85％のオルト−リン酸（Art．573 Merck） 400mlのアセトン（Art．14 Merck） １.３ｌの脱イオン水（Milli Ｑ） １ｌのガラスビーカー １ｌのガラスろう斗 ２ｌの吸引フラスコ Ultra Turrax ホモジナイザー手順 ： アセトン及びリン酸を氷上で冷やした。５ｇのAvicel^*を水で湿らし、次いで1 50mlの氷冷した85％のオルト−リン酸を加え、そしてこの混合物を氷浴上に軽く 撹拌しながら１時間置いた。100mlの氷冷アセトンを撹拌しながら加え、次いで この混合物をガラスろう斗に移し、３×100mlの氷冷アセトンで、各洗浄の後吸 引乾燥しながら洗浄した。 フィルターケーキを２×500mlの水で、各洗浄の後可能な限り吸引乾燥しなが ら洗浄した。 フィルターケーキを300mlの全容量に再懸濁し、そして均質となるまでブレン ドした（Ultra Turraxホモジナイザーを使用して）。 得られる生成物を冷蔵庫の中で保存した。 基質／バッファー溶液を40℃で５分予備加熱した。次いで酵素溶液を加え、そ してこの溶液を５秒間回転混合し、次いで40℃で20分インキュベートした。反応 を500μｌの２％のNaOHの添加により停止させ、次いで５秒間回転撹拌した。サ ンプルを5000rpmで20分遠心した。その試験管から1000μｌの上清液を別の試験 管に移し、そして500μｌのPHBAH試薬を加え、次いで10分煮沸した。この試験管 を氷冷水の中で冷やした。 サンプルの吸収を光度計で410nmにて測定した。標準グルコース曲線 ： 300mg／ｌを含むストック溶液を５，10，15及び25mg／ｌに希釈した。1000μ ｌの希釈標準品を500μｌのPHBAH試薬と混合し、そしてその他のサンプルと同様 に処理した（前記参照）。定義 ： １ Savi Ｕ（単位）は１分当り１μmoleのグルコース当量を形成できる酵素の 量と定義する。活性の決定 ：還元グルコース当量の遊離は標準曲線を利用して計算した。 その結果を以下の表に示す。 以下の表に示す株を振盪フラスコの中で以下より成る基質中で増殖させた： Rofec（Roquette 由来） 10ｇ／ｌ NH₄NO₃ 10ｇ／ｌ KH₂PO₄ 10ｇ／ｌ Solcafloc 40ｇ／ｌ MgSO₄，７H₂O 0.75ｇ／ｌ Pluronic 100％ 0．1ml 水 1000ml 活性はＳ−CEVU／mlで測定した。 実施例３ アルカリセルラーゼ粉末の調製 本発明に係るセルラーゼ粉末調製品は以下のアクレモニウム株のそれぞれの培 養により調製した：Ａ．ブラシペニウムCBS 866.73，Ａ．ジクロモスポルムCBS 687.73／ATCC 32181，Ａ．オナクラバトゥムCBS 311.74，Ａ．ピンカートニアCB S 157.70，Ａ．ロゼオグリセウムCBS 134.56，Ａ．インコロラトゥムCBS 146.62 ／ATCC 14613及びＡ．フラトゥムCBS 299.70H。 各セルラーゼ調製品を以下の通りにして調製した： YPGアガースラントを種子培養培地として用いた。アガープレート上で増殖し た胞子のアガー片を100mlの培養培地を含む２枚のバッフラーの付いた500mlの容 量のエーレンマイヤーフラスコに接種した。27℃で48時間培養した。 この種子培養物３mlを４％の小麦のもみがら及び0.1％のTween 80より成るpH6 .7のメイン培養培地に、ここでも500mlのエーレンマイヤーフラスコ中の全部で1 00mlの流体において接種した。振盪フラスコ上で27℃で５日間培養した。25振盪 フラスコを使用し、そして培養液濾過物をセルロース材料の吸着を回避するため に焼結ガラスフィルターを介して集めた。 その濾液を10KDのカットオフ値をもつ膜の付いたAmicon限外濾過ユニットでも との容量の１／５にまで濃縮し、そして凍結乾燥した。 活性はＳ−CEVU／mgで測定した。 実施例４ 洗浄組成物中のアクレモニウム株由来のセルラーゼの性能 材料及び方法 装置 ：Terg−ｏ−tometer 液体容量 ：100ml 撹拌 ：鉛直スターラーで150回転／min すすぎ時間 ：水道水で10min 洗浄温度 ：40℃ 洗浄液 ：6.5ｇ／ｌのヨーロッパタイプ粉末洗剤（Ariel Co lor；洗剤粉末中に既に入っている商業酵素は電子 レンジで85℃に加熱し、その温度に10min維持する ことで失活させた） pH ：10.0 水硬度 ：２mMのCaCl₂ 洗浄時間 ：30min 繰り返し回数 ：６回 織物 ：古びた黒色の綿100％の５×６cmの２枚の見本 乾燥 ：タンブル乾燥 評価： 表面フィブリル及び糸から突き出ているファイバーがセルラーゼにより除去さ れたとき、黒色布帛の表面は一層濃く見え、そして毛羽立ちがなかった。試験パ ネルは見本を互いと等級分けした。これらに「最悪」の１から始まり「最高」の 見本の18に至る数字を付けた。12を超える値の見本は非常に改善された表面外観 を有した。６を超える値をもつ見本は明らかに目に見えて改善された表面外観を 有していた。 