JPH10510167A - ポリケチドの無細胞合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 モジュラーポリケチドシンターゼを用いるポリケチドの生成を達成する無細胞系が記載される。新規なおよび／または公知のポリケチドのライブラリーはまた、芳香族PKS、モジュラーPKSもしくはそれらの両方を用いる無細胞系で生成され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリケチドの無細胞合成 政府の契約に関して 本発明は、国立衛生研究所からの研究費援助(GM22172およびCA66736-01)の形 で、米国政府の援助を受けてなされた。技術分野 本発明は、一般に、ポリケチド(polyketide)およびポリケチドシンターゼに関 する。さらに特定すると、本発明は、無細胞系(cell-free system)を用いる、ポ リケチドおよびポリケチドのライブラリーを生成する新規な方法に関する。発明の背景 ポリケチドは、天然生成物の大きな、構造的に多様なファミリーである。ポリ ケチドは、抗生物質的特性および薬理学的特性を含む広範な生物学的活性を有す る。例えば、ポリケチドは、テトラサイクリンおよびエリスロマイシンのような 抗生物質、ダウノマイシン(daunomycin)を含む抗ガン剤、免疫抑制剤（例えば、 FK506およびラパマイシン(rapamycin)）、ならびに獣医学用の生成物（例えば、 モネンシン(monensin)およびアベルメクチン(avermectin)）により代表される。 ポリケチドは、生物体の殆どの種類に存在し、そして菌糸型細菌の１クラスで ある放線菌に特に豊富である。この放線菌は、種々のポリケチドを産生する。ポ リケチドシンターゼ(PKS)は、脂肪酸シンターゼ(FAS)に関連する多機能の酵素で ある。PKSは、アシルチオエステル（通常、アセチル、プロピオニル、マロニル またはメチルマロニル）の間の（脱カルボキシ化）クライゼン（Claisen）縮合 の繰り返しを介して、ポリケチドの生合成を触媒する。各縮合に続いて、これら は、成長するポリケチド鎖のβ-ケト基におけるケト還元、脱水、およびエノイ ル還元を含む還元サイクルの全て、または一部を触媒するか、あるいは全く触媒 しないことにより、生成物に構造的可変性を導入する。PKSは、縮合サイクルの 変更に加えて、全鎖長、プライマーおよび延長ユニットの選択、ならびに特に芳 香族ポリケチドの場合は、発生期ポリケチド鎖の位置特異的環化を制御すること により、その生成物内に、多大な構造的多様性を導入する。炭素鎖が各特定の産 生物の特徴的な長さまで成長した後、これは、チオリシス（thiolysis）または アシル転移により、シンターゼから放出される。それゆえ、PKSは、所定のポリ ケチドを産生するために共に働く酵素のファミリーから構成される。天然に生じ るポリケチドに見られる変化に寄与するのは、各PKSに遺伝的にプログラム化さ れた、鎖長、鎖構成ユニットの選択、および還元サイクルの制御された変化であ る。 ２つのPKSの一般的クラスが存在する。これらの分類は周知である。例えば、H opwood，D.A.およびKhosla，C.，Secondary Metabolites: Their Function and Evolution （1992）Wiley Chichester（Ciba Foundation Symposium 171）pp．88 -112を参照されたい。 １つのクラスは、タイプＩまたはモジュラー(modular)PKSとして知られ、エリ スロマイシンおよびアベルメクチンのような複合ポリケチドの生合成を触媒する PKSにより代表される。これらの「モジュラー」PKSは、いくかの多機能の大型タ ンパク質のアセンブリを含み、これらの大型タンパク質の間には、炭素鎖のアセ ンブリおよび修飾の各工程のための別々の活性部位のセットを有する(Cortes,J. ら、Nature（1990）348:176；Donadio，S.ら、Science（1991）252:675;MacNeil ，D．J.ら、Gene（1992）115:119)。縮合および還元の１サイクルに必要な活性 部位は、「モジュール」としてクラスター形成される（Donadioら、Science(199 1),上記: Donadio，S.ら、Gene（1992）111:51）。例えば、6-デオキシエリスロ ノライドＢシンターゼ(DEBS)は、３つの多機能性のタンパク質、DEBS 1、DEBS 2 、およびDEBS 3から構成され（Caffrey，P.ら、FEBS Letters（192）304:225） 、これらのそれぞれが２つのモジュールを有する。（図１参照）。 以下に記載するように、モジュールは、少なくとも、成長するポリケチド鎖上 への延長ユニットの縮合に必要な、最小の活性を含む。必要な最小の活性は、ケ トシンターゼ(KS)、アシルトランスフェラーゼ(AT)、およびアシルキャリアタン パク質(ACP)である。還元サイクルまたは環化のような、更なる改変反応のため の付加的な活性もまた、モジュールに包含され得る。構造的多様性は、これらの PKS中の活性部位の数およびタイプの変化からこのクラスのPKSに生じる。このク ラスのPKSは、PKSの１次配列中の活性部位の数およびクラスタリングとポリケチ ド骨格の構造との間において、一対一の相互関係を示す。 第２のクラスのPKS、芳香族またはタイプII PKSは、単一のセットの反復して 使用される活性部位を有する(Bibb，M．J.ら、EMBO J.（1989）8:2727；Sherman , D．H.ら、EMBOＪ.（1989）8:2717；Fernandez-Moreno，M．A.ら、J．Biol．Ch em.（1992）267:19278)。Streptomycesは、芳香族ポリケチドの大量生産者であ る放線菌である。現在までに研究された各Streptomyces芳香族PKSでは、炭素鎖 アセンブリは、３つのオープンリーディングフレーム(ORF)の産生物を必要とす る。（図２参照）。ORF1は、ケトシンターゼ(KS)およびアシルトランスフェラー ゼ(AT)の活性部位(KS/AT)をコードする；ORF2は、鎖長決定因子(CLF)、ORF1の産 生物と類似したタンパク質をコードするが、KSおよびATモチーフを欠く；そして ORF3は、別のアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする。いくかの遺伝子ク ラスターはまた、発生期のポリケチド骨格の環化に関与するケトレダクターゼ(K R)およびシクラーゼ(cyclase)をコードする。しかし、同定可能なポリケチドを 産生するためには、KS/AT、CLF、およびACPのみが存在する必要があることが見 出された。 6-メチルサリチル酸PKSのような真菌類のPKSは、6-メチルサリチル酸の生合成 に必要な活性部位をすべて含む単一の多領域ポリペプチドから構成される（Beck , J.ら、Eur．J．Biochem.（1990）192:487-498; Davis，R.ら、Abstr．of the Genetics of Industrial Microorganism Meeting，Montreal，abstr．P288(1994 )）。真菌類のPKSは、モジュラーおよび芳香族PKSの両方の特徴を取り込む。 Streptomyces coelicolorは、ブルーに着色したポリケチドであるアクチノロ ジン(actinorhodin)を産生する。アクチノロジン遺伝子クラスター(act)は、ク ローン化され(Malpartida，F.およびHopwood，D．A．Nature（1984）309:462；M alpartida，F.およびHopwood，D．A．Mol．Gen．Genet.（1986）205:66)、そし て完全に配列決定された(Fernandez-Morenoら、J．Biol．Chem．(1992),上記；H allam，S.E.ら、Gene（1988）74:305；Fernandez-Moreno，M．A.ら、Cell（1991 ）66:769；Caballero，J.ら、Mol．Gen．Genet.（1991）230:401)。このクラス ターは、上記のPKS酵素、シクラーゼおよびアクチノロジンを導く連続する修飾 反応に関わる一連の調整酵素、ならびにこの抗生物質の搬出に関わるタンパク質 およびこの遺伝子クラスターの転写を特異的に活性化させる少なくとも１つのタ ンパク質をコードする。抗生物質の生合成の全体的な制御、ならびにポリケチド 生合成の出発ユニット(アセチルCoA)および延長ユニット(マロニルCoA)の供給の ために必要とされる他の遺伝子は、ゲノム中の他の部位に位置する。 S．coelicolor由来のact遺伝子クラスターは、S．parvulusでアクチノロジン を産生するために使用されている。Malpartida，F.およびHopwood，D．A．Natur e（1984）309:462)。 Bartelら(J．Bacteriol．(1990)172:4816-4826)は、４つの遺伝子座actI、act III、actIVおよびactVIIからなるS．coelicolor act遺伝子クラスターで形質転 換されたS．galilaeusを用いて、アロエサポナリン(aloesaponarin)IIを組換え により産生した。基本act遺伝子を含むが、グラナチシン(granaticin)、オキシ テトラサイクリン、テトラセノマイシン(tetracenomycin)およびフレノリシン(f renolicin)のPKS由来のACP遺伝子を有するハイブリッドPKSもまた、設計され、 これらは、機能性のシンターゼを発現し得る。Khosla，Cら、J．Bacteriol．（1 993）175:2197-2204。Hopwood，D．A.ら(Nature（1985）314:642-644)は、組換 え技術を用いるハイブリッド芳香族ポリケチドの産生を記載している。Sherman ，D. H.ら(J．Bacteriol.（1992）174:6184-6190)は、トランスで、S．violaceo ruber由来の対応するグラナチシン(gra)遺伝子を用いる、act PKS遺伝子クラス ターの異なる成分を欠いている種々のS．coelicolor変異体の形質転換を報告し ている。 モジュラー（タイプＩ）PKSによる複合体ポリケチド生合成のための上記モデ ルは、放射性同位体および安定同位体標識実験、異種の発現、定方向突然変異誘 発、ならびに部分的に活性なタンパク質に関するインビトロでの研究によって実 証されているが、複合体ポリケチドの無細胞の酵素学的合成は、30年以上にわた る尽力（Caffreyら、FEBS Letters(1992)、上記；Aparicio，J.F.ら、J．Biol. Chem.（1994）269:8524;Bevitt，D.J.ら、Eur．J.Biochem.（1992）204:39；Caf frey，P.ら、Eur．J．Biochem.（1991）195:823）；Leadlay，P.F.ら、Bioche m．Soc．Trans.（1993）21:218；Marsden，A.F.A.ら、Science（1994）263:378 ；Wawszkiewicz，E.J.ら、Biochemische Z.（1964）340:213;Corcoran，J.W.ら 、Proc．5th Int．Congr．Chemother．(Vienna，1967)，Abstracts of Communic ations，p．35；Corcoran，J.W.ら、Antibiotics IV.Biosynthesis（1982）Corc oran，J.W.編（Springer-Verlag，New York）p．146；Roberts，G.FEBS Lett.（ 1983）159:13；Roberts，G.ら、Biochemical Soc．Trans.（1984）12:642；Huna iti，A.A.ら、Antimicrob．Agents．Chemother.（1984）25:173)）にもかかわら ず未だに成功していない。これは、これらの大型で発現しにくい多機能タンパク 質の完全活性型(fully active form)を天然に存在する生産者生物体から単離す ることの困難さに一部起因し、また、ポリケチド生合成の際に形成される中間体 (intermediates)の相対的な不安定さに一部起因する。例えば、上記３つのDEBS タンパク質は、これまでに、天然の生産者生物体であるSaccharopolyspora eryt hraeaからそれぞれ精製されている(Caffreyら、FEBS Letters(1992)、上記；Apa ricioら、J．Biol．Chem．(1994)、上記；Bevittら、Eur．J．Biochem．(1992) 、上記；Caffreyら、Eur．J．Biochem．(1991)、上記；Leadlayら、Biochem．So c．Trans.（1993）；Marsdenら、Science(1994)、上記）。上記精製された酵素 の研究は、それらの酵素の立体特異性の解明を促進し、2S-メチルマロニル-CoA が６つのアシルトランスフェラーゼ部位の全てに対する延長基質であることを示 し（Marsdenら、Science(1994)、上記）、これにより、メチル分岐センター(met hyl-branched centers)の異なる構成が、特異的な酵素結合中間体の選択的なエ ピマー化に起因することを示唆した。しかし、完全な代謝回転アッセイ(full tu rnover assay)の欠如により、これらの研究者は、酵素複合体のメカニズムをよ り詳細に精査することができなかった。 これらの制限のいくつかを克服すべく、E.coli(Aparicioら、J．Biol．Chem. (1994)、上記；Bevittら、Eur．J．Biochem．(1992)、上記；Caffreyら、Eur．J ．Biochem．(1991)、上記；Leadlayら、Biochem．Soc．Trans．(1993);)およびS ．coelicolor（Kao，C.M.ら、Science（1994）265:509；国際公開第WO 95/08548 号（1995年３月30日公開））のような異種宿主中でモジュラーPKSサブユニット が発現されている。E.coli中で発現したタンパク質は完全には活性でないが、イ ンビボでの6-デオキシエリスロノリド（「6-DEB」）の産生によって実証される ように、S．coelicolor中での異種発現によって活性タンパク質の産生が行われ た。6-メチルサリチレートシンターゼ（Dimroth，P.ら、Eur．J．Biochem.（197 0）13:98；Beck，J.ら、Eur．J.Biochem.（1990）192:487）；Spencer J.B.ら、 Biochem．J.（1992）288:839）、カルコンシンターゼ（Lanz，T.ら、J．Biol．C hem.（1991）266:9971(1991)）およびテトラセノマイシンシンターゼ（Shen，B. ら、Science（1993）262:1535）のようなより単純なPKSからのポリケチドの無 細胞の酵素学的合成が報告されている。 しかし、今日に至るまで、モジュラーPKSからのポリケチドの無細胞の酵素学 的合成を記載した者、あるいは無細胞系を用いて異なるポリケチドの多様性を含 むライブラリーを生成した者はいない。発明の要旨 本発明は、新規および公知の両方のポリケチドを生成する方法を提供する。１ つの実施態様において、モジュラーPKSを含む無細胞系は、適切な基質セットと インキューベートすると、ポリケチドの合成を達成する。 他の実施態様において、本発明は、無細胞系を用いることによって複数の異な るポリケチドを含むライブラリーを合成する方法、およびこれらのライブラリー を生成するための無細胞サブ系のマトリックスに関する。 従って、１つの局面において、本発明は、無細胞系内にモジュラーポリケチド シンターゼの少なくとも２つのモジュールを含む１つまたはそれ以上のタンパク 質を提供する工程と、少なくとも１つの開始ユニットおよび少なくとも１つの延 長ユニットを該系に添加する工程と、該開始ユニットおよび該延長ユニットを含 む該無細胞系を、該ポリケチドが合成される条件下でインキュベートする工程と 、該ポリケチドを該無細胞系から必要に応じて回収する工程とを包含する方法に 関する。 