結果： 試験した各株について、３通りのセルラーゼ投与量を試験し、そしてめかくし サンプルで比較した： このデーターは、特にアクレモニウム種CBS 478.94が、しかしア クレモニウム種CBS 265.95も、商業洗剤マトリックスにおいて非常に良好な色調 の明瞭化を供することを示す。 実施例５ セルロースファイバー含有織物の表面フィブリル及び糸から突き出たファイバー の除去として決定したアクレモニウム株由来のセルラーゼの性能 材料及び方法 装置 ：Terg−ｏ−tometer 液体容量 ：100ml 撹拌 ：鉛直スターラーで150回転／min すすぎ時間 ：水道水で５min 洗浄温度 ：40℃ 洗浄液 ：0.05Ｍのリン酸バッファー pH ：7.0 洗浄時間 ：30min 繰り返し回数 ：２回 織物 ：古びた黒色の綿100％の５×６cmの２枚の見本 乾燥 ：タンブル乾燥 評価： 表面フィブリル及び糸から突き出ているファイバーがセルラーゼにより除去さ れたとき、黒色布帛の表面は一層濃く見え、そして毛羽立ちがなかった。試験パ ネルは見本を互いと等級分けした。これらに「最悪」の１から始まり「最高」の 見本の18に至る数字を付けた。12を超える値の見本は非常に改善された表面外観 を有した。 試験した各株について、２通りのセルラーゼ投与量を試験し、そしてめかくし サンプルで比較した： このデーターは、特にアクレモニウム・フラトゥムCBS 299.70H由来のセルラ ーゼ、しかしアクレモニウム・インコロラトゥムCBS 146.62（ATCC 14613）由来 のセルラーゼも試験条件下で非常に良好な色調の明瞭化を供することを示す。 更なる試験において、アクレモニウム・オブクラバトゥムCBS 311.74、アクレ モニウム・ブラシペニウムCBS 866.73及びアクレモニウム・ピンカートニアCBS 157.70由来のセルラーゼも試験条件下で色調の明瞭化を供した。 実施例６ アクレモニウム種CBS 265.95由来の第５族セルラーゼのクローニング及び発現 50のプール中の約10⁶個のクローンより成るアクレモニウム種CBS 265.95由来 のライブラリーを記載の通りにしてＥ．コリの中で構築した。 DNAをこのライブラリー由来の100個のクローンから単離し、そしてcDNA挿入の ための分析にかけた。挿入頻度は＞99％と見い出された。一部のプール由来のサ ンプルを酵母の中に形質転換し、そして250〜500の酵母コロニーを含む50〜10枚 のプレートを各プールから得た。 エンドグルカナーゼ陽性コロニーを同定し、そしてAZTL HEセルロースを有す るアガープレート上で単離した。cDNAインサートを酵母コロニーから直接増幅し 、そして上記の材料及び方法の章に記載の通りにして特性決定した。エンドグル カナーゼをコードするcDNA のＮ末端及びＣ末端のそれぞれをSEQ ID No.１及び２に示す。 このcDNAはDSM 10076中のプラスミドから得られる。 単離した酵母クローンをAZCLβ−グルカン、AZCLキシログルカン又はAZCL HE セルロースを含むアガープレート上で同時に試験し、そしてAZCL HEセルロース 及びAZCLβ−グルカンで陽性であることが見い出された。 全DNAを酵母コロニーから単離し、そしてプラスミドDNAを上記の通りにしてＥ ．コリの形質転換により拾い出した。アスペルギルスの中でこのエンドグルカナ ーゼを発現させるため、DNAをHindIII／XbaＩで消化し、ゲルでサイズ分別し、 そしてエンドグルカナーゼ遺伝子に対応するフラグメントを精製した。この遺伝 子を次にHindIII／XbaＩ消化したpHD414にライゲーションさせ、プラスミドpA2C 346を得た。 Ｅ．コリの中でのDNAの増幅後、プラスミドpA2C346を上記の通りにしてアスペ ルギルス・オリザに形質転換した。 Ａ．オリザ形質転換体の試験 各形質転換体を上記の通りにしてエンドグルカナーゼ活性について試験した。 形質転換体の一部はアスペルギルス−オリザのバックグランドより有意に高いエ ンドグルカナーゼ活性を有していた。このことは、アスペルギルス・オリザの中 でのエンドグルカナーゼの効率的な発現を実証する。 エンドグルカナーゼは第５族セルラーゼに属し（Henrissat，B．ら、Biochem ．J．Vol．293，p．781-788，(1993)の開示内容に基づく族の決定）、そしてＮ 末端に菌類型CBD(セルロース結合性ドメイン)を有することが決定された。菌類 型CBDはGilkes，Henrissat，Kilburn，Miller及びWarrenのMicrobiological Rev iews，Vol．55，p．303-315（1991）に記載されている。 実施例７ アクレモニウム種CBS 265.95由来の第７族セルラーゼのクローニング及び発現 50のプール中の約10⁶個のクローンより成るアクレモニウム種CBS 265.95由来 のライブラリーを上記の通りにしてＥ．コリの中で構築した。 クローニング及び発現を実施例６に記載の通りに実施し、pA2C347を得た。 