他の局面において、本発明は、それぞれが、少なくとも１つの延長ユニットの 開始ユニット（成長ポリケチド鎖を含む）へのカップリングを達成する酵素活性 を含む１つまたはそれ以上のポリケチドシンターゼタンパク質を含む一連の無細 胞サブ系を含むポリケチドライブラリーを生成するためのマトリックスであって 、該サブ系のそれぞれは、少なくとも１つの開始ユニットおよび少なくとも１つ の延長ユニットを含み、ここで、少なくとも１つの酵素活性または少なくとも１ つの延長ユニットまたは少なくとも１つの開始ユニットが該遺伝子内の各サブ系 間で異なるマトリックスに関する。 他の局面において、本発明は、これらのマトリックスを用いてポリケチドのラ イブラリーを調製する方法に関する。 さらに他の局面において、本発明は、所望のポリケチドを生成する方法であっ て、機能性モジュラーポリケチドシンターゼ（PKS）、またはその機能性部分を 提供する工程であって、ここで、該PKSは、天然の第１モジュール開始ユニット でロードされ得ず、または一旦ロードされると、該PKSは、延長ユニットの該第 １モジュール開始ユニットへの縮合を触媒し得ずポリケチド中間体を生成し得な い、工程と、該PKSの基質である開始ユニットを該系に添加する工程と、該ポリ ケチドが合成される条件下で、該PKSおよび該開始ユニット基質を含む該系をイ ンキュベートする工程と、該ポリケチドを必要に応じて回収する工程とを包含す る方法に関する。 さらに別の局面において、本発明は、天然の第１モジュール開始ユニットでロ ードされ得ず、または一旦ロードされると、延長ユニットの該第１モジュール開 始ユニットへの縮合を触媒し得ず、ポリケチド中間体を生成し得ない、機能性モ ジュラーポリケチドシンターゼ系またはその機能性部分に関する。図面の簡単な説明 図１は、6-DEB(1)の生成を触媒するモジュラーPKSクラスターの組織化(organi zation)の図である。 図２は、典型的な芳香族PKS遺伝子クラスターの図である。 図3Aは、pCK12由来のDEBS 1+2+チオエステラーゼ（DEBS 1+2+TE）あるいはpCK 7由来のDEBS 1,2,および3の複合体を含むタンパク質画分のクーマシーブルー染 色した５％アクリルアミドゲルを図示する。レーンIa、IbおよびIcは、精製工程 1の後(a)、工程2の後(b)、および工程3の後(c)のDEBS 1+2+TEを示す。レーンIIa 、 IIb、IIc．IIdおよびIIeは、工程1の後(a)、工程2の後(b)、工程3の後(c)、(d) および(e)のDEBS 1,2,および3を溶出量の昇順で示す。 図3Bは、¹⁴Ｃで標識した開始ユニット[1-¹⁴Ｃ]プロピオニル-CoA（20 μM）（ レーンIaおよびIIa）、[1-¹⁴Ｃ]ブチリル-CoA（160 μM）（レーンIbおよびＩＩ ｂ）、[1-¹⁴Ｃ]アセチル-CoA（40 μM）（レーンIcおよびIIc）、ならびにヨー ドアセトアミド（1 Mm）を用いた30分間のプレインキュベーションの後の[1-¹⁴ Ｃ]プロピオニル-CoA（20 μM）（レーンId）による、DEBS 1,2,および3（レー ンIa〜Id）またはDEBS 1+2+TE（レーンIIa〜IIc）の共有結合改変(covalent mod ification)を示すオートラジオグラムを図示する。 図４は、¹⁴Ｃで標識した6-DEB(1)およびトリケチドラクトン(2)のインビトロ 合成を示すオートラジオグラムを図示する。 図５は、DEBS 1+2+TEによる[1-¹³Ｃ]プロピオニル-CoAのトリケチドラクトン( 2a)への変換(a)およびDEBS 1+2+TEによる[2,3-¹³Ｃ₂]-(2S,3R)-2-メチル-3-ヒド ロキシペンタノイル-NACチオエステル(3)トリケチドラクトン(2b)の変換(b)を図 式化したものである。 図6Aは、別の基質(substrates)のポリケチド産物への組込みを示す薄層クロマ トグラフィー-オートラジオグラムを図示する。レーンIbは、推定上のＣ₁₀-ラク トンホモログ(5)（図5B参照）、Ｒ_f＝0.36（矢印１で示す）を含む。レーンIIb は(4)（図5B参照）、化合物(4)の標準サンプルのＲ_fと同一のＲ_f＝0.23（矢印２ で示す）を含む。 図6Bは、DEBS 1+2+TEによるアセチル-CoAの化合物(4)への変換(a)、およびDEB S 1+2+TEによるブチリル-CoAの化合物(5)への提案された変換(b)を図式化したも のである。発明の詳細な説明 本発明は、新規かつ公知のポリケチド（polyketide）の合成ならびにポリケチ ドライブラリーの合成のための無細胞（cell-free）系を提供する。モジュラー ポリケチド合成の場合、これらの酵素を用いたポリケチドの無細胞生成は、今ま で達成されていなかった。しかし、上記のように、特定の芳香族合成によるポリ ケチドの無細胞合成は達成されているが、これらの系はポリケチドのライブラリ ーを構築するのには使用されていない。このライブラリーは、薬理学的または他 の活性についてスクリーニングされるべき化合物の供給源として有用である。 このようなライブラリーの構築のための無細胞系の使用は、いくつかの利点を 有する。第１に、透過性の問題が排除され、その結果、そうでなければ細胞を透 過しないため有効でない基質を使用することができる。第２に、差動的（differ ential）な透過性により生成物の可変性が排除される。第３に、別の代謝事象（ metabolic event）が最小化されるか、または除去され、その結果反応はきれい に進行して、基質をポリケチド生成物に変換する。第４に、ポリケチドシンター ゼ遺伝子が発現されそしてポリケチドが生成される条件を調節する、より大きな 可能性がある。例えば、所定のポリケチドの合成に通常は有用であるコファクタ ー（例えば、NADPH）が、供給されてもよく、または抑制されてもよい。最後に 、基質をシンターゼに提供するための細胞メカニズムが排除されるため、所定の シンターゼについて「非天然」の基質を使用可能である。ライブラリーを作製す るために無細胞系を使用することの結果、産生（生成）が細胞内合成に限定され る場合に可能なよりも多くの種類のポリケチドが、合成され得る。 ポリケチドシンターゼタンパク質を含む特定の無細胞系が与えられると、最終 的に生成されるポリケチドの性質は、提供される基質に依存し、そしてコファク ターに関する条件などに依存する。所定のPKSタンパク質の補体により所定の無 細胞系についての可能性を探索するためには、無細胞系をこれらの因子の変化に より「サブ系」に細分することが有利である。作動可能にするために、無細胞系 またはサブ系は、「開始ユニット」上への「延長ユニット」の縮合を達成するの に十分な酵素的活性とともに、ポリケチドシンターゼタンパク質を含まなければ ならない。ここで、「開始ユニット」は、成長ポリケチド鎖を含み得る。無細胞 系は、開始および延長ユニットのより大きな乱交雑性（promiscuity）を提供す るので、様々な開始および延長ユニットを含むたくさんのサブ系ならびに様々な （differing）条件により、対応する様々なポリケチドをもたらし得る。 本出願に使用する、「開始ユニット」は、付加的なClaisen縮合が達成され得 る物質をいう。開始ユニットは、本来的（natively）に開始ユニット（starte r）とみなされるものであってもよく、またはネイティブな状態では中間体成長 ポリケチド鎖であるものであってもよい。「第１モジュール開始ユニット」は、 PKSの第１のモジュールの適切な活性部位上にロードされ得るアシルチオエステ ルである。「天然の開始ユニット」は、PKSによる延長の際に、天然のポリケチ ド生成物を生成するアシルチオエステルである。「非天然開始ユニット」は、PK Sによる延長の際に、通常は、代謝の間にPKSにより生成されるもの以外のポリケ チド生成物を生成するアシルチオエステルである。 インビトロ条件下における開始ユニットについてのモジュラーPKSの緩和され た特異性は、Pieperら、Nature（1995）378:263-266により報告されている。公 知の開始ユニットには、例えば、アセチル-CoA、プロピオニル-CoA、ブチリル-C oA、イソブチリル-CoA、シクロヘキサノイル-CoA、アミノヒドロキシベンゾイル -CoA、および中間体ポリケチド鎖が含まれる。さらに、延長ユニットは、開始ユ ニットの供給源として使用され得る（Pieperら、Biochem．（1996）35:2054〜20 60を参照のこと）。従って、ポリケチドを生成し得る系において、その系で使用 される開始ユニットおよび延長ユニットは、同じであってもよく、違ってもよい 。 次いで、開始ユニットは、無細胞系またはサブ系に含まれるシンターゼの活性 により延長される。延長ユニットは、成長ポリケチドのカルボキシ末端に付加さ れ、そして延長ユニットの性質は、アシルトランスフェラーゼ（AT）活性により 決定される。適切な延長ユニットは、マロニル-CoA、メチルマロニル-CoA、およ びエチルマロニル-CoAを含む。配列の比較により、マロニル-CoA-特異的ATおよ びメチルマロニル-CoA-特異的ATの特性が同定されている（Haydockら、FEBS Let t．（1995）374：246-248）。メチルマロニル-CoAまたはエチルマロニル-CoAが 延長ユニットとして使用される場合、キラル中心は縮合（condensation）中に生 成される。 芳香族のまたはモジュラーPKS系のいずれかにおいて発生する還元性サイクル は、適切なケトレダクターゼ（KR）活性の存在ならびにインビトロ系中での反応 条件の両方に依存する。還元性活性の非存在により、ケトンを得；還元は、キラ ル中心を含むアルコールを生成する。デヒドラターゼ（DH）活性も存在する場合 、アルケンがもたらされ、これはキラル中心を排除する。加えて、エノイル（en oy l）レダクターゼ活性が存在してもよく、これはβ-ケト基をメチレン基に還元す る。従って、延長ユニットの単一の縮合について５つの理論的に可能な還元性サ イクルが得られる。このバリエーションは、用いられるべき無細胞系におけるコ ファクター条件、およびタンパク質の性質の両方により達成される。 環化、芳香族化、鎖長限定などをもたらす、様々な他の触媒的活性は、主に、 シンターゼタンパク質の性質により決定される。 従って、ケチドの生成についての無細胞系のアベイラビリティーは、シンター ゼの性質、延長ユニットの性質、開始ユニットの性質および条件の性質を変化さ せることによりポリケチドのライブラリーを生成する独特の機会を提供する。単 純なマトリックスが想定され、それにより、様々のシンターゼ触媒的活性を有す るが、最低でも開始ユニット（さらなるClaisen縮合を介する成長ポリケチド鎖 を含む）を延長する能力を有する無細胞系が、用いられ得る。これらの無細胞系 はそれぞれ、サブ系に細分され得、ここで残りの変数が操作されて、合成の最終 的な結果を達成する。従って、同一のポリケチドシンターゼ活性を有する一連の サブ系は、ポリケチドの多様性をもたらすように、異なる開始ユニット、異なる 延長ユニットを供給され得、そして異なる条件下でインキュベートされ得る。類 似のバリエーションが、異なるPKS活性を有する無細胞系のサブ系に関して用い られ得、そしてマトリックスをもたらし、ここで１つの次元は、無細胞系そのも のの性質を変化させるとして想定され得、そして他の次元は、基質および条件の バリエーションを含む。 Ａ．定義 本発明を記載する際に、次の用語が使用され、そして以下に示すように定義さ れることが意図される。 「無細胞系」とは、細胞溶解物、細胞抽出物または他の調製物を意図し、ここ で、調製物中の実質的に全ての細胞が破壊されまたはそうでなければ処理され、 その結果すべてもしくは選択された細胞成分（例えば、オルガネラ、タンパク質 、核酸、細胞膜自身（またはそれらのフラグメントもしくは成分）など）が細胞 から放出され、または適切な培地中に再懸濁され、そして／または細胞環境（ce llular milieu）から精製される。無細胞系は、もちろん、精製もしくは単離さ れ たタンパク質および適切な試薬および緩衝液から調製された反応混合物を含む。 「無細胞サブ系」とは、無細胞系の一部のいずれか（すなわち、所定の組成物 が、独立した触媒のために２つかそれより多くの別々のコンパートメントに効果 的に細分化される際にもたらされるか、あるいはポリケチドシンターゼ酵素活性 の同じ補体を含む反応混合物である際にもたらされる無細胞系）を意味する。従 って、所定の「無細胞系」の「サブ系」は、異なる基質もしくは条件による比較 において異なり得るが、同じ触媒ポリケチドシンターゼ活性を含む。 「精製された」もしくは「単離された」とは、ポリペプチドまたはヌクレオチ ド配列についていうときは、示された分子が、自然において分子が通常集合（as sociate）している生物体の全体から分離してそして個別であることを意味する 。従って、無細胞抽出物に含まれるタンパク質は、無細胞抽出物からタンパク質 がさらに精製されるように、「精製された」もしくは「単離された」タンパク質 を構築する。加えて、「精製された」または「単離された」タンパク質とは、合 成によりもしくは組換えにより生成され、そして必要に応じて、宿主細胞から精 製された、タンパク質をいう。「単離された」ヌクレオチド配列は、自然におい て見出される配列を有する生物体の全体から分離しそして個別であるヌクレオチ ド配列；あるいは自然において通常それと会合する配列の全体もしくは一部を欠 く配列；あるいはそれが自然に存在しながらも、異種の配列（以下に定義する） がそれと会合する配列である。 モジュラーPKS遺伝子クラスターまたはモジュラーポリケチドシンターゼの単 一の「モジュール」とは、コードするために十分な遺伝子クラスターの部分また は単一の延長ユニットの開始ユニットもしくは成長ポリケチド鎖への縮合を達成 するために必要な活性を少なくとも有するために十分なポリケチドシンターゼの 部分をいう。従って、必要な最小活性は、ケトシンターゼ（KS）、アシルトラン スフェラーゼ（AT）およびアシルキャリアタンパク質（ACP）を含む。これらの ３つの活性のすべては、単一の延長ユニットの成長ポリケチド鎖上への縮合に必 要である。ポリケチドの効果的な合成のための少なくとも１つのモジュールは、 濃縮開始（initial condensation）を達成するために、さらなるATおよびACPを 含まなければならない。加えて、そして必要に応じて、モジュールはケトレダク ターゼ活性（KR）、シクラーゼ、デヒドラターゼ（DH）、エノイルレダクターゼ （ER）および／またはチオエステラーゼ（TE）を含み得る。 芳香族ポリケチド合成のネイティブな形態において、必要な活性の部分は、異 なるタンパク質に発生し得る。芳香族ポリケチドシンターゼの場合もまた、単一 の延長ユニットの開始ユニットもしくは成長ポリケチド上への縮合を達成するた めに、ケトシンターゼ（KS）、アシルトランスフェラーゼ（AT）およびアシルキ ャリアタンパク質（ACP）は、存在しなければならない。還元、環化、芳香族化 およびさらなる誘導体化に関連する様々な活性もまた存在し得る。少なくとも１ つの鎖長制限因子（CLF）もまたなければならない。 「PKS遺伝子クラスター」および「PKS遺伝子セット」という表現は、交換可能 に（interchangeably）使用されて、宿主細胞において、以下に定義される１つ またはそれ以上の適合性制御エレメントの支配下にある場合に、機能性PKSを生 成し得るPKS遺伝子のあらゆるセットを意味する。機能性PKSは、少なくとも１つ の延長ユニットの成長ポリケチド上への縮合を触媒するもの、すなわち、少なく とも１つの機能性モジュールを有するものであるか、あるいはインビボもしくは インビトロのいずれかにおける延長機能を触媒するものである。従って、「PKS 遺伝子クラスター」は、対応する天然クラスターに見出される全ての遺伝子を包 含する必要はない。 さらに、クラスターは、単一種由来のPKS遺伝子を含み得、または例えば、別 のポリケチドの合成のためのクラスター由来の対応するコーディング配列で置換 された特定のポリケチドの合成のためのクラスター由来のコーディング配列との 天然のハイブリッドであり得る。ハイブリッドクラスターは、モジュラーおよび 芳香族のPKSのいずれかもしくは両方の由来の遺伝子を含み得る。遺伝子クラス ターに含まれる遺伝子はネイティブな遺伝子である必要はないが、これらの変異 体またはアナログであり得る。変異体またはアナログは、コーディング配列の１ つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により調製され得る。 