単離した酵母クローンをAZCLβ−グルカン、AZCL−キシログルカン又はAZCL H Eセルロースを含むアガープレート上で同時に試験し、そしてAZCL HEセルロース 、AZCLキシログルカン及びAZCLβ−グルカンの全ての基質に対して陽性であるこ とが見い出された。 エンドグルカナーゼをコードするDNA配列をSEQ ID No.３に示す。 このcDNAはDSM 9969中のプラスミドから得られうる。 このエンドグルカナーゼは第７族セルラーゼに属することが決定された（Henr issat，B．ら、Biochem．J．Vol．293，p．781-788（1993）の開示に基づく族の 決定）。 アスペルギルス・オリザで発現されるエンドグルカナーゼの分子量（MW）はSD S−PAGEで58KDと決定された。 実施例８ アクレモニウム種CBS 478.94由来の第７族セルラーゼのクローニング及び発現 50のプール中の約10⁶個のクローンより成るアクレモニウム種CBS 478.94由来 のライブラリーを上記の通りにしてＥ．コリの中で構築した。 クローニング及び発現を実施例６に記載の通りに実施し、pA2C34 9を得た。 単離した酵母クローンをAZCLβ−グルカン、AZCL−キシログルカン又はAZCL H Eセルロースを含むアガープレート上で同時に試験し、そしてAZCL HEセルロース 、AZCLキシログルカン及びAZCLβ−グルカンの全ての基質に対して陽性であるこ とが見い出された。 エンドグルカナーゼをコードするDNA配列をSEQ ID No.４に示す。この配列は フサリウム・オキシスポルムEGIをコードするDNAと945塩基に関して約66％の同 一性を示した（Sheppardら、1994，Family C endoglucanase参照）。 このcDNAはDSM 9977中のプラスミドから得られうる。 このエンドグルカナーゼは第７族セルラーゼに属することが決定された（Henr issat，B．ら、Biochem．J．Vol．293，p．781-788（1993）の開示に基づく族の 決定）。 アスペルギルス・オリザで発現されるエンドグルカナーゼの分子量（MW）はSD S−PAGEで60KDと決定された。 実施例９ アクレモニウム種CBS 478.94由来の新セルラーゼのクローニング及び発現 50のプール中の約10⁶個のクローンより成るアクレモニウム種CBS 478.94由来 のライブラリーを上記の通りにしてＥ．コリの中で構築した。 クローニング及び発現を実施例６に記載の通りに実施し、pA2C359を得た。 単離した酵母クローンをAZCLβ−グルカン、AZCL−キシログルカン又はAZCL H Eセルロースを含むアガープレート上で同時に試験し、そしてAZCL HEセルロース 及びAZCLキシログルカンの２種類の基質に対してのみ陽性であることが見い出さ れた。 エンドグルカナーゼをコードするDNA配列をSEQ ID No.５に示す。 このcDNAはDSM 10077中のプラスミドから得られうる。 そのＮ末端は、Gilkes，Henrissat，Kilburn，Miller及びWarrenのMicrobiolo gical Reviews，Vol．55，p．303-315（1991）に記載の菌類型CBDとの相同性を 示した。 実施例10 アクレモニウム種CBS 478.94由来の第５族セルラーゼのクローニング及び発現 50のプール中の約10⁶個のクローンより成るアクレモニウム種CBS 478.94由来 のライブラリーを上記の通りにしてＥ．コリの中で構築した。 クローニング及び発現を実施例６に記載の通りに実施し、pA2C363を得た。 単離した酵母クローンをAZCLβ−グルカン、AZCL−キシログルカン又はAZCL H Eセルロースを含むアガープレート上で同時に試験し、そしてAZCL HEセルロース 及びAZCLβ−グルカンの２種類の基質に対してのみ陽性であることが見い出され た。 エンドグルカナーゼをコードするDNA配列をSEQ ID No.６に示す。 このcDNAはDSM 10079中のプラスミドから得られうる。 このエンドグルカナーゼは第５族セルラーゼに属し（Henrissat，B．ら、Bioc hem．J．Vol．293，p．781-788（1993）の開示に基づく族の決定）、そしてＮ末 端に菌類型CBD(セルロース結合性ドメイン)を有することが決定された。菌類型C BDはGilkes，Henrissat，Kilburn，Miller及びWarrenのMicrobiological Review s，Vol．55，p．303-315（1991）に記載されている。 アスペルギルス・オリザで発現されるエンドグルカナーゼの分子量（MW）はSD S−PAGEで60KDと決定された。 基質としてCMCを用いたとき、pH 6.5〜10のpH域において50％以上の比活性が 得られた。 実施例11 アクレモニウム種CBS 478.94由来のセルラーゼのクローニング及び発現 50のプール中の約10⁶個のクローンより成るアクレモニウム種CBS 478.94由来 のライブラリーを上記の通りにしてＥ．コリの中で構築した。 