ヌクレオチド配列を改変する技術(例えば、部位特異的変異誘発)は、例えば、Sa mbrookら、前出; DNA Cloning，第IおよびII巻、前出; Nucleic Acid Hybridiza tion，前出に記載されている。 「PKS遺伝子クラスター」はまた、PKSにより生成されるコアポリケチドへの改 変をコードする遺伝子を含有し得、これらの遺伝子には、例えば、天然の生成物 経路からのポスト-ポリケチド合成酵素（例えば、０-メチルトランスフェラーゼ およびグリコシルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子が挙げられる。「PK S遺伝子クラスター」は、さらに、ヒドロキシラーゼ、メチラーゼまたは他のア ルキラーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、グリコトランスフェラーゼ、リアー ゼ、エステルシンターゼまたはアミドシンターゼ、および種々のヒドロラーゼ( 例えば、エステラーゼおよびアミダーゼ)をコードする遺伝子が挙げられ得る。 以下にさらに説明されるように、PKS遺伝子クラスターに含まれる遺伝子は、 同じプラスミドに存在する必要がないか、または同じプラスミドに存在するなら ば、同じまたは異なる制御配列により制御され得る。 「宿主細胞」は、単細胞統一体として培養される原核微生物または真核細胞株 由来の細胞および子孫ならびにそれらの培養物（culture）であり、これは、本 発明のPKS遺伝子クラスターを有する組換えベクターの受容体として使用され得 るか、または使用されてきた。単一の親細胞の子孫は、偶発的または故意の変異 のため、その形態学またはゲノムDNAもしくは全DNA相補物が、必ずしも元の親細 胞と完全に同一であり得ないことが理解される。関連の特性(例えば、所望のPKS をコードするヌクレオチド配列の存在)により特徴づけられる親細胞と十分に類 似するこの親細胞の子孫は、この定義に含まれ、そして上記用語によりカバーさ れる。 用語「異種の」は、これがコーディング配列および制御配列のような核酸配列 に関する場合には、通常なら組換え構築物の領域と会合しない配列、および／ま たは、通常なら特定の細胞と会合しない配列を示す。それゆえ、核酸構築物の「 異種の」領域は、他の分子と天然に会合している状態で見出されていない他の核 酸分子内の、あるいはこの核酸分子に結合した核酸の同定可能なセグメントであ る。例えば、構築物の異種の領域は、コーディング配列と天然に会合している状 態で見出されていない配列により隣接されるコーディング配列を包含し得る。異 種のコーディング配列の他の例は、このコーディング配列自体が自然には見出さ れない構築物（例えば、ネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有する合成配 列）である。同様に、宿主細胞に通常存在しない構築物で形質転換された宿主細 胞は、本発明の目的のための異種であると考えられる。本明細書中で使用される ように、対立遺伝子変化または天然に起こる変異事象は、異種DNAを生成しない 。 「コーディング配列」またはタンパク質もしくはペプチドを「コードする」配 列は、適切な調節配列の制御下に置かれるときに、インビトロまたはインビボで 、mRNAに転写されるか(DNAの場合)、またはポリペプチドに翻訳される(mRNAの場 合)核酸配列である。 「制御配列」とは、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化 シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどを集合的に意味 し、これらは、宿主細胞において、コーディング配列の転写および／または翻訳 を集合的に提供する。所望の遺伝子が転写かつ翻訳され得る限り、これらの制御 配列の全ては必ずしも組換えベクターに存在する必要がない。 「作動可能に連結される」とは、エレメントの配置を意味し、ここで、このよ うに記載される成分がこれらの通常の機能を果たすように配置される。それゆえ 、コーディング配列に作動可能に連結される制御配列は、このコーディング配列 の発現をもたらし得る。制御配列は、これらがその発現を指向するのに機能する 限り、コーディング配列と隣接する必要はない。それゆえ、例えば、翻訳されて いないが転写はされた介在配列がプロモーター配列とコーディング配列との間に 存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コーディング配列に「作動可能に連 結されている」と考えられ得る。 ポリケチドの「ライブラリー」または「組合わせライブラリー」は、複数の異 なるポリケチドの集合（collection）を意味することを意図する。ライブラリー のメンバーの相違は、それらが、芳香族の、モジュラーの、または真菌のPKSか らの変異体遺伝子、相同遺伝子、またはネイティブ遺伝子の任意の組み合わせを 含む、異なるPKS無細胞系により生成されたことから生じ得る。ライブラリーの メンバーの相違はまた、異なる開始ユニット、延長ユニットおよび条件の使用か ら生じ得る。ライブラリーを生成するために使用される、無細胞系におけるPKS は、単一の系（例えば、act、fren、gra、tcm、whiE、gris、eryなど）からの由 来であり得、そして必要に応じてさらなるポリケチドの改変を触媒する能力のあ る、改変酵素をコードする遺伝子を含み得る。あるいは、シンターゼ活性の組み 合わせは、合理的にまたは確立論的に、シンターゼの近縁（assortment）からの 由来であり得る。例えば、シンターゼ系は、act PKSからのKS／AT成分、gra PKS からのCLF成分、およびfren PKSからのACP成分を含むように構築され得る。シン ターゼは、必要に応じて、他の酵素的活性も同様に含み得る。 従って、ライブラリー中のポリケチドの多様性は、シンターゼの性質を変化さ せることまたはポリケチドを構築するために使用される基質の性質を変化させる こと、あるいはそれらの両方から生じ得る。好ましくは、ライブラリーは、シン ターゼ系の性質を１つの次元において変更させ、そして基質の性質および／また はインキュベート条件を他方の次元において変更させるマトリックスの培養の結 果として生成される。このように生成されるポリケチドのライブラリーは、生物 学的、薬理学的または他の活性についてテストまたはスクリーニングされ得る。 「任意の」または「任意に（必要に応じて）」とは、次に記載される事象また は情況が起こり得るかまたは起こり得ないこと、およびその記載は上記事象また は情況が起こる例および起こらない例を含むことを意味する。例えば、表現「さ らに任意に精製される」とは、さらなる精製が行われてもまたは行われなくても よく、そしてその記載はそのようなさらなる精製の実施および不実施の両方を包 含することを意味する。 Ｂ．一般的方法 本発明の方法により生成されたポリケチドは、問題のポリケチドのタイプに依 存して、多くの障害を処置するための治療薬としての使用のためにスクリーニン グされ得る。例えば、本発明の方法により生成されたポリケチドのいくつかは、 免疫抑制剤、抗腫瘍剤としての用途、ならびにウイルス、細菌、および寄生虫感 染の処置のための用途が見出され得る。 本発明の、無細胞系の使用により、広範囲の種々のポリケチドが候補として合 成され得る。上記で説明したように、無細胞技術の使用は、基質の選択における 、より大きな柔軟性、および所望のポリケチドの合成における、代謝反応の競合 からのより少ない干渉を可能にする。無細胞系でポリケチドを生成する能力はま た、 PKSおよびそれらの作用の機構の特徴付けのための強力な道具を提供する。 本発明の実施は、他に指示がない限り、化学、微生物学、分子生物学および組 換えDNA技術の当該分野の技術範囲内で慣用の方法を利用する。このような技術 は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(最新版)；DNA Cloning: A Practical Approach，第Ｉ巻お よびII巻(D．Glover編)；Oligonucleotide Synthesis(N．Gait編、最新版)；Nuc leic Acid Hybridization(B．HamesおよびS．Higgins編、最新版)；Transcripti on and Translation(B．HamesおよびS．Higgins編、最新版)；H.O．House，Mode rn Synthetic Reactions，第2版(Menlo Park，CA: The Benjamin/Cummings Publ ishing Company，1972)；およびJ．March，Advanced Organic Chemistry: React ions，Mechnisms and Structure，第４版(New York: Wiley-Interscience，1992 )を参照のこと。 前出または後出に関わらず、本明細書中で引用されている全ての出版物、特許 および特許出願は、その全体が本明細書中で参考として援用されている。 本明細書および添付の請求の範囲で用いられるように、単数形「a」、「an」 および「the」は、文脈にて他に明らかに指示がない限り、複数形を包含する。 従って、例えば、「ポリケチドシンターゼ(a polyketide synthase)」との表示 は、ポリケチドシンターゼの混合物を包含し、「PKS酵素(a PKS enzyme)」との 表示は、このような酵素の混合物を包含する、などである。 １．PKS の組換え産生 本発明は、特に機能的モジュラーPKS酵素の有為な量の産生および単離のため に、これらの酵素の産生のために組換えベクターで形質転換された宿主細胞を使 用する。芳香族およびハイブリッドのPKSもまた、このような方法で産生し得る 。宿主細胞は、それらの天然に存在するPKS遺伝子を実質的に欠失した、遺伝子 的に操作された細胞であり得る。 無細胞系で効果的な機能的PKS酵素の産生のための宿主細胞は、組換えPKS遺伝 子クラスターを宿す能力を有する任意の生物に由来し得、原核生物または真核生 物のいずれにも由来し得る。しかし、好ましい宿主細胞は、多くのポリケチドの 大量産生株である菌糸型細菌の１クラスである放線菌から構築される宿主細胞で ある。PKSの産生における使用のための特に好ましい属は、Streptomycesである 。従って、例えば、S．ambofaciens、S．avermitilis、S．azureus、S．cinnamo nensis、S．coelicolor、S．curacoi、S．erythraeus、S．fradiae、S．galilae us、S．glaucescens、S．hygroscopicus、S．lividans、S．parvulus、S．peuce tius、S．rimosus、S．roseofulvus、S．thermotolerans、S．violaceoruberは 、とりわけ、都合の良い宿主細胞を提供し、中でも、S．coelicolorが好ましい 。（例えば、Hopwood，D．A.およびSherman，D．H．Ann．Rev．Genet.（1990）2 4 :37-66；O'Hagan，D．The Polyketide Metabolites(Ellis Horwood Limited，1 991)の種々のポリケチド産生生物およびこれらの天然産物に関する記載を参照の こと）。 上記の細胞は、標準の技術（例えば、相同組換え）を用いて、この細胞から天 然に生じるPKS遺伝子を欠失させることにより、遺伝子操作され得る。（例えば 、Khosla，C.ら、Molec．Microbiol.（1992）6:3237を参照のこと）。例えば、S .coelicolorのネイティブ株は、芳香族ポリケチドアクチノロジン(actinorhodin )の生合成を触媒するPKSを産生する。S．coelicolor CH999株(WO 95/08548（前 出）に記載されている)は、内因性プラスミドを欠き、そして他の色素性S．coel icolor抗生物質であるウンデシルプロジギオシン(undecylprodigiosin)の生合成 をブロックする安定な変異を有する株であるS．coelicolor CH1の染色体から、 天然actクラスター全てを相同組換えによって欠失させることにより構築された( Khoslaら、Molec．Microbiol．(1992)、前出)。 上記の宿主細胞は、１つまたはそれ以上のベクターで形質転換され得、延長ユ ニット(extender unit)の縮合をもたらすのに十分な少なくとも１セットの機能 的なPKS活性、またはこの活性を有するPKSに関連した配列のランダムな組合せを 含むカクテルを集合的にコードする。このベクターは、PKSのサブユニットまた はカクテル成分のネイティブまたはハイブリッドの組み合わせ、あるいはそれら の変異体を包含し得る。 無細胞合成の実施のためのPKSの産生のために、組換えベクターが構築され得 、これは、単一のPKS芳香族またはモジュラー遺伝子クラスター由来の遺伝子を 含 むか、または、例えば別の遺伝子クラスターからの対応する部分により置換され た１つのクラスターからの遺伝子または遺伝子の一部を有する、ハイブリッドPK S遺伝子クラスターを含み得る。例えば、ACPは、産物の構造に影響を及ぼすこと なく、異なる芳香族シンターゼの間で容易に交換可能であることが見出されてい る。さらに、与えられたKRは、異なる鎖長のポリケチド鎖を認識し、そして還元 し得る。従って、これらのコード配列は、本明細書中で記載の構築物において自 由に交換可能である。それゆえ、PKS酵素を産生するために用いられるPKS遺伝子 クラスターは、少なくとも１つの延長ユニットを成長しているポリケチドへ縮合 するPKSを産生するために最終的には機能するPKS遺伝子配列の任意の組合せ由来 であり得る。 ハイブリッドクラスターの例には、とりわけ、２つまたはそれ以上の、act遺 伝子クラスター、whiE遺伝子クラスター、フレノリシン(fren)、グラナチシン(g ra)、テトラセノマイシン(tcm)、6-メチルサリチル酸(6-msas)、オキシテトラサ イクリン(otc)、テトラサイクリン(tet)、エリスロマイシン(ery)、グリセウシ ン(griseusin)(gris)、ナナオマイシン(nanaomycin)、メデルマイシン(medermyc in)、ダウノルビシン(daunorubicin)、チロシン(tylosin)、カルボマイシン(car bomycin)、スピラマイシン(spiramycin)、アベルメクチン(avermectin)、モネン シン(monensin)、ノナクチン(nonactin)、クラマイシン(curamycin)、リファマ イシン(rifamycin)およびカンジシジン(candicidin)シンターゼ遺伝子クラスタ ーに由来するコード配列を有するクラスターが挙げられる。多くのハイブリッド 遺伝子クラスターが、構築され、これらはact、fren、tcm、gris、およびgra遺 伝子クラスターに由来する成分を有する（WO 95/08548を参照のこと）。いくつ かのハイブリッドクラスターが、新規および公知のポリケチドの両方をS．coeli color CH999において機能的に発現し得る。しかし、他のハイブリッド遺伝子ク ラスターが、上記のように、本明細書中の開示を用いて、容易に産生され得、そ して同定可能なポリケチドの生成についてスクリーニングされ得る。 上記の遺伝子クラスター、またはPKS遺伝子、モジュール、活性部位もしくは それらの部分のランダムな組合せを有する組換えベクターは、当該分野で公知の 技術を用いて都合よく生成され得る。例えば、目的のPKSサブユニットは、PKSサ ブユニットを発現する生物から、組換え法を用いて、例えばこの遺伝子を発現す る細胞由来のcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、 あるいはこの遺伝子を含むことが知られているベクターからこの遺伝子を得るこ とにより、得られ得る。次いでこの遺伝子は、標準の技術を用いて、単離されそ してその他の所望のPKSサブユニットと組み合わされ得る。問題の遺伝子がすで に、適切な発現ベクター中に存在する場合、それは、例えば、その他のPKSサブ ユニットとインサイチュで所望のように組み合わされ得る。目的の遺伝子はまた 、クローン化よりもむしろ合成的に産生され得る。ヌクレオチド配列は、所望の 特定のアミノ酸配列に対する適切なコドンを用いて設計され得る。一般に、その 配列が発現される目的の宿主に好適なコドンが選択される。