クローニング及び発現を実施例６に記載の通りに実施し、pA2C369を得た。 単離した酵母クローンをAZCLβ−グルカン、AZCL−キシログルカン又はAZCL H Eセルロースを含むアガープレート上で同時に試験し、そしてAZCL HEセルロース 及びAZCLキシログルカンの２種類の基質に対してのみ陽性であることが見い出さ れた。 エンドグルカナーゼをコードする部分Ｎ末端DNA配列をSEQ ID No.７に示す。 このcDNAはDSM 10084中のプラスミドから得られうる。 実施例12 セルロースファイバー含有織物の表面フィブリル及び糸から突き出ているファイ バーの除去として決定したアクレモニウム種からクローニングしたセルラーゼの 性能 酵素 ：実施例10記載のエンドグルカナーゼ 装置 ：Terg−ｏ−tometer 液体容量 ：100ml 撹拌 ：鉛直スターラーで150回転／min すすぎ時間 ：水道水で５min 洗浄温度 ：40℃ 水硬質 ：Ｉ）０°dH II）１mMのCaCl₂＝app．６°Ｈ 洗浄液 ：Ｉ）0.05Ｍのリン酸バッファー、pH7.0 II）6.5ｇ／ｌのAriel Color，pH10.0：洗剤中に 既に存在している商業酵素は電子レンジの中で 85℃に加熱し、そしてその温度に10分保つこと により失活させた。 洗浄時間 ：Ｉ）30min II）20min 繰り返し回数 ：Ｉ）２回 II）３回 評価用の織物 ：古びた黒色の綿100％の５×６cmの２枚の見本 乾燥 ：タンブル乾燥 評価： 表面フィブリル及び糸から突き出ているファイバーがセルラーゼにより除去さ れたとき、黒色布帛の表面は一層濃く見え、そして毛羽立ちがなかった。試験パ ネルは見本を互いと等級分けする。これらに「最悪」の１から始まり「最高」の 見本の18に至る数字を付けた。11を超える値の見本は非常に改善された表面外観 を有した。６を超える値をもつ見本は明らかに目に見えて改善された表面外観を 有していた。 ２通りに投与量を試験し、そしてめかくしサンプルと比較した。古びていない 黒色綿に対するパネル評点単位としてのデーター。バッファー及び洗剤間のデー ターは直接比較できず、その理由はそれらは異なる洗浄回数及び異なる繰り返し 回数による異なる実験であ るからである。 このデーターは試験したエンドグルカナーゼ（サッカロマイセス・セレビジエ DSM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコード化）がバッファー 及び洗剤の双方において良好な色調明瞭化を供することを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｄ０６Ｍ 16/00 Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｚ Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｄ０６Ｍ 16/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:75） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アンデルセン，レネ ノンボエ デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ（番地なし) (72)発明者 ラッセン，セーレン フレンステズ デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ（番地なし) (72)発明者 カウッピネン，マルクス サカリ デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ（番地なし) (72)発明者 ニールセン，ジャック ベフ デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酵素組成物であって、アルカリ条件において実質的なセルロース分解活性 を有し、アクレモニウム属に由来する菌類に由来するか又はそれにより産生され るが、但しヒュミコラ・インソレンスDSM 1800、フサリウム・オキシスポルムDS M 2672、ミセリオフトラ・サーモフィラCBS 117.65又はセファロスポリウム種RY M−202に由来するエンドグルカナーゼ（EC３．２．１．４）に対して生起させた 抗体と免疫学的に交差反応性でないことを条件とする、酵素組成物。 ２．アクレモニウム種、セファロスポリウム種、アクレモニウム・アクレモニ ウム、アクレモニウム・ペルシシヌム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アク レモニウム・ジクロモスプルム、アクレモニウム・オブクラバトゥム、アクレモ ニウム・ピンカートニア、アクレモニウム・ロゼオグリセウム、アクレモニウム ・インコロラトゥム及びアクレモニウム・フラトゥムより成る株の群から選ばれ る菌類に由来する又はそれにより産生される、請求項１記載の酵素組成物。 ３．アクレモニウム種CBS 478.94、アクレモニウム種CBS 265.95、アクレモニ ウム・パーシシヌムCBS 169.65、アクレモニウム・アクレモニウムAHU 9519、セ ファロスポリウム種CBS 535.71、アクレモニウム・ブラシペニウムCBS 866.73、 アクレモニウム・ジクロモスポルムCBS 683.73、アクレモニウム・オブクラバト ゥムCBS 311.74、アクレモニウム・ピンカートニアCBS 157.70、アクレモニウム ・ロゼオグリセウムCBS 134.56、アクレモニウム・インコロラトゥムCBS 146.62 及びアクレモニウム・フラトゥムCBS 299.70Hより成る群から選ばれる菌類に由 来する又はそれにより産生される請求項 １又は２記載の酵素組成物。 ４．pH10においてpH8.5での活性と比較して50％以上の比活性を有し、その活 性が酸膨潤セルロース基質に対するSavi Ｕ単位で測定されたものである、請求 項１〜３のいづれか１項記載の酵素調製品。 ５．線形アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキ ル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリ ウム、アルキルスルホン酸ナトリウム及びα−スルホ−脂肪酸エステルの存在下 で安定である請求項１記載の酵素調製品。 ６．単離された酵素であって、アルカリ条件において実質的なセルロース分解 活性を有し、ここでこのセルラーゼがアクレモニウム種CBS 487.94に由来するも しくはそれにより産生されるものであるか、又は ｉ）前記セルラーゼのアミノ酸配列と60％以上相同性であるアミノ酸配列を含 んで成る； ii）前記セルラーゼに対して生起された抗体と反応する；及び／もしくは iii）前記セルラーゼをコードするDNA配列と同一のプローブとハイブリダイズ するDNA配列によりコードされる； 前記セルラーゼの機能性類似体である、酵素。 ７．単離された酵素であって、アルカリ条件において実質的なセルロース分解 活性を有し、ここでこのセルラーゼがアクレモニウム種CBS 265.95に由来するも しくはそれにより産生されるものであるか、又は ｉ）前記セルラーゼのアミノ酸配列と60％以上相同性であるアミノ酸配列を含 んで成る； ii）前記セルラーゼに対して生起された抗体と反応する；及び／もしくは iii）前記セルラーゼをコードするDNA配列と同一のプローブとハイブリダイズ するDNA配列によりコードされる； 前記セルラーゼの機能性類似体である、酵素。 ８．単離された酵素であって、アルカリ条件において実質的なセルロース分解 活性を有し、ここでこのセルラーゼがアクレモニウム・パーシシヌムCBS 169.65 、アクレモニウム・アクレモニウムAHU 9519、セファロスポリウム種CBS 535.71 、アクレモニウム・ブラシペニウムCBS 866.73、アクレモニウム・ジクロモスポ ルムCBS 683.73、アクレモニウム・オブクラバトゥムCBS 311.74、アクレモニウ ム・ピンカートニアCBS 157.70、アクレモニウム・ロゼオグリセウムCBS 134.56 、アクレモニウム・インコロラトゥムCBS 146.62もしくはアクレモニウム・フラ トゥムCBS 299.70Hに由来するもしくはそれにより産生されるものであるか、又 は ｉ）前記セルラーゼのアミノ酸配列と60％以上相同性であるアミノ酸配列を含 んで成る； ii）前記セルラーゼに対して生起された抗体と反応する；及び／もしくは iii）前記セルラーゼをコードするDNA配列と同一のプローブとハイブリダイズ するDNA配列によりコードされる； 前記セルラーゼの機能性類似体である、酵素。 ９．pH10においてpH8.5での活性と比較して50％以上の比活性を有し、その活 性が酸膨潤セルロース基質に対するSavi Ｕ単位で測定されたものである、請求 項６〜８のいづれか１項記載の単離された酵素。 10．線形アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエ チレンアルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、α−オレフィンスル ホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウム及びα−スルホ−脂肪酸エス テルの存在下で安定である請求項９記載の単離された酵素。 11．アルカリ条件下において実質的なセルロース分解活性を有する酵素組成物 の製造方法であって、アクレモニウム種CBS 478.94、アクレモニウム種CBS 265. 