標準的な方法により 調製された重複するオリゴヌクレオチドから完全な配列がアセンブルされ得、そ して完全なコーディング配列にアセンブルされる。例えば、Edge(1981)Nature 2 92 ：756；Nambairら、（1984）Science 223：1299；Jayら、(1984)J.Biol．Chem .259：6311参照。 ネイティブのPKSサブユニット配列に対して変異が作成され得、そしてそのよ うな変異体は、この変異体がその他のPKSサブユニットとともに機能し得、同定 可能なポリケチドの合成を集合的に触媒し得る限り、ネイティブの配列の代わり に使用され得る。そのような変異は、例えば、変異を含む合成オリゴヌクレオチ ドを調製し、そして制限エンドヌクレアーゼ消化を用いてPKSサブユニットをコ ードする遺伝子中に変異した配列を挿入することによる従来技術を用いてネイテ ィブな配列に作成され得る。(例えば、Kunkel,T.A.（1985）Proc．Natl．Acad.S ci．USA 82：448；Geisselsoderら、(1987)BioTechniques ５：786を参照)。あ るいは、変異は、ミスマッチプライマー(一般に長さ10〜20のヌクレオチド)を用 いてなされ得、このプライマーは、ミスマッチした二本鎖の融解温度以下の温度 で、ネイティブなヌクレオチド配列(一般にRNA配列に対応するcDNA)にハイブリ ダイズする。このプライマーは、プライマーの長さおよび塩基組成を比較的狭い 限度内に保つことにより、および変異体塩基を中心に位置させることにより特異 的に成し得る。ZollerおよびSmith、Methods Enzymol.(1983)100：468。プライ マー伸長は、DNAポリメラーゼを用いて行われ、生成物はクローン化され、そ してプライマーが伸長した鎖の分離から得た変異DNAを含むクローンが選択され る。選択は、ハイブリダイゼーションプローブとして変異体プライマーを用いて 達成され得る。この技術はまた、複数の点変異を生成するために適用し得る。例 えば、Dalbie-McFarlandら、Proc．Natl．Acad．Sci USA（1982）79：6409を参 照。PCR変異誘発もまた、所望の変異をもたらすための使用を見い出す。 上記のように得られたヌクレオチド配列のランダム変異誘発は、当該分野で公 知のいくつかの異なる技術、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位内で配列を変え ることにより、オリゴヌクレオチドリンカーをランダムにプラスミドに挿入する ことにより、Ｘ線または紫外線で照射することにより、インビトロDNA合成の間 に不正確なヌクレオチドを取り込むことにより、誤りがちなPCR変異誘発により 、合成の変異体を調製することにより、またはインビトロでプラスミドDNAを化 学物質で損傷させることにより、達成され得る。化学的変異原には、例えば、重 亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、塩基を損傷または除去し、そ れにより正常な塩基対形成を妨害する試薬（例えば、ヒドラジンまたはギ酸）、 ヌクレオチド前駆体のアナログ（例えば、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラ シル、２-アミノプリン）、またはアクリジンをインターカレートする試薬（例 えば、プロフラビン、アクリフラビン、キナクリン）などが含まれる。一般的に 、プラスミドDNAまたはDNAフラグメントは、化学物質で処置され、E．coli中に 形質転換されそして変異プラスミドのプールまたはライブラリーとして増殖され る。 ランダム酵素の変異型の大きな集団は、米国特許第5,521,077号（Khoslaら） に記載の「組換え増強変異誘発」を用いてインビボで構築され得る。 延長ユニットの縮合を触媒するのに少なくとも十分なPKSタンパク質を集合的 にコードする遺伝子配列は、ネイティブなものであれ変異体であれ、当業者に公 知の方法を用いて１つまたはそれ以上の発現ベクター中に挿入され得る。PKS遺 伝子、モジュール、活性部位、またはそれらの部分のランダムな組合せを、発現 ベクターに取り込むために、これらのカクテルが調製され得、そして当該分野で 周知で、以下に詳細が記載される技術により、発現ベクターを生成するために調 製され用いられ得る。発現ベクターは、所望のPKSコーディング配列に作動可能 に連結された制御配列を含む。本発明に使用するための適切な発現系は、真核生 物宿主細胞および原核生物宿主細胞において機能する系を含む。しかし、上記で 説明したように、原核生物系が好適であり、そして特に、Streptomyces spp.と 適合する系が特に重要である。そのような系で使用するための制御要素は、任意 にオペレーター配列を含むプロモーター、およびリボソーム結合部位を含む。特 に有用なプロモーターは、機能的PKS酵素が産生する結果となる、１つまたはそ れ以上のactプロモーター、tcmプロモーター、スピラマイシンプロモーターなど のような、PKS遺伝子クラスター由来の制御配列を含む。しかし、ガラクトース 、ラクトース(lac)およびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーターの ような、その他の細菌プロモーターもまた、本発明の構築物における使用を見い 出す。さらなる例は、トリプトファン(trp)、βラクタマーゼ(bla)プロモーター 系、バクテリオファージλPL、およびT5のような生合成酵素由来のプロモーター 配列を含む。さらに、tacプロモーター(米国特許第4,551,433号)のような、合成 のプロモーターもまた、天然には生じないが、細菌宿主細胞で機能する。 他の調節配列もまた所望され得、この配列は宿主細胞の成長に相関してPKS遺 伝子の発現の調節を可能にする。調節配列は当業者に公知であり、そしてこの例 としては、遺伝子の発現を、化学的または物理的刺激(調節化合物の存在を含む) に応答して開始(turn on)または停止(turn off)させる調節配列を含む。その他 のタイプの調節エレメント(例えば、エンハンサー配列)もまたベクター中に存在 し得る。 選択マーカーもまた、組換え発現ベクター中に含まれ得る。形質転換細胞株の 選択において有用であり、そして一般に、細胞が適切な選択培地中で成長すると き、その発現が形質転換細胞上の選択可能な表現型を与える遺伝子を含む種々の マーカーが公知である。そのようなマーカーは、例えば、プラスミドに抗生物質 の耐性または感受性を付与する遺伝子を含む。あるいは、いくつかのポリケチド は、本来着色されており、この特徴は、本発明の構築物により首尾良く形質転換 された細胞（すなわち、これは単離され得、そして無細胞系でポリケチドを触媒 的に調製するために用いられ得る機能的PKSを発現する）を選択するための生来 の(built-in)マーカーを提供する。 目的の種々のPKSサブユニット、またはPKS遺伝子、モジュール、活性部位、ま たはそれらの部分のカクテルが、別個の制御エレメントとともに、または例えば 単一プロモーターの制御下で１個のカセットとして、１つまたはそれ以上の組換 えベクター中にクローン化され得る。PKSサブユニットまたはカクテル成分は、 ハイブリッドPKSが生成され得るように、その他のPKSサブユニットまたはカクテ ル成分の容易な欠失および挿入を可能にするための隣接する制限部位を含み得る 。そのような独特の制限部位の設計は当業者に公知であり、そして部位特異的変 異誘発およびPCRのような、上記の技術を用いて達成され得る。 これらの技術を用いて、本明細書に記載の無細胞系での使用のためのPKS酵素 の産生のためのシャトルベクターとして、プラスミドpRM5が構築された。プラス ミドpRM5は、PacIおよびNsiI制限部位に隣接するアクチノロジンPKSサブユニッ トをコードする遺伝子を含む。PacIおよびNsiI部位に隣接するPKSをコードする 新しいヌクレオチド配列は、アクチノロジンPKS遺伝子を容易に置換し得る。シ ャトルプラスミドはまた、act KR遺伝子(actIII)、シクラーゼ遺伝子(actVII)、 および推定のデヒドラターゼ遺伝子(actIV)、ならびにColEIレプリコン(E.coli の形質転換を可能にする)、適切な短縮型(truncated)SCP2^*(低コピー数)Strepto mycesレプリコン、およびactクラスター由来のactII-ORF4アクティベーター遺伝 子(栄養菌糸において成長期から定常期への移行の間にactプロモーターからの転 写を誘導する)を含む。pRM5は、多様なactI/actIIIプロモーター対を有する。 本発明の組換えベクターを適切な宿主中に導入する方法は、当業者に公知であ り、そして代表的には、CaCl₂または２価のカチオンおよびDMSOのようなその他 の薬剤の使用を包含する。DNAはまた、エレクトロポレーションにより細菌細胞 中に導入され得る。 次いで、機能的PKSタンパク質の発現系を含むように改変された細胞は、これ らのタンパク質が産生される条件下で培養される。 ２．無細胞系の調製 無細胞系で使用するためのポリケチドシンターゼタンパク質が、上記のように 組換え的に調製されるべきである場合、関連のPKSタンパク質を産生する細胞は 、所望のタンパク質が細胞内で産生される場合、必要に応じて収集されそして破 壊 される。しかし、発現系が、タンパク質を増殖培地に分泌する場合、タンパク質 は、直接培地から精製され得る。 タンパク質が分泌されない場合、タンパク質は細胞溶解物から単離され得る。 これは、一般的に、細胞成分およびいくつかの外来性のタンパク質を欠く粗製の 抽出物を最初に調製することにより達成される。次いで、所望のタンパク質は、 さらに（すなわち、カラムクロマトグラフィー、HPLC、免疫吸着剤技術、または 当該分野で周知の他の従来の方法により）精製され得る。適切な増殖条件および 回収方法の選択は、当該分野の技術範囲内である。 例えば、目的のPKSを発現する細胞は、所定の数の細胞を産生するために増殖 され得る。細胞は、超音波処理、凍結融解サイクルなどの技術（これらにより、 細胞膜が、破砕されて、粗製の無細胞の調製物を形成する）により、破壊され得 る。粗製の無細胞の調製物は、この段階でPKSの供給源として用いられ得るか、 またはさらに遠心分離、濾過などにより処理されて細胞上清を形成し得る。必要 に応じて、核酸が、例えば、ポリエチレンイミンまたは他のPKSの酵素活性を妨 害しない同様の試薬で沈澱させることにより、細胞上清から除去され得る。調製 物は、この段階でPKSの供給源として用いられ得る。必要に応じて、PKSは、当業 者に公知の技術によりさらに精製され得る。 ポリケチドのライブラリーの構築における使用のために、組換え的に産生され たポリケチドシンターゼタンパク質に加えて、単離されたネイティブ型が、いく つかの場合に用いられ得る。 単離されたPKSは、以下に例示するように、無細胞系でポリケチドを触媒的に 合成するために用いられ得る。無細胞系は、適切な緩衝液中に、精製したPKSお よびポリケチドの触媒的合成に必要な基質を含む。PKSに依存して、開始基質ユ ニットは、例えば、アセチルCoA、マロンアミルCoA、プロピオニルCoA、ブチリ ルCoA、イソブチリルCoA、イソバレリルCoA、芳香族コエンザイムＡチオエステ ル（例えば、ベンゾイルCoA、アミノベンゾイルCoA、アミノヒドロキシベンゾイ ルCoAなど）、ヘテロ環（例えば、チオフェンカルボキシルCoAなど）、および部 分的に合成されたポリケチドを含み得る。あるいは、コエンザイムＡチオエステ ルは、対応するＮ-アセチルシステアミンチオエステルによって置換され得る。 延長ユニットには、例えば、マロニルCoA、メチルマロニルCoA、エチルマロニル CoA、および当業者に周知の他の同様の分子が含まれる。 単離または精製されたモジュラーポリケチドシンターゼを用いたポリケチドの 合成のための無細胞系を提供することは、いままで不可能であった。本発明によ れば、このような無細胞系が、これらの複合シンターゼにより生成されるポリケ チドの生成のためにさえ提供される。 本明細書中で開示される無細胞系を用いて調製されるポリケチドは、薄膜クロ マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、分析用および/または調整用ゲ ル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、核磁気共鳴 （「NMR」）、質量分析、または当該分野で周知の他の従来の方法を含む当該分 野で公知の任意の種々の技術（例えば、WO 95/08548を参照のこと）を用いて単 離および同定され得る。 ３．PKS およびライブラリー設計における使用に関するさらなる背景情報 上記の無細胞の調製物は、多数の異なるポリケチドを含むポリケチドライブラ リーの構築において特に有用である。合成に必要なPKS触媒活性を含むタンパク 質の変化によって含まれ得る変化を概説することは有用である。芳香族およびモ ジュラーおよび真菌のPKS由来のコーディング配列を組み合わせるハイブリッド 系は得られ得るが、より詳細にこれらのPKSの作用の様態、および組合せの可能 性を記載することは有益であり得る。説明を簡単にするために、芳香族、モジュ ラー、および真菌のPKS系は、別々に議論される。 一般的に、ポリケチド合成は、３つの段階で起こる。第一の段階において、PK Sにより触媒されて、新生のポリケチド骨格が単体のCoAチオエステルから生成さ れる。第２の段階において、この骨格は位置特異的に環化される。いくつかの環 化反応がPKS自体によって制御されるが、他は下流の酵素の活性により生じる。 最後の段階で、環化された中間体は、機械論的に多様な「テイラーリング(tailo ring)酵素」の作用によりさらに改変されて、天然の産物を生じる。 a)芳香族PKS 背景：芳香族PKSについては、ポリケチド生合成は、縮合酵素であるβ-ケトア シルシンターゼ/アシルトランスフェラーゼ（KS/AT）の活性部位上にロードする プライマーユニットで開始する。次いで、延長ユニット（通常マロネート）が、 アシルキャリアタンパク質（ACP）のパンテテイニルアームに転移する。KS/ATは 、ACP結合マロネートと開始ユニットとの間の縮合を触媒する。さらなる延長ユ ニットを、新生のポリケチド鎖がタンパク質鎖長因子（CLF）とおそらくKS/ATと によって決定される所望の鎖長まで成長するまで、逐次付加される。従って、KS 、CLF、およびACPは、ポリケチド骨格を生成するための最少のセットを形成する 。次いで、新生のポリケチド鎖を、（もし存在すれば）ケトレダクターゼ（KR） により位置特異的ケト還元に供する。シクラーゼ（CYC）およびアロマターゼ（A RO）は、後で、分子内アルドール縮合による位置特異的な環形成事象を触媒する 。次いで、環化された中間体は、下流のテイラーリング酵素で制御されるさらな る位置特異的および/または立体特異的修飾（例えば、0-メチル化、ヒドロキシ ル化、グリコシル化など）を受けることがある。 アセチルCoAは、ほとんどの芳香族ポリケチドの通常の開始ユニットである。 しかし、マロンアミルCoA(Gatenbeck，S．Biochem．Biophy．Res．Commun.（196 1）6:422-426)およびプロピオニルCoA(Paulick，R．C.ら、J．Am．Chem．Soc.(1 976)98:3370-3371)は、それぞれ、ポリケチドのテトラサイクリンクラスおよび アンスラサイクリンクラスの多くのメンバーのプライマーである。ダウノルビシ ンPKSはまた、アセチルCoA、ブチリルCoA、およびイソブチリルCoAを開始ユニッ トとして許容し得る(Oki，T.ら、J．Antibiot.（1981）34:783-790; Yoshimoto ，A.ら、J．Antibiot.（1993）46:1758-1761)。 act KRは、これまで研究された全ての最小のPKSと生産的に相互作用し得、C-9 ケト還元を触媒するのに必要かつ十分である。相同なKRは、他のPKSクラスター において見出されているが、これらは、同一の位置特異性でケト還元を触媒する 。しかし、フレノリシン（frenolicin）、グリセウシン、およびダウノルビシン の構造は、これらの生合成の経路においてさらなるC-17ケト還元が起こることを 示唆する。同様に、いくつかのアングサイクリン（angucycline）は、新生ポリ ケチド鎖が環化される前に起こるC-15ケト還元を受ける(Gould，S．J.ら、J．Am . Chem．Soc.(1992)114:10066-10068)。C-15およびC-17還元を担うケト還元酵素 は、未だ同定されていない；しかし、２つの相同のKRがダウノルビシンPKSクラ スターにおいて見出されている(Grimm，A.ら、Gene(1994)151:1-10; Ye，J.ら、 J．Bacteriol.（1994）176:6270-6280)。これらはC-9およびC-17還元を触媒する ようである。 ほとんどの天然に存在する細菌性芳香族ポリケチドの生合成における最初の２ つの６員環の形成は、PKSサブユニットにより制御される；さらなる閉環は、さ らなるシクラーゼおよび修飾酵素により制御される。これらの反応により導入さ れる構造の多様性は、最初の２つの環化によるものよりも大きいようである。し かし、特定の好ましいパターンが観察される。これは、これらの下流のシクラー ゼの少なくともいくつかは、組合せライブラリーの構築にとって有用であり得る ことを示唆する。例えば、イソクロマンキノンのピラン環は、いつもC-3とC-15 との間の環化を介して形成される；生成物の２つの立体化学的に異なるクラスが 観察される。アンスラサイクリンおよびテトラサイクリンにおいて、第三のアル ドール縮合は、通常C-3とC-16との間で起こるのに対し、非還元テトラセノマイ シン（tetracenomycin）および関連する化合物においては、C-5およびC-18の間 で起こり、アングサイクリンにおいては、C-4とC-17との間で起こる。これらの 酵素のうちいくつかをコードする代表的な遺伝子は、すでにクローン化されてい る(Fernandez-Moreno，M.A.ら、J．Biol．Chem.（1994）269:24854-24863; Shen ，B.ら、Biochemistry（1993）32:11149-11154)。少なくともいくつかのシクラ ーゼが異なる長さおよび/または還元の程度の鎖を認識し得、それにより芳香族 ポリケチドの組合せライブラリーの多様性を増大させる。 下流のシクラーゼの非存在下で、ポリケチド鎖は、非酵素的反応を受ける。最 近、ある程度の予測性が、可能性のこのレパートリーの中に現れた。例えば、ヘ ミケタールおよびベンゼン環は、メチル末端に見られる２つの共通の部分である 。ヘミケタールは、適切な位置のエノールで形成され、そしてその後脱水が起こ り得る。ベンゼン環はより長い環化されていないメチル末端で形成される。カル ボキシル末端上で、３つのケチド単位で形成されるγ-ピロン環が頻繁に観察さ れる。自発的な脱炭酸が、β-カルボニルの存在によって活性化される遊離のカ ル ボキシル末端で起こる。 環化された中間体は、種々のタイプの修飾を受けて、最終の天然の産物を生成 し得る。天然に存在する芳香族ポリケチドの間の特定の構造モチーフの反復は、 いくつかのテイラーリング酵素、特に基トランスフェラーゼが、組合せ的に有用 であり得ることを示唆する。２つの例を以下に議論する。 0-メチル化は、共通の下流修飾である。いくつかのSAM依存性0-メチルトラン スフェラーゼ遺伝子がPKS遺伝子クラスターにおいて見出されているが(Decker, H.ら、J．Bacteriol.（1993）175:3876-3886)、これらの特異性は未だ系統的に 研究されていない。おそらくそれらのいくつかは、組合せの生合成にとって有用 であり得る。例えば、0-11-メチル化は、芳香族のポリケチドのアンスラサイク リン、テトラセノマイシン、およびアングサイクリンのクラスのいくつかのメン バーにおいて起こる。 ライブラリー設計： 以下の設計ルール（design rule）のセットは、合理的ま たは確率論的に芳香族ポリケチド経路（これは、鎖合成、C-9ケト還元、および ２つの第１芳香族環の形成を含む）における生合成の初期段階の操作を可能にす る。それぞれの生合成的自由度が他の全てのものとは非依存的である場合、N₁× N₂×...N_i...N_n-1×N_nクローンの単一の組み合わせライブラリーを設計すること が可能なはずである。ここで、N_iは、ｉ番目の自由度を利用し得る経路の数であ る。しかし、実際には、全ての酵素的自由度が、非依存的なわけではない。従っ て、重複性を最小化するためには、PKS酵素産生クローンのサブライブラリーを いくつか設計するのが好ましい。 （１）鎖長。芳香族合成では、ポリケチド炭素鎖長は最小PKSによって決まる 。最小PKSの内では、アシルキャリアタンパク質は特異性に影響を及ばすことな く相互変換され得るが、鎖長因子は重要である。いくつかのケトシンターゼ／鎖 長因子の組み合わせは機能的であるが、他はそうでない；従って、特定の長さの ポリケチド鎖の生合成は、最小PKSで補償され得、ここで、ケトシンターゼおよ び鎖長因子は両方とも同じPKS遺伝子クラスターから生じる。これまでに、act、 fren、tcm、およびwhiE PKSクラスター由来の最小PKSを用いて、それぞれ炭素が 16 個（オクタケチド）、18個（ノナケチド）、20個（デカケチド）および24個（ド デカケチド）を有する鎖長が生成され得る(McDanielら，Science(1993)、上記； McDanielら，J．Am．Chem．Soc.(1993)、上記)；McDanielら，Proc．Natl.Acad ．Sci．USA(1994)、上記）。whiE最小PKSはまた、KRの存在下で22炭素の骨格を 生成し得、これは、fren PKSに対して見出されるような緩和された鎖長制御の程 度を示唆する。 （２）ケト還元。ケト還元はケトレダクターゼを必要とする。act KRは、これ までに研究された任意の長さを有する初期のポリケチド骨格のC-9カルボニル（ カルボキシル末端から数えて）の還元を触媒し得る。さらに、act KRは、上記の 全ての最小PKSと適合する。ホモロガスなケトレダクターゼが、他のPKSクラスタ ー中に同定されている（Sherman，D.H.ら、EMBO J.(1989)8:2717-2725；Yu，T.- W.ら、J．Bacteriol.(1994)176:2627-2534；Bibb，M.J.ら、Gene(1994)142:31-3 9）。これらの酵素は、すべての対応する天然産物がこの改変に供され得るので 、同様にC-9でのケト還元を触媒し得る。稀な状況では、act KRでのC-7ケト還元 もまた観察されている。 （３）第１環の環化。最小PKSのみが第１環の形成を制御し得るが、この反応 の位置特異的な進行は他のPKSタンパク質によって左右され得る。例えば、これ までに研究された最も最小PKSは、単独で存在する場合にC-7／C-12環化を伴うポ リケチドを生成する。対照的に、tcm最小PKSのみは、C-7／C-12環化産物およびC -9／C-14環化産物の両方を生成する。任意の最小PKSを伴うケトレダクターゼの 存在は、初期のポリケチド鎖を拘束し、ケト還元の位置に関して独占的に環化す る：C-9ケト還元についてはC-7／C-12環化、およびC-7ケト還元についてはC-5／ C-10環化（McDaniel，R.ら、J．Am．Chem．Soc.(1993)115:11671-11675；McDani el，R.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1994)91:11542-11546；McDaniel，R.ら 、J．Am．Chem．Soc.(1994)116:1085510859）。同様に、TcmN酵素の使用は、異 なる長さの非還元ポリケチドについてはC-9／C-14環化に対する位置特異性を変 化させるが、還元された分子に対する効果は有さない。 （４）第１環芳香族化。非還元ポリケチド内の第１環を非触媒的に芳香族化す る。対照的に、還元ポリケチドには芳香族化サブユニットが必要とされる。異な るPKSクラスターからのこれらのサブユニットの鎖長特異性に関するヒエラルキ ーが存在すると思われる。例えば、act AROは、16炭素鎖のみを認識し（McDanie lら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1994)、上記）、fren AROは、16炭素鎖およ び18炭素鎖の両方を認識するが、gris AROは、16炭素鎖、18炭素鎖および20炭素 鎖を認識する。 （５）第２環の環化。還元ポリケチドの第２環のC-5／C-14環化は、適切なサ イクラーゼを用いて達成され得る。act CYCは、オクタケチドおよびノナケチド を環化し得るが、これはそれより長い鎖を認識しない。デカケチド以上の鎖に対 する特異性を有する、等価なC-5／C-14サイクラーゼは同定されていないが、グ リセウシン（griseusin）のような天然産物の構造はこれらの存在を暗示する。C -9／C-14第１鎖を有する十分に長い非還元鎖の場合、C-7／C-16第２環の形成は 、最小PKSにより触媒される（McDanielら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1994) 、上記） （６）さらなる環化。PKSのKS/AT、CLF、ACP、KR、AROおよびCYCサブユニット は、規定の鎖長を有する中間体の形成、還元パターン、および２つの第１環化を 同時に触媒する。代表的には、天然に存在するポリケチドの生合成は、特徴的な 生物学的活性産物を生成するために、下流のサイクラーゼおよび他の修飾酵素の 活性化を必要とし、続いて本明細書および本発明者らの先の出版物に記載される 操作されたポリケチドの生合成における反応は特異的酵素の非存在下で起こり、 そして個々の分子の異なる物理的および化学的特性によって決定される。おそら く、このような化学的可能性および束縛を反映すると、一致パターンが観測され る結果、いくらかの予測性を与える。ポリケチド鎖の非環化メチル末端により形 成される２つの共通部分は、ヘミケタールおよびベンゼン環である。ヘミケター ルの形成は、適切に配置されたエノールの存在下で起こり、そして、続いて、水 和形態および脱水和形態の両方は単離されることが多いので、脱水和し得る（Mc Daniel，R.ら、Science(1993)262:15461550；McDaniel，R.ら、J．Am．Chem．So c.(1994)116:1085510859；Fu，Hら、J．Am．Chem．Soc.(1994)116:416644170） 。一方、ベンゼン環形成は、より長い非加工のメチル末端を用いて起こる（Fuら 、J．Am．Chem．Soc.(1994)、上記）。その鎖のカルボキシル末端で最も頻繁に 観 測される部分は、３つのケチド単位により形成されるγ-ピロン環であり（McDan ielら、J．Am．Chem．Soc.(1994)、上記；Fuら、J．Am．Chem．Soc.(1994)、上 記；Fu，Hら、Biochemistry(1994)33:9321-9326；Fu，Hら、Chem．& Biol.(1994 ):205-210；Zhang，H.-l.ら、J．Org．Chem.(1990)55:1682-1684）；遊離のカル ボン酸が残存する場合、β-カルボニルが存在するならば代表的には脱カルボキ シル化が起こる（McDanielら、Science(1993)、上記；McDaniel，R.，Ebert-Kho sla，S.，Hopwood，D.A.およびKhosla，C.，J．Am．Chem．Soc.(1993)、上記；K ao，C.M.ら、J．Am．Chem．Soc.(1994)116:11612-11613）。メチルおよびカルボ キシル末端は、優先的に、非依存的に環化する傾向にあるが、替わりが存在しな い場合には同時環化することを念頭において、多くのアルドール縮合も同様に予 測され得る（McDanielら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1994)、上記）。インビ ボで観測されるこれらの非酵素的環化パターンはまた、初期のバイオミメティッ ク研究に一致する（Griffin，D.A.ら、J．Chem．Soc．Perkin Trans.(1984)1:10 35-1042）。 天然に存在する他の細菌性芳香族ポリケチドの構造を同時に用い、先に提示し た設計ルールを外挿し、インビボでの組み合わせの生合成（例えば、還元ポリケ チドおよび非還元ポリケチドの生合成）により生成され得る分子多様性の程度を 見積もり得る。還元ポリケチドについては、同一の自由度として、鎖長、第１環 の芳香族化、および第２環の芳香族化が挙げられる。非還元ポリケチドについて は、これらは、鎖長および第１環の環化における位置特異性を含む。到達し得る 構造の数は、各自由度が変化し得る様式の数の産物である。５つの異なる長さの 鎖がこれまでに操作されている（16-、18-、20-、22-および24-炭素長）。ダイ ネミシンアントラキノン（Tokiwa，Y.ら、J．Am．Chem．Soc.(1992)114:4107-41 10）、シマオミシン（Carter，G.T.ら、J．Org．Chem.(1989)54:4321-4323）お よびベナスタチン（Aoyama，T.ら、J．Antibiot.(1992)45:1767-1772）の構造お よび推定される生合成経路から、それぞれ、14炭素、26炭素、およびおそらく28 炭素骨格を生成する最小PKSの単離が予測され、可能な数は８に至る。このよう な最小PKSのクローニングは、先に単離されている最小PKSに対する遺伝子（例え ば、actI遺伝子）を用いて達成され得る（Shermanら、EMBO J.(1989)、上記；Yu ら、J．Bacteriol.(1994)、上記；Bibbら、Gene(1994)上記；Malpartida，F.ら 、Nature(1987)325:818-821）。還元鎖は、芳香族化されるかそうでないかのい ずれかであり得る；第２環サイクラーゼは第１環が芳香族化される場合に選択的 である。非還元鎖の第１環化の位置特異性は、TcmNのような酵素の存在に依存し て変化し得る。 例えば、還元ポリケチドについて、関連の自由度は、鎖長（これは、少なくと も７通りに操作され得る）、第１環の芳香族化（これは、少なくとも２通りに操 作され得る）、および第２環の環化（これは、芳香族化された中間体のみについ て少なくとも２通りに操作され得る）を含む。非還元ポリケチドについて、第１ 環化の位置特異性もまた操作され得る。従って、還元ポリケチドについての組み 合わせの可能性は、少なくとも７×３＝21である；非還元ポリケチドにおける組 み合わせの可能性は少なくとも７×２＝14である。さらに、これらの数は、非酵 素的または非特異的酵素触媒された工程により組換え株に産生されるさらなる少 量産物（主要産物当たり５〜10のオーダー）を含まない。従って、芳香族ポリケ チドの生合成における最初の数工程のみでの組み合わせ操作から生成され得るポ リケチドの数は、数百のオーダーである。従って、遺伝子操作された生合成は、 薬物発見のための化学的多様性に関する潜在的に無限の供給源を意味する。 ｂ）モジュラーPKS 背景：モジュラーPKSによる合成の例として、DEBSによるポリケチドの生合成 は、モジュール１縮合活性（β-ケトアシルシンセナーゼ（KS））上に開始ユニ ットをロードするモジュール１中の第１のアシルトランスフェラーゼ（AT）活性 を用いて開始される。モジュール１の第２のATは、アシルキャリアタンパク質（ ACP）活性のパンテテイニルアーム上に第１の延長ユニットをロードする。KSは 、ACP-結合マロニルユニットとプライマーユニットとの間の脱カルボキシル的縮 合を触媒する。次いで、得られたジケチドは、モジュール１のケトレダクターゼ （KR）活性により還元され、β-ケト基をアルコールに転換する。より複雑なモ ジュール（例えば、DEBSモジュール４）において、さらなる還元的サイクル活性 （デヒドラターゼ（DH）およびエノイルレダクターゼ（ER））は、モジュール のKRが最初のケト還元を行った後で働き始める。次いで、モジュール１産物は、 モジュール２KSに変化する。モジュール２ATは、モジュール２ACP上に第２の延 長ユニットをロードし、次いで、モジュールKSは縮合を行い、還元的に加工され たトリケチドを生じる。さらなるモジュールは、成長するポリケチド鎖上に他の 延長ユニットをそれぞれ追加および加工しながら働き始める。ポリケチド鎖の最 終的な長さは、PKSに存在するモジュールの数（DEBSの場合は６）により決定さ れ、そして任意の位置での還元的結果は、対応するモジュール中に存在する還元 的サイクル活性の補完により決定される。ポリケチド鎖の生成後、この分子は、 DEBSモジュール６の末端に融合したチオエステラーゼ（TE）活性による位置特異 的環化に供される。