95、アクレモニウム・パーシシヌムCBS 169.65、アクレモニウム・アクレモニウ ムAHU 9519、セファロスポリウム種CBS 535.71、アクレモニウム・ブラシペニウ ムCBS 866.73、アクレモニウム・ジクロモスポルムCBS 683.73、アクレモニウム ・オブクラバトゥムCBS 311.74、アクレモニウム・ピンカートニアCBS 157.70、 アクレモニウム・ロゼオグリセウムCBS 134.56、アクレモニウム・インコロラト ゥムCBS 146.62及びアクレモニウム・フラトゥムCBS 299.70Hより成る群から選 ばれる株を適当な栄養培地の中で培養することを含んで成る方法。 12．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA 構築体であって、前記DNA配列が： ａ）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列並 びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから獲 得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列並 びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから獲 得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列 並びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから 獲得できるDNA配列と相同体である、又は ii）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列 並びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから 獲得できるDNA配列と同一のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする 、又は iii）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配 列並びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドか ら獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列によりコードされるポリペプチドと相 同性であるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.１に示すＮ末端DNA配列及びSEQ ID No.２に示すＣ末端DNA配列 並びに／もしくはサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076中のプラスミドから 獲得できるDNA配列によりコードされる精製されたエンドグルカナーゼに対して 生起した抗体と免疫反応性であるポリペプチドをコードする、 類似体、 を含んで成るDNA構築体。 13．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA 構築体であって、前記DNA配列が： ａ）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列と相同性である、又は ii）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列と同一のプローブとハイブリ ダイズする、又は iii）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列によりコ ードされるポリペプチドと相同性であるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.３に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9969中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードされる精製され たエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫反応性であるポリペプチド をコードする、 類似体、 を含んで成るDNA構築体。 14．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA 構築体であって、前記DNA配列が： ａ）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列と相同性である、又は ii）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列と同一のプローブとハイブリ ダイズする、又は iii）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列によりコ ードされるポリペプチドと相同性であるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.