次いで、マクロライド産物は、下流の酵素（例えば、ヒドロ キシラーゼ、オキシダーゼ、メチルトランスフェラーゼ、グルコシラーゼなど） により改変され、最終的な天然産物を生成する。 ライブラリー構築：以下の設計ルールのセットは、モジュラーポリケチド生合 成経路における、初期生合成工程の理論的あるいは確率論的な操作に当てはまる 。操作要素は以下を包含する： (1)開始ユニット。インビトロ条件下での開始ユニットのための、緩和された 特異性のモジュラーPKSが報告されている（Pieperら、1995、前出）。 (2)延長ユニット。所与のモジュールで使用される延長ユニットの性質は、AT 活性によって決定される。配列比較によって、マロニル-CoA特異的ATおよびメチ ルマロニル-CoA特異的ATの活性の特性が明確に同定された(Haydockら、1995、前 出)。メチルマロニル-CoAまたはエチルマロニル-CoAを用いる活性において、２ つの可能な立体化学のうちの１つを有するキラル中心が生じる。従って、２つの 共通の延長ユニット、すなわちマロニル-CoAおよびメチルマロニル-CoAに関して 、３つの可能な構造的成果が存在する。 (3)還元サイクル。KSで触媒される縮合によって形成されるβ-ケト基の還元状 態は、モジュール内に存在する還元サイクル活性のセットによって支配される。 従って、いかなる還元活性も存在しないとケトン官能が生じ、他方、KR活性のみ が存在すると、２つの可能な立体化学のうちの１つを有するアルコール基が生じ る。KR活性およびDH活性の両方が存在すると、アルケンが形成する結果となる； AT活性によって立体中心が生じていた場合、その位置のキラリティーは失われる 。KR活性、DH活性、およびER活性の完全な補体が存在すると、その結果、β-ケ ト基からメチレン基へ完全に還元される。従って、任意のモジュールで、５つの 理論的に可能な還元サイクルの成果が存在する。 (4)環化。線状ポリケチド鎖は、多くの可能な機構を通じて環化し得る。DEBS チオエステラーゼ(TE)活性は、ヒドロキシ酸をラクトン化する広範囲な能力を示 す(Aggarwalら、1995、前出)。また、いくつかの既知の天然産物（例えば、アベ ルメクチン、メビノリン）は、複数のアルケン基を含むポリケチド鎖のディール ス-アルダー環化を通じて形成されるようである。アルコールがケトン上に環化 してケタールおよびスピロケタールを形成することもまた、通常観察される。 従って、任意の単一のモジュールに関して、２つの共通の延長ユニットのみを 考慮した場合、少なくとも14個の理論的構造的成果が存在する。全ての操作可能 な要素が同時に制御されるならば、S個の開始ユニットを用いてN個のモジュール PKSから製造され得る Ｓ×(14)^N 個の可能なポリケチド鎖が存在する。DEBSのような6-モジュールPKSに関して、 単一の開始ユニットを用いて、14⁶個または7.5×10⁶個のポリケチド鎖が製造さ れ得る。さらに、下流での修飾（例えば、環化、基の移動反応、酸化還元など） を触媒する酵素が、本明細書中および他で提示される内容に沿って研究され得る 。従って、これらの自由度のうちの少なくともいくつかを組み合わせて利用して 、天然で観察される多様性に匹敵する構造的多様性を有する合成産物のライブラ リーを生成し得る。 モジュラーPKSは広範に分析されてはいないが、活性部位と産物の構造との１ 対１対応は、天然に生じる「複合」ポリケチドにおいて観察される信じられない ほどの化学的多様性と相まって、これらの多酵素系内の組み合わせの可能性が、 芳香族PKSに関しての可能性よりもかなり高いものであり得ることを示唆する。 例えば、脂肪族モノマー（アセテート、プロピオネート、ブチレート、イソバレ レートなど）、芳香族（アミノヒドロキシ安息香酸）、脂環族（シクロヘキサン 酸）、および複素環（ピペコリン酸）を包含する、より広い範囲のプライマーユ ニットが、種々の巨大環式ポリケチドにおいて見出される。最近の研究は、モジ ュラーPKSが、その開始ユニットについて緩和された特異性を有することを示唆 した（Kaoら、Science(1994)、前出）。縮合反応に続くβ-ケト還元の程度もま た、遺伝子操作によって変更され得る(Donadioら、Science(1991)、前出；Donad io,S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:7119-7123)。同様に、ポリケチド産 物のサイズは、適切な数のモジュールを有する変異体を設計することによって変 更され得る(Kao,C.M.ら、J.Am.Chem.Soc.(1994)116：11612-11613)。モジュラー PKSはまた、延長ユニットの選択に関して（この特性がどの程度操作され得るの かはいまだ示されていないとはいえ）、各縮合サイクルにおいてかなりのバラエ ティーを示す。最後に、これらの酵素は、その産物中に広範囲な不斉中心を高度 に制御された様式で生成することで、特に周知である。従って、モジュラーPKS 経路内の組み合わせの可能性は、実質的に無限であり得る。 ｃ）グリコシル化 芳香族ポリケチドおよび複合ポリケチドの両方は、しばしばグリコシル化され る。多くの場合（例えば、ドキソルビシンおよびエリスロマイシン）、１つまた は複数の糖基が存在しないと、生理活性はかなり弱くなる。天然に生じるポリケ チドアグリコンに付着する糖基のタイプおよび数には、途方もない多様性がある 。特に、デオキシ糖およびアミノ糖が通常見出される。位置化学的優先性(regio chemical preference)が、多くのグリコシル化天然産物において検出され得る。 アンスラサイクリンのうちで、0-17がしばしばグリコシル化され、他方、アング サイクリンのうちで、C-10が通例グリコシル化される。エリスロマイシンの生合 成に関与するグリコシルトランスフェラーゼは、アグリコン部分に関して緩和さ れた特異性を有し得る（Donadio,S.ら、Science(1991)252:675-679）。エロラマ イシン(elloramycin)グリコシルトランスフェラーゼは、非天然のNDP糖ユニット を認識することができ、そしてそれを位置特異的に芳香族ポリケチドアグリコン に付加することができる(Decker,H.らAngew.Chem.(1995)、印刷中）。これらの 初期の結果は、二次代謝経路由来のグリコシルトランスフェラーゼが独特の特性 を有 し、そして組み合わせライブラリーの生成において使用するための魅力的な標的 であり得ることを示唆する。 ｄ）真菌PKS 放線菌と同様に、糸状菌はポリケチド天然産物の豊富な供給源である。6-メチ ルサリチル酸シンターゼ(6-MSAS)およびメビノリンシンターゼのような真菌PKS が単一の多ドメインタンパク質でコードされるという事実（Beckら、Eur.J.Bioc hem.(1990)、前出；Davis,R.ら、Abstr.Genet.Ind.Microorg.Meeting、前出）は 、これらもまた、組み合わせ変異誘発のための標的となり得ることを示す。さら に、真菌PKSは、上記で概説されかつ前出のWO 95/08548に記載された遺伝子的ス トラテジーを用いて、S.coelicolor CH999において機能的に発現され得る。細菌 芳香族ポリケチドにおいて観察されない鎖長（例えば、テトラケチド、ペンタケ チドおよびヘキサケチド）が、真菌芳香族ポリケチドにおいて見出された（O'Ha gan,D.The Polyketide Metabolites(Ellis Horwood，Chichester,U.K.，1991)。 同様に、真菌芳香族ポリケチドの環化パターンは、細菌芳香族ポリケチドにおい て観測されるパターンとは非常に異なる（同上）。細菌からのモジュラーPKSと 対照的に、S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼによって、 分岐メチル基が真菌ポリケチド骨格中に導入される；メビノリンPKS(Davis,R.ら 、Abstr.Genet.Ind.Microorg.Meeting、前出)の場合、この活性はモノシストロ ン性PKS内の１つのドメインとしてコードされる。真菌ポリケチドにおける化学 的多様性の、これらおよび他の供給源が、実際に組み合わせ操作を受け入れやす いかどうかを実験的に評価することが、今や可能である。 ｅ）要旨： 無細胞系においてPKS遺伝子産物によって触媒的に生産され得る、潜在的に新 規なポリケチドの数は、新規な自由度を利用するにつれ、および／またはタンパ ク質工学ストラテジーは、天然で観察されない特異性を有する酵素サブユニット を創造する仕事に対して向けられるにつれ、幾何級数的に増加する。例えば、非 アセテート開始ユニットを、ポリケチド骨格に組み込み得る（例えば、ダウノル ビシンにおけるプロピオネートおよびオキシテトラサイクリンにおけるマロンア ミド）。さらに、下流での環化および後の工程での修飾（例えば、天然に生じる ポリケチドにおいて通常見られる基の移動反応および酸化還元）を触媒する酵素 が、本明細書および他で提示される内容に沿って研究され得る。従って、これら の自由度のうちの少なくともいくつかを組み合わせて利用して、天然で観察され る多様性に匹敵する構造的多様性を有する合成産物のライブラリーを生成し得る 。 Ｃ．実験 以下は、本発明を実施するための具体的な実施態様の実施例である。これらの 実施例は、例示の目的のためだけに提供され、どのような場合においても本発明 の範囲を限定することを意図していない。 使用される数字（例えば、量、温度など）の正確さを確実にするために努力し たが、いくらかの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。 下記の実施例は、モジュラーPKSの組換え産生、ならびに組換えDEBSによる、 および活性欠失変異体による、ポリケチドのインビトロ合成のための方法を記載 する。後者の変異体は「DEBS 1+2+TE」と命名され、DEBSのモジュール６のＣ末 端に通常見出されるチオエステラーゼドメインに融合したDEBS１からの最初の２ つのモジュールを含む（図１）。DEBSおよびDEBS 1+2+TEの両方がS.coelicolor CH999において成功裡に発現され、精製され、そして各々、6-dEB(1) および(2R,3S,4S,5R）-2,4-ジメチル-3,5-ジヒドロキシ-n-ヘプタン酸６-ラクト ン(2) のインビトロ触媒的合成のための、無細胞系において使用された。Saccharopoly spora erythraeaゲノムのery遺伝子クラスターにおいて、３つのオープンリーデ ィングフレーム（eryAI、eryAII、およびeryAIII）がDEBSポリペプチドをコード し、そして32kbにわたる。この遺伝子は、６つの繰り返しユニットで組織され、 各々は「モジュール」と命名される（図１参照）。各モジュールは、ポリケチド 生合成の間に追加のモノマーの伸長する鎖上への縮合を触媒する、活性部位のセ ットをコードする。各モジュールは、アシルトランスフェラーゼ(AT)、β-ケト アシルキャリアタンパク質シンターゼ(KS)、およびアシルキャリアタンパク質(A CP)、ならびに還元活性部位（β-ケトレダクターゼ(KR)、デヒドラターゼ(DH)、 エノイルレダクターゼ(ER)）のサブセットを含む。モジュール内の還元部位の数 は、各縮合サイクルにおけるβ-ケト還元の程度に対応する。モジュールの末端 でコードされるチオエステラーゼ(TE)は、ラクトン形成を触媒するようである。 eryAI、eryAII、およびeryAIIIの大きなサイズ、および複数の活性部位の存在 のために、これらの遺伝子は、遺伝子操作された宿主細胞CH999のような宿主細 胞中での発現に適したプラスミド中に、インビボ組換え技術を用いて好都合にク ローン化され得る。WO 95/08548に記載されたこの技術は、プラスミドpMAK705(H amiltonら(1989)J.Bacteriol.171:4617)の誘導体を用いて、第一の許容的な温度 で複製可能であり、かつ第二の非許容的な温度で複製ができない温度感受性ドナ ープラスミドと、レシピエントプラスミドとの間のインビボ組換えを可能にする 。このようにクローン化されたeryA遺伝子は、pRM5の誘導体であるpCK7を与える (M cDanielら(1993)Science 262:1546)。コントロールプラスミドであるpCK7fは、e ryAIにおけるフレームシフト変異をもたらすために構築される。pCK7およびpCK7 fは、E.coliにおける遺伝子操作のためのColEIレプリコン、ならびに短縮型SCP2^* （低コピー数）Streptomycesレプリコンを有する。これらのプラスミドはまた 、分岐した(divergent)actI/actIIIプロモーターペアおよびactII-ORF4、アクチ ベーター遺伝子（これらのプロモーターからの転写のために必要とされ、そして 栄養菌糸体における成長期から定常期への遷移の間の発現を活性化する）を含む 。PKS遺伝子の高レベル発現は、菌糸成長の定常期の開始時に起こる。 実施例１ S ．coelicolor CH999の産生 S.coelicolor宿主細胞を遺伝子操作してネイティブなact遺伝子クラスターを 除去し、そしてCH999と呼ばれる宿主細胞を、WO 95/08548(本明細書中に参考と して援用される)に記載のようにS.coelicolor CHl(Khoslaら、Molec．Microbiol .(1992)、前出)を用いて構築した。S.coelicolor CH999はACT遺伝子のクラスタ ー全体を欠損する。 実施例２ 組換えベクターpRM5の産生 シャトルプラスミドを用いてCH999中に組換えPKSを発現する。このようなプラ スミドは、代表的には、colEIレプリコン、適切に短縮されたSCP2^*Streptomyces レプリコン、両方向のクローニングを許容する２つのact-プロモーター、増殖期 から定常期への移行の間actプロモーターからの転写を誘導するactII-ORF4アク チベーターをコードする遺伝子、および適切なマーカー遺伝子を含む。制限部位 はこれらのベクター中へ操作されて、天然に生じるPKSの個々のサブユニット（ またはドメイン）をコードするカセットから始まるPKS遺伝子クラスターの組み 合わせ構築を容易にする。この方法の数ある多くの利点には、(i)全ての関連す る生合成遺伝子はプラスミド由来であり、それゆえE.coliにおける容易な操作お よび突然変異誘発を受け入れられる、および(ii)PKS遺伝子クラスターの全体 のライブラリーは同じ細菌宿主にて発現され得る、がある。 pRM5は、CH999でPKSを発現するために用いたシャトルプラスミドであった。そ れは、E.coliにおいて遺伝子操作を可能にするColEIレプリコン、適切に短縮さ れたSCP2^*(低コピー数)Streptomycesレプリコン、および栄養菌糸体で増殖期か ら定常期への移行の間にactプロモーターからの転写を誘導する、actクラスター 由来のactII-ORF4アクチベーター遺伝子を含む。pRM5は、多様なactI/actIIIプ ロモーターペアを有し、同時に、両プロモーターの下流に種々の操作されたPKS 遺伝子の挿入を容易にするために便利なクローニング部位を有する。pRM5は、SC P2^*のpar遺伝子座を欠いている；その結果このプラスミドは、わずかに不安定で ある(チオストレプトンの非存在下で約２％が損失)。この特徴は、目的の表現型 が、このプラスミド由来の変異体PKSに明確に割り当てられ得ることを、迅速に 確認するために、故意に導入された。pRM5由来の組換えPKSは、ほぼ、増殖の指 数的成長相から定常期への移行期に、良好な収率で発現される。 pRM5を、WO95/08548に記載されるように構築した。 実施例３ 芳香族PKSに対する発現ベクターの構築、および芳香族PKSの発現 WO98/08548は、アクチノロジン(actinorhodin)(act)、グラナチシン(granatic in)(gra)およびテトラセノマイシン(tetracenomycin)(tcm)遺伝子クラスターの 芳香族ポリケチド合成遺伝子クラスターの一部を用いる、pRM5宿主プラスミドを 用いる発現ベクターの構築を記載する。多くのハイブリッドクラスターを記載す る。これらのハイブリッドクラスターをS．coelicolor CH999に導入し、そして 発現して種々のポリケチドを順に産生する関連のポリケチドシンターゼを産成し た。フレノリシンＢ(fren)PKS遺伝子クラスター由来の遺伝子を用いるさらなる 構築物もまた調製した。 実施例４ モジュラーPKSの産生 組換えモジュラーDEBS PKS遺伝子を含有する発現プラスミドを、温度感受性 「ドナー」プラスミド（すなわち、第１の許容温度にて複製可能であり、そして 第２の非許容温度にて複製不可能であるプラスミド）から、WO95/08548、および Kaiら（Science(1994)265：509）に記載のように、二重組換え事象を介して「レ シピエント」シャトルベクターへ漸増的にDNAを転移することにより構築した。p CK7は完全なeryA遺伝子を含む。eryAIにおけるフレームシフトエラーを含むコン トロールプラスミドである、pCK7fを同様の様式で構築した。pCK7およびpCK7fを E.coli ET12567(MacNeil(1988)J.Bacteriol．170：5607)に形質転換して非メチ ル化プラスミドDNAを生成し、そして続いて標準的なプロトコル(Hopwoodら(1985 )Genetic manipulation of Streptomyces．A laboratory manual．The John Inn es Foundation：Norwich)を用いてS．coelicolor CH999へ移入した。 R2YE培地上でのCH999/pCK7の増殖の際、２つのポリケチドを産生した。さらに 、３つの高分子量タンパク質（＞200 kDa）、おそらくDEBS1、DEBS2およびDEBS3 (Caffreyら、FEBS Lett.(1992)304：225)がまた、ドデシル硫酸ナトリウムポリ アクリルアミドゲル電気泳動(「SDS-PAGE」)を介してCH999/pCK7の粗抽出物に観 察された。ポリケチド産物はCH999/pCK7Fからは観察されなかった。 実施例５ 変異体DEBS PKSの組換え産生 本実施例では、DEBS3のTEに融合したDEBS1(「DEBS 1+2+TE」)から成る欠損変 異体PKSを構築した；プラスミドpCK12は、DEBS 1+2+TEをコードする遺伝子を含 んだ。 DEBS 1+2+TE PKSは、モジュール６のアシルキャリアタンパク質のカルボキシ ターミナル末端(ACP-6)へのモジュール２のアシルキャリアタンパク質のカルボ キシターミナル末端(ACP-2)の融合を含んだ（図１を参照）。従って、ACP-2は、 このPKSにおいて本質的にインタクトであり、そしてACP-6とTEとの間に天然に見 出されるアミノ酸配列が続く。pCK12は、ACP-2のカルボキシターミナル末端とAC P-6のカルボキシターミナル末端との間の欠損を除いてpCK7と同一である(Kaoら 、Science(1994)、前出)。融合はDEBS1の残基L3455とDEBS3のQ2891との間で起こ る。SpeI部位はこれらの２つの残基の間に存在するので、融合におけるDNA配列 はCTC ACTAGTCAGである。 実施例６ pCK7 およびpCK12からの無細胞DEBSの調製 DEBSの調製を以下のように行った。S.coelicolor CH999/pCK12またはCH999/pC K7細胞を液体培養での55時間の増殖後に採集した。代表的には、８〜10グラムの 細胞（湿潤細胞重量）をソニケーション(５×30 sバースト)を用いて破砕した。 得られた細胞スラリーを超遠心分離(192,000×gにて2h)し、そして核酸を0.2％ のポリエチレンイミンで沈殿し（工程１）、約200 mgの総タンパク質を得た、す べての３つのDEBSタンパク質を55％飽和硫酸アンモニウム溶液中で沈殿した。そ の後、150 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.1)、15％グリセロール、2mM ジチオ スレイトール(「DTT」)、および２mM エチレンジアミンテトラ酢酸(「EDTA」)を 含むインキュベーション緩衝液（緩衝液I）を使用した。Sephadex G25 M上での 脱塩（工程２）後、約30 mgのタンパク質(15〜20 mg/mL)をAgarose BioGel Aサ イズ排除カラム(140mL)にアプライした。DEBSタンパク質を含む画分をプールし 、そしてYM 30限外濾過膜上で１mg/mLに濃縮した（工程３）。 DEBSタンパク質をSDS-PAGEにより330 kDa(DEBS 3)、370 kDa(DEBS 1)および38 0 kDa(DEBS 2)のそれらの高分子量により検出した；これらのタンパク質は種々 のコントロール株の細胞抽出物には存在しなかった。DEBSタンパク質の見かけの 分子量をまた、高分子量マーカーとしてチログロブリン(669 kDa)およびアポフ ェリチン(443 kDa)を用いて、Superose 6 HR 10/30カラム(Pharmacia)上でゲル 濾過することにより評価した（図3Aを参照）。 細胞抽出物から単離した組換えDEBSタンパク質を上述のように部分的に精製し た。Biogel AおよびSuperose 6（それぞれ、サイズ排除上限15 MDaおよび1.5 MD a）上の３つのDEBSサブユニットを含む粗抽出物のサイズ排除クロマトグラフィ ーは、DEBS 1およびDEBS 2が、DEBS 3とよりもより強固に互いに会合しているこ とを明らかにした。さらに、DEBS 1およびDEBS 2(それぞれ、370 kDaおよび380k Da)は、10 MDaと１MDaとの間のM_rに対応する広範な画分にわたって溶出し、これ は、それらが多量体複合体（ゲル濾過の間部分的に解離する）を形成し得るこ とを指示する。しかし、DEBS 3は、この極度に大きいM_r範囲内に存在しない。Su perose 6カラム上のサイズ較正実験から、DEBS 3(330 kDa)は、（チログロブリ ン、669 kDaと同様に）二量体として大部分溶出する。濃縮の際、DEBS 1および2 のみを含むBiogel Aカラム画分（図3Aを参照）は、インビトロで不活性であるこ とが見出された。しかし、DEBS 3のみを含む濃縮された画分でプールされた場合 （図3A）、３つのタンパク質の再構成された複合体は、粗細胞抽出物の硫酸アン モニウム沈殿を介して得られたDEBS 1、2、および3調製物に対して匹敵する活性 を示した。これらの精製結果は、DEBSの活性には高分子量のオリゴマー複合体、 可能であれば二量体の三量体の形成が必要であることを示唆する。精製された（ しかし十分に活性ではない）DEBSサブユニットによるホモダイマーの形成が報告 されている（Aparicioら、J．Biol．Chem．(1994)、前出；Bevittら、Eur．J. B iochem．(1992)、前出；Caffreyら、Eur．J．Biochem(1991)、前出；およびLead layら、Biochem．Soc．Trans．(1993)、前出）。 鎖伸展反応の非存在下での¹⁴C標識化開始ユニットによる無細胞DEBS調製物の 共有改変を図3Bに示す。部分的に精製されたDEBS調製物(40 mg総タンパク質)を 、基質[1-¹⁴C]プロピオニル-CoA(20 μM)、[1-¹⁴C]ブチリル-CoA(160 μM)、[1^{- 14} C]アセチル-CoA(40 μM)、またはヨードアセトアミド(1 mM)での30分間プレイ ンキュベーションを含む[1-¹⁴C]プロピオニル-CoA(20 μM)でインキュベートし た。変性およびSDS-PAGE(５％)におけるタンパク質の分離の後、分離したタンパ ク質をニトロセルロース膜上に電気転移し、¹⁴C標識化タンパク質を５日間Ｘ線 フィルムに曝露した。 実施例７ 6-dEB および(2R,3S,4S,5R)-2,4-ジメチル-3,5-ジヒドロキシ n- ヘプタン酸δ-ラクトンの無細胞の合成 ポリケチド合成のためのインビトロアッセイ系を確立するために、実施例６に 記載の通りに調製された完全なDEBS１、２、および３系およびDEBS 1+2+TEの部 分的に精製された調製物を、それらの天然基質である[1-¹⁴C]プロピオニル-CoA 、 (2RS)-メチルマロニル-CoA、およびNADPHとともにインキュベートした。 実施例６に記載のDEBS 1+2+TEおよびDEBS１、２、および３調製物（精製工程 ２）を、1mL緩衝液当たり８mgの総タンパク質濃度に調整した。250μLの容積の 緩衝液Iに溶解させた[1-¹⁴C]プロピオニル-CoA（比活性50Ci/mol．10μM）、メ チルマロニル-CoA（250μM）、およびNADPH（500μM）とともに、インキュベー ションを28℃で３時間行った。その後、インキュベーション混合物を２×２mL酢 酸エチルで抽出し、酢酸エチルをエバポレートし、続いて生成物を薄層クロマト グラフィー（[TLC」）で60％酢酸エチル/40％ヘキサン中で分析した。TLCプレー トを、Ｘ線フィルムに２日間曝露した。 オートラジオグラムのレーンIaおよびIb（図４）は、[1-¹⁴C]プロピオニル-Co AおよびNADPHを含むがメチルマロニル-CoAは含まないDEBS 1+2+TE（Ia）ならび に全ての３つの基質を含むDEBS 1+2+TE（Ib）の抽出物を示す。オートラジオグ ラムのレーンIIa、IIb、およびIIc（図４）は、[1-¹⁴C]プロピオニル-CoAおよび NADPHを含むがメチルマロニル-CoAは含まないDEBS１、２、および３（IIa）のイ ンキュベーション、全ての３つの基質を含むDEBS１、２、および３（IIb）のイ ンキュベーション、ならびにDEBS１、２、および３とセルレニン（100μM）との 15分間のプレインキュベーション後の全ての３つの基質の添加（IIc）を示す。 溶媒系として、酢酸エチル/ヘキサン（50:50）を用いた。レーンIbにおいて、主 要な標識化成分は、R_f(0.30)で標準トリケチド（２）（矢印を参照）と同一であ るが、一方レーンIIbにおいては、最も低い極性の標識化生成物は、R_f(0.40)で 標準6-dEB（１）（矢印を参照）と同一である。レーンIbおよびIIbにおいて、少 数の生成物（しかし、6-dEBでもトリケチドラクトンでもない）の濃度は、反応 緩衝液中でDTT濃度の関数として実質的に変化する；これらのDTT-依存性生成物 の構造は、研究中である。コントロールの実験もまた、DEBS 1+2+TE、NADPH非存 在下の完全DEBS、および匹敵する無細胞の、CH999およびCH999/pSEK38由来の調 製物（アクチノロジンPKS遺伝子クラスターを発現する組換え株）を用いて行わ れた。全ての４つのコントロールにおいて、6-dEBもトリケチドラクトンも検出 されなかった。強くより極性であるバンドである、明らかなレーンIIa、IIb、お よびIIcもまた、CH999単独から得られた抽出物を含む全ての上記のヌル（nul l）コントロール中に存在した。酵素的に産生された[¹⁴C]-(1)および[¹⁴C]-(2) の同一性はそれぞれ、標準未標識化キャリアを用いてTLCで精製された生成物の それぞれを希釈し、そして再結晶して一定の活性にすることにより確認された。 従って、DEBS１、２、および３と[1-¹⁴C]プロピオニル-CoAとのインキュベート 由来の標識化6-dEBを、15.4mgの（１）と混合してエーテル/ヘキサンから４回再 結晶した。各再結晶の後、各サンプルの２〜３部を液体シンチレーション計数に より分析した；2132±16dpm/mg（１回目の再結晶）；2117±23dpm/mg（２回目の 再結晶）；2125±2dpm/mg（３回目の再結晶）；2141±17dpm/mg（４回目の再結 晶）；（平均¹⁴C act．2129±9dpm/mg）。同様に、DEBS 1+2+TEと[1-¹⁴C]プロピ オニル-CoAとのインキュベーション由来の同様に標識化されたトリケチドを、20 .4mgの未標識化（２）と混合し、そしてエーテル/ヘキサンから４回再結晶した ：4528±306dpm/mg（１回目の再結晶）；4725±80dpm/mg（２回目の再結晶）；4 662±74dpm/mg（３回目の再結晶）；4706±60dpm/mg（４回目の再結晶）；（平 均¹⁴C act．4655±77dpm/mg）。 これらの結果は、TLC-オートラジオグラフィー（図４）から明らかにされるよ うに、無細胞のDEBSタンパク質調製物の各々が、6-dEB(1)または(2R,3S,4S,5R)- 2,4-ジメチル-3,5-ジヒドロキシ-n-ヘプタン酸δ-ラクトン（２）のいずれかの 参照サンプルのそれぞれに同一なTLCのR_f値を有する¹⁴C-標識化生成物を合成し たことを示す。[¹⁴C]-(1)および[¹⁴C]-(2)の同一性を、TLCで精製した放射標識 化生成物のそれぞれを、標準未標識化キャリア6-dEBまたはトリケチドラクトン とともに希釈し、そして各サンプルを繰り返し再結晶して一定の活性にすること により確実にされた。各ラクトン生成物の形成は、関連するタンパク質調製物な らびにメチルマロニル-CoAおよびNADPHの絶対的な必要性を示し、そしてこれは 、双方ともに脂肪酸生合成の縮合反応における周知のインヒビターであるN-エチ ルマレイミドおよびセルレニンの両方（Plate，C．A.ら、J．Biol．Chem.（1970 ）245：2868；D'Agnolo，G.ら、Biochim．Biophys．Acta（1973）326：155；Kau ppinen，S.ら、Carlsberg Res．Commun.（1988）53：357-370）により阻害され た。精製された生成物の観察された放射性化学的収量に基づき、DEBS１、２、お よび３により触媒される6-dEBの形成を、33pmol/mg総タンパク質であると評価し た。 比較によれば、DEBS 1+2+TEによる（２）の形成は、600pmol/mg総タンパク質で あった。 トリケチドラクトン生成物における標識化の特異性は、メチルマロニル-CoAお よびNADPHの存在下で[1-¹³C]プロピオニル-CoAとDEBS 1+2+TEとの分画スケール インキュベーションにより、明確に確認された。100MHz ¹³C NMRによる誘導体化 生成物（2a）の分析（図４（a）を参照のこと）は、予想された部位（C-5、(2R, 3S,4S,5R)-2,4-ジメチル-3,5-ジヒドロキシ-n-ヘプタン酸δ-ラクトン中）にお ける富化に対応する81.3ppmでの増強されたピークを示した（Kao，C.M.ら、J．A m．Chem．Soc.(1994)、前出）。 実施例８ 無細胞系におけるDEBS 1+2+TEの基質特異性 インビトロのアッセイを、実施例６に記載のように、［1-¹⁴C]プロピオニル-C oAを[1-¹⁴C]ブチリル-CoA(160μM)または[1-¹⁴C]アセチル-CoA（40μM）のいず れかで置き換えて行った。DEBS 1+2+TEのインキュベーション（精製工程２）を 、メチルマロニル-CoAを除くか、または適切な¹⁴C標識プライマー基質に加えて メチルマロニル-CoAおよびNADPHを含めて行った。あるいは、全ての３つの基質 を加える前に、DEBS 1+2+TEを１mMのN-エチルマレイミドとともに予めインキュ ベートした。NADPHの非存在下、ならびに等量のS．coelicolor CH999由来のタン パク質調製物を用いて行ったコントロール実験では、観察された標識生成物を生 じなかった。酢酸エチル／ヘキサン（60：40）を溶媒系として使用した。 上記のラジオクロマトグラフィックアッセイの進歩は、これらの多機能性酵素 複合体の基質特異性の予備的な分析を可能にする。例えば、DEBS 1+2+TEは、タ ンパク質アシル化および生成物形成の両方により示されるように、プライマーユ ニットアナログについて緩和した特異性を示すようである。[1-¹⁴C]プロピオニ ル-CoAによる期待されるアシル化に加えて、DEBS 1+2+TEおよびDEBS 1（DEBS 1 、2、および3の混合物由来）の両方ともがまた、[1-¹⁴C]アセチル-CoAおよび[1-¹⁴ C]ブチリル-CoAとともに共有付加生成物を形成する（図3Bを参照のこと）。タ ンパク質の標識はヨードアセトアミドのような活性部位のチオールインヒビター の 存在により影響されないので、基質はおそらく、DEBS 1のＮ末端の「ロードされ ている」アシルトランスフェラーゼドメインに結合する。全ての３つのアシル-C oA基質は、同等の効率でDEBS 1またはDEBS 1+2+TEと反応するようである。（図3 B中のブチリル-CoA標識バンドの明らかにより低い強度は[1-¹⁴C]ブチリル-CoAの 10倍低い特異的活性のためである。）