４に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 9977中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードされる精製され たエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫反応性であるポリペプチド をコードする、 類似体、 を含んで成るDNA構築体。 15．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA 構築体であって、前記DNA配列が： ａ）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列と相同性である、又は ii）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列と同一のプローブとハイブリ ダイズする、又は iii）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列により コードされるポリペプチドと相同性で あるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.５に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10077中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードされる精製され たエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫反応性であるポリペプチド をコードする、 類似体、 を含んで成るDNA構築体。 16．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA 構築体であって、前記DNA配列が： ａ）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列と相同性である、又は ii）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列と同一のプローブとハイブリ ダイズする、又は iii）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列により コードされるポリペプチドと相同性であるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.６に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10079中のプラスミドから獲得できるDNA配列 によりコードされる精製されたエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免 疫反応性であるポリペプチドをコードする、 類似体、 を含んで成るDNA構築体。 17．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA 構築体であって、前記DNA配列が： ａ）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列、又は ｂ）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジエD SM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列の類似体であって、 ｉ）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列と相同性である、又は ii）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列と同一のプローブとハイブリ ダイズする、又は iii）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列を含んで成るDNA配列により コードされるポリペプチドと相同性であるポリペプチドをコードする、又は iv）SEQ ID No.７に示すDNA配列及び／もしくはサッカロマイセス・セレビジ エDSM 10084中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードされる精製され たエンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫反応性であるポリペプチド をコードする、 類似体、 を含んで成るDNA構築体。 18．請求項１〜５のいづれか１項記載の酵素組成物又は請求項６〜10のいづれ か１項記載の単離された酵素又は請求項12〜17のいづれか１項記載のDNA構築体 によりコードされた酵素と、界面活性剤、封鎖剤、無機塩、追加酵素、酵素の活 性剤又は加速剤、塩素捕促剤又は還元剤、漂白剤、漂白活性化剤、可溶化剤、香 料、酸化防止剤、顔料及び水より成る群から選ばれる少なくとも一種の成分とを 含んで成る洗浄組成物。 