メチルマロニル-CoAおよびNADPHの存在下 で、アセチル-CoAおよびブチリル-CoAの両方ともが、DEBS 1+2+TEの代用ポリケ チド鎖イニシエーターとして作用して、それぞれ化合物(2)上記のC₈アナログで ある化合物(4)（図6Bを参照のこと）、および(2)のC₁₀ホモログであると想定さ れる化合物(5)（図6Bを参照のこと）を薄層クロマトグラフィー−オートラジオ グラフィーにより判断されるように生じる（図6Aを参照にこと）。 先のCoAチオエステルに加えて、DEBS 1+2+TE酵素がまた、ポリケチド鎖伸長中 間体のN-アセチルシステアミンチオエステルである(2S,3R)-2-メチル-3-ヒドロ キシペンタノイル-NACチオエステル(3)をプロセスし得る。それゆえ、メチルマ ロニル-CoAおよびNADPHの存在下で[1-¹⁴C]-(3)（Cane，D.E.ら、J．Am．Chem．S oc．(1981)103:5960; Cane，D.E.ら、Tetrahedron（1983）39:3449; Cane，D.E. ら、J．Am．Chem．Soc.（1986）108:4957; Cane，D.E.ら、J．Am．Chem．Soc.(1 987)109:1255; Cane，D.E.ら、Tetrahedron Lett.（1991）32:5457; およびCane ，D.E.ら、J．Antibiot.（1995）48:647-651(1995)）とDEBS 1+2+TEとのインキ ュベーションは、上記のように、トリケチドラクトン(2)について期待されるク ロマトグラフィーの移動度を有し、かつ未標識のトリケチドラクトンで希釈され る場合に再結晶化して活性を定常化し得る標識された生成物を生じた。標識の特 異性を、[2,3,-¹³C₂]-(3)とDEBS 1+2+TE、メチルマロニル-CoAおよびNADPHとの 分取スケールのインキュベーションにより明白に確認した。得られたトリケチド ラクトン(2b)（図４を参照のこと）の¹³C NMRスペクトルは、36.7および81.3ppm を中心とする、増強されそしてカップリングされた二重線（J_cc＝34.5Hz）の対 を示した。これは、それぞれ、標識C-4およびC-5の予想される各部位における富 化に対応する。この結果は、インタクトな細胞実験における、先に報告された[2 ,3,-¹³C₂]-(3)のエリスロマイシンマクロライドへの組み込み（Caneら、J．Am.C hem．Soc．(1981)、前出；Caneら、Tetrahedron（1983）前出; Caneら、J．Am. Chem．Soc.（1986）前出; Caneら、J．Am．Chem．Soc.（1987）前出; Caneら、 Tetrahedron Lett.（1991）前出）、ならびにポリケチド鎖伸張の進行した中間 体のNACチオエステルが他のポリケチドに組み込まれたことが示された多数の実 験の結果と一致する。 本明細書中で提供される実施例は、これらのNACチオエステルがPKS中の適切な 活性部位に直接ロードされ、そしてさらなるタンパク質またはコファクターの関 与を必要としないという推測をさらに信用させる。この実験はまた、マクロライ ドシンターゼが外因的に付加された鎖伸長中間体を認識し、そしてそれらを天然 の産物へのさらなるプロセシングのために結合体PKSモジュールに正確にロード する能力を直接確認する。 実施例９ 2,4,- ジメチル-5-エチル-3-ヒドロキシ-2-ピロンの無細胞合成 実施例６に記載のDEBS1+2+TE調製を、実施例７に記載するように使用し、但し NADPHを反応混合物に添加しなかった（精製工程２）。この反応は、NMR分析によ り示されるように2,4,-ジメチル-5-エチル-3-ヒドロキシ-2-ピロンを生成した。 以下の実験は、このような基質が非天然の開始ユニットと競合する範囲では、 天然の第１のモジュール開始ユニットからの、または延長ユニットの脱カルボキ シル反応由来のこのような開始ユニットからのモジュラーPKSにおいて、ポリケ チドの合成を阻害する方法を提供する。この方法は、天然の開始ユニットを有す るPKSの第１のモジュールのロードを、その上に開始ユニットがロードされる鍵 となる活性部位を不活化することにより（例えば、KS1を欠失させるか、またはK S1を非機能にすることにより、もしくはACP1を欠失させるか、またはACP1を非機 能にすることにより）阻害する工程を包含する。無細胞系（ここで、非天然の開 始ユニットからのポリケチドの合成が所望される）において、この方法は、天然 の開始ユニットおよび／または延長ユニットの存在に基づいて、所望されない競 合性ポリケチドの合成を最小化するという利点を提供する。さらに、この方法は 、無細胞系において相当なコストで供給される延長ユニットを節約する。この方 法はまた、非天然の基質からの所望のポリケチドの生成が天然の基質の存在によ り 阻害され得るインビボの系において特に重要であり、それにより非天然の開始ユ ニットの効率的な使用を排除して所望の生成物を生じる。 実施例10 [KS1^*]-DEBS1+2+TE の構築、発現、および分析 プロピオニル-CoAを添加しない場合、DEBS1+2+TEはメチルマロニルロード酵素 の脱カルボキシル化によりプロピオニル開始ユニットを形成し得る。この反応は 、機能的なモジュール１KS活性を必要とし、これは延長ユニットを開始ユニット と縮合させるために、ロードされたメチルマロネートを脱カルボキシル化する。 供給されたプロピオニル-CoA開始ユニットが存在しない場合、脱カルボキシル化 された延長ユニットは後方へ転移され得、第２のメチルマロニル-CoA延長のロー ド、および続くジケチドの形成を可能にする。別の開始ユニットがこの系に供給 される場合には、プロピオニルユニットのこの後方形成（back-formation）が所 望されないので、モジュール１KSが部位特異的変異誘発を介して不活化されたDE BS1+2+TEの変異体を調製した。KS1配列は活性部位のシステイン残基（特徴的な 配列ｃys-ser-ser-ser-leu内に存在する）がアラニンに置換されるように改変し た。得られた発現プラスミド（pKA0179と名付けた）は、標準的な反応条件（プ ロピオニル-CoA、メチルマロニル-CoA、およびNADPH）下では不活性である2-モ ジュールPKSをコードする。従って、KSIの不活化はプロピオニルユニットの後方 形成を妨げるが、ジケチドの形成もまた妨げる。しかし、ジケチドチオエステル （すなわち、(2S,3R)-2-メチル-3-ヒドロキシ-ペンタノイル N-アセチルシステ アミンチオエステル、メチルマロニル-CoA、およびNADPH）とともにこのタンパ ク質が供給される場合、（2R,3S,4S,5R）-2,4-ジメチル-3,5-ジヒドロキシヘプ タノン酸δ-ラクトンが生成される。この構築物は、対応するジケチドチオエス テルの使用により、正常なトリケチド生成物が混入しない、異常な開始ユニット を有するトリケチドのインビトロの生成を可能にする。 実施例11 [KS1^*]DEBS 変異体を用いる発酵による新規のポリケチドのインビボ生成 実施例10に記載するように、DEBSのモジュール１β-ケトアシルシンターゼ（K S1）活性は部位特異的変異誘発を通じて不活化され得る。この変異は、モジュー ルの任意の組み合わせに組み込まれて一連のDEBS後退PKSを生成し得、これは適 切なジケチドチオエステル（例えば、2-メチル-3-ヒドロキシペンタノイル N-ア セチルシステアミンチオエステルまたはアナログ）を供給しない限り、ポリケチ ド合成について無能である。実施例10に記載される方法は、［KSl^*]-DEBSに基づ く発現プラスミドを含むS．coelicolor CH999の培養物を活性的に増殖させるた めに、適切なジケチドチオエステルアナログの供給により新規のポリケチドのイ ンビボ生成を可能にするように拡大し得る。細胞のチオエステル化系が酸に対し て機能的である場合、および細胞が酸に対して浸透性である場合、遊離のカルボ ン酸として対応するジケチドがまた培養物に供給され得る。例えば、（2R,3S,4S ,5R）-2,4-ジメチル-3,5-ジヒドロキシ-n-ヘプタン酸δ-ラクトンのインビボ生 成が先に上述されている。 S．coelicolor CH999/pKA0179の培養物は、スポア（spore）を有する200mLのS MM培地（５％のPEG-800、0.06％のMgSO₄、0.2％の（NH₄）₂SO₄、25mMのTES、pH7 .2、25mMのKH₂PO₄、25mMのK₂HPO₄、1.6％グルコース、0.5％のカザミノ酸、微量 元素）の播種により確立される。培養物を30℃で325rpmで振盪しながらインキュ ベートする。１mLのメチルスルホキシド中の（2S,3R）-2-メチル-3-ヒドロキシ ペンタノイル N-アセチルシステアミンチオエステル（100mg）および4-ペンチン 酸（15mg）の溶液を３つの部分：50時間後（400mL）；62時間後（300mL）；およ び86時間後（300mL）に分けて培養物に添加する。全部で144時間後、培養物を遠 心分離して菌糸を取り除く。発酵ブロスをNaClで飽和し、そして酢酸エチル（5 ×100mL）で抽出する。組み合わせた有機抽出物をNa₂SO₄で乾燥させ、濾過し、 そして濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィーにより、（2R,3S,4S,5R）-2,4- ジメチル-3,5-ジヒドロキシ-n-ヘプタン酸δ-ラクトンが得られる。 この方法は、天然のプロピオネート開始ユニットを含むポリケチドが混入しな い、非天然の開始ユニットを含む新規のモジュールポリケチドの大規模な生産の ための手段を提供する。 本明細書中で報告される無細胞の結果は、容易な変異誘発手段の有用性との組 み合わせて、モジュールPKS構造およびメカニズムの研究への新規のアプローチ を提供する。記載された組換え起源に由来する完全に活性なタンパク質のかなり の収量は、放射性同位元素法ならびにNMR分光法および質量分析によるこの多機 能性触媒の詳細な分析を可能にする。DEBSがプライマーのような種々の基質を受 容し得ると仮定すると、適切に安定な状態の動力学的パラメーターの決定により 基質特異性を定量的に評価すること、および機構的な詳細をさらにプローブする ことが可能である。さらに、本明細書中で報告されるような無細胞系は、新規な ポリケチドの合成を制御するための全く新しい経路を提供し、そうでなければこ れはインビボ操作の生合成を介して利用可能ではないかもしれない。 従って、ポリケチドを生成するための新規な方法が開示される。本発明の好ま しい実施態様がいくらか詳細に記載されるが、明らかな改変が添付の請求の範囲 に規定されるような本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ得ること が理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 コスラ，チャイタン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94305, スタンフォード，ピーター コッツ サー クル 132 (72)発明者 パイパー，レンバート アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025, メンロパーク，メンロ アベニュー 957 (72)発明者 ルオ，ガングリン アメリカ合衆国 ロード アイランド 02906，プロビデンス，プレストン スト リート 80，アパートメント ナンバー３ (72)発明者 ケーン，デイビッド イー. アメリカ合衆国 ロード アイランド 02906，プロビデンス，ローレル アベニ ュー 35

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．所望のポリケチドを生成する方法であって、 （ａ）無細胞系内にモジュラーポリケチドシンターゼの少なくとも２つのモジ ュールを含む１つまたはそれ以上のタンパク質を提供する工程と、 （ｂ）少なくとも１つの開始ユニットおよび少なくとも１つの延長ユニットを 該系に添加する工程と、 （ｃ）該開始ユニットおよび該延長ユニットを含む該無細胞系を、該ポリケチ ドが合成される条件下でインキュベートする工程と、 （ｄ）必要に応じて該ポリケチドを該無細胞系から回収する工程と、 を包含する方法。 ２．前記開始ユニットおよび前記延長ユニットが異なる、請求項１に記載の方法 。 ３．前記ポリケチドの合成条件がNADPHの添加を含む、請求項１に記載の方法。 ４．工程（ａ）において、モジュラーPKSの少なくとも３モジュールを含む少な くとも２つのタンパク質が提供される、請求項１に記載の方法。 ５．前記１つのタンパク質または複数のタンパク質が、少なくとも２つの異なる モジュラーPKSからのモジュールを含む、請求項１に記載の方法。 ６．所望のポリケチドを生成する方法であって、 （ａ）機能性モジュラーポリケチドシンターゼ（PKS）、またはその機能性部 分を提供する工程であって、ここで、該PKSには、天然の第１モジュール開始ユ ニットがロードされ得ず、またはここで、一旦ロードされると、該PKSは、延長 ユニットの該第１モジュール開始ユニットへの縮合を触媒し得ず、ポリケチド中 間体を生成し得ない、工程と、 （ｂ）該PKSの基質である開始ユニットを該系に添加する工程と、 （ｃ）該ポリケチドが合成される条件下で、該PKSおよび該開始ユニット基質 を含む該系をインキュベートする工程と、 （ｄ）必要に応じて該ポリケチドを回収する工程と、 を包含する方法。 ７．ポリケチドのライブラリーを調製する方法であって、 （ａ）多数の無細胞系またはサブ系を提供する工程であって、各系またはサブ 系は、少なくとも１つの延長ユニットのポリケチド鎖へのカップリングを達成す る酵素活性を含む１つまたはそれ以上のポリケチドシンターゼタンパク質ならび に少なくとも１つの開始ユニットおよび少なくとも１つの延長ユニットを含む、 工程と、 （ｂ）該開始ユニットおよび該延長ユニットを含む該無細胞系またはサブ系を 、該ポリケチドが合成される条件下でインキュベートする工程と、 （ｃ）必要に応じて該ポリケチドを該無細胞系またはサブ系から回収する工程 と、 を包含する方法。 ８．少なくとも１つの系またはサブ系内の前記開始ユニットおよび前記延長ユニ ットが、互いに異なる、請求項７に記載の方法。 ９．前記無細胞系のそれぞれが少なくとも２つのサブ系に細分され、該サブ系の それぞれが、少なくとも１つの開始ユニットおよび少なくとも１つの延長ユニッ トを含み、ここで、該開始ユニットおよび該延長ユニットの少なくとも１つが、 該同一の無細胞系の該サブ系のそれぞれの間で異なる、請求項７に記載の方法。 １０．少なくとも２つの異なる無細胞系またはサブ系が、同一の開始ユニットお よび同一の延長ユニットを含む、請求項７に記載の方法。 １１．無細胞サブ系、基質開始ユニットおよび基質延長ユニットのマトリックス であって、 （ａ）それぞれが、少なくとも１つの延長ユニットとポリケチド鎖との結合に 影響を与える酵素活性を含む１つまたはそれ以上のポリケチドシンターゼタンパ ク質を含む一連の無細胞サブ系を含み、 （ｂ）該サブ系のそれぞれは、少なくとも１つの開始ユニットおよび少なくと も１つの延長ユニットを含み、そして （ｃ）少なくとも１つの酵素活性または少なくとも１つの延長ユニットまたは 少なくとも１つの開始ユニットが該遺伝子内の各サブ系間で異なる、 マトリックス。 １２．前記遺伝子内の前記サブ系が、２次元アレイ内に配置され、ここで、１つ の次元において、各サブ系は、少なくとも１つの任意の他のサブ系とは異なる酵 素活性を有し、同一の開始ユニットおよび／または延長ユニットを有し、他の次 元において、各サブ系は、他のサブ系と同一のポリケチドシンターゼ酵素活性を 含み、そして少なくとも１つの異なる開始サブユニットまたは延長サブユニット を有する、請求項１１に記載のマトリックス。 １３．前記ポリケチドシンターゼタンパク質が、モジュラーポリケチドシンター ゼ由来の酵素活性を含む、請求項１１に記載のマトリックス。 １４．前記ポリケチドシンターゼタンパク質が、芳香族ポリケチドシンターゼ由 来の酵素活性を含む、請求項１１に記載のマトリックス。 １５．前記ポリケチドシンターゼタンパク質が、モジュラーPKSおよび芳香族PKS の両方由来の酵素活性を含む、請求項１１に記載のマトリックス。 １６．天然の第１モジュール開始ユニットでロードされ得ず、または一旦ロード されると、延長ユニットの該第１モジュール開始ユニットへの縮合を触媒し得ず 、ポリケチド中間体を生成し得ない、機能性モジュラーポリケチドシンターゼ系 ま たはその機能性部分。