19．染色布帛の着色密度において局在的なバリエーションを供する方法であっ て、前記布帛を請求項１〜５のいづれか１項記載の酵素組成物又は請求項６〜10 のいづれか１項記載の単離された酵素又は請求項12〜17のいづれか１項記載のDN A構築体によりコードされた酵素で処理する方法。 20．紙パルプの水性懸濁物の排水性を改善するための方法であって、前記紙パ ルプを請求項１〜５のいづれか１項記載の酵素組成物又は請求項６〜10のいづれ か１項記載の単離された酵素又は請求項12〜17のいづれか１項記載のDNA構築体 によりコードされた酵素で処理する方法。 21．リサイクル紙の脱インクのための方法であって、前記紙を請求項１〜５の いづれか１項記載の酵素組成物又は請求項６〜10のいづれか１項記載の単離され た酵素又は請求項12〜17のいづれか１項記載のDNA構築体によりコードされた酵 素で処理する方法。 22．前記DNA配列がアクレモニウムの株、特にアクレモニウム種CBS 478.94の 株のDNAライブラリーから単離又はそれに基づいて製造されたものである、請求 項14〜17のいづれか１項記載のDNA構築体。 23．前記DNA配列がアクレモニウム種の株、特にアクレモニウム 種CBS 265.95の株のDNAライブラリーから単離又はそれに基づいて製造されたも のである、請求項12又は13記載のDNA構築体。 24．請求項13〜17のいづれか１項記載のDNA構築体を含んで成る組換発現ベク ター。 25．請求項13〜17のいづれか１項記載のDNA構築体又は請求項24記載の組換発 現ベクターを含んで成る細胞。 26．真核細胞、特に菌類細胞、例えば酵母細胞又は糸状菌細胞である、請求項 25記載の細胞。 27．前記細胞がアスペルギルス又はトリコデルマの株、特にアスペルギルス・ ニガー又はアスペルギルス・オリザの株に属する、請求項26記載の細胞。 28．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素を製造する方法であって、請求項25〜 28のいづれか１項記載の細胞を前記酵素の産生が可能となる条件下で培養し、そ してその酵素をこの培養物から回収することを含んで成る方法。 29．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素であって： ａ）請求項12又は13記載のDNA構築体によりコードされる、 ｂ）請求項28記載の方法により製造される、及び／又は ｃ）SEQ ID No.１及び２のそれぞれに示すＮ末端及びＣ末端DNA配列、又はSEQ ID No.３に示すDNA配列、及び／又はサッカロマイセス・セレビジエDSM 10076 もしくはDSM 9969のそれぞれの中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコ ードされる精製エンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫学的に反応性 であり、且つアクレモニウム種CBS 265.95に由来する、 酵素。 30．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素であって： ａ）請求項14〜17のいづれか１項記載のDNA構築体によりコード される、 ｂ）請求項28記載の方法により製造される、及び／又は ｃ）SEQ ID No.４，５，６もしくは７のそれぞれに示すDNA配列（Ｎ末端）及 び／又はサッカロマイセス・セレビジエDSM 9977，DSM 10077，DSM 10079もしく はDSM 10084のそれぞれの中のプラスミドから獲得できるDNA配列によりコードさ れる精製エンドグルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫学的に反応性であり 、且つアクレモニウム種CBS 478.94に由来する、 酵素。 31．請求項29又は30記載のエンドグルカナーゼ活性を示す酵素に富む酵素調製 品。 32．ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、ペクチンアセチルエス テラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ 、ペクテートリアーゼ、エンドグルカナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、プ ロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、キュチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカ ーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びトランスグルタミナーゼより成る群から選ばれ る１又は複数の酵素を追加的に含んで成る、請求項31記載の調製品。